KR20130066481A - 암 특이적 당쇄의 분석 방법 및 암 진단에서의 이의 이용 - Google Patents
암 특이적 당쇄의 분석 방법 및 암 진단에서의 이의 이용 Download PDFInfo
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Abstract
암 특이적 당쇄의 분석 방법은, 제1 어레이 형태로 배열된 복수 개의 웰을 포함하는 제1 플레이트 및 제2 어레이 형태로 배열된 복수 개의 혼합 영역을 포함하는 제2 플레이트를 이용하여 수행될 수 있다. 암 특이적 당쇄의 분석 방법은, 암 환자의 혈액으로부터 분리된 혈청을 포함하는 시료를 제1 플레이트를 이용하여 처리하여 하나 이상의 당쇄를 추출하는 단계; 상기 복수 개의 혼합 영역을 이용하여 상기 하나 이상의 당쇄를 매트릭스 물질과 혼합하고 상기 복수 개의 혼합 영역 각각에 레이저를 조사함으로써 하나 이상의 당쇄를 이온화하는 단계; 전기장하에서, 이온화된 하나 이상의 당쇄의 검출기 도달 시간을 측정함으로써 하나 이상의 당쇄의 제1 질량 스펙트럼을 도출하는 단계; 및 도출된 질량 스펙트럼을, 정상인의 혈액을 이용하여 도출된 제2 질량 스펙트럼과 비교하여 암 특이적 당쇄를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
Description
실시예들은 암 특이적 당쇄의 분석 방법 및 이를 이용한 암 진단에의 응용 방법에 관한 것이다.
혈액 내 질병 예측인자(biomarker)는 질병발생시나 특이적인 생리상태 하에서, 조직에 있던 물질이 순환기 계열로 분비하여 혈액에 평소보다 과량으로 존재하는 특성을 나타낸다는 것이 알려져 있다. 생체 고분자 물질에 대한 심도있는 특성 분석 도구를 통해 단백질의 구조를 정확히 분석하고 해석하게 됨으로서, 프로테오믹스(proteomics) 기술의 발전을 통해 질병 예측인자의 변화를 민감하고 정확하게 측정할 수 있게 되었다. 혈액 내 특정 물질의 정성, 정량적 변화를 탐지함으로서 질병의 상태, 약물의 치료 효과 및 다른 질병과의 연관성을 종합적으로 판단하게 해주는 표식자로서 단백질에 대한 많은 연구가 진행되어 온 바 있으나, 여지껏 획기적인 질병 예측 인자의 발견 및 진단 의약 분야로의 응용은 기대에 못 미치고 있는 실정이다.
한편, 인체를 구성하는 단백질의 약 70%는 당화(glycosylated)되어 있는데, 프로테오믹스 학문의 일부분으로서 글라이코믹스(glycomics)라 불리우는 연구분야는 당쇄(glycan)의 구조와 특성을 대상으로 하는 학문이다. 최근 혈중 당쇄를 질병의 예측인자로 활용하고자 이를 정밀 분석 대상으로 하여 진단 의약 분야에 적용해보려는 연구 및 응용 기술의 개발이 새롭게 부각되고 있다. 그 동안의 연구 및 발명에서는, 난소암을 비롯한 유방암, 전립선암, 간암, 폐암, 위암, 췌장암 등 여러 악성 종양에서 당화현상(glycosylation)이 특이적으로 변화하는 것이 밝혀졌다. 즉, 단백질의 당단백질(glycol-protein)화는 암화되는 과정에서 변화되어 각 질환에서 혈청 당단백질을 구성하는 올리고당류 (oligosaccharide)의 수준이 변화된다는 것이다. 이 중 일부 당단백의 변화는 질환의 생체 표지자로서의 가능성이 있는 것으로 제시되고 있다. 일 예로, 미국 등록특허 제7,651,847호에는, 특정 암 환자들의 혈액에서 분리 분취한 올리고당류의 반복 조각들에 대한 질량분석 스펙트럼의 형태분석(pattern analysis)을 통해 난소암 및 유방암의 발병 가능성을 진단하고 암 진행 단계를 예측하는 기술이 개시되어 있다. 특히, 미국 등록특허 제7,651,847호는 단백질 중 뮤신(mucin)에 주목하였다. 뮤신은 높은 글라이코설레이션(high glycosilation)으로 조합된 당단백질로 분류되는데, 그 분자량의 큰 부분은 올리고당이라고 알려져 있다. 대부분의 상피세포암(즉, 상피조직암)은 자주 많은 양의 뮤신생성을 동반한다. 예를 들면, CA125(cancer antigen 16)(뮤신16)는 난소암의 전형적인 종양표지자로서 난소암 환자의 경우 체내에서 그 분비량이 증가한다고 보고되었다. 또한, 뮤신 1 은 유방암과도 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
하지만, 뮤신 1 또는 뮤신 16(CA 125)과 같은 뮤신의 농도를 측정하는 것은 여러가지 이유로 복잡하다. 뮤신은 약 2.5×106 내지 약 2.9×106 달톤(Da)의 분자량을 갖는 고분자의 불균일계 당단백질의 분자구조를 가지며, 현재 뮤신 측정을 위해 일반적으로 사용되고 있는 항원-항체 면역특이반응법은 부정확하고 정량적이지 못하다.
또한, CA125와 같이 흔히 측정되는 뮤신은 난소암의 종양이 어떠한 종류인가에 따라서 그 수치값이 다르게 나타나는 경향이 있다. 또한, CA125 농도가 정상보다 높게 나타나는 경우는 1단계 난소암 환자 중에서는 약 50% 정도에 그치고 있을 뿐만 아니라, 임신 또는 다른 암에 의해서도 CA125 농도가 높아지는 위양성(false positive) 반응을 보이는 문제점이 있다. 더구나 증세가 약한 자궁내막증이나 골반염증성 질병을 가진 여성들의 경우에도 상당수에서 높은 농도의 CA125 수치가 나타난다. 그렇기 때문에 CA125라는 표지자는 특별히 초기 난소암을 선별하는 데에는 적절하지 못하다는 문제가 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 기존에 사용되는 난소암 진단 예측 인자보다 특이성(specificity) 및 민감성(sensitivity)이 우수한 새로운 예측 인자로서 혈중 당쇄를 발굴할 수 있는 암 특이적 당쇄의 분석 방법을 제공할 수 있다. 상기 암 특이적 당쇄의 분석 방법은 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 분석형(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight; MALDI-TOF) 질량 분석법에 의하여 많은 양의 혈청을 고집적 분리 분취함으로써 단 시간 내 고효율의 분석(high throughput)을 달성할 수 있다.
나아가, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 암 특이적 당쇄의 분석 방법을 이용하여 암 발병 여부 및 암의 진행 정도를 판단할 수 있는 암 진단에의 응용 방법을 제공할 수 있다.
일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법은, 제1 어레이(array) 형태로 배열된 복수 개의 웰(well)을 포함하는 제1 플레이트(plate)를 제공하는 단계; 암 환자의 혈액으로부터 분리된 혈청을 포함하는 시료를 상기 제1 플레이트를 이용하여 처리하여 상기 시료로부터 하나 이상의 당쇄를 추출하는 단계; 제2 어레이 형태로 배열된 복수 개의 혼합 영역을 포함하는 제2 플레이트를 제공하는 단계; 상기 복수 개의 혼합 영역을 이용하여 상기 하나 이상의 당쇄를 매트릭스 물질과 혼합하고, 상기 복수 개의 혼합 영역 각각에 레이저를 조사함으로써 상기 하나 이상의 당쇄를 이온화하는 단계; 이온화된 상기 하나 이상의 당쇄를 전기장하에서 이동시킨 후 검출기에 의해 검출하는 단계; 상기 하나 이상의 당쇄 각각의 상기 검출기 도달 시간을 측정함으로써 상기 하나 이상의 당쇄의 제1 질량 스펙트럼을 도출하는 단계; 및 도출된 상기 제1 질량 스펙트럼을, 정상인의 혈액을 이용하여 도출된 제2 질량 스펙트럼과 비교하여 암 특이적 당쇄를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에 따른 암 진단을 위한 선별(screening)법은, 이상에 기재한 암 특이적 당쇄의 분석 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 암 진단을 위한 선별법은, 진단 대상자의 혈액을 이용하여 제3 질량 스펙트럼을 생성하는 단계; 상기 제3 질량 스펙트럼에서, 상기 제1 질량 스펙트럼 및 상기 제2 질량 스펙트럼을 이용하여 결정된 상기 암 특이적 당쇄에 대응되는 하나 이상의 피크(peak)를 도출하는 단계; 및 상기 하나 이상의 피크를 상기 제1 질량 스펙트럼 및 상기 제2 질량 스펙트럼 각각의 피크와 비교하여 상기 진단 대상자의 암 진행 정보를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법을 이용하면, 기존에 사용되는 CA125(cancer antigen 125) 등 암 예측 인자보다 특이성(specificity) 및 민감성(sensitivity)이 우수한 새로운 예측 인자로서 혈중 당쇄를 발굴할 수 있다. 또한, 복수 개의 웰이 어레이 형태로 배열된 제1 플레이트를 이용하여 시료의 전처리 과정을 수행하며, 복수 개의 혼합 영역에 어레이 형태로 배열된 제2 플레이트를 이용하여 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간 분석형(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight; MALDI-TOF) 질량 분석 과정을 수행함으로써 혈액으로부터 질량 분석까지의 전 과정을 고집적화 및 일체화하여 고효율의 분석(throughput)을 달성할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법은, MALDI-TOF 질량 분석법을 활용함으로써 당쇄의 이온화 과정에서 깨짐 현상(fragmentation)의 발생을 감소시켜 온전한 형태의 이온에 대한 질량값을 측정할 수 있으며, 매우 큰 검출 범위를 가지므로 큰 질량값을 갖는 물질의 분석이 용이하고, 다른 형태의 질량 분석법에 비하여 높은 분리능을 가지고 정확한 분석이 가능하며, 높은 감도를 달성할 수 있어 극미량의 시료에 대해서도 분석이 가능하여 소모되는 시료의 양이 매우 적은 이점이 있다.
나아가 MALDI-TOF 질량 분석법을 활용하여 측정된 데이터는 다전하(multiple charged ion)를 띄지 않고 단순한 스펙트럼으로 나타나므로 해석이 용이하며, 얻어지는 데이터의 크기가 적고 처리 속도가 빠른 장점을 가진다. 나아가, 시료에 포함되어 있는 완충 용액이나 염 등 이물질에 의한 영향이 상대적으로 적으며, 시료의 준비로부터 측정까지의 시간이 매우 짧아 많은 양의 시료 분석에 적합할 뿐만 아니라, 기기의 사용 및 유지가 쉽고 비용이 저렴한 이점이 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따른 암 진단에의 응용 방법에 의하면, 이상에 기재한 암 특이적 당쇄의 분석 방법을 이용하여 결정된 암 표지자를 이용하여 암 발병 여부 및/또는 암의 진행 정도를 판단할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법을 나타내는 순서도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에서 혈액으로부터 하나 이상의 당쇄를 분리하는 과정을 나타내는 순서도이다.
도 3a는 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에서 제1 플레이트를 극초단파(microwave)를 이용한 반응기에서 조작하는 것을 나타내는 사진이다.
도 3b는 96개 웰로 구성된 제 1플레이트의 개략도이다.
도 4는 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에서 제2 플레이트의 사용을 나타내는 사진이다.
도 5a 및 5b는 시그마사의 인간 혈청으로부터 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 의하여 얻은 대표적인 질량 스펙트럼을 나타내는 그래프들이다.
도 6a 및 6b는 각각 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 의하여 암 환자의 혈액으로부터 도출된 질량 스펙트럼과 정상인의 혈액으로부터 도출된 질량 스펙트럼을 나타내는 그래프들이다.
도 2는 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에서 혈액으로부터 하나 이상의 당쇄를 분리하는 과정을 나타내는 순서도이다.
도 3a는 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에서 제1 플레이트를 극초단파(microwave)를 이용한 반응기에서 조작하는 것을 나타내는 사진이다.
도 3b는 96개 웰로 구성된 제 1플레이트의 개략도이다.
도 4는 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에서 제2 플레이트의 사용을 나타내는 사진이다.
도 5a 및 5b는 시그마사의 인간 혈청으로부터 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 의하여 얻은 대표적인 질량 스펙트럼을 나타내는 그래프들이다.
도 6a 및 6b는 각각 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 의하여 암 환자의 혈액으로부터 도출된 질량 스펙트럼과 정상인의 혈액으로부터 도출된 질량 스펙트럼을 나타내는 그래프들이다.
이하에서, 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들에 대하여 상세히 살펴본다.
일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법은, 암 마커(marker)에 해당하는 당쇄를 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간 분석형(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight; MALDI-TOF) 질량 분석법에 의하여 분석하도록 구성될 수 있다. 암 환자의 혈액으로부터 혈청을 분리하고 이를 다시 반복 단위 분자 그룹까지 분해한 후, 분해된 조각들의 분자량 분포 및 상대적 세기들을 질량 스펙트럼으로 얻을 수 있다. 또한, 이와 같이 얻어진 질량 스펙트럼을 암 환자가 아닌 정상인의 혈청으로부터 얻은 질량 스펙트럼과 형태 분석(pattern analysis)을 통해 비교함으로써 암 특이적 당쇄를 결정할 수 있다.
나아가, 일 실시예에 따른 암 진단을 위한 선별(screening)법은 이상에 기재한 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 의하여 결정된 암 특이적 당쇄를 이용하여 진단 대상자의 암 진행 여부 및/또는 정도를 진단하도록 구성될 수 있다. 즉, 진단 대상자의 혈액으로부터 위에 기재한 과정에 의하여 질량 스펙트럼을 도출하고, 도출된 질량 스펙트럼을 이용하여 진단 대상자의 체내에서 암이 발병하였는지 및 암이 어느 단계까지 진행되었는지 등을 판단할 수 있다.
본 명세서에서 기재된 실시예들에서 암 특이적 당쇄의 분석 방법 및 암 진단을 위한 선별법은 난소암을 기준으로 하여 설명되었다. 그러나, 본 발명의 실시예들의 적용 대상이 되는 암은 난소암에 한정되는 것은 아니며, 유방암, 전립선암, 간암, 폐암, 위암, 췌장암 또는 본 명세서에 기재되지 않은 다른 모든 종류의 종양이 본 발명의 실시예의 대상이 될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법을 나타내는 순서도이다.
도 1을 참조하면, 제1 어레이 형태로 배열된 복수 개의 웰(well)을 포함하는 제1 플레이트를 제공할 수 있다(S1). 제1 플레이트는 MALDI-TOF 질량 분석을 수행하기 위한 전처리 과정으로서 시료로부터 하나 이상의 당쇄를 분리하는 과정을 수행하기 위한 수단이다. 복수 개의 웰 각각은 시료가 주입된 튜브 등 용기가 장착되거나 또는 시료가 직접 주입될 수 있는 홀(hole) 또는 홈(groove) 등으로 구성될 수 있으며, 특정 형상에 한정되지 않는다. 제1 플레이트에는 복수 개의 웰이 어레이 형태로 배열될 수 있다. 어레이 형태로 배열된 복수 개의 웰을 이용하여 많은 양의 시료를 한꺼번에 처리함으로써 시료의 처리 과정을 신속하게 수행할 수 있다.
제1 플레이트가 제공되면, 암 환자의 혈액으로부터 분리된 혈청을 포함하는 시료를 제1 플레이트를 이용하여 처리함으로써, 시료로부터 하나 이상의 당쇄를 분리할 수 있다(S2).
도 2는 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 있어 혈액으로부터 하나 이상의 당쇄를 분리하는 과정을 나타내는 순서도이다.
도 2를 참조하면, 먼저 시료를 준비하기 위하여 암 환자의 혈액으로부터 혈청을 분리할 수 있다(S21). 이를 위하여, 암 환자로부터 채혈된 혈액을 응고를 위해 일정 시간 동안 저온에 놓아 두었다가, 원심분리를 통하여 혈액에서 혈청만을 분리할 수 있다. 예를 들면, 혈액을 얼음 위에서 1시간 동안 놓아두어 혈괴(clot)가 형성되도록 한 후, 약 4℃의 온도에서 약 10분간 약 3500g의 가속도로 원심분리하여 혈청을 분리할 수 있다. 분리된 혈청의 보관이 필요할 경우에는, 혈청을 멸균 극저온 튜브에 옮겨 담은 후 영하 약 80℃의 온도에 보관할 수도 있다.
다음으로, 분리된 혈청을 포함하는 시료를 제1 플레이트의 복수 개의 웰 각각에 주입할 수 있다(S22). 본 명세서에서 주입이란 시료를 해당 영역에 직접 주입하는 것을 의미할 수도 있으며, 또는 시료가 튜브 등 다른 용기 내에 주입되어 있을 경우 시료가 주입된 용기를 해당 부분에 장착하는 것을 의미할 수도 있다. 각각의 웰에 대한 시료 주입 시 시료는 완충 용액과 혼합되어 주입될 수도 있다. 완충 용액으로는 이탄산 암모늄(ammonium bicarbonate)이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다음으로, 시료 내의 혈청을 분해 처리할 수 있다(S23). 예컨대, 시료에 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 주입하고 약 95℃의 온도로 가열하여 단백질을 변성시킬 수 있다. 또한, 단백질이 변성된 시료를 효소와 혼합시켜 단백질로부터 하나 이상의 당쇄를 분리할 수 있다(S24). 예컨대, 시료에 펩타이드 N-글리코시다제 F(peptide N-glycosidase F; PNGase F) 효소를 주입하여 효소 혼합에 의해 당쇄를 잘라낼 수 있다. 일 실시예에서는, 효소 혼합 시 시료에 극초단파(microwave)를 조사할 수도 있다. 예컨대, 극초단파는 약 37℃의 온도에서 약 400W의 세기로 약 10분간 조사될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 3a는 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에서 제1 플레이트를 극초단파를 이용한 반응기에서 조작하는 과정을 나타내는 사진이며, 도 3b는 96개 웰로 구성된 제 1플레이트의 개략도이다.
도 3a 및 3b를 참조하면, 제1 플레이트는 어레이 형태로 배열된 96개의 웰을 포함하는 96 웰 플레이트(96 well plate)일 수 있다. 도 3a에 도시되는 바와 같이, 96 웰 플레이트를 극초단파 혼합기의 챔버 내에 위치시키고 혼합기를 작동시켜 웰에 위치하는 시료에서 효소 혼합이 이루어지도록 할 수 있다. 그러나 이는 예시적인 것으로서, 제1 플레이트 및 이를 이용하여 효소 혼합을 수행하기 위한 장비의 형태는 상기 도면에 도시된 것에 한정되는 것은 아니다.
다음으로, 알코올 침전을 이용하여 시료로부터 단백질을 제거할 수 있다(S25). 이를 위하여, 시료를 무수 에탄올(absolute ethanol)과 혼합한 후 냉각시킴으로써 단백질을 침전시킬 수 있다. 예컨대, 시료와 에탄올을 약 1:4의 비율로 혼합한 후 영하 약 80℃의 저온에서 단백질을 침전시킬 수 있다. 단백질이 침전되면, 원심 분리를 통해 단백질을 제외한 상층액만을 새로운 튜브에 옮겨 추출할 수 있다. 원심 분리는 약 4℃의 온도에서 약 3500g의 가속도를 이용하여 수행될 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이상과 같이 추출된 시료는 고속 진공 건조기(speed vacuum dryer) 등을 이용하여 건조될 수도 있다.
다음으로, 건조된 시료에서 고체 상태 추출(solid phase extraction) 과정에 의하여 하나 이상의 당쇄를 용출(elute)할 수 있다(S26). 예를 들면, 흑연상 탄소 컬럼(graphite carbon column)에 증류수, 약 80% 농도의 아세토니트릴(acetonitrile; ACN) 용액 및 다시 증류수를 순차적으로 흘려넣어 준비할 수 있다. 그리고 건조된 시료를 증류수를 이용하여 녹인 후 컬럼에 넣을 수 있다. 다음으로, 컬럼에 증류수를 흘려주어 염을 제거한 후 당쇄의 용출을 위하여 ACN 용액을 주입할 수 있다. 용출을 위해 주입되는 ACN 용액은 약 10% 농도의 ACN 용액, 약 20% 농도의 ACN 용액, 또는 약 0.05% 농도의 삼불화초산 (trifluoacetic acid) 용액이 혼합된 약 40% 농도의ACN 용액 등일 수 있다. 이상의 용액은 약 4 mL 내지 약 10 mL양 만큼씩 컬럼에 주입될 수 있으며, 그 결과 하나 이상의 당쇄가 용출될 수 있다.
일 실시예에서는, 전술한 제1 플레이트를 이용한 시료의 처리 과정(S22 내지 S26) 중 하나 또는 복수 개의 단계를 수행하는 데에 있어서 제1 플레이트의 복수 개의 웰에 한 번에 물질을 분주하거나 또는/또한 복수 개의 웰로부터 한 번에 물질을 추출할 수 있는 멀티 피펫 시스템(multi pipette system)을 이용할 수 있다. 예컨대, 멀티 피펫 시스템으로는 메틀로 톨레도(Mettler Toledo) 사의 리퀴데이터 96(Liquidator 96)을 이용할 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 복수 개의 웰을 포함하는 제1 플레이트 및 멀티 피펫 시스템을 이용함으로써, 많은 양의 시료를 한꺼번에 처리할 수 있으며 공정의 규격화 및 자동화를 통해 신속하면서도 임상에 적합한 재현성 있는 결과를 얻을 수 있다.
다시 도 1을 참조하면, 제2 어레이 형태로 배열된 복수 개의 혼합 영역을 포함하는 제2 플레이트를 제공할 수 있다(S3). 각각의 혼합 영역은 시료 및 매트릭스 물질이 주입되거나 이들 물질이 주입된 튜브 등 용기가 장착될 수 있는 홀(hole) 또는 홈(groove) 등으로 구성될 수 있으며, 특정 형상에 한정되지 않는다. 혼합 영역은 복수 개가 제2 어레이 형태로 배열되므로 많은 양의 시료를 한꺼번에 처리할 수 있다. 혼합 영역의 개수는 전술한 제1 플레이트상의 웰의 개수와 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
일 실시예에서, 제1 플레이트는 96개의 웰을 포함하는 96 웰 플레이트이며, 제2 플레이트는 384개의 웰을 포함하는 384 웰 플레이트일 수 있다. 도 4는 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 있어서 제2 플레이트의 사용 형태를 나타내는 사진으로서 384 웰 플레이트를 나타낸다. 그러나 이는 예시적인 것으로서, 제2 플레이트상의 혼합 영역의 개수는 위에 기재한 것과 상이할 수 있으며 또한 제1 플레이트 상의 웰의 개수와 동일하거나 더 적을 수도 있다.
일 실시예에서, 하나 이상의 당쇄는 액체 상태에서 매트릭스 물질과 혼합되어 복수 개의 혼합 영역에 각각에 주입될 수 있다. 예컨대, 하나 이상의 당쇄와 매트릭스 물질을 모두 용해시킬 수 있는 용매상에 이들을 주입하고, 하나 이상의 당쇄와 매트릭스 물질이 동시에 혼합된 액체를 제2 플레이트상의 각 혼합 영역에 주입할 수 있다. 주입된 액체가 혼합 영역상에서 건조됨에 따라 당쇄 및 매트릭스 물질이 결정화될 수 있다.
한편, 다른 실시예에서는, 제2 플레이트의 복수 개의 혼합 영역 각각에 미리 매트릭스 물질이 주입되어 있을 수 있다. 즉, 제2 플레이트를 매트릭스 물질이 미리 복수 개의 혼합 영역에 균일하게 도포되어 프리스팟(pre-spot) 플레이트로 준비하고, 하나 이상의 당쇄를 녹인 용액을 각각의 혼합 영역에 적하하여 매트릭스 물질과 결정 상태로 혼합할 수 있다. 예컨대, 제2 플레이트는 플레이트 표면에 시료의 고집적화를 유도하기 위해 소수/친수성 물질이 처리되어 있는 마이크로포커스(u-Focus) 플레이트위에, 획득된 당쇄를 분석하기 위하여 디하이드록시벤젠산(dihydroxybenzoic acid)이 각 혼합 영역에 미리 도포되어 있는 플레이트일 수 있다. 마이크로포커스 플레이트에 대해서는 미국등록특허 제7,619,215호 및 대한민국 등록특허 제10-0544860호 및 제10-0883908호 등에 기재되어 있다.
일 실시예에서, 약 10% 및 20% 농도의 ACN 용액을 이용하여 용출된 분액(fraction)에 존재하는 당쇄는 중성 당쇄인데, 중성 당쇄는 쉽게 이온화 되지 않는 이유로 제 2 플레이트에 매트릭스를 도포시 염화나트륨을 함께 첨가하여 중성 당쇄의 MALDI-TOF 스펙트럼을 얻을 때 양극 모드에서의 이온화를 유도할 수 있다. 이때, 각 혼합 영역은 직경이 약 1700 내지 약 2000 ㎛ 이고 각 혼합 영역당 약 1.5 내지 약 2.0 ㎍ 의 매트릭스가 균일하게 도포되도록 하였다. 산성 당쇄는 약 40% 농도의 ACN 용액을 이용하여 용출된 분액에서 얻어지는데, 이 경우에는 동일한 방법으로 제 2 플레이트에 염화나트륨을 빼고 디하이드록시벤젠산만을 미리 도포하여 결정화 시킨 후 시료를 주입/혼합하여 음극모드에서 분석할 수 있다.
매트릭스 물질은 레이저로부터 에너지를 흡수하여 쉽게 이온화되는 물질로서, MALDI-TOF 질량 분석법은 매트릭스를 이용한 이온 전달 과정에 의하여 시료를 간접적으로 이온화하도록 구성된다. 예컨대, 매트릭스 물질은 레이저에 의하여 쉽게 여기(excitation)되는 구조를 갖는 유기 화합물일 수 있으며, 방향계 유기 화합물일 수도 있다. 또한, 유기 화합물을 잘 용해시키면서 시료도 잘 용해시킬 수 있도록 하기 위하여 매트릭스 물질로 둘 이상의 물질의 혼합물을 이용할 수도 있다.
MALDI-TOF 질량 분석법을 이용하여 질량 스펙트럼을 얻는 데에 있어서, 시료의 분석 감도를 극대화하기 위해서는 시료와 매트릭스 물질을 혼합한 후 혼합된 물질을 건조하여 결정화하는 시료 장착 준비 방법이 매우 중요하다. 시료와 매트릭스 물질의 상대적 혼합 비율 및 건조 속도 등 다양한 요소들이 분석에 영향을 미치게 되며, 이러한 시료 전처리 과정 중의 오차는 분석의 재현성을 떨어뜨리는 원인이 된다. 일 실시예에서는, 시료 전처리에 의한 영향을 최소화하고 간편하면서도 높은 균일성을 갖는 결정을 얻기 위하여, 분석하고자 하는 하나 이상의 당쇄가 주입될 혼합 영역에 미리 매트릭스 물질을 기계적으로 정확하게 도포한 프리스팟(pre-spot) 플레이트를 제2 플레이트로 이용할 수 있다.
제2 플레이트가 준비되면, 시료로부터 추출된 하나 이상의 당쇄를 복수 개의 혼합 영역 각각에 주입하고, 혼합 영역에 레이저를 조사하여 당쇄를 이온화할 수 있다(S4). 먼저, 도 4에 도시된 것과 같이 시료로부터 추출된 하나 이상의 당쇄를 각각의 혼합 영역에 미리 결정화 상태로 도포되어 있는 매트릭스 물질과 혼합할 수 있다. 또는, 당쇄와 매트릭스 물질을 용액상으로 혼합시킨 후 혼합영역에 주입하여 건조시켜 결정화할 수 있다. 다음으로, 각각의 혼합 영역에 레이저를 조사하여 당쇄를 이온화할 수 있다. 예컨대, 레이저는 고체형 야그(YAG) 레이저일 수도 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 매트릭스 물질의 경우 레이저로부터 에너지를 흡수하여 용이하게 이온화되는 물질로 이루어져 있으므로, 매트릭스 물질에 의한 이온 전달 과정을 통하여 하나 이상의 당쇄를 간접적으로 이온화할 수 있다.
다음으로, 이온화된 당쇄를 전기장하에서 이동시킨 후 검출기에 의해 검출할 수 있다(S5). 검출기는 제2 플레이트로부터 공간적으로 이격된 위치에 배치될 수 있으며, 당쇄로부터 생성된 이온들은 전기장에 의하여 가속되어 검출기 방향으로 이동할 수 있다. 이때, 이온들이 이동하는 제2 플레이트와 검출기 사이의 공간은 정확한 측정을 위하여 진공으로 유지될 수 있다. 시료의 용매에 따라 서로 다른 극성을 가진 이온이 검출될 수 있으며, 용매에 따라 이온에 인가되는 전기장을 양극 모드(positive mode) 또는 음극 모드(negative mode) 로 변경할 수 있다. 예컨대, 농도 약 10% 또는 약 20%의 ACN 용액이 함유된 용매는 양극 모드에서 검출할 수 있으며, 농도 약 40%의 ACN이 함유된 용매는 음극 모드에서 검출할 수 있다.
그러나 이상에 기재한 수치는 예시적인 것으로서, 시료 및 매트릭스 각각의 양, 매트릭스 물질의 종류 및 양, 또는 인가되는 전기장의 극성 등은 공지된 MALDI-TOF 질량 분석 기술을 적용함으로써 적절히 결정될 수 있다.
다음으로, 각각의 당쇄의 검출기 도달 시간을 측정함으로써 하나 이상의 당쇄의 질량 스펙트럼을 도출할 수 있다(S6). 당쇄로부터 생성된 이온들은 전기장에 의하여 가속되어 이동하는 동안 질량 대 전하비에 따라 분리된다. 따라서, 각각의 이온이 검출기에 도달하는 시간을 이용하여 해당 이온의 질량 대 전하량비를 특정할 수 있다. 이상의 과정을 하나 이상의 당쇄의 이온들에 대하여 수행함으로써, 하나 이상의 당쇄의 질량 대 전하비 및 이의 세기를 질량 스펙트럼의 형태로 도출 해 낼 수 있다.
도 5a 및 5b는, 시그마사에서 판매하는 인간 혈청으로부터, 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 의하여 도출된 질량 스펙트럼을 나타내는 그래프들이다. 도 5a는 약 10% 농도의 ACN 용액을 이용하여 용출된 하나 이상의 당쇄의 양극 모드에서의 질량 스펙트럼을 나타내며, 도 5b는 약 20% 농도의 ACN 용액을 이용하여 용출된 하나 이상의 당쇄의 양극 모드에서의 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도시되는 바와 같이, 약 1000 달톤(Da) 내지 약 3000 Da 정도의 분자량 범위에서 각 당쇄의 질량 대 전하비(m/z)의 위치 분포 및 이들의 상대적인 세기를 확인할 수 있으며 각 피크(peak)의 상대적인 높이를 확인할 수 있는 질량 스펙트럼을 얻을 수 있다. 또한, 각 스펙트럼 밑에 분자 구조가 표시되어 있고 그 각각의 구조 밑에 기재된 숫자는 이론적으로 계산한 해당 당쇄의 질량값으로서, 측정된 각 당쇄의 질량값(각 피크의 윗부분에 빨간 상자 안에 표시되어 있는 숫자)과 이론적인 계산값 사이의 편차를 측정한 결과 평균적으로 약 20×10-3 내지 50×10-3 달톤[약 20 내지 50 ppm (parts per million)] 이하의 작은 차이를 나타내었다.
또한, 제2 플레이트의 복수 개의 혼합 영역 각각에 주입된 각 10%와 20% 분액(fraction)에서 얻어진 데이터의 재현성을 살펴보기 위하여, 상이한 10개의 서로 다른 혼합 영역에 주입된 시료를 분석하여 질량 스펙트럼의 각 피크의 상대적인 세기를 비교하였다. 그 결과, 피크의 세기의 최소 편차는 약 0.49%이며 최대 편차는 약 13.7%이고 평균 편차는 약 7.5% 정도의 재현성을 얻을 수 있었다.
이상에서 설명한 과정(S1 내지 S6)에 의하여, 암 환자의 혈액으로부터 혈중 당쇄의 질량 스펙트럼을 도출하였다. 다음으로, 도출된 질량 스펙트럼을 정상인의 혈액으로부터 도출된 질량 스펙트럼과 비교하여 암 특이적 당쇄, 즉, 암 표지자를 결정할 수 있다(S7). 본 명세서에서 정상인이란, 전술한 암 환자에 대한 대조군으로서 해당 암이 발병하지 않은 것으로 판명된 임의의 피험자를 지칭한다. 정상인의 혈액의 질량 스펙트럼은 본 실시예에서 기술한 암 환자의 혈액의 질량 스펙트럼을 얻는 과정(S1 내지 S6)과 동일한 과정에 의하여 얻을 수 있으며, 또는 본 명세서에 기재되지 않은 다른 상이한 방법에 의하여 얻을 수도 있다.
하나 이상의 당쇄에 관련하여 암 환자 및 정상인 각각의 혈액으로부터 얻은 질량 스펙트럼을 패턴 분석에 의해 비교함으로써, 특정 암의 발병 및/또는 진행 정도의 지표가 되는 암 특이적 당쇄를 결정할 수 있다. 질량 스펙트럼의 패턴 분석은, 암 환자의 질량 스펙트럼에서 각 당쇄에 대응되는 피크의 세기를 정상인의 질량 스펙트럼에서 각 당쇄에 대응되는 피크의 세기와 비교하는 방법으로 이루어질 수 있으며, 또는 다른 공지된 패턴 분석 방법에 의하여 이루어질 수도 있다.
도 6a는 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 의하여 암 환자의 혈액으로부터 도출된 20% 분액의 질량 스펙트럼을 나타내며, 도 6b는 정상인의 혈액으로부터 도출된 20% 분액의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 도시되는 바와 같이 질량 대 전하비가 약 1257.42, 약 1419.47, 약 1485.53, 약 1647.59, 약 1809.64 및 약 1850.67 분자의 세기 피크가 암 환자의 경우와 정상인의 경우 상대적으로 큰 차이를 나타내는 것을 확인할 수 있어 해당 질량 대 전하비를 갖는 당쇄를 암 표지자로 결정할 수 있다.
하기 표 1은 일 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 의하여 결정된 암 표지자의 질량값 및 구조를 나타낸다.
| 질량 대 전하비 (m/z) | (※) 구조 |
| 1257.42 |
|
| 1419.47 |
|
| 1485.53 |
|
| 1647.59 |
|
| 1809.64 |
|
| 1850.67 |
|
※ 
Man, 
Hex, 
GlcNAc, 
HexNAc, 
NeuAc, 
Fuc
상기 표 1에 도시되는 것과 같이, 암 표지자로 결정된 각각의 당쇄는 만노즈(mannose; Man, 질량 대 전하비 162.05), 헥소스(hexose; Hex, 질량 대 전하비 162.05), N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine; GlcNAc, 질량 대 전하비 203.08), N-아세틸헥소사민(N-acetylhexosamine; HexNAc, 질량 대 전하비 203.08), N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid; NeuAc, 질량 대 전하비 291.09) 및 푸코스(fucose; Fuc, 질량 대 전하비 146.08) 등 여러 개의 당 중 하나 이상이 연결된 당쇄의 형태일 수 있다.
그러나, 위에 기재한 암 표지자는 단지 예시적인 것으로서 본 발명의 실시 예에 의하여 분석될 수 있는 암 특이적 당쇄는 상기 표 1에 기재된 것으로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 미국 등록특허 제7,651,847호에서 질량 분석 스펙트럼의 형태 분석에 사용된 다양한 올리고당류 당쇄들이 본 발명의 실시예에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 의하여 암 표지자로 결정될 수도 있다.
실시 예들에서는 질량 분석 효율을 높이기 위하여 어레이 형태로 웰이 배열되어 있는 제1 플레이트를 이용하여 시료의 전처리를 수행하고, 또한 어레이 형태로 혼합 영역이 배열되어 있는 프리스팟 형태의 제2 플레이트를 이용하여 MALDI-TOF 질량 분석 과정을 수행함으로써, 혈액으로부터 질량 분석까지의 전 과정을 고집적화 및 일체화하였다. 그 결과 공정의 규격화 및 자동화가 가능하게 되어 신속하면서도 임상에 적합한 재현성 있는 결과를 얻을 수 있는 이점이 있다. 예를 들어, 본 발명의 발명자들은 100명의 피험자로부터 획득한 시료를 2일 이내에 분석하여 신속하게 진단 결과를 도출할 수 있었다.
일 실시예에서는, 이상에서 설명한 암 특이적 당쇄의 분석 방법에 의하여 결정된 암 특이적 당쇄를 이용한, 암 진단을 위한 선별법을 제공할 수도 있다.
즉, 암 환자 및 정상인의 혈액을 이용하여 제1 질량 스펙트럼 및 제 2 질량스펙트럼을 각각 생성하며, 진단 대상자의 혈액을 이용하여 제3 질량 스펙트럼을 생성할 수 있다. 제1 내지 제3 질량 스펙트럼 중 하나 이상은 암 특이적 당쇄의 분석 방법의 단계(S1 내지 S6)에 기재된 것과 동일 또는 대응되는 방법으로 도출될 수 있다. 제1 내지 제3 질량 스펙트럼 각각은 반드시 하나의 질량 스펙트럼을 지칭하는 것은 아니며, 암 환자, 정상인 및 진단 대상자의 수에 따라 복수 개의 스펙트럼을 포함할 수도 있다.
다음으로, 제1 스펙트럼과 제 2 스펙트럼을 비교하여 중요한 암 표지자를 발굴하고 진단 기준을 세울 수 있다. 이는 암 특이적 당쇄의 분석 방법의 단계(S7)와 동일 또는 대응되는 과정에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 암 표지자를 결정하고 데이터베이스화하는 과정 및 암 표지자에 해당하는 피크들의 상대적 세기를 통하여 암 환자와 정상인을 구별, 판정하기 위한 판단 기준을 설정하는 과정을 포함할 수도 있다. 다음으로, 제3 질량 스펙트럼에서 암 특이적 당쇄에 대응되는 피크들의 세기를 얻어진 판단 기준에 비교하여 암 발병 여부 및/또는 암 진행 정도를 진단할 수 있다.
도 6a 및 6b를 참조하여 전술한 것과 같이, 암 환자 혈청에서 얻은 질량 스펙트럼과 정상인의 혈청에서 얻은 질량 스펙트럼은 질량 대 전하비가 약 1257.42, 약 1419.47, 약 1485.53, 약 1647.59, 약 1809.64 및 약 1850.67 분자량에서 피크의 세기 등이 차이가 있음을 볼 수 있다. 따라서, 암 환자와 정상인의 질량 스펙트럼에서 암 특이적 당쇄의 피크 차이를 암의 종류 및 진행 정도에 따라 미리 시료들을 같은 방법으로 분석하여 데이터베이스화하여 판단 기준을 설정한 다음, 진단 대상자의 혈액으로부터 도출된 질량 스펙트럼을 이 판단 기준과 비교하여 진단 대상자의 암 발병 여부 및/또는 진행 정도 등을 진단할 수 있다.
| 실제 환자 혈청수 (41) | 정상인 혈청수 (30) | 전체 (71) | |
| 양성 판정 (환자로 판정) |
진양성 (31) CA125 (-)1:8, (+)2:23 |
위양성 (4) | 양성 예측률= 89% 진양성/(진양성+위양성) |
| 음성 판정 (정상으로 판정) |
위음성 (10) CA125 (-): 3, (+): 7 |
진음성 (26) | 음성 예측률= 72% 진음성/(위음성+진음성) |
| 민감도(Sensitivity) (31/41) = 76% CA125 계 (-): 11, (+): 30 |
특이도(Specificity) (26/30) = 87% |
적중률 = 80% (진양성+진음성)/전체 |
1. CA125 (-)는 그 농도가 35 IU(international unit)/mL 미만임을 뜻한다.
2. CA125 (+)는 그 농도가 35 IU/mL와 같거나 그 이상임을 뜻한다.
위 표 2는 71명의 각기 다른 인간 혈청을 사전정보 없이 공급받아 일 실시예에 따른 방법을 활용하여 판정한 결과를, 판정 이후에 입수된 받은 각 혈청의 실제 정보와 비교하여 얻은 결과 값이다.
먼저 판단 기준을 설정하기 위해, 1차로 난소암 환자 30명과 정상인 22명의 혈청을 공급받아 10% 분액과 20%의 분액에서 표 1에서 언급한 피크(peak)들을 비롯한 총 52개의 암 표지자 피크들을 설정한 다음, 이 피크들의 암 환자와 정상인에 있어서의 상대적 세기를 비교하여 환자와 정상인을 구별, 판정하기 위한 판정 기준을 설정하였다.
다음 2차로 진단 대상자(암 환자와 정상인 합하여 모두 71명)의 혈청을 사용하여 10% 분액과 20%의 분액에서 각각의 제3질량 스펙트럼을 얻었고, 여기에서부터 상기 언급한 52개의 피크에서의 상대적 세기 값을 구한다음, 그 각 각을 판정 기준에 대입하여 판정하였다. 즉, 52개 피크에서의 상대적 세기를 암 환자의 피크 및 정상인의 피크와 각각 비교하여 암 환자 또는 정상인 중 어느 쪽에 근접한지를 비교하였으며, 52개 피크 전체의 비교 결과를 종합하여 판정 결과를 도출하였다.
이때 하나의 혈청을 복수의 분액 및/또는 웰 플레이트상의 복수의 웰을 이용하여 분석할 수도 있다. 본 발명의 발명자들은 하나의 혈청으로부터 10% 분액 및 20% 분액을 각각 얻고, 10% 분액 및 20% 분액을 각각 웰 플레이트상의 3개의 웰에 주입함으로써 하나의 혈청이 총 6개의 웰에서 분석되도록 하였다. 각 분액이 3개의 웰에 주입되어 있으므로 52개의 암표지자에 대응되는 총 156개까지의 피크가 얻어지며, 동일 암표지자에 대응되는 피크들 각각의 값을 이용하여 판정 결과를 도출함으로써, 질량 스펙트럼을 얻는 과정에서의 편차를 최소화하고자 하였다. 또한, 하나의 혈청에 대해 전술한 과정을 복수 회 수행하여 판정 결과를 도출할 수도 있다. 그러나 이는 단지 예시적인 것으로서, 분액의 종류나 개수, 각 분액이 주입되는 웰의 개수, 및 판정의 반복 회수 등은 판정의 목적이나 특성을 고려하여 적절하게 결정될 수 있으며, 본 명세서에 기재한 것에 한정되는 것은 아니다.
이상의 과정에 의한 판정 결과는 숫자로 표현되며, 이를 환자근접률(%)이라고 명명하였다. 이렇게 각각의 인간혈청에서 도출된 환자근접률이 50.0% 이상이면 양성, 즉 환자로 판정하고, 50.0% 미만이면 정상인으로 판정하였다. 또한 환자인 경우에는 판정 후에 입수된 각 혈청의CA125 농도를 35 IU/mL 이상인 혈청의 숫자와 35 IU/mL 미만인 경우를 헤아려 표시하였다. 이 때 정상인 혈청들인 경우에는 CA125 농도가 모두 35 IU/mL 미만이었다.
위 결과를 검토할 때, 일 실시예에 의한 판정결과 양성 예측률이 89%, 특이도가 87%인 것, 또한 적중률이 80%라는 것 그리고 민감도 76%가, CA125 농도로 판정한 민감도 73%[=(23+7)/41]보다 우수하다는 것을 알 수 있다. 그리고 이 결과는 단지 52명만의 혈청을 데이터베이스로 판정하였다는 것을 고려하면, 향후 더욱 획기적인 진전이 기대된다.
본 명세서에서, 실시예들에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법은 도면에 제시된 순서도를 참조로 하여 설명되었다. 간단히 설명하기 위하여 상기 방법은 일련의 블록들로 도시되고 설명되었으나, 본 발명은 상기 블록들의 순서에 한정되지 않고, 몇몇 블록들은 다른 블록들과 본 명세서에서 도시되고 기술된 것과 상이한 순서로 또는 동시에 일어날 수도 있으며, 동일한 또는 유사한 결과를 달성하는 다양한 다른 분기, 흐름 경로, 및 블록의 순서들이 구현될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 기술되는 방법의 구현을 위하여 도시된 모든 블록들이 요구되지 않을 수도 있다.
나아가, 실시예들에 따른 암 특이적 당쇄의 분석 방법 및 이를 이용한 암 진단을 위한 선별법의 일부 측면은 일련의 과정들을 수행하기 위한 컴퓨터 프로그램의 형태로 구현될 수도 있으며, 상기 컴퓨터 프로그램은 자기 기록 매체 또는 광학 기록 매체 등 컴퓨터로 판독 가능한 기록 매체에 기록될 수도 있다.
이상에서 살펴본 본 발명은 도면에 도시된 실시예들을 참고로 하여 설명하였으나 이는 예시적인 것에 불과하며 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 실시예의 변형이 가능하다는 점을 이해할 것이다. 그러나, 이와 같은 변형은 본 발명의 기술적 보호범위 내에 있다고 보아야 한다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해서 정해져야 할 것이다.
Claims (2)
- 제1 어레이 형태로 배열된 복수 개의 웰을 포함하는 제1 플레이트를 제공하는 단계;
암 환자로부터 채취된 혈액으로부터 분리된 혈청을 포함하는 시료를 상기 제1 플레이트를 이용하여 처리하여 상기 시료로부터 하나 이상의 당쇄를 추출하는 단계;
제2 어레이 형태로 배열된 복수 개의 혼합 영역, 및 상기 복수 개의 혼합 영역 각각에 결정화 상태로 도포되며 레이저로부터 에너지를 흡수하여 이온화되는 매트릭스 물질을 포함하는 제2 플레이트를 제공하는 단계;
상기 복수 개의 혼합 영역을 이용하여 상기 하나 이상의 당쇄를 상기 매트릭스 물질과 혼합하고, 상기 복수 개의 혼합 영역 각각에 레이저를 조사함으로써 상기 하나 이상의 당쇄를 이온화하는 단계;
이온화된 상기 하나 이상의 당쇄를 전기장하에서 이동시킨 후 검출기에 의해 검출하는 단계;
상기 하나 이상의 당쇄의 상기 검출기 도달 시간을 측정함으로써 상기 하나 이상의 당쇄의 제1 질량 스펙트럼을 도출하는 단계; 및
도출된 상기 제1 질량 스펙트럼을, 정상인으로부터 채취된 혈액을 이용하여 도출된 제2 질량 스펙트럼과 비교하여 암 특이적 당쇄를 결정하는 단계;
진단 대상자로부터 채취된 혈액을 이용하여 제3 질량 스펙트럼을 생성하는 단계;
상기 제3 질량 스펙트럼에서, 상기 제1 질량 스펙트럼 및 상기 제2 질량 스펙트럼을 이용하여 결정된 상기 암 특이적 당쇄에 대응되는 하나 이상의 피크를 도출하는 단계; 및
상기 하나 이상의 피크를 상기 제1 질량 스펙트럼 및 상기 제2 질량 스펙트럼 각각의 피크와 비교하여 상기 진단 대상자의 암 진행 정보를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 암 진행 정보는, 암 발병 여부 및 암 진행 단계 정보 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
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