KR20130065900A

KR20130065900A - 망막 질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20130065900A
Application number: KR1020110132500A
Authority: KR
Inventors: 이종우
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2011-12-12
Filing date: 2011-12-12
Publication date: 2013-06-20
Anticipated expiration: 2031-12-12
Also published as: KR101420751B1

Abstract

본 발명은 망막 질환의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 상세하게는, 다음 단계를 포함하는 망막 질환의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법이다: (a) (i) Arf72A[ADP(Adenosine diphosphate) Ribosylation Factor 72A] 유전자 또는 단백질, 또는 (ii) Arl1(ADP-ribosylation factor-like protein 1) 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현량, Arf72A 또는 Arl1 단백질의 양 또는 Arf72A 또는 Arl1 단백질의 활성을 측정하는 단계. 상기 Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현량, Arf72A 또는 Arl1 단백질의 양 또는 Arf72A 또는 Arl1 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시험물질은 망막 질환의 치료제 후보물질로 판정된다. 본 발명에 따르면, 망막질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.

Description

망막 질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법{Methods for Screening Therapeutic Candidates of Retinopathy}

본 발명은 망막 질환의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

진핵세포의 소포체(Endoplasmic Reticulum; ER)는 분비단백질(secreted proteins)을 합성하고 그 단백질의 폴딩(folding) 상태를 확인하는 장소로 기능한다(Hebert and Molinari, 2007). 세포의 생존에 있어, 소포체는 소포체로부터 배출되는 단백질이 제대로 폴딩되었는지 확인하는 소포제 품질관리(ER quality control)라 불리는 진핵세포의 감시기작을 작동하기 때문에 필수적으로 중요하다. 일부 소포체 단백질은 소포체에서 미스-폴딩된 단백질은 인식하는 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. UDP-글루코즈-당단백질 당 전이효소(UDP-glucose-glycoprotein glycotransferase)는 소수성 백본(backbone)의 친수성 탄수화물(Trombetta and Helenius, 1999) 및 Bip/Hsc3을 통해 합성되는 당단백질의 폴딩 상태를 인식하는 것으로 알려져 있다(N. ichikawa et al., 2001; Ryoo et al., 2007). 미스-폴딩된 단백질을 발견되면, 소포체는 복합적인 체크포인트 기작(Vashist and Ng, 2004)을 통해 격리시키고, 유비퀴틴(ubiquitin)/프로테오솜(proteosome) ERED(Ⅰ) 및 자식작용(autophagy)/리소좀(lysosome) ERAD(Ⅱ)을 포함하는 소포체-관련 변성(Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation; ERAD) 경로를 통해 분해한다(Hiller et al., 1996; Fujita et al., 2007).

COP(Ⅱ)-코팅된 소낭(vesicle)은 소포체의 소낭 버딩(budding)에 관련된다. 지질 대사의 국부적 변화에 의해 Sar1과 같은 스몰(small) GTPase가 수용기(adaptor) 단백질 및 코트 복합체의 소포체막 결집 가능하게하고 소포체로부터 소낭 버딩을 조절한다고 보고되어있다(Cai et al., 2007). 소포체로부터 분비되는 소낭 전송의 분자적 기작에 대한 많은 연구가 되어있음에도 불구하고, 분해되기 위해 분비되는 카고(cargo) 단백질을 조절하는 분자적 기작은 잘 알려져 있지 않다. 즉, 분해되는 카고 단백질과 관련된 어떠한 코트 단백질 및 스몰 GTPase도 보고되어 있지 않다. 그러므로 소포체에서 특정한 경로(pathway)로 카고 단백질의 이동을 결정하는 분자적 기작에 대한 연구가 필요하다.

중요하게도, 분비단백질에 대한 소포체 품질관리 및 전송 시스템의 오작동(malfunctioning)은 많은 인간의 질병과 밀접한 관련이 있다(Hebert and Molinari, 2007; Kaufman, 2002). 진핵세포는 비-폴딩 단백질 반응(Unfolded Protein Response; UPR)이라 불리는 단백질-폴딩능이 잘못되는 것을 방지하는 보호기작을 갖는다(Ron, 2002). 그러나, 유전적 소인이나 병리학적 상태는 ERAD 기작(Travers et al., 2000)을 포함하는 UPR의 기능을 쉽게 압도할 수 있어, 소포체에 미스-폴딩된 단백질이 축적되게 된다. 스트레스 상태는 많은 인간 질병과 관련 있다(Hebert and Molinari, 2007; Kaufman, 2002). 예컨대, 로돕신의 돌연변이는 상염색체-우성 색소성 망막염(Autosomal-dominant Retinitis Pigmentosa; ADRP) 발병 케이스의 약 25%를 차지한다(Inglehearn et a., 1998). 미스-폴딩되거나 불안정한 돌연변이 로돕신은 야생형 로돕신의 성숙을 간섭 할 수 있으며, 이러한 세포 상태는 망막 변성를 유도하는 것으로 알려져 있다. 초파리(Drosophila)의 동등한 돌연변이의 경우 또한 연령-의존(age-dependent) 망막 변성을 유도하므로, 이는 초파리가 다른 광변환(빛이 전기적 신호로 변환) 생리학을 가짐에도, 이러한 돌연변이를 갖는 광수용체는 사람과 같은 기작을 통해 죽게 된다(Colley et al., 1995a; Kurada and O'Tousa, 1995). 이는 초파리 모델을 인간 질환뿐 아니라 세포내 전송의 본질적 문제를 연구하는데 적용될 수 있음을 뒷받침한다.

초파리에서, arf72A 유전자는 포유류 Arl1의 동족체이다(Eisman et al., 2006; Li et al., 2004). arf72A는 Arf1과 55% 상동성을 갖으며 효모 및 포유류의 Arl1과 70-80%의 상동성을 갖는 필수적인 GTP-결합 단백질을 코딩하나, 콜레라 톡신 공동인자 활성과 같은 ARF(Acute Renal Failure) 활성 또는 치명적인 이중 돌연변이 Arf1을 구하는 능력은 결핍되어 있다(Tamkun et al., 1991). Arl1의 기능은 골지 복합체에 위치하고 Arf1과 작용기를 공유하는 것으로, arf72A도 유사하게 엑소시토시스(exocytosis) 및 엔도시토시스(endositosis)에 대한 소낭 전송에 관련될 것이라고 추정된다(Munro, 2005; Liu et al., 2006; Burd et al., 2004). arf72A는 arf-유사 유전자 중 첫 번째로 클로닝 되었지만, 초파리에서 그의 세포적 기능은 동물 발생 및 중심체 순환(centrosome recycling)에 관련한다는 것을 제외하면 거의 알려져 있지 않다(Eisman et al., 2006). arf72A 유전자의 돌연변이에 의해 유도되는 치사율로 인해 초파리의 돌연변이를 연구하는데 어려움이 있다. 그러므로, 초파리 눈에서 FLP-FRT(Flippase recombination enzyme-Flippase Recognition Target) 시스템을 이용한 모자이크 분석 및 RNAi를 이용한 녹-다운(knock-down)으로 arf72A의 세포적 기능을 설명하는 독특한 접근접이 제시되었다(Stowers and Schwarz, 1999).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자는 망막 질환을 개선 또는 치료하고자 예의 노력한 결과, 포유류 유전자인 Arl1과 유사한 초파리의 arf72A 유전자의 돌연변이 연구를 통해, 상염색체 우성 망막병증 초파리 모델의 광수용체 세포에서 arf72A를 억제하는 경우, 망막 변성(retinal degradation)를 억제시키는 결과를 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 망막 질환의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 망막 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 망막 질환의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) (i) Arf72A[ADP(Adenosine diphosphate) Ribosylation Factor 72A] 유전자 또는 단백질, 또는 (ii) Arl1(ADP-ribosylation factor-like protein 1) 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현량, Arf72A 또는 Arl1 단백질의 양 또는 Arf72A 또는 Arl1 단백질의 활성을 측정하는 단계;

상기 Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현량, Arf72A 또는 Arl1 단백질의 양 또는 Arf72A 또는 Arl1 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시험물질은 망막 질환의 치료제 후보물질로 판정된다.

본 발명자들은 망막 질환을 개선 또는 치료하고자 예의 노력한 결과, 포유류 유전자인 Arl1과 유사한 초파리의 망막 관련 유전자의 돌연변이 연구를 통해, 상염색체 우성 망막병증 초파리 모델의 광수용체 세포에서 arf72A를 억제하는 경우, 망막 변성(retinal degradation)를 억제시키는 결과를 규명하였다.

본 발명의 망막 질환의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 각각의 단계로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): (i) Arf72A 유전자 또는 단백질, 또는 ( ii ) Arl1 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉

본 발명에 따르면, (i) Arf72A 유전자 또는 단백질, 또는 (ii) Arl1 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시킨다.

상기 세포는 다양하게 준비될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용될 수 있는 세포에는 감각 전송 세포(sensory transducer cells)이고, 가장 바람직하게는, 광수용체 세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 초파리의 광수용체 세포를 분리하여 이용하였다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”는 Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현량, Arf72A 또는 Arl1 단백질의 양 또는 Arf72A 또는 Arl1 단백질의 활성에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

단계 (b): Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현량, Arf72A 또는 Arl1 단백질의 양 또는 Arf72A 또는 Arl1 단백질의 활성을 측정하는 단계

이어, 시료가 처리된 세포에서 Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현량, Arf72A 또는 Arl1 단백질의 양 또는 Arf72A 또는 Arl1 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시험물질은 망막 질환의 치료제 후보물질로 판정될 수 있다.

Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 제1쇄 cDNA를 제조한다. 이어, 제1쇄 cDNA를 주형으로 이용하고, Arf72A 또는 Arl1 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현량 변화를 측정한다.

Arf72A 또는 Arl1 단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, Arf72A 또는 Arl1 단백질의 양의 변화는 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 판정된 망막 질환의 치료제 후보물질은 망막 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다.

바람직하게는, 상기 망막 질환은 망막병증, 상염색체 우성 망막병증(autosomal-dominant retinopathy), 어셔 증후군, 스타가트병(Stargardt disease), 바렛-비들 증후군, 베스트병, 맥락막 결여, 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 망막색소변성증, 망막 황반성 퇴화증, 레베르선천성흑내장(Leber Congential Amaurosis; Laber's Hereditary Optic Neuropathy), BCM(Blue-cone monochromacy), 망막층간 분리, ML(Malattia Leventiness), 오구치병(Oguchi disease) 또는 레프섬병(Refsum disease)이며, 가장 바람직하게는 망막병증 또는 상염색체 우성 망막병증이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) Arf72A[ADP(Adenosine diphosphate) Ribosylation Factor 72A] 유전자의 발현 억제제 또는 Arf72A 단백질의 활성 억제제, 또는 (ii) Arl1(ADP-ribosylation factor-like protein 1) 유전자의 발현 억제제 또는 Arl1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 억제제는 소포체에서 로돕신을 정상적으로 성숙 및 배출시킨다.

바람직하게는, 상기 망막 질환은 망막병증, 상염색체 우성 망막병증(autosomal-dominant retinopathy), 어셔 증후군, 스타가트병(Stargardt disease), 바렛-비들 증후군, 베스트병, 맥락막 결여, 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 망막색소변성증, 망막 황반성 퇴화증, 레베르선천성흑내장(Leber Congential Amaurosis; Laber's Hereditary Optic Neuropathy), BCM(Blue-cone monochromacy), 망막층간 분리, ML(Malattia Leventiness), 오구치병(Oguchi disease) 또는 레프섬병(Refsum disease)이고, 가장 바람직하게는, 망막병증 또는 상염색체 우성 망막병증이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은, Arf72A(서열목록 제1서열) 또는 Arl1(서열목록 제2서열)의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 Arf72A 또는 Arl1 mRNA의 서열에 상보적이고 Arf72A 또는 Arl1 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, Arf72A 또는 Arl1 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6내지 100 염기이고, 바람직하게는 8내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol ., 5(3):343-55(1995)). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어 "RNAi"는 바람직하게는, "siRNA”로, "siRNA”는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(8-10).

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(Arf72A 또는 Arl1 mRNA 서열에 상응하는 (corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(Arf72A 또는 Arl1 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다.

siRNA 말단 구조는 Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, Arf72A 유전자의 발현 억제제 또는 Arl1 유전자의 발현 억제제는 상기 Arf72A 유전자 또는 Arl1 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA이고, 가장 바람직하게는 siRNA 이다. 본 발명의 siRNA 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제3서열 및 제4서열의 뉴클레오타이드 서열의 이중쇄 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 (예컨대, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여)할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 망막 질환의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법 및 망막 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 광수용체 세포의 소포체와 골지 복합체 간의 분비단백질 수송 및 소포체 품질 관리과 관련된 arf72A82의 역할을 규명하였다.

도 1은 초파리 광수용체 세포에서 ARF72A 단백질이 골지 복합체에 위치함을 확인한 결과이다. 도 1a는 초파리 낱눈의 횡단면(위) 및 종단면(아래)을 도식으로 나타낸 그림이다. 하나의 낱눈은 중심에 위치한 R7 및 R8을 둘러싼 R1-R6 세포로 모두 8개의 광수용체 세포로 구성된다. 도 1b는 UAS::RFP-arf72A/UAS::Rab6-GFP; Rh::Gal4의 망막으로부터 분리한 낱눈을 공촛점 현미경으로 관찰한 결과이다. 화살표는 RFP-ARF72A(빨간색) 형광을 가리키며, 이는 골지 마커인 Rab6-GFP(초록색) 형광과 같이 위치함을 나타낸다.
도 2는 arf72A 돌연변이 광수용체에서 모자이크 망막을 내부 막-관련한 감소를 보여준다. 도 2a는 arf72A 모자이크 망막을 발생시키기 위한 도식을 나타낸다. 도 2b는 모자이크 망막의 전자현미경 그림을 보여준다. 하나의 낱눈에 야생형 및 돌연변이 광수용체 세포가 존재하였다. 라브도미어 아래의 색소 입자가 존재(b, 화살표)하는 것은 광수용체가 야생형임을 말한다. 야생형 소포체(c, 화살표)는 균일한 소포체 막 구조를 보여준다. arf72A 돌연변이 세포(d, 화살표)는 증식된 내부 막 및 변형된 조면소포체의 막 구조를 보여준다.
도 3은 arf72A의 결핍에 의한 과-증식 골지 복합체를 보여준다. Rab6-GFP의 위치는 야생형(a) 및 arf72A 돌연변이(b)의 광수용체 세포에서 관찰되었다. 하나의 낱눈을 공촛점 현미경으로 가시화하였다. 야생형 광수용체 세포는 초파리 조직의 특징인 세포질 전체에 간간이 GFP 염색을 나타내지만, 돌연변이 세포는 사이즈나 수 적으로 확장된 GFP 염색을 보여준다. 낱눈의 중간에 나타나는 빨간색 선은 구조적 단백질 간의 고정-유도 교차-연결(fixation-induced cross-link)에 의해 라브도미어의 자가형광을 보여준다.
도 4는 GFP-표지된 로돕신이 야생형 세포에서보다 돌연변이 세포에서 목적지로 더 빠르게 이동함을 보여준다. 도 4a는 로돕신이 소포체로부터 최종 목적지인, 라브도미어(빨간색)에 도달하는 과정의 도식화하여 보여준다. 도 4b 및 도 4c는 eyFLP; arf72A, UAS::Rh1-GFP, Rh1::GAL4, 80B FRT/TM2(평형 이형접합체) 및 eyFLP; arf72A, UAS::Rh1-GFP, Rh1::GAL4, 80B FRT/GMR::hid, 80B FRT(arf72A 돌연변이 세포만으로 구성된 망막을 갖는 모자이크 파리)를 이용한 비타민 A 구조 실험 결과를 보여준다. 각 20 마리의 야생형 및 arf72A 돌연변이 광수용체 세포를 GFP-표지된 로돕신의 세포 내 분포에 따라 분류하였다. 도 4b는 Ⅰ형 광수용체 세포는 Rh1-GFP가 주로 세포질에 존재하고, Ⅱ형 광수용체 세포는 Rh1-GFP가 세포질 및 라브도미어에 존재하며. Ⅲ형 광수용체 세포는 Rh1-GFP가 주로 라브도미어에 존재한다. 도 4c는 시간에 따른 야생형 및 arf72A 돌연변이 세포에서 라브도미어로의 로돕신 전송을 측정한 결과를 그래프로 보여준다. Ⅱ형 및 Ⅲ형 광수용체 세포를 매 6시간 마다 확인하였다. 화살표 및 삼각형 화살표는 각각 세포질 로돕신 염색 및 라브도미어의 로돕신 염색을 보여준다.
도 5는 소포체에서 카고 분자의 폴딩 상태를 구별하는 arf72A의 기능을 확인한 결과를 보여준다. 도 5a는 arf72A가 ninaE^D1/+ 광수용체 세포의 소포체 막에 위치함을 보여준다. ninaE^D1/+ 광수용체 세포에서 UAS::RFP-arf72A 및 UAS::Rh1-GFP를 Rh1::GAL4로 과발현 하였다. 야생형과 다르게, ninaE^D1/+ 광수용체 세포에서 RFP-ARF72A는 핵 주위 소포체에 해당하는 핵 주위 영역에서 강하게 염색되어 세포질 Rh1-GFP와 겹침을 보여준다. 도 5b는 ninaE^D1/+ 광수용체 세포에서 arf72A의 결핍은 ER 품질관리를 우회하는 결과를 보여준다. GFP-표지된 로돕신이 야생형 및 ninaE^D1/+ 광수용체 세포에서 라브도미어에만 존재함을 보여준다. ninaE^D1/+ 이중-돌연변이 광수용체 세포에서 GFP-표지된 세포질 로돕신은 완전히 라브도미어로 전송되었다. 도 5c는 arf72A-RNAi/ninaE^D1/+ 광수용체 세포에서 소포체 축적된 로돕신은 소포체의 품질관리를 우회하는 결과를 보여준다. 1일된 파리의 머리에서 GFP 항체를 이용하여 로돕신을 검출하였다. w¹¹¹⁸및 ninaE¹¹⁷ 파리 눈을 음성 대조군으로 사용하였다. 야생형(3 열)과 비교하여, ninaE^D1/+는 GFP-표지된 로돕신의 총 양을 감소시키나, 미성숙 로돕신은 증가하였다(4 열). arf72A-RNAi/ninaE^D1/+ 이중-돌연변이(arf72A-RNAi/UAS;;Rh1-GFP, Rh1::Gal4, ninaE^D1) 망막은 로돕신의 레벨이 보다 감소하였으나, 성숙 로돕신은 증가하였다(5 열).
도 6은 arf72A의 결핍이 ninaE^D1/+ 광수용체 세포에서 막 결함을 구조하는 것을 확인한 결과를 보여준다. 세포 내 구조를 확인하기 위해, 1일된 파리의 머리를 전자 현미경 분석하고자 임베드(imbedded)하였다. 도 6a 내지 도 6c의 ninaE^D1/+ 광수용체 세포는 우성 ninaE^D1/+ 돌연변이의 특징인 대량의 막 축적(화살표)를 보여준다. 도 6d 내지 도 6f는 ninaE^D1/arf72A-RNAi 이중 돌연변이(+ 광수용체 세포에서 막 축적이 상당히 감소되었다(도 6e, 화살표) 또한, 이중-돌연변이 광수용체 세포의 형태는 arf72A 돌연변이 광수용체 세포와 유사함을 보여준다(도 6f, 화살표).
도 7은 arf72A의 결핍이 ninaE^D1-유도 망막 변성를 구조하는 것을 보여주는 결과이다. 망막 변성의 정도를 확인하기 위해, 23일된 파리의 머리를 전자 현미경 분석하고자 임베드하였다. ninaE^D1/+ 망막의 arf72A 기능의 결핍은 낱눈의 광수용체 세포의 보존에 의해 낱눈의 인테그리티(integrity)가 상당히 향상됨을 보여준다. 도 7a는 Rh1 :: GAL4 , UAS :: Rh1 - GFP , ninaE ^D1 /+, 도 7b는 UAS :: arf72A - RNAi ; Rh1 :: GAL4 및 UAS :: Rh1 - GFP / ninaE ^D1 이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

초파리 주 및 초파리 유전자형

초파리는 비타민 A 구조실험(rescue experiment)에 사용한 파리를 제외하고 모두 25℃ 인큐베이터 안의 표준 음식 하에 성장하였다. 표준 유전학을 다음의 유전자형을 발생시키는데 사용하였다:

w¹¹¹⁸은 야생형주로, ninaE¹¹⁷은 로돕신 결핍(null)주, ninaE^D1은 ninaE 우성 돌연변이주, arf72A¹은 arf72A 결핍주로, P[GD6768]v17826은 arf72A 녹-다운주로 사용하였다. 평형 염색체(balancer chromosome)는 Lindsley 및 Zimm이 보고한 방법을 이용하였다(1992). arf72A 모자이크 파리는 p[ry ⁺ ;hs-neo;FRT]80B FLP 재조합효소 타겟 염색체를 갖는 arf72A 염색체에 의해 제조되었다(Stowers and Schwarz, 1999). 제조된 염색체는 그 후에 yweyFLP; FRT 80B 또는 yweyFLP; FRT80B GMR::hid FRT를 갖는 스몰 또는 메가 패치를 제조하는데 사용하였다. 두 번째 및 세 번째 염색체의 Rh1::GAL4 드라이버 삽입은 Tabuchi et al.(2000)에 의해 제조된 Rh1::GAL4 주로부터 유래하였고, arf72A 녹-다운 컨스트럭트 및 세포의 마커를 포함하는 다양한 UAS 타겟의 과발현을 위해 사용하였다. UAS::Rh1-GFP는 Pichaud 및 Desplan(2001)의 prh1::eGFP를 사용하여 제조하였다. Rh1::GAL4 및 UAS::Rh1-GFP를 재조합하여 FRT arf72A 주에 삽입하였다. Rh1::GAL4 드라이버 및 UAS::Rh1-GFP를 삽입한 GFP 형광의 존재 및 Rh1::GAL4 드라이버의 이후 발생에서 w+ 양적 증가로 새로운 염색체를 확인하였다.

트랜스제닉 동물의 발생

게이트웨이 시스템(Invitrogen, 미국)을 이용하여 arf72A에 대한 특이적인 프라이머를 디자인하였다. 역방향 프라이머에 arf72A의 아미노기 말단 및 스탑 코돈에 RFP(Red Fluorescent Protein)을 포함하는 것을 제외하고 나머지는 pENRT TOPO 벡터(Invitrogen, 미국) 및 최종 벡터인 pTRW(Carnegie Institute of Washington, 미국)에 제조자의 지시에 따라 직접 클로닝하였다. 플라스미드 추출은 양성 클론으로부터 Qiagen 키트(미국)를 이용하여 실시하였다. 주입(injection) 후에, G0 세대의 파리를 w;SM1/Sco; TM2/Sb 평형 파리와 교배하였다. 교배의 자손 중 mini-w⁺눈을 분류하였다. Mini-w⁺를 이식유전자의 존재를 확인하는 마커로 사용하였다. Mini-w⁺ 눈을 갖는 파리(G1 세대)를 w¹¹¹⁸과 교배하여 이식유전자의 위치를 맵핑하였다. w¹¹¹⁸파리의 교배 후에, Mini-w⁺ 파리를 드라이버 스톡(stock)과 교배하였다. 모든 경우에, Mini-w⁺ 파리를 이식 유전자의 과발현을 위해 cnbw/cnbw; Rh1::GAL4, UAS::Rh1-GFP/Ubx130 es emc2와 교배하였다.

광학 현미경 및 전자 현미경

초파리 눈을 촬영하는데 SV 스테레오현미경(Zeiss, 미국) 및 스폿 RTKE 디지털 현미경 카메라(Diagnostic Instruments, 미국)를 사용하였다. 파리 눈은 Wachburn 및 O'Tousa(1992)가 기재한 방법에 따라 전자 현미경을 위한 샘플로 준비하였다. 전자 현미경을 위한 섹션은 80-100 ㎚ 두께로 하였으며, 5% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)가 첨가된 50% 에탄올로 첫 번째 염색하고, 레이놀드 리드 시트르산(Renold's lead citrate)에 정치하였다. 전자 현미경은 히타치(Hitachi) H600(미국) 또는 Tecnai G2 F30(FEI, 미국) 전자현미경을 이용하였다. 모든 전자현미경 사진은 낱눈을 R1-R6 광수용체 핵의 깊이에 교차-섹션하여 나타내었다.

전체-마운트(whole-mount) 낱눈 분리 및 형광 현미경

48시간 안에 이클로즈(eclose)된 파리를 희생하였다. 전체-마운트 낱눈(ommatidia) 분리를 위해, 파리 머리를 몸체로부터 분리하였다. 파리 머리를 두개골(sagittal) 절단하여 이등분하였다. 뇌 및 주둥이를 제거하였다. 눈을 1×PBS(Phosphate Buffered Saline)가 있는 현미경 슬라이드에 올려두었다. ER-트랙커^TM 블루-화이트 DPX(Invitrogen, 미국) 염색을 위해, 슬라이드에 두기 전에, 파리 눈을 ～1 μM ER-트랙커에 20분 동안 배양하고, 1×PBS로 30분 동안 세척하였다. 날카로운 플래티넘 바늘을 이용하여 낱눈을 분리하고, 망막의 큰 부분을 풀어주었다. 고정액(0.5% 파라포름알데하이드) 처리 전에 비망막 조직을 제거하고, 마운팅 배지(Vector Laboratories, 미국)를 첨가하였다. 바이오-래드 MRC 1024 스캐닝 공촛점(2 channel/LaserSharp 3.2 program/networked) 시스템(Hercules, 미국) 또는 LSM5 파스칼 레이저 스캐닝 현미경(Carl Zeiss, 독일)을 이용하여 각각의 낱눈을 관찰하였다. 광학 이미지는 ×100 오브젝티브이다.

비타민 A 구조(rescue)

Nicols 및 Pak(1985)이 보고한 방법에 따라 파리를 비타민 A 부족 단순배지(270 ㎖ 증류수, 230 ㎖ 포도주스, 11 g 박토-아가(Bacto-agar), 3 g 글루코즈(glucose), 1 g 수크로즈(sucrose), 0.5 g 프럭토즈(fructose), 1 g 효모)에서 배양하였다. 생겨난 파리를 물을 적신 면으로 구성된 새로운 유리병에 옮겨 24시간 동안 금식시켰다. 금식한 파리를 전-트랜스-레티놀(all-trans-retinol)로 구성된 유리병으로 옮기고, 해부 전 24시간 동안 차광상태를 유지하였다. 전-트랜스-레티놀(Sigma, 미국)은 95% 에탄올에 용해(10 ㎎/㎖)하고, 1% 수크로즈 용액에 희석하여 최종농도는 2 ㎎/㎖로 하였다.

웨스턴 블럿 분석

2일된 표본으로부터 파리 머리를 수집하여 용해 버퍼(1.5 M 트리스 pH 6.8, 10% 글리세롤, 2.2% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), 0.00125% 브로모페놀 블루, 5% B-머캅토에탄올)에서 균질화하고 10% SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 러닝한 후, 나일론 막으로 전송하였다. 젤을 30 V로 밤새 블럿하고 5% 탈지분유를 포함하는 TTBS(TBS-Tween 20)에서 30분 동안 블로킹하였다. 마우스 항-로돕신 항체, 4C5(Developmental Studies Hybridoma Bank, 미국)를 1:1000로 희석한 TTBS에서 반응하였다. 래빗 항-GFP 폴리클로날 항체(AB 프론티어, 대한민국)를 1:5000로 희석한 TTBS에서 반응하였다. 항-마우스 또는 항-래빗 HRP(Horse Radish Peroxidase) 표지된 2차 항체(Pierce, 미국)를 1:10000로 희석한 TTBS에서 반응하였다. 피어스(Pierce) 슈퍼시그날 시약을 이용하여 화학 발광을 측정하였다.

결과

ARF72A 의 골지 복합체로의 위치

치사(lethal) 초파리 돌연변이로부터 Arf27A 유전자의 서열을 확인한 결과, 그 서열은 효모 및 소의 Arf1과 55% 상동성(homology)을 갖고 있었다(Tamkun et al., 1991). 다양한 종의 Arf 패밀리의 DNA 또는 단백질을 이용한 계통 발생적 분석한 결과는 arf72A는 포유류의 arl1과 일치하는 결과를 나타냈다(Kahn et al., 2004). ARF72A의 아미노산 서열은 마우스 또는 인간 arl1의 그것과 85%의 상동성을 갖으며 G2 미리스토일화 부분이 보존되는 것을 발견하였다.

초파리 arf72A 및 포유류 Arl1 간의 뚜렷한 상동성을 가지므로, 세포 내 위치도 유사할 것이다. 초파리 광수용체 세포에서 ARF72A 위치를 조사하기 위해, UAS/Rh1-Gal4 시스템을 이용하여 RFP-arf72A 및 골지 마커 단백질인 Rab6-GFP를 발현시키고, 파리 망막으로부터 8 광수용체 세포로 구성된 낱눈을 분리하였다(도 1a). 전체-마운트 낱눈의 공초점 현미경사진은 초파리 조직에서 골지 복합체인 세포질의 RFP 및 GFP 염색을 보여준다(도 1b 및 도 1c, Kondylis et al., 2001). 또한, RFP 형광은 골지 마커 단백질의 GFP 형광과 부분적으로 겹쳐져 나타났다. ARF27A의 골지 복합체 내 위치는 효모 및 포유류의 Arl1 위치와 일치한다(Lee et al., 1997; Panic et al., 2003; Icard-Liepkalns et al., 1997; Lu et al., 2001).

모자이크 분석

소낭 전송 시스템의 오작동은 흔히 ER 막의 과증식 및 골지 복합체 및 엔도솜(endosome)의 확장과 같은 비정상적 세포 내 구조를 유도한다(Colley et al., 1991; Satoh et al., 1997, 2005). 초파리 arf72A의 결핍은 세포 내 구조의 특정 변화를 유도하므로, 소낭 전송에서 Arf 패밀리 단백질의 기능의 중요하다. arf72A 유전자 돌연변이 시 유도되는 치사로 인해, ey-FLP-FRT 시스템을 이용하여 고-분화된 광수용체 세포에서 치사 돌연변이 유전자형을 조사할 수 있는 모자이크 파리를 제조하였다(도 2a, Stowers and Schwarz, 1999). 야생형 클론과 arf72A 돌연변이 클론을 구별하기 위해, 야생형 광수용체 세포의 라브도미어(rhabdomere) 밑에만 나타나는 색소 입자인 w⁺ 유전자를 세포 마커로 사용하였다. arf72A 돌연변이 세포의 전자현미경 이미지는 과증식된 내부 막을 보여준다(도 2b). 더 두드러지게, 조면소포체 막은 상당히 확장되고 부어오른것을 발견하였고, 전자밀도 및 광학 영역에서 균일한 야생형 소포체 막과 비교하여 불균일함을 확인하였다.

소포체막의 변화는 arf72A가 ER과 골지 복합체 간의 막 전송과 관련 있음을 말해준다. 소포체로부터 로돕신 배출의 실패는 로돕신 레벨을 감소시키지만, arf72A 돌연변이의 망막에서 로돕신 양의 감소는 세포 내 전송 돌연변이의 로돕신과 비교하여 보다 덜 감소하였다(Colley et al., 1991; Ozaki et al., 1993; Kurada and O'Tousa, 1995). arf72A 돌연변이의 눈에서 로돕신 양의 약한 감소는 소포체 표현형이 분비 단백질의 소포체 배출 실패에 기인하지 않음을 말해준다.

arf72A 의 소포체-골지 막 전송 음성 조절

소포체와 골지 복합체 간의 막 전송은 동역학적 과정으로 이의 전진성(anterograde) 및 후진성(retrograde)은 두 세포소기관 간의 막 균형을 유지하면서 고도로 조절된다(Lippincott-Schwartz, 1993). 따라서, arf27A 결핍에 의한 ER 막의 구조적 변화는 소포체와 골지 복합체 간의 전송 동역학에 변화를 줄 것이다. 소포체-골지 간의 전송 동역학을 조사하기 위해, eyFLP-GMR::hid FRT 시스템을 이용하여 arf72A 돌연변이 세포로 구성된 파리 눈을 갖는 모자이크 파리를 제조하였다. 사멸 반응기, hid의 눈-특이적 발현으로 눈 안의 arf72A 돌연변이 세포를 제외한 야생형 세포를 제거하였다. 야생형 및 arf72A 돌연변이 광수용체 세포의 골지 복합체를 골지 마커로 GFP-표지된 Rab6를 발현하여 가시화하였다. arf72A 돌연변이 세포는 야생형 세포와 비교하여 세포질 전체적으로 크기와 그 수에 있어 광범위한 골지 구조를 보여주어, 골지 복합체의 막 균형이 변화함을 나타내었다(도 3).

소포체 및 골지 복합체의 구조적 변화는 소낭 전송의 효율성에 영향을 줄 것이다. 이를 확인하기 위해, 야생형 및 arf72A 돌연변이의 광수용체 세포에서 GFP-표지된 로돕신을 UAS/Rh1 Gal4를 이용하여 발현하였다. 로돕신은 조면소포체에서 합성되어져, 소낭 전송 시스템을 통해 그의 목적지인 라브도미어로 전송된다(도 4a, Pak, 1995). 로돕신 성숙 과정 동안, 소포체로부터의 배출은 색소포, 레티날 및 트랜스형에서 시스형으로의 광-유도 구조적 변화를 요구한다. 레티날 또는 빛이 없으면, 로돕신 분자는 소포체에 머물 것이다(Ozaki et al., 1993; Sarfare et al., 2005). 그러므로, 로돕신이 소포체에서 라브도미어에 도달하는 타겟팅 속도는 차광상태에서 전-트랜스-레티놀을 공급하고 그 후 망막을 빛에 노출하여 측정 할 수 있다. 놀랍게도, 로돕신의 라브도미어로의 타겟팅 속도는 야생형보다 arf72A 돌연변이 광수용체 세포에서 더 빠르게 움직이는 것을 확인하였다. GFP-표지 로돕신 위치는 20 야생형 및 20 arf72A 돌연변이 광수용체 세포를 Ⅰ형(로돕신이 주로 세포질에 위치), Ⅱ형(로돕신이 주로 세포질 및 라브도미어에 위치) 및 Ⅲ형(로돕신이 주로 라브도미어에 위치)로 분류하여 24시간 동안 매 6시간마다 공촛점 형미경을 통해 확인하였다(도 4b). Ⅱ형 및 Ⅲ형의 광수용체 세포를 구분하기 위해, 매 6시간 동안 모든 arf72A 돌연변이 광수용체 세포를 Ⅱ형 또는 Ⅲ형으로 점수화하였다(도 4c). 실제로, 돌연변이 광수용체 세포는 6시간 후에 35%가, 18시간 후에는 80%가 Ⅲ로 분류되었다. 반대로, 야생형 광수용체 세포의 GFP-표지 로돕신은 18시간 후에 조차 Ⅱ형 또는 Ⅲ형 세포가 단 55%로, 매우 느리게 이동하였다. 또한, Ⅲ형 세포를 측정할 때, arf72A 돌연변이 세포의 소포체에 있던 로돕신이 더 빠르게 사라질 뿐 아니라 빠르게 타겟팅 됨을 확인하였다. 이러한 결과는 arf72A가 음성 조절자로 기능함으로, arf72A의 결실은 소포체 및 골지 복합체 간의 막 균형을 골지 복합체 쪽으로 옮기며 소포체에서 골지 복합체로의 막 수송을 가속화한다.

arf72A 및 소포체 품질관리

단백질의 분비과정은 세포구획을 통한 단백질 폴딩, 전사후 변형(post-transcriptional modifications) 및 전송으로 구성된다. 소포체에서의 적절한 폴딩 및 배출은 효모 및 포유류 세포 시스템에서 속도-제한적인 단계로 보고되어 있다(Coughlan et al., 2004; Petaja Repo et al., 2000). 본 발명에서, arf72A 돌연변이 광수용체는 소포체 및 골지 복합체 간 막 동역학의 변화로 라브도미어로의 로돕신 수송이 빨라지고, 세포질의 로돕신이 빠르게 사라지는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 arf72A가 소포체로부터의 단백질 배출을 조절한다는 것을 말해준다. 결과적으로, 소포체 막에 ARF72A의 증가는 새로이 합성된 단백질이 분비되거나 분해되기 위해 소포체 루멘(lumen)에 축적됨을 말한다.

우성 ninaE^D1 돌연변이를 같은 조건을 제조하는데 사용하였다. 우성 ninaE^D1 돌연변이는 야생형 로돕신의 소포체에서 성숙을 방해하고 로돕신의 배출을 저해하는 미스-폴딩된 돌연변이 로돕신을 생산한다. 따라서, 돌연변이 및 야생형 로돕신은 소포체에 축적된다. ninaE^D1/+ 광수용체 세포에서 Rh1-GFP 형광은 대부분 소포체 마커인 RFP-KDEL의 RFP 형광과 함께 위치하였다. 이는 우성 ninaE^D1/+ 돌연변이 세포로 소포체로부터 단백질을 배출하는데 요구되는 유전적 요소를 연구하기위한 이상적인 시스템이다. 본 명세서에서, ninaE^D1/+ 광수용체 세포에서 RFP-arf72A 및 Rh1-GFP 발현을 공촛점 현미경으로 조사하였다(도 5a). 야생형과 비교하여 ninaE^D1/+ 광수용체 세포는 초파리 조직에서 소포체 염색의 특징인 핵 주위에서 강한 RFP-ARF72A 염색을 나타내고, 세포질 전체에 염색되어, 부분적으로 Rh1-GFP 염색과 겹쳐졌다(Orso et al., 2009). ninaE^D1/+ 광수용체 세포에서 RFP-ARF72A의 소포체 위치를 소포체-트랙커와 동시-표지하여 확인하였다. 그러므로, 야생형과 비교하여 ninaE^D1/+ 광수용체 세포의 소포체에서 더 ARF72A가 검출되었다(도 1b). 이는 소포체에서 arf72A의 기능적 역할은 미스-폴딩된 단백질을 축적하는 것임을 말해준다.

소포체-골지 수송의 음성 조절자인 arf72A에 대한 결과는 arf72A 돌연변이 세포에서 소포체 배출 과정의 속도-제한적 단계가 제대로 폴딩는지 확인하는 데 영향을 줄 것이라고 말한다. arf72A 기능의 결핍이 소포체 품질 체크에 기능하는지 확인하기 위해, GFP-표지 로돕신의 위치를 조사하여 우성 ninaE^D1/+ 돌연변이와 함께 arf72A의 우위(epistatic) 분석을 수행하였다(도 5b). 야생형 및 arf72A-RNAi 광수용체 세포에서 GFP-표지 로돕신을 가시화하니, 라브도미어를 제외한 염색을 나타내었고, ninaE^D1 광수용체 세포는 우성 세포질 염색을 나타냈다(도 5b). 반면에, RNAi에 의한 눈-특이적인 arf72A 녹-다운으로 이중-돌연변이의 세포질로부터 라브도미어로 이동한 로돕신의 양이 증가하여 ninaE^D1/+ 광수용체에서 소포체 품질 관리를 절충하는 것을 확인하였다.

웨스턴 블럿 분석을 통해 공촛점 현미경 결과의 우위(epistastic) 결과를 확인하였다. 성숙 과정 동안, 로돕신은 소포체에서 글리코실(glycosyl)화되고 40 kDa 소포체 형태에서 34 kDa 라프도머릭(rhabdomeric) 형태로 서서히 변화한다(Katanosaka et al., 1998; Webel et al., 2000). 따라서, 로돕신의 성숙 상태를 웨스턴 블럿을 통해 사이즈로 확인할 수 있다. 1일된 파리에서 전위적으로(Ectopically) 발현된 GFP-표지된 로돕신을 성숙 상태를 확인하기 위한 GFP 특이적인 항체를 이용하여 프로브(probe)하였다. 이전의 결과와 일관되게, 야생형 망막과 비교하여, ninaE^D1/+ 망막에서 총 GFP-표지 로돕신은 감소하였으나, 미성숙 로돕신은 증가하였다(도 5c의 3열 및 4열; Colley et al., 1995b). 이중-돌연변이(arf72A-RNAi/UAS::Rh1-GFP, Rh1::Gal4, ninaE^D1) 망막은 추가적으로 총 로돕신레벨이 감소하였으나, 성숙 로돕신은 증가하였다(도 5의 5열). 이러한 결과는 소포체의 품질관리는 arf72A 기능의 결핍에 의해 절충되는 것을 나타낸다. 또한, 이중-돌연변이에서 로돕신의 레벨이 감소한 것은 로돕신이 소포체에서 품질관리를 우회하였지만, 대부분의 로돕신이 라브도미어에 도달하기 전에 변성됨을 나타낸다.

arf72A 구조( rescue ) ninaE ^D1 -관련된 막 손상 및 ninaE ^D1 -유발된 망막 변성

초파리에서 ninaE^D1과 같은 로돕신의 우성 돌연변이는 생애-의존 망막 변성을 연구하기 위한 모델로 사용되어왔다. 최근 연구에서, 우성 로돕신 돌연변이 중 하나인 ninaE^G69D는 소포체 스트레스를 조절하여 구조되었다(Ryoo et al., 2007; Kang and Ryoo, 2009). 소포체 품질관리를 담당하는 arf72A 기능의 손실은 결과적으로 전반적인 로돕신 양의 감소를 불러오나, ninaE^D1/+ 망막에서 성숙한 부분을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 결과는 arf72A 결손에 의한 소포체 스트레스의 감소를 통해 ninaE^D1-관련된 표현형의 구조(rescue) 가능성을 향상시킨다. 우성 ninaE^D1 돌연변이 광수용체 세포는 엄청난 막 축적(buildup) 및 조면소포체의 축적을 나타낸다(도 6a 내지 도 6c). 소포체-유사 막 축적은 이중 돌연변이에 여전히 존재하였지만, 비정상 막 강화는 현저히 감소하였다(도 6d 내지 도 6f). 흥미롭게도, 이중-돌연변이 세포의 소포체 막은 arf72A 돌연변이 세포의 것과 유사하다.

arf72A 결핍의 영향이 ninaE^D1-유발된 망막을 변성시키는지 확인하였다. 녹-다운 컨스트럭트 도입에 의한 arf72A 기능의 결핍은 ninaE^D1/+에 의한 망막 변성을 억제하였다(도 7). 이웃하는 세포에 의한 식균작용 및 라브토머릭 결손의 일부를 보이는 ninaE^D1/+ 망막과 비교하여, ninaE^D1/+의 arf72A 기능의 결핍은 라브도미어 및 낱눈 구조의 보존으로 효과적으로 망막 변성을 지연시켰다.(도 7a 내지 도 7c). 흥미롭게도, 전반적인 노화된 이중-돌연변이 광수용체 세포의 크기는 막 균형의 결함으로 현저히 감소하였다. 이는 ninaE^D1/+에서 arf72A 결핍은 소포체 루멘으로부터 소포체-축적된 로돕신을 배출함으로써 막 축적 및 망막 변성의 지연을 보조한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

다음 단계를 포함하는 망막 질환의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법:
(a) (i) Arf72A[ADP(Adenosine diphosphate) Ribosylation Factor 72A] 유전자 또는 단백질, 또는 (ii) Arl1(ADP-ribosylation factor-like protein 1) 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현량, Arf72A 또는 Arl1 단백질의 양 또는 Arf72A 또는 Arl1 단백질의 활성을 측정하는 단계;
상기 Arf72A 또는 Arl1 유전자의 발현량, Arf72A 또는 Arl1 단백질의 양 또는 Arf72A 또는 Arl1 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 시험물질은 망막 질환의 치료제 후보물질로 판정된다.
제 1 항에 있어서, 상기 세포는 광수용체 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 망막 질환은 망막병증, 상염색체 우성 망막병증(autosomal-dominant retinopathy), 어셔 증후군, 스타가트병(Stargardt disease), 바렛-비들 증후군, 베스트병, 맥락막 결여, 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 망막색소변성증, 망막 황반성 퇴화증, 레베르선천성흑내장(Leber Congential Amaurosis; Laber's Hereditary Optic Neuropathy), BCM(Blue-cone monochromacy), 망막층간 분리, ML(Malattia Leventiness), 오구치병(Oguchi disease) 또는 레프섬병(Refsum disease)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 망막 질환은 망막병증 또는 상염색체 우성 망막병증인 것을 특징으로 하는 방법.
(i) Arf72A[ADP(Adenosine diphosphate) Ribosylation Factor 72A] 유전자의 발현 억제제 또는 Arf72A 단백질의 활성 억제제, 또는 (ii) Arl1(ADP-ribosylation factor-like protein 1) 유전자의 발현 억제제 또는 Arl1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 망막 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 억제제는 소포체에서 로돕신을 정상적으로 성숙 및 배출시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 망막 질환은 망막병증, 상염색체 우성 망막병증(autosomal-dominant retinopathy), 어셔 증후군, 스타가트병(Stargardt disease), 바렛-비들 증후군, 베스트병, 맥락막 결여, 맥락망막 위축(gyrate-atrophy), 망막색소변성증, 망막 황반성 퇴화증, 레베르선천성흑내장(Leber Congential Amaurosis; Laber's Hereditary Optic Neuropathy), BCM(Blue-cone monochromacy), 망막층간 분리, ML(Malattia Leventiness), 오구치병(Oguchi disease) 또는 레프섬병(Refsum disease)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 망막 질환은 망막병증 또는 상염색체 우성 망막병증인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 Arf72A 유전자의 발현 억제제 또는 Arl1 유전자의 발현 억제제는 상기 Arf72A 유전자 또는 Arl1 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.