KR20130059950A

KR20130059950A - 신규한 락토바실러스 속 균주 및 이의 생균제 용도

Info

Publication number: KR20130059950A
Application number: KR1020110126212A
Authority: KR
Inventors: 이연희
Original assignee: (주) 피엘바이오
Priority date: 2011-11-29
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2013-06-07
Anticipated expiration: 2031-11-29
Also published as: KR101335454B1

Abstract

본 발명은 장내 유해한 병원균을 억제하고, 장 세포 부착이 우수하고, 면역증강 효과가 있으며, 내성 전이가 없고, 내산성 및 내담즙성이 우수한 신규 락토바실러스 속 유산균 및 이의 생균제로서의 용도에 관한 것이다. 상기 생균제는 가축의 사료 첨가제 및 수의학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 락토바실러스 속 균주 및 이의 생균제 용도 {Novel Lactobacillus sp. strains and their use as probiotics}

항생제를 가축의 사료에 혼합하여 축산업에 사용하면서, 설사와 같은 가축의 질병의 예방과 치료, 성장촉진 및 사료효율 개선 등의 생산성이 향상되었으며 축산농가의 소득 증가에 기여하였다.

그러나 항생제의 이러한 효과에도 불구하고 내성 균주의 출현, 축산물 내 잔류 항생제의 확인, 및 동물에서 사람으로 세균의 내성 전이로 인한 인체 안전성 문제로 논란이 일기 시작했으며, 이로 인해 항생제의 사용을 제한하는 추세이며, 축산물에 대한 항생제 잔류검사도 강화되고 있다. 최근 EU 집행위원회 (European commission)는 동물의 성장 촉진제로 사료에 첨가되는 항생제의 사용을 금지하였다. 한국에서는 축산업에서의 항생제 총사용량이 2001년에는 1,595톤, 2008년에는 1,211톤 및 2009년에는 999톤으로 감소하고 있는 추세이며 (국립수의과학검역원), 특히 2009년에는 고도 내성을 일으키는 인수공통 항생제 (e.g. 바시트라신, 클로르테트라사이클린, 콜리스틴, 린코마이신, 네오마이신, 옥시테트라사이클린 및 페니실린)를 동물사료로 사용하는 것을 금지하였다. 또한, 구충제와 항콕시디움을 제외한 항생제는 2012년부터 동물사료로 전면 사용 금지될 예정이다.

이러한 항생제 사용의 제한 및 금지 조치에 따라 항생제의 사용이 줄어들면서, 항생제를 대체할 물질에 대한 관심이 높아지고 있다. 현재 사용 중인 항생제 대체제는 유기산제 (산성화제, acidifiers), 생균제 (probiotics), 프리바이오틱스 (prebiotics), 사료 첨가용 복합효소제 (enzymes), 면역 조절제 (immunod ㎕ators), 식물 추출 물질 (plant extracts) 및 광물질 등이 있으나, 이 중 생균제 (probiotics)가 가장 주목을 받고 있다.

생균제 (probiotics)는 일반적으로 건강에 유익한 생균 식품 첨가제로 정의되었으나 (Lilly and Stillwell, Science 147:747-748, 1965), 최근 들어 Salminen 등 (Int. J. Food Microbiol. 44:93-106, 1998)에 의해 인체나 동물의 건강을 증진시키기 위하여 고안된 식품 및 사료 또는 식이 첨가제에 들어있는 살아있는 미생물 제제라고 정의되고 있다. 생균제로 가장 많이 이용되고 있는 세균은 유산균으로서 락토바실러스 (Lactobacillus)와 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 등이 있다.

생균제로서 갖추어야 할 바람직한 조건은, 안전해야 하고, 산과 담즙에 대한 내성 (tolerance)이 있어야 하며, 장관 상피 (intestinal epithelium)에 부착능이 있어야 하며, 병원성균 (pathogenic bacteria)에 대하여 길항 활성이 있어야 하며, 면역 증강 효과가 있어야 하며, 내성 유전자를 가지고 있다 하더라도 항생제 내성의 전이가 되지 말아야 한다.

유산균 (lactic acid bacteria, LAB)은 장내 미생물 균형에 도움을 주고 항균 활성, 명역 활성 및 항암 활성 등 많은 유용한 점이 있음에도 불구하고, 현재 생균제로서 사용되고 있는 유산균의 대부분은 정확한 생균제로서의 평가가 이루어지지 않은 경우가 다수이며, 타 유산균의 도용을 억제할 수 있는 시스템 개발도 전 무한 현실이다. 또한 가축용 생균제는 가축의 장내에서 분리하여 개발하는 것이 가장 이상적이나, 많은 생균제로 사용되는 균주가 그러하지 못하고 있다.

이에, 본 발명자들은 생균제로서의 조건을 만족하는 신규 유산균을 개발하기 위하여 연구하였으며, 돼지 장 함유물로부터 선발한 4종의 유산균이 내산성 및 내담즙성을 나타내며, 장내 유해 미생물 생육 억제 활성 및 면역 증강 활성을 나타내므로, 사료 첨가제 또는 동물의 병원성 미생물 감염에 치유 효과가 있는 우수한 생균제로 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 돼지 장 함유물로부터 분리된, 내산성 및 내담즙성을 나타내며, 장내 유해 미생물 생육 억제 활성 및 면역 증강 활성을 나타내는 유산균 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 유산균 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 생균제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 생균제 조성물을 포함하는 동물 사료용 첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 생균제 조성물을 포함하는 장내 병원성 미생물 감염 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 생균제 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하여 장내 병원성 미생물의 생육을 억제하거나 상기 미생물에 의한 설사를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 돼지 장 함유물로부터 분리된, 내산성 및 내담즙성을 나타내며, 장내 유해 미생물 생육 억제 활성 및 면역 증강 활성을 나타내는 유산균 균주에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 유산균 균주는 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius) KACC91678P 균주이다. 상기 균주는 본 발명에서 PL9028 로 명명되기도 한다.

바람직하게, 상기 유산균 균주는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KACC91679P 균주이다. 상기 균주는 본 발명에서 PL9031 로 명명되기도 한다.

바람직하게, 상기 유산균 균주는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KACC91680P 균주이다. 상기 균주는 본 발명에서 PL9033 으로 명명되기도 한다.

바람직하게, 상기 유산균 균주는 락토바실러스 아밀로보러스 (Lactobacillus amylovorus) KACC91681P 균주이다. 상기 균주는 본 발명에서 PL9034 로 명명되기도 한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 락토바실러스 살리바리우스 KACC91678P 균주, 락토바실러스 플란타룸 KACC91679P 균주, 락토바실러스 플란타룸 KACC91680P 균주 및 락토바실러스 아밀로보러스 KACC91681P 균주로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 생균제 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 동물 사료용 첨가제에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 장내 병원성 미생물 감염 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 병원성 미생물은 장출혈성 대장균 (Enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC), 대장균 O157:H7, 대장균 O78, 대장균 O26, 살모넬라 엔테라이티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis) 및 살모넬라 더비 (Salmonella derby) 로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

바람직하게, 상기 상기 장내 병원성 미생물 감염 질환은 설사, 장염, 위장관염, 변비, 복통, 복부팽만, 콜레라 및 식중독으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 생균제 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하여 장내 병원성 미생물의 생육을 억제하거나 상기 미생물에 의한 설사를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 동물은 돼지를 포함한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 2004년과 2006년에 걸쳐 총 1,120 마리의 돼지의 분변 시료로부터 장내 물질을 채취하였고, 이로부터 형태, 그람 염색, 카탈라아제 반응 및 m ㎕tiplex PCR 분석을 통하여 유산균 (Lactobacillus sp.) 총 432 균주를 분리 및 동정하였으며, 돼지 설사 유발균 8종에 대한 억제능 테스트를 통하여 가장 효과가 우수한 4종 균주, 즉 PL9028, PL9031, PL9033 및 PL9034 균주를 선발하였다. 상기 4종 균주는 모두 돼지 설사 유발균 8종에 대하여 우수한 억제능을 나타내었으며, 약산성 조건에서도 (pH 5.5~6) 모두 20% 이상의 우수한 억제능을 나타내었다.

상기 4종 균주는 용혈 현상 검사, 젤라틴 액화 반응 검사, 유해물질 생성 검사 및 유해 효소 검사에서 사용 안정성을 나타내었으며, 나아가 내산성 및 내담즙성을 나타내었으므로 낮은 pH 인 위 환경과 담즙을 함유하고 있는 장관 (intestinal tract) 환경에서도 살아남아야 하는 생균 (probiotic bacteria)으로서의 조건을 만족하였다.

또한, 일반적으로 가축 및 축산물에 대한 항생제 사용량 중 테트라사이클린 계열 항생제의 사용량이 가장 많은 것으로 보고되고 있으며, 대부분의 락토바실러스 속 유산균들이 반코마이신에 대해서 내재 내성인 것으로 알려져 있는데, 본 발명에서 선발한 4종 균주 역시 항생제 내성 MIC (minimum inhibitory concentration, 최소 발육억제농도) 검사에서 반코마이신 및 테트라사이클린에 모두 128 ug/㎖ 이상의 고도 내성을 나타내었다. 그러나, 테트라사이클린 계열 항생제 다음으로 많이 사용하고 있는 페니실린 계열의 페니실린은 PL9034, PL9031 의 두 균주가 감수성 범위 안에 있었고, 그 외 암피실린, 이미페넴, 겐타마이신, 클린다마이신 및 에리트로마이신에 대해서는 4종 균주 모두 감수성을 나타내었다. 또한, 상기 4종 균주는 항생제 내성 유전자인 tet 유전자 및/또는 bla 유전자를 가지고 있었으나, 내성 유전자를 전이하지 않는 것으로 확인되었다.

또한, 생균제 유산균은 장내에 정착하여 증식 및 서식할 수 있을 때 그 기능을 할 수 있는데, 상기 4종 균주는 모두 돼지와 사람의 장 세포에 10⁴CFU 정도가 부착되어, 인체 장관에 서식하고 장내 조건에서 생육할 수 있는 잠재력이 확인되었다. 또한, 4종 균주 모두 단독 처리시 TNF-α 의 분비를 유도하였으므로 면역증강 효과를 확인할 수 있었고, 특히 PL9031 및 PL9034 균주는 LPS (lipopolysaccaride)에 의한 과도한 TNF-α의 분비를 저하시켜 주는 기능을 나타내었으므로, 박테리아 감염시 LPS 에 의해 유도되는 septic shock 를 최소화 할 수 있다.

위의 모든 실험 결과를 토대로 하여, 본 발명자들은 상기 4종의 균주가 여러 장내 병원성 세균을 억제할 수 있고, 내산성 및 내담즙성을 나타내며, 장 세포 부착이 우수하고, 면역증강 효과가 있으며, 내성 전이가 없으므로, 상기 균주들을 항생제를 대체할 생균제로 결정할 수 있었다. 이에, 본 발명자들은 16S rRNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석을 통하여 상기 균주를 동정하였고, 이들 균주를 각각 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 수탁번호 KACC91678P, KACC91679P, KACC91680P 및 KACC91681P 를 부여받았다.

상기 균주들은 단독 사용이 가능함은 물론, 혼합 사용 시에도 기능의 보완과 상승 작용을 기대할 수 있다. 또한, 이 유산균은 실온에서 생균 사멸이 적고, 사료 첨가제로 활용가능한 균 종류이므로, 항생제를 대체하여 가축의 성장 촉진과 사료 효율을 개선시킬 수 있는 생균제로서 사용 가능하다.

본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 KACC91678P 균주는 돼지 장내 물질로부터 분리되었으며, 간상형의 그람 양성 균주로, 카탈라아제 음성 반응을 보이며, 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 가진다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 KACC91679P 균주, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KACC91680P 균주는 돼지 장내 물질로부터 분리되었으며, 간상형의 그람 양성 균주로, 카탈라아제 음성 반응을 보이며, 서열번호 2의 16S rRNA 서열을 가진다.

본 발명의 락토바실러스 플란타룸 KACC91680P 균주는 돼지 장내 물질로부터 분리되었으며, 간상형의 그람 양성 균주로, 카탈라아제 음성 반응을 보이며, 서열번호 3의 16S rRNA 서열을 가진다.

본 발명의 락토바실러스 아밀로보러스 KACC91681P 균주는 돼지 장내 물질로부터 분리되었으며, 장간균 및 그람 양성 균주로, 카탈라아제 음성 반응을 보이며, 서열번호 4의 16S rRNA 서열을 가진다.

본 발명의 균주는 통상적인 물리 화학적 돌연변이 방법 등에 의해 이와 동등한 활성을 가지고 필드 안정성이 뛰어나거나 또는 보다 뛰어난 항균 활성을 나타내도록 개선 또는 개량될 수 있다.

본 발명은 또한, 락토바실러스 살리바리우스 KACC91678P 균주, 락토바실러스 플란타룸 KACC91679P 균주, 락토바실러스 플란타룸 KACC91680P 균주 및 락토바실러스 아밀로보러스 KACC91681P 균주로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 생균제 조성물을 제공한다. 이 때, 상기 미생물 배양액에는 미생물이 생산해낸 여러 항균성 유기산 및 비단백질성 항균 물질들이 포함되어 있어 생균제 조성물의 유효성분으로 포함되었을 때 균주를 포함한 조성물과 동등한 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 상기 본 발명에 따른 생균제 조성물은 본 발명의 유산균과 함께 가축이 섭취하기에 적합하고, 섭취시 유해 미생물의 생육을 억제하며 장내 균총의 균형을 개선시키는 활성을 가지는 다른 종류의 공지된 미생물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 생균제 조성물은 상기 유효 성분 외에 통상적인 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 조성물은 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 동결건조 또는 열건조될 수 있고, 캡슐화된 형태 또는 배양 현탁액이나 건조 분말 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물은 장내 병원성 세균 억제, 내산성 및 내담즙성 등이 우수한 프로바이오틱 유산균 또는 그 배양액을 포함함으로써, 다양한 장내 병원성 세균들의 감염 억제 및 치료 효과가 우수하고, 숙주의 장내 균총을 정상화시킴으로써 세균성 질병을 예방할 수 있음은 물론, 장내 병원성 세균 억제제, 면역 증강제, 살균제, 소화제, 정장제 및 지사제 등의 생균제 조성물로서 사료, 식품 및 의약품 등에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명 미생물은 돼지의 장관으로부터 분리된 것으로 정상적인 장내 미생물 균총을 형성하기 때문에 특히 가축 사육에 더욱 잇점이 있다.

바람직하게, 본 발명의 생균제 조성물은 동물 사료용 첨가제로서, 또는 장내 병원성 미생물 감염 질환의 치료 또는 예방용 조성물으로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 생균제 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하여 장내 병원성 미생물의 생육을 억제하거나 상기 미생물에 의한 설사를 예방 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 생균제가 적용될 수 있는 가축은 개, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 오리, 칠면조 및 거위 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 돼지이다.

본 발명의 생균제 조성물이 사료 첨가제로 사용되는 경우, 기존 항생제의 대체용으로 사용되어 장내 유해균의 생육을 억제하며 장내 균총을 안정되게 유지하여 가축의 건강상태를 양호하게 하고 가축의 증체량과 육질을 개선시키고 산유량 및 면역력을 증가시킬 수 있다. 이 때, 신규한 락토바실러스 속 균주 또는 그의 배양액을 사료 100 중량부에 대하여 1~20 중량부로 포함하는 것이 바람직하며, 10~20 중량부로 포함하는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 사료 첨가제는, 이에 한정되는 것은 아니나, 발효 사료, 배합 사료, 펠렛 형태 및 사일레지 (silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효 사료는 본 발명의 균주와 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있으며, 상기 배합 사료는 여러 종류의 일반 사료와 본 발명의 락토바실러스 균주를 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효 사료 또는 배합 사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 본 발명에 따른 락토바실러스 균주로 발효시킴으로서 제조될 수 있다.

본 발명의 생균제 조성물이 장내 병원성 미생물 감염 질환의 치료 또는 예방용 조성물로 사용되는 경우, 상기 장내 병원성 미생물은 장출혈성 대장균 (Enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC), 대장균 O157:H7, 대장균 O78, 대장균 O26, 살모넬라 엔테라이티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis) 및 살모넬라 더비 (Salmonella derby) 로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 장내 병원성 미생물 감염 질환은 설사, 장염, 위장관염, 변비, 복통, 복부팽만, 콜레라 및 식중독으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 장내 병원성 미생물 감염 질환의 치료 또는 예방용 조성물은 임상 투여시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 주성분인 상기 락토바실러스속 균주 또는 이들의 배양액 의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 약제학적 제형의 조성물로 제조할 수 있다. 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 속의 신규 미생물은 내산성 및 내담즙성이며 장내 유해한 병원성 세균을 억제하는 프로바이오틱스로, 기존 항생제를 대체하여 가축에 투여 시 장내 미생물 균총의 안정화를 이루어 장내 유해한 미생물의 이상 발효에 의하여 발생할 수 있는 증상들을 치료하거나 사전에 예방할 수 있으며 건강 상태를 양호하게 하고 가축의 증체량증가, 육질 개선, 산유량 증가 및 면역력 증가 등의 효과를 얻을 수 있다.

도 1은 돼지 장 세포주인 IPI-21 세포에 대한 PL9028, PL9031, PL9033 및 PL9034 균주의 부착 양상을 그람 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 인간 장 세포주인 Caco-2 세포 세포에 대한 PL9028, PL9031, PL9033 및 PL9034 균주의 부착 양상을 그람 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 대식 세포주 RAW 264.7에 대한 무처리 대조군 (cell control), LPS 단독 처리군 (LPS control), 유산균 단독 처리군 (회색 막대) 및 LPS 및 유산균 처리군 (흰색 막대)에서의 TNF-a 의 분비 정도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 돼지 장내 물질의 채취 및 유산균의 분리

1-1. 돼지 장내 물질의 채취

Lactobacillus amylovorus , L. intestinalis , L. crispatus , L. plantarum , L. acidophilus , L. ruminis , L. saerimneri , L. reuteri , L. buchneri , L. murinus 및 L. mucosae 등의 유산균은 다양한 농도로 돼지의 장, 맹장 및 직장에 존재하며, 돼지 분변에서 분리할 수 있다. 이에, 경기도 소재 도축장에서 도축되는 건강한 돼지로부터 2004년과 2006년간 8회에 걸쳐 1120 마리의 돼지 장내 물질을 채취하였다. 2004년 4회에 걸쳐 572 마리의 돼지 분변 시료와, 2006년 4회에 걸쳐 548 마리의 돼지 분변 시료를 수집하여 총 1,120 마리의 돼지 분변 시료로부터 돼지 장내 물질을 채취하였다.

1-2. 유산균 추정 균의 분리

유산균의 1차 분리는 0.002% Bromophenol blue 첨가 De Man Rogosa (이하 MRS, Difco, Becton, Dickinson and Company sparks, MD, U.S.A) 배지에 채취 해온 시료를 도말하여 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 유산균 형태로 보이는 콜로니를 채취하여 1차 계대를 하였다. 배양하여 자란 콜로니를 카탈라아제 반응 실험을 통하여 음성반응을 보이는 균만 선별하였고, 이후 그람 염색하여 그람 양성 균주 이면서 간상형 (rod form)인 균주를 M ㎕tiplex PCR (Yu-Li Song, et.al., FEMS Microbiology Letters, 187: 167-173, 2000) 에 의해 동정 분리하였다.

MRS 배지에서 자란 콜로니 중 카탈라아제 음성 반응 균주이면서 그람 염색에 의해 그람 양성 및 간상형인 균주는 2004년에 519 균주, 2006년에 431 균주로, 총 950 균주였다. M ㎕tiplex PCR에 의해서 락토바실러스 속 (Lactobacillus. sp.) 으로 동정된 균주는 2004년에는 186 균주, 2006년에는 246 균주로 최종 432 균주였다.

실시예 2. 병원균 억제능 테스트 ( antimicrobial activity test )를 통한 유산균의 선발

2-1. 병원균 억제능 테스트

상기 실시예 1에서 1차 선발한 유산균 432개 중에서 돼지 설사 유발균에 대하여 억제능이 있는 균주를 선발하기 위하여 well test 를 수행하였다. 우선 돼지 설사 유발균으로 E. coli (EHEC, CCARM1250, swine), E. coli O157:H7 (CCARM1239, swine), E. coli 078 (ETEC, CCARM230, swine), E. coli 026 (EPEC, CCARM228, swine), S. enteritidis (CCARM134, swine), S. typhimurium DT104 (CCARM125, human), S. cholerasuis (CCARM43, swine) 및 S. derby (CCARM42, swine) 를 선택하였다. 실시예 1에서 선발한 유산균을 각각 100 ㎖ MRS 배지에서 37℃, 24 시간 배양시킨 후 원심분리 (10,000 x g, 15 min)한 상등액을 동량의 에틸 아세테이트와 섞어주었다. 1 시간 동안 세게 흔들어준 후 에틸 아세테이트 층을 따서 증발 농축기 (evaporator)를 이용하여 1/100으로 농축하였다. 돼지 설사 유발균은 MacFarland 0.5 로 맞추어 M ㎕ler-Hington (이하 MH) 고체배지에 접종하였고, 멸균 파스퇴르 피펫으로 구멍을 내어 유산균 농축액 100 ㎕ 를 주입하였다. 음성 대조군 (negative control)으로는 MRS broth 를 추출하여 사용하였다. 35℃에서 하룻밤 배양시킨 후 억제환의 유무 및 크기를 확인하여, 최종적으로 총 4종의 유산균을 선발하였다.

표 1은 음성 대조군 및 최종 선발 균주 PL9028, PL9031, PL9033 및 PL9034 의 억제환의 크기를 측정한 결과를 나타낸다. 대조군인 MRS broth 추출액에서 억제능을 보이는 설사 유발균은 없었으나, 유산균 PL9028, PL9031, PL9033 및 PL9034 은 8종의 병원균 모두에 대하여 우수한 억제능을 나타내었다. 이에, 유산균 PL9028, PL9031, PL9033 및 PL9034 을 각각 국립농업과학원 농업유전자원센터에 수탁번호 KACC91678P, KACC91679P, KACC91680P 및 KACC91681P 를 부여받았다.

병원균	억제환의 크기 (mm)
병원균	대조군	PL9028	PL9031	PL9033	PL9034
E. coli (EHEC)	6	21	17	21	18
E. coli O157:H7	6	22	20	24	18
E. coli 078 (ETEC)	6	23	21	25	19
E. coli 026 (EPEC)	6	22	18	22	18
S. enteritidis	6	23	20	25	19
S. typhimurium DT104	6	24	20	25	20
S. cholerasuis	6	24	20	25	19
S. derby	6	23	20	24	19

2-2. pH 에 따른 억제능

유산균의 산도에 따른 억제능을 배제시키기 위해 유산균 배양액을 약산성 (pH 5.5~ 6.0)으로 pH를 올린 후 억제능이 있는지 알아보았다. 유산균을 MRS 액체배지에 접종하고 24시간 동안 35℃에서 배양하였으며, 원심분리 (10,000 x g, 4℃ 에서 15 분) 하여 균체를 제거하고 유산균 배양 상등액과 동량의 Mueller-Hinton (이하 MH (2X)) 배지와 섞은 후 saturated TRIS로 pH 6, 5.75, 5.5로 세가지로 맞추고 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다. 실시예 2-1 에서 사용한 설사 유발균을 10⁶ CFU/㎖ 이 되도록 접종하여 35℃에서 24 시간 배양 시킨 후 450 nm의 흡광도에서 optical density를 측정하였다. 대조군으로 유산균 배양 상등액 대신 MRS 액체배지를 사용하였다.

표 2는 pH에 따른 각 유산균 배양액의 설사 유발균의 성장 억제율 (%)을 나타낸다. 대조군인 MRS broth 추출액에서 억제능을 보이는 설사 유발균은 없었으나, 유산균 PL9028, PL9031, PL9033 및 PL9034 은 8종의 병원균 모두에 대하여 pH에 상관없이 모두 20% 이상의 억제율을 보였고, pH6 보다는 pH5.75와 pH5.5에서 각 유산균들이 설사 유발균들을 많이 억제하였다.

		대조군³	PL9028	PL9031	PL9033	PL9034
E. coli (EHEC)	pH 6¹	0.00²	24.1	46.1	45.9	48.1
	pH 5.75	0.00	46.8	60.7	55.7	61.9
	pH 5.5	0.00	50.7	80.7	80.3	75.0
E. coli O157:H7	pH 6	0.00	29.6	45.5	47.0	40.8
	pH 5.75	0.00	40.9	54.1	53.3	53.7
	pH 5.5	0.00	43.2	75.6	81.6	68.1
E. coli 078 (ETEC)	pH 6	0.00	27.5	37.8	46.2	41.2
	pH 5.75	0.00	0.0	39.8	22.5	25.9
	pH 5.5	0.00	0.0	82.5	36.4	75.7
E. coli 026 (EPEC)	pH 6	0.00	26.4	52.6	44.8	56.0
	pH 5.75	0.00	13.1	71.4	60.0	71.5
	pH 5.5	0.00	39.5	92.1	71.3	89.0
S. enteritidis	pH 6	0.00	29.4	43.0	46.4	48.4
	pH 5.75	0.00	43.7	60.6	61.9	61.0
	pH 5.5	0.00	23.4	89.1	59.2	79.5
S. typhimurium DT104	pH 6	0.00	39.6	47.5	73.6	66.4
	pH 5.75	0.00	50.4	63.0	75.1	81.2
	pH 5.5	0.00	58.2	96.5	85.3	95.8
S. cholerasuis	pH 6	0.00	34.7	45.9	47.6	53.5
	pH 5.75	0.00	47.4	59.6	61.4	65.5
	pH 5.5	0.00	55.4	86.8	84.8	78.6
S. derby	pH 6	0.00	35.2	51.7	42.1	54.6
	pH 5.75	0.00	49.1	65.4	59.3	66.2
	pH 5.5	0.00	52.9	83.0	81.7	77.3
¹: 배양 상등액의 pH ²: 성장 억제율 (%)=MRS 의 흡광도 ³: 유산균이 없는 경우의 성장 억제율= (MRS배지에서의 흡광도-각각의 pH배지에서의 흡광도) / MRS배지에서의 흡광도 X 100

실시예 3. 선발 유산균의 안전성 실험

3-1. 안정성 실험

용혈 현상 (hemolysis) 검사를 위하여, 혈액 한천 배지에 실험 균을 접종하고 37℃에서 24 시간 배양하고, 용혈 여부와 종류를 관찰하여 기록하였다.

젤라틴 액화 반응 검사를 위하여, MRS 젤라틴 배지 (0.3 g beef extract, 0.5 g peptone, 12 g gelatin, 100 ㎖ MRS broth) 에 실험 균을 접종하고 35℃에서 6 주간 실험하였다. 배양 후 접종하지 않은 대조군과 함께 4℃ 에서 4 시간 정도 식힌 후 확인하였다. 냉장 후에도 배지가 굳지 않으면 양성 반응으로 보았다.

유해물질 생성 검사를 위하여, 암모니아, 인돌 및 페닐피루브산 (phenylpyruvic acid) 등의 유해물질들의 생성 여부를 검사하였다.

유해효소 확인 검사를 위하여, 베타-글루쿠로니다아제 (beta-glucuronidase) 및 베타-글루코시다아제 (beta-glucosidase)와 같은 유해효소 여부를 확인하였다.

표 3은 상기 안정성 실험 결과를 나타낸다. α-hemolysis를 보이는 균주는 PL9028 및 PL9031 이었다. 세균의 병원성은 세포 침입능에 좌우되는 경우가 많은데, 세포 침입에는 단백질 분해 능력이 필요하다. 단백질 분해능의 조사방법인 젤라틴 액화 실험에서는 4 균주 모두 음성이었다. 또한, 4 균주 모두에서 유해 대사산물인 암모니아가 생성되지 않았으며, 인돌 및 페닐피루브산도 생성되지 않았다. 또한, 일부 장내 미생물이 생성하는 유해효소로 알려져 있는 효소 중에서 베타-글루쿠로니다아제 및 베타-글루코시다아제의 생성 여부를 확인해 본 결과 모두 생성하지 않는 것으로 확인되었다.

검사항목	PL9028	PL9031	PL9033	PL9034
용혈현상	α	α	-	-
젤라틴 액화 반응	-	-	-	-
우레아제 (urease) 생성	-	-	-	-
인돌 생성	-	-	-	-
페닐피루브산 생성	-	-	-	-
베타-글루쿠로니다아제 생성	-	-	-	-
베타-글루코시다아제 생성	-	-	-	-

3-2. 내산성 및 내담즙성 검사

내산성 실험은 돼지의 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 pH 3.0 배지에 1000 U/㎖의 펩신을 첨가한 인공 위액에서 실시하였다. 분리 유산균 균주를 각각 액체 배지에서 24 시간 배양한 후 원심 분리하여 세포를 회수하고 멸균 생리식염수로 3 회 세척하였다. 상등액과 동일한 양으로 인공 위액을 첨가하여 유산균 배양 조건과 같은 조건에서 90 분 동안 반응시킨 후 대조군과 비교하여 희석하여 MRS 플레이트에 도말하여 생균수를 계수하여 내산성 정도를 확인하였다.

내담즙성 실험은 인공 위액 조건에서 90 분 동안 처리된 각 유산균 배양액을 사용하였으며, pH 7.0 배지에 0.3% 담즙 (돼지 담즙 추출액, Sigma) 및 1000 U/㎖ 트립신이 첨가된 인공 담즙액에서 실시하였다. 인공 위액 처리된 배양액을 원심분리 후 상등액과 동일한 양의 인공 담즙액을 첨가하여 90 분간 더 반응시킨 후 대조군과 비교하여 희석하여 MRS 플레이트에 도말하여 생균수를 계수하여 내담즙성 정도를 확인하였다.

상기 내산성 및 내담즙성 검사 결과를 표 4에 나타내었다. PL9028, PL9031 및PL9033 균주의 경우 인공 위액 및 인공 담즙액을 처리한 후에도 거의 100% 생존하였으며, PL9034는 1/100 CFU가 감소하였으나 역시 내산성 및 내담즙성을 나타내었다.

(단위: CFU)	0 분	인공위액에서^a 90 분	인공담즙액에서^b 90 분
PL9028	2.86 x 10⁷	2.23 x 10⁷	5.40 x 10⁶
PL9031	1.80 x 10⁷	1.54 x 10⁷	2.27 x 10⁷
PL9033	7.10 x 10⁷	5.80 x 10⁷	6.30 x 10⁷
PL9034	6.05 x 10⁵	6.00 x 10³	4.00 x 10³
^a: 인공위액을 처리함 ^b: 인공위액을 처리 후 이어서 인공 담즙액을 처리함

실시예 4. 선발 유산균의 항생제 감수성 검사

항생제 감수성 검사는 미국 임상검사표준연구소 (Clinical and Laboratory Standards Institute, 이하 CLSI, M45-A, Vol. 26, No. 19, 2006) 의 방법에 따라 Cation-adjusted Mueller- Hinton broth with lysed horse blood (이하 CAMHB 2.5 ~ 5%) 배지를 사용하여 broth microdilution 방법으로 조사하였다. 간략히 설명하면, 선발 유산균을 MRS 아가에 접종하여 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤 배양하였고, 균체는 멸균식염수 (0.85% NaCl) 에 MacFarland value 0.5 가 되도록 탁도를 맞추어 최종 5 x 10⁵ CFU/ ㎕ 이 되도록 항생제가 첨가된 배지에 접종하였다. 이미페넴 (Imipenem)은 한국화학연구원 (KRICT, Korea Research Institute of Chemical Technology)에서 받아 사용하였고, 나머지 다른 항생제는 모두 Sigma (St. Louis, Mo., U.S.A)에서 구입하였다. 항생제의 농도는 0.25에서 128 mg/㎖로 사용하였다. 항생제에 대한 Q.C.로 ATCC25922 및 ATCC49619 를 사용하였고, 국가 임상실험 표준위원회 (National Committee for Clinical Laboratory Standard, 이하 NCCLS) 가이드라인에 따라 결과를 분석하였다.

표 5는 각 유산균의 항생제 내성 검사 결과를 나타낸다. 선발 유산균 모두 반코마이신 및 테트라사이클린에 128 이상의 고도 내성을 나타내었다. PL9028 및 PL9033는 페니실린에 내성을 보여 주었다. 그 외 암피실린, 이미페넴, 겐타마이신, 클린다마이신 및 에리트로마이신에 대해서는 4종 균주 모두 감수성을 나타내었다.

(단위: ug/㎖)		페니실린	암피실린	이미페넴	겐타마이신	반코마이신	클린다마이신	에리트로마이신	테트라사이클린
PL9028		64	4	≤0.25	1	>128	≤0.25	≤0.25	>128
PL9031		4	2	≤0.25	≤0.25	>128	≤0.25	≤0.25	>128
PL9033		64	4	≤0.25	0.5	>128	≤0.25	≤0.25	>128
PL9034		1	1	≤0.25	≤0.25	>128	≤0.25	≤0.25	>128
KCTC3018		8	2	≤0.25	0.5	>128	≤0.25	≤0.25	64
KCCM40210		0.5	0.5	≤0.25	0.5	>128	≤0.25	≤0.25	2
ATCC49619		0.25-1	0.06-0.25	0.03-0.12	-	0.12-0.5	0.03-0.12	0.03-0.12	0.12-0.5
ATCCC25922		-	-	-	0.25-1	-	-	-	-
기준*	S	≤8	≤8	≤0.5	≤4	≤4	≤0.5	≤0.5	-
	I	-	-	-	8	8~16	1~2	1~4	-
	R	-	-	-	≥16	≥32	≥4	≥8	-
ATCC49619: Streptococcus pneumoniae ; ATCC25922: E. coli; *: CLSI 에서 정한 가이드라인에 따른 MIC 기준으로, S 는 감수성 (susceptible), I 는 중등도 감수성 (intermediate), R 은 내성 (resistant)을 나타냄

실시예 5. 장관 세포에 대한 부착능 실험

5-1. 돼지 장 세포에 대한 부착능

돼지 장 세포주인 IPI-21 세포 (Boar miniature male ileum, ECACC)를 열 불활성화된 10% Fetal bovine serum (이하, FBS) 및 0.024 IU/㎖ 의 인슐린 (소의 췌장 유래, Sigma, St. Louis, Mo., U.S.A)이 첨가된 DEME 배지 (D ㎕becco's modified minimal essential medium, Gibco, BRL. U.S.A) 에서 배양한 후 1.0 X 10⁵ 씩 6 웰 플레이트에 접종한 후 배양하면서 post-confluence 된 상태를 확인한 후 실험을 실시하였다. 10 mM 인산완충용액 (phosphate buffer saline, 이하 PBS) 으로 3회 세척을 실시하고 새로운 DMEM 배지를 분주하였다. MRS 에서 계대 배양한 유산균 (about 1 X 10⁸ CFU/㎖)을 PBS로 3 회 세척한 후 6 웰 플레이트에 접종하고 1 시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양이 종료된 세포를 10 mM PBS로 3회 세척을 실시하여 각각의 부착되지 않은 유산균을 제거한 후 4% 고정액으로 고정하여 그람 염색하여 부착 여부를 광학현미경 (Nikon, eclipse80i, JAPAN)을 사용하여 관찰하였다. 또한 정확한 계수를 위하여 위의 PBS로 세척한 플레이트를 0.1% TritonX-100 으로 처리하여 세포와 유산균을 회수하여 단계 희석 (serial dilution)을 한 후 아가 플레이트에 100 ㎕ 씩 넣어 평판 도말 (spreading) 하였다. 2 일간 37℃ 배양기에서 배양한 후 계수하였다. 대조군은 무처리군으로 하였다.

장 세포에 부착된 각 유산균 수를 표 6에 나타내었으며, 그람 염색을 통한 부착 양상을 도 1에 나타내었다. PL9034 가 약 3.37 X 10⁴ 로 가장 많이 부착되었고, PL9028, PL9031 및 PL9033 도 각각 10⁴정도로 많이 부착되었다. 또한, PL9034 는 그람 염색 사진에서 보는 바와 같이 다른 선발 유산균과는 다른 성상으로 장간균임을 확인할 수 있었다.

	IPI-21 세포에 부착된 유산균 수 (단위: CFU)
PL9028	1.02 x 10⁴± 1.74 x 10³
PL9031	2.13 x 10⁴± 6.18 x 10³
PL9033	9.73 x 10³± 7.19 x 10²
PL9034	3.37 x 10⁴ ± 8.99 x 10³

5-2. 인간 장 세포에 대한 부착능

인간 장 세포주인 Caco-2 세포 (Human intestinal cell line, KCLB)를 6 웰 플레이트에 1.0 X 10⁵ cells/well 로 접종하여 배양하였다. post-confluence된 상태를 확인한 후 실험을 실시하였다. 배양에 사용한 배지는 DMEM (Gibco, BRL. U.S.A)에 20% 불활성화된 FBS (Gibco, BRL. U.S.A)를 첨가하여 사용하였으며, 37℃ 의 10% CO₂ 배양기에서 배양하며 실험하였다. 유산균 부착 실험은 IPI-21 세포의 경우와 동일한 방법으로 시행하였다. 대조군은 무처리군으로 하였다.

장 세포에 부착된 각 유산균 수를 표 7에 나타내었으며, 그람 염색을 통한 부착 양상을 도 2에 나타내었다. PL9034 가 약 1.79 X 10⁵ 로 가장 많이 부착되었고, PL9028, PL9031 및 PL9033 도 각각 10⁴정도로 많이 부착되었다. 또한, PL9034 는 그람 염색 사진에서 보는 바와 같이 다른 선발 유산균과는 다른 성상으로 장간균임을 확인할 수 있었다.

	Caco-2 세포에 부착된 유산균 수 (단위: CFU)
PL9028	1.69 x 10⁴± 8.06 x 10³
PL9031	1.22 x 10⁴± 8.29 x 10³
PL9033	9.77 x 10³± 5.78 x 10²
PL9034	1.79 x 10⁵ ± 4.53 x 10⁴

실시예 6. 면역 관련 실험

대식 세포주 RAW 264.7 (mouse monocyte; macrophage from KCLB (Korean Cell Line Bank))을 10% FBS (Gibco BRL, Grand island, N.Y. U.S.A) 및 1% antibiotic-antimycotics (Gibco BRL, Grand island, N.Y. U.S.A) 이 첨가된 RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640, Gibco BRL, Grand island, N.Y. U.S.A) 배지에 배양하여 96 웰에 1.0 X 10⁵/웰 씩 접종하고 1 ug/㎖의 LPS (lipopolysaccaride)로 세포를 자극하였다. 이후 MRS broth에 계대 배양한 각 유산균을 PBS로 3회 세척을 실시한 후 최종 균수가 1.0 X 10⁸ CFU/웰 이 되도록 RPMI1640 에 현탁한 후 플레이트에 분주하고 24 시간 동안 37℃ 의 CO₂ 배양기에서 배양하였다. LPS 만 반응시킨 것, 유산균만 반응시킨 것, 및LPS 및 유산균을 같이 반응시킨 것의 상등액을 각각 모아서 cell free 상태를 만든 후 -70℃ 에 보관하였다가 면역증강관련 사이토카인 실험에 사용하였다. TNF-α Cytokine kit (Biosource, 542Flynn Road Camarillo, CA 93012, U.S.A)를 사용하였다. 50 ㎕ 의 세포 배양 상등액을 제조자의 프로토콜에 의해서 triple 로 분석하였다. SPECTRAmax 250 Microplate Spectrophotometer (Molec ㎕ar Devices, Sunnyvale, California, U.S.A)로 흡광도 450 nm에서 O.D (optical density)를 읽었다. 시료의 사이토카인의 농도를 결정하기 위한 각각의 사이토카인의 표준 (standard)은 제조자의 표준으로 일반화하였으며, 흡광도에 의한 O.D 값은 SOFTmaxPRO ELISA (Molec ㎕ar Devices, U.S.A)를 사용하여 사이토카인의 농도 변화를 측정하였다.

면역증강 실험의 사이토카인 값은 triple로 실험하였으며, 각각의 평균, 표준편차와 유의도는 PASW Statistics 17 version (spss Inc. U.S.A)으로 분석하였으며, 일원배치분산분석법 (one way ANOVA test)을 사용하여 대조군 (control)과 실험군을 비교 분석 하여 유의도를 구하였다.

전염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokine)인 TNF-α 는 비병원성균 (유산균)이 대식 세포 (macrophage cell)를 자극하면 분비되며, 이로 인해 사이토카인 mRNA 수준이 높아지게 되고, IL-10 이 분비된다. 본 발명에서 상기 방법으로 대식 세포주 (Raw 264.7) 에서 분비되는 TNF-α 의 농도를 측정한 결과, 무처리군인 대조군과 비교하여, 유산균만 처리한 경우 세포성 면역에 관여하는 TNF-α 가 모두 증가하였다. 또한, LPS 로 대식 세포주를 자극시 2000 pg/㎖ 이상의 TNF-α 가 분비되었고, LPS로 대식 세포주를 자극하고 유산균 을 처리한 경우 PL9031 및 PL9034 는 LPS 단독 처리시보다 TNF-α의 분비가 유의적으로 감소하였다 (도 3). 이 결과로, 우선 4 균주 모두는 유산균만 처리시 TNF-α 를 유도하였으므로 면역증강 효과가 있는 것이며, 특히 PL9031 및 PL9034는 LPS 에 의한 과도한 TNF-α 의 분비를 저하시키는 기능도 보였으므로, 박테리아 감염시 LPS 에 의해 유도되는 septic shock를 최소화 할 수 있는 기능을 가지는 것으로 판단된다.

실시예 7. 유산균의 내성 전이 유전자 실험

7-1. 유산균의 내성 유전자 확인

유산균의 Genomic DNA는 Cetyltrimethylammonium bromide 추출 방법 (이하 CTAB, Murray and Thompson, 1980)을 변형하여 수행하였다. 유산균을 5 ㎖ 의 MRS 배지에 접종하여 밤샘 배양하였다. Tris-EDTA (이하 TE) 버퍼로 세척하고 펠렛을 567 ㎕ TE 버퍼, 5 ㎕ RNaseA, 15 ㎕ 10% SDS, 및 20 unit mutanolysin 을 혼합하여 파이펫팅을 반복하면서 현탁액을 만들었다. 이 현탁액을 잘 섞으면서 37℃ 에서 1 시간 동안 배양한 후, -70℃ 에서 30 분 동안 얼리고 37℃ 에서 10 분 동안 녹였다. 4 ㎕ 프로테이나제 K (20 mg/㎖)를 첨가 하여 용해 (lysis)될 때까지 잘 섞으면서 37℃ 에서 1 시간 동안 배양하였다. 5 M NaCl 용액 100 ㎕ 를 넣고 잘 섞어주었다. 현탁액에 CTAB/NaCl (10% w/v; 0.7 M) 용액 80 ㎕를 넣고 65℃ 에서 10분간 배양하였다. 그 다음에 용해물 (lysate)을 거의 같은 양의 클로로포름/이소아밀 알코올 (24;1)과 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 (25:24:1)로 추출하였다. 최종적으로 genomic DNA는 한 배의 이소프로판올을 넣어 -20℃ 에서 30분 동안 침전시켰고 원심분리 하여 50 ㎕ TE 버퍼에 재현탁하였다.

유산균의 항생제 내성 유전자를 조사하기 위해 이미 잘 알려진 determinants를 PCR을 하여 확인하였다. 테트라사이클린 (tet genes) 과 에리트로마이신 (erm genes), 클린다마이신 (lnu (A) gene) 및 베타-락탐 항생제 (bla gene) 내성 관련 유전자를 PCR 증폭 방법으로 확인하였고 PCR 조건은 표 8에 기재된 대로 시행하였다. 그 결과 각 유산균이 가지고 있는 항생제 내성 유전자를 표 9에 나타내었다.

내성 유전자	프라이머	서열번호	PCR 조건	크기 (bp)
aad (E)	5'-GCAGAACAGGATGAACGTATTCG-3' 5'-ATCAGTCGGAACTATGTCCC-3'	5 6	94℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 30초; 30 사이클	369
bla	5'-CAT ART TCC GAT AAT ASM GCC-3' 5'-CGT STT TAA CTA AGT ATS GY-3'	7 8	95℃에서 30초 51℃에서 1분, 72℃에서 45초; 35 사이클	297
cat	5'-TTA GGT TAT TGG GAT AAG TTA-3' 5'-GCA TGR TAA CCA TCA CAW AC-3'	9 10	95℃에서 30초 48℃에서 1분 72℃에서 45초; 35 사이클	300
erm (A)	5'-AAGCGGTAAACCCCTCTGA-3' 5'-TTCGCAAATCCCTTCTCAAC-3'	11 12	94℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 30초; 30 사이클	190
erm (B)	5'-TTTTGAAAGCCGTGCGTCTG-3' 5'-CTGTGGTATGGCGGGTAAGTT-3'	13 14	94℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 30초; 30 사이클	202
erm (C)	5'-AATCGTCAATTCCTGCATGT-3' 5'-TAATCGTGGAATACGGGTTTG-3'	15 16	94℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 30초; 30 사이클	299
lnu (A)	5'-GGT GGC TGG GGG GTA GAT GTA TTA ACT GG-3' 5'-GCT TCT TTT GAA ATA CAT GGT ATT TTT CGA TC-3'	17 18	95℃에서 30초 55℃에서 30초 60℃에서 4분; 25 사이클	323
tet (K)	5'-CAATACCTACGATATCTA-3' 5'-TTGAGCTGTCTTGGTTCA-3'	19 20	94℃에서 30초 50℃에서 30초 72℃에서 30초; 30 사이클	352
tet (L)	5'-TGGTCCTATCTTCTACTCATTC-3' 5'-TTCCGATTTCGGCAGTAC-3'	21 22	94℃에서 30초 53℃에서 30초 72℃에서 30초; 30 사이클	385
tet (M)	5'-GGTGAACATCATAGACACGC-3' 5'-CTTGTTCGAGTTCCAATGC-3'	23 24	94℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 30초; 30 사이클	401
tet (O)	5'-AGCGTCAAAGGGGAATCACTATCC-3' 5'-CGGCGGGGTTGGCAAATA-3'	25 26	94℃에서 30초 55℃에서 30초 72℃에서 30초; 30 사이클	1723
tet (Q)	5'-AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG-3' 5'-CGGAGTGTCAATGATATTGCA-3'	27 28	94℃에서 30초 63℃에서 30초 72℃에서 30초; 30 사이클	169
tet (S)	5'-ATCAAGATATTAAGGAC-3' 5'-TTCTCTATGTGGTAATC-3'	29 30	94℃에서 1분, 55℃에서 1분 72℃에서 2분; 30 사이클	573
tet (T)	5'-AAGGTTTATTATATAAAAGTG-3' 5'-AGGTGTATCTATGATATTTAC-3'	31 32	94℃에서 30초 46℃에서 30초 72℃에서 30초; 30 사이클	169
tet (W)	5'-GGMCAYRTGGATTTYWTIGC-3' 5'-TCIGMIGGIGTRCTIRCIGGRC-3'	33 34	Touchdown	1187
tetB (P)	5'-AAAACTTATTATATTATAGTG-3' 5'-TGGAGTATCAATAATATTCAC-3'	35 36	94℃에서 30초 46℃에서 30초 72℃에서 30초; 30 사이클	169

항생제 내성 유전자

bla

cat

linA

aad (E)

erm (A)

erm (B)

erm (C)

tet (K)

tet (M)

tet (L)

tet (O)

tetB (P)

tet (Q)

tet (S)

tet (T)

tet (W)

PL9028

-

+

-

+

PL9031

-

+

PL9033

+

-

+

PL9034

-

--

+

7-2. 내성 전이 여부 확인

내성 전이 여부를 수용체 균주 (Enterococcus faecalis, JH2-2; Lactococcus lactis, LMG19460) 를 사용하여 실험하였다. Neve et al. (J. Bacteriol . vol. 157, 833-838, 1984) 방법을 변형한 Filter mating 법으로 실험하였다. 제공자 균주 (테트라사이클린에 내성인 유산균 균주) 및 수용체 균주 (Enterococcus faecalis, JH2-2 (리팜피신에만 내성), Lactococcus lactis, LMG19460 (리팜피신에 내성))를 MRS broth에 밤새 배양하였다. 배양 후에 제공자 (donor):수용체 (recipient) 비율을 10:1 로 혼합하였다. 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오스 필터로 필터링하고, 필터를 MRS 아가 플레이트 위에 놓고 35℃ 배양기에서 24 시간 메이팅 (mating) 시켰다. 메이팅 후에 필터를 MRS broth에 현탁 시키고, 제공자, 수용체 및 접합완료 (transconjugant) 세포를 분리하여 계수하기 위하여 이 배지를 단계 희석하여 적합한 항생제가 포함된 MRS 아가 플레이트에 도말하였다. Lactococcus lactis 는 혐기성 조건 하에서 실험하였다. 테트라사이클린의 최종 농도는 64 ug ㎖^-1 , 람파피신은 50 ug ㎖^- ¹ 으로 하였다. 그 결과, tet 유전자를 가진 4 균주는 모두 내성 유전자를 전이하지 않는 것으로 확인되었다.

실시예 8. 유산균의 동정

병원성균 억제 효과가 있는 락토바실러스 속 4 균주에 대하여 정확한 종을 결정하기위하여 유전자의 16S rRNA 염기배열을 비교하여 알려진 균주들의 염기배열과 비교함으로써 균주를 동정하였다. 동정 결과는 표 10에 나타내었다. 16S rRNA 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 분석에서 PL9028 은 99%의 16S rRNA 상동성으로 락토바실러스 살리바리우스의 표준 균주 (Lactobacillus salivarius strain CH-9)에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었고, PL9031 은 100%의 16S rRNA 상동성으로 락토바실러스 플란타룸의 표준 균주 (Lactobacillus plantarum strain MiLAB14) 에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다. 또한, PL9033 은 99%의 16S rRNA 상동성으로 락토바실러스 플란타룸의 표준 균주 (Lactobacillus plantarum strain BDLP0001) 에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었고, PL9034 은 100%의 16S rRNA 상동성으로 락토바실러스 아밀로보러스의 표준 균주 (Lactobacillus amylovorus strain LAB16) 에 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보여주는 균주로 동정되었다.

	기탁번호	16S rRNA 서열	Species
PL9028	KACC91678P	서열번호 1	L. salivarius
PL9031	KACC91679P	서열번호 2	L. plantarum
PL9033	KACC91680P	서열번호 3	L. plantarum
PL9034	KACC91681P	서열번호 4	L. amylovorus

농업생명공학연구원

KACC91678P

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KACC91681P

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<110> PL BIO., LTD. <120> Novel Lactobacillus sp. strains and their use as probiotics <130> DPP20115622KR <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1002 <212> DNA <213> Lactobacillus salivarius PL9028 (KACC91678P) <220> <221> gene <222> (1)..(1002) <223> 16S rRNA <400> 1 cgaaactttc ttacaccgaa tgcttgcatt caccgtaaga agttgagtgg cggacgggtg 60 agtaacacgt gggtaacctg cctaaaagaa ggggataaca cttggaaaca ggtgctaata 120 ccgtatatct ctaaggatcg catgatcctt agatgaaaga tggttctgct atcgctttta 180 gatggacccg cggcgtatta actagttggt ggggtaacgg cctaccaagg tgatgatacg 240 tagccgaact gagaggttga tcggccacat tgggactgag acacggccca aactcctacg 300 ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgcaagtc tgatggagca acgccgcgtg 360 agtgaagaag gtcttcggat cgtaaaactc tgttgttaga gaagaacacg agtgagagta 420 actgttcatt cgatgacggt atctaaccag caagtcacgg ctaactacgt gccagcagcc 480 gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagg gaacgcaggc 540 ggtcttttaa gtctgatgtg aaagccttcg gcttaaccgg agtagtgcat tggaaactgg 600 aagacttgag tgcagaagag gagagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata 660 tatggaagaa caccagtggc gaaagcggct ctctggtctg taactgacgc tgaggttcga 720 aagcgtgggt agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc 780 taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg ccgcagctaa cgcaataagc attccgcctg 840 gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 900 agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctttgac 960 cacctaagag attaggtttt cccttcgggg acaagtgaca gg 1002 <210> 2 <211> 932 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum PL9031 (KACC91679P) <220> <221> gene <222> (1)..(932) <223> 16S rRNA <400> 2 gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg 60 tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa 120 taccgcataa caacttggac cgcatggtcc gagtttgaaa gatggcttcg gctatcactt 180 ctggatggtc ccgcggcgta ttagctagat ggtgaggtaa cggctcacca tggcaatgat 240 acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct 300 acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc 360 gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga 420 gtaactgttc aggtattgac ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480 gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca 540 ggcggttttt taagtctgat gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac 600 tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag 660 atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct 720 cgaaagtatg ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccataccgt aaacgatgaa 780 tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc 840 ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 900 tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc ga 932 <210> 3 <211> 875 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum PL9033 (KACC91680P) <220> <221> gene <222> (1)..(875) <223> 16S rRNA <400> 3 acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat catgatttac atttgagtga gtggcgaact 60 ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga agcgggggat aacacctgga aacagatgct 120 aataccgcat aacaacttgg accgcatggt ccgagtttga aagatggctt cggctatcac 180 ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag atggtggggt aacggctcac catggcaatg 240 atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc 300 ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc 360 gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga acatatctga 420 gagtaactgt tcaggtattg acggtattta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480 cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg 540 caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa 600 actggaaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt 660 agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg 720 ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg 780 aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc 840 gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaa 875 <210> 4 <211> 975 <212> DNA <213> Lactobacillus amylovorus PL9034 (KACC91681P) <220> <221> gene <222> (1)..(975) <223> 16S rRNA <400> 4 cggaaccaac agatttactt cggtaatgac gttgggaaag cgagcggcgg atgggtgagt 60 aacacgtggg gaacctgccc ctaagtctgg gataccattt ggaaacaggt gctaataccg 120 gataataaag cagatcgcat gatcagcttt tgaaaggcgg cgtaagctgt cgctaaggga 180 tggccccgcg gtgcattagc tagttggtaa ggtaacggct taccaaggcg acgatgcata 240 gccgagttga gagactgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg 300 aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag 360 tgaagaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttggtga agaaggatag aggtagtaac 420 tggcctttat ttgacggtaa tcaaccagaa agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg 540 aaaaataagt ctaatgtgaa agccctcggc ttaaccgagg aactgcatcg gaaactgttt 600 ttcttgagtg cagaagagga gagtggaact ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata 660 tggaagaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgca actgacgctg aggctcgaaa 720 gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta 780 agtgttggga ggtttccgcc tctcagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840 gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat ctagtgcaat 960 ctgtagagat acgga 975 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aad (E) gene <400> 5 gcagaacagg atgaacgtat tcg 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for aad (E) gene <400> 6 atcagtcgga actatgtccc 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for bla gene <400> 7 catarttccg ataatasmgc c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for bla gene <400> 8 cgtstttaac taagtatsgy 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for cat gene <400> 9 ttaggttatt gggataagtt a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for cat gene <400> 10 gcatgrtaac catcacawac 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for erm (A) gene <400> 11 aagcggtaaa cccctctga 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for erm (A) gene <400> 12 ttcgcaaatc ccttctcaac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for erm (B) gene <400> 13 ttttgaaagc cgtgcgtctg 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for erm (B) gene <400> 14 ctgtggtatg gcgggtaagt t 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for erm (C) gene <400> 15 aatcgtcaat tcctgcatgt 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for erm (C) gene <400> 16 taatcgtgga atacgggttt g 21 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lnu (A) gene <400> 17 ggtggctggg gggtagatgt attaactgg 29 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lnu (A) gene <400> 18 gcttcttttg aaatacatgg tatttttcga tc 32 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (K) gene <400> 19 caatacctac gatatcta 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (K) gene <400> 20 ttgagctgtc ttggttca 18 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (L) gene <400> 21 tggtcctatc ttctactcat tc 22 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (L) gene <400> 22 ttccgatttc ggcagtac 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (M) gene <400> 23 ggtgaacatc atagacacgc 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (M) gene <400> 24 cttgttcgag ttccaatgc 19 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (O) gene <400> 25 agcgtcaaag gggaatcact atcc 24 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (O) gene <400> 26 cggcggggtt ggcaaata 18 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (Q) gene <400> 27 agaatctgct gtttgccagt g 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (Q) gene <400> 28 cggagtgtca atgatattgc a 21 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (S) gene <400> 29 atcaagatat taaggac 17 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (S) gene <400> 30 ttctctatgt ggtaatc 17 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (T) gene <400> 31 aaggtttatt atataaaagt g 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (T) gene <400> 32 aggtgtatct atgatattta c 21 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (W) gene (n is inosine) <400> 33 ggmcayrtgg atttywtngc 20 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tet (W) gene (n is inosine) <400> 34 tcngmnggng trctnrcngg rc 22 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tetB (P) gene <400> 35 aaaacttatt atattatagt g 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for tetB (P) gene <400> 36 tggagtatca ataatattca c 21

Claims

락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius) KACC91678P 균주, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KACC91679P 균주, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KACC91680P 균주 및 락토바실러스 아밀로보러스 (Lactobacillus amylovorus) KACC91681P 균주로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 생균제 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는 동물 사료용 첨가제.
제1항의 조성물을 포함하는 장내 병원성 미생물 감염 질환의 치료 또는 예방용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 장출혈성 대장균 (Enterohemorrhagic Escherichia coli; EHEC), 대장균 O157:H7, 대장균 O78, 대장균 O26, 살모넬라 엔테라이티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis) 및 살모넬라 더비 (Salmonella derby) 로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
제3항에 있어서, 상기 질환은 설사, 장염, 위장관염, 변비, 복통, 복부팽만, 콜레라 및 식중독으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항의 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하여 장내 병원성 미생물의 생육을 억제하거나 상기 미생물에 의한 설사를 예방 또는 치료하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 병원성 미생물이 장출혈성 대장균, 대장균 O157:H7, 대장균 O78, 대장균 O26, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 타이피뮤리움, 살모넬라 콜레라수이스 및 살모넬라 더비로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 동물은 돼지인 방법.
내산성 및 내담즙성을 나타내며, 장내 유해 미생물 생육 억제 활성 및 면역 증강 활성을 가지는 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius) KACC91678P 균주.
내산성 및 내담즙성을 나타내며, 장내 유해 미생물 생육 억제 활성 및 면역 증강 활성을 가지는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KACC91679P 균주.
내산성 및 내담즙성을 나타내며, 장내 유해 미생물 생육 억제 활성 및 면역 증강 활성을 가지는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) KACC91680P 균주.
내산성 및 내담즙성을 나타내며, 장내 유해 미생물 생육 억제 활성 및 면역 증강 활성을 가지는 락토바실러스 아밀로보러스 (Lactobacillus amylovorus) KACC91681P 균주.