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KR20130016244A - 단백질 키나아제의 억제제 - Google Patents

단백질 키나아제의 억제제 Download PDF

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KR20130016244A
KR20130016244A KR1020127025774A KR20127025774A KR20130016244A KR 20130016244 A KR20130016244 A KR 20130016244A KR 1020127025774 A KR1020127025774 A KR 1020127025774A KR 20127025774 A KR20127025774 A KR 20127025774A KR 20130016244 A KR20130016244 A KR 20130016244A
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KR
South Korea
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pyridin
alkyl
methoxyphenyl
fluoro
mmol
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020127025774A
Other languages
English (en)
Inventor
울리히 하이제르
앙드레 제이 니스트로이
루체 짜이틀만
Original Assignee
인게니움 파르마코이티칼스 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인게니움 파르마코이티칼스 게엠베하 filed Critical 인게니움 파르마코이티칼스 게엠베하
Publication of KR20130016244A publication Critical patent/KR20130016244A/ko
Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

하기 화학식(I)의 화합물은 단백질 키나아제 특히 사이클린 의존성 키나아제 패미리 및/또는 글리코겐 합성효소 키나아제 3 패미리 구성원의 억제제이며 또한 특정한 유형의 통증, 염증성 질환, 암, 면역질환, 증식성 질환, 감염성 질환, 심혈관 질환, 대사장애, 신 질환, 신경계 및 정신 신경 질환, 및 신경변성 질환을 예방 및/또는 치료하는데 유용하다.
Figure pct00034

상기 식에서, R1, R2, R3, Ra, A, B 및 x는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.

Description

단백질 키나아제의 억제제 {Inhibitors of Protein kinases}
본 발명은 단백질 키나아제 특히 사이클린 의존성 키나아제 패미리 및/또는 글리코겐 합성효소 키나아제 3 패미리 구성원의 억제제, 및 그의 치료적 적용에 관한 것이다. 더욱이 본 발명은 본 명세서에서 정의된 적어도 하나의 억제제의 유효량을 투여함을 포함하는, 특정한 유형의 통증, 염증성 질환, 암, 면역질환, 증식성 질환, 감염성 질환, 심혈관 질환, 대사장애, 신 질환, 신경계 및 정신 신경 질환, 및 신경변성 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
사이클린 의존성 단백질 키나아제 ("CDK")는 세포사이클 조절 및 전사 조절에서 세포 내에서 여러 가지 역할을 하는 잘 보존된 효소의 패미리를 구성한다 (Nasmyth, K., Science 1996, 274, 1643-1677; Morgan, D. O., Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 1997, 13, 261-291). CDK 1, 2, 3, 4, 및 6과 같은 패미리의 일부 구성원은 G1 (새로운 라운드의 세포분열에 대한 DNA 복제의 개시와 유사분열 사이의 간격) 내지 S (활성 DNA 합성효소의 기간)과 같은 세포주기의 상이한 상들 사이의 변화, 또는 활성 유사분열과 세포분열이 일어나는 G2에서 M상으로의 진행을 조절한다. CDK7, 8, 및 9를 포함하는 단백질의 이러한 패미리의 다른 구성원들은 전사 사이클에서 키 포인트를 조절하는 반면, CDK5는 신경 및 분비 세포 기능에서 역할을 한다.
CDK 복합체는 조절 사이클린 서브유닛 (예, 사이클린 A, B1, B2, D1, D2, D3, 및 E) 및 촉매적 키나아제 서브유닛 (예, cdc2 (CDK1), CDK2, CDK4, CDK5, 및 CDK6)의 회합을 통하여 형성된다. 명칭이 암시하는 바와 같이, CDK는 그의 표적 기질을 인산화하기 위하여 사이클린 서브 유닛에 대한 절대 의존성, 세포 사이클의 특정 부분을 통한 진행을 조절하기 위한 상이한 키나아제/사이클린 쌍 기능을 나타낸다.
CDK9는 그의 사이클린 파트너(사이클린 T1, T2a, T2b, 또는 K)과 함께 RNA 중합효소 II의 가장 큰 서브유닛의 카르복실 말단 영역(CTD)을 인산화시켜 전사의 신장상 중에 작용하는 양성 전사 신장 인자 b (P-TEFb) 단백질의 촉매 성분을 구성한다. P-TEFb는 양성 전사 인자는 물론 RNA전이의 음성 조절 인자와 협력하여 작용하며, 따라서 전사신장의 차단을 극복한다 (Liu, H., and Herrmann, C. H., J. Cell Physiol. 2005, 203, 251-260). P-TEFb를 선택적으로 억제하는 플라보피리돌 유사체가 최근에 기술되었다 (Ali, A. 등, Chembiochem. 2009, 10, 2072-2080).
신생세포의 기본 특성 중의 하나인 세포 사이클 조절곤란이 CDK 및 이의 조절 인자의 유전 변형 및 자유화와 밀접하게 연관되어 있는 것으로 알려져 있으며, 이것은 CDK의 억제제가 암과 같은 증식성 질환의 치료제로서 유용할 수 있다는 것을 암시한다. 따라서 CDK를 표적하는 소분자 억제제는 암치료요법에서 광범위하게 관심이 모아졌다 (Dai, Y., and Grant, S., Current Opinion in Pharmacology, 2003, 3, 362-370; Zhang, J. et al ., Nat. Rev. Cancer 2009, 9, 28-39). 세포 사이클 진행을 억제할 수 있는 능력은 암과 같은 증식성 질환의 치료제로서 CDK의 소분자 억제제의 일반적 역할을 제안한다. 최근에, CDK9/사이클린 T 작용의 억제는 또한 HIV 복제의 방지와 연관되어 있고 따라서 새로운 CDK 생물학의 발견은 예를 들면 바이러스 감염(WO 02/100401)과 같은, CDK 억제제에 대한 새로운 치료적 징후을 가능하게 하는데 기여한다(Sausville, E. A., Trends Molec. Med. 2002, 8, S32-S37). 이 분야에 대한 추가 조사는 Ali, A. et al . (Chembiochem. 2009, 10, 2072-2080)에 의해 발표되었다. CDK 억제제는 다른 것 중에서 면역 질환 및 신경변성 질환과 같은 다른 증상을 치료하는데 사용할 수 있는 것으로 생각된다.
50 이상의 약리적 CDK 억제제가 기술되었으며, 이들의 일부는 강력한 항종양 활성을 갖는다 (Dai, Y., and Grant, S., Current Opinion in Pharmacology, 2003, 3, 362-370). 최근에, CDK 억제제에 대한 종양세포의 민감성을 예측하기 위한 분자 마커가 기술되었다(Eguchi, T. et al ., Mol. Cancer Ther. 2009, 8, 1460-1472). 단백질 키나제 억제제의 민감성에 관한 기여는 Bain, J. et al . (Biochem. J 2007, 408, 297-315) 및 Karaman, M. W. et al . (Nat. Biotechnol. 2008, 26, 127-132)에 의해 조사되고 발표되었다. 더욱이 공지된 CDK 억제제에 대한 개괄적인 검토는 문헌에서 발견할 수 있다 (Huwe, A. et al ., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2003, 42, 2122-2138; Krug, M. and Hilgeroth, A. Mini. Rev. Med Chem 2008, 8, 1312-1327). 예를 들면 암의 치료를 위한 사이클린 의존성 키나아제 억제제로서 2-아닐리노-4-페닐피리미딘 유도체의 사용이 국제출원공개 WO 2005/012262호에서 보고되었다. 더욱이, 암 등을 치료하기 위한 2-피리미디닐아미노-4-티아졸릴-피리미딘 유도체가 국제출원공개 WO 2005/012298호에 기술되었다. 단백질 키나아제 억제제로서 4,5-디하이드로-티아졸로, 옥사졸로 및 이미다졸로[4,5-h]퀴나졸린-8-일아민은 국제출원공개 WO 2005/005438호에 공지되어 있다. 더욱이, 사이클린 의존성 키나아제 억제제로서 유용한 인돌리논 유도체 및 인디루빈 유도체는 국제출원공개 WO 02/081445호 및 WO 02/074742호에 기술되었다. 추가로, 다양한 치료 적용을 위한 CDK 억제제는 국제출원공개 WO2005/026129호에 기술되었다.
공지된 CDK 억제제는 일반적으로 CDK를 억제할 수 있는 그의 능력에 따라 또는 특이적 CDK에 대한 그의 선택성에 따라 분류할 수 있다. 플라보피리돌은 예를 들면 판(pan) CDK 길항제로서 작용하며 또한 특이적 CDK에 대해 특히 선택적이지 않다 (Dai, Y., and Grant, S., Current Opinion in Pharmacology, 2003, 3, 362-370). 퓨린 기본 CDK 억제제, 예를 들면 오로모우신, 로소비틴, 푸르바놀올 및 CGP74514A는 CDK 1, 2 및 5에 대해 더 큰 선택성을 나타내지만, CDK 4 및 6에 대한 억제활성을 나타내지 않는 것으로 알려져 있다 (Dai, Y., and Grant, S., Current Opinion in Pharmacology, 2003, 3, 362-370). 더욱이, 로스코비틴과 같은 퓨린 기본 CDK 억제제는 신경계에서 항-아포토시스 효과를 발휘하거나 (O'Hare, M. et al., Pharmacol Ther 2002, 93, 135-143) 또는 알쯔하이머 질환과 같은 신경변성 질환에서 신경 세포사를 예방할 수 있는 것으로 입증되었다 (Filgueira de Azevedo, W. Jr., Biochem Biophys Res Commun 2002, 297, 1154-1158; Knockaert, M. et al ., Trends Pharmacol Sci 2002, 23, 417-425).
증식성, 면역학적, 감염성, 심혈관 및 신경 변성 질환과 같은 증상의 치료를 위한 CDK를 표적하는 무한한 잠재성을 고려해볼 때, 특수한 CDK의 선택적 억제제로서 소분자의 개발이 바람직한 목표를 구성한다.
글리코겐 합성효소 키나아제-3 (GSK3)는 처음에는 글리코겐 대사의 조절에 수반된 효소로서, 특히 글리코겐 합성효소를 비활성화하는 단백질 키나아제로서, 확인되었다. 더욱 최근에, 전사 인자, 대사성 효소, 구조 단백질 및 신호 단백질을 포함하는 여러 가지 표적 단백질을 인산화함으로써 다양한 범위의 세포 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 (Lee, J. et al ., Diabetes Res Clin Pract. 2007, 77, Suppl 1:S49-57). 따라서, GSK3는 세포내 시그날 전달경로를 조절하는 주요 효소로서 간주되며, 따라서 세포외 및 세포내 조절 인자에 대한 세포 반응을 조절한다. GSK3의 두 개의 이소형(isoform)이 기술되었으며 (GSK3-알파 및 -베타), 이들은 높은 서열 상동성 (전체 86% 및 키나아제 영역에서 97%) 및 생화학 특성을 기본으로 하여 서로 매우 유사하다. 그러나, 이들의 생리학적 기능은 유전자 비활성화가 마우스에서 상이한 표현형을 유도하기 때문에 충분히 과잉이지 않을 수 있다 (Lee, J. et al ., Diabetes Res Clin Pract. 2007, 77, Suppl 1:S49-57).
GSK3 활성 또는 발현의 세포 표적 및 유전자 또는 약리학적 조절의 동정을 기본으로 하여, GSK3는 여러 가지 심각한 인간 질병의 분자 병인에 연관되는 것으로 보인다. 예를 들면, GSK3 억제는 대사 질환을 포함한 인간 질환, 특히 당뇨병 (MacAulay, K. et al ., Expert Opin Ther Targets. 2008, 12, 1265-1274; Rayasam, G. V. et al ., Br J Pharmacol. 2009, 156, 885-898; Lee, J. et al ., Diabetes Res Clin Pract. 2007, 77, Suppl 1:S49-57), 알쯔하이머 병, 파킨스병, 근위축성 측색 경화증 및 헌팅톤병을 포함한 신경 변성 질환(Hooper, C. et al ., J Neurochem. 2008, 104, 1433-1439; Martinez, A., Med Res Rev. 2008, 28, 773-796; Wada, A., Front Biosci. 2009, 14, 1558-1570; Huang, H. C. et al ., Curr Drug Targets. 2006, 7, 1389-1397), 실질성 신장병 (Obligado, S. H. et al ., Kidney Int. 2008, 73, 684-690), 쌍극성 장애를 포함한 신경성 및 정신 신경성 질환 (O'Brien, W. T. et al ., Biochem Soc Trans. 2009, 37, (Pt 5) 1133-1138; Jope, R. S. et al ., Curr Drug Targets. 2006, 7, 1421-1434), 심근 경색 및 뇌졸중을 포함한 심혈관 질환 (Juhaszova, M. et al ., Circ Res. 2009, 104, 1240-1252), 암을 포함한 증식성 질환 (Luo, J. et al ., Cancer Lett. 2009, 273, 194-200) 및 다발성 경화증, 관절염 및 결장염을 포함한 염증성 질환(Jope, R. S. et al., Neurochem Res. 2007, 32, 577-595)에서 치료 효과를 발휘하는 것으로 제안되었다.
여러 가지 GSK3 소분자 억제제, 예를 들면 아미노-피리미딘, 티아디아졸리딘디온, 말레이이미드, 인디루빈, 파울론 및 히메니알디신이 확인되었다 (Cohen, P. et al ., Nat Rev Drug Discov. 2004, 3, 479-487; Martinez, A., Med Res Rev. 2008, 28, 773-796). 최근에, 두 개의 개시된 GSK3 억제제가 알쯔하이머 병의 치료를 위한 질환 조절 약물로서 임상적 개발에 들어갔다. 그러나, 현재 알려진 억제제의 키나아제 선택성은 제한된 것으로 보이며 또한 추가의 약학적 개발에 중요할 수 있다. 그 외에, 지금까지 개발된 모든 GSK3 억제제는 유사한 잠재성을 갖는 GSK3, GSK3 알파 및 베타의 두 개 이소형을 억제한다 (Martinez A., Med Res Rev. 2008, 28, 773-796). 따라서, GSK3의 더욱 개선된 억제제에 대한 필요성이 강하게 지적된다.
본 발명은 CDK9와 같은 사이클린-의존성 키나아제 및/또는 GSK3-알파 및 -베타와 같은 글리코겐 합성효소 키나아제 3 패미리 구성원의 신규 소분자 억제제를 제공한다. 적합하게, 상기 소분자 억제제는 특수한 CDK, 특히 CDK9, 및/또는 글리코겐 합성효소 키나아제 3 패미리 구성원을 억제하는데 선택성을 나타낸다. 상기 소분자 억제제는 증식성, 면역성, 신경변성, 감염성 및 심혈관 질환과 같은 증상의 치료에 대한 치료적 유용성을 가질 수 있다. 더욱이 본 발명의 소분자 억제제는 놀랍게도 염증성 질환 및 임의 유형의 통증의 치료에 유익한 효과를 발휘하는 것으로 나타났다.
염증성 질환 및 임의 유형의 통증에 대한 현재 치료는 단지 부분적으로만 효과적이며, 또한 쇠약하게 하거나 위험한 부작용의 원인이 될 수 있다. 예를 들면, 심한 통증을 치료하기 위해 사용된 종래의 진통제의 많은 것은 구토, 현기증, 변비, 호흡저하, 및 인지장애와 같은 약화하는 부작용을 유발한다 (Brower, V., Nat Biotechnol. 2000, 18, 387-391).
염증 및 특히 염증성 통증의 치료를 위한 현재의 접근법은 사이토카인 억제 (예, 1L1β) 및 염증 유발성 TNFα의 억제를 목적으로 한다. 현재 인정된 항 사이토카인/항 TNFα 치료는 혈류에서 TNFα 순환을 감소시키는 인플릭시맙 및 에타너셉트와 같은 키메라 항체를 기본으로 한다. TNFα는 COX-2, MMP, iNOS, cPLa2 및 기타와 같은 중요한 효소의 합성을 유도하는 가장 중요한 염증성 매개체 중의 하나이다. 그러나 이들 "생물학적 제제"의 주요한 결점은 순환 TNFα의 거의 디지털 전부나 제로 감소를 유도하는 효율 및 그의 동력학의 부수적 손실을 갖는 이들의 면역원성 잠재성에 있다. 후자는 심각한 면역 억제성 부작용을 생기게 할 수 있다.
따라서 이러한 치료의 통상적 결과는 부분적이거나 만족스럽지 못하고, 일부의 경우에 이들 약물의 부작용이 그의 임상적 유용성보다 더 크다.
결론적으로, 염증성 질환, 특히 만성 염증성 및 신경병성 통증을 치료하는 안전하고 효과적인 방법에 대한 높게 충족되지 않는 요구가 있다.
분절 기본 스크리닝 기술 및 구조 기본 약물 설계 또는 리간드 결합 모드의 지식 기본 예측같은 새로운 접근법들이 최근 문헌들에 기술되었다 (Wyatt, P. G. et al ., J Med Chem 2008, 51, 4986-4999; Ghose, A. K. et al ., J Med Chem 2008, 51, 5149-5171). CDK9의 구조적 특징에 대한 추가의 안목은 플라보피리돌과 복합체 CDK9/사이클린 T1의 해결된 X-선 구조의 간행물에 의해 수행되었다 (Baumli, S. et al., EMBO J 2008, 27, 1907-1918).
정의
명세서 및 특허청구범위 전반을 통하여, 표현 "알킬"은, 구체적으로 제한되지 않는 한, C1 -12 알킬기, 적합하게는 C1 -6 알킬기, 예, C1 -4 알킬기를 나타낸다. 알킬기는 직쇄이거나 또는 분지될 수 있다. 적절한 알킬기는, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필 (예, n-프로필 및 이소프로필), 부틸 (예, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸 및 tert-부틸), 펜틸(예, n-펜틸), 헥실(예, n-헥실), 헵틸 (예, n-헵틸) 및 옥틸 (예, n-옥틸)을 포함한다. 예를 들면 표현 "알콕시", "할로알킬" 및 "티오알킬"에서 표현 "알크"는 "알킬"의 정의에 따라 해석되어야 한다. 대표적인 알콕시기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시 (예, n-프로폭시), 부톡시(예. n-부톡시), 펜톡시(예, n-펜톡시), 헥속시 (예, n-헥속시), 헵톡시 (예, n-헵톡시) 및 옥톡시 (예, n-옥톡시)를 포함한다. 예시적인 티오알킬기는 메틸티오-를 포함한다. 대표적인 할로알킬기는 플루오로알킬, 예를 들면 CF3를 포함한다.
표현 "알케닐"은, 구체적으로 제한되지 않는 한, C2 -12 알케닐기, 적절하게는 C2-6 알케닐기, 예, C2 -4 알케닐기를 나타내며, 이는 임의의 원하는 위치에서 적어도 하나의 이중 결합을 포함하고 임의의 삼중 결합을 포함하지 않는다. 알케닐기는 직쇄이거나 분지될 수 있다. 하나의 이중결합을 포함하는 예시적인 알케닐기는 프로페닐 및 부테닐을 포함한다. 2개의 이중 결합을 포함하는 예시적인 알케닐기는 펜타디엔닐, 예, (1E, 3E)-펜타디엔닐을 포함한다.
표현 "알키닐"은, 구체적으로 제한되지 않는 한, C2 -12 알키닐기, 적절하게는 C2-6 알키닐기, 예, C2 -4 알키닐기를 나타내며, 이는 임의의 원하는 위치에서 적어도 하나의 삼중결합을 포함하며 또한 하나 이상의 이중결합을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 알키닐기는 직쇄이거나 분지될 수 있다. 예시적인 알키닐기는 프로핀일 및 부틴일을 포함한다. 표현 "알킬렌"은 구체적으로 제한되지 않는 한 식 -(CH2)n-의 사슬 (여기서 n은 정수, 예, 1 내지 5임)을 나타낸다.
표현 "사이클로알킬"은, 구체적으로 제한되지 않는 한, C3 -10 사이클로알킬기 (즉 3 내지 10개 고리 탄소 원자), 더욱 적절하게는 C3 -8 사이클로알킬기, 예, C3 -6 사이클로알킬기를 나타낸다. 대표적인 사이클로알킬기는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸을 포함한다. 고리 탄소 원자의 가장 적절한 수는 3 내지 6이다.
표현 "사이클로알케닐"은, 구체적으로 제한되지 않는 한, C5 -10 사이클로알케닐기 (즉 5 내지 10개 고리 탄소 원자), 더욱 적절하게는 C5 -8 사이클로알케닐기, 예, C5 -6 사이클로알케닐기를 나타낸다. 대표적인 사이클로알케닐기는 사이클로펜텐일, 사이클로헥센일, 사이클로헵텐일 및 사이클로옥텐일을 포함한다. 고리 원자의 가장 적절한 수는 5 내지 6이다.
표현 "카르보사이클릭" 또는 "카르보사이클"은, 구체적으로 제한되지 않는 한, 모든 고리 원자가 탄소이고 3 내지 12개 고리 탄소 원자, 적절하게는 3 내지 10개 탄소 원자 및 더욱 적절하게는 3 내지 8개 탄소 원자를 포함하는 임의의 고리 시스템을 나타낸다. 카르보사이클릭기는 포화되거나 부분적으로 포화될 수 있지만, 방향족 고리에 융합된 방향족 고리 또는 비방향족 고리를 포함하지 않을 수 있다. 카르보사이클릭 기의 예는 모노사이클릭, 바이사이클릭, 및 트리사이클릭 고리 시스템, 특히 모노사이클릭 및 바이사이클릭 고리 시스템을 포함한다. 다른 카르보사이클릭(carbocylcyl)기는 다리 결합 고리 시스템 (예, 비사이클로[2.2.1]헵텐일)을 포함한다. 카르보사이클릭기의 구체예는 사이클로알킬기이다. 카르보사이클릭 기의 추가 예는 사이클로알케닐기이다.
표현 "헤테로사이클릭" 또는 "헤테로사이클"은, 구체적으로 제한되지 않지만, 하나 이상(예, 1, 2 또는 3개)의 고리 원자가 N, S 및 O로부터 선택된 헤테로원자로 치환된 카르보사이클릭기를 나타내다. 헤테로사이클릭기의 구체예는 하나 이상 (예, 1, 2 또는 3, 특히 1 또는 2, 특히 1) 고리 원자가 N, S 또는 O (특히 N 또는 O)으로부터 선택된 헤테로원자로 치환된 사이클로알킬기 (예, 사이클로펜틸 또는 더욱 특히 사이클로헥실)을 나타낸다. 하나의 헤테로 원자를 함유하는 대표적인 헤테로사이클릭기는 피롤리딘, 테트라하이드로푸란 및 피페리딘을 포함하며, 또한 두 개의 헤테로원자를 함유하는 대표적인 헤테로사이클릭기는 모르폴린 및 피페라진을 포함한다. 헤테로사이클릭기의 더욱 구체적인 예는 하나 이상 (예, 1, 2 또는 3, 특히 1 또는 2, 특히 1)의 고리원자가 N, S 및 O (특히 N 또는 O) 고리원자로부터 선택된 헤테로원자에 의해 치환되는 사이클로알케닐기 (예, 사이클로헥센일기)이다. 이러한 기의 예는 디하이드로피란일 (예, 3,4-디하이드로-2H-피란-2-일-)이다.
표현 "아릴"은, 구체적으로 제한되지 않는 한, C6 -12 아릴기, 적합하게는 C6 -10 아릴기, 더욱 적합하게는 C6 -8 아릴기를 나타낸다. 아릴기는 적어도 하나의 방향족 고리 (예, 두 개 또는 세 개 고리)를 함유할 것이지만, 비방향족인 추가적인 고리를 함유할 수도 있다. 하나의 방향족 고리를 갖는 대표적인 아릴기의 예는 페닐이다. 두 개의 방향족 고리를 갖는 대표적인 아릴기의 예는 나프틸이다. C5 -8 카르보사이클릭 (적합하게는 C5 -6 카르보사이클릭)에 융합된 페닐(예, 인단)이 또한 아릴의 일예이다.
표현 "헤테로아릴", 구체적으로 제한되지 않는 한, 하나 이상 (예, 1, 2, 3 또는 4, 적합하게는 1, 2 또는 3) 고리 원자가 N, S 및 O로부터 선택된 헤테로원자에 의해 치환되거나 또는 N, S 및 O로부터 선택된 하나 이상 (예, 1, 2, 3 또는 4, 적합하게는 1, 2 또는 3) 고리원자를 함유하는 5원 방향족 고리에 의해 치환되는 아릴 잔기를 나타낸다. 하나의 헤테로원자를 갖는 대표적인 모노사이클릭 헤테로아릴기는 5원 고리 (예, 피롤, 푸란, 티오펜); 및 6원 고리 (예, 피리딘, 예를 들어 피리딘-2-일, 피리딘-3-일 및 피리딘-4-일)을 포함한다. 두 개의 헤테로원자를 갖는 대표적인 모노사이클릭 헤테로아릴기는 5원 고리(예, 피라졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 이미다졸, 예를 들어 이미다졸-1-일, 이미다졸-2-일, 이미다졸-4-일); 6원 고리 (예, 피리다진, 피리미딘, 피라진)을 포함한다. 3개의 헤테로원자를 갖는 대표적인 모노사이클릭 헤테로아릴기는 1,2,3-트리아졸 및 1,2,4-트리아졸을 포함한다. 4개의 헤테로원자를 갖는 대표적인 모노사이클릭 헤테로아릴기는 테트라졸을 포함한다. 대표적인 바이사이클릭 헤테로아릴기는 인돌 (예, 인돌-6-일), 벤조푸란, 벤조티오펜, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 인다졸, 벤즈이미다졸, 벤즈티아졸, 퀴나졸린 및 퓨린을 포함한다. 헤테로사이클릭에 융합된 페닐 (예, 벤조-1,3-디옥솔-5-일, 2,3-디하이드로-벤졸 1,4-디옥신-6-일)이 또한 헤테로아릴의 일예이다. 적합하게는 헤테로원자 또는 헤테로원자는 방향족 고리의 멤버이다.
전술한 아릴 및 헤테로아릴기는, 필요에 따라, 하나 이상 (예, 1, 2 또는 3, 전형적으로 1 또는 2)의 일가 또는 다가 작용기에 의해 임의로 치환될 수 있다. 적절한 치환기는 알킬, 사이클로알킬, 페닐, 피리딜, 푸릴, 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 알콕시, 사이클로알콕시, 페닐옥시, 카르보사이클릭옥시, 헤테로사이클릭옥시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 알케닐, 알키닐, 알카노일, 알콕시알카노일, 알콕시알킬, 니트로, -S-알킬 (예, 메틸티오), 할로 (예, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도), 시아노, 하이드록실, -SO2 알킬, -SO2 사이클로알킬, -SO2 헤테로사이클릭, -CO2H, -CO2 알킬, -NH2, -NH알킬, -N(알킬)2 (예, 디메틸아미노), -CO-N(알킬)2 및 -CO-NH(알킬)을 포함한다. 대부분의 대표적 치환기는 알킬, 알콕시, 할로, 니트로 및 하이드록실로부터 선택된다.
치환된 아릴기의 예는 4-플루오로-페닐, 3-플루오로-페닐, 펜타플루오로-페닐, 4-하이드록시페닐-, 3-니트로-페닐-, 4-(트리플루오로메틸)-페닐-, 4-아닐리닐-, 2-비페닐일-, 3-비페닐일- 및 4-비페닐일-을 포함한다. 치환된 헤테로아릴기의 예는 N-메틸-2-피롤릴, 2-메틸-1-피롤릴, 3-메틸-2-피롤릴 및 3-페닐-1-피롤릴을 포함한다.
-알킬아릴의 예는 페닐메틸- (예, 벤질) 및 페닐에틸, 2-페닐에트-1-일, p-톨릴-메틸-, p-톨릴-에틸-, m-톨릴-메틸-, m-톨릴-에틸-, o-톨릴-메틸-, o-톨릴-에틸-, 2-(4-에틸-페닐)-에트-1-일-, 2,3-디메틸-페닐-메틸-, 2,4-디메틸-페닐-메틸-, 2,5-디메틸-페닐-메틸-, 2,6-디메틸-페닐-메틸-, 3,4-디메틸-페닐-메틸-, 3,5-디메틸-페닐-메틸-, 2,4,6-트리메틸-페닐-메틸-, 2,3-디메틸-페닐-에틸-, 2,4-디메틸-페닐-에틸-, 2,5-디메틸-페닐-에틸-, 2,6-디메틸-페닐-에틸-, 3,4-디메틸-페닐-에틸-, 3,5-디메틸-페닐-에틸-, 2,4,6-트리메틸-페닐-에틸-, 벤즈히드릴 (예, 디페닐-메틸, 디페닐-에틸), 트리틸 (예, 트리페닐-메틸), 트리페닐-에틸, 큐밀 (예, 1-메틸-1-페닐에틸), 2-에틸-페닐-메틸-, 3-에틸-페닐-메틸-, 4-에틸-페닐-메틸-, 2-에틸-페닐-에틸-, 3-에틸-페닐-에틸-, 4-에틸-페닐-에틸-, 2-플루오로-벤질, 1-메틸-2-플루오로-펜-6-일-메틸-, 1-메틸-2-플루오로-펜-4-일-메틸-, 1-메틸-2-플루오로-펜-6-일-에틸-, 1-메틸-2-플루오로-펜-4-일-에틸-, 1H-인데닐-메틸-, 2H-인데닐-메틸-, 1H-인데닐-에틸-, 2H-인데닐-에틸-, 인다닐-메틸-, 인단-1-온-2-일-메틸-, 인단-1-온-2-일-에틸-, 테트랄리닐-메틸-, 테트랄리닐-에틸-, 플루오로렌닐-메틸-, 플루오렌닐-에틸-, 디하이드로나프탈리닐-메틸-, 디하이드로나프탈린닐-에틸-, 또는 (4-사이클로헥실)-페닐-메틸-, (4-사이클로헥실)-페닐-에틸-을 포함한다. 가장 대표적인 -알킬아릴은 페닐메틸-이다.
-알킬헤테로아릴의 예는 피리디닐메틸- (예, 2-피리디닐메틸), N-메틸-피롤-2-메틸-, N-메틸-피롤-2-에틸-, N-메틸-피롤-3-메틸-, N-메틸-피롤-3-에틸-, 2-메틸-피롤-1-메틸-, 2-메틸-피롤-1-에틸-, 3-메틸-피롤-1-메틸-, 3-메틸-피롤-1-에틸-, 4-피리디노-메틸-, 4-피리디노-에틸-, 2-(티아졸-2-일)-에틸-, 테트라하이드로이소키놀리닐-메틸-, 테트라하이드로이소키놀리닐-에틸-, 2-에틸-인돌-1-메틸-, 2-에틸-인돌-1-에틸-, 3-에틸-인돌-1-메틸-, 3-에틸-인돌-1-에틸-, 4-메틸-피리딘-2-메틸-, 4-메틸-피리딘-2-일-에틸-, 4-메틸-피리딘-3-메틸, 4-메틸-피리딘-3-에틸을 포함한다. 가장 대표적인 -알킬헤테로아릴기는 피리디닐메틸-이다.
표현 "-알킬카르복실릭"은, 구체적으로 제한되지 않는 한, 알킬렌 부위, 예, C1-4 알킬렌 부분을 통해 결합된 카르보사일클릭 잔기를 나타낸다.
표현 "-알킬헤테로사이클릭"은, 구체적으로 제한되지 않는 한, 알킬렌 부위, 예, C1 -4 알킬렌 부위를 통해 결합된 헤테로사이클릭 잔기를 나타낸다.
표현 "-알킬아릴"은, 구체적으로 제한되지 않는 한, 알킬렌 부위, 예, C1 -4 알킬렌 부위를 통해 결합된 아릴 잔기를 나타낸다.
표현 "-알킬헤테로아릴"은, 구체적으로 제한되지 않는 한, 알킬렌 부위, 예, C1-4 알킬렌 부위를 통해 결합된 헤테로아릴 잔기를 나타낸다.
용어 "할로겐" 또는 "할로"는 플루오로 (F), 클로로 (Cl) 및 브롬(Br)을 포함한다.
용어 "아미노"는 그룹 -NH2을 나타낸다.
입체 이성체
특허청구된 화합물의 모든 가능한 입체이성체는 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따른 화합물이 적어도 하나의 키랄 중심을 갖는 경우, 이들은 에난티오머로서 존재할 수 있다. 상기 화합물이 두 개 이상의 키랄 중심을 갖는 경우, 이들은 추가로 부분입체이성체로서 존재할 수 있다. 이러한 이성체들 및 그의 혼합물은 모두 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해하여야 한다.
입체이성체의 제조 및 분리
본 발명에 따른 화합물의 제조방법이 입체이성체들의 혼합물을 생성하는 경우, 이들 이성체는 분취용 크로마토그래피와 같은 통상적인 기술에 의해 분리할 수 있다. 본 화합물은 라세미 형태로 제조할 수 있거나, 또는 개개 에난티오머는 에난티오 특이적 합성 또는 분해에 의해 제조할 수 있다. 본 화합물은 예를 들면 (-)-디-p-톨루오일-D-타타르산 및/또는 (+)-디-p-톨루오일-L-타타르산 등의 광학적 활성산에 의한 염 형성 후에 상기 유리 염기의 분별결정 및 재생에 의한 부분입체이성체 쌍의 형성과 같은 통상의 기술에 의해 이들의 성분 에난티오머로 분해할 수 있다. 본 화합물은 또한 부분입체 이성체 에스테르 또는 아미드의 형성 후에 크로마토그래피 분리 및 키랄 보조제의 제거에 의해 분해할 수 있다.
약학적으로 허용되는 염:
유리 화합물들과 이들의 염 또는 용매화물 형태의 화합물 간의 밀접한 관계를 고려하여, 화합물이 본 문맥에서 언급될 때마다, 그런 사정으로 볼 때 가능하거나 적절하다면, 상응하는 염, 용매화물 또는 다형체가 또한 의도된다.
용매화물
상기 화합물의 일부는 물과의 용매화물 (예, 수화물) 또는 통상의 유기용매를 형성할 수 있으며, 또한 이러한 용매화물은 또한 본 발명의 범위 내에서 포함되는 것으로 의도된다. 이들의 염을 포함하는 본 화합물은 또한 이들의 수화물 형태로 얻어질 수 있거나, 또는 이들의 결정화를 위해 사용되는 다른 용매를 포함한다.
약물에 사용하기에 적합한 화학식(I)의 화합물의 염 및 용매화물 및 그의 생리학적 작용성 유도체는 대이온 또는 연합용매가 약학적으로 허용가능한 것들이다. 그러나, 비-약학적으로 허용되는 대이온 또는 연합용매를 갖는 염 및 용매화물은 예를 들면 다른 화합물 및 이들의 약학적으로 허용되는 염 및 용매화물의 제조에 있어서 중간체로서 사용하기 위해 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에 따른 적합한 염은 유기 및 무기산 또는 염기로 형성된 것들을 포함한다. 약학적으로 허용되는 산부가염은 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산, 시트르산, 타타르산, 인산, 락트산, 피루빈산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 트리페닐아세트산, 설팜산, 설파닐산, 숙신산, 옥살산, 푸마르산, 말레산, 말산, 만델산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살로아세트산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 아릴설폰산 (예를 들면, p-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 나프탈렌설폰산 또는 나프탈렌디설폰산), 살리실산, 글루타르산, 글루콘산, 트리카르발릴산, 신남산, 치환된 신남산 (예를 들면, 페닐, 메틸, 메톡시 또는 할로 치환된 신남산, 예를 들면 4-메틸 및 4-메톡시신남산), 아스코르브산, 올레산, 나프토에산, 하이드록시나프토에산(예를 들면 1- 또는 3-하이드록시-2-나프토에산), 나프탈렌아크릴산 (예를 들면 나프탈렌-2-아크릴산), 벤조산, 4-메톡시벤조산, 2- 또는 4-하이드록시벤조산, 4-클로로벤조산, 4-페닐벤조산, 벤젠아크릴산 (예를 들면 1,4-벤젠디아크릴산), 이세티온산, 과염소산, 프로피온산, 글리콜산, 하이드록시에탄설폰산, 파모산, 사이클로헥산설팜산, 살리실산, 사카린산 및 트리플루오로아세트산, 특히 염산으로부터 형성된 것들을 포함한다. 약학적으로 허용되는 염기염은 암모늄염, 알칼리금속 염 예를 들어 나트륨 및 칼륨의 것들, 알칼리 토금속염 예를 들어 칼슘 및 나그네슘의 것들 및 유기염기와의 염 예를 들어 디사이클로헥실아민 및 N-메틸-D-글루카민을 포함한다.
본 발명의 화합물의 모든 약학적으로 허용되는 산부가염 형태는 본 발명의 범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
다형체 결정 형태:
더욱이, 본 화합물의 결정 형태의 일부는 다형체(polymorph)로 존재할 수 있으며 또한 이들은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
전구 약물:
본 발명은 본 발명의 화합물의 전구 약물을 그의 범위에 추가로 포함한다. 일반적으로, 이러한 전구 약물은 원하는 치료학적으로 활성 화합물로 생체내에서 용이하게 전환 가능한 화합물의 작용성 유도체일 것이다. 따라서 이들 경우에, 즉 본 발명의 치료 방법에서, 용어 "투여하는"은 청구된 화합물 중의 하나 이상의 전구 약물 유형과 함께 기술된 다양한 장애의 치료를 포함하지만, 이것은 대상에게 투여한 후 생체내에서 상기 명시된 화합물로 전환한다. 적절한 전구 약물 유도체의 선택 및 제조를 위한 통상적인 절차는 예를 들면 "Design of Prodrugs" ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985에 기술되어 있다.
보호기:
본 발명의 화합물의 제조방법의 어느 것 중에, 관련된 분자의 어느 것에 민감성 또는 반응성 기를 보호하는 것이 필요하고 및/또는 바람직할 수 있다. 이것은 통상적인 보호기, 예를 들면 여기에서 전적으로 참고로 인용되는 문헌들에 기술된 것들을 사용하여 달성할 수 있다 (Protective Groups in Organic Chemistry, ed. McOmie, J. F. W., Plenum Press, 1973; Greene, T. W. and Wuts, P. G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991). 보호기는 당해 분야에 알려진 방법을 사용하여 편리한 후속단계에서 제거할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조성물"은 치료학적 유효량으로 청구된 화합물을 포함하는 생성물은 물론, 청구된 화합물들의 조합으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생기는 임의의 생성물을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명은 사이클린 의존성 키나아제 및/또는 글리코겐 합성효소 키나제 3 패미리 구성원의 억제제, 및 유효량의 사이클린 의존성 키나아제 (cdk, CDK) 및/또는 글리코겐 합성효소 키나아제 3의 적어도 하나의 억제제를 필요한 대상에게 투여함을 포함하는 특정한 유형의 통증, 염증성 질환, 면역질환, 증식성 질환, 감염성 질환, 심혈관 질환, 대사질환, 정신신경 질환, 신장 질환 및 신경변성 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 하기 화학식(I)의 억제제 화합물, 그의 모든 토오토머 및 입체이성체을 포함하는, 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체가 제공된다:
Figure pct00001
상기 식에서,
Ra는 H 또는 메틸이고;
R1은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되며:
카르보사이클릭 또는 -C1 -6 알킬-카르보사이클릭, 여기서 상기 카르보사이클릭 기는 사이클로헥실 또는 사이클로펜틸임;
헤테로사이클릭 또는 -C1 -6 알킬-헤테로사이클릭기, 여기서 상기 헤테로사이클릭기는 피페리딘, 피페라진, 모르폴린 또는 피롤리딘임;
아릴 또는 -C1 -6 알킬-아릴;
헤테로아릴 또는 -C1 -6 알킬-헤테로아릴, 여기서 상기 헤테로아릴은 피리딘, 티아졸 또는 티오펜임;
여기서 전술한 카르보사이클릭기, 헤테로사이클릭기, 아릴기 또는 헤테로아릴기의 어느 것은 독립적으로 하기 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 기에 의해 임의로 치환될 수 있음:
할로, OH, NH2 및, 카르보사이클릭 및 헤테로사이클릭 기의 경우, =O; 또는
C1 -4 알킬, -O(C1 -4 알킬), -NH(C1 -4 알킬), -NHC(O)(C1 -4 알킬), -S(C1 -4 알킬), -SO(C1-4 알킬), -SO2(C1 -4 알킬) 또는 -SO2NH(C1 -4 알킬), 이들 중 어느 것은 할로 또는 OH에 의해 추가로 치환될 수 있음; 또는
R3, -C1 -4 알킬-R3, OR3, NHR3, -NHC1 -4 알킬-R3, -OC1 -4 알킬-R3, SR3, SOR3 또는 SO2R3;
여기서 R3는 아릴기, 헤테로아릴기, 카르보사이클릭기 또는 헤테로사이클릭기, 이들중 어느 것은 하나 이상 (예, 하나)의 할로, C1 -4 알킬, -O(C1 -4 알킬), NH2, -NH(C1-4 알킬), -C(O)(C1 -4 알킬)기, -NHC(O)(C1 -4 알킬), 이들 알킬기의 어는 것은 할로 또는 OH에 의해 더욱 치환될 수 있음;
각각의 R2는 독립적으로 할로, OH, NH2; 또는 C1 -4 알킬, -O(C1 -4 알킬), -NH(C1-4 알킬), -C(O)(C1 -4 알킬), 이들 중 어느 것은 할로 또는 OH로 추가로 치환될 수 있거나; 또는
R4, -C1 -4 알킬-R4, OR4, NHR4, -NHC1 -4 알킬-R4, -OC1 -4 알킬-R4, SR4, SOR4 또는 SO2R4이며;
여기서 R4는 아릴기, 헤테로아릴기, 카르보사이클릭기 또는 헤테로사이클릭기이며, 이들 중 어느 것은 하나 이상 (예,하나)의 할로, OH, C1 -4 알킬, -O(C1 -4 알킬), NH2, -NH(C1 -4 알킬), -C(O)(C1 -4 알킬), -NHC(O)(C1 -4 알킬)기로 치환될 수 있으며, 이들 알킬기 중 어느 것은 할로 또는 OH로 치환될 수 있으며; 또한
x는 0-4이다.
화학식(I)의 화합물들에 유사한 일부 화합물은 선행기술로부터 알려져 있다. 예를 들면, 유럽 특허 제 1 679 309 (Ono Pharmaceutical)은 항스테레스 약물은 물론 파킨슨병, 정신분열병, 심근 경색증과 같은 증상에 관한 것이다. 유럽 특허 제 1 679 309는 본 발명의 화합물에 유사한 일부 화합물을 기술한다. 그러나 이들 화합물은 예시된 화합물들이 피리딘 유도체보다는 모두 피리미딘이라는 점에서 본 발명의 화합물들과 상이하다.
국제출원공개 WO 2004/084824호 (Merck)는 나트륨 통로 차단제로서 비아릴 치환된 6-원 헤테로사이클에 관한 것이다. 증상들은 만성 및 신경성 동통 및 CNS 장애를 포함한 다른 증상을 포함한다. 국제출원공개 WO 2004/084824호는 사이클릭성분의 모두가 직접 결합되어 있다는 점에서 본 발명의 화합물과 상이한 화합물들을 기술한다.
국제출원공개 WO 2002/094825호 (Banyu Pharmaceutical)는 NPY 작용제에 관한 것이며 또한 증상은 순환기 질환, 중추질환, 대사질환, 성 및 생식기능 장애, 소화성 질환, 호흡기 질환 등을 포함한다. 국제출원공개 WO 2002/094825가 R1 (본 출원에 의해 정의된 바와 같음)가 스피로 고리 시스템을 거쳐 말단 비사이클릭 고리에 결합된 피페리딘 고리를 포함하는 3개의 고리 시스템인 화합물에 관한 것이라는 점에서 이 문헌에 기술된 화합물은 본 발명의 화합물들과 상이하다.
국제출원공개 WO 2005/103022호(Transtech Pharma)는 멜란코르틴 수용체 조절제로서 치환된 티아졸 및 피리미딘 유도체에 관한 것이다. 증상들은 암 및 심혈관질환을 포함한다. 국제출원공개 WO 2005/103022호는 본 발명의 화합물과 유사한 일부 화합물들을 기술하고 있지만, 이들 화합물은 피리딘 유도체보다는 티아졸 또는 피리미딘 유도체이기 때문에 본 발명의 화합물들과 상이하다.
프랑스 특허 2878247 (Galderma Research & Development)는 서브타입 감마 수용체의 퍼옥시좀 증식제-활성화 수용체 타입을 조절하는 신규 화합물 및 화장용 및 약학적 조성물에서 그의 용도에 관한 것이다. 상기 증상들은 대부분 피부 질환이지만, 비만과 같은 지질 대사 관련 질환, 및 염증성 질환 예를 들어 관절염 및 암을 포함한다. 본 출원의 화합물들과 가장 유사한 FR 2878247에 기술된 화합물들은 치환기가 상이한 구조이다는 점에서 본 발명의 화합물과 상이하다.
국제출원공개 WO 2001/62233호 (F Hoffmann La Roche)는 아데노신 수용체 조절제에 관한 것이다. 증상들은 특히 알쯔하이머병, 파킨슨병, 정신분열병 및 통증을 포함한다. 국제출원공개 WO 2001/62233호는 본 발명의 화합물과 유사한 일부 화합물을 기술하고 있지만, 이들 화합물은 본 발명의 것과 유사한 R1 치환기를 갖지 않는다.
미국특허 제5,886,191호는 항응고 활성을 가지며 또한 혈전색전성 질환을 치료하는데 유용하다고 하는 아미디노인돌 및 아미디노아졸 유사 화합물에 관한 것이다.
국제출원공개 WO 2005/003123호는 하기 화학식의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00002
상기 화합물 영역은 암, 알쯔하이머병, 뇌졸중, 파킨슨병, ALS 및 헌팅톤병과 같은 증상의 치료에서 사용되는 JNK 특이적 억제제라고 한다.
국제출원공개 WO 2009/140519호는 TPRA1 통로의 활성을 조절하고 화학병기제에 의해 원인이 된 상처를 치료하는데 유용한 화합물에 관한 것이다.
국제출원공개 WO 2002/102790호는 감염을 치료하는데 유용한 PDF 억제제로서 N-포르밀 하이드록실아민 화합물에 관한 것이다.
유럽공보 유럽 특허 제 0254322는 하기 화학식의 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00003
상기식에서, A는 NH일 수 있으며 또한 B는 페닐에 의해 임의로 치환된 피리딜일 수 있다. 상기 화합물은 강심제 성질을 가지며 또한 울혈성 심장기능상실, 부정맥, 협심증 및 고혈압과 같은 증상의 치료에 사용되는 것으로 알려져 있다.
국제출원공개 WO 2010/053861호는 통증, 인지장애 및 무드 장애를 포함하는 증상의 치료에 유용한 것으로 알려진 아미드 화합물에 관한 것이다.
본 출원인의 선행 출원공개 WO 2009/047359호는 사이클린 의존성 키나아제의 억제제에 관한 것이다. 이들 화합물은 피리딘보다는 피리미딘이다는 것을 제외하고는 본 발명의 화합물과 유사하다. 코어 부분에 대하여 피리미딘을 피리딘으로 변형은 이들 화합물의 프로파일에서, 특히 이들의 용해도, 수송, 대사 및 특성화의 더욱 상세한 사항에 관하여, 새로운 특징들 제공한다.
본 발명의 특정한 화합물에서 Ra는 H이다.
본 발명의 적절한 화합물에서, x는 0 내지 3이며 또한 x가 2인 화합물이 특히 적합하다.
R2　고리 치환기의 부분은 다음과 같이 언급된다:
Figure pct00004
상기 식에서,
x가 1 이상인 경우, R2　치환기는 동일하거나 상이할 수 있다.
화학식(I)의 적절한 화합물에서, R2는 할로, C1 -4　알킬, C1 - 4할로알킬, C1 -4　알콕시 또는 C1 -4　할로알콕시이다.
특히 적합한 R2　기는 플루오로 또는 메틸 또는 메톡시를 포함하며, 이들 각각은 1 내지 3개의 할로, 특히 플루오로 부분에 의해 임의로 치환된다.
화학식(I)의 화합물의 일부 예에서는 두 개의 R2기가 있으며, 이들 중 하나가 할로이며 또한 이들 중 다른 것은 메톡시 또는 할로메톡시이다. 전형적으로, 상기 메톡시 또는 할로메톡시기는 2-위치에 있으며 또한 상기 할로기는 4- 또는 5-위치에 있다. 따라서 R2　치환기로 치환된 페닐의 구체예는 4-플루오로-2-메톡시페닐 및 5-플루오로-2-메톡시페닐을 포함한다.
본 발명의 적절한 화합물에서, 상기 그룹 R1는 C5　또는 C6　카르보사이클릭, C5　또는 C6　헤테로사이클릭, -C1 -3　알킬-페닐, -C1 -3　알킬( C5　또는 C6 헤테로아릴), -C1-3　알킬( C5　또는 C6　카르보사이클릭), -C1 -3　알킬( C5　또는 C6　헤테로사이클릭), 페닐 또는 C5　또는 C6　헤테로아릴이며, 여기서 전술한 사이클릭 기의 어는 것은 상술한 바와 같이 임의로 치환될 수 있다.
따라서 적절하게 R1은 사이클로헥실, 사이클로펜틸, -C1 -3 알킬(사이클로헥실), -C1 -3　알킬(사이클로펜틸)이거나; 또는 R1은 피페리딘, 피페라진, 모르폴린 및 피롤리딘, -C1 -3　알킬 (피페리딘), -C1 -3　알킬(피페라진), -C1 -3　알킬(모르폴린), -C1 -3　알킬(피롤리딘)이거나; 또는 R1은 페닐 또는 -C1 -3　알킬-페닐이거나; 또는 R1는 피리딘, 티아졸, 티오펜, -C1 -3　알킬(피리딘),-C1 -3　알킬(티아졸) 또는 -C1 -3　알킬(티오펜)이며, 여기서 전술한 사이클릭기의 어는 것은 상술한 바와 같이 임의로 치환될 수 있다.
R1이 -C1 -3　알킬(카르보사이클릭), -C1 -3　알킬(헤테로사이클릭), -C1 -3　알킬(아릴) 또는 -C1 -3　알킬(헤테로아릴)기인 경우, 특히 적합한 -C1 -3　알킬 링커 부분은
-CH2-;
-CH(CH3)-;
-CH2CH(CH3)-; -CH(CH3)CH2-; 및
-CH2CH2-
를 포함한다.
R1의 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 기가 치환되는 경우, 적절한 치환기는 하기로부터 선택된 하나 이상의 그룹을 포함하낟:
할로, OH, NH2 및, 카르보사이클릭 및 헤테로사이클릭기, =0; 또는
-C1 -4　알킬, -0(C1 -4　알킬), -NH(C1 -4　알킬), -NHC(0)(C1 -4　알킬), 이들 중 어느 것은 할로 또는 OH 에 의해 추가로 치환될 수 있음; 또는
R3, -C1 -4　알킬-R3, OR3, NHR3, -NHC1 -4　알킬-R3, -OC1 - 4알킬-R3;
여기서 R3는 아릴기, 헤테로아릴기, 카르보사이클릭기 또는 헤테로사이클릭기이며, 이들 중 어느 것은 하나 이상의 할로, OH, NH2　또는 C1 -4　알킬 또는 -0(C1 -4　알킬)기로 치환될 수 있으며, 이들 알킬기의 어느 하나는 할로로 치환될 수 있다.
R1의 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 기의 더욱 적합한 치환기는 NH2, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, =0 (카르복실릭 및 헤테로사이클릭기의 경우), NHC(0)Me, R3, NHR3, 및 NHCH2R3(여기서 R3는 상기 정의된 바와 같음)로부터 선택된 하나 이상의 기를 포함한다.
특히 적합한 R3　그룹은 5 또는 6개 고리 원자를 갖는 사이클릭 그룹을 포함한다. 이러한 R3　그룹의 예는 피페리딘, 4-메틸피페리딘, 피페라진, 4-메틸피페라진, 티에닐, 예를 들면 티엔-2-일, 티아졸릴, 예를 들면 티아졸-2-일, 피리디닐, 예를 들면 피리딘-2-일, 피리딘-3-일 또는 피리딘-4-일, 및 페닐을 포함한다.
R3가 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭기를 나타내는 경우, 이것은 예를 들면 비치환되거나 또는 C1 - 4알킬(예를 들면 비치환될 수 있음)로 치환될 수 있다.
R4가 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭기를 나타내는 경우, 이것은 예를 들면 비치환되거나 또는 C1 - 4알킬로 치환될 수 있다 (예를 들면 이것은 비치환될 수 있다).
화학식(I)의 적절한 화합물은:
1 . N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로헥산카르복사미드;
2. 2-사이클로헥실-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)아세트아미드;
3. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)피페리딘-4-카르복사미드;
4. 4-아미노-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로헥산-카르복사미드;
5. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-5-옥소피롤리딘-3-카르복사미드;
6. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(4-메톡시페닐)-아세트아미드;
7. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-페닐아세트아미드;
8. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(피리딘-4-일)아세트아미드;
9. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(티오펜-2-일)아세트아미드;
10. (2S)-N-(4-(5-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-페닐프로판아미드;
11. (2S)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(4-메톡시페닐)-프로판아미드;
12. 13. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(피리딘-3-일)프로판아미드의 이성체들;
14. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(6-메톡시피리딘-3-일)아세트아미드;
15, 16. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(피리딘-4-일)프로판아미드의 이성체들;
17, 18. (2R)-N-(4-(5-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(티오펜-2-일)프로판아미드의 이성체들;
19. 2-(2-클로로피리딘-4-일)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)아세트아미드;
20. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아세트아미드;
21. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-3-(피리딘-4-일)부탄아미드;
22. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-((피리딘-4-일)메틸)-프로판아미드;
23. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-3-(피리딘-3-일)부탄아미드;
24. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-((피리딘-3-일)메틸)-프로판아미드;
25, 26. 트란스-3-아세트아미도-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)-피리딘-2-일)사이클로헥산카르복사미드;
27. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)프로판아미드;
28. 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)벤질)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)-피리딘-2-일)프로판아미드;
29. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부탄아미드;
30. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-4-(피리딘-2-일아미노)-cis-사이클로헥산카르복사미드;
31. N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)아세트아미드;
32. cis-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-4-(피리딘-4-일아미노)-사이클로헥산카르복사미드;
33. cis-3-아세트아미도-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로-헥산카르복사미드;
34. (1R,3S)-3-아세트아미도-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로펜탄카르복사미드;
35. cis-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-4-(티아졸-2-일아미노)-사이클로헥산카르복사미드;
36. cis-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-4-(페닐아미노)-사이클로헥산카르복사미드;
37. (1R,3S)-3-(벤질아미노)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로펜탄카르복사미드;
38. cis-4-(벤질아미노)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로헥산카르복사미드;
39. (1R,3S)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-3-(페닐아미노)-사이클로펜탄카르복사미드;
40. (1R,3S)-3-아세트아미도-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로헥산카르복사미드;
또는 모든 토오토머 또는 입체이성제를 포함하는, 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체를 포함한다.
화학식(I)의 또 다른 적절한 화합물은 (1S,3R)-3- 아세트아미도 -N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일) 사이클로펜탄카르복사미드; 모든 토오토머 및 입체이성체를 포함하는, 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체이다.
화학식(I)의 화합물은 하기 화학식(II)의 화합물을 하기 화학식 (III)의 화합물과 반응시켜 합성할 수 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
상기식에서,
Ra, R1 , R2 및 x은 화학식(I)에서 정의된 바와 같다.
상기 반응은 하기 방법 A에 기술된 바와 같은 HATU 커플링 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
화학식(III)의 화합물은 잘 알려져 있으며 또한 용이하게 입수할 수 있거나 또는 당해 분야의 기술자에게 잘 알려진 방법으로 제조할 수 있다.
화학식(II)의 화합물은 하기 화학식(IV)의 화합물을 하기 화학식 (V)의 화합물과 반응시켜 제조할 수 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
상기 식에서,
Ra, R2 및 x는 화학식(I)에 대해 정의된 바와 같고,
X는 이탈기, 특히 클로로이다.
상기 반응은 하기 일반적 방법에서 기술된 바와 같이 수행할 수 있다.
화학식(IV) 및 (V)의 화합물은 잘 알려져 있으며 또한 용이하게 입수할 수 있거나 또는 당해 분야의 기술자에게 잘 알려진 방법으로 제조할 수 있다.
화학식(I)의 화합물을 제조하는 대체 방법은 하기 화학식(VI)의 화합물을 하기 화학식(VII)의 화합물과 반응시킴으로써 수행한다.
Figure pct00009
Figure pct00010
상기 식에서,
R1, R2 및 x는 화학식(I)에서 정의된 바와 같고,
X는 이탈기, 특히 클로로이다.
상기 반응은 하기 방법 B에서 기술된 바와 같이 부크왈드 타입 (Buchwald type) 반응을 사용하여 수행할 수 있다.
화학식(VII)의 화합물은 잘 알려져 있으며 또한 용이하게 입수 가능하며 또한 당해분야의 기술자에게 잘 알려진 방법으로 제조할 수 있다.
화학식(VI)의 화합물은 4-브로모-2-클로로피리딘을 하기 일반적 방법 부분에서 기술된 반응 조건하에 상기 정의된 바와 같은 화학식(V)의 화합물과 반응시켜 제조할 수 있다. 화학식(V)의 화합물 및 4-브로모-2-클로로피리딘은 용이하게 입수 가능한 출발물질이다.
대안적으로, 화학식(I)의 화합물은 화학식(I)의 보호된 화합물로부터 제조할 수 있다. 예를 들면, R1이 유리 1차 또는 2차 아민기를 갖는 화학식(I)의 화합물 (예를 들면 R1이 피페리딘-4-일인 경우)은 적절하게 보호된 화합물을 탈보호시켜 제조할 수 있다. 적절한 아민 보호기의 일 예는 BOC이고 또한 R1이 피페리딘-4-일인 경우에, 보호된 R1 그룹은
Figure pct00011
이다.
아민의 탈보호는 하기 방법 C에 기술되어 있다.
화학식(I)의 화합물은 또한 화학식(I)의 다른 화합물로부터 제조할 수 있다. 이것의 일 예는 R1이 NH2로 치환된 사이클릭기인 화학식(I)의 화합물을 R1이 NHR3 (식중, R3는 화학식(I)에서 정의된 바와 같음)로 치환된 화학식(I)의 화합물로 전환하는 것이다. 상기 반응은 하기 방법 D에서 기술된 바와 같은 찬-람 타입 (Chan-Lam type) 커플링 반응을 사용하여 수행할 수 있다.
따라서 본 발명의 추가 양상에서는
a) 하기 화학식(II)의 화합물을 HATU 커플링 방법을 사용하여 하기 화학식(III)의 화합물과 반응시키거나:
Figure pct00012
Figure pct00013
상기식에서,
Ra, R1, R2 및 x는 화학식(I)에서 정의된 바와 같으며; 또는
b) 하기 화학식 (VI)의 화합물을 부크왈드 타입 반응을 사용하여 하기 화학식 (VII)의 화합물과 반응시키거나:
Figure pct00014
Figure pct00015
상기식에서,
R1, R2 및 x는 화학식(I)에서 정의된 바와 같고,
X는 이탈기, 특히 클로로이며; 또는
c) 화학식(I)의 보호된 화합물을 탈보호하거나; 또는
d) 화학식(I)의 화합물을 화학식(I)의 또 다른 화합물로 전환시키는 단계를
포함하는 화학식(I)의 화합물의 제조방법이 제공된다.
화학식 (II) 및 (VI)의 화합물은 본 발명의 추가 양상을 구성한다.
상기에서 이미 기술된 바와 같이, 화학식(I)의 화합물은 분자 수준으로 사이클린 의존성 키나아제 패미리에 관한 키나아제의 억제제이며, 따라서 통상 CDK 패미리, MAP-키나아제 패미리, GSK3 패미리 및 CDK-유사 키나아제 패미리를 포함하는 CMGC 부류의 키나아제로 그룹화된다(Manning G. et al ., Science 2002, 298, 1912-1934).
특히 화학식(I)의 화합물은 CDK 패미리 및/또는 GSK3 패미리 및/또는 CDK-유사 키나아제 패미리를 억제한다. 서열 상동성을 기본으로, 상기 CDK 패미리는 통상 CDK1/CDC2, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK8, CDK9, CDK10, CDK11/CDC2L6, CCRK, CrkRS/Crk7/CDK12, CHED/CDC2L5/CDK13, PITSLRE A, PITSLRE B, PCTK1 (PCTAIRE 단백질 키나아제 1), PCTK2 (PCTAIRE 단백질 키나아제 2), PCTK3 (PCTAIRE 단백질 키나아제 3), PFTK1 (PFTAIRE 단백질 키나아제 1) 및 PFTK2 (PFTAIRE 단백질 키나아제 2)로서 지정된 키나아제로 이루어진 것으로 간주될 수 있다. 상기 GSK3 키나아제 패미리는 CDKL1 (사이클린 의존성 키나아제 유사물 1)/KKIALRE, CDKL2 (사이클린 의존성 키나아제 유사물 2)/KKIAMRE, CDKL3 (사이클린 의존성 키나아제 유사물 3)/NKIAMRE, CDKL4, CDKL5, GSK3 알파, GSK3 베타, MOK, ICK 및 MAK를 포함한다. 상기 CDK-유사 키나아제 패미리는 DYRK1A, DYRK1B, DYRK2, DYRK3, DYRK4, PRP4, HIPK1, HIPK2, HIPK3, HIPK4, CLK1, CLK2, CLK3, CLK4, MSSK1, SRPK1 및 SRPK2를 포함한다.
화합물은 다른 효소 또는 단백질에 대한 실질적인 억제 효과를 갖지 않고 하나 이상의 CDKs 및/또는 글리코겐 합성효소 키나아제 3 패미리 구성원의 선택적 억제제인 것이 유리하다. 특히 화합물은 특수한 CDK에 대해 증가된 선택성을 나타내는 것이 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 "증가된 선택성"은 상기 억제 화합물이 앞서 여기에서 인용된 CDK 및/또는 글리코겐 합성효소 키나아제 3 패미리의 그룹으로부터 선택된 특수한 키나아제에 적어도 10-100 배 더 선택적이다는 것을 의미한다. 상기 억제 화합물은 특수한 키나아제에 대해 20-90 배 더 선택적인 것이 바람직하다. 또한 상기 억제 화합물은 특수한 키나아제에 대해 30-80배 더 선택적인 것이 특히 바람직하다.
화학식(I)의 화합물은 다른 키나아제보다 CDK9에 대해 증가된 선택성을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "억제하는" 또는 "억제"는 적어도 부분적으로 사이클린 의존성 키나아제의 세포 작용, 즉 그의 활성 또는 사이클린 의존성 키나아제의 발현을 하향 조절하고(downregulate), 감소하고, 저하하고, 억제하고, 비활성화하거나 또는 저해하는 화합물의 능력을 의미한다.
더욱이, 용어 "사이클린 의존성 키나아제 억제제" 또는 "글리코겐 신타제 키나아제 3 패미리 억제제"는 사이클린 의존성 키나아제 패미리 구성원 또는 글리코겐 합성효소 키나아제 3 패미리 구성원의 량 및/또는 활성을 하향 조절하고, 감소하거나, 또는 그렇지 않으면 조절할 수 있는 임의의 화합물 또는 화합물의 그룹을 의미한다. 상기 키나아제의 억제는, 제한되지 않지만, 키나아제 폴리펩티드에 직접 결합, 상기 키나아제를 변성하거나 그렇지 않으면 비활성화하거나, 또는 키나아제를 암호화하는 상기 유전자의 발현을 억제(예, mRNA에 전사, 신생 폴리펩티드로 번역 및/또는 성숙 단백질로 최종 변형)하는 것을 포함하는 당해 분야에 알려진 다양한 메카니즘의 어느 것에 의해 달성할 수 있다. 더욱이 키나아제 억제제는 또한 CDK 또는 CDK 의존성 통로의 분자 작용성 하류의 발현, 변형, 조절 또는 활성화를 방해할 수 있다. 일반적으로, 키나아제 억제제는 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 소분자 또는 다른 화학 부분일 수 있다. 구체적으로, 키나아제 억제제는 또한 사이클린 의존성 키나아제에 대하여 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 포함한다.
치료학적 용도
화학식(I)의 화합물은 사이클린 의존성 키나아제 및/또는 글리코겐 합성효소 키나제 3 패미리의 억제제이다. 따라서 이들은 비정상 분열세포에서 세포 사이클의 조절을 저지하거나 회복하는 능력을 갖는 것으로 기대된다. 따라서 화학식(I)에 따른 화합물은 암과 같은 증식성 장애를 치료 및/또는 예방하는데 유용함을 입증할 것이다.
따라서 본 발명의 추가 양상에서는 의약에서, 특히 사이클린 의존성 키나아제 특히 CDK9의 활성에 의해 매개되는 질환 및 증상의 치료에서 사용되는 일반식(I)의 화합물을 제공한다.
사이클린 의존성 키나아제 특히 CDK9의 활성에 의해 매개되는 질환 및 증상의 치료용 약제의 제조에서 일반식(I)의 화합물의 용도가 추가로 제공된다.
더욱이, 본 발명은 사이클린 의존성 키나아제 특히 CDK9의 활성에 의해 매개되는 질환 및 증상의 치료방법으로, 화학식(I)의 화합물의 유효량을 이러한 치료가 필요한 대상에게 투여함을 포함하는 방법을 제공한다.
CDK 및 GSK3 패미리 구성원은 아폽토시스, 증식, 분화 및 전사에서 역할을 하며, 따라서 화학식(I)에 따른 화합물은 증식성 질환, 예를 들어 감염성 질환, 면역 질환, 신경변성 질환, 염증성 장애, 대사 장애, 신 질환, 신경계 및 정신신경 질환, 심혈관 질환 및 통증의 치료에 유용할 수 있는 것으로 알려져 있다.
중요하게는, 화학식(I)에 따른 화합물은 또한 CDK9 및/또는 GSK3에 대한 이들의 높은 선택성으로 인하여 예상하지 않은 항염증성 효과를 나타낸다.
통증
신경병성 통증:
사이클린 의존성 키나아제의 억제가 통각 둔화 효과를 매개하는데 관계한다는 발견은 예상하지 못했다.
따라서 본 발명의 통증의 치료에 사용하기 위한 화학식(I)의 화합물에 관한 것이다.
더욱이 본 발명은 통증의 치료를 위한 약제의 제조에서 화학식(I)의 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 통증의 치료방법으로서, 유효량의 화학식(I)에 따른 사이클린 의존성 키나아제의 억제제를 이러한 치료가 필요한 대상에게 투여함을 포함하는 방법에 관한 것이다.
특히 화학식(I)의 화합물은 만성, 신경병성 및/또는 염증성 통증의 치료에 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "통증"은 임의 유형의 통증에 관한 것이며 또한 광범위하게는 급성 통증, 만성 통증, 염증성 및 신경병성 통증과 같은 통증의 유형을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, "통증"은 신경병성 통증 및 관련 증상을 포함한다. 통증은 만성, 무해자극 통증 (정상 무해 자극으로부터 통증의 인식), 통각과민 (임의의 소정의 통증 자극에 대한 과대 반응) 및 수용 분야(즉 자극이 적용될 때 "통증"이 있는 부분)의 확장, 환상 통증 또는 염증성 통증일 수 있다.
급성 통증 유형은, 이로 제한되지 않지만, 조직 손상과 관련된 통증, 수술후 통증, 외상 후 통증, 화상에 기인하는 통증, 국부 또는 전신 감염에 기인하는 통증, 췌장염, 장의 방광염, 월경곤란, 과민성 장 증후군, 크론병, 요관 급통증 및 심근경색을 포함하는 질환과 관련된 내장 통증을 포함한다.
더욱이, 용어 "통증"은 다발성 경화증, 척수손상, 외상성 뇌손상, 파킨슨병 및 뇌졸중을 포함하는 CNS 장애와 관련된 통증을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, "통증"은, 이로 제한되지 않지만, 두통 (예를 들면 편두통, 돌발성 및 만성 긴장형 두통, 긴장형 유사 두통, 만성 군발 두통 및 만성 발작성 반두증), 요통증, 암 통증, 골관절염 통증 및 신경병성 통증을 포함하는 만성 통증유형에 관한 것이다.
본 명세서에서 정의된 바와 같은 염증성 통증 (조직 손상 반응 및 얻어진 염증 과정에서 통증)은, 이로 제한되지 않지만, 결합조직병, 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 다발성 경화증 및 관절염을 포함하는 질환과 관련된 염증성 통증에 관한 것이다.
신경병성 통증 (말초신경 및 중추신경계에 대한 손상으로부터 생기는 통증)은, 이로 제한되지 않지만, 대사성 신경장애(예, 당뇨병성 신경장애), 대상포진 후 신경통, 삼차 신경통, 뇌 신경통, 뇌졸중 후 신경 장애성 통증, 다발성 경화증-수반성 신경장애성 통증, HIV/AIDS-관련 신경장애성 통증, 암 관련 신경장애성 통증, 수근관 관련 신경장애성 통증, 척수 상처 관련 신경장애성 통증, 복합성 국소 통증 증후군, 섬유근 통증 관련 신경장애 통증, 반사성 교감신경성 디스트로피(reflex sympathic dystrophy), 환상사지 증후군 또는 말초신경 또는 척수 외상, 수술, 사지의 절단 및 절단 통증을 포함한 신경 절단, 항암 및 항-AIDS 요법의 부작용에 의해 원인이 되는 통증, 수술 후 신경장애성 통증, 우발성 또는 외상 후 신경증 또는 단신경염과 같은 신경장애 관련 통증, 및 결합조직 질환에 의해 원인이 되는 신경장애성 통증 예를 들어 류마티스 관절염, 왈렌베르그 증후군, 전신홍반 루프스, 다발성 경화증, 또는 결절다발 동맥염을 포함하는 증상들을 포함한다. 신경증은 신경근병, 단일신경병, 다발성 단신경 장애, 다발성 신경장애 또는 신경얼기병으로 분류된다.
용어 "무해자극 통증"은 정상적으로 통증이 없는 자극으로부터 생기는 통증을 나타낸다. 무해자극 통증은 자극된 부분 이외에서 일어날 수 있다.
용어 "통각과민"은 고통스런 자극에 증가된 민감성을 나타낸다.
용어 "통각감퇴"는 고통스런 자극에 감소된 민감성을 나타낸다.
통증의 진행에서 CDK9의 역할은 본 발명의 효과가 메카니즘의 정확한 동정에 의존하지 않지만 다음의 작용 메카니즘을 기본으로 할 수 있다. 사이클린 T1 및 CDK9은 TNFα의 기본 프로모터 활성을 자극한다. TNFα는 염증성 유전자 네트워크의 발현을 조절하는 염증 유발성 사이토카인 및 통증 매개체이다. 세포 TNF 수용체 반응을 매개함에 있어서, 여러 가지 유도 가능한 전사인자가 중요한 것으로 나타났다. TNFα는 사이토카인 유전자에 대한 그의 보충을 촉발하지만, 전사인자는 유전자 전사의 자극을 위해 p-TEFb 복합물과 상호작용한다 (Barboric, M. et al ., Mol Cell, 2001, 8, 327-337). 추가로, CDK9는 TRAF2의 결합 파트너, TNFα 수용체 복합물의 구성원이며(MacLachlan, T. K. et al ., J Cell Biochem. 1998, 71, 467-478), 반면 GP130, 즉 염증 유발성 IL6 수용체 복합물의 서브유닛은 최근에 CDK9의 또 다른 잠재적 결합 파트너로서 확인되었다 (Falco, G. D. et al ., Oncogene. 2002, 21, 7464-7470). 여러 가지 유전자의 TNFα 매개성 발현에서 주요 역할(예, 고통 매개체로서 사이토카인)으로서, CDK9는 염증성 통증과 같은 임의 유형의 통증의 치료를 위한 중심 표적으로서 여겨질 수 있다.
신경 장애성 통증의 치료에 있어서, 약리학적 작용은 중추신경계 (CNS)에서 혈액뇌장벽(BBB)을 초월하여 일어나야 한다. CNS에서 주요 면역 세포로서 미세아교 세포는 예를 들면 활성화 시 다양한 독성 인자 예를 들어 사이토카인 (TNFα, IL1β, IL6) 및 다른 염증 유발성 분자(Huwe 2003)를 방출한다. 미세아교세포는 TNFα 수용체 또는 Toll-유사물의 자극에 의해 활성화되어 상술한 사이토카인의 전사 활성화를 유도한다. 미세아교세포 기여는 만성 CNS 질환에서 유용한 것으로 논의되었으며 또한 통증 인식에 기여할 수 있다.
최근에 유도성 전사인자는 척수에서 인터루킨 1β (IL1β)를 거쳐 사이클로옥시게나제-2 (COX-2)의 발현을 조절한다 (Lee et al . 2004). 척수 프로스타글란딘 E2의 상승에 대한 주요 기여체로서, 통증 매개체 COX-2는 다양한 항 침해 수용성/항염증성 약물에 대한 표적으로서 이미 알려져 있다. COX-2와는 대조적으로, CDK9 작용의 억제는 바로 단일 매개체 대신에 다양한 통증 매개체의 억제를 유도한다. 따라서 CDK9 억제제의 항침해 수용성 작용은 예를 들면 COX-2 억제제에 비하여 우수할 수 있다.
염증성 질환
놀랍게도, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 화학식(I)에 따른 CDK 억제 화합물은 시험관내 및 생체내 염증 분석에서 항염증 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌다.
따라서 본 발명의 추가 양상에서는 염증성 질환의 치료에서 사용하기 위한 화학식(I)의 화합물이 제공된다.
또한 염증성 질환의 치료용 약물의 제조에서 화학식(I)의 화합물의 용도가 제공된다.
더욱이, 본 발명은 화학식(I)의 화합물의 유효량을 치료가 필요한 대상에게 투여함을 포함하는 염증성 질환의 치료 방법을 제공한다.
다른 CDK보다 CDK9의 증가된 선택성을 나타내는 화학식(I)의 화합물조차 항염증성 효과를 발휘한다는 것은 특히 놀라운 것이다. 이러한 발견은 여러 가지 CDK 패미리 구성원에 대한 다지향성 작용이 염증성 질환을 치료하기 위해 사용되는 CDK 억제제의 바람직한 특징이라는 최근에 강화된 믿음에 반함을 교시한다 (Leitch, A., Haslett, C. and Rossi, A., Br J Pharmacol. 2009, 158, 1004-1016). CDK 억제제의 범선택성이 염증성 질환에서 치료학적 성공을 달성하게 위해 유익하며 또한 단일 히트 치료법이 비효과적임을 입증하는 것으로 기대된다는 이전에 제안된 견해에 반하여, 다른 CDK보다 CDK9의 증가된 선택성을 나타내는 화학식(I)의 화합물에 의한 본 출원인의 결과는 놀랍게도 CDK9의 바람직한 억제가 염증 유발성 매개체의 전사 억제를 포함하는 강력한 항염증 효과 및 면역학적 관련 세포 유형에 대한 항증식성 및/또는 아포토시스 촉진성 효과를 매개할 수 있다는 것을 보여준다.
염증성 질환의 진전에서 CDK9의 역할은 다음의 작용 메카니즘을 기본으로 할 수 있다: 염증성 질환 예를 들어 류마티스 관절염 (RA); 죽상동맥경화증; 천식; 염증성 창자병, 전신 홍반 루프스 및 여러 가지 다른 자가면역 질환은 상기 질환에서 종양 괴사인자 α (TNFα), 염증성 및 조직 장애 통로의 주요 조절체에 의해 매개된다. TNFα 시그널은 여러 가지 트랜스듀서를 통하여 매개되며 또한 반응 유전자의 전사 조절을 가능하게 하는 것으로 알려져 있다. 여러 가지 전사인자들은 유도성 프로모터에 CDK9를 결합하고 보충하는 것으로 나타났으며, 여기서 이것은 RNA Pol II의 CTD의 인산화를 촉매한다 (West, M. J. et al ., Journal of Virology 2001, 75, 8524-8537). RNA Pol II CTD 의 과잉 인산화를 하면 TNFα에 의해 조절되는 것으로 또한 알려진 IL-1β IL-6 및 IL-8와 같은 염증 유발성 사이토카인의 전사 유도를 가능하게 한다.
여러 가지 연구들은 TNFα가 염증 유발성 사이토카인 발현을 조절하는 자기 시그널 전달 카스케이드의 '마스터 조절체'라는 것을 보여주었다. 이러한 염증 유발성 카스케이드를 방해하기 위하여, 특이적 항체(Abs)는 TNFα 시그널를 차단하는데 성공적으로 사용될 수 있다. Abs로 RA의 안티-TNFα처리는 여러 가지 임상연구에서 그의 치료학적 효능을 이미 입증하였으며 또한 인프리시맙(Infliximab) 및 에타네르셉트와 같은 FDA 승인 약물이 시판에 들어갔다 (Feldmann and Maini, NatMed, 2003, 9, 1245-1250). 그러나, Ab 기본 치료법의 단점들은 이들의 면역원성 잠재성, 진행성 치료중에 효율의 부수적 손실 및 높은 치료 비용을 포함한다. 그 외에, Ab 동력학은 순환 TNFα의 거의 양단간의 감소를 허용한다. 그 결과, 면역 반응의 생리적 작용이 또한 억제된다 (Laufer, S. et al ., Inflammation and Rheumatic Diseases, 2003, Thieme, 104-105).
p38 MAPK 또는 IKK와 같은 표적을 지향하는 키나제 억제제로 TNFα 매개성 시그날 전달 카스타드내로 치료적 개입은 각각의 표적에 대하여 특이성의 부족으로 인하여 대부분의 경우에 심한 역효과를 나타냈다.
이와 대조적으로, 본 명세서에서 나타낸 바와 같은 화학식(I)에 따른 CDK 특이적 억제제는 생리학적 기능과 상호작용을 감소시키는 TNFα 시그날 전달 통로의 바닥부분에서 간섭할 수 있다. 추가로, 상기 화합물은 우수한 특이성을 통하여 역효과를 회피함으로써 자가 TNFα 매개성 염증성 네트워크를 방해할 것이다. 따라서 화학식(I)의 CDK 특이적 억제제에 의한 처리는 염증성 및 자가면역 질환의 치료를 위한 유망한 전략을 구성한다.
따라서 본 명세서에서 나타낸 바와 같은 화학식(I)에 따른 화합물은 염증성 질환의 치료를 위해 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "염증성 질환"은 신체 조직의 염증의 원인이 되어 다음에 급성 또는 만성 염증성 증상을 생기게 하는 면역계 또는 조직의 세포 또는 비세포 매개체에 의해 촉발되는 질환에 관한 것이다.
이러한 염증성 질환의 예는 타입 I-IV의 과민성 반응, 예를 들면, 이로 제한되지 않지만, 폐의 과민성 질환 예를 들어 천식, 아토피 질환, 알레르기 비염 또는 결막염, 눈꺼풀의 혈관부종, 유전적 혈관부종, 항수용체 과민성 반응 및 자가 면역 질환, 하시모토 갑상선염, 전신 홍반 루프스, 굿파스처 증후군, 천포창, 중증근육 무력증, 그레이브 및 레이노병, 타입 B 인슐린 내성 당뇨병, 류마티스 관절염, 건선, 크론병, 공피증, 혼합 결합 조직병, 다발 근육염, 사르코이드증(sarcoidosis), 베게너 육아종증, 사구체 신염, 급성 또는 만성 이식편대 숙주반응이다.
더욱이, 용어 "염증성 질환"은, 이로 제한되지 않지만, 복강 염증, 피부염, 위장염 (염증성 장 질환, 궤양 대장염), 섬유증, 눈 및 눈확 염증, 눈마름병 및 소조르겐 증후군으로부터 기인한 심한 눈마름병, 유방염, 귀염, 구강 염증, 근골격계 염증 (통풍, 골관절염 포함), 중추신경계의 염증성 질환(다발성 경화증, 세균성 수막염, 수막염 포함), 비뇨생식관 염증 (전립샘염, 사구체 신염 포함), 심혈관 염증 (죽상 동맥 경화증, 심장 기능 상실 포함), 기도 염증 (만성 기관지염, 만성 폐쇄 폐병 포함), 갑상샘염, 당뇨병, 골염, 근육염, 다발 장기 부전 (패혈증 포함), 다발 근육염 및 건선 관절염을 포함한다.
면역질환
화학식(I)에 따른 화합물은 또한 예를 들면 자가면역 질환과 같은 면역 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
따라서 본 발명은 면역 질환 예를 들면 자가면역 질환의 치료에 사용되는 화학식(I)의 화합물을 제공한다.
더욱이, 면역 질환 예를 들면 자가면역 질환의 치료용 약물의 제조에서 화학식(I)의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 화학식(I)의 화합물의 유효량을 치료가 필요한 대상에게 투여함을 포함하는 면역 질환 예를 들면 자가면역 질환의 치료방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 질환"은, 이로 제한되지 않지만, 알레르기, 천식, 이식편대 숙주병, 면역 결핍 및 자가면역 질환을 포함하는 질환에 관한 것이다.
구체적으로, 면역 질환은 당뇨병, 류마티스병, AIDS, 만성 육아종증 병, 이식기관 및 조직의 거부, 비염, 만성 폐쇄 폐병, 골다공증, 궤양성 대장염, 크론병, 동염, 홍반 루프스, 건선, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 탈모, 재발성 감염, 아토피 피부염, 습진 및 심한 아나필락시 반응을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 더욱이, "면역 질환"은 또한 접촉성 알레르기, 식품 알레르기 또는 약물 알레르기와 같은 알레르기를 포함한다.
증식성 질환
화학식(I)의 화합물은 세포 사이클의 조절에 관여하는 주요 분자를 나타내는 사이클린 의존성 키나아제의 억제제이다. 세포 사이클 조절 부전은 신생세포의 주요한 특징의 하나이다. 따라서 상기 화합물은 세포를 비정상으로 분열하는데 세포 사이클의 조절을 억제하거나 회복하는데 유용함을 입증하는 것으로 기대된다. 화학식(I)에 따른 화합물은 암 등의 증식성 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
따라서 본 발명은 증식성 질환의 치료에서 사용하기 위한 화학식(I)의 화합물을 제공한다.
또한 증식성 질환의 치료용 약물의 제조에서 화학식(I)의 화합물의 용도가 제공된다.
그 외에, 본 발명은 화학식(I)의 화합물의 유효량을 치료가 필요한 대상에게 투여함을 포함하는 증식성 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "증식성 질환"은, 이로 제한되지 않지만, 양성 종양, 형성 이상, 과형성을 포함하는 암 장애는 물론 전이성 성장 또는 임의의 다른 변형을 포함하는 종양에 관한 것이다.
용어 "암"은, 이로 제한되지 않지만, 양성 및 악성 종양 같은 암종, 육종, 암육종, 혈액 형성 조직의 암, 뇌를 포함한 신경 조직의 종양 및 피부 세포의 암을 포함한다.
치료될 수 있는 암의 예는, 이로 제한되지 않지만, 암종, 예를 들면 방광, 유방, 결장의 암종 (예, 결장 직장암 예를 들어 결장 샘암종 및 결장 샘종), 신장, 표피, 간, 폐, 예를 들면 샘암종, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐 암종, 식도, 쓸개 담낭, 난소, 췌장 (예, 외분비 췌장 암종), 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선, 또는 피부, 예를 들면 편평세포암종; 림프 계통의 조혈 종양, 예를 들면 백혈병, 급성 림프성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호드킨 림프종, 비-호드킨 림프종, 털세포 림프종, 또는 버케트 림프종; 골수성 계통의 조혈 종양, 예를 들면 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수형성 이상 증후군, 또는 전골 수세포 백혈병; 갑상샘 소포암; 중간엽 기원의 종양, 예를 들면 섬유육종 또는 횡문근육종; 중추 또는 말초 신경계의 종양, 예를 들면 별아교 세포종, 신경모세포종, 신경아교종 또는 신경집종; 흑색종; 고환종; 기형암종; 골육종; 제노데로마 색소성(xenoderoma pigmentoum); 케라톡탄토마(keratoctanthoma); 갑상선 소포암; 카포시육종, 별아교세포종, 기저세포암종, 소장암, 소장 종양, 위장 종양, 글리오블라스토마, 리포사르코마, 생식세포 종양, 두경부 종양 (귀, 코 및 인후 부분의 종양), 구강, 인후, 후두 및 식도의 암, 골 및 그의 지지 및 결합 조직의 암 같은 악성 및 양성 골 종양, 예, 악성 골육종, 양성 골종, 연골 종양; 유사 악성 연골성 육종 또는 양성 연골종, 골육종; 방광 및 신체 내부 및 외부 기관 및 남성 및 여성의 비뇨 생식계 구조의 종양, 연부 조직 종양, 연부 조직 육종, 윌름 종양, 또는 내분비 및 외분비 샘, 예, 갑상샘, 부갑상샘, 뇌하수체, 부신, 침샘의 암을 포함한다.
감염성 질환
더욱이 본 발명은 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 화학식(I)의 화합물에 관한 것이다.
또 다른 양상에서는 감염성 질환의 치료용 약물의 제조에 있어서 화학식(I)의 화합물의 용도가 제공된다.
본 발명은 추가로 화학식(I)의 화합물의 유효량을 치료가 필요한 대상에게 투여함을 포함하는 감염성 질환의 치료 방법을 제공한다.
특정의 숙주 세포 CDK는 바이러스 복제 즉 CDK2, CDK7, CDK8 및 CDK9에 포함되는 것으로 알려져 있다 (Wang, D. et al ., J. Virol. 2001, 75, 7266-7279). 구체적으로, HIV-1 전사 신장 및 히스톤 메틸화의 조절에서 CDK9 키나아제 활성의 역할이 기술되었다 (Zhou, M. et al ., J. Virol 2004, 78, 13522-13533).
따라서 바람직한 실시양태에서 본 발명은 적어도 하나의 화학식(I)에 따른 사이클린 의존성 키나아제의 유효량을 투여함을 포함하며, 상기 화합물이 다른 CDK에서보다 CDK9에 대한 증가된 선택성을 나타내는 감염성 질환의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "감염성 질환"은 바이러스, 박테리아, 곰팡이류 및/또는 기생충과 같은 병원체에 의해 원인이 되는 감염증을 포함한다.
바이러스 유도성 감염 질환은 레트로바이러스, 인간 내재성 바이러스, 헤파드나바이러스, 헤르페스 바이러스, 플라비바이러스, 아데노바이러스, 토가바이러스 및 폭스바이러스에 의한 감염이 원인이 되는 질환들을 포함한다. 구체적으로, 감염성 질환은, 이로 제한되지 않지만, HIV-1, HIV-2, HTLV-I 및 HTLV-II 등의 바이러스, HBV등의 헤파드나바이러스, 단순성 헤르페스 바이러스 I (HSV I), 단순성 헤르페스 바이러스 11 (HSV II), 엡스타인-바르 바이러스 (EBV), 수두-대상포진 바이러스 (VZV), 인간 사이토메가로 바이러스 (HCMV) 또는 인간 헤르페스 바이러스 8 (HHV-8)와 같은 헤르페스바이러스, HCV와 같은 플라비바이러스, 웨스트 나일 또는 엘로우 페버 바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 폭스바이러스, 신드비스 바이러스 또는 아데노바이러스를 포함하는 바이러스에 의해 원인이 된다. 감염성 질환의 예는, 이로 제한되지는 않지만, AIDS, 보렐리아증, 보툴리눔 독소증, 설사, BSE (소해면양뇌증), 치쿤구니아, 콜레라, CJD (크로이츠펠트-야콥병), 결막염, 거대세포 바이러스 감염, 뎅기/뎅기열, 뇌염, 동부 마뇌염, 서부 마뇌염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 대장균 감염, 음식물 감염(foodborne infection), 발입병, 진균성 피부염, 위장염, 헬리코박터 필로리 감염, 간염(HCV, HBV), 대상포진 (띠헤르페스), HIV 감염, 인플루엔자, 말라리아, 홍역, 수막염, 수막뇌염, 물사마귀, 모기 매개 질환, 파르보바이러스 감염, 흑사병, PCP (폐포자충폐염), 회색질 척수염, 일차성 위장염, Q 열, 광견병, 호흡계 발진 바이러스 (RSV) 감염, 류마티스열, 비염, 리프트 계곡열, 로타바이러스 감염, 살모넬라증, 살모넬라 엔테리티디스, 옴, 이질, 마마, 연쇄상 구균 감염, 파상풍, 독소 충격 증후군, 결핵, 궤양 (소화성 궤양 질환), 유행 출혈열, 두창(variola), 사마귀, 서부 나일강 바이러스 감염 (서부 나일강 뇌염), 백일해, 황열병을 포함한다.
심혈관 질환
또 다른 양상에서 본 발명은 심혈관 질환의 치료에서 사용하기 위한 화학식(I)의 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 심혈관 질환의 치료용 약물의 제조에서 화학식(I)의 화합물의 용도에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 적어도 하나의 화학식(I)의 화합물의 억제제의 유효량을 치료가 필요한 대상에게 투여함을 포함하는 심혈관 질환의 치료에 관한 것이다.
심혈관 질환의 분야는 CDK 억제제에 대한 가능한 임상 적용을 구성하는 것으로 보고되었다 (Meijer, L. et al., Pharmacol Ther 1999, 82, 279-284). 더욱이, 사이클린 T/CDK9 복합물의 억제 및 더욱 구체적으로 CDK9의 억제는 심장 기능 상실과 같은 심혈관 질환의 치료에 유리한 역할을 할 수 있다고 알려져 있다 (WO2005/027902).
따라서 다른 CDK보다 CDK9에 대해 증가된 선택성을 나타내는 화학식(I)의 화합물은 심혈관 질환의 치료에 특히 사용된다.
용어 "심혈관 질환"은, 이로 제한되지 않지만, 울혈성 심장기능 상실 같은 심장 및 혈관계통의 장애, 심근경색증, 심장의 허혈성 질환, 예를 들어 안정한 협심증, 불안정한 협심증 및 무증후성 허열, 모든 종류의 심방 및 심실 부정맥, 고혈압성 혈관질환, 말초 혈관질환, 관상 동맥성 심질환 및 죽상 동맥 경화증을 포함한다. 더욱이, 여기에서 기술된 바와 같은 용어는, 이로 제한되지 않지만, 성인 선천성 심질환, 동맥류, 협심증, 혈관신경성 부종, 대동맥 협착증, 대동맥 자루, 대동맥 판역류, 부정맥원성 좌실형성 이상, 동정맥 기형, 심방 잔떨림, 베체트 증후군, 느린 맥, 심장 비대, 심장 근육병증 예를 들어 울혈성, 비대 및 제한 심장근육병증, 경동맥 협착, 뇌출혈, 초그-스트라우스 증후군, 콜레스테롤 색전증, 세균성 심내막염, 섬유 근육 형성 이상, 울혈성 심장기능 상실, 심장 판막 질환 예를 들어 무력한 판막 또는 협착 판막, 심장 발작, 경막외 또는 경막하 혈종, 폰 히펠-린다우병, 충혈, 고혈압, 폐동맥 고혈압, 비대 성장, 좌심실 비대, 우심실 비대, 좌심 저형성 증후군, 저혈압, 간헐 파행, 허혈성 심장병, 클리펠-트레나우나이-웨버 증후군, 외측 연수 증후군, 승모판 탈출증, QT 연장증후군 승모판 탈출증, 심장근육 허혈, 심장 근육염, 심낭막의 장애, 심장막염, 말초 혈관 질환, 정맥염, 결절성 다발 동맥염, 폐동맥 판쇄증, 레이노병, 재협착, 류마티스성 심질환, Sneddon 증후군, 협착증, 위대 정맥 증후군, 증후군 X, 빈맥, 유전성 출혈 모세혈관 확장증, 모세혈관확장증, 측두 동맥염, 폐쇄혈전 혈관염, 혈전증, 혈전 색전증, 정맥류, 혈관병, 혈관염, 혈관경련 수축, 심실 잔떨림, 윌리암 증후군, 말초혈관병, 정맥류 및 다리 궤양, 깊은 정맥 혈전등 및 울프-파킨슨-화이트 증후군을 포함한다.
더욱이 용어 "심혈관 질환"은 선천성 결함, 유전자 결함, 환경적 영향 (예, 식사 영향, 생활습관, 스트레스 등), 및 다른 결함 또는 영향으로부터 생기는 질환을 포함한다.
신경변성 질환
CDK 억제제는 신경 보호 효과를 발휘하는 것으로 기술되었다. 구체적으로, CDK 억제제는 알쯔하이머 병과 같은 신경변성 질환에서 신경 세포사를 예방하는 것으로 보고되었다 (Filgueira de Azevedo, W. Jr., Biochem Biophys Res Commun 2002, 297, 1 154-1 158; Knockaert, M. et al., Trends Pharmacol Sci 2002, 23, 417-425; Meijer, L. et al., Pharmacol Ther 1999, 82, 279-284).
따라서 CDK 억제제인 화학식(I)에 따른 화합물은 신경변성 질환의 치료학적 관리에서 유익한 효과를 제공하는 것으로 기대된다.
따라서 본 발명은 신경 변성 질환의 치료에서 사용하기 위한 화학식(I)의 화합물에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 신경변성 질환의 치료용 약물의 제조에서 화학식(I)의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 화학식(I)의 화합물의 유효량을 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하는 신경변성 질환의 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어 "신경변성 질환"은 중추신경계 질환은 물론 말초신경계 장애, 이로 제한되지 않지만, 뇌손상, 뇌혈관 질환 및 이의 결과, 파킨슨병, 대뇌 피질 핵 변성증, 운동 뉴런 질환, 치매, 예를 들어 ALS, 다발성 경화증, 외상성 뇌손상, 뇌졸중, 뇌졸중 후, 외상후 뇌 손상, 및 소형선 뇌혈관질환, 치매, 예를 들어 알쯔하이머 병, 혈관치매, 레비 소체형 치매, 전측 두엽 치매 및 염색체 17에 결합된 파킨슨증, 전두측 두골 치매, 예를 들어 픽병, 진행성 핵 마비, 대뇌 피질 핵 형성증, 헌팅톤 병, 시상 치매, Creutzfeld-야곱 치매, HIV 치매, 치매 수반 정신분열증, 코르사코프 정신병 및 AIDS-관련 치매를 포함한다.
유사하게, 인지 기능 관련 장애, 예를 들면 가벼운 인지기능 장애, 연령 관련 인지 장애, 연련 관련 인지 기능 감퇴, 혈관성 인지장애, 주의 결함 장애, 주의 결함 다동성 장애 및 학습 장애를 가진 어린이의 기억장애가 또한 신경 변성 장애인 것으로 고려된다.
구체적으로, 본 발명은 상술한 유형의 통증 및 관련 증상 및 염증성 장애, 면역 질환, 증식성 질환, 감염성 질환, 심혈관 질환 및 신경 변성 질환을 치료하는 방법으로서, 여기서 상기 "치료하는"은 통증 및 관련 증상 및 염증성 장애, 면역 질환, 증식성 질환, 감염성 질환, 심혈관 질환 및 신경변성 질환의 예방, 개선 및 치료를 포함한다.
상기 명시된 하나 이상의 증상을 치료하는데 사용되는 경우, 화학식(I)의 화합물은 하나 이상의 다른 화학식(I)의 화합물과 함께 또는 통증, 염증성 장애, 면역 질환, 증식성 질환, 감염성 질환, 심혈관 질환 및 신경변성 질환를 위한 하나 이상의 약제와 함께 사용할 수 있다. 이러한 약제는 당해 분야에 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
약학적 조성물
본 발명의 또 다른 양상에서는 활성 성분으로서 화학식(I)의 화합물을 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 (즉 무독성) 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
더욱이, 본 발명은 또한 CDK의 적어도 두 개의 억제제 및/또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 결합하는 조성물을 포함한다. 상기 적어도 두 개의 억제제는 동일한 사이클린 의존성 키나아제를 억제할 수 있고 및/또는 상이한 유형의 사이클린 의존성 키나아제를 억제할 수 있으며, 예를 들면 상기 조성물에서 하나의 억제제는 CDK9를 억제하지만, 다른 억제제는 예를 들면 CDK2를 억제할 수 있다.
통증 치료에 관하여, 개개의 통증 약물처리는 흔히 많은 것 중의 단지 하나의 통증 전달 경로를 방해하기 때문에 단지 부분적으로 효과적인 통증 경감을 제공한다. 따라서 화학식(I)의 화합물은 통증 인지 과정에서 상이한 점에서 작용하는 통증 감소(진통)제와 함께 투여할 수 있다.
"진통제"는 통증 인지의 감소 원인이 되는 하나의 분자 또는 분자의 조합을 포함한다. 진통제는 CDK의 억제 이외의 작용 메카니즘을 사용한다.
한 부류의 진통제, 예를 들어 비스테로이드 소염제(NSAID)는 침해 수용체에 의해 검출되는 자극의 화학 전달물질을 하향 조절하며 또한 또 다른 부류의 약물, 예를 들면 아편 유사제는 CNS에서 침해수용 정보의 처리 후에 변화시킨다. 다른 진통제는 국소 마취제, 항경련제 및 항우울제 예를 들면 트리사이클릭 항우울제이다. CDK 억제제 외에도 하나 이상 부류의 약물을 투여하면 통증의 더욱 효과적인 개선을 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물의 방법 및 조성물에서 사용하기 위한 바람직한 NSAID는 아스피린, 아세타미노펜, 이부프로펜 및 인도메타신이다. 더욱이 사이클로옥시게나제-2 (COX-2) 억제제, 예를 들면 특이적 COX-2 억제제 (예, 세레코십, COX189, 및 로페코십)는 또한 본 발명의 방법 또는 조성물에서 진통제로서 사용될 수 있다.
바람직한 트리사이클릭 항우울제는 클로미프라민(Clomipramine), 아목사핀(Amoxapine), 노르트리틸린(Nortriptyline), 아미트리필린(Amitriptyline), 이미프라민(Imipramine), 데시프라민(Desipramine), 독세핀(Doxepin), 트리미프라민( Trimipramine), 프로트립틸린(Protriptylin), 및 이미프라민 마모에이트(Imipramine pamoate)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더욱이 항경련제 (예, 가바펜틴), GABAB 작용제 (예, L-바클로펜), 아편유사제, 반닐로이드 수용체 길항제 및 칸나비노이드(CB) 수용체 작용제, 예, 진통제로서 CB1 수용체 작용제가 또한 본 발명의 방법 및 조성물에서 바람직하다.
본 발명의 사이클린 의존성 키나아제 억제제 조성물을 제조함에 있어서, 하나는 레밍톤과 같은 잘 알려진 약학적 근원의 표준적 추천에 따를 수 있다: The Science and Practice of Pharmacy, 19 th ed. (Mack Publishing, 1995).
본 발명의 약학적 조성물은 공지된 방법으로 적절한 투여 수준에서 통상적인 고체 또는 액체 담체 또는 희석제 및 통상적인 약학적으로 제조된 보조제 중에서 제조될 수 있다. 바람직한 제제는 경구 적용에 적합하다. 이들 투여 형태는 예를 들면 환제, 정제, 필름 정제, 코팅된 정제, 캡슐, 분말 및 침착물을 형성한다.
더욱이 본 발명은 또한 비경구 적용, 예를 들면 피부, 진피내, 위내, 피내, 비강내, 정맥내, 근육내, 복강내, 비강내, 질내, 협내, 경피, 직장, 피하, 설하, 국소 또는 경피 적용을 위한 약학적 제제를 포함하며, 여기서 대표적인 부형제 및/또는 희석제 외에도 상기 제제는 활성 성분으로서 본 발명에 따른 적어도 하나의 억제제 및/또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
활성 성분으로서 본 발명에 따른 적어도 하나의 화학식 (I)의 화합물 및/또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 전형적으로 의도하는 투여 형태, 즉 정제, 캡슐 (고체 충진, 반고체 충진 또는 액체 충진), 조성용 분말, 겔, 엘릭시르, 분산성 과립, 시럽, 현탁액 형태의 경구 투여에 대하여 선택된 적절한 담체 물질과 함께 또한 통상적인 약학적 관행에 부합되게 투여할 수 있다. 예를 들면 정체 또는 캡슐 형태의 경구 투여의 경우, 활성 약물 성분은 임의의 경구 비독성 약학적으로 허용되는 담체와 함께, 바람직하게는 락토오스, 전분, 수크로오스, 셀룰로오스, 스테아르산 마그네슘, 인산 이칼슘, 황산 칼슘, 활석, 만니톨, 에틸알코올 (액체 충진 캡슐) 같은 불활성 담체와 함께 결합할 수 잇다.
더욱이, 적절한 결합제, 윤활제, 붕괴제 및 착색제가 또한 정제 또는 캡슐내에 혼입될 수 있다. 분말 및 정제는 활성성분으로서 본 명세서에서 인용된 바와 같은 화학식(I)에 따른 사이클린 의존성 키나아제 억제제 또는 그의 유사체 또는 각각의 약학적 활성 염을 약 5 내지 약 95 중량% 함유할 수 있다.
적절한 결합제는, 제한되지 않지만, 전분, 젤라틴, 글루코오스 또는 베타 락토오스 등의 천연 당, 콘 감미제, 아카시아, 트라가칸트 또는 올레산 나트륨 등의 천연 및 합성 고무, 알긴산 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜 및 왁스를 포함한다. 적절한 윤활제 중에서, 붕산, 스테아린산 나트륨, 스테아린산 마그네슘, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨, 염화 나트륨 등이 언급될 수 있다.
적절한 붕괴제는 전분, 메틸셀룰로오스, 한천, 벤토나이트, 잔탄 검, 구아 검등을 포함한다.
감미제 및 향미제는 물론 보존제도 또한 필요에 따라 포함될 수 있다. 붕괴제, 희석제, 윤활제, 결합제 등이 이하에 더욱 상세하게 논의된다.
목표 가능한 약물 담체로서 가용성 고분자는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리하이드록시프로필메타크릴아미드페놀, 폴리하이드록시아스파타미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥사이드폴리라이신을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 화합물은 약물의 조절된 방출을 달성하는데 유용한 일종의 생분해성 고분자, 예를 들면 폴리락트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리하이드록시 부티에르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드록시피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 하이드로겔의 가교 결합 또는 양친매성 블록 공중합체에 결합될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 약학적 조성물은 치료학적 효과 예를 들면 항히스타민 활성 등을 최적화하기 위한 임의의 하나 이상의 성분들 또는 활성 성분들의 조절 방출속도를 제공하기 위해 서방성 형태로 제형화할 수 있다. 지연 방출을 위해 적합한 투여 형태는 활성성분으로 함침되거나 또는 정제 형태로 성형된 변하는 분쇄속도를 갖는 층들 또는 조절 방출성 고분자 매트릭스를 갖는 정제, 또는 이러한 함침 또는 캡슐화된 다성성 고분자 매트릭스를 함유하는 캡슐을 포함한다.
액체 형태 제형은 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 일 예로서, 여기에는 비경구 주사용 물 또는 물/프로필렌 글리콜 용액, 또는 경구 용액, 현탁액 및 에멀젼용 감미제 및 유백제의 첨가가 언급될 수 있다. 액체 형태 제형은 또한 비강내 투여용 용액을 포함할 수 있다.
흡입에 적합한 에어로졸 제제는 용액 및 분말 형태의 고체를 포함할 수 있으며, 이들은 불활성, 압축 기체, 예 질소와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 조합되게 존재할 수 있다.
좌제를 제조하는 경우, 저융점 왁스, 예를 들어 코코아 버터 같은 지방산 글리세리드의 혼합물을 먼저 용융한 다음, 활성성분을 그 내부에 예를 들면 교반에 의해 균일하게 분산시킨다. 이어서 용융된 균질한 혼합물은 편리한 크기의 주형에 붓고, 냉각시키고, 고화시킨다.
또한 사용 직전에, 경구 또는 비경구 투여용 액체 형태 제제로 전환하려고 하는 고체 형태 제형이 포함된다. 이러한 액체 형태는 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 경피로 공급할 수 있다. 경피 조성물은 크림, 로션, 에어로졸 및/또는 에멀젼 형태를 가질 수 있으며 또한 이러한 목적으로 당해 분야에 알려진 바와 같이 매트릭스 또는 저장소 형태의 경피 패치 중에 포함될 수 있다.
여기서 인용되는 용어 "캡슐"은 상기 활성성분(들)을 포함하는 조성물을 보유 또는 함유시키기 위한 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 알코올, 또는 변성 젤라틴 또는 전분으로 만든 특수한 용기 또는 봉입체(enclosure)를 나타낸다. 경질 쉘(shell)을 갖는 캡슐은 전형적으로 뼈 또는 유구 피부로부터 혼합 또는 비교적 높은 겔 강도 젤라틴으로 만든다. 캡슐 자체는 소량의 염료, 불투명제, 가소제 및/또는 보존제를 함유할 수 있다. 정제 중에 압축 또는 주형 고체 투여 형태는 적절한 희석제와 활성 성분을 포함하는 것으로 이해된다. 정제는 습식 조립법, 건식 조립법에 의해 또는 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 압축에 의해 얻어진 혼합물의 압축 또는 조립화에 의해 제조할 수 있다.
경구 겔은 친수성 반고체 매트릭스 중에 분산 또는 가용화된 활성 성분을 나타낸다.
조성용 분말은 예를 들면 물 중에 또는 쥬스 중에 현탁될 수 있는 적합한 희석제 및 활성 성분을 함유하는 분말 혼합물을 포함한다.
적절한 희석제는 일반적으로 조성물 또는 투여 형태의 대부분을 형성하는 물질이다. 적절한 희석제는 락토오스, 수크로오스, 만니톨 및 소르비톨과 같은 당, 밀, 옥수수 벼, 및 감자로부터 유도된 전분, 및 미세 결정성 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스를 포함한다. 조성물 중에 희석제의 량은 총 조성물의 약 5 내지 약 95 중량%, 바람직하게는 약 25 내지 약 75 중량%, 및 더욱 적합하게는 약 30 내지 약 60 중량% 범위일 수 있다.
용어 "붕괴제"는 약물의 약학적으로 활성인 성분의 붕괴 및 방출을 지지하기 위해 조성물에 첨가된 물질을 의미한다. 적절한 붕괴제는 전분, 소듐 카르복시메틸 전분 등의 "냉수 가용성" 변형 전분, 천연 및 합성 고무 예를 들어 로커스트 빈(locust bean), 카라야(karaya), 구아(guar), 트라가칸트(tragacanth) 및 한천, 메틸셀룰로오스 및 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 미세 결정성 셀룰로오스, 및 가교 결합 미세 결정성 셀룰로오스 예를 들면 소듐 마크로스카라멜로오스, 알긴산 및 알긴산 나트륨 등의 알기네이트, 벤토나이트 등의 점토, 및 발포성 혼합물을 포함한다. 조성물 중에 붕괴제의 량은 조성물의 약 2 내지 약 20 중량%, 더욱 적절하게는 약 5 내지 약 10 중량% 범위일 수 있다.
결합제는 분말 입자와 함께 결합 또는 "접착"(glue)하는 물질이며 또한 이들을 과립을 형성시켜 응집성으로 만들어, 제형에서 "접착제"로서 작용한다. 결합제는 희석제 또는 충전제(bulking agent)에서 이미 이용 가능한 응집강도를 추가한다. 적절한 결합제는 수크로오스 등의 당, 밀, 옥수수 벼 및 감자로부터 유도된 전분, 아카시아, 젤라틴 및 트라가탄트 등의 천연 고무, 알긴산, 알긴산 나트륨 및 암모늄 칼슘 알긴산염 등의 해초의 유도체, 메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 물질, 폴리비닐 피롤리돈, 및 규산 알루미늄 마그네슘 등의 무기 화합물을 포함한다. 조성물 중에 결합제의 량은 총 조성물의 약 2 내지 약 20 중량%, 적합하게는 약 3 내지 약 10 중량%, 및 더욱 적합하게는 약 3 내지 약 6 중량% 범위일 수 있다.
윤활제는 마찰 또는 마모를 감소시켜 주형 또는 다이로부터 방출시키기 위해 압축된 후에, 정제 과립 등을 가능하게 투여 형태로 첨가되는 일종의 물질을 의미한다. 적절한 윤활제는 금속성 스테아린산염 예를 들면 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 또는 스테아린산 칼륨, 스테아린산, 고융점 왁스, 및 다른 수 가용성 윤활제 예를 들면 염화 나트륨, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨, 올레산 나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 및 D,L-류신을 포함한다. 윤활제는 과립의 표면에서 존재해야 하기 때문에 통상 압축 전에 가장 마지막 단계에서 첨가된다. 조성물 중에 윤활제의 량은 조성물의 약 0.2 내지 약 5 중량%, 적합하게는 조성물의 약 0.5 내지 약 2 중량%, 및 더욱 적합하게는 약 0.3 내지 약 1.5 중량% 범위일 수 있다.
활제는 약학적 조성물의 성분들의 소성(baking)을 방지하고 입상물의 유동 특성을 개선하여 유동이 유연하고 균일하게 하는 물질이다. 적절한 활제는 이산화 실리콘 및 활석을 포함한다.
본 조성물 중에 활제의 량은 최종 조성물의 약 0.1 내지 약 5 중량%, 적합하게는 약 0.5 내지 약 2 중량% 범위일 수 있다.
착색제는 본 조성물 또는 투여형태의 착색을 제공하는 부형제이다. 이러한 부형제는 점토 또는 산화 알루미늄 등의 적절한 흡수제 상에 흡수되는 식품 등급 염료를 포함할 수 있다. 착색제의 량은 조성물의 약 0.1 내지 약 5 중량%,, 적합하게는 약 0.1 내지 1 중량% 범위일 수 있다.
본 발명은 특정 유형의 통증, 염증성 장애, 면역 질환, 증식성 질환, 심혈관 질환 또는 신경변성 질환의 치료를 위해 활성성분으로서 사이클린 의존성 키나아제 억제제를 함유하는 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 것에 관한 것이다.
"필요한 대상"은 동물, 적절하게는 포유동물 및 가장 적절하게는 인간을 포함하며, 이들은 장차 특정 유형의 통증, 염증성 장애, 면역 질환, 증식성 질환, 심혈관 질환 또는 신경변성 질환을 경험하거나 또는 상기 증상들의 진행중인 경험을 갖는 것으로 기대된다. 예를 들면 이러한 동물 또는 인간은 현재 통증의 원인이 되고 또한 통증의 원인에 기여할 가능성이 있는 진행중인 증상을 가질 수 있거나, 또는 동물 또는 인간이 통상 고통스런 결과를 갖는 과정 또는 사건을 견디었거나 견디고 있을 것이다. 당뇨병 신경장애성 통증 과민 및 콜라겐 혈관질환과 같은 만성 통증 증상은 첫 번째 유형의 예이고, 특히 염증 또는 신경 손상 부분에서 덴트 충전, 및 독소 노출 (화학요법제에 대한 노출을 포함)은 후자 유형의 예이다.
원하는 치료 효과를 달성하기 위하여, 각각의 사이클린 의존성 키나아제 억제제는 치료학적으로 유효한 량으로 투여되어야 한다.
용어 "치료학적 유효량"은 지시된 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어내는 일정량의 활성 화합물 또는 약제를 나타내는데 사용된다. 이러한 반응은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 요구되고 있으며 또한 치료되는 질환의 증후군의 경감을 포함하는 조직, 시스템, 동물 또는 인간에서 발생할 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 치료학적 유효량은 예를 들면 통증, 특히 염증성 또는 신경병성 통증을 감소시키는 량을 포함한다. 구체적으로, 치료학적 유효량은 치료하고자 하는 대상에서 통각저하 효과를 발휘하는 량을 나타낸다.
이러한 유효량은 예를 들면, 통증에 대한 대상의 민감성, 그의 키, 체중, 나이, 및 건강, 통증의 근원, CDK 억제제를 투여하는 양상, 투여된 특수한 억제제, 및 다른 인자들에 따라 대상마다 변화할 것이다. 그 결과, 특수한 환경하에 특수한 대상에 대한 유효량을 경험적으로 결정하는 것이 바람직하다.
실시예
화합물의 제조를 위한 일반적 절차
분석 방법
NMR 분광은 Bruker AM 400 분광계 또는 Varian 400MHz 머큐리 플러스 분광계 상에서 수행하였다. 다음의 약자들이 사용된다: s (일중선), d (이중선), dd (이중선의 이중선), t (삼중선), 및 m (다중선). ESI-MS: 질량 분광은 IonsprayTM 인터페이스 (MDS Sciex, Thorn Hill, ON, 캐나다)로 장착된 MDS Sciex API 365 질량 분광계로 취하였다. 기구 세팅, 데이터 취득 및 처리는 윈도우스TM용 Applied Biosystems (Foster City, CA, 미국) AnalystTM 소프트웨어에 의해 제어하였다. 50 - 100 스캔은 피크를 축적하기 위해 양의 이온화 Q1 스캔 모드로 수행하였다. 시료 용액은 약 10 ㎍/ml의 농도에 도달하도록 0.5% 포름산 중에 50% MeOH로 희석하였다. 각각의 시료 용액은 주입 펌프 (Havard 장치 22, Havard Instruments, Holliston, MA, 미국) 및 융합 실리카 모세관을 통해 미량 주사기에 의해 20 ul/분의 속도로 직접 주입하였다. 박층 크로마토그래피(TLC)는 Macherey Nagel Polygram? SIL G/UV245을 사용하여 수행하였다. 가시화(visualisation)는 254 nm에서 UV광을 사용하여 수행한 다음 과망간산 칼륨 또는 닌히드린으로 염색하였다. 용매는 사용 전에 증류하였다. 모든 상업적으로 입수 가능한 시약은 추가의 정제 없이 사용하였다. 정밀검사작업에서 사용된 pH-7 완충액은 물 (1 l)중 인산이수소칼륨 (85.0 g) 및 수산화 나트륨 (14.5 g)을 용해하여 제조하였다. 분석 HPLC는 머크-히타찌 장치를 사용하여 수행하였다: AcN-물 (유속: 1 ml 분-1 ), 칼럼: 리크로스피어 5um RP18e, 125 x 4.0 mm (Merck), 펌프: L-7100 머크-히타찌가 사용되었다. 구배 A는 실시예에서 정제된 화합물의 검출을 위해 사용하였다. 구배 A의 특징화(characterisation): t = 0 분에서 AcN-물 (5/95)에서 출발하여 AcN-물 (50/50)까지 15 분 이내, 추가 5분 후에 AcN-물 (95/5)까지, AcN-물 (95/5)에서 추가 3분 동안 잔류. 제조용 정제를 위한 여러 가지 방법이 사용되었다. 적절한 방법이 실험 데이터에서 주지되었다.
일반적 약어
AcN 아세토니트릴
ATP 아데노신-5'-트리포스페이트
Boc tert-부틸옥시카르보닐
CHCl3 클로로포름
conc. 농축된
Cs2CO3 탄산 세슘
DCM 디클로로메탄
DIPEA 디이소프로필에틸아민
DEA 디에틸아민
DMSO 디메틸설폭사이드
ESI-MS 일렉트로스프레이 질량분석
EtOH 에탄올
HATU 2-(1H-7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄-헥사플루오로-포스페이트
HCl 염산
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
IPA 이소프로필 알코올
MeOH 메탄올
NHz 메가헤르쯔
min 분
mp 융점
NMR 핵자기 공명
rt 체류시간
UV 자외선
THF 테트라하이드로푸란
TFA 트리플루오로아세트산
TLC 박층 크로마토그래피
xantphos 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸잔텐
실시예의 제조를 위한 일반적 접근법, 출발물질의 제조 및 일반적 방법
실시예의 제조를 위한 일반적 접근법
여기에서 기술된 실시예는 화합물(I)로부터 출발하여 적절한 카르복실산으로 HATU 커플링에 의해 (방법 A에 따라) 또는 타입(II)의 화합물로부터 출발하여 적절한 아미드와 Buchwald 타입 반응에 의해 (방법 B에 따라) 합성하였다.
Figure pct00016

출발물질의 제조
4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2- 아민(I)의 제조
Figure pct00017
2-아미노-4-클로로-피리딘(5.00 g, 38.9 mmol) 및 4-플루오로-2-메톡시페닐 보론산 (9.26 g, 54.4 mmol)을 1,2-디메톡시에탄(100 ml)중에서 취하였다. 탄산 나트륨(80ml, 2M)의 수용액을 첨가하고 아르곤 가스를 30 분간 정화하였다. 비스-(트리페닐포스핀) 팔라듐(II) 클로라이드 (Pd(PPh3)2Cl2) (272 mg, 0.39 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고 다시 아르곤 가스로 20 분간 정화하였다. 반응 혼합물을 교반하면서 85℃-90℃로 서서히 가열하고 8시간 동안 유지시켰다. 반응 완료시, 반응 혼합물은 실온으로 냉각하고 불용성 고체 잔사를 여과하였다. 여과물을 1,2-디메톡시 에탄이 완전히 증발될 때까지 농축하였다. 과량의 빙수를 첨가하여 생성물을 침전시키고, 여과하고, 엄청난 량의 물로 세척하고, 60℃에서 진공하에 건조시켰다. 다시 이 고체 미정제 생성물을 석유 에테르 (10%) 중에 에틸 아세테이트로 세척하고 건조시켜 20 g (88%)의 화합물(I)을 생성시켰다.
2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘의 제조, 방법 B에 의한 피리딘을 제조하는 일반적 절차
Figure pct00018
8 ml의 1,4-디옥산 중 4-플루오로-2-메톡시페닐보론산 (440 mg, 2.58 mmol)의 용액에 2.5 ml의 포화 수성 탄산 나트륨 용액을 첨가하였다. 실온에서 30분간 아르곤을 정화하였다. 4-브로모-2-클로로피리딘 (500 mg, 2.58 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (150 mg, 0.129 mmol)을 반응 혼합물에 동시에 첨가하고 아르곤 기체를 40분 더 기포시켰다(bubbled). 반응 혼합물을 환류 하에 16 시간 동안 가열하고, TLC는 반응 완료를 확인하며 또한 상기 혼합물은 감압하에 농축하였다. 잔사는 DCM과 물 사이에 분할하였다. 유기층을 분리하고, 염수, 물로 세척하고, 건조하고(Na2S04), 농축시켰다. 얻어진 미정제 잔사는 DCM중 15% 에틸 아세테이트로 용출하면 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 통하여 정제하여 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘(450 mg, 73.3%)을 얻었다.
2-클로로-4-(5-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘의 제조
화합물 2-클로로-4-(5-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘은 상술한 절차에 따라 5-플루오로-2-메톡시페닐보론산으로부터 출발하여 66.4%의 수율로 합성하였다.
일반적 방법
방법 A: ( HATU 커플링을 통해)
Figure pct00019
DIPEA (2 당량)은 DCM 또는 AcN중 카르복실산 RCOOH (1 당량)의 용액에 첨가하고 밀봉관에서 15-20 분간 교반하였다. HATU (1 당량)을 첨가하고 혼합물을 아르곤으로 10분간 퍼징(purge)하였다. 반응물은 깨끗한 용액이 얻어질 때까지 실온에서 교반하였다. 아민 I (1 당량)을 첨가하고, 혼합물을 다시 10분간 퍼징한 다음 밀봉관에서 80-100℃에서 2 - 18 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각하고, pH-7 완충액으로 퀀칭하였다. 유기층을 분리하고 수성층을 DCM으로 추출하였다. 결합된 유기층을 물 및 염수로 연속적으로 세척하고, 건조하고(Na2S04) 진공하에 미정제 잔사로 농축하였다. 잔사를 분취용 TLC/HPLC로 처리하여 순수한 화합물을 얻었다.
방법 B: (아미드에 대한 Buchwald 타입 반응을 통해)
Figure pct00020
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (5 몰%)는 건조 밀봉 관에서 건조 1,4-디옥산 중 아미드 RCONH2　(1 당량)과 적절한 타입 II의 4- 또는 5-플루오로화 화합물(1 당량)의 혼합물에 첨가하고 아르곤으로 15 분간 퍼징하였다. 탄산 세슘 (2 당량) 및 잔트포스(Xantphos) (10 몰%)를 첨가하고 전체 물질을 다시 아르곤으로 15분간 퍼징하고 밀봉하였다. 이어서 반응 혼합물을 실온으로 냉각하기 전에 120℃에서 3-6시간 동안 가열하였다. 이어서 과량의 물로 퍼징하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물, 염수로 세척하고, 건조하고(Na2S04), 진공하에 농축 건조시켰다. 이렇게 얻어진 잔사를 분취용 TLC/HPLC로 처리하여 순수한 화합물을 얻었다.
방법 C: ( TFA 을 사용하여 산성 조건 하에 탈보호를 통해)
Figure pct00021
소량의 DCM 중 Boc-보호된 화합물 (0.1 mmol)의 용액에 TFA/DCM (4 ml, 1:1)의 혼합물을 첨가하였다. 이 용액은 용매를 감압하에 제거하기 전에 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수득된 잔사는 분취용 TLC/HPLC로 정제하였다.
방법 D: ( Chan - Lam 커플링을 통해)
Figure pct00022
페닐 보론산 (900 mg, 4.10 mmol), 아세트산 구리 (746 mg, 4.10 mmol) 및 피리딘 (0.4 ml, 4.10 mmol)을 실온에서 DCM (10 ml)중 아미노 화합물(2.73 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 DCM (50 ml)으로 희석한 다음, 유기층을 물 (25 ml) 및 식염수(25 ml)로 세척하고 결합된 유기층을 Na2S04로 건조하고 농축시켰다. 미정제 생성물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물을 얻었다.
실시예의 합성
실시예 1 : N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일) 사이클로헥산카르복사미드
출발물질 사이클로헥산카르복사미드의 제조. 수성 암모니아를 CHCl3　(10 ml)중 사이클로헥산카르보닐 클로라이드 (500 mg, 3.41 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 완료 후에, 반응 혼합물을 CHCl3　(2 x 30 ml)로 희석하였다. 유기층을 포화 중탄산나트륨 용액, 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조시켰다. 유기층을 진공하에 농축하고 미정제 화합물을 헥산(2 x 8 ml)으로 세척하고 건조시켜 200 mg (46.1 %)의 사이클로헥산카르복사미드를 얻었다.
실시예 1의 제조. 실시예 1은 밀봉 관 중에서 120-125℃에서 3 시간 동안 1,4-디옥산(5ml)중 상술한 사이클로헥산카르복사미드 (75.0 mg, 0.53 mmol), Cs2C03　(262 mg, 0.79 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (100 mg, 0.42 mmol), 잔트포스 (25 mg, 80 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (24 mg, 40 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 석유 에테르 중에 에틸 아세테이트(5%)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업(workup) 후에 정제하여 생성물을 51.7%의 수율로 얻은 다음, DCM (5 ml)중 상기 수득된 화합물 (65.0 mg, 0.17 mmol)을 용해시키고 0℃에서 30분간 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.20 ml, 0.20 mmol)을 첨가하여 HCI-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 및 DCM으로 분쇄하여 33 mg의 HCl- 염 (50%)을 얻었다.1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ= 10.38 (s, 1 H), 8.28 (d, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 7.38 (t, 1 H), 7.18 (d, 1 H), 7.08 (d, 1 H), 6.88 (t, 1 H), 3.82 (s, 3H), 1.82-1 .60 (m, 5H), 1.44-1.18 (m, 5H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6):δ= 1 1.08 (s, br., 1 H), 8.32 (d, 1 H), 8.09 (s, 1 H), 7.45 (t, 1 H), 7.36 (d, 1 H), 7.12 (dd, 1 H), 6.94 (dt, 1 H), 3.84 (s, 3H), 1.86-1 .82 (d, 2H), 1.76-1 .73 (d, 2H), 1.66-1 .63 (d, 1 H), 1.42-1 .36 (m, 2H), 1.28-1 .20 (m, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 15.3 min (100%), mp: 92℃에서 분해, 129℃에서 완전히 용융.
실시예 2: 2- 사이클로헥실 -N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일) 아세트아미드
출발물질 2-사이클로헥실아세트아미드의 제조. 수성 암모니아는 CHCl3　(10 ml)중 2-사이클로헥실아세틸 클로라이드 (500 mg, 3.1 1 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 완료 후에, 반응 혼합물을 CHCl3　(2 x 30 ml)로 희석하였다. 유기층은 포화 중탄산 나트륨 용액, 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조시켰다. 유기층을 진공하에 농축하고, 미정제 화합물을 헥산(2 x 8 ml)으로 세척하고 건조시켜 400 mg (87.8%)의 2-사이클로헥실아세트아미드를 얻었다.
실시예 2의 제조. 실시예 2는 1,4-디옥산(5ml)중 상술한 2-사이클로헥실아세트아미드 (75.0 mg, 0.59 mmol), Cs2C03　(262 mg, 0.79 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (111 mg, 0.47 mmol), 잔트포스 (27 mg, 47 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (27 mg, 23 μmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 석유 에테르 중에 에틸 아세테이트(5%)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제하여 생성물을 49.5%의 수율로 얻은 다음, DCM (5 ml)중 상기 수득된 화합물 (65.0 mg, 0.16 mmol)을 용해시키고 0℃에서 30분간 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.19 ml, 0.19 mmol)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 및 DCM으로 분쇄하고 진공하에 건조시켜 30 mg의 HCl-염 (46,1%)을 얻었다.
　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ= 10.38 (s, 1 H), 8.22 (d, 1 H), 8.18 (s, 1 H), 7.36 (t, 1 H), 7.18 (d, 1 H), 7.06 (dd, 1 H), 6.92 (dt, 1 H), 3.82 (s, 3H), 2.24 (d, 2H), 1.82-1.62 (m, 6H), 1.38-0.92 (m, 6H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ= 10.96 (s, br., 1 H), 8.31 (d, 1 H), 8.11 (s, 1 H), 7.43 (t, 1 H), 7.31 (d, 1 H), 7.09 (dd, 1 H), 6.94 (dt, 1 H), 3.83 (s, 3H), 2.32 (d, 2H), 1.71 -1 .64 (m, 6H), 1.20-0.96 (m, 5H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 16.9 분 (100%), mp: 109℃에서 분해, 137℃에서 완전히 용융.
실시예 3: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)피페리딘-4- 카르복사 미드
단계 A: tert-부틸 4-카르바모일피페리딘-1-카르복실레이트의 제조. 5% 수성 탄산 나트륨 (7 ml)과 1,4-디옥산 (3 ml)의 혼합물 중 이소니페코트아미드 (500 mg, 3.90 mmol)의 용액에 Boc-무수물(1 .30 ml, 5.85 mmol)을 첨가하고 실온에서 5시간 동안 교반하였다. pH는 아세트산을 사용하여 5-6으로 조절하고 휘발물질은 진공하에 증발시켰다. 잔사는 n-펜탄 및 디에틸에테르로 분쇄하여 백색 고체로서 740 mg (82.4%)의 tert-부틸 4-카르바모일피페리딘-1-카르복실레이트를 얻었다.
단계 B: 실시예 3의 Boc-보호된 전구물질. tert-부틸 4-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)피페리딘-1-카르복실레이트는 125℃에서 3 시간 동안 1,4-디옥산(10 ml)중 상기 얻어진 화합물 tert-부틸 4-카르바모일피페리딘-1-카르복실레이트 (100 mg, 0.44 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (94 mg, 0.4 mmol), Cs2C03　(184 mg, 0.56 mmol), 잔트포스 (13 mg, 23 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (9 mg, 8 μmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, DCM, 석유 에테르, MeOH를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제하여 생성물을 무색오일로서 23.5%의 수율로 얻었다. 1H-NMR (400MHz, CDCl3): δ= 8.34 (s, 1 H), 8.25 (d, 1 H), 8.00 (s, 1 H), 7.70-7.65 (m, 1 H), 7.48-7.42 (m, 1 H), 7.35-7.32 (m, 1 H), 7.22 (d, 1 H), 6.76-6.70 (m, 2H), 4.17 (s, 2H), 3.83 (s, 3H), 2.82 (t, 2H), 2.45-2.40 (m, 1 H), 1.93-1 .90 (m, 2H), 1.79-1 .70 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 0.88-0.86 (m, 4H), MS (m/z): 430.2 (M+H+).
실시예 3의 제조. 실시예 3은 0℃에서 DCM중 상기 수득된 tert-부틸 4-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)피페리딘-1-카르복실레이트 (130 mg, 0.30 mmol), TFA (0.05 ml, 0.61 mmol)로부터 출발하여 방법 C에 따라 합성하고, 실온으로 가온하고 16 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물은 n-펜탄으로 분쇄하여 상기 화합물을 무색 오일로서 80.2%의 수율로 얻은 다음, DCM (5 ml)중에 상기 수득된 화합물 (50.0 mg, 0.15 mmol)을 용해하고 0℃에서 1 시간 동안 2.2 당량의 에테르성 HCl을 첨가하여 HCl-염으로 전환시켰다. 　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ= 8.35 (s, 1 H), 8.24 (d, 1 H), 7.89 (s, 1 H), 7.35-7.20 (m, 2H), 6.75-6.70 (m, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.18 (d, 2H), 2.72-2.66 (m, 2H), 2.41 (t, 1 H), 1 .96-1 .93 (m, 2H), 1.77-1.72 (m, 2H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ= 8.34 (d, 1 H), 7.83 (d, 1 H), 7.62 (s, 1 H), 7.06 (d, 1 H), 6.92 (t, 1 H), 3.94 (s, 3H), 3.53-3.50 (m, 2H), 3.18-3.12 (m, 2H), 2.98 (s, 1 H), 2.26- 2.22 (m, 2H), 2.09-2.06 (m, 2H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 9.7 분 (97.5%), 융점: 260℃에서 분해, 280℃에서 완전히 용융.
실시예 4: cis -4-아미노-N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일) 사이클로헥산 - 카르복사미드
단계 A: cis-4-[[(1,1-디메틸에톡시)카르보닐]아미노]-사이클로헥산카르복실산의 제조. Boc-무수물 (2.30 ml, 4.19 mmol)을 0℃에서 디옥산 (14 ml)중 탄산 나트륨 수용액 (6 ml, 5 중량%)중에 cis-4-아미노 사이클로헥실 카르복실산 (1.00 g, 6.99 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온하고 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 시트르산을 사용하여 pH~4로 산성화시켰다. 화합물을 에틸 아세테이트 (3 x 30 ml)로 추출하고 염수(15 ml)로 세척하였다. 결합된 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하였다. 용매를 증발시키고 건조시켜 1.2 g (71.8%)의 cis-4-[[(1,1-디메틸에톡시)카르보닐]아미노]-사이클로헥산카르복실산을 제조하였다.
단계 B: cis-tert-부틸-4-카르바모일사이클로헥실카르바메이트의 제조. 피발로일 클로라이드 (0.36 ml, 2.96 mmol)을 0℃에서 CHCl3　(10 ml), 트리에틸아민 (0.7 ml)중 cis-4-[[(1,1-디메틸에톡시)카르보닐]아미노]-사이클로헥산카르복실산 (600 mg, 2.47 mmol)의 용액에 첨가하고 1 시간 동안 교반하였다. 이어서 수성 암모니아를 반응 혼합물에 첨가하고 1 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에, 반응 혼합물은 CHCl3　(2 x 25 ml)로 희석하였다. 유기층을 포화 중탄산 나트륨 용액, 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조시켰다. 유기층을 진공하에 농축하고, 미정제 화합물을 헥산(2 x 6 ml)으로 세척하고 건조시켜 500 mg (91.8%)의 cis-tert-부틸-4-카르바모일사이클로헥실카르바메이트를 백색 고체로서 제조하였다.
단계 C: 실시예 4의 Boc-보호된 전구물질. cis-tert-부틸-4-(4-(4--플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로헥실 카르바메이트는 환류하에 18 시간 동안 1,4-디옥산(15 ml)중 상기 얻어진 화합물 cis-tert-부틸-4-카르바모일사이클로헥실카르바메이트 (400 mg, 1.65 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (310 mg, 1.32 mmol), Cs2C03　(810 mg, 2.47 mmol), 잔트포스 (76.0 mg, 0.13 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (76 mg, 66 μmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 석유 에테르중 천연 알루미나 및 에틸 아세테이트(25%)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제하여 생성물 cis-tert-부틸-4-(4-(4--플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로헥실 카르바메이트를 27%의 수율로 제공하였다.　1H-NMR (400MHz, CDCl3): δ= 10.29 (s, 1 H), 8.30 (s, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 7.37 (t, 1 H), 7.17 (d, 1 H), 7.09 (d, 1 H), 6.91 (t, 1 H), 6.82 (s, 1 H), 3.81 (s, 3H), 3.51 (s, 1 H), 1.80-1 .84 (m, 2H), 1.65-1.69 (m, 2H), 1.52-1.56 (m, 4H), 1.38 (s, 9H), MS (m/z): 444.2 (M+H+).
실시예 4는 0℃에서 3 시간 동안 TFA/DCM (1:1, 5ml)의 혼합물 중 상기 얻어진 화합물 cis-tert-부틸 4-(4-(4--플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로헥실 카르바메이트(100 mg, 0.23 mmol)로부터 출발하여 방법 C에 따라 합성하였다. 휘발성 물질을 증발시키고 미정제 생성물을 에틸 에테르로 세척하여 생성물을 82%의 수율로 얻은 다음, DCM (5 ml)중 상기 얻어진 화합물 (60.0 mg, 0.17 mmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 2.2 당량의 에테르성 HCl을 첨가하여 HCl-염으로 전환시켰다. 휘발성 물질을 증발시키고 잔사를 디에틸 에테르(2 x 3 ml)로 분쇄하고, 여과하고 건조시켜 황백색 고체로서 40 mg의 HCl-염을 66%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.33 (s, 1 H), 8.28 (d, 1 H), 8.19 (s, 1 H), 7.37 (t, 1 H), 7.17 (d, 1 H), 7.08 (d, 1 H), 6.92 (t, 1 H), 3.80 (s, 3H), 3.06 (s, 1 H), 1.85-1 .89 (m, 2H), 1.57-1.61 (m, 6H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.96 (s, 1 H), 8.33 (s, 1 H), 8.19 (d, 1 H), 8.08-8.01 (m, 2H), 7.44-7.31 (m, 2H), 7.14-7.10 (m, 1 H), 6.95-6.92 (m, 1 H), 3.83 (s, 3H), 3.20 (s, 2H), 2.50 (s, 1 H), 1.96 (s, 1 H), 1.80-1.60 (m, 6H), HPLC (λ = 214 nm, [A]): rt 8.3 min (100%), mp: 220℃에서 분해, 240℃에서 완전히 용융.
실시예 5: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-5- 옥소피롤리딘 -3-카르복사미드
실시예 5는 90℃에서 18시간 동안 밀봉 관에서 DCM (20 ml)중 상업적으로 시판중인 화합물 5-옥소피롤리딘-3-카르복실산 (150 mg, 1.17 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (230 mg, 1.06 mmol), HATU (660 mg, 1.75 mmol) 및 DIPEA (1.2 ml, 2.3 mmol)로부터 출발하여 방법 A에 따라 합성하고, n-펜탄/디에틸 에테르로 분쇄하여 통상의 정밀검사 후 정제시켜 생성물을 15.5%의 수율로 얻은 다음, DCM/THF (1:1, 10 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (50.0 mg, 0.15 mmol)을 용해시킨 다음 0℃에서 1 시간 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.18 ml, 0.18 mmol, 1 M)로 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 n-펜탄 및 디에틸 에테르로 분쇄하여 백색 고체로서 40 mg의 HCl-염 (72.8%)을 얻었다.　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.68 (s, 1 H), 8.33 (d, 1 H), 8.16 (s, 1 H), 7.64 (s, 1 H), 7.38 (t, 1 H), 7.22 (s, 1 H), 7.09 (dd, 1 H), 6.93 (td, 1 H), 3.81 (s, 3H), 3.49 (d, 2H), 2.36-2.40 (m, 3H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.90 (s, br., 1 H), 8.33 (d, 1 H), 8.16 (s, 1 H), 7.64 (s, 1 H), 7.41 (t, 1 H), 7.28 (s, 1 H), 7.10 (dd, 1 H), 6.93 (td, 1 H), 3.82 (s, 3H), 3.49 (t, 2H), 3.34 (d, 1 H), 2.40 (d, 2H), HPLC (λ = 214 nm, [A]): rt 9.6 min (98.9%), mp: 용융 범위: 240-243℃.
실시예 6: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-(4- 메톡시페닐 )-아세트아미드
출발물질 2-(4-메톡시페닐)아세타미드의 제조. DCM (30 ml)중 2-(4-메톡시페닐)아세트산(500 mg, 3.00 mmol)의 용액에 0℃에서 염화 티오닐 (0.4 ml, 4.5 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 하룻밤 계속 교반하였다. 수성 암모니아 (2 ml)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 백색 고체 수득물을 여과하고 진공하에 건조시켜 350 mg (70%)의 2-(4-메톡시페닐)아세트아미드를 백색 고체로서 얻었다.
실시예 6의 제조. 실시예 6은 120℃에서 4 시간 동안 밀봉 관에서 1,4-디옥산 (10 ml)중 상술한 2-(4-메톡시페닐)아세트아미드(100 mg, 0.62 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (114 mg, 0.48 mmol), Cs2C03　(299 mg, 0.90 mmol), 잔트포스 (28 mg, 40 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (28 mg, 40 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 석유 에테르 중 MeOH (5%)을 사용하여 분취용 TLC에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 27.1%의 수율로 제조한 다음, DCM (4 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (60.0 mg, 165μmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 1.0 당량의 에테르성 HCl (0.165 ml, 0.165 mmol)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 및 DCM으로 분쇄하여 55 mg의 HCl-염을 91%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ = 8.35 (s, 1 H), 8.20 (d, 1 H), 7.87 (s, 1 H), 7.32 (t, 1 H), 7.24 (s, 1 H), 7.17 (d, 1 H), 6.92 (d, 2H), 6.75-6.69 (m, 2H), 3.82 (s, 6H), 3.70 (s, 2H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6):δ = 10.79 (s, 1 H), 8.29 (d, 1 H), 8.11 (s, 1 H), 7.36 (t, 1 H), 7.25-7.20 (m, 3H), 7.06 (dd, 1 H), 6.90-6.85 (m, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.64 (s, 2H), HPLC (λ = 214 nm, [A]): rt 15 min (100%), mp: 122 ℃에서 분해, 205 ℃에서 완전히 용융.
실시예 7: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2- 페닐아세트아미드
출발물질 2-페닐아세트아미드의 제조. 염화 티오닐 (0.53 ml, 7.34 mmol)을 0℃에서 CHCl3　(20 ml)중 페닐 아세트산(0.50 g, 3.67 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 3 시간 동안 서서히 가열하였다. 반응 완료 후에, 휘발성 물질을 증발시키고 반응 혼합물을 CHCl3　(5 ml)로 희석하였다. 이어서 반응 혼합물을 수성 암모니아로 퀀칭하고 실온에서 10 분간 교반하였다. 반응 혼합물을 CHCl3　(2 x 25 ml)로 희석하였다. 유기층을 분리하고, 포화 중탄산 나트륨 용액, 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하였다. 유기층을 진공하에 농축시키고, 미정제 화합물을 헥산 (2 x 6 ml)으로 세척하고 건조시켜 백색 고체로서 0.5 g (91.8%)의 2-페닐아세트아미드를 제조하였다.
실시예 7의 제조. 실시예 7은 125℃에서 5 시간 동안 1,4-디옥산 (15 ml)중 상술한 2-페닐아세트아미드(200 mg, 1.48 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (280 mg, 1.18 mmol), Cs2C03　(730 mg, 2.22 mmol), 잔트포스 (68.0 mg, 0.11 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (68 mg, 50 μmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 석유 에테르중 에틸 아세테이트 (13%)를 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 무색 고체로서 생성물을 22%의 수율로 제조한 다음, DCM (5 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (75.0 mg, 0.22 mmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 진공하에 증발시키고 디에틸 에테르로 분쇄하고 진공하에 건조시켜 60 mg의 HCl-염(73%)을 백색 고체로서 얻었다. 1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.71 (s, 1 H), 8.32 (d, 1 H), 8.17 (s, 1 H), 7.37-7.29 (m, 5H), 7.26-7.22 (m, 1 H), 7.19 (dd, 1 H), 7.02 (dd, 1 H), 6.89 (dt, 1 H), 3.78 (s, 3H), 3.72 (s, 2H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 11.17 (s, 1 H), 8.33 (d, 1 H), 8.12 (s, 1 H), 7.42-7.22 (m, 7H), 7.10 (dd, 1 H), 6.91 (dt, 1 H), 3.81 (s, 3H), 3.77 (s, 2H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 15 min (100%), mp: 193-197 ℃.
실시예 8: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-(피리딘-4-일) 아 세트아미드
실시예 8은 밀봉 관에서 120-125℃에서 3 시간 동안 1,4-디옥산 (5 ml)중 상업적으로 시판중인 화합물 2-(피리딘-4-일)아세트아미드(100 mg, 0.73 mmol), Cs2C03　(344 mg, 1.05 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (156 mg, 0.66 mmol), 잔트포스 (38 mg, 90 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (33 mg, 40 μmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, CHCl3중 MeOH(5%)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 44.4%의 수율로 제조한 다음, DCM (5 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (50.0 mg, 0.15 mmol)을 용해시키고 0℃에서 30 분간 2.2 당량의 에테르성 HCl을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 및 DCM으로 분쇄하여 엷은 주황색 고체로서 48 mg의 HCl-염(78.2%)을 얻었다. 　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.86 (s, 1 H), 8.51 (d, 1 H), 8.33 (d, 1 H), 8.16 (s, 1 H), 7.38-7.32 (m, 3H), 7.22 (dd, 1 H), 7.07 (dd, 1 H), 6.89 (dt, 1 H), 3.80 (s, 2H), 3.79 (s, 3H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 11.36 (s, br., 1 H), 8.85 (s, 2H), 8.35 (d, 1 H), 8.14 (s, 1 H), 8.05 (s, 1 H), 7.39-7.30 (m, 2H), 7.08 (d, 1 H), 6.95-6.93 (m, 1 H), 4.23 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 9.2 min (98.9%), mp: 170℃에서 분해, 190℃에서 완전히 용융.
실시예 9: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-(티오펜-2-일) 아 세트아미드
실시예 9는 125℃에서 4 시간 동안 1,4-디옥산 (10 ml)중 상업적으로 시판중인 화합물 2-(티오펜-2-일)아세트아미드(100 mg, 0.71 mmol), 4-클로로-6-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (152 mg, 0.64 mmol), Cs2C03　(297 mg, 0.90 mmol), 잔트포스 (22 mg, 40 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (15 mg, 10 μmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, DCM중 중성 알루미나, MeOH을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 20.5%의 수율로 제조한 다음, DCM (2 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (50.0 mg, 0.15 mmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르로 분쇄하여 황백색 고체로서 HCl-염을 59%의 수율로 얻었다. 　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, CDCl3): δ = 8.35 (s, 1 H), 8.21 (d, 1 H), 8.04 (s, 1 H), 7.34-7.28 (m, 2H), 7.20 (d, 1 H), 7.04-7.02 (m, 2H), 6.76-6.70 (m, 2H), 3.97 (s, 2H), 3.83 (s, 3H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, CD3OD): δ = 8.32 (d, 1 H), 7.79-7.74 (m, 2H), 7.62 (t, 1 H), 7.36 (d, 1 H), 7.07-7.02 (m, 2H), 7.00 (t, 1 H), 6.94-6.90 (m, 1 H), 4.13 (s, 2H), 3.94 (s, 3H), HPLC (λ = 214 nm, [A]): rt 15.3 min (97%), mp: 216-221℃.
실시예 10: (2S)-N-(4-(5- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2- 페닐프로판아미드
실시예 10은 125℃에서 5 시간 동안 1,4-디옥산 (10 ml)중 상업적으로 시판중인 화합물 (S)-2-페닐프로판아미드(100 mg, 0.67 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (145 mg, 0.61 mmol), Cs2C03　(281 mg, 0.85 mmol), 잔트포스 (21 mg, 40 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (14 mg, 10 μmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, DCM중 중성 알루미나, MeOH을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 17.9%의 수율로 제조한 다음, DCM (4 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (80.0 mg, 0.23 mmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl(0.22 ml, 0.27 mmol)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르로 분쇄하여 황백색 고체로서 HCl-염을 62.5%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, CDCl3): δ = 8.38 (s, 1 H), 8.19 (d, 1 H), 7.78 (s, 1 H), 7.39-7.25 (m, 5H), 7.19-7.18 (m, 1 H), 7.12-7.02 (m, 2H), 6.93-6.89 (m, 1 H), 3.80 (s, 3H), 3.75 (q, 1 H), 1.60 (d, 3H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, CD3OD): δ = 8.33 (d, 1 H), 7.76-7.73 (m, 2H), 7.43-7.20 (m, 7H), 4.00 (q, 1 H), 3.88 (s, 3H), 1.57 (d, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 17.2 min (98.2%), mp: 80℃에서 분해, 160℃에서 완전히 용융.
실시예 11: (2S)-N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-(4- 메톡시페닐 )- 프로판아미드
단계 A: (S)-4-벤질-3-(2-(4-메톡시페닐)아세틸)옥사졸리딘-2-온의 제조. n-부틸리튬 (15.4 ml, 24.7 mmol, 1.6 M)을 -78 ℃에서 건조 THF (100 ml)중 (S)-4-벤질 옥사졸리디논(4.00 g, 22.5 mmol)의 용액에 첨가하고, 30 분 동안 교반하였다. 이어서 THF (50 ml)중 p-메톡시페닐 아세틸 클로라이드 (6.50 ml, 29.3 mmol)를 -78 ℃에서 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 가온시키고 하룻밤 교반하였다. 이어서 포화 염화 암모늄 용액 (50 ml)으로 퀀칭하고 에틸 아세테이트(3 x 50 ml)로 추출하였다. 미정제 화합물을 용출물로서 석유 에테르 중 에틸 아세테이트 (7%)를 사용하여 실리카 겔 (60-120 메시) 상에서 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 황백색 고체로서 6.0 g (82.5%)의 (S)-4-벤질-3-(2-(4-메톡시페닐)아세틸)옥사졸리딘-2-온을 제조하였다.
단계 B: (S)-3-((R)-2-(4-메톡시페닐)프로파노일)-4-벤질옥사졸리딘-2-온의 제조. 건조 THF (10 ml)중 (S)-4-벤질-3-(2-(4-메톡시페닐)아세틸)옥사졸리딘-2-온 (1.00 g, 3.07 mmol)의 용액을 -78 ℃에서 리튬 디이소프로필 아미드 (400 mg, 3.69 mmol, 0.1 M)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 교반하였다. 요오도메탄 (2.00 g, 14.1 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고 -20 ℃로 가온하고 2 시간 더 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 염화 암모늄 용액 (20 ml)으로 퀀칭하고 에틸 아세테이트(3 x 25 ml)로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 농축시켰다. 미정제 화합물은 용출물로서 석유 에테르 중 에틸 아세테이트(10%)를 사용하여 실리카 겔 (60-120 메시)상에 칼럼 크로마토그리패로 정제하여 담황색 고체로서 350 mg (33.8%)의 (S)-3-((R)-2-(4-메톡시페닐)프로파노일)-4-벤질옥사졸리딘-2-온을 제조하였다.
단계 C: (R)-2-(4-메톡시페닐)프로판의 제조. THF (20 ml)중 (S)-3-((R)-2-(4-메톡시페닐)프로파노일)-4-벤질옥사졸리딘-2-온 (1.50 g, 4.42 mmol)의 용액을 수산화 리튬 (750 mg, 17.6 mmol)과 과산화 수소 (0.9 ml, 26.5 mmol, 물중 30%)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 이어서 용매를 증발시키고, 잔사를 희석된 HCl (10 ml)로 산성화하고 DCM (3 x 50 ml)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 미정제 화합물을 용출물로서 석유 에테르 중 에틸 아세테이트 (20%)를 사용하여 실리카 겔 (60-120 메시) 상에서 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 액체로서 600 mg (76%)의 (R)-2-(4-메톡시페닐)프로판산을 제조하였다.
단계 D: (R)-2-(4-메톡시페닐)프로판아미드의 제조. DCM (10 ml) 중 (R)-2-(4-메톡시페닐)프로판산 (400 mg, 2.22 mmol)의 용액에 실온에서 염화 티오닐 (0.42 ml, 5.55 mmol)을 첨가하고 하룻밤 교반하였다. 휘발성 물질을 증발시키고 잔사를 수성 암모니아(5 ml)에 서서히 첨가하였다. 침전된 백색 고체를 여과하고 건조시켜 백색 고체로서 250 mg (62.5%)의 (R)-2-(4-메톡시페닐)프로판아미드를 얻었다.
실시예 11의 제조. 실시예 11은 125℃에서 4 시간 동안 밀봉 관에서 DCM (10 ml)중 상술한 (R)-2-(4-메톡시페닐)프로판아미드 (150 mg, 0.83mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (158 mg, 0.68 mmol), Cs2C03　(409 mg, 1.24 mmol), 잔트포스 (35 mg, 60 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (38 mg, 30 μmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, CHCl3중 MeOH (3%)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 38%의 수율로 제조한 다음, DCM (2 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (60.0 mg, 0.15 mmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 1.0 당량의 에테르성 HCl을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 디에틸에테르로 분쇄하여 황백색 고체로서 58mg의 HCl-염을 얻었다 (88%).　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.62 (s, 1 H), 8.25 (d, 1 H), 8.18 (s, 1 H), 7.38-7.30 (m, 3H), 7.19 (d, 1 H), 7.08 (dd, 1 H), 6.92 (d, 3H), 4.03 (q, 1 H), 3.82 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 1 .53 (d, 3H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 11.06 (s, 1 H), 8.34 (d, 1 H), 8.10 (s, 1 H), 7.38 (t, 1 H), 7.32-7.24 (m, 3H), 7.08 (d, 1 H), 6.92 (d, 3H), 4.03 (q, 1 H), 3.82 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 1.53 (d, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 16.3 min (100%), mp: 210 ℃.
실시예 12 및 13: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-(피리딘-3-일) 프로판아미드의 이성체
출발물질 2-(피리딘-3-일)프로판아미드의 제조. 염화 티오닐 (0.64 ml, 8.86 mmol)을 0 ℃에서 CHCl3　(30 ml)중 2-(피리딘-3-일)프로판산 (0.67 g, 4.43 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 70 ℃에서 3 시간 동안 서서히 가열하였다. 반응 완료 후에, 휘발성 물질을 증발시키고 반응 혼합물을 CHCl3　(5 ml)로 희석하였다. 이어서 반응 혼합물을 수성 암모니아로 퀀칭하고 실온에서 10 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 CHCl3　(2 x 35 ml)로 희석하였다. 유기층을 분리하고 포화 중탄산 나트륨 용액, 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하였다. 유기층을 진공하에 농축하고, 미정제 화합물을 핵산 (2 x 50 ml)으로 세척하고 건조시켜 백색 고체로서 0.43 g (65%)의 2-(피리딘-3-일)프로판아미드를 얻었다.
실시예 12 및 13의 제조. 실시예 12 및 13은 120-125℃에서 3 시간 동안 밀봉 관에서 1,4-디옥산 (5 ml)중 상술한 2-(피리딘-3-일)프로판아미드 (100 mg, 0.66 mmol), Cs2C03　(311 mg, 0.95 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (140 mg, 0.59 mmol), 잔트포스 (38 mg, 90 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (33 mg, 40 μmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, CHCl3중 MeOH (2-3%)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 이어서 분취용 키랄 HPLC (CHIRALPAC 1 C (250 x 4.6 mm, 5μ, 이동상: 핵산/EtOH/DEA:70/30/0.1 )에 의해 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 25.6% (실시예 12) 및 27.7% (실시예 13)의 수율로 얻은 다음, DCM (각각 5 ml) 중에 (실시예 12: 60.0 mg, 0.16 mmol, 실시예 13: 65.0 mg, 0.17 mmol)을 용해하고 0℃에서 30 분 동안 2.2 당량의 에테르성 HCl을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 및 DCM으로 분쇄하여 보라색 고체 (실시예 12)로서 76.2%의 수율 및 회백색 고체로서 74.2%의 수율로 각각 60mg의 HCl-염을 얻었다. 1H-NMR (유리 염기, 두 개의 이성체, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.78 (s, 1 H), 8.59 (s, 1 H), 8.42 (d, 1 H), 8.26 (d, 1 H), 8.16 (s, 1 H), 7.78 (d, 1 H), 7.36-7.30 (m, 2H), 7.18 (d, 1 H), 7.04 (d, 1 H), 6.88 (t, 1 H), 4.04 (q, 1 H), 3.78 (s, 3H), 1.46 (d, 3H),　1H-NMR (HCl- 염, 두 개의 이성체, 400MHz, DMSO-d6): δ = 11 .00 (s, 1 H), 8.92 (d, 1 H), 8.82 (s, 1 H), 8.56 (s, br., 1 H), 8.32 (d, 1 H), 8.14 (s, 1 H), 8.04-7.98 (m, 1 H), 7.40-7.22 (m, 2H), 7.08 (d, 1 H), 6.92 (t, 1 H), 4.36 (q, 1 H), 3.82 (s, 3H), 1 .58 (d, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 9.8 min (99.1 %), 실시예 12: 키랄 순도: 99.58%, 실시예 13: mp: 50℃에서 분해, 170℃에서 완전히 용융, 키랄 순도: 99.19%.
실시예 14: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-(6- 메톡시피리딘 -3-일) 아세트아미드
단계 A: (6-메톡시피리딘-3-일)메탄올의 제조. 수소화 알루미늄 리튬 (0.40 g, 10.8 mmol)을 -10 ℃에서 THF (30 ml)중 메틸 6-메톡시 니코티네이트 (1.50 g, 8.97 mmol)의 용액에 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온시키고 1 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에, 반응 혼합물은 포화 황산 나트륨(10 ml)으로 퀀칭하고 여과하였다. 여과물을 농축하고 CHCl3　(2 x 25 ml)로 희석하였다. 유기층을 포화 중탄산 나트륨 용액, 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조시켰다. 유기층을 여과하고 진공하에 농축시켜 무색 액체로서 1.1 g의 (6-메톡시피리딘-3-일)메탄올을 얻었다.
단계 B: 5-(클로로메틸)-2-메톡시피리딘의 제조. 염화 티오닐 (0.23 ml, 3.23 mmol)을 0 ℃에서 DCM 중 (6-메톡시피리딘-3-일)메탄올 (1.10 g, 8.41 mmol)의 용액에 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에, 휘발성 물질을 증발시키고 반응 혼합물을 포화 중탄산 나트륨 용액으로 염기화하였다. 화합물을 DCM (2 x 30 ml)으로 추출하고 염수(15 ml)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 농축하고 건조시켜 무색 액체로서 1.1g (88%)의 5-(클로로메틸)-2-메톡시피리딘을 얻었다. 이 화합물을 다음 단계에서 직접 취하였다.
단계 C: 2-(6-메톡시피리딘-3-일)아세토니트릴의 제조. 시안화 나트륨 (1.25 g, 25.4 mmol)을 DMSO (10 ml)중 5-(클로로메틸)-2-메톡시피리딘 (1.00 g, 6.34 mmol)의 용액에 첨가하고 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후에, 반응 혼합물을 염수로 희석하고 화합물을 DCM (3 x 35 ml)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 미정제 화합물을 용출물로서 석유 에테르 중에 100-200 실리카 겔, 10% 에틸 아세테이트를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 0.6 g (63.8%)의 2-(6-메톡시피리미딘-3-일)아세토니트릴을 얻었다.
단계 D: 2-(6-메톡시피리딘-3-일)아세트아미드의 제조. 폴리 인산 (6 g)중 화합물 2-(6-메톡시피리미딘-3-일)아세토니트릴 (0.60 g, 4.05 mmol)을 95℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 중탄산 나트륨으로 중화하고 상기 화합물을 DCM (3 x 20 ml)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수 (15 ml)로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 미정제 화합물을 에테르 (2 x 5 ml)로 세척하여 백색 고체로서 350 mg (52.2%)의 2-(6-메톡시피리딘-3-일)아세트아미드를 얻었다.
실시예 14의 제조. 실시예 14는 125℃에서 3 시간 동안 1,4-디옥산 (15 ml)중 상술한 2-(6-메톡시피리딘-3-일)아세트아미드 (250 mg, 1.50 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (280 mg, 1.20 mmol), Cs2C03　(740 mg, 2.25 mmol), 잔트포스 (69.0 mg, 0.12 mmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (69 mg, 60 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, CHCl3중 중성 알루미나, MeOH (5%)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 20%의 수율로 제조한 다음, DCM (5 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (50.0 mg, 0.13 mmol)을 용해시키고 2.2 당량의 에테르성 HCl을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 휘발성 물질을 증발시키고, 잔사를 에테르(2 x 3 ml)로 분쇄하고 건조시켜 무색고체로서 45mg의 HCl-염(83%)을 얻었다. 　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.78 (s, 1 H), 8.35 (d, 1 H), 8.19 (s, 1 H), 8.1 1 (s, 1 H), 7.72 (d, 1 H), 7.38 (t, 1 H), 7.21 (d, 1 H), 7.07 (d, 1 H), 6.91 (t, 1 H), 6.79 (d, 1 H), 3.84 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.68 (s, 2H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 8.32 (d, 1 H), 8.11 (s, 2H), 7.71 -7.69 (m, 1 H), 7.43-7.39 (m, 3H), 7.1 1 -7.08 (m, 1 H), 6.94-6.91 (m, 1 H), 6.82-6.80 (m, 1 H), 3.83 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.76 (s, 2H), HPLC (λ = 214 nm, [A]): rt 14.1 min (92.8%), mp: 융점 범위: 174-178 ℃.
실시예 15 및 16: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-(피리딘-4-일) 프로판아미드의 이성체
단계 A: 에틸 2-(피리딘-4-일)아세테이트의 제조. 염화 티오닐 (1.70 ml, 23.0 mmol)을 0 ℃에서 EtOH (30 ml)중 피리딘-4-일-아세트산 하이드로클로라이드 (2.00 g, 11.5 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류하에 18 시간 동안 가열한 다음, 반응 혼합물의 온도를 실온으로 낮추고 휘발성 물질을 진공하에 증발시켰다. 미정제 반응 혼합물을 수성 중탄산 나트륨 용액으로 염기화하고, 에틸 아세테이트(2 x 50 ml)로 추출하고, 물, 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조시켰다. 여과 후에, 유기 용매를 증발시키고 건조시켜 담황색 액체로서 1.50 g (86.2%)의 에틸 2-(피리딘-4-일)아세테이트를 얻었다. 이것은 다음 단계를 위해 그 자체로 취하였다.
단계 B: 에틸 2-(피리딘-4-일)프로파노에이트의 제조. THF (10 ml)중 에틸 2-(피리딘-4-일)아세테이트 (1.00 g, 6.06 mmol)의 용액을 질소 대기 하에 -50℃에서 THF (10 ml)중 수소화 나트륨(0.24 g, 6.06 mmol, 60 %)의 현탁액에 적가하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. THF (10 ml)중 요오드화 메틸 (2.10 ml, 33.6 mmol)을 15분의 시간에 걸쳐 -50℃에서 서서히 첨가한 다음, 반응 혼합물을 -10℃까지 가온하고 4 시간 더 계속 교반시켰다. 반응 혼합물을 수성 염화 암모늄으로 퀀칭하고 에틸 아세테이트(2 x 50 ml)로 추출하였다. 결합된 유기 추출물을 염수 (50 ml)로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켰다. 미정제물을 디에틸 에테르(10 ml)로 세척하고 무색 액체로서 550 mg (50.7%)의 에틸 2-(피리딘-4-일)프로파노에이트를 얻었다.
단계 C: 2-(피리딘-4-일)프로판아미드의 제조. 메탄올성 암모니아 (20 ml)를 스틸 봄브(steel bomb)중 에틸 2-(피리딘-4-일)프로파노에이트 (140 mg, 0.78 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 70 ℃로 18 시간 동안 가열한 다음, 반응물의 온도를 실온으로 낮추고 휘발성 물질을 증발시켰다. 반응 혼합물을 n-펜탄으로 세척하여 주황색 고체로서 45 mg (38.8%)의 2-(피리딘-4-일)프로판아미드를 얻었다.
실시예 15 및 16의 제조. 실시예 15 및 16은 120℃에서 4 시간 동안 1,4-디옥산 (20 ml)중 상술한 2-(피리딘-4-일)프로판아미드 (0.36 g, 2.40 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (0.56 g, 2.40 mmol), Cs2C03　(1.10 g, 3.45 mmol), 잔트포스 (0.12 g, 0.22 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (0.110 g, 0.096 mmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, DCM중 중성 알루미나, MeOH (1-2%)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 담황색 고체로 0.46 g (55.5%)의 생성물을 얻었다. 다음에 분취용 키랄 HPLC (CHIRALPAC 1C (250 x 4.6 mm, 5μ), 이동상: 핵산/EtOH/DEA:70/30/0.1), 수율 5.9% (실시예 15) 및 7.9% (실시예 16).　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6):δ = 10.81 (s, 1 H), 8.50 (d, 2H), 8.29 (d, 1 H), 8.17 (s, 1 H), 7.39-7.33 (m, 3H), 7.19 (dd, 1 H), 7.07 (dd, 1 H), 6.90 (t, 1 H), 4.06 (q, 1 H), 3.79 (s, 3H), 1.42 (d, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 9.8 min (100% (실시예 13), 99.3% (실시예 16)), mp: 융점 범위: 49-51 ℃, 키랄 순도: 96.68%, [□]D= +171o (실시예 15), 융점 범위: 96-102 ℃, 키랄 순도: 97.26%, [□]D= -151o(실시예 16).
실시예 17 및 18: N-(4-(5- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-(티오펜-2-일) 프로판아미드의 이성체
단계 A: 메틸 2-(티오펜-2-일)아세테이트의 제조. 염화티오닐 (10.20 ml, 140.7 mmol)을 0℃에서 MeOH (100 ml)중 티오펜-2-일-아세트산 (10.0 g, 70.3 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류하에 18 시간 동안 가열하고, 휘발성 물질을 증발시키고 미정제 반응 혼합물을 수성 중탄산 나트륨 용액으로 염기화하고, DCM으로 추출하고, 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조시켰다. 여과 후에, 유기 용매를 증발시키고 건조시켜 무색 액체로서 10.75 g (98%)의 메틸 2-(티오펜-2-일)아세테이트를 얻었다.
단계 B: 메틸 2-(티오펜-2-일)프로파노에이트의 제조. THF (25 ml)중 메틸 2-(티오펜-2-일)아세테이트(4.90 g, 31.4 mmol)의 용액을 질소의 대기 하에 -50 ℃에서 THF (25 ml)중 수소화 나트륨(1.20 g, 31.4 mmol, 60 %)의 현탁액에 적가하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반한 후, 요오드화 메틸을 15분에 걸쳐 -50℃에서 THF (25 ml)중의 용액으로서 (1.76 ml, 28.2 mmol)을 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 -30℃까지 가온시키고 2시간 더 계속 교반하였다. 이어서 수성 염화 암노늄으로 퀀칭하고, DCM (2 x 30 ml)로 추출하고 염수(30 ml)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 미정제물은 용출물로서 석유 에테르 중에 에틸 아세테이트 (5%)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피 (100-200 메시)로 정제하여 무색 액체로서 2.2 g (41.7%)의 메틸 2-(티오펜-2-일)프로파노에이트를 얻었다.
단계 C: 2-(티오펜-2-일)프로판아미드의 제조. 메탄올성 암모니아 (10 ml)를 밀봉 관에서 메틸 2-(티오펜-2-일)프로파노에이트 (200 mg, 1.17 mmol)에 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃로 18시간 동안 가열하였다. 휘발성 물질을 증발시키고 잔사를 n-펜탄으로 세척하여 갈색 고체로서 130 mg (71.3%)의 2-(티오펜-2-일)프로판아미드를 얻었다.
실시예 17 및 18의 제조. 실시예 17 및 18은 환류하에 6 시간 동안 1,4-디옥산 (20 ml)중 상술한 2-(티오펜-2-일)프로판아미드 (400 mg, 2.58 mmol), 2-클로로-4-(5-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (0.61 g, 2.58 mmol), Cs2C03　(1.20 g, 3.71 mmol), 잔트포스 (0.13 g, 0.23 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (0.14 g, 0.13 mmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고,중성 알루미나, DCM을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 담황색 고체로 생성물을 0.3 g (32.6%)을 얻었다. 다음에 분취용 키랄 HPLC (CHIRALPAC 1 C (250 x 30 mm, 5μ), 핵산/IPA/DEA:85/15/0.1), 수율 10.5% (실시예 17) 및 5.6% (실시예 18). 다음에 DCM (2 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (각각 30.0 mg, 0.08 mmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.1 ml, 0.1 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물은 n-펜탄 및 디에틸 에테르로 분쇄하여 HCl-염을 담갈색 고체로서 60.5%의 수율 (실시예 17) 및 담황색 고체로서 62%의 수율(실시예 18)로 얻었다.　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.82 (s, 1 H), 8.34 (d, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 7.39 (d, 1 H), 7.29-7.15 (m, 4H), 7.04 (d, 1 H), 6.96 (t, 1 H), 4.36 (q, 1 H), 3.76 (s, 3H), 1 .45 (d, 3H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 11.02 (s, 1 H), 8.35 (d, 1 H), 8.18 (s, 1 H), 7.39 (d, 1 H), 7.31 -7.17 (m, 4H), 7.06 (s, 1 H), 6.97 (t, 1 H), 4.38 (q, 1 H), 3.78 (s, 3H), 1.48 (d, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 17.5 min (100%, 두 개의 이성체), mp: 용융 범위: 77-80℃, 키랄 순도: 98%, [□]D= +14.83o(실시예 17), 116 ℃, 화합물은 60 ℃에서 분해하며 116℃에서 완전히 용융한다. 키랄 순도: 97.5%, [□]D= -17.58(실시예 18).
실시예 19: 2-(2- 클로로피리딘 -4-일)-N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일) 아세트아미드
실시예 19는 밀봉 관에서 90 ℃에서 16 시간 동안 DCM (10 ml)중 상업적으로 시판중인 화합물 2-(2-클로로피리딘-4-일)아세트산 (150 mg, 0.88 mmol), 2-아미노-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (153 mg, 0.70 mmol), DIPEA (0.23 ml, 1.32 mmol) 및 HATU (500 mg, 1.32 mmol)로부터 출발하여 방법 A에 따라 합성하고, 석유 에테르 중에 에틸아세테이트(5%)를 사용하는 분취용 TLC에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 46%의 수율로 얻은 다음, DCM (2 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (40.0 mg, 102 μmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 1.0 당량의 에테르성 HCl (0.102 ml, 0.102 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물은 디에틸 에테르 및 DCM으로 분쇄하여 황백색 고체로서 HCl-염을 88%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (유리 염기, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.87 (s, 1 H), 8.32 (d, 2H), 8.14 (s, 1 H), 7.49-7.36 (m, 3H), 7.21 (d, 1 H), 7.08 (d, 1 H), 6.87 (d, 1 H), 3.85 (s, 2H), 3.83 (s, 3H),　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 11.25 (s, 1 H), 8.38 (d, 2H), 8.14 (s, 1 H), 7.53 (s, 1 H), 7.39 (d, 3H), 7.13 (d, 1 H), 6.94 (d, 1 H), 3.92 (s, 2H), 3.83 (s, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 14.6 min (100%), mp: 203℃
실시예 20: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-(4-(4- 메틸피페 라진-1-일) 페닐 ) 아세트아미드
단계 A: 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아세트산의 제조. 1-(4-(4-메틸-피페라진-1-일)-페닐)-에탄온(1.00 g, 4.52 mmol), 황 (0.35 g, 10.9 mmol), 모르폴린 (3.03 ml, 3.00 g, 34.5 mmol) 및 p-톨루엔 설폰산 (0.08 g, 0.46 mmol)을 환류하에 4 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물은 실온으로 냉각하고 얼음으로 퀀칭하였다. 고체를 여과하고 건조시켰다. 미정제 생성물을 EtOH (35 ml)중 10% KOH에서 취하고 하룻밤 환류하였다. 용매를 감압하에 증발시키고 잔사를 물(15 ml)중에 용해하고 에틸 아세테이트(20 ml)로 세척하였다. pH는 2N HCl을 사용하여 2로 조절하고, 농축하고 감압하에 건조시켜 2.6 g의 미정제 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아세트산을 얻었다.
단계 B: 메틸 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아세테이트의 제조. 염화 티오닐 (0.32 g, 2.77 mmol)을 0℃에서 MeOH (30 ml)중 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아세트산(2.60 g, 11 .1 mmol)의 현탁액에 적가하고 5 시간 동안 환류하였다. 반응 혼합물을 농축하고 잔사를 물 중에 용해하고, 포화 중탄산 나트륨을 사용하여 pH ~8까지 알칼리성으로 만들고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, 수성 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 증발 건조시켜 미정제 화합물을 얻었다. 미정제물은 용출물로서 DCM중 4% MeOH를 사용하여 중성 알루미나 상에서 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 갈색 고체로서 250 mg의 메틸 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아세테이트를 얻었다.
단계 C: 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아세트아미드의 제조. 메탄올성 암모니아 (15 ml)중 메틸 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아세테이트(0.45 g, 1.81 mmol)를 압력 봄브(pressure bomb)중 100℃에서 가열하였다. 과량의 MeOH를 감압하에 농축하여 미정제 화합물을 얻었다. 이것은 n-펜탄으로 세척하고 진공하에 건조시켜 갈색 고체로서 0.24 g (57%)의 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아세트아미드를 얻었다.
실시예 20의 제조. 실시예 20은 밀봉 관에서 120-125 ℃에서 3 시간 동안 건조 1,4-디옥산(3 ml)중 상술한 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아세트아미드 (100 mg, 0.43 mmol), Cs2C03　(210 mg, 0.64 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (122 mg, 0.52 mmol), 잔트포스 (20 mg, 34 μmmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (20 mg, 17 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 석유 에테르 중에 에틸아세테이트(5%)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 43%의 수율로 얻은 다음, 건조 DCM (5 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (50.0 mg, 137 μmol)을 용해시키고 0℃에서 30 분 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.16 ml, 0.16 mmol)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물은 디에틸 에테르로 분쇄하고 70℃에서 4시간 동안 오븐에서 건조시켜 황백색 고체로서 HCl-염을 76.9%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 7.43-7.36 (m, 1 H), 7.32-7.28 (m, 1 H), 7.28-7.24 (m, 3H), 7.10 (d, 1 H), 6.99-6.94 (m, 3H), 6.94-6.88 (m, 1 H), 3.83-3.75 (m, 5H), 3.67 (s, 2H), 3.49-3.44 (m, 2H), 3.18-3.04 (m, 4H), 2.80 (d, 2H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 10.4 min (100%), mp: 248℃.
실시예 21: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-3-(피리딘-4-일) 부틸아미드
단계 A: (Z)-에틸 3-(피리딘-4-일)부트-2-에노에이트의 제조. 트리에틸 포스피노 아세테이트 (1.96 ml, 9.91 mmol)을 -10℃에서 건조 THF (15 ml)중 수소화 나트륨(0.40 g, 9.91 mmol, 60%)의 현탁액에 첨가하고 10 분 동안 교반하였다. 4-아세틸 피리딘(1.00 g, 8.26 mmol)을 -10℃에서 적가하고 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고 아세트산 (pH ~ 4)으로 퀀칭하고, 물로 희석하고 DCM (3 x 45 ml)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고 증발 건조시켜 미정제 화합물을 생성시켰다. 용출물로서 석유 에테르 중 10-15% 에틸 아세테이트를 사용하여 중성 알루미나 상에서 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 담갈색 액체로서 900 mg (57.3%)의 (Z)-에틸 3-(피리딘-4-일)부트-2-에타노에이트를 얻었다.
단계 B: 에틸 3-(피리딘-4-일)부타노에이트의 제조. 탄소 팔라듐 (70 mg, 10 중량%)을 EtOH (10 ml)중 (Z)-에틸 3-(피리딘-4-일)부트-2-에노에이트(0.70 g, 3.66 mmol)의 용액에 첨가하고 풍선 압력(balloon pressure)하에 18 시간 동안 수소화 시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통하여 여과하고 EtOH로 세척하였다. 여과물을 감압하에 농축하여 담갈색 액체로서 0.50 g (71.4%)의 에틸 3-(피리딘-4-일)부타노에이트를 얻었다.
단계 C: 3-(피리딘-4-일)부탄아미드의 제조. 메탄올성 암모니아 (10 ml) 중 에틸 3-(피리딘-4-일)부타노에이트 (0.50 g, 2.59 mmol)의 용액을 압력 봄브 중에 100℃로 48 시간 동안 가열하였다. 용매를 감압하에 증발시켜 미정제 화합물을 생성시키고, n-펜탄으로 세척하고 감압하에 건조시켜 황백색 고체로서 0.2 g (47%)의 3-(피리딘-4-일)부탄아미드를 얻었다.
실시예 21의 제조. 실시예 21은 밀봉 관에서 120-125 ℃에서 4 시간 동안 건조 1,4-디옥산(5 ml)중 상술한 3-(피리딘-4-일)부탄아미드 (150 mg, 0.91 mmol), Cs2C03　(450 mg, 1.37 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (0.19g, 0.82 mmol), 잔트포스 (42 mg, 1.37 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (42 mg, 40 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 석유 에테르 중에 에틸아세테이트(10%)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 22.6%의 수율로 얻은 다음, 아세톤 (5 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (40.0 mg, 0.10 mmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.12 ml, 0.12 mmol, 1M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물은 n-펜탄으로 분쇄하고 건조시켜 황백색 고체로서 HCl-염을 75.8%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 8.83 (d, 2H), 8.26 (d, 1 H), 8.10-8.04 (m, 3H), 7.40 (t, 1 H), 7.31 -7.28 (m, 1 H), 7.12-7.08 (m, 1 H), 6.92 (td, 1 H), 3.80 (s, 3H), 3.63-3.54 (m, 1 H), 3.04-2.96 (m, 2H), 1.33 (d, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 9.5 min (97.0%), mp: 233 ℃.
실시예 22: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 ) 피리딘-2-일)-2-((피리딘-4-일)메틸)- 프로판아미드
단계 A: 디에틸 2-(1-(피리딘-4-일)프로판-2-일)말로네이트의 제조. 0℃에서 DMF (50 ml)중 디에틸 메틸 말로네이트(2.41 g, 13.9 mmol)의 현탁액에 수소화 나트륨(1 .66 g, 41.6 mmol, 60%)을 첨가한 다음, 화합물 4-클로로메틸 피리딘 하이드로클로라이드 (2.50 g, 15.2 mmol)를 첨가하고 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 아세트산으로 퀀칭하고 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 에틸 아세테이트 층을 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축시켜 담갈색 오일로서 2.50 g (68.1 %)의 디에틸 2-(1 -(피리딘-4-일)프로판-2-일)말로네이트를 얻었다.
단계 B: 2-((피리딘-4-일)메틸)프로판산의 제조. 화합물 디에틸 2-(1 -(피리딘-4-일)프로판-2-일)말로네이트 (2.50 g, 9.43 mmol)를 농축 HCl (30 ml)중에 16 시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물의 pH는 고체 중탄산 나트륨을 첨가하여 6으로 조절하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 에틸아세테이트 층을 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켜 황백색 고체로서 1.20 g (76.9%)의 2-((피리딘-4-일)메틸)프로판산을 얻었다.
단계 C: 2-((피리딘-4-일)메틸)프로판아미드의 제조. 염화 옥살일(154 mg, 1.21 mmol)을 질소의 대기하에 0℃에서 DCM (5 ml) 중 2-((피리딘-4-일)메틸)프로판산 (100 mg, 0.61 mmol)의 교반 용액에 첨가한 다음 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 미정제 산 염화물을 생성시켰다. 수성 암모니아(5 ml)를 0℃에서 상기 산 염화물 용액에 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 에틸 아세테이트 층은 물로 세척한 다음, 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켜 담갈색 고체로서 92.0 mg (92.9%)의 2-((피리딘-4-일)메틸) 프로판아미드를 생성시켰다.
실시예 22의 제조. 실시예 22는 밀봉 관에서 120-125℃에서 16 시간 동안 건조 1,4-디옥산(10 ml)중 상술한 2-((피리딘-4-일)메틸)프로판아미드 (170 mg, 1.04 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (223 mg, 942 μmol), Cs2C03　(929 mg, 2.82 mmol), 잔트포스 (33 mg, 57 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (22 mg, 19 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 석유 에테르 중에 에틸아세테이트(5%)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 22.4%의 수율로 얻은 다음, DCM (5 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (50.0 mg, 137 μmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.16 ml, 0.16 mmol, 1M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물은 n-펜탄으로 분쇄하고 건조시켜 회백색 고체로서 HCl-염을 60.4%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 8.82-8.80 (m, 2H), 8.30 (d, 1 H), 8.16 (s, br., 1 H), 7.98-7.92 (m, 2H), 7.41 -7.37 (m, 1 H), 7.26-7.22 (m, 1 H), 7.10 (dd, 1 H), 6.95-6.89 (m, 1 H), 3.80 (s, 3H), 3.04-2.95 (m, 3H), 1.14 (d, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 9.7 min (100%), mp: 193 ℃.
실시예 23: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-3-(피리딘-3-일) 부 탄아미드
단계 A: (E)-에틸 3-(피리딘-3-일)부트-2-에노에이트의 제조. 디에틸 2-옥소펜틸-포스포네이트(1.85 g, 8.26 mol)를 건조 THF (15 ml)중 수소화 나트륨(0.50 g, 12.4 mmol, 60%)의 현탁액에 적가한 다음, 실온에서 3-아세틸 피리딘(1.00 g, 8.26 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, 아세트산으로 퀀칭하고 pH~6으로 조절하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고 CHCl3로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 증발 건조시켜 미정제 화합물을 얻었다. 용출물로서 석유 에테르 중 10-15% 에틸 아세테이트를 사용하여 중성 알루미나를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 액체로서 600 mg (40%)의 (E)-에틸 3-(피리딘-3-일)부트-2-에노에이트를 얻었다.
단계 B: 에틸 3-(피리딘-3-일)부타노에이트의 제조. 탄소 팔라듐 (600 mg, 10 중량 %)를 EtOH (10 ml)중 (E)-에틸 3-(피리딘-3-일)부트-2-에노에이트(0.60 g, 3.14 mmol)의 용액에 첨가하고 풍선 압력하에 3 시간 동안 수소화시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통하여 여과하고 EtOH로 세척하였다. 여과물을 농축하고 감압하에 건조시켜 무색 액체로서 0.60 g (100%)의 에틸 3-(피리딘-3-일)부타노에이트를 얻었다.
단계 C: 3-(피리딘-3-일)부탄아미드의 제조. 메탄올성 암모니아 (10 ml) 중 에틸 3-(피리딘-3-일)부타노에이트(0.50 g, 2.59 mmol)의 용액을 압력 봄브 중에서 100℃로 하룻밤 가열하였다. 용매를 감압하에 증발하고, n-펜탄으로 세척하고 감압하에 건조시켜 담갈색 고체로서 0.2 g (47%)의 3-(피리딘-3-일)부탄아미드를 얻었다.
실시예 23의 제조. 실시예 23은 밀봉 관에서 120-125℃에서 3 시간 동안 1,4-디옥산(5 ml)중 상술한 3-(피리딘-3-일)부탄아미드 (80.0 mg, 0.49 mmol), Cs2C03　(242 mg, 0.74 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (0.14 g, 0.58 mmol), 잔트포스 (22 mg, 40 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (22 mg, 20 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 석유 에테르 중에 에틸아세테이트(5%)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 30.9%의 수율로 얻은 다음, DCM (5 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (50.0 mg, 137 μmol)을 용해시키고 0℃에서 30 분 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.16 ml, 0.16 mmol, 1M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물은 에테르, DCM으로 분쇄하고 진공하에 건조시켜 황백색 고체로서 HCl-염을 63.5%의 수율로 얻었다.　　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 8.92 (s, 1 H), 8.78 (s, 1 H), 8.57 (s, br., 1 H), 8.30 (d, 1 H), 8.09-8.00 (m, 2H), 7.42-7.35 (m, 1 H), 7.31-7.26 (m, 1 H), 7.10 (d, 1 H), 6.95-6.89 (m, 1 H), 3.81 (s, 3H), 3.57-3.52 (m, 1 H), 2.96-2.86 (m, 2H), 1.35 (d, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 9.5 min (100%), mp: 200 ℃.
실시예 24: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-((피리딘-3-일)메틸)- 프로판아미드
단계 A: (피리딘-3-일)메탄올의 제조. 수소화 붕소 나트륨 (883 mg, 23.6 mmol)을 0℃에서 25 ml의 MeOH 중 피리딘-3-카르복살데히드(2.50 g, 23.6 mmol)의 혼합물에 3번 조금씩 첨가하고 실온에서 8 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 조각으로 퀀칭하고 감압하에 농축하였다. 잔사를 물과 에틸 아세테이트 사이에로 분할하였다. 결합된 에틸 아세테이트 층을 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켜 담황색 오일로서 2.20 g (86.3%)의 (피리딘-3-일)메탄올을 얻었다.
단계 B: 3-(클로로메틸)피리딘 하이드로클로라이드의 제조. 염화 티오닐(9.60 g, 80.6 mmol)을 0℃에서 30 ml의 CHCl3 중에 (피리딘-3-일)메탄올(2.20 g, 20.1 mmol)의 교반 용액에 적가하고 4 시간 동안 환류하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 갈색 고체로서 2.10 g (63.6%)의 3-(클로로메틸)피리딘 하이드로클로라이드를 얻었다.
단계 C: 디에틸 2-(1-(피리딘-3-일)프로판-2-일)말로네이트의 제조. 0℃에서 DMF (25 ml)중 디에틸 메틸 말로네이트(1.80 g, 10.2 mmol)의 현탁액에 수소화 나트륨(1.25 g, 31.0 mmol, 60%)을 첨가한 다음 3-(클로로메틸)피리딘 하이드로클로라이드(2.00 g, 12.2 mmol)을 첨가하고 실온에서 8 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 아세트산으로 퀀칭하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 에틸 아세테이트 층을 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 진공하에 농축시켜 담갈색 오일로서 2.50 g (91.2%)의 디에틸 2-(1-(피리딘- 3-일)프로판-2-일)말로네이트를 얻었다.
단계 D: 2-((피리딘-3-일)메틸)프로판산의 제조. 디에틸 2-(1-(피리딘-3-일)프로판-2-일)말로네이트 (2.00 g, 7.55 mmol)을 농축 HCl (30 ml)중에 16 시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 고체 중탄산 나트륨(pH~7)을 사용하여 중화시키고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 에틸 아세테이트 층을 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켜 갈색 반고체로서 580 mg (46.4%)의 2-((피리딘-3-일)메틸)프로판산을 얻었다.
단계 E: 2-((피리딘-3-일)메틸)프로판아미드의 제조. 염화 옥살릴(385 mg, 3.03 mmol)을 질소 대기하에 0℃에서 DCM (5 ml) 중 2-((피리딘-3-일)메틸)프로판산(250 mg, 1.52 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하고 얻어진 잔사를 0℃에서 액체 암모니아(5 ml)로 퀀칭하고 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 에틸 아세테이트 층을 물로 세척하는 다음 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켜 갈색 고체로서 90 mg (36.3%)의 2-((피리딘-3-일)메틸)프로판아미드를 얻었다.
실시예 24의 제조. 실시예 24는 밀봉 관에서 120-125℃에서 16 시간 동안 1,4-디옥산(15 ml)중 상술한 2-((피리딘-3-일)메틸)프로판아미드 (350 mg, 2.13 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (460 mg, 1.94 mmol), Cs2C03　(1.90 mg, 5.82 mmol), 잔트포스 (67 mg, 45 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (45 mg, 38 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 석유 에테르 중에 에틸아세테이트(5%)를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 25.8%의 수율로 얻은 다음, 아세톤 (5 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (50.0 mg, 137 μmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.13 ml, 0.16 mmol)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 n-펜탄으로 분쇄하여 황백색 고체로서 HCl-염을 73%의 수율로 얻었다.　　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 8.85 (s, 1 H), 8.76 (d, 1 H), 8.46 (d, 1 H), 8.29 (d, 1 H), 8.15 (s, 1 H), 8.00-7.96 (m, 1 H), 7.42-7.37 (m, 1 H), 7.27 (d, 1 H), 7.09 (dd, 1 H), 6.95-6.88 (m, 1 H), 3.81 (s, 3H), 3.18-3.08 (m, 2H), 2.94-2.88 (m, 1 H), 1.14 (d, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 9.7 min (100%).
실시예 25 및 실시예 26: trans -3- 아세트아미노 -N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )-피리딘-2-일) 사이클로헥산카르복사미드
단계 A: trans-메틸 3-아미노사이클로헥산카르복실레이트의 제조. 염화 티오닐(0.6 ml)을 0℃에서 MeOH (20 ml)중 trans-3-아미노-사이클로헥산 카르복실산 (0.5 g, 2.8 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 65℃로 가열하고 진공하에 농축시켰다. 수득된 잔사를 포화 중탄산 나트륨 (10 ml) 사이에 분할하고, 에틸아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기층을 식염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 진공하에 농축시켜 무색 액체로서 400 mg (90.9%)의 trans-메틸 3-아미노사이클로헥산카르복실레이트를 얻었다.
단계 B: trans-메틸 3-아세트아미도사이클로헥산 카르복실레이트의 제조. 아세트산 무수물 (1.20 ml, 12.7 mmol)을 0℃에서 피리딘(10 ml)중 trans-메틸 3-아미노사이클로헥산-카르복실레이트 (0.40 g, 2.54 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 1 시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공하에 제거하고, 수득된 잔사를 DCM 중에 용해하고 포화 중탄산 나트륨 용액으로 세척한 다음 식염수(10 ml)로 세척하였다. 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과한 후에, 여과물을 진공하에 농축시켜 무색 액체로서 350 mg (69.0%)의 trans-메틸 3-아세트아미도사이클로헥산 카르복실레이트를 얻었다.
단계 C: trans-3-아세트아미도사이클로헥산 카르복사미드의 제조. 메탄올성 암모니아(20 ml)를 trans-메틸 3-아세트아미도사이클로헥산카르복실레이트 (350 mg, 1.75 mmol)에 첨가하고, 스틸 봄브(steel bomb)에 취하고 70 ℃에서 18 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 n-펜탄으로 세척하고 감압하에 건조시켜 백색 고체로서 200 mg (57.1 %)의 trans-3-아세트아미도사이클로헥산 카르복사미드를 얻었다.
실시예 25 및 26의 제조. 실시예 25 및 26은 밀봉 관에서 125℃에서 5 시간 동안 1,4-디옥산 (15 ml)중 상술한 trans-3-아세트아미도사이클로헥산 카르복사미드 (200 mg, 1.08 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (260 mg, 1.08 mmol), Cs2C03　(500 mg, 1.56 mmol), 잔트포스 (57 mg, 97 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (50 mg, 40 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하여 혼합물로서 두 개의 화합물을 59.8%의 수율로 생성시키고, DCM중 2% MeOH를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 1 단계로 정제하였다. 분취용 HPLC (CHIRALPAK IA (20 x 250 mm, 5μ), 헥산/EtOH/DEA:90/10/0.1, λ= 281 nm, 유속: 19 ml min-1)로 추가로 정제하여 실시예 25을 24%의 수율로 또한 실시예 26을 14.4%의 수율로 얻은 다음, 아세톤 (5 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (실시예 25: 110 mg, 0.28 mmol, 실시예 26: 80.0mg, 0.21 mmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl (실시예 25: 0.34 ml, 0.34mmol, 실시예 26: 0.25 ml, 0.25 mmol, 1M) 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물은 물 중에 용해하고 동결건조시켜 황백색 고체로서 HCl-염을 61.2%의 수율(실시예 25, 키랄 순도: 96%) 또한 백색 고체로 40.7%의 수율(실시예 26, 키랄 순도 97%)로 얻었다. 실시예 25 및 26에 대한　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 8.30 (d, 1 H), 8.14 (s, 1 H), 7.60 (d, 1 H), 7.40 (dd, 1 H), 7.27-7.23 (m, 1 H), 7.09 (dd, 1 H), 6.91 (td, 1 H), 3.98- 3.92 (m, 1 H), 3.82 (s, 3H), 2.84-2.75 (m, 1 H), 1.84 (s, 3H), 1.80-1.63 (m, 3H), 1.59.-1.48 (m, 5H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 11.2 min (98.75% (실시예 25), 99.15% (실시예 26)), 광회전: +10.5°(실시예 25) 및 -7.4°(실시예 26) (MeOH중 1% 용해), mp (실시예 25): 70℃에서 시작하여 160℃에서 완전히 용해, (실시예 26): 80℃에서 시작하여 160℃에서 완전히 용융.
실시예 27: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-(4-(4- 메틸피페라진 -1-일) 페닐 ) 프로판아미드
단계 A: 디에틸 2-메틸-2-(4-니트로페닐)말로네이트의 제조. 디에틸 메틸 말로네이트(6.17 g, 35.4 mmol)를 DMSO (50 ml)중 수소화 나트륨 (1.63 g, 42.5 mmol, 60%)의 교반 용액에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 1-플루오로-4-니트로벤젠 (5.00 g, 35.4 mmol)을 반응 혼합물에 적가하고 실온에서 6 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 염화 암모니아 용액으로 퀀칭하고 디에틸 에테르로 추출하였다., 분리된 유기층을 식염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 진공하에 농축시켜 미정제 생성물을 제공하였다. 용출물로서 석유 에테르 중에 20% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 (60-120 메시) 상에 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 오일로서 8.20 g (78.8%)의 디에틸 2-메틸-2-(4-니트로페닐)말로네이트를 얻었다.
단계 B: 디에틸 2-(4-아미노페닐)-2-메틸말로네이트의 제조. 염화 제1 주석 2 수화물 (30.60 g, 135.6 mmol)을 EtOH (100 ml)중 디에틸 2-메틸-2-(4-니트로페닐)말로네이트 (8.00 g, 27.1 mmol)의 용액에 첨가하고 환류하에 16 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 감압하에 농축하였다. 잔사를 물 중에서 취하고 트리에틸 아민으로 염기화하여 pH~8로 조절하였다. 침전된 고체를 여과하고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과물로부터 분리된 유기층을 물, 식염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축시켜 갈색 오일로서 6.0 g (83%)의 디에틸 2-(4-아미노페닐)-2-메틸말로네이트를 얻었다.
단계 C: 디에틸 2-메틸-2-(4-(피페라진-1-일)페닐)말로네이트의 제조. 자일렌 (20 ml) 중 디에틸 2-(4-아미노페닐)-2-메틸말로네이트 (6.00 g, 22.6 mmol), 비스-(2-클로로에틸)아민. HCl (4.82 g, 27.2 mmol)의 현탁액을 48 시간 동안 환류하였다. 반응 혼합물을 진공하에 농축하고 잔사를 포화 중탄산 나트륨 용액과 에틸 아세테이트 사이에 분할하였다. 분리된 유기층을 물, 식염수로 세척하고 여과하고 감압하에 농축시켜 미정제 생성물을 제공하였다. 용출물로서 CHCl3 중 5% MeOH를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 갈색 오일로서 4.80g (63.5%)의 디에틸 2-메틸-2-(피페라진-1-일)페닐)말로네이트를 얻었다.
단계 D: 디에틸 2-메틸-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)말로네이트의 제조. 포름알데히드(2 ml), 포름산 (2 ml) 및 디에틸 2-메틸-2-(4-(피페라진-1-일)페닐)말로네이트(4.80 g, 14.4 mmol)의 혼합물을 환류 하에 2 시간 동안 가열하고 반응 혼합물을 감압하에 농축하였다. 포화된 중탄산 나트륨 용액을 첨가하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물, 식염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 진공하에 농축시켜 갈색 오일상 액체로서 3.50 g (70.0%)의 디에틸 2-메틸-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)말로네이트를 얻었다.
단계 E: 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)프로판산의 제조. 농축 HCl (20 ml)중에 디에틸 2-메틸-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)말로네이트(3.50 g, 10.0 mmol)를 밀봉 관에서 환류하에 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 톨루엔으로 공-증류시켜 암갈색 고체로서 (1.7 g, 70%)의 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)프로판산을 얻었다.
단계 F: 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)프로판아미드의 제조. 염화 티오닐 (2 ml) 및 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)프로판산(1.00 g, 4.03 mmol)의 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하고, 잔사를 건조 THF (10 ml)중에 취하고, -78℃로 냉각하고, 용액이 투명해질 때까지 암모니아 가스로 퍼징하였다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온하고, 침전물을 여과하고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과물을 감압하에 농축시켜 갈색을 띤 백색 고체로서 (0.5 g, 55%)의 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)프로판아미드를 얻었다.
실시예 27의 제조. 실시예 27은 밀봉 관에서 120-125℃에서 3 시간 동안 1,4-디옥산 (5 ml)중 상술한 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)프로판아미드 (200 mg, 0.81 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (170 mg, 0.71 mmol), Cs2C03　(0.53 g, 1.62 mmol), 잔트포스 (42 mg, 70 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (37 mg, 30 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 55.1%의 수율로 얻은 다음, 아세톤 (3 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (120 mg, 0.26 mmol)을 용해시키고 0℃에서 30 분 동안 2.2 당량의 에테르성 HCl (0.60 ml, 0.58 mmol)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물은 n-펜탄으로 분쇄하고 물 중에 용해하고 50℃에서 농축 건조시켜 담황색 고체로서 HCl-염을 64.5%의 수율로 얻었다.　　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 11.80 (s, br., 1 H), 11.00 (s, br., 1 H), 8.32 (d, 1 H), 8.16 (s, 1 H), 7.49-7.40 (m, 2H), 7.34 (d, 2H), 7.13 (dd, 1 H), 7.00-6.91 (m, 3H), 4.10-4.02 (m, 1 H), 3.84 (s, 3H), 3.81 -3.74 (m, 2H), 3.48-3.42 (m, 2H), 3.18-3.06 (m, 4H), 2.77 (d, 3H), 1 .41 (d, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 11.1 min (93.7%), mp: 102℃에서 시작하여 165℃에서 완전히 용융.
실시예 28: 2-(4-(4- 메틸피페라진 -1-일)벤질)-N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )-피리딘-2-일) 프로판아미드
단계 A: 디에틸 2-(4-니트로벤질)-2-메틸말로네이트의 제조. 디에틸 메틸 말로네이트(1.60 ml, 9.25 mmol)를 소듐 에톡사이드 용액의 새로 제조된 용액 [EtOH (20 ml)중 (나트륨 (212 mg, 9.25 mmol)]에 첨가하고 1 시간 동안 교반하였다. 4-니트로벤질 브로마이드(2.00 g, 9.25 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하고 환류하에 6 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 농축하였다. 잔사를 물과 CHCl3사이에 분할하였다. 분리된 유기층을 물, 식염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켜 미정제 생성물을 생성시켰다. 이것은 용출물로서 석유 에테르 중에 5% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 (100-200 메시) 상에 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 오일상 액체로서 850 mg (29.7%)의 디에틸 2-(4-니트로벤질)-2-메틸말로네이트를 얻었다.
단계 B: 디에틸 2-(4-아미노벤질)-2-메틸말로네이트의 제조. 염화 제2주석 2수화물 (4.39 g, 19.4 mmol)을 EtOH (30 ml)중 디에틸 2-(4-니트로벤질)-2-메틸말로네이트 (3.00 g, 9.70 mmol)의 용액에 첨가하고 환류하에 3시간 동안 교반하였다. 물 및 에틸 아세테이트를 첨가하고 용액을 트리에틸 아민으로 염기화하여 pH~9로 조절하였다. 염을 여과하고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 유기층을 여과물로부터 분리하고 물, 식염수로 세척하고, 여과하고 감압하에 농축시켜 갈색 오일로서 2.20 g (81 .4%)의 디에틸 2-(4-아미노벤질)-2-메틸말로네이트를 얻었다.
단계 C: 디에틸 2-(4-(피페라진-1-일)벤질)-2-메틸말로네이트의 제조. 자일렌 (10 ml)중에 디에틸 2-(4-아미노벤질)-2-메틸말로네이트 (2.00 g, 7.17 mmol) 및 비스-(2-클로로에틸)아민. HCl (1.90 g, 10.8 mmol)의 용액을 환류하에 48 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 잔사를 포화 중탄산 나트륨 용액과 에틸 아세테이트 사이에 분할하였다. 포화된 유기층을 물, 식염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 용출물로서 CHCl3 중 5% 메탄올을 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 갈색 오일로서 1.90 g (76.3%)의 디에틸 2-(4-(피페라진-1-일)벤질)-2-메틸말로네이트를 얻었다.
단계 D: 디에틸 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)벤질)-2-메틸말로네이트의 제조. 디에틸 2-(4-(피페라진-1-일)벤질)-2-메틸말로네이트 (500 mg, 1.43 mmol), 포름알데히드(2 ml) 및 포름산(2 ml)의 혼합물을 환류하에 2시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 포화 중탄산 나트륨 용액과 에틸 아세테이트 사이에 분할하였다. 유기층을 분리하고 물, 식염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 농축시켜 갈색 오일로서 400 mg (86.8%)의 디에틸 2-(4-(4-메틸피페라진 -일)벤질)-2-메틸말로네이트를 얻었다.
단계 E: 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)벤질)프로판산의 제조. 농축 HCl (10 ml)중 디에틸 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)벤질)-2-메틸말로네이트 (1.50 g, 4.29 mmol)의 용액을 밀봉 관에서 130-140℃에서 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 톨루엔으로 공-증류시켜 암갈색 고체로서 700 mg (63.6%)의 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)벤질)프로판산을 얻었다.
단계 F: 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)벤질)프로판아미드의 제조. 염화 티오닐 (2 ml) 및 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)벤질)프로판산 (500 mg, 1.91 mmol)의 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 50 ℃ 이하에서 농축하였다. 잔사는 건조 THF (5 ml) 중에서 취하고, -78 ℃로 냉각하고 암모니아 가스로 퍼징하였다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온하고, 고체를 여과하고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과물을 감압하에 농축시켜 갈색을 띤 백색 고체로서 300 mg (60.2%)의 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)벤질)프로판아미드를 얻었다.
실시예 28의 제조. 실시예 28은 밀봉 관에서 120-125℃에서 4 시간 동안 1,4-디옥산 (5 ml)중 상술한 2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)벤질)프로판아미드 (200 mg, 0.77 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (163 mg, 0.68 mmol), Cs2C03　(378 mg, 1.14 mmol), 잔트포스 (29 mg, 26 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (12 mg, 11 μmol)로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 35.3%의 수율로 얻은 다음, 아세톤 (3 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (125 mg, 0.27 mmol)을 용해시키고 2.2 당량의 에테르성 HCl (0.6 ml, 0.6 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 n-펜탄으로 분쇄하고 물 중에 용해하고 50 ℃에서 농축시켜 담황색 고체로서 HCl-염을 58.1%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 1 1.50 (s, br., 1 H), 10.90 (s, br., 1 H), 8.33 (d, 1 H), 8.17 (s, 1 H), 7.46 (t, 1 H), 7.43-7.39 (m, 1 H), 7.17-7.11 (m, 3H), 6.99-6.89 (m, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.74 (d, 2H), 3.48-3.42 (m, 2H), 3.15-2.92 (m, 7H), 2.78 (d, 3H), 1.09 (d, 3H), HPLC (λ = 214 nm, [A]): rt 11 .4 min (98.5%), mp: 160 ℃에서 시작하여 185 ℃에서 완전히 용융.
실시예 29: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-3-(4-(4- 메틸피페라진 -1-일) 페닐 ) 부탄아미드
단계 A: 1-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)에탄온의 제조. 4-플루오로 아세토페논(5.0 g, 3.6 mmol) 및 N-메틸 피페라진 (20 ml, 4 용적%)의 용액을 120 ℃에서 밀봉 관중에 16 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 얼음물로 부었다. 침전된 고체를 여과하고 진공하에 건조시켜 고체로서 7.50 g (94.5%)의 1-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)에탄온을 얻었다.
단계 B: (Z)-에틸 2-시아노-3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부트-2-에노에이트의 제조. 에틸 시아노 아세테이트 (3.12 g, 27.6 mmol), 암모늄 아세테이트 (123 mg, 1.76 mmol), 아세트산 (0.2 ml, 3.5 mmol)을 벤젠 (25 ml)중 1-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)에타논 (5.0 g, 23 mmol)의 교반 용액에 연속적으로 첨가하고 135-140 ℃에서 36 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물속에 붓고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 감압하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 이것은 용출물로서 CHCl3　중 2% 메탄올을 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 황색 액체로서 (Z)-에틸 2-시아노-3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부트-2-에노에이트 2.30 g (32.4%)를 얻었다.
단계 C: 메틸 2-시아노-3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부타논에이트의 제조. (Z)-에틸 2-시아노-3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부트-2-에노에이트(700 mg, 2.30 mmol)를 0℃에서 메탄올(20 ml)중 Mg 금속 (2.10 g, 89.4 mmol)의 교반 혼합물에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다 (반응은 Mg 금속에 의해 활성화되어, 발열성임). 이어서 반응 혼합물을 투명한 용액이 얻어질 때까지 6N HCl (20 ml)로 퀀칭하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (2 x 20 ml)로 세척하고, 포화 중탄산 나트륨으로 염기화하고 DCM (3 x 50 ml)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 물, 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축시켜 무색 액체로서 400 mg (54%)의 메틸 2-시아노-3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부타노에이트를 얻었다.
단계 D: 3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부탄니트릴의 제조. 메틸 2-시아노-3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부타노에이트 (700 mg, 2.32 mmol), 염화 나트륨 (405 mg, 6.90 mmol), DMSO (5 ml) 및 물 (2 ml, 3 용적%)의 혼합물을 첨가하고 160-165 ℃에서 12 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 물속에 붓고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물, 염수로 세척하고 무수 황산 나트름으로 건조하고 여과하고 진공하에 농축시켜 무색 액체로서 450 mg (79.6%)의 3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부탄니트릴을 얻었다.
단계 E: 3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부탄아미드의 제조. 3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부탄니트릴 (450 mg, 1 .85 mmol) 및 폴리인산 (4.5 g)의 현탁액을 90 ℃에서 3 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 냉수로 희석하고 포화 중탄산 나트륨 용액으로 염기화 하였다. 수성 층을 DCM으로 추출하고, 물 및 식염수로 세척하였다. 유기층을 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 진공하에 농축시켜 담황색 고체로서 360 mg (74%)의 3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부탄아미드를 얻었다.
실시예 29의 제조. 실시예 29는 밀봉 관에서 125℃에서 4 시간 동안 1,4-디옥산 (8 ml)중 상술한 3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부탄아미드 (120 mg, 0.46 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (130 mg, 0.55 mmol), Cs2C03　(223 mg, 0.68 mmol), 잔트포스 (24 mg, 40 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (21 mg, 18 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 분취용 TLC에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 28.2%의 수율로 얻은 다음, 아세톤 (2 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (60.0 mg, 129 μmmol)을 용해시키고 0℃에서 1 시간 동안 2.2 당량의 에테르성 HCl (0.28 ml, 0.28 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 에테르로 분쇄하고 진공하에 건조시켜 담황색 고체로서 HCl-염을 77.1%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.60 (s, 1 H), 10.07 (s, br., 1 H), 8.29 (d, 1 H), 8.13 (s, 1 H), 7.37 (dd, 1 H), 7.22 (dd, 1 H), 7.19-7.14 (m, 2H), 7.08 (dd, 1 H), 6.95-6.89 (m, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.80-3.71 (m, 2H), 3.50-3.43 (m, 2H), 3.26-3.16 (m, 1 H), 3.16-3.05 (m, 2H), 3.03-2.90 (m, 2H), 2.80 (d, 3H), 2.70-2.61 (m, 2H), 1.20 (d, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 11 .3 min (97.0%), mp: 70 ℃에서 시작하여 160℃에서 완전히 용융.
실시예 30: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-4-(피리딘-2- 일아미노 )- cis - 사이클로헥산카르복사미드
단계 A: 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온의 제조. cis-4-아미노사이클로헥실 카르복실산 (1 .60 g, 11.2 mmol)을 290℃로 15 시간 동안 가열하였다. 반응 완료 후에, 반응 혼합물을 DCM 중에 현탁하고 여과하였다. 유기층을 증발 건조시켜 황백색 고체로서 1.20 g (86.3%)의 2-아자사이클로[2.2.2]옥탄-3-온을 얻었다.
단계 B: 2-(피리딘-2-일)-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온의 제조. 1,4-디옥산(30 ml)중 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온 (0.6 g, 4.8 mmol), 2-클로로피리딘 (0.65 g, 5.76 mmol), Cs2C03　(2.36 g, 7.20 mmol) 및 잔트포스 (0.22 g, 0.38 mmol)의 혼합물을 첨가하고 아르곤 가스로 15 분 동안 퍼징하였다. 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (0.22 g, 0.19 mmol)을 첨가하고 10 분안 더 계속 퍼징하였다. 반응 혼합물을 125℃에서 3 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 여과하였다. 여과물을 농축하고 감압하에 건조시켜 미정제 화합물을 얻었다. 용출물로서 석유 에테르 중에 15% 에틸 아세테이트를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 담황색 고체로서 600 mg (61.9%)의 2-(피리딘-2-일)-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온을 얻었다.
단계 C: cis-4-(피리딘-2-일아미노)사이클로헥산카르복실산의 제조. 2N HCl (15 ml)중 2-(피리딘-2-일)-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온(0.60 g, 2.97 mmol)을 환류하에 17 시간 동안 가열하였다. 용매를 감압하에 제거하고 물을 첨가하였다. 반응 혼합물을 포화 중탄산 나트륨 용액을 사용하여 알칼리성으로 만들고 DCM으로 추출하였다. 결합된 유기층을 물, 식염수로 건조하고 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 농축시켜 황백색 고체로서 500 mg의 cis-4-(피리딘-2-일아미노)사이클로헥산카르복실산(76.5%)을 얻었다.
단계 D: cis-4-(피리딘-2-일아미노)사이클로헥산카르복사미드의 제조. cis-4-(피리딘-2-일아미노)사이클로헥산 카르복실산 (0.22 g, 1 .00 mmol)을 실온에서 염화 티오닐 (2 ml)중에 용해하고 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 미정제 산 염화물을 생성시키고, 액체 암모니아/THF (1 :1 , 15 ml)에 첨가하고 실온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고 여과하였다. 여과물을 감압하에 농축하여 황백색 고체로서 100 mg의 cis-4-(피리딘-2-일아미노)사이클로헥산 카르복사미드를 얻었다.
실시예 30의 제조. 실시예 30은 밀봉 관에서 120-125℃에서 3 시간 동안 건조 1,4-디옥산 (5 ml)중 상술한 cis-4-(피리딘-2-일아미노)사이클로헥산 카르복사미드(100 mg, 0.45 mmol), Cs2C03　(225 mg, 0.68 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (130 mg, 0.54 mmol), 잔트포스 (21 mg, 36 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (21 mg, 18 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하였다. 화합물은 분취용 TLC에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 29.4%의 수율로 생성시킨 다음, 아세톤 (4 ml) 중에 상기 얻어진 화합물 (60.0 mg, 0.14 mmol)을 용해시키고 0℃에서 30 분 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.17 ml, 0.17 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 n-펜탄으로 분쇄하고, 건조하고 밀리포어 수(Millipore water)중에 용해하고 50℃에서 감압하에 증발시켜 황백색 고체로서 50 mg(76.5%)의 HCl-염을 얻었다.　　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 13.84 (s, br., 1 H), 1 1.54 (s, br., 1 H), 8.89 (s, 1 H), 8.35 (d, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 7.95-7.84 (m, 2H), 7.52-7.41 (m, 2 H), 7.22 (d, 1 H), 7.14 (dd, 1 H), 7.01 -6.93 (m, 1 H), 6.84 (d, 1 H), 4.08-3.98 (m, 1 H), 3.86 (s, 3H), 2.81 -2.71 (m, 1 H), 2.02-1.90 (m, 2H), 1.86-1.71 (m, 6H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 10.2 min (99.6%).
실시예 31: N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-2-(2-(4- 메틸피페라진 -1-일)피리딘-4-일) 아세트아미드
단계 A: 2-tert-부틸-1,3-디사이클로헥실이소우레아의 제조. 디사이클로헥실 카르보디이미드 (2.00 g, 9.70 mmol), tert-부탄올 (1.00 ml, 10.6 mmol) 및 촉매량의 염화 구리 (9.0 mg, 90 μmol)의 현탁액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 CHCl3　(5 ml)로 세척하고 용매를 진공하에 증발시켜 담녹색 농후 액체로서 2.5 g (74%)의 화합물 2-tert-부틸-1,3-디사이클로헥실이소우레아를 얻었다.
단계 B: 디에틸 2-(2-클로로피리딘-4-일)말로네이트의 제조. 2-클로로-4-피콜린을 0℃에서 탄산 디에틸(10 ml) 중 수소화 칼륨(1.80 g, 15.8 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 유지시키고 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 염화 암모늄 (15 ml)으로 퀀칭하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켜 미정제 생성물을 생성시켰다. 용출물로서 석유 에테르 중에 8% 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔(60-120 메시)상에 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 액체로서 750 mg (36%)의 디에틸 2-(2-클로로피리딘-4-일)말로네이트를 얻었다.
단계 C: 2-(2-클로로피리딘-4-일)아세트산의 제조. 농축 HCl (15 ml)중 디에틸 2-(2-클로로피리딘-4-일)말로네이트(1.30 g, 4.79 mmol)의 용액을 18 시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 농축하고 톨루엔(2 x 20 ml)으로 공-증류하여 미정제 생성물을 생성시켰다. 디에틸 에테르로 분쇄하여 정제하여 백색 고체로서 500 mg (57%)의 2-(2-클로로피리딘-4-일)아세트산을 생성시켰다.
단계 D: tert-부틸 2-(2-클로로피리딘-4-일)아세테이트의 제조. 화합물 2-tert-부틸-1,3-디사이클로헥실이소우레아 (650 mg, 2.30 mmol)를 실온에서 DCM (5 ml)중 2-(2-클로로피리딘-4-일)아세트산 (200 mg, 1.16 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 24 시간 동안 교반하고, 여과하고, DCM (5 ml) 및 포화 중탄산 나트륨 용액(10 ml)으로 세척하였다. 용매를 진공하에 증발시켜 무색 액체로서 200 mg (77%)의 tert-부틸 2-(2-클로로피리딘-4-일)아세테이트를 얻었다.
단계 E: 1-(4-메틸피페라진-1-일)-2-(2-(4-메틸피레라진-1-일)피리딘-4-일)에타논의 제조. tert-부틸 2-(2-클로로피리딘-4-일)아세테이트(600 mg, 2.64 mmol) 및 N-메틸 피페라진 (2 ml)의 용액을 밀봉 관중에 140℃에서 24 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 물을 첨가하고 DCM으로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 진공하에 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 용출물로서 CHCl3　중 5% MeOH를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 액체로서 600 mg (71 %)의 1-(4-메틸피페라진-1-일)-2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)에타논을 얻었다.
단계 F: 2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)아세트산의 제조.
농축 HCl (10 ml)중 1-(4-메틸피페라진-1-일)-2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)에타논(800 mg, 2.52 mmol)의 용액을 12 시간 동안 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 농축시켰다. 잔사를 톨루엔으로 2회 공-증류하여 미정제 450 mg의 2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)아세트산을 생성시켰다. 미정제물을 다음 단계를 위해 그 자체로 취하였다.
단계 G: 메틸 2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)아세테이트의 제조. 염화 티오닐(0.9 ml)을 0℃에서 MeOH (15 ml)중 2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)아세트산(900 mg, 3.82 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 85℃에서 4 시간 동안 가열하고 농축시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트와 포화 중탄산 나트륨 용액 사이에 분할하였다. 유기층을 분리하고 수성층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 진공하에 농축시켜 무색 액체로서 750 mg (78%)의 메틸 2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리미딘-4-일)아세테이트를 얻었다.
단계 H: 2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)아세트아미드의 제조. 메탄올성 암모니아(10 ml)중 메틸 2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)아세테이트(750 mg, 2.81 mmol)를 90℃에서 72 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 농축하고 진공하에 건조시켜 미정제 생성물을 생성시켰다. 디에틸 에테르로 분쇄하고 정제시켜 담갈색 고체로서 370 mg (31 %)의 2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)아세트아미드를 얻었다.
실시예 31의 제조. 실시예 31은 밀봉 관에서 120-125℃에서 4 시간 동안 1,4-디옥산 (10 ml)중 상술한 2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)아세트아미드(150.0 mg, 0.650 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (182.0 mg, 0.754 mmol), Cs2C03　(313 mg, 0.96 mmol), 잔트포스 (34 mg, 50 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (29 mg, 25 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 분취용 TLC에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 19.6%의 수율로 생성시킨 다음, 아세톤 (2 ml) 중에 상기 얻어진 화합물을 용해시키고 0℃에서 1시간 동안 1.1 당량의 에테르성 HCl (0.10 ml, 0.10 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르로 분쇄하고, 진공하에 건조시켜 담황색 고체로서 35 mg(81%)의 HCl-염을 얻었다.　　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 1 1 .35-1 1.28 (m, 1 H), 8.96 (s, 1 H), 8.65 (s, 1 H), 8.09 (d, 1 H), 7.98 (dd, 1 H), 7.37-7.27 (m, 1 H), 7.12 (dd, 1 H), 7.02- 6.91 (m, 2H), 4.52-4.40 (m, 2H), 3.97-3.92 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.59-3.49 (m, 4H), 3.23-3.11 (m, 2H), 2.81 -2.77 (m, 3H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 9.1 min (100%).
실시예 32: cis -N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-4-(피리딘-4-일아미노)- 사이클로헥산카르복사미드
단계 A: 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온의 제조. 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온을 상술한 바와 같이 제조하였다.
단계 B: 2-(피리딘-4-일)-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온의 제조. 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온 (0.6 g, 4.8 mmol), 4-브로모피리딘 하이드로클로라이드 (1.17 g, 5.76 mmol), Cs2C03　(2.36 g, 7.20 mmol) 및 잔트포스 (0.22 g, 0.38 mmol)의 혼합물을 아르곤 가스로 10 분 동안 퍼징하였다. 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (0.22 g, 0.19 mmol)을 첨가하고 10 분 동안 더 탈기하였다. 반응 혼합물을 125℃에서 3 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 여과하였다. 여과물을 농축하고 감압하에 건조시켜 미정제 화합물을 생성시켰다. 용출물로서 CHCl3　중 0.5% MeOH를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 담황색 고체로서 600 mg (61.9%)의 2-(피리딘-4-일)-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온을 제조하였다.
단계 C: cis-4-(피리딘-4-일아미노)사이클로헥산디카르복실산의 제조. 2N HCl (15 ml)중 2-(피리딘-4-일)-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온 (0.60 g, 2.97 mmol)의 용액을 환류하에 17 시간 동안 가열하였다. 용매를 제거하고 감압하에 건조시켜 황백색 고체로서 600 mg의 cis-4-(피리딘-4-일아미노)사이클로헥산카르복실산 (76.5%)을 얻고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 D: cis-4-(피리딘-4-일아미노)사이클로헥산카르복사미드의 제조. cis-4-(피리딘-4-일아미노)사이클로헥산카르복실산 (600 mg, 2.74 mmol)을 실온에서 염화 티오닐(2 ml)중에 용해하고 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 미정제 산 염화물을 생성시키고, 액체 암모니아/THF (1 :1, 15 ml)에 첨가하고 실온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고 여과시켰다. 여과물을 감압하에 농축하여 백색 고체로서 400 mg (68%)의 cis-4-(피리딘-4-일아미노)사이클로헥산카르복사미드를 얻었다.
실시예 32의 제조. 실시예 32는 밀봉 관에서 120-125℃에서 4 시간 동안 1,4-디옥산 (5 ml)중 상술한 cis-4-(피리딘-4-일아미노)사이클로헥산카르복사미드(100 mg, 0.45 mmol), Cs2C03　(225 mg, 0.68 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (130 mg, 0.54 mmol), 잔트포스 (21 mg, 36 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (21 mg, 18 mmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, CHCl3중 0-1 % MeOH를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워트업 후에 정제시켜 생성물을 26.0%의 수율로 생성시킨 다음, 아세톤 (4 ml) 중에 상기 얻어진 화합물(60.0 mg, 0.14 mmol)을 용해시키고 2.0 당량의 에테르성 HCl (0.28 ml, 0.28 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 n-펜탄으로 분쇄하고, 물 중에 용해하고 50℃에서 감압하에 증발시켜 담황색 고체로서 HCl-염을 76.5%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 13.35-13.18 (m, 1 H), 8.56-8.48 (m, 1 H), 8.31 (d, 1 H), 8.23-8.18 (m, 2H), 8.08-8.04 (m, 1 H), 7.42-7.36 (m, 1 H), 7.26-7.21 (m, 1 H), 7.12-7.07 (m, 1 H), 7.03-6.99 (m, 1 H), 6.95-6.88 (m, 1 H), 3.82 (s, 3H), 2.72-2.65 (m, 1 H), 1.94-1.66 (m, 9H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 10.4 min (98.3%), mp: 260℃.
실시예 33: cis -3- 아세트아미도 -N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)사이클로- 헥산카르복사미드
단계 A: cis-메틸 3-아미노사이클로헥산카르복실레이트의 제조. 염화 티오닐(0.6 ml)을 0℃에서 MeOH (20 ml)중 cis-3-아미노-사이클로헥산카르복실산 (미국 AMRI로부터 입수, cat-no.: A00342, 0.50 g, 2.80 mmol)의 용액에 첨가하고 환류하에 12 시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공하에 증발시키고 수득된 잔사를 포화 중탄산 나트륨 용액과 에틸 아세테이트 사이에 분할하였다. 분리된 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 진공하에 농축시켜 무색 액체로서 400 mg (90.9%)의 cis-메틸 3-아미노사이클로헥산 카르복실레이트를 얻었다.
단계 B: cis-메틸 3-아세트아미도사이클로헥산 카르복실레이트의 제조. 아세트산 무수물 (1.20 ml, 12.7 mmol)을 아르곤의 대기하에 피리딘 (10 ml)중 cis-메틸 3-아미노사이클로헥산 카르복실레이트(0.40 g, 2.54 mmol)의 교반 용액에 첨가하고 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 과량의 피리딘을 진공하에 제거하고 잔사를 DCM과 포화 중탄산 나트륨 용액 사이에 분할하였다. 분리된 유기층을 물, 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 진공하에 농축시켜 무색 액체로서 cis-메틸 3-아세트아미도사이클로헥산 카르복실레이트(350 mg, 69.0%)를 얻었다.
단계 C: cis-3-아세트아미도사이클로헥산카르복사미드의 제조. cis-메틸 3-아세트아미도사이클로헥산 카르복실레이트 (350 mg, 1.75 mmol) 및 메탄올성 암모니아 (20 ml)의 혼합물을 스틸 봄브 중에 90℃에서 72 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 감압하에 농축시켜 미정제 생성물을 제공하고 n-파라핀으로 세척하여 백색 고체로서 200 mg (57.1 %)의 cis-3-아세트아미도사이클로헥산 카르복사미드를 얻었다.
실시예 33의 제조. 실시예 33은 밀봉 관에서 125℃에서 4 시간 동안 1,4-디옥산 (10 ml)중 상술한 cis-3-아세트아미도사이클로헥산 카르복사미드 (250 mg, 1.35 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (386 mg, 1.63 mmol), Cs2C03　(660 mg, 2.02 mmol), 잔트포스 (71.0 mg, 121 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (62 mg, 54 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고 분취용 TLC에 의한 통상의 워크업 후에 정제시켜 생성물을 31.8%의 수율로 생성시킨 다음, 아세톤 (5 ml) 중에 상기 얻어진 화합물(100 mg, 0.26 mmol)을 용해시키고 0℃에서 30분 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.31 ml, 0.31 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하였다. 반응 혼합물을 디에틸에테르로 분쇄하고, 건조시켜 HCl-염을 64.2%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 8.31 (d, 1 H), 8.06 (s, 1 H), 7.80 (d, 1 H), 7.45-7.40 (m, 1 H), 7.34-7.30 (m, 1 H), 7.10 (dd, 1 H), 6.95-6.89 (m, 1 H), 3.82 (s, 3H), 3.62-3.53 (m, 1 H), 2.66-2.54 (m, 1 H), 1.94-1.88 (m, 1 H), 1.82-1.72 (m, 5H), 1.34-1.22 (m, 4H), 1.13-1.03 (m, 1 H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 11.4 min (100%), mp: 198 ℃.
실시예 34: (1R,3S)-3- 아세트아미도 -N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)사이클로- 펜탄카르복사미드
단계 A: (1R,3S)-메틸 3-아미노사이클로펜탄카르복실레이트의 제조. 염화 티오닐 (1.30 ml, 18.2 mmol)을 MeOH (20 ml)중 (1R,3S)-3-아미노 사이클로 펜틸 카르복실산 (2.00 g, 12.1 mmol)의 교반 용액에 첨가하고 3 시간 동안 환류하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하고 톨루엔으로 공-증류하여 황백색 고체로서 1.9 g (87%)의 (1R,3S)-메틸 3-아미노사이클로페탄카르복실레이트를 얻었다.
단계 B: (1R,3S)-메틸 3-아세트아미도사이클로펜탄 카르복실레이트의 제조.아세트산 무수물(0.07 ml, 7.00 mmol)을 피리딘 (5 ml)중 (1R,3S)-메틸 3-아미노사이클로펜탄카르복실레이트(200 mg, 1.39 mmol)의 교반 용액에 첨가하고 주위 온도에서 15 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하고 물 및 CHCl3를 첨가하였다. 유기층을 분리하고 포화 중탄산 나트륨 용액, 식염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축시켜 갈색 오일로서 180 mg (69%)의 (1R,3S)-메틸 3-아세트아미도사이클로펜탄카르복실레이트를 얻었다.
단계 C: (1R,3S)-3-아세트아미도사이클로펜탄카르복사미드의 제조. 암모니아 가스는 압력 봄브 중에 -78℃에서 MeOH (5 ml)중 (1R,3S)-메틸 3-아세트아미도사이클로펜탄카르복실레이트 (180 mg, 0.96 mmol)의 용액에 통과시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온시키고 100℃에서 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 갈색 오일로서 150 mg의 (1R,3S)-3-아세트아미도사이클로펜탄카르복사미드를 얻었다.
실시예 34의 제조. 실시예 34는 밀봉 관에서 120-125℃에서 15 시간 동안 1,4-디옥산 (10 ml)중 상술한 (1R,3S)-3-아세트아미도사이클로펜탄카르복사미드 (300 mg, 1.76 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (501 mg, 211 mmol), Cs2C03　(870 mg, 2.64 mmol), 잔트포스 (82 mg, 0.141 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (82 mg, 70 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, CHCl3중 0-2% MeOH 를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제시키고 에테르로 분쇄하여 생성물을 9.8%의 수율로 생성시킨 다음, 아세톤 (3 ml) 중에 상기 얻어진 화합물을 용해시키고 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.20 ml, 0.19 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하여 황백색 고체로서 통상의 워크업 후 HCl-염을 83.9%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 8.34 (d, 1 H), 8.12 (s, 1 H), 7.96 (d, 1 H), 7.50-7.45 (m, 1 H), 7.41 (d, 1 H), 7.14 (dd, 1 H), 6.99-6.93 (m, 1 H), 4.08-4.00 (m, 1 H), 3.85 (s, 3H), 3.07-2.98 (m, 1 H), 2.23-2.15 (m, 1 H), 1.92-1.83 (m, 3H), 1.78 (s, 3H), 1.67-1 .56 (m, 1 H), 1.54-1.44 (m, 1 H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 10.8 min (100%), mp: 95℃.
실시예 35: cis -N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-4-(티아졸-2-일아미노)- 사이클로헥산카르복사미드
단계 A: 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온의 제조. 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온을 상술한 바와 같이 제조하였다.
단계 B: 2-(티아졸-2-일)-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온의 제조. 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온 (0.5 g, 4.0 mmol), 2-브로모티아졸 (0.79 g, 4.81 mmol), Cs2C03　(2.0 g, 6.0 mmol), 잔트포스 (0.19 g, 0.32 mmol) 및 1,4-디옥산(25 ml)의 혼합물을 아르곤 가스로 15 분 동안 탈기하였다. 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (0.18 g, 0.16 mmol)을 첨가하고, 추가로 15 분 동안 탈기하고 밀봉관 중에 125℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각한 후에, 반응 혼합물을 여과하고 여과물을 감압하에 증발시켜 미정제 화합물을 제공하였다. 용출물로서 석유 에테르 중에 10% 에틸 아세테이트를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 담황색 고체로서 500 mg (60%)의 2-(티아졸-2-일)-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온을 얻었다.
단계 C: cis-4-(티아졸-2-일아미노)사이클로헥산카르복실산의 제조. 2N HCl (15 ml)중 2-(티아졸-2-일)-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온 (0.50 g, 2.43 mmol)의 용액을 환류하에 17 시간 동안 가열하였다. 용매를 감압하에 제거하고 잔사를 포화 중탄산 나트륨 용액과 CHCl3사이에 분할하였다. 분리된 유기층을 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 증발 건조시켜 황백색 고체로서 0.2 g의 cis-4-(티아졸-2-일아미노)사이클로헥산카르복실산 (36.8%)을 얻었다.
단계 D: cis-4-(티아졸-2-일아미노)사이클로헥산카르복사미드의 제조. 염화 티오닐 (1 ml) 중 cis-4-(티아졸-2-일아미노)사이클로헥산카르복실산 (200 mg, 0.88 mmol)의 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 과량의 염화 티오닐을 진공하에 제거하여 미정제 산 염화물을 얻었다. 액체 암모니아/THF (1 :1, 15 ml)를 -60℃에서 상기 제조된 산 염화물 용액에 첨가하고 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 DCM중 10% MeOH로 희석하고 여과하였다. 여과물을 감압하에 농축하여 백색 고체로서 140 mg (70%)의 cis-4-(티아졸-2-일아미노)사이클로헥산카르복사미드를 얻었다.
실시예 35의 제조. 실시예 35는 밀봉 관중에 125℃에서 3 시간 동안 1,4-디옥산 (4 ml)중 상술한 cis-4-(티아졸-2-일아미노)사이클로헥산카르복사미드 (140 mg, 0.62 mmol), Cs2C03　(310 mg, 0.93 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (170 mg, 0.74 mmol), 잔트포스 (28 mg, 49 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (28 mg, 25 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, CHCl3중 0-2% MeOH를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제하여 생성물을 30.1%의 수율로 생성시킨 다음, 아세톤 (4 ml) 중에 상기 얻어진 화합물(80.0 mg, 0.19 mmol)을 용해시키고 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.23 ml, 0.23 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환하여 상기 화합물을 n-펜탄으로 분쇄하고 동결건조한 후 HCl-염을 담황색 고체로서 72.5%의 수율로 얻었다. 1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 8.34-8.31 (m, 1 H), 8.17 (s, br., 1 H), 7.45-7.38 (m, 1 H), 7.36-7.33 (m, 1 H), 7.31 -7.22 (m, 1 H), 7.14-7.08 (m, 1 H), 6.98-6.90 (m, 2H), 3.82 (s, 3H), 2.71 -2.63 (m, 1 H), 2.54-2.50 (m, 1 H), 1.90-1 .78 (m, 4H), 1.77-1 .65 (m, 4H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 10.4 min (95.4%), mp: 85℃.
실시예 36: cis -N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-4-( 페닐아미노 )- 사이클로헥산카르복사미드
단계 A: 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온의 제조. 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온은 상기 기술된 바와 같이 제조하였다.
단계 B: 2-페닐-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온의 제조. 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온 (0.6 g, 4.8 mmol), 요오도 벤젠 (1.16 g, 5.76 mmol), Cs2C03　(2.36 g, 7.20 mmol), 잔트포스 (0.22 g, 0.38 mmol) 및 1,4-디옥산(30 ml)의 혼합물을 밀봉 관에 충전하고 아르곤 가스로 15 분 동안 탈기하였다. 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (0.22 g, 0.19 mmol)을 첨가하고, 추가로 15 분 동안 탈기하고 125℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 감압하에 농축시켜 미정제 화합물을 제공하였다. 용출물로서 CHCl3 중에 0.5% MeOH를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 트로마토그래피로 정제하여 담황색 고체로서 600 mg (62%)의 2-페닐-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온을 얻었다.
단계 C: cis-4-(페닐아미노)사이클로헥산카르복실산 하이드로클로라이드의 제조. 2-페닐-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온 (0.60 g, 2.97 mmol) 및 2N HCl (15 ml)의 용액을 환류하에 17 시간 동안 가열하였다. 반응의 완료 후에, 용매를 감압하에 제거하고 건조시켜 황백색 고체로서 600 mg의 cis-4-(페닐아미노)사이클로헥산카르복실산 하이드로클로라이드 (76.5%)를 얻고 다음 단계에서 사용하였다.
단계 D: cis-메틸 4-(페닐아미노)사이클로카르복실레이트의 제조. 염화 티오닐 (0.65 g, 5.47 mmol)을 실온에서 MeOH (10 ml)중 cis-4-(페닐아미노)사이클로헥산카르복실산 하이드로클로라이드(600 mg, 2.74 mmol)의 교반 용액에 첨가하고 환류하에 5시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하였다. 미정제 생성물을 포화 중탄산 나트륨 용액으로 염기화하고 DCM (2 x 25 ml)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 미정제 화합물을 생성시키고, 석유 에테르 중에 10% 에틸 아세테이트 중에 용출시켜 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일상 액체로서 500 mg의 cis-메틸 4-(페닐아미노)사이클로헥산카르복실레이트(78%)를 얻었다.
단계 E: cis-4-(페닐아미노)사이클로헥산카르복사미드의 제조. cis-메틸 4-(페닐아미노)사이클로헥산카르복실레이트 (0.50 g, 2.14 mmol)를 압력 봄브 중에 메탄올성 암모니아(15 ml)중에 용해하고 100℃에서 3일 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 감압하에 농축시켜 미정제 화합물을 생성시키고, n-펜탄으로 세척하고 진공하에 건조시켜 백색 고체로서 300 mg (63%)의 cis-4-(페닐아미노)사이클로헥산카르복사미드를 얻었다.
실시예 36의 제조. 실시예 36은 밀봉 관중에 120-125℃에서 3 시간 동안 건조 1,4-디옥산 (10 ml)중 상술한 cis-4-(페닐아미노)사이클로헥산카르복사미드 (150 mg, 0.91 mmol), Cs2C03　(0.34 mg, 1.36 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (0.20 g, 1.09 mmol), 잔트포스 (32 mg, 50 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (32 mg, 25 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 석유 에테르 중 에틸 아세테이트(40-50%)를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제하여 생성물을 34.6%의 수율로 생성시킨 다음, DCM 중에 상기 얻어진 화합물(100 mg, 0.24 mmol)을 용해시키고 0℃에서 30 분 동안 2.2 당량의 에테르성 HCl (0.52 ml, 0.52 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환시켜 HCl-염을 68.1%의 수율로 얻었다. 　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 8.36 (d, 1 H), 8.20 (s, 1 H), 7.53-7.37 (m, 7H), 7.17-7.12 (m, 1 H), 7.00-6.94 (m, 1 H), 3.86 (s, 3H), 3.57-3.50 (m, 1 H), 2.83-2.77 (m, 1 H), 2.18-2.08 (m, 2H), 1.95-1 .85 (m, 2H), 1.83-1.75 (m, 2H), 1.73-1.64 (m, 2H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 11.8 min (100%), mp: 170 ℃.
실시예 37: (1R,3S)-3-( 벤질아미노 )-N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일) 사이클로펜탄카르복사미드
단계 A: (1R,3S)-메틸 3-아미노사이클로펜탄카르복실레이트의 제조. (1R,3S)-메틸 3-아미노사이클로펜탄카르복실레이트는 상술한 바와 같이 제조하였다.
단계 B: (1R,3S)-메틸 3-(벤질아미노)사이클로펜탄카르복실레이트의 제조. 탄산 칼륨 (462 mg, 3.30 mmol)을 MeOH (10 ml)중 (1R,3S)-메틸 3-아미노사이클로펜탄카르복실레이트 (400 mg, 2.22 mmol)의 용액에 첨가하고 1 시간 동안 교반하였다. 브롬화 벤질(0.2 ml, 1.8 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고 60-65℃에서 15 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 수득된 잔사를 물과 CHCl3사이에서 분할하였다. 유기층을 분리하고 물로 세척하고, 물, 식염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 용출물로서 CHCl3 중 2% MeOH를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 순도 75%를 갖는 180 mg의 (1R,3S)-메틸 3-(벤질아미노)사이클로펜탄카르복실레이트를 얻고 다음 단계를 위해 진행하였다.
단계 C: (1R,3S)-3-(벤질아미노)사이클로펜탄카르복사미드의 제조. 암모니아 가스를 스틸 봄브 중에 -78℃에서 MeOH (5 ml)중 (1R,3S)-메틸 3-(벤질아미노)사이클로펜탄카르복실레이트 (250 mg, 1.14 mmol)의 용액에 통과시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온시키고, 100℃로 더 가열하고 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 진공하에 건조시켜 갈색 액체로서 순도 50%를 갖는 250 mg의 (1R,3S)-3-(벤질아미노)사이클로펜탄카르복사이드를 얻고 다음 단계를 위해 미정제 화합물로서 진행하였다.
실시예 37의 제조. 실시예 37은 밀봉 관중에 120-125℃에서 3 시간 동안 1,4-디옥산 (5 ml)중 상술한 (1R,3S)-3-(벤질아미노)사이클로펜탄카르복사이드 (250 mg, 1.15 mmol, 50% 순도), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (163 mg, 0.69 mmol), Cs2C03　(560 mg, 1.72 mmol), 잔트포스 (53 mg, 91 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (53 mg, 45 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, CHCl3　중 MeOH (2%)를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼 크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제하고, CHCl3　중 MeOH (5%)를 사용하여 분취용 TLC로 추가로 정제여 생성물을 59.0%의 수율로 얻고, 아세톤(3 ml)중에 상기 얻어진 화합물(75.0 mg, 0.17 mmol)을 용해시키고 0℃에서 30 분 동안 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.21 ml, 0.21 mmol)을 첨가하여 HCl-염으로 전환시키고, 실온에서 아세톤을 증발시키고, 물을 첨가하고 동결건조시켜 정제하여 생성물을 황백색 고체로서 79.8%의 수율로 얻었다. 　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.78-10.74 (m, 1 H), 9.22-9.10 (m, 1 H), 8.34-8.31 (m, 1 H), 8.19 (d, 1 H), 7.58-7.53 (m, 2H), 7.48-7.43 (m, 3H), 7.42-7.36 (m, 1 H), 7.26-7.23 (m, 1 H), 7.10 (dt, 1 H), 6.95-6.89 (m, 1 H), 4.19-4.14 (m, 1 H), 3.82 (s, 3H), 3.66-3.52 (m, 1 H), 3.28-3.20 (m, 1 H), 3.12-3.02 (m, 1 H), 2.38-2.22 (m, 1 H), 2.20-2.10 (m, 1 H), 2.08-1.90 (m, 2H), 1.90-1.70 (m, 1 H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 11 .4 min (100%).
실시예 38: cis -4-( 벤질아미노 )-N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)사이클로- 헥산카르복사미드
단계 A: 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온의 제조. 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온은 상술한 바와 같이 제조하였다.
단계 B: 2-벤질-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온의 제조. THF (10 ml)중 화합물 2-아자비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온 (1.1 g, 8.8 mmol)은 0℃에서 THF (10 ml)중 수소화 나트륨 (0.42 g, 10.6 mmol, 60%)의 교반 현탁액에 첨가하고 15분 동안 교반하였다. 브롬화 벤질 (1 .05 ml, 8.80 mmol)을 0℃에서 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 염화 나트륨으로 퀀칭하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 결합된 유기층을 물, 염수로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 감압하에 농축시켜 미정제 화합물을 얻었다. 미정제 화합물을 n-펜탄으로 분쇄하여 고체로서 900 mg (47.6%)의 2-벤질-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온을 얻었다.
단계 C: cis-4-(벤질아미노)사이클로헥산 카르복실산의 제조. 2N HCl (15 ml)중 2-벤질-2-아자-비사이클로[2.2.2]옥탄-3-온 (0.9 g, 4.2 mmol)의 용액을 환류하에 18 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 수성층을 에틸 아세테이트로 세척하였다. 수성층을 감압하에 농축하여 고체로서 550 mg의 cis-4-(벤질아미노)사이클로헥산카르복실산 (56.7%)을 얻었다.
단계 D: cis-메틸 4-(벤질아미노)사이클로헥산카르복실레이트의 제조. 염화 티오닐을 0℃에서 MeOH (7 ml)중 화합물 cis-4-(벤질아미노)사이클로헥산카르복실산 (0.5 g, 2.1 mmol)의 용액에 첨가하고 반응 혼합물을 환류하에 18 시간 동안 가열하였다. 이어서 휘발성 물질을 진공하에 제거하고 반응 혼합물을 포화 중탄산 나트륨을 사용하여 염기화 하였다. 수성층을 에틸 아세테이트, 물 및 식염수로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 감압하에 농축시켜 갈색 고체로서 350 mg의 cis-메틸 4-(벤질아미노)사이클로헥산카르복실레이트 (66%)를 얻었다.
단계 E: tert-부틸-cis-4-(메톡시카르보닐)사이클로헥실벤질카르바메이트의 제조. Boc-무수물 (0.2 ml, 0.9 mmol)을 0℃에서 DCM (5 ml) 및 트리에틸아민 (0.16 ml, 1.21 mmol) 중 cis-메틸 4-(벤질아미노)사이클로헥산카르복실레이트(0.2 g, 0.8 mmol)의 교반 용액에 첨가하고 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고 물, 식염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 감압하에 농축시켜 갈색 액체로서 250 mg의 tert-부틸-cis-4-(메톡시카르보닐)사이클로헥실벤질카르바메이트 (89.3%)를 얻었다.
단계 F: tert-부틸 벤질-cis-4-카르바모일사이클로헥실카르바메이트의 제조. tert-부틸-cis-4-(메톡시카르보닐)사이클로헥식벤질카르바메이트(0.25 g, 0.72 mmol)를 압력 봄브 중에 메탄올성 암모니아(15 ml)로 용해하고 100℃에서 3일 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 감압하에 농축시켜 미정제 화합물로서 200 mg의 tert-부틸 벤질-cis-4-카르바모일사이클로헥실카르바메이트를 생성시켰다. 미정제 화합물 (LC-MS는 30% 아미드를 나타냄)은 다음 단계를 위해 곧바로 취하였다.
단계 G: 실시예 38 tert-부틸 cis-4-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로헥실벤질카르바메이트의 Boc-보호된 전구물질은 밀봉 관중에 125℃에서 4 시간 동안 1,4-디옥산 (3 ml)중 상술한 tert-부틸 벤질-cis-4-카르바모일사이클로헥실카르바메이트 (200 mg, 0.18 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (38.0 mg, 0.16 mmol), Cs2C03　(88.0 mg, 0.27 mmol), 잔트포스 (6.0 mg, 10 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (4 mg, 3 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, 분취용 HPLC (Gemini C-18 (50 x 30 mm, 10 μ, 이동상: MeOH/물/ HCOOH:70/30/0.01, 유속: 40 ml min-1 )에 의한 통상의 워크업 후에 정제하고, 고무상 고체로서 tert-부틸 cis-4-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로헥실벤질카르바메이트를 4.6%의 수율로 얻었다.
실시예 38이 제조. 실시예 38은 실온에서 DCM (5 ml)중 TFA (0.2 ml)을 사용하여 상술한 tert-부틸 cis-4-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로헥실벤질카르바메이트로부터 출발하여 방법 C에 따라 합성하고, n-펜탄으로 분쇄하여 담갈색 고체로서 상기 화합물을 얻은 다음, 아세톤 (3 ml)중 상기 얻어진 화합물 (20 mg, 46 μmol)을 용해하고 1.2 당량의 에테르성 HCl (0.05 ml, 0.05 mmol, 1 M)을 첨가하여 HCl-염으로 전환함으로써 황백색 고체로서 HCl-염을 92.2%의 수율로 얻었다. 실온에서 아세톤을 증발시키고, 물을 첨가하고 동결건조시킴으로써 정제하여 황백색 고체로서 생성물을 92%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.75 (s, 1 H), 9.17 (s, br., 1 H), 8.98 (s, br., 1 H), 8.32 (t, 1 H), 8.18 (d, 1 H), 7.57 (t, 2H), 7.45-7.38 (m, 4H), 7.26 (s, 1 H), 7.10 (d, 1 H), 6.91 -6.89 (m, 1 H), 3.82 (s, 3H), 3.07 (d, 1 H), 2.22-2.03 (m, 1 H), 1.98-1.76 (m, 4H), 1.39-1.73 (m, 2H), 1.51 -1.33 (m, 2H), 1.23 (s, 2H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 11.5 min (97.8%).
실시예 39: (1R,3S)-N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일)-3-( 페닐아 미노)- 사이클로펜탄카르복사미드
단계 A: (1R,3S)-메틸 3-아미노사이클로펜탄카르복실레이트의 제조. (1R,3S)-메틸 3-아미노사이클로펜탄카르복실레이트를 상술한 바와 같이 제조하였다.
단계 B: tert-부틸 (1S,3R)-3-(메톡시카르보닐)사이클로펜틸카르바메이트의 제조. Boc-무수물 (2.90 ml, 13.1 mmol)을 THF (10 ml), 물 (20 ml)중 (1R,3S)-메틸 3-아미노사이클로펜탄카르복실레이트 (1.70 g, 11.9 mmol) 및 탄산 칼륨(3.29 g, 23.8 mmol)의 용액에 첨가하고 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (2 x 50 ml)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 물 (20 ml), 식염수 (20 ml)로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과하고 진공하에 농축시켜 무색 액체로서 2.5 g (87%)의 tert-부틸 (1S,3R)-3-(메톡시카르보닐)사이클로펜틸카르바메이트를 얻었다.
단계 C: tert-부틸 (1S,3R)-3-카르바모일사이클로펜틸카르바메이트의 제조. 암모니아 가스를 강철 봄브 중에 -78℃에서 MeOH (20 ml)중 tert-부틸 (1S,3R)-3-(메톡시카르보닐)사이클로펜틸카르바메이트 (2.0 g, 8.2 mmol)를 얻었다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온하고, 80℃로 가열하고, 48 시간 동안 추가로 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 농축시켜 갈색 고체로서 1.6 g (85.5%)의 tert-부틸 (1S,3R)-3-카르바모일사이클로펜틸카르바메이트를 얻었다.
단계 D: tert-부틸 (1S,3R)-3-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로펜틸카르바메이트의 제조. tert-부틸 (1S,3R)-3-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로펜틸카르바메이트는 밀봉 관중에 120℃에서 4 시간 동안 tert-부틸 (1S,3R)-3-카르바모일사이클로펜틸카르바메이트 (750 mg, 3.28 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (930 mg, 3.94 mmol), Cs2C03　(1.63g, 4.92 mmol), 잔트포스 (173 mg, 0.29 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (150 mg, 0.13 mol) 및 1,4-디옥산 (10 ml)를 사용하여 방법 B에 따라 반응시켜 합성하였다.
단계 E: (1R,3S)-3-아미노-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로펜탄카르복사미드의 제조. (1R,3S)-3-아미노-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로펜탄카르복사미드는 방법 C에 따라 DCM (6 ml)중 tert-부틸 (1S,3R)-3-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로펜틸카르바메이트 (1.00 g, 2.33 mmol), TFA (2 ml)를 사용하여 0℃에서 시작하여 실온으로 가온시키고 2시간 동안 교반시켜 제조하였다.
실시예 39의 제조. 보론산 페닐 (900 mg, 4.10 mmol), 아세트산 구리 (746 mg, 4.10 mmol) 및 피리딘 (0.40 ml, 4.10 mmol)을 실온에서 DCM (10 ml)중 tert-부틸 (1S,3R)-3-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로카르바메이트 (600 mg, 2.73 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 동일 온도에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 DCM (50 ml)으로 희석한 다음, 유기층을 물 (25 ml), 식염수(25 ml)로 세척하였다. 결합된 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 농축하였다. 미정제 생성물은 석유 에테르 중 25% 에틸 아세테이트를 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 갈색 고체로서 200 mg (18%)의 실시예 39를 57%의 수율로 얻은 다음, 아세톤 (5 ml)중 상기 얻어진 화합물(200.0 mg, 0.493 mmol)을 용해하고 0℃에서 30 분 동안 2.2 당량의 에테르성 HCl (1000㎕, 1,084 mmol, 1M)을 첨가하고 동결 건조시켜 HCl-염으로 전환시킴으로써 황백색 고체로서 생성물을 74%의 수율로 생성시키고, 실온에서 아세톤을 증발시키고 물을 첨가하고 동결건조시켜 정제하여 황백색 고체로서 생성물을 74%의 수율로 얻었다.　1H-NMR (HCl-염, 400MHz, DMSO-d6): δ = 10.99 (s, 1 H), 8.92 (s, 1 H), 8.72 (s, 1 H), 7.98 (t, 1 H), 7.44-7.16 (m, 5H), 7.14 (d, 1 H), 6.94 (t, 1 H), 3.94-3.86 (m, 1 H), 3.91 (s, 3H), 3.10-3.06 (m, 1 H), 2.29-2.08 (m, 2H), 1 .96-1.81 (m, 5H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 13.3 min (100%), mp: 180℃에서 시작하여 200℃에서 완전히 용융.
실시예 40: (1R,3S)-3- 아세트아미도 -N-(4-(4- 플루오로 -2- 메톡시페닐 )피리딘-2-일) 사이클로헥산카르복사미드
단계 A: cis-3-아미노사이클로헥산카르복실산의 제조. CHCl3중 아지화 수소산의 7% (w/v) 저장용액 (196 ml, 0.32 mol, 상기 저장용액은 CHCl3　(2 l)에 400ml의 물중 400g의 NaN3를 첨가하여 제조하였다). 황산 (167 ml)을 0℃에서 교반하면서 서서히 첨가하였다. 상부 CHCl3　층을 따라내고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 여과하고 냉장고에 저장하였다. 적정 분석은 사용 전에 행하였다. 용액을 35℃에서 황산(150 ml) 및 CHCl3　(500 ml)의 혼합물 중에 cis-사이클로헥산-1,3-디카르복실산 (50.0 g, 0.29 mol)의 용액에 7시간에 걸쳐 적가하였다. 첨가 완료 후에, 반응 혼합물을 40℃에서 10 시간 동안 교반하고 50℃에서 3시간 동안 추가로 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 산 층을 분리하였다. 산 층을 수소화 바륨으로 pH~9로 염기화하고 현탁액을 여과하였다. 여과물을 묽은 황산으로 중화하고 현탁액을 다시 여과하였다. 여과물을 진공하에 농축시켜 미정제 화합물을 얻고 MeOH (30 ml)로 세척하여 고체로서 39.0 g (93.8%)의 cis-3-아미노사이클로카르복실산을 얻었다 [TLC 시스템: CHCl3 중 15% MeOH, Rf　0.1 ].
단계 B: tert-부틸-cis-3-아미노사이클로헥산카르복실산의 제조. Boc-무수물 (353 ml, 1.54 mol)은 0℃에서 디옥산 (1 l) 및 물 (1 l)의 혼합물 중 cis-3-아미노사이클로헥산카르복실산 (200 g, 1.40 mol), DIPEA (974 ml, 5.59 mol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 다시 냉각하고 2N HCl을 사용하여 pH 2로 산성화시키고 DCM (3 x 1 l)로 추출하고 결합된 유기층을 물(2 x 1 l), 염수 (2 x 1 l)로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조하고 여과시켰다. 진공하에 농축시켜 미정제 화합물을 생성시키고 석유 에테르(300 ml)로 세척하여 고체로서 202 g (59.4%)의 tert-부틸-cis-3-아미노사이클로헥산카르복실산을 얻었다. [TLC 시스템: CHCl3중 20% MeOH, Rf　0.1 ].
단계 C: 1R,3S-메틸 3-아미노사이클로헥산카르복실레이트의 제조. 1R,3S-메틸 3-아미노사이클로헥산카르복실레이트는 환류하에 에틸 아세테이트 중 tert-부틸-cis-3-아미노사이클로헥산카르복실산의 용액에 R-(+)-1-페닐에틸아민을 첨가하고 혼합물을 1 시간 동안 교반하여 제조하였다. 반응 혼합물을 환류하에 여과하고 뜨거운 에틸 아세테이트로 세척하였다. 고체를 에틸 아세테이트 중에 취하고 0.1 N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 에틸 아세테이트 층을 진공하에 농축하여 원하는 1R,3S-메틸 3-아미노사이클로헥산카르복실레이트를 얻었다.
단계 D: tert-부틸 (1S,3R)-3-카르바모일사이클로헥실카르바메이트의 제조. tert-부틸 (1S,3R)-3-카르바모일사이클로헥실카르바메이트는 건조 DMF 중 카르보닐디이미다졸 및 1R,3S-메틸 3-아미노사이클로헥산카르복실레이트을 반응시켜 제조하였다.
단계 E: tert-부틸 (1S,3R)-3-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로헥실카르바메이트의 제조. tert-부틸 (1S,3R)-3-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일카르바모일)사이클로헥실카르바메이트는 방법 B에 따라 61.2%의 수율로 제조하였다.
단계 F: (1R,3S)-3-아미노-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로헥산카르복사미드의 제조. (1R,3S)-3-아미노-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로헥산카르복사미드는 방법 C에 따라 96.3%의 수율로 제조하였다.
실시예 40의 제조. 실시예 40은 상술한 (1R,3S)-3-아미노-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로헥산카르복사미드로부터 출발하여 아세트산 무수물을 사용하여 74.9%의 수율로 합성하였다.　1H-NMR (400MHz, CDCl3): δ = 8.32-8.25 (m, 2H), 8.14-8.07 (m, 1 H), 7.33 (t, 1 H), 7.22-7.20 (m, 1 H), 6.76-6.69 (m, 2H), 5.45 (d, 1 H), 3.89-3.83 (m, 4H), 2.43-2.40 (m, 1 H), 2.26-2.23 (m, 1 H), 1.97-1 .89 (m, 6H), 1.51 -1.37 (m, 3H), 1.16-1 .12 (m, 1 H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 11.1 min (100%), 키랄 HPLC: 99.18%., mp: 234-236 ℃.
실시예 41: (1S,3R)-3-아세트아미도-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로펜탄카르복사미드
단계 A: 1-아자비사이클로[2.2.1]헵탄-3-온의 제조. (1S)-(+)아자비사이클로[2,2,1]헵트-5-엔-3-온(1.00 g, 11.9 mmol)은 50 psi에서 5 시간 동안 Parr 수소화 장치 중에서 탄소 팔라듐(50 mg, 10 중량%) 상에서 건조시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통하여 여과하고 에틸 아세테이트로 세척하였다. 결합된 여과물 및 세척물을 진공하에 농축하여 백색 고체로서 1.00 g (95.75%)의 1-아자비사이클로[2.2.1]헵탄-3-온을 얻었다.
단계 B: (1S,3R)-3-아미노사이클로펜탄카르복실산 하이드로클로라이드의 제조. 3N HCl (20 ml)중 1-아자비사이클로[2.2.1]헵탄-3-온 (1.00 g, 9.01 mmol)의 용액을 4 시간 동안 환류시켰다. 휘발성 물질을 진공하에 증발하고, 톨루엔으로 공-증류시키고 감압하에 건조시켜 백색 고체로서 1.30 g (87.2%)의 (1S,3R)-3-아미노사이클로펜탄카르복실산 하이드로클로라이드를 얻었다.
단계 C: (1S,3R)-사이클로펜탄카르복실산, 3-[[(1,1-디메틸에톡시)카르보닐]아미노]의 제조. 물 (20 ml)중 수성 탄산 칼륨 (2.20 g, 15.7 mmol)을 0℃에서 THF (20 ml)중 (1S,3R)-3-아미노사이클로펜탄카르복실산 하이드로클로라이드 (1.30 g, 7.85 mmol)의 현탁액에 첨가하고, 15분 동안 교반하고 Boc-무수물(2.70 ml, 11.8 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 20 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 10% 아세트산을 사용하여 4.0-5.0의 pH로 산성화하고 에틸 아세테이트(2 x 30 ml)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물, 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 농축시켜 담황색 액체로서 1.30 g (72.2%)의 (1S,3R)-사이클로펜탄카르복실산, 3-[[(1,1-디메틸에톡시)카르보닐]아미노]를 얻었다.
단계 D: 카르밤산, [(1S,3R)-3-(아미노카르보닐)사이클로펜틸]-, 1,1-디메틸에틸 에스테르의 제조. N,N'-카르보닐 디이미다졸 (2.76 g, 17.0 mmol)을 THF (20 ml)중에 (1S,3R)-사이클로펜탄카르복실산, 3-[[(1,1-디메틸에톡시)카르보닐]아미노] (1.32 g, 5.73 mmol)의 용액에 첨가하고 60℃에서 1 시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고 아세트산 암모늄 (2.62 g, 34.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 4 시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고 에틸 아세테이트(2 x 30 ml)로 추출하였다. 결합된 유기층을 물, 염수로 연속적으로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 진공하에 농축시켜 1.3 g의 미정제물을 얻었다. 미정제 화합물을 디에틸 에테르 중에 현탁하고, 15 분 동안 교반하고, 여과하고 디에틸 에테르로 세척하고 고체를 감압하에 건조시켜 백색 고체로서 300 mg (23.2%)의 카르밤산, [(1S,3R)-3-(아미노카르보닐)사이클로펜틸]-,1,1-디메틸에틸 에스테르를 얻었다.
단계 E: tert-부틸 (1R,3S)-3-(6-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리미딘-4-일카르바모일)사이클로펜틸카르바메이트의 제조. tert-부틸 (1R,3S)-3-(6-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리미딘-4-일카르바모일)사이클로펜틸카르바메이트는 밀봉 관중에 110℃에서 20 시간 동안 1,4-디옥산 (5 ml)중 상술한 카르밤산, [(1S,3R)-3-(아미노카르보닐)사이클로펜틸]-,1,1-디메틸에틸 에스테르 (150 mg, 0.66 mmol), 2-클로로-4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘 (155 mg, 0.66 mmol), Cs2C03　(321 mg, 0.98 mmol), 잔트포스 (19.0 mg, 328 μmol) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (29 mg, 26 μmol)으로부터 출발하여 방법 B에 따라 합성하고, CHCl3　중 0-2% MeOH를 사용하여 중성 알루미나 상에 칼럼크로마토그래피에 의한 통상의 워크업 후에 정제하고, 에틸 아세테이트로 분쇄하여 담황색 고체로서 생성물을 (70.9%)의 수율로 얻었다.
단계 F: (1S,3R)-3-아미노-N-(6-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리미딘-4-일)사이클로펜탄카르복사미드의 제조. (1S,3R)-3-아미노-N-(6-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리미딘-4-일)사이클로펜탄카르복사미드는 상술한 tert-부틸 (1R,3S)-3-(6-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리미딘-4-일카르바모일)사이클로펜틸카르바메이트(200 mg, 0.46 mmol)로부터 출발하여 방법 C에 따라 황색 고체로서 (71.8%)의 수율로 얻었다.
실시예 41의 제조. 아세트산 무수물 (0.035 ml, 0.304 mmol)을 0℃에서 DCM (5 ml) 및 촉매량의 AcOH (0.1 ml)중 (1S,3R)-3-아미노-N-(6-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리미딘-4-일)사이클로펜탄카르복사미드(100 mg, 0.30 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 2.5 시간 동안 교반하였다. 물을 반응 혼합물에 첨가하고 DCM (3 x 25 ml)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 물, 염수로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고 진공하에 농축시켜 황백색 고체로서 90 mg (80.3%)의 (1S,3R)-3-아세트아미도-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로펜탄카르복사미드를 얻었다.　1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ = 10.52 (s, 1 H), 8.31 (s, 1 H), 8.21 (s, 1 H), 7.92 (t, 1 H), 7.39-7.36 (m, 1 H), 7.19-7.02 (m, 2H), 6.92 (q, 1 H), 4.02 (t, 1 H), 3.90 (s, 3H), 2.98 (t, 1 H), 2.17-2.10 (m, 1 H), 1.91 -1.62 (m, 6H), 1.59-1.42 (m, 2H), HPLC (λ= 214 nm, [A]): rt 10.4 min (100%), 키랄 HPLC: 98.52%, mp: 125-129 ℃.
생물학적 실시예, 키나아제 억제제의 IC50-값의 평가 및 측정
생물학적 실시예 1: 시험관내 키나아제 억제 분석
시험관내 키나아제 평가분석은 당해 분야에 기술된 표준 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 이들 기술은 또한 시험관내 평가 분석, 예를 들어 Millipore Inc. (www.millipore.com), ProQinase GmbH (www.proqiiiase.de) 및 기타에 의해 제공된 평가를 제공하기 위하여 상업용 서비스 공급자에 의해 사용되고 있다.
다음의 프로토콜은 실험을 수행하기 위해 한 가지 가능한 방법을 기술한다.
1. 시험 화합물
화합물은 100% DMSO 중 1 x 10-02　저장용액으로서 3개의 96-웰 V-형 미량정량 플레이트의 칼럼 2에서 각각 100㎕이 사용되었다 (다음에서, 상기 플레이트는 "마스터 플레이트"로서 인용됨).
이후에, 마스터 플레이트의 칼럼 2에서 1 x 10-02　저장용액은 용매로서 100% DMSO을 사용하여 단계, 반대수 희석(semi-logarithmic dilution)으로 처리하여, 10개의 상이한 농도를 생기게 하고, 희석한계는 칼럼 12에서 3 x 10-07　M/100% DMSO이다. 칼럼 1 및 7은 대조군으로서 100% DMSO로 충전하였다. 다음에, 단계 희석된 카피 플레이트의 각 웰 2 x 5㎕을 96-채널 피펫터를 사용하여 2개 동일 세트의 "화합물 희석 플레이트"에서 분취하였다.
키나아제 억제 평가 일에, 45㎕ H20은 화합물 희석 플레이트 세트의 각각의 웰에 첨가하였다. 침전을 최소화하기 위하여, H20는 상기 화합물 용액을 상기 분석 플레이트에 옮기기 몇 분 전에 상기 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트는 철저하게 교반하여, 세미-로그 스텝에서 1 x 10-03　M/10% DMSO 내지 3 x 10-08　M/10% DMSO의 농도를 갖는 "화합물 희석 플레이트/10% DMSO"를 수득하였다. 이들 플레이트는 5㎕ 화합물 용액을 "분석 플레이트"로 옮기기 위해 사용하였다. 화합물 희석 플레이트는 작업 일의 종료시에 버렸다. 분석을 위해(하기 참조), 화합물 희석 플레이트의 각 웰로부터 5㎕ 용액은 분석 플레이트로 옮겼다. 분석의 최종 용적은 50 ㎕이었다. 모든 화합물은 1 x 10-04　M 내지 3 x 10-09　M 범위의 10개 최종 분석 농도에서 시험하였다. 반응 혼합물에서 최종 DMSO 농도는 모든 경우에 1 %이었다.
2. 재조합 단백질 키나아제
억제 프로파일을 결정하기 위하여, 다음의 5개 단백질 키나아제가 사용되었다: CDK2/CycA, CDK4/CycD1 , CDK5/p35NCK, CDK6/CycD1 및 CDK9/CycT. 상기 단백질 키나아제는 바큐로바이러스 발현 시스템을 사용하여 인간 재조합 GST-융합 단백질 또는 그의 표지 단백질(His-tagged protein)로서 Sf9 곤충 세포 중에 발현된다. 카나아제는 GSH-아가로스 (Sigma) 또는 Ni-NTH-아가로스(Qiagen)를 사용하여 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 각각의 키나아제의 순도는 SDS-PAGE/은 염색으로 측정하였으며 또한 각각의 키나아제의 동일성은 키나아제 특이적 항체에 의한 웨스턴 블룻 분석에 의해 또는 질량 분광계에 의해 확인하였다.
3. 단백질 키나아제 분석
모든 키나아제 분석은 50㎕ 반응 용적으로 Perkin Elmer/NEN (Boston, MA, 미국)으로부터 96-웰 플래시플레이트TM에서 수행하였다. 반응 혼합물은 다음 순서로 4 단계로 피펫팅 하였다:
ㆍ20㎕의 분석 완충제 (표준 완충제)
ㆍ5㎕의 ATP 용액(H20중)
ㆍ5㎕의 시험 화합물(10% DMSO 중)
ㆍ10㎕의 기질/10㎕의 효소 용액 (예비 혼합)
모든 효소에 대한 분석은 60 mM HEPES-NaOH (pH 7.5), 3 mM MgCl2, 3 mM MnCl2, 3μM Na-오르토바나데이트, 1.2 mM DTT, 50 ㎍/ml PEG20000, 1μM [33P]-ATP (웰당 약 5 x 1005 cpm).
효소 및 기질은 웰 마다 다음과 같은 량으로 사용하였다:
Figure pct00023
반응 혼합물은 30℃에서 80 분 동안 배양하였다. 반응은 50㎕의 2% (v/v) H3PO4로 정지시키고, 플레이트는 흡인하고 200㎕ H20 또는 200㎕ 0.9% (w/v) NaCl로 두 번 세척하였다. 33P의 편입은 마이크로플레이트 신틸레이션 계수기(Microbeta, Wallac)로 측정하였다.
모든 분석은 베크만 카운터/사기안 로보트 시스템으로 수행하였다.
4. 원 자료의 평가
각각의 분석 플레이트의 칼럼 1 (n=8)에서 카운트의 중앙값은 "낮은 대조기준"(low control)로 정의하였다. 이값은 단백질 키나아제가 없지만 기질이 존재하는 방사능의 비특이적 결합을 반영한다. 각 분석 플레이트 (n=8)의 칼럼 7에서 카운트의 중앙값은 "높은 대조기준"(high control), 즉 임의 억제제가 없는 완전한 활성으로 취하였다. 높은 대조기준과 낮은 대조 기준 사이의 차이는 100% 활성으로 언급하였다. 데이터 분석의 일부로서, 특수한 플레이트로부터 낮은 대조기준 값은 높은 대조기준 값으로부터 뿐만 아니라 상응하는 플레이트의 모든 80개 "화합물 값"으로부터 감산하였다. 특수한 플레이트의 각 웰에 대한 잔류 방사능(%)은 다음 식으로 계산하였다:
잔류 방사능(%) = 100 X [(화합물의 cpm - 낮은 대조기준l) / (높은 대조기준 - 낮은 대조기준)]
각각의 농도에 대한 잔류 방사능 및 화합물 IC50 값은 Quattro Workflow V2.0.1.3 (독일 뮌헨 Quattro Research GmbH; www.quattro-research.com)를 사용하여 계산하였다. 사용된 모델은 100%에서 고정된 파라미터 "최고" 및 0%에서 "최하"를 갖는 "Sigmoidal 반응 (variable slope)"을 사용하였다.
표 1은 실시예 화합물 1 내지 39에 대한 시험관내 키나아제 억제 분석의 결과를 나타낸다.
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
표 1의 칼럼 7 내지 9에 나타낸 시험관내 키나아제 억제 결과는 밀리포어의 키나아제프로필러TM(KinaseProfiler) 서비스를 사용하여 얻었으며 또한 CDK9에 대한 특이성을 나타내는 화합물을 선택하는데 사용하였다. 구체적으로, 다른 CDK에 대하여 현저한 억제 효력을 가진 다른 화합물로부터 상기 CDK9-특이적 화합물을 구별하는 것이었다.
더욱이, 이들 데이터는 효능 및 선택성에 대하여 새로운 및 더욱 개량된 구조식/화합물의 디자인을 지지하는 구조 활성 상관(SAR)을 입증하는데 사용하였다.
표 2. 키나아제 활성 분석 IC50 프로파일
화합물 33 및 34의 IC50 프로파일은 시험관내 효소 키나아제 억제 분석에서 사이클린 의존성 키나아제 CDK1/CycB, CDK2/CycA, CDK3/CycE, CDK5/p35NCK, CDK6/CycD3, CDK7/CycH/MAT1, CDK9/CycT GSK3-알파, GSK3-베타 및 IRAK1에 대해 결정하였다.
표 2. 화합물 33 및 34에 대한 선택성 ( IC50 )
Figure pct00027
이들 분석에서 얻어진 IC50 값은 CDK9 억제에 대하여 화합물의 특이적 선택성 및 효능을 평가하는데 사용하였다.
이들 분석에서 얻어진 결과는 CDK9에 대한 선택성을 나타내는 화합물을 선택하는데 사용하였다. 구체적으로, 다른 CDK에 대하여, 즉 CDK 1, 2, 3, 5, 6, 및 7에 대하여도 또한 현저한 억제 효력을 가진 다른 화합물로부터 상기 CDK9-특이적 화합물을 구별하는 것이었다.
더욱이 이들 데이터는 효능 및 선택성에 대하여 새로운 및 더욱 개량된 구조식/화합물의 디자인을 지지하는 구조 활성 관계(SAR)를 입증하는데 사용하였다.
생물학적 실시예 2: 시험관내 키나아제 결합분석
시험관내 키나아제 결합분석은 당해 분야에 기술된 표준 기술을 사용하여 수행하였다. 이들 기술은 또한 Ambit Biosciences Inc. (www.ambitbio.com)에서 제공된 시험관내 키나아제 결합 분석 서비스 예를 들어 KINOMEscanTM 서비스를 제공하기 위해서 상업용 서비스 공급자게 의해 사용되고 있다.
다음의 프로토콜은 실험을 수행하기 위하여 한 가지 가능한 방법을 기술한다.
대부분의 분석을 위하여, 키나아제 표지된 T7 파지 균주는 BL21 균주에서 유도된 이. 콜라이 숙주에서 24-웰 블록에서 동시에 성장하였다. 이. 콜라이는 로그-상(log-phase)으로 성장하고 냉동 저장(감염 다중도=0.4)로부터 T7 파지로 감염되고 용해까지 (90-150 분) 32℃에서 진탕하면서 배양하였다. 용해물은 원심분리(6,000 x g)하고 여과(0.2㎛)하여 세포파편을 제거하였다. 잔류하는 키나아제는 HEK-293 세포에서 생산된 다음, qPCR 검출을 위해 DNA로 표지하였다. 스트렙타비딘-피복된 자석 비드는 실온에서 소분자 리간드로 30분 동안 처리하여 키나아제 분석을 위해 친화성 수지를 생산하였다. 리간드의 비드는 과량의 바이오틴으로 차단하고 차단 완충제 (SeaBlock (Pierce), 1% BSA, 0.05% 트윈TM 20, 1 mM DTT)로 세척하여 결합되지 않은 리간드를 제거하고 비특이적 파지 결합을 감소시켰다. 결합 반응은 1x 결합 완충제 (20% SeaBlockTM, 0.17x PBS, 0.05% 트윈TM 20,6 mM DTT)중에 키나아제, 리간드의 친화성 비드 및 시험 화합물을 결합시켜 조합하였다. 시험 화합물은 100% DMSO중에 40 x 스톡(stock)으로 제조하고 분석에서 직접 희석하였다. 모든 반응은 0.04 ml의 최종 용적으로 폴리프로필렌 384-웰 플레이트에서 수행하였다. 분석 플레이트는 1시간 동안 진탕하면서 실온에서 배양하고 친화성 비드는 ㅅ세척 완충제(1x PBS, 0.05% 트윈TM 20)로 세척하였다. 이어서 비드는 용출 완충제 (1x PBS, 0.05% 트윈TM20, 0.5 μM 비-바이오틴화 친화성 리간드) 중에 재현탁하고 실온에서 30분 동안 진탕하며 재현탁시켰다. 용출물에서 키나아제 농도는 qPCR로 측정하였다.
생물학적 실시예 3: TNF -알파-유도성 세포 효과의 억제
CDK9는 TNF-알파에 세포의 노출에 의해 생기는 효과를 조정함으로써 세포내 시그날 전달 이벤트 및 전사 반응을 생기게 하는 것으로 보고되었다 (MacLachlan, T. K. et al ., J Cell Biochem. 1998, 71, 467-78, Brasier, A. R., Cell Cycle. 2008, 7, 2661-6). 인간 HeLa 세포주 같은 TNF-알파 반응성 세포주는 TNF-알파에 대한 세포 반응, 예를 들어 트랜스펙터 TNF-알파 반응성 리포터 유전자의 전사 조절, 및 이러한 반응에서 키나아제 억제제의 효과를 연구하는데 사용할 수 있다.
다음의 프로토콜은 실험을 수행하는 한 가지 가능한 방법을 기술한다.
TNF-알파 매개성 전자 반응에 대한 화합물 효과를 분석하기 위하여, TNF-알파 유도성 리포터 유전자로 안정하게 트랜스펙트 된 HeLa-유도성 세포주가 사용되었다 (파노믹스 카탈로그 번호 RC0013). 세포주는 루시페라아제 리포터 유전자(Panomics P/N LR0051) 및 pHyg를 인간 부두 상피 HeLa 세포에 동시 트랜스펙션한 다음, 히그로마이신 선택에 의해 얻었다. TNFα 유도성 루시페라아제 활성은 히그로마이신-내성 세포로부터 클론을 선택하는데 사용하였다. 세포주는 유지하고 제조자의 지시서에 따라 자극하였다. 요컨대 세포는 12-웰 플레이트에서 1ml의 성장 배지에서 5x　105/웰로 파종하고 37 ℃ 및 5% CO2에서 24 시간 동안 가습 배양기에서 배양하였다. 배지는 1ml의 혈청 유리 배지로 대체하고 화합물은 10μM의 농도까지 첨가하였다. 배양 1시간 후에, TNF-알파는 50 ng/ml의 최종 농도를 달성하기 위하여 첨가하였다. 배양 접시는 37 ℃ 및 5% CO2에서 6 시간 동안 가습 배양기에서 추가로 배양하고, 배지를 제거하고 100 μL의 용해 완충제를 각 웰에 첨가하고 루시페라아제 활성에 대한 분석을 분석 제조자(Promega P/N E1500)의 권장서에 따라 수행하였다. 이 세포주에 대한 더 많은 정보를 위해, www.panomics.com을 방문하시오.
표 1: 실시예
TNF-알파-유도성 리포터 유전자 발현에 대한 화합물 효과는 하기 표 1에서 칼럼 6에 나타낸다. 화합물 없이 DMSO-처리된 세포의 활성 비로서 3μM의 화합물 의 존재하에 배양 후 잔류 루시페라아제 활성을 나타낸다. 구체적으로, 이것은 다른 CDK에 대한 현저한 억제 효능을 갖는 다른 화합물로부터 세포 투과성 화합물을 구별하는 것이지만, 세포를 투과하지 않거나 또는 실험 상태에서 불안정하다. 더욱이 이들 데이터는 효력 및 세포 효과에 대하여 새로운 및 더욱 개량된 구조식/화합물의 디자인을 지지하는 구조 활성 관계(SAR)를 입증하는데 사용하였다.
생물학적 실시예 4: THP -1 세포로부터 LPS -유도성 사이토카인 방출의 억제
사이토카인 TNFα, IL6 및 IL1β와 같은 염증성 매개체는 지속적인 통증상태는 물론 염증성 장애에 기여할 수 있는 것으로 인식되었다. CNS 조직에서 말초 및 미세아교세포에서 마크로파지 같은 면역세포로부터 방출된 후, 이들 매개체는 염증성 및 신경변증성 통증에서뿐만 아니라 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환에서도중요한 역할을 하는 것으로 보인다 (Marchand, F. et al ., Nat Rev Neurosci 2005, 6, 521-532). 그리하여 종양 괴사 인자α(TNFα)의 억제는 마찬가지로 염증성 장애의 치료에서 관련 표적을 나타낸다 (Lavagno, L. et al ., Eur J Pharmacol 2004, 501, 199-208).
인간 THP-1 세포주는 지질 다당류(LPS) 또는 종양 괴사 인자[TNFα]에 의해 매개되는 바와 같이 사이토카인 발현의 시험관내 모델로서 사용할 수 있다. 단핵구성 THP-1 세포 (ATCC; TIB-202)는 LPS에 의한 유도시 또는 TNFα (자기분비 유도) 그 자체에 의해 TNFα, IL6 및 IL1β와 같은 염증성 사이토카인을 발현하는 마크로파지 유사 세포로 분화할 수 있다. 따라서 THP-1 시험관내 분석은 사이토카인 발현의 약리학적 억제를 나타내기 위해서 강력한 스크리닝 모델로서 사용할 수 있다 (Singh, U. et al., Clin Chem 2005, 51, 2252-2256; Rutault, K. et al ., J Biol Chem 2001, 276, 6666-6674).
다음의 프로토콜은 실험을 수행하기 위한 하나의 가능한 방법을 기술한다.
THP-1 세포는 10% FCS 및 1% Pen/Strep로 보충된 변형 RPMI-1640 배지 (ATCC, Cat. No. 30-2001)에서 성장시켰다. 사이토카인 억제 분석의 경우, 세포는 100 ng/ml PMA (시그마, P1585)로 보충된 표준 성장 배지에서 6-웰 플레이트에서 5x 105 세포/ml의 밀도로 파종하여 마크로파지 유사 세포로의 분화를 유도하였다. 24 시간 후에, 배지는 표준 성장 배지(PMA 없음)로 대체하고 세포는 48 시간 더 배양하여 분화를 완료하였다.
분화 72 시간 후에, 배지는 무혈청 성장 배지로 대체하고 CDK-억제 화합물은 물론 양성 및 음성 대조군과 같은 참조 화합물은 각각 DMSO 중에 용해되어 0.5 내지 5 μM 범위의 농도로 첨가하였다 (웰에서 DMSO의 최종 농도는 0.1%이다). 세포는 100 ng/ml LPS (시그마, L2630)로 4-48 시간 더 자극하기 전에 화합물로 60 분 동안 배양하였다. 상청액을 수집하고 상업적으로 이용 가능한 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 예를 들면 TNFα, IL-6 및 IL-1β에 대해, 사이토카인 발현을 위해 즉시 분석하거나 (eBioscience, Cat. No 88-7346, 88-7066, 88-7010) 또는 평가할 때까지 20℃에서 냉동 보관하였다.
세포 배양 상청액 내의 TNFα, IL-6 및 IL-1β의 농도는 제조업자의 지시서에 따라 상업용 ELISA 키트 (eBioscience)를 사용하여 측정한다.
생물학적 실시예 5 : 마우스의 카라기난 분석
카라기난 유도성 발 부종의 모델은 각각의 화합물의 염증 유도성 통증 인지의 감소 및 항염증 활성을 예측하기 위하여 사용되는 표준 실험실 분석이다. 다음의 프로토콜은 실험을 수행하기 위한 한가지 가능한 방법을 기술한다.
기본적 측정은 카라기난과 같은 자극제에 대한 반응에서 부종 및 기계적 과민성은 물론 열적 과민성의 측정을 구성한다.
염증 및 결과의 염증성 통증은 마우스 뒷발 (동측성 발) 내에 25㎕의 1% 카라기난 (염분 함유)의 피하 주사에 의해 유발된다. 10 마리 마우스의 각 그룹은 카라기난 주사 전에 30분 복강내 주사에 의해 화학식(I)에 따른 화합물, 30 mg/kg 체중, 부형제 ((400㎕)의 2% 하이드록스프로릴 셀룰로오스, 0.25% 락트산(85% 용액)) 및 염분 (생리적 NaCl)을 수취한다. 반대측성 발은 카라기난 주사를 수취하지 않는다.
카라기난 주사에 의해 유발된 발 부종은 주사된 (동측성) 발의 발허리 부분에서 등쪽에서 발바닥까지 측정된 증가된 발 크기에 의해 검출된다. 동측성 및 반대측성 발의 크기는 염증을 위한 대체 마커로서 작용하며 또한 카라기난 주사 후 여러 시간 지점에서: 주사 후 (-1), 2h (2), 3h (3), 4h (4), 5h (5), 6h (6), 24h (24) 주사 전에 측정한다.
모든 마우스의 발 크기는 카라기난 전에 30분 주입된 치료 물질의 유형과 상관없이 카라기난 주사 후 첫 번째 시간 내에 예를 들어 2 내지 3mm (+10%)로 증가할 수 있다. 시간 과정 중에, 카라기난 주사 전에 CDK-억제 화합물로 치료를 받은 마우스는 카라기난 주사 후 24 시간까지 부종의 감소를 나타낼 수 있으며: 발 크기의 증가는 예를 들어 10%에서 8% 이하로 떨어질 수 있었다. 반면 대조 마우스의 발 크기는 이 시점에서 평균 30%까지 증가할 수 있었다. 24 시간 포스트 카라기난 주사 후에, 카라기난으로 처리된 모든 발의 크기는 주사 후 96 시간에서 최대로 증가할 수 있다.
카라기난 분석의 판독으로서, 하그리브스(Hargreaves) 분석을 수행할 수 있으며, 여기서 상기 분석은 방사열로 열 민감성의 측정을 가능하게 한다. 하그리브수 분석 (Hargreaves et al ., 1988)은 플렉시글라스 챔버를 대신하기 때문에 동물의 뒷발의 발바닥 표면상에 방사열원을 집중시켜 자유 이동하는 동물에서 침해 수용 감도를 측정한다. 구체적으로, 발의 아래쪽은 예를 들어 55℃의 열을 발생시키는 광원에 노출한다. 열 감도는 노출 시작 및 노출된 발의 올림/끌어당김 사이의 잠재성으로 측정한다.
여기에서 기술된 바와 같은 CDK9 억제제 및 카라기난으로, 또는 나프록센 및 카라기난으로, 또는 용매 및 카라기난으로 각각 처리된, 마우스는 하그리브수 분석에 처리된다. CDK 억제제 및 카라기난으로 처리된 마우스는 음성의 대조 마우스에 비하여 더 긴 잠재성을 나타낼 수 있었다. 이러한 관찰은 여기에서 기술된 바와 같은 CDK 억제제의 통증 저하 효과를 나타낼 것이다.
생물학적 실시예 6: 래트의 카라기난 분석
다음은 래트의 카라기난 분석을 수행하는 한 가지 가능한 방법을 도시한다.
상기 분석은 Winter et al . (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1962, 111, 544-547)에 기술된 바와 같은 프로토콜에 따라 염증성 통증을 갖는 래트의 진통/항염증 활성을 검출한다.
래트 (200-250 g)는 우측 뒷발의 아래 표면에 카라기난의 현탁액으로 주입한다(0.05 ml 생리적 식염수중 발당 0.75 mg). 2 시간 후에 래트는 두 개의 뒷발의 촉각 및 열적 자극에 계속 제공된다.
촉각 자극을 위해, 동물은 그리드 상에 반전된 플라스틱 박스(18 x 11.5 x 13 cm)에 넣는다. 다음에 전자 Von Frey 프로브 (Bioseb, 모델 1610)의 선단은 먼저 미감염된 뒷발에 이어서 감염된 뒷발에 증가하는 힘으로 적용시키고 또한 발 철회(paw-withdrawal)를 유발하는데 필요한 힘을 자동으로 기록한다. 이러한 절차는 3번 수행하고 발 당 평균 힘을 계산한다.
열적 자극을 위하여, 장치는 높은 글라스 상에 넣은 개개의 아크릴 플라스틱 박스(17 x 11 x 13 cm)로 구성된다. 래트는 박스 속에 넣고 10분 동안 습관화 되기 위해 방치한다. 다음에 이동 적외선 방사원 (96±10 mW/㎠)은 먼저 미감염된 뒷발에 이어서 감염된 뒷발에 집중시키고 발 철회 잠재성을 자동으로 기록한다. 조직 손상을 방지하기 위하여, 열원은 45초 후에 자동으로 꺼진다.
거동을 측정한 후에, 발 부종은 발 침지에 의해 유발된 물 치환 (ml)을 나타내는 디지털 체적변동유량계 (Letica, 모델 7500)을 사용하여 각각의 뒷발의 용적을 측정함으로써 평가한다.
10 마리 래트를 그룹마다 분석한다. 시험 수행한다(blind).
화학식(I)에 따른 CDK 억제제와 같은 시험 물질은 2개의 투여량 (10 및 30 mg/kg)에 평가하고, 시험 60분 전에 경구투여하고, 부형제 대조 그룹과 비교하였다.
동일 실험 조건하에 투여된 모르핀(128 mg/kg 경구투여) 및 아세텔살리실산(512 mg/kg 경구 투여)은 참조 물질로서 사용될 것이다.
따라서 실험은 6 개 그룹을 포함할 것이다. 데이터는 독립 스튜던트 t 검정을 사용하여 처리된 그룹과 부형제 대조군을 비교하여 분석할 것이다.
여기에서 기술된 바와 같은 CDK9 억제제 및 카라기난으로, 또는 나프록센 및 카라기난으로, 또는 용매 및 카라기난으로 각각 처리된, 래트는 하그리브스 분석에 처리된다. CDK 억제제 및 카라기난으로 처리된 래트는 음성의 대조 래트에 비하여 더 긴 잠재성을 나타내야 한다. 이러한 관찰은 여기에서 기술된 바와 같은 CDK 억제제의 통증 저하 효과를 나타낼 것이다.
생물학적 실시예 7 : 생체내 LPS 분석
다음은 마우스의 생체내 LPS 분석을 수행하는 한 가지 가능한 방법을 기술한다.
패혈 쇼크의 LPS 유도성 모델의 경우, 마우스는 식염수 중 30㎍ 세균성 지질 다당체(LPS; L2630 SIGMA)의 복강내(i.p.) 주사를 받는다. 염증성 신호전달 연속반응의 상기 LPS-매개성 자극은 TNFα, IL-6 및 1L-1β와 같은 사이토카인의 혈청을 증가하게 한다. 혈액은 정해진 시점에서 이들 동물로부터 취할 수 있다. 그 후 혈청은 분리할 것이고 시료는 사이토카인 농도가 상업용 ELISA 분석을 사용하여 측정될 때까지 -80℃에서 저장할 수 있다 (Moreira, A. L. et al ., Braz J Med Biol Res, 1997, 30, 1199-1207).
사이토카인 TNFα, IL-6 및 1L-1β와 같은 염증성 매개체는 지속성 통증 상태는 물론 염증성 장애에 기여할 수 있는 것으로 인식되었다. CNS 조직에서 말초 및 미세 아교세포에서 마크로파지 같은 면역 세포로부터 방출된 후에, 이들 매개체는 염증성 및 신경병증성 통증에서뿐만 아니라 류마티스 관절염에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다 (Marchand, F. et al ., Nat Rev Neurosci 2005, 6, 521-532). 따라서 종양 괴사 인자 α (TNFα)의 억제는 마찬가지로 염증성 질환의 치료를 위한 관련 표적을 나타낸다 (Lavagno, L. et al ., Eur J Pharmacol 2004, 501, 199-208).
LPS 생체내 분석은 약리학적 치료에 의한 사이토카인 발현의 억제를 나타내기 위한 강력한 모델로서 사용될 수 있다.
야생형 마우스 (균주 C3HeB/FeJ) (부합된 나이, 성 및 체중)은 30㎍ LPS (SIGMA)로 복강내로 주사하였다. LPS 투여 90 분 후에 이들 동물은 0.1 ml/10 g 체중 케타민-롬펀 (50/20 mg/ml)으로 마취시키고, 혈청 제조용 혈액은 심장 천자를 통하여 취하였다.
LPS 마우스의 약리학적 처리 그룹 (n=4)은 각각 CDK-억제 화합물 또는 부형제 (음성 대조군)의 복강내(i.p.) 주사를 받았다.
20% DMSO, 5% 트윈 80, 10% 트리스 1 M pH 8, 20% PEG400, 45% PBS 중에 용해된 10 또는 30 mg/kg (체중당 화합물)의 CDK 억제제는 단일 투여량으로서 LPS 자극 30분 전에 투여하였다. 부형제 대조군은 동일한 방식으로 투여하였다.
LPS 투여 90 분 후에, 혈액 시료는 마우스로부터 취하였다. 미리, 90분 시점은 경시적 실험에 의한 동물 모델에서 TNF 알파 발현의 피크로서 확인되었다.
LPS 마우스에서의 사이토카인 수준에 대한 CDK 억제제로 약리학적 처리의 효과는 하기 기술된 바와 같은 상업용 ELISA 분석으로 분석하였다.
LPS 동물로부터 혈액 시료(~500 ㎕/동물)은 심장 천자 후 30 분 동안 젖은 얼음으로 배양하였다. 그 후에, 시료는 13.000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 혈청은 덩이로부터 분리하고 -80 ℃에서 냉동 저장하였다.
시료 중에 TNF 알파 및 IL6의 혈청 농도는 제조업자의 지시서에 따라 상업용 ELISA 키트 (Natutec)를 사용하여 측정하였다.
생물학적 실시예 8 : 신경 부분 손상 ( SNI ) - 만성 신경병증성 통증의 모델
다음은 신경 부분 손상 (SNI) - 마우스의 만성 신경병증성 통증의 모델를 수행하는 한 가지 가능한 방법을 기술한다.
염증성 및 신경병증성 통증을 분석하기 위한 여러 가지 동물 모델이 알려져 있다. 상기 모델은 신경 병소 (예, 신경 부분 손상, SNI)의 유발 후, 또는 유해 자극에 대한 노출(예, 포르말린 또는 카라기난의 주사)후에 상기 처치(intervention)에 의해 유발되는 통증의 표시는 정량화 가능한 거동 구성요소, 예를 들어 본 프레이 모발에 의한 기계적 자극에 (또는 레이저 광원 또는 리킹 거동을 사용하는 열적 자극에) 대한 발 철회 역치(paw withdrawal threshhold)에 의해 측정되는 공통적인 특징을 공유한다. 이들 반응은 인간에서 기계적 및 열적 알로디니아 (기계적 자극에 대한 과민성) 또는 통각 과민과 동일한 것으로 해석된다.
신경 부분 손상(Decosterd 및 Woolf에 의해 개발된 바와 같은 SNI 모델 (Decosterd, I., Woolf, C. J., Pain 2000, 87, 149-158)은 임상적으로 관련된 신경 병소의 유발 및 외과적 처리, 이후의 거동 실험(예, von Frey 분석)을 특징으로 한다. 상기 모델은 장딴지 신경을 무손상으로 남기는 두 가닥의 좌골 신경 (즉 정강 및 통상의 장딴지 신경)의 면과 결찰로 이루어진 통상의 신경 손상 모델을 구성한다. SNI 모델은 신경병증성 통증의 특징을 밀접하게 모방하는 기계적 및 한냉 과민성의 초기 (24 시간 미만), 지속성 및 실질적 변화를 생기게 한다. 이들 유형의 신경 손상을 가진 동물은 신경병증성 통증에 의해 보고된 것들과 유사한 기계적 자극 (무해 자극 통증)으로 병적 통증 감각 및 과민성을 일으키는 것으로 나타났다.
대안적으로, 마우스의 포르말린 분석은 염증성 및 신경병증성 통증에서 통각의 타당한 및 신뢰할 만한 거동 모델이다. 다양한 부류의 진통제에 민감성이 있다 (Hunskaar, S., Hole, K., Pain 1987, 30, 103-114). 유해한 자극은 좌측 뒷발 (피하 또는 발바닥 사이)의 등쪽 표면의 피부 아래 10㎕ 희석된 포르말린 (식염수 중 2%)로 이루어진다. 반응은 감염된 발의 리킹(licking) 및 플린칭(flinching)이다.
카라기난 분석을 위하여, 마우스의 단일 뒷발 (동측성 발)에 25㎕의 1% 카라기난 (식염수 중)의 피하 주사가 적용된다. 이후의 감염은 발의 (기계적 및 열적 자극에 대한) 장기간 팽창 및 과민성을 생기게 한다. 카라기난 분석은 시험 화합물의 항염증성 활성을 예측하는데 사용되는 표준 실험실 분석이다. 발 부종 측정 및 하그리브스 분석(광원을 통한 열적 자극으로 인한 발의 철회)가 판독을 위해 사용된다.
본 발명에 관하여, 염증성 및 신경병증성 통증의 진전에 대한 화학식(I)에 따른 사이클린 의존성 카나아제 (CDK) 억제 화합물의 투여 효과는 카라기난 및 포르말린 분석에서 SNI 모델에서 분석된다. 실험 절차 및 결과는 이하에 상세히 기술된다.
신경 부분 손상( SNI ) - 만성 신경병증성 통증의 모델
상술한 바와 같이, 신경 부분 손상(SNI) 모델은 장딴지 신경을 무손상으로 남기는 실험 동물의 좌골 신경 (정강 및 통상의 종아리 신경)의 3개의 말단 가지 중 두 개의 병소를 포함한다. SNI는 무손상 장딴지 신경 피부 영역에서 기계적 및 열적 무해자극 통증을 생기게 한다 (Decosterd, I., Woolf, C.J., Pain 2000, 87, 149-158; Tsujino, H. et al ., Mol. Cel. Neurosci. 2000, 15, 170-182).
야생형 마우스 (균주 C3HeB/FeJ) (나이, 성 및 체중 부합)는 외과적 조제 전에 4 ㎕/g에서 1:1:2의 비로 Hypnorm (0.315　mg/ml 시트르산 펜타닐 +　10　mg/ml 플루아니손; 쟌센)/Hypnovel (5　mg/ml 미다조람; Roche Applied Sciences)/물로 마취시켰다.
다음에, 좌골 신경: 통상의 종아리, 정강 및 장딴지 신경의 3개의 종말 가지를 노출하는, 무릎 수준 바로 위에 모든 마우스의 동측성 우측 뒷다리에서 무균 예방조치 하에 절개를 행하였다. 통상의 종아리 및 정강 신경은 7/0 실크로 단단하게 결찰하고
Figure pct00028
의 디지털 신경주를 제거하는 결찰에 먼 쪽으로 절단하였다. 장딴지 가지는 절차 중에 미접촉으로 잔류하였다 (여기에서는 "SNI ipsi"로 인용됨). 주요한 근육 및 피부는 봉합하고, 동물은 회복시키고 상처 치료를 했다. 동일한 마우스에서 반대 측면 좌측 뒷다리의 좌골 신경 가지는 노출하였지만 절개하지 않았다 (여기에서는 "SNI 반대 측면"으로 인용됨). 신경 부분 상처를 행한 마우스는 이후에 "SNI 마우스"로 인용된다.
수술 및 상처 치료로부터 회복 후에, SNI 마우스는 CDK-억제 화합물의 경구(p.o.) 주사를 받았다.
400㎕의 2% 하이드록스프로릴셀룰로오스, 0.25% 락트산 (85% 용액) 중에 용해된, 30mg/kg의 CDK 억제제는 von Frey 측정 (기계적 무해 자극 통증) 30분 전에 경구 적용에 의해 투여하였다. 음의 대조군으로서, 동량(400㎕)의 2% 하이드록스프로릴셀룰로오스, 0.25% 락트산(85% 용액) 부형제는 von Frey 측정 30분 전에 경구 적용에 의해 투여하였다.
억제제 또는 부형제의 주사, 및 본 프레이 분석에서 기계적 자극에 대한 발 철회 역치의 후속 측정은 107일 포스트 SNI에서 수행하였다. 기계적 자극에 대한 반사적 통각 반응은 각각의 주사 후 30분에 본 프레이 분석에서 측정하였다.
기계적 무해자극 통증의 진전에 대한 SNI 마우스에 CDK억제제의 투여 효과는 하기 기술된 바와 같이 본 프레이 분석에서 분석하였다.
본 발명의 화합물의 SNI 및 후속 투여를 행한 마우스는 본 프레이 분석에서 기계적 무해자극 통증 후 신경 상처 및 후 투여의 신호에 대해 시험하였다 (Decosterd, I., Woolf, C. J., Pain 2000, 87, 149-158). 이러한 분석은 통상 고통스럽지 않은 자극이 동물에 의해 불편하거나 통증으로 인식되는 기계적 역치를 결정한다. SNI ipsi 및 SNI contra 기선이 각각 확립된다.
SNI 마우스의 기계적 역치는 Chaplan, S. R. 등 (Journal of Neuroscience Methods, 1994, 53, 55-63) 및 Malmberg, A.B. and Basbaum, A. I. (Pain 1998, 76, 215-222)을 기본으로 하는 업-다운 방법을 사용하여 정량화 하였다.
마우스는 상부 및 플렉시 글라스 리드에 향하여 4개의 통기구를 가진 직경 약 9.5 cm, 높이 14 cm의 플렉시글라스 실린더에 넣었다. 실린더는 높은 메시 표면 (7 x 7 mm 평방)에 넣었다. 시험일 전에, 마우스는 시험 실린더에 1-2 시간 동안 순화시켰다. 시험일에 마우스는 실린더에 약 1 시간 동안 순화시키며, 여기서 순화시간은 마우스의 균주 및 이들을 이전에 시험했던 횟수와 같은 인자들에 의존한다. 일반적으로, 시험은 마우스가 조용하고 새로운 환경을 탐색하는 것을 정지하는 대로 시작할 수 있다.
마우스를 시험하기 위해, 필라멘트 2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 3.84, 4.08, 및 4.31 (힘 범위 = 0.04 내지 2.0 g)를 사용하였다. 3.61 mN 필라멘트를 먼저 적용시켰다. 상기 필라멘트는 한 발의 발바닥 표면에 조심스럽게 적용시키고, 굴곡시키고 2-4초 동안 그 위치에 유지하였다. 자극에 대한 양의 반응 (굴곡 반응)이 일어날 때마다, 다음의 더 약한 본 프레이 모발을 적용시켰으며; 음의 반응 (무반응)이 일어날 때마다 다음의 더 강한 힘을 적용시켰다. 시험은 반응에서 1차 변화 후 4번 이상의 자극에 대한 반응이 얻어졌을 때까지 계속하였다. 시험한 가장 높은 힘은 4.31이었다. 결정 역치는 2 g이었다.
일련의 점수 (즉, "굴곡 반응" 및 "무반응") 및 적용된 마지막 필라멘트의 힘은 Chaplan, S.R. 등 (Journal of Neuroscience Methods, 1994, 53, 55-63)에 기술된 바와 같은 기계적 역치를 결정하기 위하여 사용하였다. 결정된 역치는 동물이 시간의 50%에 반응하는 것으로 기대되는 값이다. 마우스는 본 프레이 측정을 수행한 후에 희생시켰다.
생물학적 실시예 9: 포르말린 분석 - 염증성 공정의 모델/염증성 및 만성 신경병증성 통증
다음은 마우스에서 포르말린 분석을 수행하는 한 가지 가능한 방법, 염증성 공정의 모델은 물론 염증성 및 만성 신경병증성 통증 분석을 나타낸다.
마우스에서 포르말린 분석은 통각의 타당한 및 신뢰할 만한 거동 모델이며 또한 다양한 부류의 진통제에 민감하다 (Hunskaar, S., Hole, K., Pain 1987, 30, 103-114). 유해한 자극은 좌측 뒷발에 10㎕ 희석된 포르말린 (식염수중 2%)의 피하 또는 발바닥 내부 주사이다. 이 반응은 주사된 발의 리킹(licking) 및 프린칭(flinching)이다. 이 반응은 두 개의 상을 나타내며, 이것은 염증성 과정의 두 개의 상이한 부분 (Abbott, F. V. et al ., Pain 1995, 60, 91-102), 초기/급성 상 0-5　분 후 주자, 및 나중/만성 상 5-30 분 후 주사를 반영한다. 다음 프로토콜은 실험을 수행하기 위한 한 가지 가능한 방법을 기술한다:
나이, 성 및 체중 부합성 야생형 마우스 (C3HeB/FeJ)가 이 분석에서 사용된다. 포르말린 주사 전에, 동물은 각각 10 마리 동물의 실험 그룹으로 불규칙하게 세분한다. 포르말린 주사 30분 전에, (400㎕)의 2% 하이드록스프로릴셀룰로오스, 0.25% 락트산 (85% 용액)의 적절한 투여량은 복강내 주사에 의해 투여할 수 있다.
포르말린 주사를 위하여 마우스는 운동에 의한 주사의 방해를 피하기 위하여 종이 타월로 유지한다. 주사된 뒷발은 엄지손가락과 집게 손가락 사이에 유지시키고, 10㎕의 포르말린(2%)을 해밀톤 주사기를 사용하여 발바닥의 뒷발 내에 두 개의 앞 원환체 사이에 피하(s.c.) 주사하였다. 포르말린- 및 억제제-처리된 마우스의 거동은 하기 기술되는 바와 같다.
포르말린 처리된 마우스의 거동, 즉 리킹 및 플린칭은 정해진 시간에 걸쳐 자동화 트래킹 시스템(Ethovision 3.0 Color Pro, Noldus, Wageningen, 네덜란드)에 의해 검색한다: 측정은 포르말린 주사 후 5분 개시하고 포르말린 주사 후 30분에 정지하였다. 이 시간 프레임은 통각과민인 포르말린 유발성 통각(통증)의 II상을 포함한다.
두 개의 상이한 형광염료가 주사된 뒷발 (황색 염료)(Lumogenyellow; BASF Pigment, Cologne, 독일) 및 반대쪽 발(청색 염료) (Lumogenviolet; Kremer Pigmente, Aichstetten, 독일)을 각각 국소적으로 만들기 위해 사용된다. 리킹 거동을 결정하기 위하여, 마우스는 CCD 카메라로 검색한다. 검색 및 기록 후에, 비디오는 EthoVision 소프트웨어 (Ethovision 3.0 Color Pro, Noldus, Wageningen, 네덜란드)를 사용하거나 또는 수동 분석에 의해 분석한다. 형광 도트 크기 및 형광 세기를 측정하고 리킹 및 바이팅(biting)을 통한 형광 도트 크기의 감소는 처리 대 미처리 발의 도트 크기 감소의 비교에 의해 자동으로 계산한다.
또 다른 분석 판독 변형으로서, 개개 동물의 리킹 거동은 비디오 파일로 수동으로 트래킹 하였다. 리킹 시간은 포르말린 주사 후 30분에 걸쳐 기록하고 3개의 상이한 리킹 영역 (등, 발바작, 발끝)을 위해 세분하였다. 전체 리킹 시간은 각각의 동물은 물론 각각의 실험 그룹에 대해 계산하고 또한 화합물 효능의 결정을 위한 인자로서 사용할 수 있다.
그 결과 포르말린 주사 정에 부형제 처리를 받은 마우스 (음의 대조군)는 포르말린 처리된 발에서 형광 도트 크기의 현저한 감소 및 지연된 리킹 시간을 나타낸 것으로 밝혀졌다.
반면, 리킹 시간의 감소 및 그 결과 포르말린 처리된 발의 형광 도트 크기의 비 현저한 감소는 시험 화합물/포르말린-처리된 마우스에서 관찰될 수 있었다. ㄷ동일한 효과, 즉 리킹 시간의 감소 및 형광 도트 크기의 약간의 변화는 Ikappa 키나아제 억제제로 처리된 대조 마우스에서 관찰되었다.
이러한 관찰은 CDK 억제제 처리된 마우스에서 감소된 염증성/만성 통증 인지를 위해 및 시험 화합물의 통각저하 효과를 위해 나타낸다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식(I)의 억제제 화합물, 그의 모든 토오토머 및 입체이성체을 포함하는, 그의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체:
    [화학식I]
    Figure pct00029

    상기 식에서,
    Ra는 H 또는 메틸이고;
    R1은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되며:
    카르보사이클릭 또는 -C1 -6 알킬-카르보사이클릭, 여기서 상기 카르보사이클릭 기는 사이클로헥실 또는 사이클로펜틸임;
    헤테로사이클릭 또는 -C1 -6 알킬-헤테로사이클릭기, 여기서 상기 헤테로사이클릭기는 피페리딘, 피페라진, 모르폴린 또는 피롤리딘임;
    아릴 또는 -C1 -6 알킬-아릴;
    헤테로아릴 또는 -C1 -6 알킬-헤테로아릴, 여기서 상기 헤테로아릴기는 피리딘, 티아졸 또는 티오펜임;
    여기서 전술한 카르보사이클릭기, 헤테로사이클릭기, 아릴기 또는 헤테로아릴기의 어느 것은 독립적으로 하기 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 기에 의해 임의로 치환될 수 있음:
    할로, OH, NH2 및, 카르보사이클릭 및 헤테로사이클릭 기의 경우, =O; 또는
    C1 -4 알킬, -O(C1 -4 알킬), -NH(C1 -4 알킬), -NHC(O)(C1 -4 알킬), -S(C1 -4 알킬), -SO(C1-4 알킬), -SO2(C1 -4 알킬) 또는 -SO2NH(C1 -4 알킬), 이들 중 어느 것은 할로 또는 OH에 의해 추가로 치환될 수 있음; 또는
    R3, -C1 -4 알킬-R3, OR3, NHR3, -NHC1 -4 알킬-R3, -OC1 -4 알킬-R3, SR3, SOR3 또는 SO2R3;
    여기서 R3는 아릴기, 헤테로아릴기, 카르보사이클릭기 또는 헤테로사이클릭기, 이들 중 어느 것은 하나 이상의 할로, C1 -4 알킬, -O(C1 -4 알킬), NH2, -NH(C1 -4 알킬), -C(O)(C1 -4 알킬), -NHC(O)(C1 -4 알킬) 기, 이들 알킬기의 어는 것은 할로 또는 OH에 의해 더욱 치환될 수 있음;
    각각의 R2는 독립적으로 할로, OH, NH2; 또는
    C1 -4 알킬, -O(C1 -4 알킬), -NH(C1 -4 알킬), -C(O)(C1 -4 알킬), 이들 중 어느 것은 할로 또는 OH로 추가로 치환될 수 있음; 또는
    R4, -C1 -4 알킬-R4, OR4, NHR4, -NHC1 -4 알킬-R4, -OC1 -4 알킬-R4, SR4, SOR4 또는 SO2R4이며;
    여기서 R4는 아릴기, 헤테로아릴기, 카르보사이클릭기 또는 헤테로사이클릭기이며, 이들 중 어느 것은 하나 이상의 할로, OH, C1 -4 알킬, -O(C1 -4 알킬), NH2, -NH(C1-4 알킬), -C(O)(C1 -4 알킬), -NHC(O)(C1 -4 알킬)기로 치환될 수 있으며, 이들 알킬기 중 어느 것은 할로 또는 OH로 치환될 수 있으며;
    x는 0-4이다.
  2. 제 1항에 있어서, Ra가 H인 화합물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, x가 2인 화합물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, R3가 할로, C1 -4　알킬, C1 -4 할로알킬, C1 -4　알콕시 또는 C1 -4　할로알콕시인 화합물.
  5. 제 4항에 있어서, 두 개의 R3 그룹이 존재하며, 이중의 하나가 할로이고 다른 하나가 메톡시 또는 할로메톡시인 화합물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 C5　또는 C6　카르보사이클릭, C5　또는 C6　헤테로사이클릭, -C1 -3　알킬-페닐, -C1 -3　알킬(C5　또는 C6 헤테로아릴), -C1 -3　알킬(C5　또는 C6　카르보사이클릭), -C1 -3　알킬(C5　또는 C6　헤테로사이클릭), 페닐 또는 C5　또는 C6　헤테로아릴이며, 여기서 전술한 사이클릭 기의 어느 것이 제1항에 정의된 바와 같이 임의로 치환될 수 있는 것인 화합물.
  7. 제 6항에 있어서, R1이 사이클로헥실, 사이클로펜틸, -C1 -3 알킬(사이클로헥실), -C1 -3　알킬(사이클로펜틸)이거나; 또는 R1은 피페리딘, 피페라진, 모르폴린 및 피롤리딘, -C1 -3　알킬(피페리딘), -C1 -3　알킬(피페라진), -C1 -3　알킬(모르폴린), -C1 -3　알킬(피롤리딘)이거나; 또는 R1은 페닐 또는 -C1 -3　알킬-페닐이거나; 또는 R1는 피리딘, 티아졸, 티오펜, -C1 -3　알킬(피리딘), -C1 -3　알킬(티아졸) 또는 -C1 -3　알킬(티오펜)이며, 여기서 전술한 사이클릭기의 어느 것이 제1항에 정의된 바와 같이 임의로 치환될 수 있는 것인 화합물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 -C1 -3　알킬(카르보사이클릭), -C1 -3　알킬(헤테로사이클릭), -C1 -3　알킬(아릴) 또는 -C1 -3　알킬(헤테로아릴)기이고, 상기 -C1 -3　알킬 링커 부분이 -CH2-; -CH(CH3)-; -CH2CH(CH3); -CH(CH3)CH2-; 또는 -CH2CH2-인 화합물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 비치환되거나 또는 하기로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환되며:
    할로, OH, NH2 및, 카르보사이클릭 및 헤테로사이클릭기의 경우, =0; 또는
    -C1 -4　알킬, -0(C1 -4　알킬), -NH(C1 -4　알킬), -NHC(0)(C1 -4　알킬), 이들 중 어느 것은 할로 또는 OH 에 의해 추가로 치환될 수 있음; 또는
    R3, -C1 -4　알킬-R3, OR3, NHR3, -NHC1 -4　알킬-R3, -OC1 - 4알킬-R3;
    여기서 R3는 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭이며, 이들 중 어느 것은 하나 이상의 할로, OH, NH2　또는 C1 -4　알킬 또는 -0(C1 -4　알킬)기로 치환될 수 있으며, 이들 알킬기의 어느 하나는 할로로 치환될 수 있는 화합물
  10. 제 9항에 있어서, R1이 비치환되거나 또는 NH2, 메틸, 에틸, 메톡시, 에톡시, 클로로, 플루오로, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, =0 (카르복실릭 및 헤테로사이클릭기의 경우), NHC(O)Me, R3, NHR3, 및 NHCH2R3로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환되며,
    여기서 R3가 아릴, 헤테로아릴, 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 기이고, 이중의 어느 것이 하나 이상의 할로, OH, NH2, 또는 C1 - 4알킬 또는 -O(C1 - 4알킬) 기로 치환될 수 있으며, 이러한 알킬기의 어느 것이 할로로 치환될 수 있는 화합물.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, R3가 피페리딘, 4-메틸피페리딘, 피페라진, 4-메틸피페라진, 티에닐, 예를 들면 티엔-2-일, 티아졸릴, 예를 들면 티아졸-2-일, 피리디닐, 예를 들면 피리딘-2-일, 피리딘-3-일 또는 피리딘-4-일, 및 페닐인 화합물.
  12. 제 1항에 있어서,
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로헥산카르복사미드;
    2-사이클로헥실-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)아세트아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)피페리딘-4-카르복사미드;
    4-아미노-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로헥산-카르복사미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-5-옥소피롤리딘-3-카르복사미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(4-메톡시페닐)-아세트아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-페닐아세트아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(피리딘-4-일)아세트아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(티오펜-2-일)아세트아미드;
    (2S)-N-(4-(5-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-페닐프로판아미드;
    (2S)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(4-메톡시페닐)-프로판아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(피리딘-3-일)프로판아미드의 이성체들;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(6-메톡시피리딘-3-일)아세트아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(피리딘-4-일)프로판아미드의 이성체들;
    (2R)-N-(4-(5-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(티오펜-2-일)프로판아미드의 이성체들;
    2-(2-클로로피리딘-4-일)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)아세트아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)아세트아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-3-(피리딘-4-일)부탄아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-((피리딘-4-일)메틸)-프로판아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-3-(피리딘-3-일)부탄아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-((피리딘-3-일)메틸)-프로판아미드;
    trans -3-아세트아미도-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)-피리딘-2-일)사이클로헥산카르복사미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)프로판아미드;
    2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)벤질)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)-피리딘-2-일)프로판아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-3-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)부탄아미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-4-(피리딘-2-일아미노)-cis-사이클로헥산카르복사미드;
    N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-2-(2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일)아세트아미드;
    cis-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-4-(피리딘-4-일아미노)-사이클로헥산카르복사미드;
    cis-3-아세트아미도-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로-헥산카르복사미드;
    (1R,3S)-3-아세트아미도-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로펜탄카르복사미드;
    cis-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-4-(티아졸-2-일아미노)-사이클로헥산카르복사미드;
    cis-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-4-(페닐아미노)-사이클로헥산카르복사미드;
    (1R,3S)-3-(벤질아미노)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로펜탄카르복사미드;
    cis-4-(벤질아미노)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로-헥산카르복사미드;
    (1R,3S)-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)-3-(페닐아미노)-사이클로펜탄카르복사미드;
    (1R,3S)-3-아세트아미도-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로헥산카르복사미드;
    (1S,3R)-3-아세트아미도-N-(4-(4-플루오로-2-메톡시페닐)피리딘-2-일)사이클로펜탄카르복사미드;
    로부터 선택된 화합물, 또는 모든 토오토머 또는 입체이성제를 포함하는, 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 다형체.
  13. a) 하기 화학식(II)의 화합물을 HATU 커플링 방법을 사용하여 하기 화학식(III)의 화합물과 반응시키거나:
    Figure pct00030

    Figure pct00031

    상기식에서,
    Ra, R1 및 x는 화학식(I)에서 정의된 바와 같으며; 또는
    b) 하기 화학식 (VI)의 화합물을 부크왈드 타입 반응을 사용하여 하기 화학식 (VII)의 화합물과 반응시키거나:
    Figure pct00032

    Figure pct00033

    상기식에서,
    R1, R2 및 x는 화학식(I)에서 정의된 바와 같고,
    X는 이탈기, 특히 클로로이며; 또는
    c) 화학식(I)의 보호된 화합물을 탈보호하거나; 또는
    d) 화학식(I)의 화합물을 화학식(I)의 또 다른 화합물로 전환시키는 단계를
    포함하는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 화합물의 제조방법.
  14. 의약에서, 특히 사이클린 의존성 키나아제 특히 CDK9의 활성에 의해 매개되는 질환 및 증상의 치료에서 사용되는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 화합물.
  15. 사이클린 의존성 키나아제 특히 CDK9의 활성에 의해 매개되는 질환 및 증상의 치료용 약제의 제조에서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 화합물의 용도.
  16. 사이클린 의존성 키나아제 특히 CDK9의 활성에 의해 매개되는 질환 및 증상의 치료방법으로, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 화합물의 유효량을 이러한 이러한 치료가 필요한 대상에게 투여함을 포함하는 방법.
  17. 제 14항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 화합물, 용도 또는 방법에 있어서, 상기 질환 또는 증상이 통증, 감염성 질환, 면역 질환, 증식성 질환, 예를 들어 암, 감염성 질환, 심혈관 질환 또는 신경변성 질환인 화합물, 용도 또는 방법.
  18. 활성성분으로서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 화합물을 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제와 함께 포함하는 약학적 조성물.





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