KR20120113694A

KR20120113694A - 생체적합성 매개 고분자와의 화학적 결합을 이용한 분자 영상화 시스템

Info

Publication number: KR20120113694A
Application number: KR1020120108996A
Authority: KR
Inventors: 이동윤; 정민진
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2012-10-15

Abstract

본 발명은 대상세포의 분자영상화를 위한 효과적인 시스템에 관한 것으로, 양쪽 말단에 서로 다른 작용기를 가지는 생체적합성 매개 고분자 물질을 이용하여 대상세포와 조영제를 화학적으로 연결시키는 방법을 이용한 분자영상화 방법 및 이러한 화학적 결합 구조의 분자영상용 복합체 등에 관한 것이다.

Description

생체적합성 매개 고분자와의 화학적 결합을 이용한 분자 영상화 시스템{A Molecular Imaging system using chemical conjugation of Biocompatibility Polymer Mediator}

본 발명은 대상세포의 분자영상화를 위한 효과적인 시스템에 관한 것으로, 양쪽 말단에 서로 다른 작용기를 가지는 생체적합성 매개 고분자 물질을 이용하여 대상세포와 조영제를 화학적으로 연결(chemical conjugation)시키는 것을 특징으로 하는 분자영상화 방법 및 이러한 화학적 결합 구조의 분자영상용 복합체 등에 관한 것이다.

분자영상(Molecular Imaging)은 최근 급속히 발전하고 있는 분야로, 세포 내에서 일어나는 여러 분자수준의 변화, 즉 유전자의 발현, 생화학적 현상, 생물학적 변화들을 영상으로 평가하는 기법이다. 분자영상법은 분자세포생물학과 첨단영상 기술이 접목하여 가능하게 되었으며 의학, 유전학, 분자생물학,세포학, 화학, 약학, 물리학, 전산학, 의공학, 영상의학, 핵의학 등이 통합하여 생긴 새로운 분야이다.

기존의 의학영상 방법이 비특이적인 물리적, 화학적 성상의 차이를 이용하여 영상신호를 만들고 이 신호의의미를 임상적으로 추정 이용하는 데 반하여 분자영상법에서는 분자 수준, 유전자 수준의 작용에서 나오는 영상신호를 이용하기 때문에 보다 특이적 영상이라는 특징이 있다.

이러한 분자 영상화 기법은 일차적으로 의료 분야에서 유전자 치료나 인체의 각 기능을 평가하는 데 필요한 기반기술이며 더 나아가서는 생명현상에 대한 정보를 제공함으로써 생물공학 분야에 일대 혁신을 가져올 핵심 기반기술이다. 그리고 최근 20~30년간 생화학 및 분자생물학의 발전과 영상기법의 발전이 상승작용을 하여 앞으로 미래 생의학분야 연구의 지평을 여는 중요한 분야로 자리잡을 것으로 전망된다.

한편, 당뇨병은 만성적인 고혈당을 가진 중요한 특징으로 하는 질환으로서 이에 따라 뇌졸중, 심장마비, 실명, 신부전증, 신경병증 및 하지절단과 같은 합병증이 발병하여 사회적, 경제적으로 중요한 질병이다.

현재까지 당뇨병을 완치시킬 수 있는 치료법은 없으며, 인슐린 강화요법을 하더라도 고혈당으로 인한 당뇨병의 합병증을 줄일 수는 있으나, 완전히 막을 수는 없는 것이 현실적이다. 최근 당뇨병의 완치에 도전하고 있는 새로운 방법들로 가장 생리적인 방법은 췌장 또는 췌도세포 이식이라고 할 수 있는데, 췌도세포 이식의 경우 췌장이식에 비해 시술이 간편하고 시험관 내에서 면역 및 증식에 대한 조작이 가능하며, 반복시술이 가능한 장점이 있어 췌도 세포이식을 권장하고 있는 추세이다.

하지만 췌도세포 이식 후 이식된 췌도 세포가 10% 정도 남아 있을 때 인지하는 문제점을 가지고 있다. 그때는 췌도세포를 이식하기 늦은 상태이고 그렇게 때문에 이식한 췌도 세포의 생존 여부를 확인할 수 있는 분자영상이 필요하다.

그러나, 췌도 세포 이식이 활발한 현재, 췌도 세포 이식 후 췌도 세포의 위치와 생존 여부를 확인할 효과적인 방법이 없었다.

췌도 세포의 위치와 생존 여부의 파악은 췌도 세포 이식에 중요한 문제로 이식한 췌도 세포가 10%가 남아있어도 이 기능은 문제 없지만, 10% 남아있는 췌도 세포는 그 기능이 빠르게 떨어지기 때문에 췌도 세포의 위치 확인이 중요하다.

이런 경우에는 지금까지, 조영제가 췌도 세포 안으로 들어가는 방법, 즉 산화철 조영제를 세포에 침습시켜 췌도세포의 위치를 확인하고 있다. 그렇지만 기존 방식에는 몇가지 문제점을 가지고 있다.

첫째, 산화철 조영제가 세포 안에 오랜시간 동안 머물러 독성의 문제에 영향을 주어 생존율에 문제가 된다. 이로 인해 췌도 세포의 존재 여부를 알기 위해 세포에 무리를 주는 결과로 그 효과를 위해 다른 한쪽에 문제점이 생기는 결과를 초래한다.

둘째, 이 산화철 조영제는 나노 사이즈로 생체에 영향을 주지 않기 때문에 걱정 없을 것이라 생각 들지만 이 산화철 조영제는 서로 붙으려는 성질이 강하기 때문에 특히나 규칙 없이 24시간 동안 세포와 산화철 조영제를 미디아 상에서 세포로 침습하는 방식은 세포 안에서 산화철 조영제가 어떤 형태로 존재하는지 알 수 없고 이는 또한 산화철 조영제가 서로 얽혀 그로 인해 사이즈는 나노 사이즈보다 커지게 되고 이것은 세포 생존률에 영향을 미치게 된다.

셋째, 24시간동안 세포와 산화철 조영제를 미디아 조건에서 인큐베이션한 방식을 100% 라벨링이 되지 않는다. 이 사실은 기존 연구에서 보고된 바가 있으며 이식한 췌도세포의 분포와 MRI로 확인한 결과 나타나는 췌도세포의 분포가 다름을 확인하였고 이것이 문제점으로 대두되고 있다.

이에 본 발명자들은 생체적합성 매개 고분자 물질을 이용하여 세포와 산화철 조영제를 연결시켜주는 화학적인 방법으로 기존의 방법인 세포 안으로 침습하는 방법이 아닌 세포 표면에 산화철 조영제를 연결시켜주는 방법을 개발코자 예의 노력한 결과, 서로 다른 작용기를 가진 PEG를 사용하여 작용기 NHS에는 췌도 세포와 반응하고 다른 한쪽 반응기 말레이미드에는 조영제의 폴리사카라이드와 반응하게 함으로써 세포와 조영제를 서로 화학적으로 연결시켜 줄 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 종래 분자영상에 사용되는 조영제의 문제점을 해결하기 위해 새로운 방법의 분자영상화 기술에 관한 것으로,

본 발명의 주된 목적은 생체적합성 매개 고분자를 이용하여 산화철 나노입자 조영제와 대상세포를 화학적으로 연결시킨 구조를 가지는 분자영상용 복합체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생체적합성 매개 고분자를 이용하여 대상세포의 표면을 개질시키는 것을 특징으로 하는, 상기 분자영상용 복합체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분자영상용 복합체를 이용한, 대상세포의 분자영상화 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 서로 다른 작용기를 양쪽 말단에 가지는 생체적합성 매개 고분자의 한 쪽 말단은 개질용 고분자 또는 다당류로 표면개질된 산화철계 나노입자(조영제)와 결합되어 있고; 다른 한 쪽 말단은 대상세포 표면과 화학적으로 결합되어 있는 구성을 가지는 것을 특징으로 하는 분자영상용 복합체를 제공한다.

본 발명의 사용에 바람직한 분자영상 기법은 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)이다.

상기 분자영상용 복합체를 이루는 생체적합성 매개 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 알지네이트, 하이드로젤, 피브리노겐 젤, 콜라젠, 젤라틴, 카이토산, 알지네이트, 히알루로닉산, PLGA, PEI, 및 PEO로 구성된 군에서 선택할 수 있고, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용한다.

특히, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 양 쪽 말단에 서로 다른 작용기를 가지는데(헤테로 작용기), 다음의 변형된 형태 중 어느 하나의 구성을 가질 수 있다:

본 발명의 일 구체예에서, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 한쪽 말단은 말레이미드기를 가지고 있고 다당류로 표면개질된 산화철계 나노입자와 결합되어 있고; 다른 한쪽 말단은 NHS기를 가지고 있고 대상세포 표면과 화학적으로 결합되어 있는 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.

한편, 산화철계 나노입자(SPIO, 조영제)의 표면개질에는 개질용 고분자 또는 다당류를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 다당류를 사용한다.

상기 개질용 고분자는 PEG, 알지네이트, 하이드로젤, 피브리노겐 젤, 콜라젠, 젤라틴, 카이토산, 알지네이트, 히알루로닉산, PLGA, PEI, 및 PEO로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 고분자일 수 있다.

또한, 상기 다당류는 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 황산콘드로이친(chondroitin sulfate), 덱스트란(dextran), 덱스트란 설파이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 헤파린 설파이텀(heparin sulfatem), 헤파란 설파이트(heparan sulfate), 키토산(chitosan), 젤란검(gellan gum), 잔탄검(xanthan gum), 구아검(guar gum), 수용성 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives) 및 카라기난(carrageenan)으로 구성된 군에서 선택될 수 있는데, 바람직하게는 헤파린(heparin)일 수 있다.

또한, 상기 대상세포는 분자영상화 대상이 될 수 있는 세포라면 특별한 제한은 없다. 예를 들어, 췌도 세포, 줄기 세포, 역 분화 유도 줄기세포 (IPS), 지방 세포, 연골 세포, 간 세포, 또는 심근 세포 등일 수 있다. 특히, 본 발명은 특정 세포의 이식 후의 병리 상태를 확인하기 위해 분자영상화 방법을 적용하는 경우에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서는 복합세포의 일종인 췌도세포를 대상세포로 사용하였다.

그러므로, 본 발명은 말레이미드기 및 NHS기를 양쪽 말단에 각각 가지는 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 말레이미드기는 헤파린으로 표면개질된 산화철계 나노입자와 화학적으로 결합되어 있고; NHS기는 췌도세포 표면의 아민기와 화학적으로 결합되어 있는 구성을 가지는 것을 특징으로 하는 췌도세포 분자영상용 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 대상세포의 분자 영상화에 이용하기 위하여,

개질용 고분자 또는 다당류로 산화철 나노입자 표면을 개질하는 단계,

대상세포와 생체적합성 매개 고분자를 화학적으로 결합시키는 단계, 및

상기 표면개질된 산화철 나노입자와 상기 대상세포와 결합된 생체적합성 매개 고분자를 화학적으로 결합시키는 단계를 포함하는, 상기 분자 영상용 복합체의 제조방법을 제공한다.

각각의 단계에서 사용되는 구성성분은 앞서 설명한 바와 같다.

또한, 본 발명은 서로 다른 작용기를 양쪽 말단에 가지는 생체적합성 매개 고분자를 매개하여, 산화철계 나노입자의 조영제와 대상세포를 화학적으로 연결시켜 사용하는 것을 특징으로 하는, 대상세포의 분자 영상화 방법도 제공한다.

상기 방법에서 사용되는 각각의 구성에 대한 설명 역시 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명은 세포에 적용되는 종래 조영제의 문제점을 해결할 수 있다. 세포에 생체적합성 매개 고분자 물질을 이용하여 세포 표면개질과 동시에 상기 물질이 대상세포와 조영제를 연결시킴으로써, 기존의 세포 침습적 조영제가 세포에 미치는 독성여부를 해결하여 세포의 생존율을 높여주고, 대상세포에 대해 100% 라벨링이 가능하다.

따라서, 본 발명은 매우 안전하고 효율적인 분자영상화를 통해, 질환의 진단 또는 특정 세포 이식 후 병리상태 확인 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 분자영상용 복합체의 개략적인 구조를 도시한 그림이다.
도 2는 다당류로 표면을 개질한 산화철 조영제의 투과 전자 현미경 사진이다.
도 3은 표면을 개질한 산화철 조영제에 코팅된 다당류의 존재를 확인하기 위한 우라닐 아세테이트 염색사진이다.
도 4은 다당류로 표면을 개질한 산화철 조영제의 MRImage 결과이다.
도 5는 췌도세포 표면에 존재하는 산화철 조영제 존재 확인을 위한 플시안블루 염색사진 및 전자현미경 사진이다.
도 6은 조영제에 FITC 형광 Dye를 붙인 후 본 발명의 복합체를 공초점 현미경으로 확인한 사진이다.
도 7은 본 발명의 복합체에 대한 MRImage 결과이다.
도 8은 MRI상 T2감쇄 신호정도를 확인한 결과 그래프이다.
도 9는 산화철 조영제 농도에 따른 췌도세포의 MRImage 결과이다.
도 10은 조영제의 농도별 처리에 따른 췌도세포 생존율을 비교한 결과이다.
도 11은 본 발명의 복합체를 마우스에 이식한 직후 및 한 달 후의 MR T2 이미지이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 특정 세포의 체내 이식 후의 상태를 확인하는 것을 포함한다.

"생체적합"이란 바람직하지 않은 후속효과 없이 인체와 상호작용하는 물질을 의미한다.

"분자영상법"은 세포 내에서 일어나는 여러 분자수준의 변화, 즉 유전자의 발현, 생화학적 변화, 생물학적 변화를 영상으로 분석 평가하는 기법으로, 분자생물학과 첨단 영상기술이 접목하여 가능하게 되었으며 의학, 유전학, 분자생물학, 세포학, 화학, 약학, 물리학, 전산학, 의공학, 영상의학, 핵의학의 기술들이 집약되어 있는 기술이다. 분자영상법을 이용함으로써 세포의 근원적 현상, 생체기전을 영상화하는 데 시간적 정보와 공간적 정보를 함께 평가하는 것이 가능하여 질병에 대한 이해도가 증가하고, 뿐만 아니라 종양, 뇌신경 질환, 면역 질환 등 많은 난치성 질병의 조기 진단이 가능하다. 또한 특정 분자, 유전자, 신호전달체계에 작용하는 신약의 개발에 이용될 수 있으며 외부에서 주입된 유전자가 목표 장기나 조직에서 발현되는 것을 비침습적으로 영상화하고 쉽게 정량화할 수 있으므로 유전자 치료에 크게 기여한다.

"대상세포"는 임의의 병리 상태의 존재 등을 확인하기 위해 조영제를 이용하여 분자영상화 하려는 타겟이 되는 세포로서, 본 발명의 일 구체예에서는 췌도세포의 이식 후 생존 여부를 확인하려는 목적으로 분자영상법을 이용한다.

"조영제"란 어떤 특정 장기나 조직이 주위와 뚜렷한 대조를 이루어 관찰하기 쉽도록 하기 위해 쓰이는 물질로, 일반적으로 음성조영제와 양성조영제로 나뉘어진다. 음성조영제는 주위의 조직보다 X선, 방사선 등을 더 많이 흡수해서 영상을 나타내고, 양성조영제는 그 반대의 경우이다.

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 생체적합성 매개 고분자 물질을 이용하여 대상세포와 산화철 조영제를 연결시켜주는 화학적인 방법으로, 세포 안으로 침습하는 기존의 방법이 아닌 대상세포 표면에 산화철 조영제를 연결시켜주는 방법을 처음으로 고안하였다.

본 발명은 분자영상(Melecular Imaging)과 관련한 기술이다.

분자영상은 세포 내에서 일어나는 여러 분자수준의 변화를 영상으로 평가하는 기법으로, 분자영상화 기술은 크게 3가지 접근방법으로 연구되고 있는데, 광학적 영상화기법(Optical imaging), 핵의학적 영상화 기법(Nuclear imaging), MRI(Magnetic resonance imaging)를 위시한 CT, 초음파(US) 등 방사선과적 영상기법 등이다.

광학적 영상화 기법은 리포터 유전자로 형광단백질(fluorescent protein)을 이용한 방법과 luciferase라는 효소를 사용하는 발광(bioluminescent) 영상법이 가장 널리 사용되고 있다.

핵의학적 영상화 기법을 이용한 연구로 UCLA의Gambhir와 Memorial Sloan－Kettering CancerCenter의 Tjuvajev가 최초로 리포터 유전자 영상법을 개발하였으며 이들은 Herpes simplex virus 1형의 thymidine kinase(HSV1－TK) 유전자를 특정 세포 내로 이입시키고 이 유전자의 발현을 방사성 표지 기질과 PET를 이용하여 영상화한 방법을 발표하였다. TK를 이용하여 만든 영상은 PET 영상으로서 광학영상법과는 달리 투과력이 좋아 단층 영상의 획득이나 정량화가 용이하다.

그리고, MR, CT, 초음파를 이용한 방사선과적 영상화 기법이 있으며 이러한 기존의 진단방사선과 방법은 해상력이 높고 심층부까지 영상화가 가능한장점이 있다.

본 발명에서는 바람직하게 방사선과적 분자 영상화기법이 이용된다. 특히 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)을 이용하는 것이 가장 바람직하다.

자기공명영상(MRI)은 세포를 이미지하기에 적합한 분자영상기술로 MRI는 양성자에서 나오는 신호를 측정하는 것으로 어떤 조직이든 횡단면, 관상면 및 시상면 등을 필요한 각도로 자유자재로 촬영할 수 있는 진단영상 방법으로 기존 Xray 관련 영상기기의 방사능 노출에 따른 위험이 없는 장점을 가지고 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명은 일 관점에서,

서로 다른 작용기를 양쪽 말단에 가지는 생체적합성 매개 고분자의 한 쪽 말단은 다당류로 표면개질된 산화철계 나노입자와 결합되어 있고, 다른 한 쪽 말단은 대상세포 표면과 화학적으로 결합되어 있는 구성을 가지는 것을 특징으로 하는 분자영상용 복합체에 관한 것이다.

산화철계 나노입자(조영제)

본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있는 분자영상법인 MRI 영상의 선명도 및 정확도를 증가시키기 위해 조영제를 사용하는데, 1988년 처음 MRI 조영제(contrast agent)가 시판된 이후 X-ray 촬영 시 확인 불가능했던 부분이 관찰 가능하게 되면서 특히 MRI 조영제 중 나노기술을 이용한 초상자성 산화철(superparamagnetic iron oxide, SPIO)계열을 기본으로 하는 콜로이드 나노입자 용액은 조영효과가 뛰어나 MRI 조영제로써 연구 가능성 및 효과의 잠재성이 크다. 또한 현재의 연구동향에 발맞추어 민감도가 높은 진단 방법을 SPIO 조영제에 추가적으로 접목함으로써 보다 정확하고 선명한 진단이 가능하도록 하는 연구나, 진단과 치료를 동시에 수행하며 치료 효과까지도 바로 평가할 수 있는 형태의 조영제 개발이 활발할 것으로 보인다.

본 발명에서 조영제로 사용되는 물질은 산화철계 나노입자로서, 바람직하게는 초상자성 산화철계 나노입자(Superparamagnetic iron oxide nanoparticle,SPIO)이다. "산화철계 나노입자"라는 용어는 본 명세서에서 "산화철 나노입자", "산화철 조영제" 또는 "조영제" 등의 용어와 혼용하여 사용되고 있다.

산화철 나노입자는 자화되는 특성을 가지고 있어서 생의학적으로 매우 큰 활용가치를 가지고 있다. 산화철은 나노 몰농도에서도 높은 자기공명 효율을 나타내므로 MRI 조영제로 많이 연구되고 있다.

특히, 초상자성 산화철 나노입자은, 자기공명영상(MRI) 진단, 약물운반 및 치료와 같은 생물의학 분야에서 최근에 각광을 받고 있다. SPIO은 그의 초상자성 특성 때문에, 종래의 상자성 Gd-계열의 조영제 보다 MRI에서 높은 조영능력을 발휘할 수 있다. 이러한 초상자성 산화철 입자는 가돌리늄(Gd) 및 망간 (Mn)보다 더 긴 혈액 반감기를 가지며, 자기공명 효율이 상자성 복합체보다 10~100배 정도 더 높게 나타남으로써 더 작은 양을 사용할 수 있다는 장점이 있다.

상기 초상자성 산화철 나노입자는 일반적으로 알려져 있는 공침법, 졸-겔법, 열분해법 또는 에멀젼법 등을 제한없이 사용하여 제조할 수 있으나, 바람직하게는 열분해법을 사용할 수 있다. 상기 열분해법은 공침법에 비해초상자성 산화철 나노입자의 크기 조절이 용이하고, 분산성, 결정성 및 상자성이 우수한 나노입자를 제조할 수있다. 또한, 상기 초상자성 산화철 나노입자의 성장은 시드 성장법(Seed mediated growth method)을 재차 적용하여 원하는 크기로 제조할 수 있다.

그러나, 상기 초상자성 산화철 나노 입자는 화학적 결합, 조영제의 응집에 의한 점도와 면역, 및 리소자임과 같은 효소작용의 금지 등 생체 내 독성을 유발할 수 있으므로, 그 자체로는 사용할 수 없다. 따라서, 초상자성 산화철 나노 입자들을 MRI 조영제로 사용하기 위해서는 높은 영상 이미지, 적은 독성, 높은 효율성, 혈액 내에서의 긴 반감기, 조직 특이성에서의 분산력, 좋은 용해성과 생리학적인 유체에서의 안정성 등을 고려하여 생체적합성 고분자로 코팅하여야 한다.

한편, 산화철계 나노입자(SPIO, 조영제)의 표면개질에는 개질용 고분자 또는 다당류를 사용할 수 있는데, 본 발명에서는 다당류로 표면개질된 산화철 나노입자를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 다당류는 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 황산콘드로이친(chondroitin sulfate), 덱스트란(dextran), 덱스트란 설파이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 헤파린 설파이텀(heparin sulfatem), 헤파란 설파이트(heparan sulfate), 키토산(chitosan), 젤란검(gellan gum), 잔탄검(xanthan gum), 구아검(guar gum), 수용성 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives) 및 카라기난(carrageenan)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는 헤파린으로 표면개질한 산화철 나노입자를 사용한다.

헤파린은 설페이트화된 선형의 다당류로 이루어져 있으며, 주로 우론산(uronic acid)으로 구성되어 있다. 헤파린은 다양한 구조의 혼합체로서 항혈전성, 염증억제, 혈관신생 암 성장 억제 및 면역 억제 등의 다양한 성질을 가지고 있다. 본 발명에서 사용하는 헤파린은 약 20,000 Da의 분자량을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 상기 산화철계 나노입자, 바람직하게는 초상자성 산화철계 나노입자(SPIO)는 그 표면에, 본 발명에서 매개자 역할을 하는 생체적합성 매개 고분자의 한쪽 말단과 화학적으로 결합할 수 있는 리간드 및 이들을 연결시키는 역할을 하는 링커를 포함하여 이루어진다.

일 실시예에서 헤파린으로 표면개질된 산화철계 나노입자는 헤파린의 작용기를 설파이드기로 변형시켜, 본 발명에서 매개자 역할을 하는 생체적합성 매개 고분자의 한쪽 말단, 예를 들어 말레이미드기와 화학적으로 결합한다.

즉, 본 발명에서 조영제, 산화철계 나노입자는 다당류로 표면개질된 후 대상세포 내로 직접적으로 침습해 들어가는 종래의 경우와 달리, 매개 역할을 하는 생체적합성 고분자와 화학적으로 결합되어 있는 구조를 가진다.

이 때, 상기 (초상자성) 산화철계 나노입자의 크기는 특별히 제한되지는 않으나 바람직하게는 4 ~ 200 nm 이다. 상기 (초상자성) 산화철계 나노입자크기가 200 nm를 초과하면 생체 내에서 대식 세포에 의해 쉽게 인식되는 문제가 있고, 4 nm 미만인 경우에는 이의 제조가 용이하지 않은 문제가 있기 때문이다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 산화철계 나노입자의 표면에 형광 프로브를 더 결합시킬 수 있다.

상기 형광프로브로로 사용되는 형광염료는 FITC, RITC, IRDye, Cy2(상표명), Cy3(상표명), Cy3.5(상표명), Cy5(상표명), Cy5.5(상표명), Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, 알렉사 플로어(Alexa Fluor,상표명) 350, 알렉사 플로어(상표명) 430, 알렉사 플로어(상표명) 488, 알렉사 플로어(상표명) 532, 알렉사 플로어(상표명) 546, 알렉사 플로어(상표명) 568, 알렉사 플로어(상표명) 594, 알렉사 플로어(상표명) 633, 알렉사 플로어(상표명) 647, 알렉사 플로어(상표명) 660, 알렉사 플로어(상표명) 680 을 들 수 있다

대상세포

본 발명에서 대상세포란 분자영상화하기 위한 타겟으로, 특별한 제한은 없다. 대상세포로 복합세포체도 사용 가능하며 단일세포체도 사용 가능하다.

즉, 임의의 세포가 표적일 수 있으며, 바람직하게는 이식 후의 생존율을 확인하기 위한 분자영상법 적용이 필요한, 췌도 세포, 줄기 세포, 역 분화 유도 줄기세포 (IPS), 지방 세포, 연골 세포, 간 세포, 또는 심근 세포 등일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 췌도 세포를 대상세포로 사용하였다.

본 발명의 분자영상용 복합체의 구조상에서, 상기 대상세포 표면의 작용기와 생체적합성 매개 고분자의 다른쪽 말단이 화학적으로 결합되어 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 췌도세포 표면의 콜라겐 조직에 존재하는 아민기와 생체적합성 매개 고분자의 NHS기가 화학적으로 결합되어 있는 구성을 지닌다.

특히, 본 발명에서는 상기 대상세포 하나하나마다 생체적합성 매개 고분자 물질을 처리하여 그 물질에 100% 붙을 수 있도록 한 후, 상기 산화철계 나노입자(조영제)의 표면 다당류 작용기를 결합시키므로 100% 라벨링이 가능하다. 즉, 본 발명에서는 대상세포의 표면이 생체적합성 매개 고분자들로 표면개질되는 효과가 있다.

생체적합성 매개 고분자

본 발명에서 생체적합성 매개 고분자로서는 대상세포와 조영제(산화철계 나노입자)를 화학적으로 단단히 매개할 수 있는 두 작용기를 가질 수 있는 생체적합성 고분자라면 무엇이든 사용할 수 있다.

바람직한 예로써, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 알지네이트, 하이드로젤, 피브리노겐 젤, 콜라젠, 젤라틴, 카이토산, 알지네이트, 히알루로닉산, PLGA, PEI, 또는 PEO 등을 사용할 수 있다. 이 중에서 특히 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 더욱 바람직하다.

상기 생체적합성 매개 고분자는 대상세포와 산화철 나노입자(조영제)를 매개하는 역할을 하는 물질로, 양 쪽 말단에 서로 다른 작용기를 가지는 것을 특징으로 한다.

이 때, 상기 생체적합성 매개 고분자의 양 쪽 말단에 가지는 서로 다른 작용기는 대상세포 및 조영제를 표면개질한 물질의 종류에 따라 적절히 변형하여 사용할 수 있다.

이하, 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 경우를 예시로서 기술한다.

PEG는 나노 구조물을 림프구의 공격이나 단백질 흡착으로부터 보호하는 역할을 함으로써 나노 구조물의 안정성 및 체류 시간을 늘려주는 역할을 하기 때문에, 주로 아민기, 카르복시기, 하이드록시기, 티올기, 말레이미드 등으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 작용기를 갖는 다중 분지형태(muti-branched PEG)로 사용 가능하며, 2개, 3개, 6개 등 다양한 개수의 가지를 가진 형태의 PEG가 상용화 되어 있으며, 그 말단에 다양한 작용기가 적용될 수 있다.

즉, 다음의 모든 PEG를 이용하여 세포표면에 조영제와 화학적 컨쥬게이션(chemical conjugation)하는 방식으로 결합시킬 수 있다.

(i) 단일기능(Monofunctioncal)의 활성화된 PEG

?카르복실화된 mPEGs: NHS 활성 에스테르

?기타 단일기능의 활성화된 PEG

(ii) 다작용기 활성PEG(multi-arm activated PEG)

?2 작용기 PEG 시리즈

?4 작용기 PEG 시리즈

?8 작용기 PEG 시리즈

(iii) 분지형(branched) 활성 PEG

(iv) 헤테로작용성 PEG

본 발명의 일 실시예에서는 양 쪽 말단에 각각 말레이미드기와 NHS기를 지니고 있는 PEG를 사용하였다.

즉, 췌도 세포와 조영제를 연결시켜주는 컨쥬게이션 방식을 적용하기 위해 생체적합성 매개 고분자 물질인 PEG를 서로 다른 작용기를 가진 다른 두자리 즉, Heterobifuctional group을 가진 PEG를 선택하였다. PEG가 한 쪽에만 붙거나 서로 얽히는 경우가 생기는 것을 방지하기 위해 다른 두자리 작용기의 PEG를 선택하였다.

그리고, 상기 NHS기는 대상세포의 아민기와 화학적으로 결합하고 상기 말레이미드기는 산화철계 나노입자(조영제) 표면 다당류의 SH기와 화학적으로 결합한다.

이러한 방식에 의해서 본 발명의 분자영상용 복합체는 도 1에 도시한 구조를 취하게 된다.

이처럼, 본 발명의 분자영상용 복합체는 생체적합성 매개 고분자 물질을 이용하여 대상세포와 산화철계 조영제를 화학적으로 연결 시키고 있는 구성을 이루고 있고, 이는 종래 세포내로 침습시키기 위해 산화철계 조영제 표면을 개질한 구성과 비교하여, 대상세포의 표면을 개질하는 구성을 취하는 것에 특징이 있다.

즉, 본 발명에서는 PEG 등의 생체적합성 매개고분자를 이용하여 대상세포 표면을 개질함으로써, 외부의 면역반응으로부터 차단해주어 대상세포의 생존율을 높여주는데 이용하고 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서 상기 분자영상용 복합체의 제조방법에 관한 것이다.

일 구체예에서, 본 발명은 대상세포의 분자 영상화에 이용하기 위하여,

상기 표면개질된 산화철 나노입자와 상기 대상세포와 결합된 생체적합성 매개 고분자를 화학적으로 결합시키는 단계를 포함하는, 분자영상용 복합체의 제조방법을 제공한다.

각각의 성분에 대한 구체적인 설명은 앞서 언급한 바와 같다.

산화철 나노입자를 개질용 고분자 또는 다당류로 표면개질하는 방법이나, 표면개질된 조영제나 대상세포 표면의 작용기와 결합할 수 있도록 생체적합성 매개 고분자의 양쪽 말단의 작용기를 변형시키는 기술 등은 당업자들이 공지 기술들을 적절히 활용할 수 있다.

예를 들어, 상기 생체적합성 매개 고분자 또는 가교제 상의 작용기를 통하여 조영제와 대상세포에 각각 결합을 형성될 수 있다.

가교제의 말단에 상기 생체적합성 매개 고분자에 결합된 작용기와 결합 가능한 작용기 (가교 링커, cross-linker)를 도입시킬 수 있는 활성화 물질을 사용하여 가교제를 활성화시킬 수 있으며, 그 반대의 경우도 가능하다. 이때, 상기 생체적합성 매개 고분자들은 자신에 결합된 작용기와 가교제에 도입된 가교 링커를 통하여 가교되거나, 가교제에 결합된 작용기와 자신에 도입된 가교 링커를 통하여 가교될 수 있다. 상기 생체적합성 매개 고분자에 결합되는 작용기는 대상세포와 표면개질된 조영제와 화학적으로 결합할 수 있는 모든 작용기일 수 있으며, 예컨대, 아민기, 카르복시기, 하이드록시기, 티올기, 말레이미드기 등일 수 있다.

상기한 방법으로 제조된 분자영상용 복합체의 평균 크기는 50㎚ 내지 10㎛, 바람직하게는 50㎚ 내지 200㎚이다. 일 실시예에서는 60nm였다.

본 발명에 따른 분자 영상용 복합체는 MRI 영상에서 우수한 조영효과를 나타내며, 실시간 조직 영상 및 비침투적 질병의 조기진단을 위한 센서로서 활용이 가능하다.

본 발명은 또 다른 관점에서 서로 다른 작용기를 양쪽 말단에 가지는 생체적합성 매개 고분자를 이용하여, 산화철계 나노입자의 조영제와 대상세포를 화학적으로 연결시켜 사용하는 것을 특징으로 하는, 대상세포의 분자영상화 방법에 관한 것이다.

상기 분자영상화 방법은 앞서 설명한 본 발명의 분자영상용 복합체 또는 이와 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 사용을 포함한다.

담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 복합체 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 복합체 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 복합체 조성물의 다른 바람직한 양태는 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 분자영상화 방법은 본 발명의 복합체를 생체 또는 시료에 투여하는 단계; 및 상기 생체 또는 시료로부터 복합체에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 단계를 포함한다.

“시료”는 진단하고자 하는 대상으로부터 분리한 조직 또는 세포를 의미한다. 또한 상기 복합체 조성물을 생체 또는 시료에 주입하는 단계는 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 복합체에 의해 발산되는 신호는 자기장을 이용하는 각종 장비들에 의해서 감지될 수 있으며, 특히 자기공명영상 장치(MRI)가 바람직하다.

자기공명영상 장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵이 에너지를 흡수하여 에너지가 높은 상태로 만든 후 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다. 특히 상기 자기 공명 영상 장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기 공명영상 장치인 것이 바람직하다.

이와 같이, 본 발명은 대상세포와 조영제를 서로 다른 작용기를 가진 생체적합성 매개 고분자, 예를 들어 PEG를 사용하여 이의 한쪽 작용기에는 대상세포와 반응하고 다른 한쪽 반응기는 조영제(산화철 나노입자)의 표면 다당류와 반응하게 함으로써 대상세포와 조영제를 서로 연결시켜주는 화학적인 컨쥬게이션 기술에 관한 것이다.

본 발명은 이러한 구성을 특징으로 함으로써 이하의 기존 문제점들을 해결한다.

첫째, 대상세포 표면에 생체적합성 매개 고분자 물질로 산화철 조영제를 컨쥬게이션시킴으로써, 조영제가 직접 대상세포로 침습하여 세포 소기관들에 영향을 주어 생존율이 문제가 되었던 점을 해결한다.

둘째, 종래 산화철 조영제의 일정하지 않았던 존재와 형태로 인한 문제점을 대상세포 표면의 컨쥬게이션 방식을 취함으로써 해결하였다. 대상세포 표면의 컨쥬게이션 방식은 조영제 산화철의 사이즈와 크기에 문제를 가져다 주지 않기 때문이다.

셋째. 종래 단점으로 여겨지고 있던 100% 라벨링(표지)이 되지 않은 문제점을 해결하였다. 즉, 대상세포마다 생체적합성 매개 고분자 물질을 처리하여 그 물질에 100% 붙을 수 있도록 산화철 조영제의 다당류 작용기를 변화시킴으로써 100% 라벨링을 가능케 하였다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 췌도 세포 분리

실험동물(SD-rat 흰쥐)에서 제거한 췌장을 water bath에 15분간 반응시키고 반응 후 M199 미디아 (sigma) 를 50ml까지 넣고 1400RPM/2분으로 맞춰 놓은 원심분리기에 넣었다. 원심분리가 끝나면 위에 있는 상층액은 비커에 천천히 버리고, 이 작업을 2번 반복하고 25ml M199 Media를 다시 넣고 볼텍싱 해주었다.

볼텍싱이 끝나고 여과(filteration)에 들어갔다. 50ml 튜브에 깔대기를 꽂고 깔데기 안에 키트를 놓고 볼텍싱한 췌도 세포를 붓고 비어있는 췌도세포 튜브에 다시 25ml 버퍼를 넣고 흔들어서 다시 50ml 튜브에 넣고 1400RPM/2분으로 셋팅 된 원심분리기에 넣고 돌렸다.

상층액을 다시 비커에 버리고 50ml 튜브를 거꾸로 뒤집어 놓았다. 30초 후에 입구를 휴지로 닦고 피콜용액(sigma)을 5ml 넣었다. 추가로 피콜용액 10m를 넣고 그 위에 M199 미디아 10ml을 천천히 부어주었다.

RPM:2400/17분/4도/Break:0로 맞춰진 원심분리기에 넣고, 10ml 디스포저 파이펫으로 천천히 층 사이에 있는 췌도세포를 뽑아 담았다. 이 튜브에 50ml M199 미디아를 넣고 1800RPM/2분으로 맞춰놓은 원심분리기에 돌리고 디스포져 파이펫으로 뽑아 버렸다.

다시 25ml M199 미디아를 붓고 손으로 살살 풀어준 다음, 4분에 한번씩 M199 미디아를 약 10ml 붓고(비커에 버리고), 다시 10ml을 넣는 과정을 6번 반복하였다. 7번째에 10ml을 버린 후 3등분하였다. 60mm dish에 각각 9ml(①), 5ml(②) 및 1ml(③)을 넣고(대부분 islet임), 이들을 각각 10ml로 맞춰주었다.

파이펫과 현미경을 이용하여 일일이 췌도 세포를 골라낸 후, 이것을 가지고 클린벤치에서 5ml RPMIMedia(Sigma)를 채웠다. 3~6분 정도 가라앉히게 놔둔 후, 세척하고 150mm 디쉬에 담았다. RPMI+FBS+P/S Media를 디쉬에 20ml 넣고 배양하였다.

실시예 2: 다양한 다당류를 이용하여 만든 산화철 조영제 제작

Three neck, Angled Flask 100ml에 3차 D.W 30ml을 질소전용 실린지를 꽂아 질소를 흘리면서 30분간 드레싱 후에 Iron(Ⅲ)chloride Hexahydrate Eisen(Ⅲ)chloride Hexahydrate(sigma) 0.5g FeCl₃, 6H₂O(sigma), Iron(Ⅱ)chloride Tetrahydrate Eisen(Ⅱ)chloride Tetrahydrate(sigma) 0.184g FeCl₂, 4H₂O(sigma), ammonium hydroxide solution ammoniumhydroxide-Losung(Fluka) 7.5ml을 파이펫에이드로 넣었다. 30분간 질소가스를 흘리며 교반하였다.

준비된 다당류를 (하기 화학식들 참조) 3차 D.W. 25ml에 250mg 씩 넣었다. 이때 다당류의 특성에 따라 준비하는 방법이 약간 다른데, 30분간 교반한 Magnetite를 3차 증류수로 세척하고, 마지막 세척시에 30ml D.W.를 넣고 여기에 준비된 다당류를 넣어 비커 안에 코팅하는 과정에 들어갔다. 마그네틱바를 넣고 2시간 동안 교반한 후 세척하였다. 세척이 끝나고 50분 동안 소니케이션하였다. 이때, 마지막 세척시는 20ml DW를 넣고 소니케이션하였다.

[화학식 1] 덱스트란

[화학식 2] 알지네이트

[화학식 3] 글리콜키토산

[화학식 4] 메틸 셀룰로오스

[화학식 5] 다당류: 고분자량 헤파린

[화학식 6] 저분자량 헤파린

[화학식 7] 고 분자량 헤파린의 작용기를 변형시킨 다당류

산화철 조영제의 다당류 중 변형시킨 헤파린(모식도 참고)을 사용하였으며 헤파린의 작용기가 아민그룹이기 때문에 췌도 세포의 막의 작용기와 동일하여 헤파린의작용기를 2-iminothiolane을 사용하여 헤파린의 작용기를 설파이드기(-SH)로 변형시켰다. 말레이미드는 설파이드와 효과적으로 결합하는 작용기로 이를 이용하여 PEG의 나머지 한쪽 작용기를 말레이미드로 선택하였다.

소니케이션이 끝난 후 마그네틱 자석위에 12시간 올려놓았다. 그 후 상층액만을 원심분리기 튜브에 담아 RPM10.000 10분간 3번 원심분리를 하였다. 원심분리한 튜브를 가지고 시린지에 25mm 필터를 꽂아 필터링하고 산화철 조영제((주)바이알) 1ml 와 D.W 2ml 넣고 80℃로 가열된 교반기에 넣고 60분 동안 가열 한 후에 제타사이저로 사이즈를 재었다.

범위가 맞으면 울트라 필터레이션 (Amicon stirred cell model 8200) 100K에 10ml 정도 농축시켰다. 농축 후 사이즈를 잴 때 1mlDW와 방울 농축액을 넣어 재었다. 이러한 방법으로 산화철 조영제를 완성하였다.

여러 가지 다당류를 이용하여 산화철 조영제를만들어 사이즈를 측정한 결과를 이하 표 1에 나타내었다. 다당류들의 제타 전위도 함께 측정하여 나타내었다.

상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 사용한 다당류 모두 nm사이즈로 인체의 무해한 사이즈로 결과가 나왔다.

실험예 1 : 산화철 조영제의 다당류 표면개질 확인

(1) 투과전자현미경( Transmission Electron Microscope )에 의한 확인

상기 제조한 산화철 조영제를 투과전자현미경으로 관찰하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 투과전자현미경은 나도 입자의 크기와 모양을 상세히 볼 수 있는 현미경으로 산화철 조영제를 관찰하기에 적합한 현미경이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 코팅하지 않은 산화철 조영제로 크기는 나노사이즈지만 입자들이 서로 모여있고 이는 산화철 조영제의 문제점을 나타내는 중요한 근거이다.한편, 다당류 덱스트란과 고분자량 헤파린으로 코팅한 산화철 조영제 경우 일정한 모양을 유지하고 있음을 볼 수 있었다.

이를 통해 산화철 조영제의 나노입자의 사이즈를 확인함과 동시에 나노입자의 모양을 확인하였다.

(2) 표면의 다당류 존재 확인( 우라닐 아세테이트 염색)

우라닐 아세테이트 염색시료를 이용하여 산화철 조영제의 염색 후 투과전자현미경으로 확인하였다. 우라닐 아세테이트 염색시료는 다당류를 염색하여 투과전자현미경 상으로 검게 나오는 특징을 보이는 염색시료이다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

덱스트란으로 코팅한 산화철 조영제 경우에는 검을 라인으로 다당류인 덱스트란이 존재하고 있음을 확인하였다. 고분자량 헤파린의 경우에도 검은 라인과 염색되지 않은 흰 부분의 경계가 명확함으로 다당류인 고분자량 헤파린이 산화철 조영제에 존재하고 있음을 확인하였다.

더욱 정확히 확인하기 위하여 염색하지 않은 조영제와 염색을 한 조영제를 비교해 보았다.

도 3에 나타난 바와 같이, 저분자량 헤파린으로 염색을 한 결과와 염색하지 않은 결과가 명확히 다르다는 것을 확인할 수 있었다.

(3) 산화철 조영제의 MRI

상기 다당류로 코팅한 산화철 조영제를 MRI로 확인한 결과를 도 4에 도시하였다.

그 결과, 제조된 산화철 조영제는 T2감쇄를 감지하고 T2감쇄는 검게 나오는 결과를 보였다. 조영제를 처리하지 않은 경우는 T2감쇄 효곽 나타나지 않아 하얗게 나오는 결과르 보였고 다당류로 코팅한 조영제 모두 조영제의 농도가 높아질수록 T2감쇄 효과가 커져서 MRI상으로 검게 나타남을 확인하였다.

실시예 3: PEG 를 이용한 췌도 세포와 산화철 조영제와의 화학적 결합

췌도 세포와 조영제를 연결시켜주는 컨쥬게이션 방식을 적용하기 위해 생체적합성 매개 고분자 물질인 PEG를 서로 다른 작용기를 가진 다른 두자리 즉, Heterobifuctional group을 가진 PEG를 선택하였다. 서로 다른 자리가 아니라면 PEG가 한 쪽에만 붙거나 서로 얽히는 경우가 생기기에 본 연구의 목적에 다른 두자리 작용기의 PEG를 선택하였다

췌도 세포막은 콜라겐 층으로 둘러싸여 있으며 콜라겐 층에는 아민그룹이 많이 분포되어있다. 그러므로, 아민그룹과 효과적으로 결합하는 작용기 NHS를 이용하여 PEG의 다른 두자리 작용기 중 한쪽 작용기를 NHS로 선택하였다

먼저, 췌도 세포와 PEG를 PH8.0 HBSS 버퍼의 조건에서 1시간 반응 시켜 연결 시켰으며, 반응이 끝난 후 왓싱 작업에 들어가고 100mm 디쉬에 넣고 고분자량의 헤파린의 작용기를 변형하여 만든 산화철 조영제를 PH 6.0 HBSS 버퍼를 넣어 1시간 반응 시켜 컨쥬게이션 시켰다.

(1) 췌도 세포와 PEG 결합

배양된 췌도세포(islet)을 원심분리기에서 RPM1400로 2분 동안 돌리고 버퍼 HBSS PH8.0(Gibco)을 원심분리한 튜브에 붓고 이것을 100mm 배양접시에 넣었다.

PEG(NOF)25mg를 E-tube에 담고 시린지 안에 HBSS PH8.0 버퍼를 2ml 넣고 이것을 E-Tube안에 1ml 넣고 빨아들였다. 다시 한번 더 빨아낸 다음, 시린지 필터를 끼고 췌도세포가 들어있는 8ml dish에 넣었다. 인큐베이터에 한 시간 동안 넣어두었다.

한 시간 후에 RPMI1640(Gibco)를 약간 넣어 반응을 멈추게 한 다음, 50ml 튜브에 넣었다. RPM1400에서 2분 동안 원심분리기에 돌렸다.

(2) 조영제와 PEG 결합

PH 6.0 HBSS 5ml을 dish에 넣고 PEGylation 된 췌도세포를 dish에 넣었다. 그리고 자체 제작한 조영제 (600mg/ml) 450ml를 넣고 인큐베이터에 한 시간 동안 두었다. 한 시간 후에 RPMI1640(Gibco)를 약간 넣고 반응을 멈춘 후, 50ml 튜브에 넣었. RPM1400에서 2분 동안 원심분리기에 돌렸다.

실험예 2 : 복합체의 구조 확인

(1) 염색 및 전자현미경에 의한 관찰

췌도세포를 프루시안블루 염색시료로 염색하여 관찰하였다. 프루시안블루 염색시료는 철이 있는 경우 푸른색으로 염색되는 염색 시료로 췌도세포 표면쪽에 산화철 조영제가 존재하는지 여부를 확인하고자 한 실험이다.

그 결과를 도 5의 위쪽에 도시하였다. 처리하지 않은 췌도세포 경우 프루시안블루 염색시료로 염색을 했지만 아무런 염색이 되지 않은 결과를 확인했다.

그리고 종래 방법처럼 췌도 세포를 24시간 인큐베이션시켜 물리적으로 산화철 조영제가 세포 안으로 들어가도록 유도한 경우에는 세포 표면과 안이 뚜렷하게 푸른색으로 염색되었음을 확인했다. 그러나, 본 발명의 생체적합성 매개 고분자로 췌도 세포와 산화철 조영제를 화학적으로 컨쥬게이션시킨 경우에는 췌도세포 표면에 존재하는 산화철 조영제가 염색되어 가장자리가 푸른색으로 염색되었음을 확인하였다.

그리고, 전자현미경으로 관찰한 결과를 도 5의 아래쪽에 도시하였다.

즉, 처리시간이 같음에도 불구하고 1시간 인큐베이션한 결과는 세포 안으로엔도사이토시스의 메커니즘을 통하여 들어가고 있음이 확인되었고, 본 발명의 컨쥬게이션 복합체는 동일한 시간 동안 인큐베이션해도 조영제가 세포표면에 자리잡고 있음을 확인되었다.

(2) 공초점 현미경을 이용한 관찰

산화철 조영제 표면개질에 사용한 다당류에 FITC 형광 dye를 붙여, 췌도세포에 PEG를 이용하여 컨쥬게이션 된 조영제를 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, FITC 형광시료는 초록색 빛을 띠며 세포 주위에 형광시료가 라운드로 분포되어있음을 확인하였다. 이를 통해, 생체적합성 매개 고분자로 췌도세포와 산화철 조영제를 화학적으로 컨쥬게이션시킨 본 발명의 구성이 완성되었음을 확인되었다.

실시예 3 : 분자영상화- MRI 에 의한 관찰

다음으로, 췌도세포에 산화철 조영제를 처리하여 MRI로 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 산화철 조영제를 처리하지 않은 췌도세포의 경우에는 T2감쇄 효과가 없음을 확인했고, 종래 방법과 같이 산화철 조영제를 물리적으로 업테이크한 췌도세포는 T2감쇄 효과가 있음을 확인하였다. 본 발명의 복합체의 경우에는 업테이크한 췌도세포보다 T2감쇄가 높음을 보였다.

이를 통해, 산화철 조영제가 세포 안으로 업테이크한 종래의 물리적방법을 사용하는 경우는 산화철 조영제의 기능이 많이 떨어지는 것을 알 수 있다.

그리고, 도 8에서 췌도세포에 산화철 조영제를 처리하여 MRI상 T2감쇄 신호정도를 확인 한 결과를 그래프로 나타내었다.

T2 감쇄 수치는 적을수록 MRI에 효과적으로 감지한다는 것을 나타낸다. 즉, T2값이 낮을수록 조영제로써, 또한 이미지상으로써 좋은 효과를 보이는 것이고, R2값은 높을수록 좋은 결과를 의미한다.

도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 산화철 조영제를 처리하지 않은 췌도세포 경우에는 산화철 조영제를 업테이크한 췌도세포보다 감쇄 수치가 높음을 확인했고 MRI상으로 확인했듯 T2감쇄 효과로 나타나는 흐려지는효과를 보지 못했다. 그러나, 본 발명의 복합체의 경우, 종래 산화철 조영제를 업테이크한 췌도세포보다 T2감쇄가 약 4배 정도로 더 효과적이었다.

실시예 4 : 산화철 조영제 농도에 따른 췌도세포의 MRI

도 9에 도시하고 있는 것처럼, 산화철 조영제의 농도를 달리하여 췌도 세포에 처리하였다. 그리고, 종래 조영제가 췌도 세포 안으로 침습한 경우와 본 발명의 복합체의 경우를 비교하였다.

그 결과, 본 발명의 복합체의 경우가 적은 농도에서도 MR이미지가 나타남을 확인했다. 즉, 산화철 조영제를 적은 농도로 처리하여 분자영상화가 가능하므로 세포에 미치는 영향을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 췌도세포의 생존율에도 더욱 효과적이다.

이하, 직접 췌도세포의 생존율을 비교해보았다.

실시예 5 : 췌도세포의 생존율 비교

산화철 조영제를 도 10에 기재한 대로, 농도별로 처리하고 1일, 5일, 10일 후 생존율을 비교하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 본 발명의 복합체는 1일, 5일 후에도 처리하지 않은 췌도세포와 생존율의 차이를 보이지 않았으며, 낮은 농도의 산화철 조영제 처리했을 때는 오히려 생존율이 높음이 확인되었다. 그러나, 종래의 업테이크 방식의 췌도세포는 생존율이 떨어졌음을 확인할 수 있었다.

즉, 본 발명의 복합체 구성은 생체적합성 매개 고분자 물질이 췌도세포를 보호해 주는 역할을 함을 알 수 있다.

실시예 6 : 분자영상용 복합체의 마우스에게로의 이식

췌도세포에 산화철 조영제를 컨쥬게이션한 본 발명의 복합체를 누드마우스왼쪽 신장에 300개를 이식하였다.

그 결과, 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 췌도 세포가 이식됐음을 명확히확인할 수 있었다.

그리고, 한 달 후, MRI로 분자영상화하여 관찰한 결과를 도 11에 함께 나타내었다. 이식된 췌도세포의 존재 및 상태를 명확히 확인할 수 있었다.

이와 같이, 본 발명의 복합체는 이식 후의 세포 상태를 확인하기 위한 분자영상화에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

서로 다른 작용기를 양쪽 말단에 가지는 생체적합성 매개 고분자의
한 쪽 말단은 개질용 고분자 또는 다당류로 표면개질된 산화철계 나노입자와 결합되어 있고
다른 한 쪽 말단은 대상세포 표면과 화학적으로 결합되어 있는 구성을 가지는 것을 특징으로 하는 분자영상용 복합체.
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 매개 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 알지네이트, 하이드로젤, 피브리노겐 젤, 콜라젠, 젤라틴, 카이토산, 알지네이트, 히알루로닉산, PLGA, PEI, 및 PEO로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 고분자인 것을 특징으로 하는 분자영상용 복합체.
제2항에 있어서, 상기 생체적합성 매개 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG)인 것을 특징으로 하는 분자 영상용 복합체.
제3항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 한 쪽 말단은 말레이미드기를 가지고 있고 개질용 고분자 또는 다당류로 표면개질된 산화철계 나노입자와 결합되어 있고; 다른 한 쪽 말단은 NHS기를 가지고 있고 대상세포 표면과 화학적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 분자 영상용 복합체.
제3항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 다음의 헤테로 작용기를 가지는 형태 중 어느 하나의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 분자 영상용 복합체:
제1항에 있어서, 상기 개질용 고분자는 PEG, 알지네이트, 하이드로젤, 피브리노겐 젤, 콜라젠, 젤라틴, 카이토산, 알지네이트, 히알루로닉산, PLGA, PEI, 및 PEO로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 고분자인 것을 특징으로 하는 분자 영상용 복합체.
제1항에 있어서, 상기 다당류는 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 황산콘드로이친(chondroitin sulfate), 덱스트란(dextran), 덱스트란 설파이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 헤파린 설파이텀(heparin sulfatem), 헤파란 설파이트(heparan sulfate), 키토산(chitosan), 젤란검(gellan gum), 잔탄검(xanthan gum), 구아검(guar gum), 수용성 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives) 및 카라기난(carrageenan)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분자 영상용 복합체.
제7항에 있어서, 상기 다당류는 헤파린(heparin)인 것을 특징으로 하는 분자 영상용 복합체.
제1항에 있어서, 상기 대상세포는 췌도 세포, 줄기 세포, 역 분화 유도 줄기세포 (IPS), 지발 세포, 연골 세포, 및 심근 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 분자 영상용 복합체.
제9항에 있어서, 상기 대상세포는 췌도 세포인 것을 특징으로 하는 분자 영상용 복합체.
제1항에 있어서, 상기 분자영상은 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)인 것을 특징으로 하는 분자 영상용 복합체.
말레이미드기 및 NHS기를 양쪽 말단에 각각 가지는 폴리에틸렌글리콜(PEG)의
말레이미드기는 헤파린으로 표면개질된 산화철계 나노입자와 화학적으로 결합되어 있고,
NHS기는 췌도세포 표면의 아민기와 화학적으로 결합되어 있는 구성을 가지는 것을 특징으로 하는 췌도세포 분자영상용 복합체.
대상세포의 분자 영상화에 이용하기 위하여,
개질용 고분자 또는 다당류로 산화철 나노입자 표면을 개질하는 단계,
대상세포와 생체적합성 매개 고분자를 화학적으로 결합시키는 단계, 및
상기 표면개질된 산화철 나노입자와 상기 대상세포와 결합된 생체적합성 매개 고분자를 화학적으로 결합시키는 단계를 포함하는, 제1항의 분자 영상용 복합체의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 생체적합성 매개 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 알지네이트, 하이드로젤, 피브리노겐 젤, 콜라젠, 젤라틴, 카이토산, 알지네이트, 히알루로닉산, PLGA, PEI, 및 PEO로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 고분자인 것을 특징으로 하는 제1항의 분자 영상용 복합체의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 다당류는 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 황산콘드로이친(chondroitin sulfate), 덱스트란(dextran), 덱스트란 설파이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 헤파린 설파이텀(heparin sulfatem), 헤파란 설파이트(heparan sulfate), 키토산(chitosan), 젤란검(gellan gum), 잔탄검(xanthan gum), 구아검(guar gum), 수용성 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives) 및 카라기난(carrageenan)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제1항의 분자 영상용 복합체의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 개질용 고분자는 PEG, 알지네이트, 하이드로젤, 피브리노겐 젤, 콜라젠, 젤라틴, 카이토산, 알지네이트, 히알루로닉산, PLGA, PEI, 및 PEO로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 고분자인 것을 특징으로 하는 제1항의 분자 영상용 복합체의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 대상세포는 췌도 세포, 줄기 세포, 역 분화 유도 줄기세포 (IPS), 지발 세포, 연골 세포, 및 심근 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제1항의 분자 영상용 복합체의 제조방법.
서로 다른 작용기를 양쪽 말단에 가지는 생체적합성 매개 고분자를 이용하여, 산화철계 나노입자의 조영제와 대상세포를 화학적으로 연결시켜 사용하는 것을 특징으로 하는, 대상세포의 분자 영상화 방법
제18항에 있어서, 상기 분자영상은 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 산화철계 나노입자의 조영제는 다당류로 표면개질된 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 생체적합성 매개 고분자는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 대상세포는 췌도세포인 것을 특징으로 하는 방법.