[go: up one dir, main page]

KR20120113580A - 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트 - Google Patents

비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20120113580A
KR20120113580A KR1020110031354A KR20110031354A KR20120113580A KR 20120113580 A KR20120113580 A KR 20120113580A KR 1020110031354 A KR1020110031354 A KR 1020110031354A KR 20110031354 A KR20110031354 A KR 20110031354A KR 20120113580 A KR20120113580 A KR 20120113580A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gly
ala
val
asp
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020110031354A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101309485B1 (ko
Inventor
정경민
이준행
우혜련
김영란
이태희
Original Assignee
전북대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전북대학교산학협력단 filed Critical 전북대학교산학협력단
Priority to KR1020110031354A priority Critical patent/KR101309485B1/ko
Publication of KR20120113580A publication Critical patent/KR20120113580A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101309485B1 publication Critical patent/KR101309485B1/ko
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1239—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Vibrionaceae (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/28—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Vibrionaceae (F)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명에 따른 하이브리도마 클론에서 생산되는 단일클론항체는 감수성 및 특이성이 우수하여, 비브리오 패혈증균 감염 여부를 신속, 정확하게 진단 및 예방과 치료 등에 매우 유용하게 사용 될 수 있다. 또한 대장균에서 발현된 재조합 단백질 RtxA1 항원은 감수성 및 특이성이 우수하여, 비브리오 패혈증균의 감염의 진단 및 예방과 치료 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 단일클론항체는 다른 종류의 비브리오 패혈증균에 대한 교차반응성이 우수할 뿐 아니라 열처리된 비브리오 패혈증균에도 결합할 수 있으므로, 검사자가 비브리오 패혈증균에 감염된 생체시료를 열처리하여 비브리오 패혈증균을 사멸시켜 감염의 위험성을 제거한 후 감염여부에 대한 진단을 수행할 수 있으므로 매우 안전하다.

Description

비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트{Monoclonal antibody specific to Vibrio vulnificus RtxA1, hybridoma producing the monoclonal antibody and diagnostic kit comprising the monoclonal antibody}
본 발명은 비브리오 패혈증균 RtxA1에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비브리오 패혈증균 RtxA1 및 열변성된 RtxA1에 높은 반응성을 가지며 다양한 진단법에 폭넓게 활용될 수 있는 비브리오 패혈증균 RtxA1에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트에 관한 것이다.
비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)은 주로 바다와 인접한 강하구에 서식하는 호염성 병원성박테리아이며 대부분의 해산물과 관련된 사망성 질환과 관련 되어있다. 비록 비브리오 패혈증균 감염증은 비교적 역사가 짧으나, 지구 온난화에 의해서 세계적으로 임상증례가 계속적으로 증가하고 있는 새로이 주목받고 있는 질환중의 하나이다. 특히 전세계적으로 절대적인 발병례는 콜레라나 살모넬라 식중독보다 적지만 높은 치사율과 비극적인 임상증상 때문에 심각한 사회적 문제를 야기하고 있다.
비브리오 패혈증균은 1976년 미국 질병통제센터 (Centers for Disease Control; 이하 CDC로 약함)의 홀리스 (Hollis)등이 11년 동안 사람에서 분리된 호염성, 병원성 비브리오 균의 세균학적 성상을 처음 보고한 이후, 유당(lactose)을 분해하는 특징 때문에 유당 분해 비브리오 (lactose-fermenting Vibrio 또는 Lac(+))라 명명되었다. 1979년 CDC의 블레이크 (Blake)등은 CDC에 보고된 39명의 환자들의 자료를 역학적으로 분석하여 임상증상에 따라 원발성 패혈증(primary septicemia)군과 창상감염(wound infection)군으로 분류하였다 (Blake, P.A., Merson, M.H., Weaver, R.E., Hollis, D.G., Heublein, P.C., N. Engl. J. Med. 300:1-6, 1979). 같은 해 파머 (Farmer)는 새로운 종으로서 Vibrio vulnificus (vulnus=wound, ficus=forming)라 명명하였으며, 오늘에 이르고 있다(Farmer, J.J. III, Lancet 2:903, 1979).
V. vulnificus 패혈증은 잠복기가 짧고, 일단 발병하면 전격적으로 진행하여 효과적 항균제 치료 타이밍을 놓치기 쉽다. V. vulnificus 패혈증은 대부분 40대 이상(약 90-95%)의 남자(90% 이상)에서 발생하며, 정상인에서는 거의 볼 수 없고, 기저질환을 가지고 있는 환자들에서 주로 발병한다. 전 세계의 발생증례를 분석해 보면 원발성 패혈증의 경우, 대부분의 환자들은 간장 질환과 음주벽 등 만성질환을 가지고 있으며, 간장 질환으로서는 간경변, 만성간염, 간암등이 주종을 이루고, 그 외 당뇨병, 폐결핵, 만성골수염, 류마티스성 관절염 등의 기저질환이 확인되었다. 그러나 5%이하에서는 특별한 기저질환을 찾을 수 없는 경우도 있다. 미국의 경우 당뇨병, 악성종양, 혈색소증 (hemochromatosis), 지중해빈혈 (thalassemia) 등의 빈도가 비교적 높게 나타난다. 최근에는 AIDS 환자들에서 V. vulnificus 패혈증의 발생보고가 나오고 있어, 미국 CDC에서는 AIDS 환자들에게 여름철에는 굴 등의 해산물을 생식하지 말 것을 권고하고 있다. 따라서, 비브리오 패혈증균의 감염을 신속히 판정하고, 질병의 빠른 확산 막고, 초기 치료의 효율성을 극대화하기 위해 감염여부를 초기에 진단할 수 있는 효과적이고 신속한 진단법의 개발이 절실히 요구된다.
1980년 중반 이후 시작 된 비브리오 패혈증균의 발변 기전 연구를 통하여 여러 가지 독력인자가 보고되었다. 즉, 용혈독소 (Kreger, A, Lockwood, D, Infect. Immun. 33:583-590, 1981), 금속단백분해효소 (Kothary, M.H., Kreger, A.S., J. Gen. Microbiol. 133:1783-1791, 1987), 포스포리파아제 A2 (Testa, J., Daniel, L.W., Kreger, A.S., Infect. Immun. 45:458-463, 1984), 다당질 협막 (Wright, A.C., Simpson, L.M., Oliver J.D., Morris, J.G., Jr., Infect. Immun. 58:1769-1773, 1990), 시데로포어 (Simpson, L.M., Oliver, J.D., Infect. Immun. 41:644-649, 1983), RtxA1 (Kim YR, Lee SE, Kook H, Yeom JA, Na HS, Kim SY, Chung SS, Choy HE, Rhee JH. Cell Microbiol 10:848-862, 2008)등이 알려져 있다. 이 중 RtxA1은 비브리오 패혈증균 감염초기에 분비되는 주요한 독력인자로 써, 장을 통한 혈액으로 비브리오 패혈증균의 전파와 세포의 사멸에 중요한 역할을 하고 있다. 이는 RtxA1이 초기 감염의 새로운 진단법과 치료제 개발에 유용한 표적임을 보여 주고 있다.
비브리오 패혈증의 조기 진단을 위해, 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 박테리아 핵산 검출법이 이용되어 왔다. 그러나 중합효소연쇄반응을 이용한 핵산 검출법은 초기 감염을 효율적으로 진단할 수 있지만, 상대적으로 비싸고 숙련된 전문 인력과 고가의 실험시설을 요구한다. 더욱이 중합효소반응을 이용한 핵산 진단법의 고도의 특이성 때문에 다양한 비브리오 패혈증균주를 진단하는 되는 한계가 있다. 따라서, 감염의 조기 진단과 위에서 언급한 문제점 해결을 위하여, 특이적인 항원에 대한 단일클론 항체의 생산 및 이를 이용한 진단제에 대한 개발의 요구가 지속되어 왔다.
나아가, 비브리오 패혈증을 진단하기 위해 환자로부터 샘플을 채취하여 분석하는 경우 검사 및 처리과정에서 검사자가 비브리오 패혈증에 감염되는 경우가 발생하는 문제가 있었다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 비브리오 패혈증균 RtxA1에 특이적으로 결합하며 높은 교차반응성 및 열변성 RtxA1에도 결합할 수 있는 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 본 발명의 단일클론항체를 포함하는 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 수탁번호 KCLRF-BP-00261의 하이브리도마 세포 및 수탁번호 KCLRF-BP-00262의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원 및 열처리된 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원의 3491번 내지 3980번 아미노산 부위에 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상술한 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증균 검출을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 두번째 과제를 달성하기 위하여 상술한 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증균 검출을 위한 진단키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단일클론항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 비브리오 패혈증균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 단일클론항체를 열처리된 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 비브리오 패혈증균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 검출은 ELISA 또는 웨스턴 블롯일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 항체를 포함하는 비브리오 패혈증 치료제일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, (A) 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원 유래의 서열번호 6의 재조합 단백질 또는 그 융합단백질을 사용하여 생쥐를 면역화하는 단계; (B) 상기 면역화된 생쥐의 비장 세포를 마이엘로마 세포와 융합하여 배양하는 단계; (C) 상기 융합된 하이브리도마 세포에서 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 결합하는 단일 클론항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00262의 하이브리도마 세포를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.
별도로 설명되어 있지 않다면, 용어 '핵산(nucleic acid)'은 단일- 또는 이중나선 형태에서 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 가리키고, 자연 발생하는 뉴클레오타이드와 비슷한 방식에서 핵산과 결합하는 본래 뉴클레오
타이드의 알려진 유사체들을 포함하며, 특별한 언급이 없는 한, 특정 핵산 서열은 그들의 상보적 서열을 포함한다.
'작동적으로 결합된(operatively linked to)'은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.
세포와 관련하여 사용되는 용어 '재조합(recombinant)'은 세포가 이형의 핵산을 복제하거나 이형의 핵산에 의해 코드화되는 펩타이드 또는 단백질을 발현하는 것을 가리킨다. 또한 재조합 세포는 세포의 본래 형태에서 발견되는 유전자를 발현시킬 수 있으나, 변형된 유전자가 인공적인 방법에 의해 세포로 재도입 되어지기도 한다.
'프라이머'는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합체의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al.,Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-,프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
'벡터'는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주 세포 내로 유입할 수 있는 방안을 갖추어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여 한다. 여기서 외래 유전자는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원의 3491-4701 아미노산 부위를 코딩하는 서열 또는 상기 서열의 말단에 정제를 용이하게 하기 위하여 His-tag 서열을 부가한 서열을 의미한다.
'플라스미드'는 일반적으로 외래 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동적으로 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 그러나, 플라스미드는 목적하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 작제하기 위해 유전자 재조합에 의해 특정한 제한 효소에 의해 분해되고 새로운 유전자를 도입하는 벡터로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서는 플라스미드와 벡터는 상호교환적으로 사용되며, 유전공학 분야에 통상의 지식으로 가진 자라면 그들의 명칭을 구분하지 않더라도 그 의미를 충분히 이해할 것이다.
"융합단백질"은 추후 단백질 정제의 편의를 위하여 C-말단에 His-tag를 부착하고 있는 비브리오 폐증균 RtxA1을 의미한다. 따라서 본 발명에서 "융합단백질"이라 표현하였지만, 그것이 반드시 His-tag가 부착된 것을 의미하는 것이 아니며, 단백질 정제의 불편함을 감수한다면 융합단백질을 사용하지 않을 수도 있다. 그러므로 본 발명에서 "재조합 비브리오 폐증균 RtxA1"란 용어는 "비브리오 폐혈증균 RtxA1" 또는 "정제의 편의를 위한 사슬이 N-말단 또는 C-말단에 부가된 비브리오 폐혈증균 RtxA1"의 약칭으로 정의된다.
본 발명의 용어 ‘단일클론항체’란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위(에피토프)에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마의 배양에 의해 생산되기 때문에 다른 면역글로블린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 뇨, 분비물 등을 포함한다. 이들 생물학적 시료를 열처리하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료중의 비브리오 폐증균 RtxA1의 발현 여부를 확인하기 위하여 반응시킨 상기 비브리오 폐증균 RtxA1 단백질과 단일클론항체의 결합물을 의미한다.
본 발명에 따른 재조합 RtxA1(3491-4701)은 비브리오 폐혈증균 RtxA1의 단일클론항체 생성에 매우 유용한 재조합 RtxA1 단백질 항원을 제공한다. 또한 이는 비브리오 폐혈증균 RtxA1을 이용한 진단에 매우 유용한 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질 항원을 제공하고, 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 항원의 대량발현 및 정제가 용이하게 한다.
본 발명에 따른 하이브리도마 클론에서 생산되는 단일클론항체는 감수성 및 특이성이 우수하여, 비브리오 패혈증균 감염 여부를 신속, 정확하게 진단 및 예방 등에 매우 유용하게 사용 될 수 있다. 또한 대장균에서 발현된 재조합 단백질 RtxA1 항원은 감수성 및 특이성이 우수하여, 비브리오 패혈증균의 감염의 진단 및 예방 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 단일클론항체는 다른 종류의 비브리오 패혈증균 RtxA1에 대한 교차반응성이 우수할 뿐 아니라 열처리된 비브리오 패혈증균에도 결합할 수 있으므로, 검사자가 비브리오 패혈증균에 감염된 생체시료를 열처리하여 비브리오 패혈증균을 사멸시켜 감염의 위험성을 제거한 후 감염여부에 대한 진단을 수행할 수 있으므로 매우 안전하다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 재조합 RtxA1 (3491-4701)을 도입된 재조합 RtxA1 (3491-4701)발현벡터의 개열지도이다.
도 2A는 비브리오 패혈증균의 재조합 RtxA1 (3491-4701)의 발현과 정제 과정을 10% SDS-PAEG로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2B는 정제된 재조합 RtxA1 (3491-4701)단백질의 특이성을 면역블롯으로 분석한 결과이다
도 3은 정제된 5RA 단일클론 항체를 10% SDS-PAEG로 분석한 결과이다.
도 4A는 형질전환 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 조각 단백질을 모식적으로 보여주고 있다
도 4B는 재조합 RtxA1(3491-4701) 조각 단백질의 발현을 10% SDS-PAEG로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4C는 발현된 재조합 RtxA1 (3491-4701) 조각 단백질의 특이성을 면역블롯으로 분석한 결과이다
도 5는 야생종 비브리오 패혈증균에 대한 단일클론 항체 (1RA, 5RA, 11RA)의 반응성 분석을 면역블롯으로 분석한 결과이다.
도 6은 단일클론항체 (5RA와 11RA)의 여러 비브리오 패혈증균 균주에 대한 교차반응을 면역블롯으로 분석한 결과이다.
도 7은 비브리오 패혈증균에 감염된 세포에서 단일클론 항체(1RA, 4RA, 5RA, 11RA)의 반응성 분석을 면역형광항체법으로 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 비브리오 감염초기에 분비되는 특이적인 독소 항원으로 판정된, 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1 항원을 면역원으로 이용하여 마우스에 면역시키고, 면역된 마우스의 비장세포와 B-임프아세포(B-lymphoblast)인 P3X63Ag8.653가 융합된 하이브리도마 클론을 제조하고 이로부터 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 대한 단일클론 항체를 생산함으로 써 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 따른 단일클론 항체는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 대해 우수한 반응성을 보였다. 특히 일부 단일클론 항체는 열변성 RtxA1 항원과 여러 비브리오 패혈증균주에 대한 교차반응을 나타냈다. 이는 본 발명의 단일클론 항체가 간접면역형광항체,면역블롯법 및 효소면역항체법 등의 다양한 진단법에 이용 가능한 진단용 항체임을 보여 주고 있다. 또한 본 발명의 단일클론 항체는 독력인자 RtxA1의 중화 항체로 이용이 가능하므로 치료제로 사용될 수 있다.
한편, 재조합 RtxA1 단백질을 면역원으로 이용하여 융합된 하이브리도마 세포 10개에서 생산된 각각의 단일클론항체들은 비브리오 패혈증균의 RtxA1의 아미노산 결합부위에 따라 3491번 ~ 3980번째 아미노산에 결합하는 단일클론항체들, 3981 ~ 4380번째 아미노산에 결합하는 단일클론항체들 및 4381 ~ 4701번째 아미노산에 결합하는 단일클론항체들로 분류할 수 있다. 이 중 이소타입에 따른 대량생산가능성, 열변성 항원에 대한 반응성 및 RtxA1 항원과의 친화도 및 다른 종류의 비브리오 패혈증균에 대한 교차가능성 등을 종합하면 5RA(3981 ~ 4380번째 아미노산에 결합), 11RA(3491번 ~ 3980번째 아미노산에 결합 가 가장 우수한 효과를 나타내었다. 따라서, 상기 5RA는 한국세포주연구재단(Korean Cell Line Research Foundation)에 기탁번호 KCLRF-BP-00261로 기탁하고, 11RA는 기탁번호 KCLRF-BP-00262로 기탁하였다(표 1 참조).
단일클론항체는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler et al., European Journal of Immunology 6;511-519). 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역 세포와 암 세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킬 수 있다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다.
본 발명의 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또한 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전, 이온교환크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피, 친화성크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 서열번호 4의 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질을 코딩하는 서열번호 3으로 표시되는 서열을 주형으로 하고 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 중 3491번 ~ 4701번 위치의 아미노산 부위를 선택적으로 증폭하기 위하여 신규한 프라이머 서열인 서열번호 1 및 2의 전방 및 후방 프라이머로 하여 PCR을 수행한다. 그 뒤 상기 증폭된 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 중 3491번 ~ 4701번 위치의 아미노산을 코딩하는 서열(서열번호 5) 또는 상기 서열의 말단에 정제를 용이하게 하기 위하여 통상의 His-tag 서열을 첨가한 서열을 플라스미드 벡터에 삽입하고 이를 숙주세포에 형질전환한다. 이후 발현된 단백질을 정제하고 이를 마우스의 복강에 주사한 후 비장세포를 적출하여 이를 마이엘로마 세포와 융합하고 이를 배양하여 다수개의 하이브리도마 세포를 수득한다. 이후 상기 하이브리도마 세포에서 생산된 단일클론항체들에 대하여 대량생산 가능성, 교차반응성 및 열처리된 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질의 결합능 등을 종합적으로 평가하고 가장 우수한 5RA, 11RA를 한국세포주연구재단에 각각 KCLRF-BP-00261 및 KCLRF-BP-00262로 기탁하였다. 이렇게 생산된 11RA 단일클론항체는 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 중 3491번 ~ 3980번째 아미노산 부위에 특이적으로 결합할 수 있다.
단일클론항체를 분비하는 하이브리도마는 이를 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해 서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등의 정제방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 단일클론항체는 항원과 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화 (neutralization)시키며, 나아가 병원체와 병원체에 감염된 세포를 죽일 수 있다. 예를 들어, 비브리오 폐혈증균의 독소부분인 RtxA1를 특이적으로 인식하는 단일클론항체는 이에 결합하여 그 작용을 억제하거나 중화할 수 있고, 항원과 결합된 항체는 보체를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 보체에 의하여 항원이 제거되도록 할 수 있다. 또한, 단일클론항체는 항원에 결합하여 그 항원이 식균세포에 의하여 더욱 잘 잡아먹히게 만들 수도 있다. 또한, 단일클론항체가 결합되어 있는 항원 세포는 자연살해세포(NK cell)에 의해 보다 쉽게 살해당함으로써, 상기 단일클론항체를 면역반응을 통한 항원과 이 항원을 생성하는 비브리오 패혈증균의 제거에 이용할 수 있다. 따라서, 항체 자체만으로 면역반응을 통한 항원 및 비브리오 폐혈증균의 제거와 감소의 결과를 기대할 수 있어 본 발명의 항체는 비브리오 폐혈증균의 진단 또는 치료에 사용할 수 있다.
당업자라면, 본 발명에 따른 단일클론항체가 인체에 적용하기 위해 면역원성을 감소시킨 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 단일클론항체로 전환될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 카이메릭 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 재조합시킨 것이고, 인간화 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역에서 항원과 직접적으로 결합하는 상보성 결정 영역(complementarity determining regions : CDRs) 또는 상보성 결정 영역 중에서도 항원 결합 특이성에 관여하는 아미노산 잔기들(specificity determining residues : SDRs)만을 인간 항체에 이식시킨 것이다.
인간 항체는 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역 중 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역을 인간 항체의 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역대신 치환하고, 그 결과 항원결합능을 나타내는 하이브리드(hybrid: 생쥐 중쇄/인간 경쇄 혹은 생쥐 경쇄/인간 중쇄) 항체로부터 생쥐 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역을 다시 인간 중쇄 가변영역이나 경쇄 가변영역으로 치환하여 항원결합능을 나타내는 완전 인간 항체 가변영역을 골라낸 후 이를 인간 항체불변영역과 연결시키는 등의 공지의 방법을 사용하여 본 발명의 단일클론항체로부터 용이하게 제조가능하며, 이러한 변이체가 본 발명의 범위에 속함은 당연하다. 위와 같이 제조된 카이메릭 항체, 인간화항체 및 인간 단일클론항체는 공지의 방법을 사용하여 동물세포에서 생산할 수 있다.
또한 본 발명의 단일클론항체는, 상기한 바와 같은 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편으로서 비브리오 폐혈증 치료 및 진단에 사용될 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 비브리오 패혈증의 검출을 위한 진단키트에 사용되는 단일클론항체는, 이 항체가 비브리오 패혈증균의 RtxA1 항원을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 단일클론항체의 단편도 사용할 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 비브리오 패혈증 진단키트에는 RtxA1 항원을 선별적으로 인지하는 단일클론항체 또는 이의 단편 및 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다.
면역학적 분석에 사용되는 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함될 수 있다. 또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소
수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 항원-항체 복합체 형성에 대한 검출 방법 및 진단키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는 항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip)등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 단일클론항체를 포함하는 약학 조성물은 이미 사용되고 있는 항히스타민제, 소염진통제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
<실시예 1> 비브리오 패혈증균의 재조합 RtxA1 합성을 위한 올리고 뉴클레오타이드 합성
NheI 및 XhoI 제한효소 인식부위를 갖는 하기 2개의 올리고 뉴클레오타이드를 합성하였다. 또한 RA-4701R 올리고 뉴클레오타이드는 재조합 RtxA1의 정제 과정 중 히스티딘-결합 레진을 이용한 크로마토그래프에 의한 정제과정을 추가 포함하기 위하여 6개의 히스티딘을 포함하고 있다.
RA-3491F: 5'-ACATGAATTCATGCAGAGAAGTTTGGCGACTAC-3' (서열번호: 1, 전방 프라이머)
RA-4701R: 5'-CTCCTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGCACCGTTATACCCTTTTTATG-3' (서열번호: 2, 후방 프라이머)
상기 뉴클레오티드를 후속하는 비브리오 패혈증균 RtxA1 유전자의 증폭 (하기 실시예 2) 및 재조합 RtxA1 단백질 생산을 위한 재조합벡터의 제조에 이용하였다.
<실시예 2> 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction (PCR))
중합효소 및 상기 실시예 1에서 합성한 전방 프라이머(서열번호 1) 및 후방 프라이머(서열번호 2)를 혼합한 반응용액에 비브리오 패혈증균 RtxA1 전장 DNA(서열번호 3, 14106bp)를 주형 (template)으로 혼합하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 4701부분을 증폭(RtxA1(3491-4701)로 명명함)하였다. 서열번호 4는 전장 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열이다. 중화연쇄반응을 위하여 써멀 싸이클러 (Thermal cycler(PTC-100), MJ Research. Inc, 미국)를 사용하였으며 94℃에서 3분간 사전변성 (predenaturation) 시킨 후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 55℃에서 1분간 결합(annealing), 및 72℃에서 4분간 연장 (extension)을 30회 반복 실시하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 추가반응시켰다. 다음 중합효소와 비특이 증폭산물을 제거하기 위해 아가로즈 겔에서 전기영동 후 목적하는 원하는 증폭산물 밴드 부위를 조각내어 겔 추출 키트 (Geneall, 한국)를 이용하여 정제하였다.
<실시예 3> 재조합 RtxA1 제조용 벡터의 제작
도 1의 개열지도를 갖는 재조합 RtxA1 플라스미드 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2에서 정제된 C-말단에 His-tag 서열인 CATCATCATCATCATCAT이 삽입 된 RtxA1(3491-4701)의 증폭산물을 EcoRI (Fermentas, 캐나다)으로 절단 후 대장균 중합효소인 Klenow (New England Biolab, 미국)을 이용하여 절단면을 채우고 (fill in), XhoI (Fermentas, 캐나다)으로 절단하였다. 또한 pET-21(a) (Novagen, 미국) 벡터는 NheI (Fermentas, 캐나다)으로 절단 후 대장균 중합효소인 Klenow (New England Biolab, 미국)을 이용하여 절단면을 채우고 (fill in), XhoI (Fermentas, 캐나다)으로 절단하였다. 절단된 단편과 벡터는 상기 실시예 2에서 이용된 겔 추출 키트 (Geneall, 한국)를 이용하여 정제한 후 정제된 RtxA1 유전자 단편 1 μg과 pET-21(a) 단편 30 ng을 혼합하고, 10배 농도의 접합 농축액 (10 mM DTT, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, 600 mM Tris-HCl, pH7.5) 1 ㎕ 및 T4 DNA 연결효소 (ligase, Takara) 10 단위 (unit)를 가하여 전체 부피를 10 ㎕로 조정하고 상온에서 16시간 반응시켜, pET-21(a) 벡터에 재조합 RtxA1 유전자(서열번호 5+His-tag 서열)가 삽입된 9,027bp의 도 1의 개열지도를 갖는 환형 플라스미드 (pET-RtxA1(3491-4701)로 명명)를 제조하였다. 다음 플라스미드를 증폭하고, RtxA1(3491-4701) 유전자(서열번호 5)가 삽입된 pET-RtxA1(3491-4701)만을 순수분리하기 위해 대장균 DH5α (Invitrogen, 미국)에 삽입하였다. 형질전환된 대장균으로부터 재조합 pET-RtxA1(3491-4701)을 재추출한 후 DNA 염기서열 분석과 제한효소 처리하고 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 pET-RtxA1(3491-4701)에 비브리오 패혈증균 RtxA1(3491-4701) 유전자의 존재유무를 확인하였다.
<실시예 4> 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 발현
상기 실시예 3에서 제조한 재조합 RtxA1 벡터 pET-RtxA1(3491-4701)의 발현을 위해 대장균 BL21(DE3)/pLy S (Invitrogen, 미국)에 삽입하였다. 형질전환 된 대장균을 37℃ 진탕 배양기에서 4시간 배양한 후 1mM IPTG을 첨가하여 다시 3시간을 더 배양하였다. 이렇게 배양한 형질전환된 대장균을 8,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후, 대장균침전물은 용출완축액 (300 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl(pH 7.5), 10% glycerol, 0.1% Tween-20)으로 현탁하였다. 단백질 추출을 위해 현탁된 대장균침전물을 초음파분쇄기 (sonicator)를 이용하여 파쇄한 후 원심분리에 의해 상등의 단백질 추출액을 수집하고, 세포 파쇄액에 대해 10% SDS-PAGE를 실시하였다 (도 2A). 도 2A에서 분자량은 도 2A의 오늘 쪽에 표시되어 있고, 제 1과 2 레인은 각각 재조합 RtxA1 벡터 pET-RtxA1(3491-4701)로 형질전환된 대장균에서 재조합 RtxA1 단백질를 발현하기 전과 후 추출된 단백질이다.
화살표는 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 위치를 나타낸다. 도 2A에서 확인되는 바와 같이 pET-RtxA1(3491-4701)로 형질전환된 대장균에서 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질이 발현됨을 알 수 있다.
<실시예 5> 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 정제
재조합 RtxA1(3491-4701) 제조용 벡터 pET-RtxA1(3491-4701)으로 형질전환된 대장균에서 상기 실시예 4의 방법으로 단백질을 추출한 후, Ni-NTA 크로마토그래피 (Qiagen, 미국)를 제조자의 지시에 따라 이용하여 단백질 추출액으로부터 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질을 1차적으로 정제하였다. Ni-NTA 크로마토그래피를 이용하여 1차 정제한 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질을 겔 여과 액체크로마토그래피(size exclusion-HPLC) (GE Healthcare, 미국)을 이용하여 2차적으로 순수 정제하여 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질(서열번호 6+His-tag) 을 생산하였다. 정제 양상과 정제 효율은 SDS-PAGE를 실시하여 확인하였다 (도 2A). 도 2A에서 레인 3와 4는 각각 Ni-NTA 크로마토그래피와 겔 여과 액체크로마토그래피에서 정제된 단백질이고, 화살표는 정제된 재조합 RtxA1 (3491-4701) 단백질의 위치를 나타낸다. 도 2A의 레인 4에서 확인되는 바와 같이 정제된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질은 98%의 순도를 보였다.
<실시예 6> 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질의 특이성 분석
상기 실시예 5에서 확인된 130 kDa의 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질과 대조군 우혈청알부민(BSA) 단백질을 SDS-PAGE를 실시하고, 전기영동 종료 후 겔 상 단백질을 토우빈 (Towbin)의 (Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76:4350-4354)방법에 따라 Nitrocellulose 막 (Bio-Rad)으로 옮겼다. 단백질이 이적된 막을 5% 탈지유 (skim milk)가 함유된 인산완충용액으로 비특이반응을 차단하였다. 여기에 실시예 7의 재조합 RtxA1 항원단백질을 Sigma adjuvant와 동량(부피비로 1:1)으로 혼합한 다음 3주 간격으로 4차례 BALB/C(암컷, 8 주령) 마우스의 복강에 200㎕씩 주사한 후 한 달 후 마우스 혈청에서 얻은 비브리오 폐혈증균 RtxA1 단백질에 대한 다클론항체(polyclonal antibody)를 1:1000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 퍼옥시다제로 표지된 IgG (Jackson labatory, 미국) 2차 항체를 제조사의 지시에 따라 희석하여 사용하였다. 1차와 2차 항체로 반응시킨 후에는 인산완충용액으로 3회에 걸쳐 세척하였다. 2차 항체반응 및 세척이 끝난 막에 ECL 웨스턴 블럿 (western blot) 기질액 (Amersham, 미국)을 처리하고, 발광영상분석기(LAS-1000 luminescent image analyzer; Fujifilm, 일본)를 이용하여 결과를 분석하였다 (도 2B). 도 2B서 제 1 레인은 대조군 우혈청알부민(BSA) 단백질이고, 레인 2은 제조합 RtxA1(3491-4701) 단백질이다. 도 2B에서 확인되는 바와 같이 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질은 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 항체에 대해서 양성반응을 보이나, 대조군 우혈철알부민은 반응하지 않았다. 따라서, 실시예 5에서 순수 정제된 130 kDa의 재조합 단백질은 RtxA1(3491-4701) 단백질임이 확인되었다.
결국, 본 발명에 따른 재조합 RtxA1(3491-4701)은 비브리오 폐혈증균 RtxA1의 단일클론항체 생성에 매우 유용한 재조합 RtxA1 단백질 항원을 제공한다. 또한 이는 비브리오 폐혈증균 RtxA1을 이용한 진단에 매우 유용한 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질 항원을 제공하고, 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질 항원의 대량발현 및 정제가 용이하게 한다. 따라서 이와 같은 형질전환 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701)단백질은 비브리오패혈증균에 대한 진단제 또는 진단키트, 비브리오 패혈증 예방 또는 치료용 백신의 제조, 및 비브리오 패혈증균에 대한 항체 생산 등에 이용될 수 있다.
<실시예 7> 단일클론 항체 생산 세포주 제작을 위한 마우스 면역
실시예 5에서 제조된 RtxA1(3491-4701) 재조합 항원단백질(서열번호 6+His tag)을 Sigma adjuvant(Sigma, 미국)와 동량(부피비로 1:1)으로 혼합한 다음 3주 간격으로 4차례 BALB/C(암컷, 8 주령) 마우스의 복강에 200㎕씩 주사하였다. 4번째 면역 후 한 달 후 꼬리 정맥으로 정제된 재조합 RtxA1(3491-4701) 단백질을 투여한 3일 후에 비장을 적출하여 세포융합에 사용하였다.
<실시예 8> B-임프아세포(B-lymphoblast)인 P3X63Ag8.653 배양
세포융합하기 4~5일 전에 질소통에서 myeloma 세포인 P3X63Ag8.653 (ATCC accession number CRL-1580)를 꺼내 10% 우태아혈청이 첨가된 IMDM(Invitrogen, 미국) 배지에 현탁시키고 1,000rmp에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 침전세포를 조심스럽게 10% 우태아혈청이 첨가된 IMDM에 다시 현탁시켜 5% 탄산가스가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
<실시예 9> 세포융합
세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법 (Ed Harlow, David Lane : Antibodis, A laboratory manual. Cold Springs Harbor press, 1988 P139-244)에 따라 다음과 같이 실시하였다. 실시예 7에서 적출한 비장에서 비장세포들(splenocytes)을 cell strainer(Falcon, 미국)를 이용하여 분리하고 1x108 세포/㎖의 농도로 희석하였다. 1x107 세포/㎖의 myeloma 세포와 1㎖의 PEG1500(Sigma, 미국)을 동량으로 혼합하여 융합시켰다. 융합이 완료된 세포를 200㎖의 HAT(Sigma, 미국) 배지에 희석시킨 후 96 웰 마이크로플레이트에 100 ㎕씩 분주하고, 5% 탄산가스가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였다.
<실시예 10> 세포융합 하이브리도마에서 RtxA1(3491-4701)항체생성 조사
융합된 세포의 항체 생성 여부는 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 항원과 융합된 세포 배양액을 이용하여 ELISA를 실시하여 조사하였다. 재조합 RtxA1(3491-4701) 항원 단백질을 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)으로 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 항원을 코팅하였다. 항원이 코팅된 각 웰에 1% BSA 가 포함된 블러킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열 비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이 반응을 차단하였다. 각 웰에 융합된 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 Biotin-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (1:2,000; Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 HRP (Horseradish peroxidase)-축합 streptavidin (Invitrogen, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 후 다시 세척완충용액으로 3회 세척한후 연이어 TMB (3,3',5,5' - tetramethyl-benzidine) (Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 비브리오 패혈증균 RtxA1(3491-4701) 항원과 반응하는 10개의 하이브리도마를 얻었다 (표 1).
<실시예 11> 하이브리도마 세포의 클로닝
융합된 10개의 하이브리도마 세포의 클로닝을 위하여 실시예 5에서 얻은 비브리오 패혈증균 RtxA1(3491-4701) 항원과 반응하는 하이브리도마를 96 웰 플레이트의 첫 번째 웰에 약 10개의 세포가 들어가도록 세포 부유액을 넣은 후 행으로 2배 단계 희석하고, 이를 다시 열로 2배 단계 희석하는 방법으로 2회 클로닝 하였다. 선별 된 하이브리도마 클론은 30% 우태아 혈청과 7.5% DMSO (dimethyl sulfoxide)가 함유된 IMDM배지에 현탁시켜 액체질소에 보관하였다.
<실시예 12> 단일클론 항체의 정제
항체를 생성하는 클로닝된 10개의 하이브리도마 세포를 37℃, 5% 탄산가스 항온기에서 배양 후 상등액에서 항체를 정제하였다. 항체의 정제는 단백질 A 또는 G 크로마토그래피(Peptron, 한국)를 이용하였으며, 실험과정은 제조사의 방법에 따라 수행하였다. 정제 후 SDS-PAGE를 실시하여 정제도가 98%이상임을 알 수 있었다 (도 3). 도 3의 1레인에는 단백질표준 분자량 표지되어 있고, 레인 2은 단백질 A 크로마토그래피에서 정제된 항체를 보여 준다.
<실시예 13> 이소타이핑에 의한 단일클론 항체의 선별
선별된 10개의 하이브리도마 클론으로부터 단일클론 항체의 이소타입 (isotype)의 결정은 ELISA를 실시하여 조사하였다. 이소타입 결정을 위하여, 토끼에서 생선 된 각각의 mouse 이소타입에 대한 정제된 항체가 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)로 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 항체를 코팅하였다. 각각의 이소타입 항체가 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 블러킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열 비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이 반응을 차단하였다. 각 웰에 융합된 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 실세척 후 1:1000배 희석한 HRP (Horseradish peroxidase)-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (1:2000; Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 TMB (3,3',5,5' - tetramethylbenzidine) (Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이소타입을 결정한 결과, 하기 표 1에 정리된 바와 같이 중쇄 (heavy chain)의 서브클래스에 따라서 분류하면 6개는 IgG1 서브클래스, 3개는 IgG2a 서브클래스, 나머지 1개는 IgG2b 서브클래스였다. 일반적으로 IgM 항체는 진단제 개발을 위해 이용되는 고상표면이나 표적 (target) 항원 이외의 다른 성분과 비특이적으로 흡착하는 특성을 갖고 있다. 따라서 본 발명을 통해 얻어진 10개의 모든 단일클론항체는 진단용 단일클론 항체로 이용 가능한 항체로 선정하였다. 이후 제반실험에서는 이 항체만을 이용하여 특성분석을 실시하였다.
<실시예 14>: 단일클론 항체의 친화도 분석 및 항원결정기 분석을 위한 RtxA1(3491-4701) 조각의 발현
비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 4701을 포함하는 재조합 RtxA1 (3491-4701) 단백질은 실시예 4에서 발현된 것을 사용했다. 비브리오 패혈증균 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 4380을 포함하는 RtxA1 (3491-4380)의 유전자 부위는 EcoRI 및 XhoI 제한효소 인식부위를 갖는 하기 2개 (RA-3491F2와 RA-4308R)의 올리고 뉴클레오타이드와 중합효소연쇄반응를 이용하여 실시예 2와 같은 방법으로 증폭하였다.
RA-3491F2: 5´-ACATGAATTCATACCATGGCAGAGAAGTTTGGCGACTAC-3´(서열번호 7, 전방 프라이머)
RA-4380R: 5´-CCATTCTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGCGTGCCTGTTGCGTAGAACAC-3´ (서열번호 8, 후방 프라이머)
또한 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 3980을 포함하는 RtxA1 (3491-3980)의 유전자 부위는 EcoRI 및 XhoI 제한효소 인식부위를 갖는 하기 2개 (RA-3491F2와 RA-3980R)의 올리고 뉴클레오타이드와 중합효소연쇄반응을 이용하여 실시예 2와 같은 방법으로 증폭하였다.
RA-3491F2: 5´-ACATGAATTCATACCATGGCAGAGAAGTTTGGCGACTAC-3´´(서열번호 9, 전방 프라이머)
RA-3980R: 5´-CCATTCTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGCTCACCCGAGGTGGCAATGC-3´ (서열번호 10, 후방 프라이머)
증폭된 RtxA1 (3491-4380)과 RtxA1 (3491-3980) 유전자 부위는 실시예 3과 같은 방법으로 pET-21(a) 벡터에 삽입되고, 실시예 4와 같은 방법을 이용하여 형질 전환된 대장균을 이용하여 재조합 RtxA1 (3491-4380)과 RtxA1 (3491-3980) 단백질이 발현하고 추출하였다 (도 4B). 추출된 재조합 단백질의 특이성 분석은 실시예 6과 같은 방법을 이용하여 확인 되었다 (도 4C). 도 4A는 혈질 전환 대장균에서 발현된 재조합 RtxA1(3491-4701) 조각 단백질을 모식적으로 보여 주고 있다. 도 4B에서 분자량 크기는 도의 왼쪽에 표시 되어 있고, 제1레인, 2레인, 3레인과 4레인은 각각 대조군 재조합 단백질과 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1(3491-3980)을 발현하는 형질 전환 대장균에서 추출된 단백질이다. 화살표는 발현된 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1(3491-3980) 단백질의 위치를 나타낸다. 도 4C에서는 비브리오 패혈증균 RtxA1 단백질에 대한 항체를 이용하여 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1 (3491-3980) 단백질의 특이성을 분석하였다. 분자량 크기는 도의 왼쪽에 표시 되어 있고, 제1레인, 2레인, 3레인과 4레인은 각각 대조군 재조합 단백질, 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1(3491-3980)을 발현하는 형질 전환 대장균에서 추출된 단백질이다. 화살표는 RtxA1 단백질에 대한 항체가 양성 반응 보이는 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1 (3491-3980) 단백질의 위치를 나타낸다. 도 4B와 4C를 통해 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1(3491-3980)이 확인되었다.
<실시예 15> 단일클론 항체의 친화도 분석 및 항원결정기 분석
진단과 치료용 단일클론 항체의 선별에 유용한 정보로 사용되는 단일클론 항체의 친화도 분석 및 항원결정기 분석은 실시예 14에서 확인 된 재조합 RtxA1 (3491-4701)의 조각과 ELISA법에 의해 실시되었다. 재조합 RtxA1 (3491-4701), RtxA1 (3491-4380), RtxA1 (3491-3980) 단백질을 발현하는 형질전환 대장균 추출물을 각각 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)으로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 각각의 재조합 단백질을 코팅하였다. 각각의 재조합 단백질이 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 블로킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열 비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이 반응을 차단하였다. 각 웰에 단일클론 항체를 포함한 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 Biotin-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (1: 2,000; Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 HRP (Horseradish peroxidase)-축합 streptavidin를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시키 후 다시 세척완충용액으로 3회 세철한후 연이어 TMB (3,3',5,5' - tetramethyl-benzidine) (Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다 (표 1). 단일클론 항체의 친화도 분석 및 항원결정기 분석결과, 표 1에 정리된 바와 같이 5개 (5RA, 7RA, 8RA, 9RA,11RA)는 재조합 단백질 RtxA1 (3491-4701) 항원을 강하게 인식했다. 반면, 1RA와 10RA 단일클론 항체는 RtxA1 (3491-4701) 항원을 중간 정도의 강도로 인식 했고, 2RA, 3RA와 4RA 단일클론 항체는 RtxA1 (3491-4701) 항원을 약하게 인식했다. 2RA, 3RA, 8RA와 11RA 단일클론 항체는 RtxA1의 아미노산 서열 3491부터 3980부분을 인식하였고, 1RA, 5RA, 7RA와 9RA 단일클론항체는 RtxA1의 아미노산 서열 3981부터 4380부분에 결합하였다. 4RA와 10RA에 단일클론항체는 RtxA1의 아미노산 서열 4381부터 4701부분을 인식하였다. 따라서 본 발명을 통해 항원결정기가 다른 3 그룹의 단일클론 항체를 확보할 수 있었으며 각 그룹의 단일클론 항체들은 비브리오 패혈증균의 항원진단제 개발뿐만 아니라 비브리오 패혈증균에 대한 기초연구에서도 유용하게 이용될 수 있다.
<실시예 16> 열변성 RtxA1 (3491-4701)항원에 대한 단일클론 항체의 반응성 분석.
특정 항원에 특이적인 단일클론 항체는 감염 표본의 고온처럼 변성조건에서 항원을 검출하는 진단제 개발에 이용될 수 있다. 이에 본 발명에서는 재조합 RtxA1 (3491-4071) 항원을 100℃에서 3분간 열처리하여 열변성 RtxA1 (3491-4701) 항원을 얻은 후 ELISA을 실시하여 각 단일클론 항체의 반응성을 조사하였다. 열변성 재조합 RtxA1 (3491-4701) 항원을 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)으로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc, 미국)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜 각각의 재조합 단백질을 코팅하였다. 각각의 재조합 단백질이 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 블러킹완충용액 (PBS, 0.05% Tween-20, 1% BSA, 3% 열 비활성 말 혈청)을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이 반응을 차단하였다. 각 웰에 단일클론 항체를 포함한 세포배양액을 50 ㎕씩 첨가하고, 4℃에서 1 시간 반응한 다음 세척완충용액(PBS, 0.05% Tween-20, 0.05% BSA)으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 Biotin-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (1:2,000, Sigma, 미국)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 세척완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 HRP (Horseradish peroxidase)-축합 streptavidin를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 후 다시 세척완충용액으로 3회 세척한후 연이어 TMB (3,3',5,5' - tetramethyl-benzidine) (Sigma, 미국) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 2N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 단일클론 항체의 열변성 RtxA1 (3491-4701)항원에 대한 단일클론 항체의 반응석 분석결과, 표 1에 정리 된 바와 같이 1RA, 2RA, 3RA, 5RA, 7RA, 8RA, 9RA와 11RA는 열변성 RtxA1 (3491-4701)항원을 인식하였지만, 4RA와 10RA는 열변성 RtxA1 (3491-4701)항원을 인식하지 못 했다. 따라서, 본 발명에서 확보된 단일클론 항체는 검사 표본의 고온처리 후 변성된 항원검출을 위한 진단제 개발에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
<실시예 17> 야생종 비브리오 패혈증균에 대한 단일클론 항체의 반응성 분석.
야생종 비브리오 패혈증균에서 생성되는 RtxA1 독소 단백질에 대한 단일클론 항체의 반응성을 분석하기 위해서 면역블럿 (Immunoblot)을 수행 하였다. 야생종 비브리오 패혈증균 M06-24/O 균주를 (Reddy GP, Hayat U, Abeygunawardana C, Fox C, Wright AC, Maneval DR, Jr., Bush CA, Morris JG, Jr. J Bacteriol 1992;174:2620-2630) 2.5% NaCl을 포함한 HI 배지에 접종 후 37℃ 진탕 배양기에서 16시간 배양하였다. 이 배양액을 1/200로 다시 2.5% NaCl이 포함한 HI 배지에 접종한 후 37℃ 진탕 배양기에서 2 시간 본 배양을 시행하였다. 이렇게 배양한 본 배양액을 12,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액 300 ㎕ 와 차가운 아세톤 (Sigma, 미국) 1,200 ㎕ 을 혼합해서 -20℃에 30분간 처리 하였다. 이렇게 30분 처리한 배양 상등액과 아세톤 혼합물을 12,000rpm에서 15분간 원심분리 한 후 침전물을 수집하고, 이 침전물을 20 ㎕ 2x 샘플 완충용액에 용출시킨 후 10% SDS-PAGE를 실시하였다. SDS-PAGE 종료 후 겔 상 단백질을 토우빈 (Towbin)의 (Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76:4350-4354) 방법에 따라 Nitrocellulose 막 (Bio-Rad, 미국)으로 옮겼다. 단백질이 이적된 막을 5% 탈지유 (skim milk)가 함유된 인산완충용액으로 비특이반응을 차단하였다. 여기에 50 ㎍/㎖로 희석한 비브리오 패혈증균 RtxA1 단일클론 항체를 이용하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 퍼옥시다제로 표지된 IgG (Jackson labatory, 미국) 2차 항체를 제조사의 지시에 따라 희석하여 사용하였다. 1차와 2차 항체로 반응시킨 후에는 인산완충용액으로 3회에 걸쳐 세척하였다. 2차 항체반응 및 세척이 끝난 막에 ECL 웨스턴 블럿 (western blot) 기질액 (Amersham, 미국)를 처리하고, 발광영상분석기(LAS-1000 luminescent image analyzer; Fujifilm, 일본)를 이용하여 결과를 분석하였다 (도 5). 도 5에서 제 1 레인은 대조군으로 RtxA1 유전가 삭제된 돌연변이 비브리오 패혈증균주 CMM744 (Kim YR, Lee SE, Kook H, Yeom JA, Na HS, Kim SY, Chung SS, Choy HE, Rhee JH. Cell Microbiol 2008;10:848-862)의 배양액이고, 레인 2는 야생종 비브리오 패혈증균의 배양액이다. 도 5에서 확인되는 바와 같이 1RA, 5RA, 11RA 단일클론 항체는 양생종 비브리오 패혈증균 배양액에 대해서 130 kDa 크기에서 양성 반응을 보였다. 따라서, 1RA, 5RA, 11RA 단일클론 항체는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원의 검출용 진단제 개발을 위해 유용할 것이다.
<실시예 18> 단일클론 항체의 여러 비브리오 패혈증균 균주에 대한 교차반응.
효율적이고 유용한 비브리오 패혈증균의 검출용 진단제 개발을 위해서는 단일클론 항체가 여러 비브리오 패혈증균 균주에 대한 교차반응을 보여야 하기 때문에 본 발명에서 확보된 단일클론 항체들과 여러 비브리오 패혈증균주의 교차 반응성을 조사 하였다. 이를 위하여, 환자에서 분리된 비브리오 패혈증균주(ATCC 29307 (ATCC, 미국), CMCP6 (Kim YR, Lee SE, Kim CM, Kim SY, Shin EK, Shin DH, Chung SS, Choy HE, Progulske-Fox A, Hillman JD, Handfield M, Rhee JH. Infect Immun 2003;71:5461-5471), YJ016 (Chen CY, Wu KM, Chang YC, Chang CH, Tsai HC, Liao TL, Liu YM, Chen HJ, Shen AB, Li JC, Su TL, Shao CP, Lee CT, Hor LI, Tsai SF. Genome Res 2003;13:2577-2587))와 환경 균주(Env1 (Rosche TM, Smith B, Oliver JD. Appl Environ Microbiol 2006;72:4356-4359.))을 각각 2.5% NaCl을 포함한 HI 배지에 접종 후 37℃ 진탕 배양기에서 16시간 배양하였다. 이 배양액을 1/200로 다시 2.5% NaCl이 포함한 HI 배지에 접종한 후 37℃ 진탕 배양기에서 2 시간 본 배양을 시행하였다. 이렇게 배양한 본 배양액을 12,000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액 300 ㎕ 와 차가운 아세톤 (Sigma, 미국) 1,200 ㎕ 을 혼합해서 -20℃에 30분간 처리하였다. 이렇게 30분 처리한 배양 상등액과 아세톤 혼합물을 12,000rpm에서 15분간 원심분리 한 후 침전물을 수집하고, 이 침전물을 20 ㎕ 2x sample 완충용액에 용출시킨 후 10% SDS-PAGE를 실시하였다. SDS-PAGE 종료 후 겔 상 단백질을 토우빈 (Towbin)의 (Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76:4350-4354) 방법에 따라 Nitrocellulose 막 (Bio-Rad, 미국)으로 옮겼다. 단백질이 이적된 막을 5% 탈지유 (skim milk)가 함유된 인산완충용액으로 비특이반응을 차단하였다. 여기에 50 ㎍/㎖로 희석한 비브리오 패혈증균 RtxA1 단일클론 항체를 이용하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 퍼옥시다제로 표지된 IgG (Jackson labatory, 미국) 2차 항체를 제조사의 지시에 따라 희석하여 사용하였다. 1차와 2차 항체로 반응시킨 후에는 인산완충용액으로 3회에 걸쳐 세척하였다. 2차 항체반응 및 세척이 끝난 막에 ECL 웨스턴 블럿 (western blot) 기질액 (Amersham, 미국)를 처리하고, 발광영상분석기(LAS-1000 luminescent image analyzer; Fujifilm, 일본)를 이용하여 결과를 분석하였다 (도 6). 도 6A와 6B에서 제 1 레인은 대조군으로 RtxA1 유전가 삭제된 돌연변이 비브리오 패혈증균주 CMM744의 배양액, 레인 2는 ATCC 29307 비브리오 패혈증균주의 배양액, 레인 3는 CMCP6 비브리오 패혈증균주의 배양액, 레인 4는 YJ016 비브리오 패혈증균주의 배양액, 레인 5는 Env1 비브리오 패혈증균주의 배양액이다. 도 6A에서 확인되는 바와 같이 5RA 단일클론 항체는 ATCC 29307, CMCP6와 YJ016 비브리오 패혈증균주 배양액에 대해서 130 kDa 크기에서 양성 반응을 보였고, 도 6B에서 11RA 단일클론항체는 ATCC 29307, CMCP6, YJ016와 Env1 비브리오 패혈증균주의 배양액에 대해서 130 kDa 크기에서 양성 반응을 보였다, 따라서, 5RA와 11RA 단일클론 항체는 여러 비브리오 패혈증균주들에 RtxA1 항원의 검출용 진단제 개발을 위해 유용할 것이다.
<실시예 19> 비브리오 패혈증균에 감염된 세포에서 단일클론 항체의 반응성 분석
최근까지는 박테리아의 조직 감염 진단을 위해 표준진단법으로 면역형광항체법 (immunofluorescence assay)이 널리 이용되어 왔기 때문에 본 발명에서 확보된 단일클론 항체와 비브리오 패혈증균의 반응성을 조사하기 위해 비브리오 패혈증균이 접종된 헬라 (HeLa)세포 (ATCC, 미국)를 이용하여 간접면역형광항체법을 수행하였다. 비브리오 패혈증균를 FA (fluorescence assay)용 슬라이드(Nunc, 미국)에서 단층배양된 헬라세포에 100 MOI로 1시간 접종하고, 3.7% 포름알데하이드 (formaldehyde)로 감염된 세포를 고정하였다. 고정된 비브리오 패혈증균 감염세포는 0.2% 트리이톤 액스-100 (Triton X-100)을 처리한 후 각 단일클론 항체를 1% BSA가 포함된 인산완충용액을 이용하여 10~50 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 처리하고, 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후 인산완충용액을 이용해서 3회 세척하였다. 세척 후 Alexa Flour 488 축합 항-마우스 IgG항체 (20 ㎍/㎖; Invitrogen, 미국)를 처리하고, 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 인산 완충용액으로 3회 세척하고, DAPI을 포함한 ProLong Gold anti-fade (Invitrgen, 미국) 용액으로 mounting 한 후 형광현미경하에서 관찰하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, RtxA1 돌연변이 비브리오 패혈증균주 CMM744에서는 단일클론 항체가 음성 반응을 보였지만, 야생종 비브리오 패혈증균이 감염된 세포에서는 분명한 양성 반응을 보였다. 따라서, 1RA, 4RA, 5RA, 11RA 단일클론 항체는 비브리오 패혈증균이 감염된 세포에서 RtxA1 항원의 검출용 진단제 개발을 위해 유용할 것이다.
단일클론항체
 이소타입

 열변성 항원에 대한 반응성
 친화도(Binding activity)
RtxA1(3491-4701) RtxA1(3491-4380) RtxA1(3491-3980)
1RA IgG1 양성 중 약 음성
2RA IgG2a 양성 약 약 중
3RA IgG1 양성 약 약 중
4RA IgG1 음성 약 음성 음성
5RA IgG2a 양성 강 약 음성
7RA IgG1 양성 강 약 음성
8RA IgG2b 양성 강 강 강
9RA IgG1 양성 강 약 음성
10RA IgG1 음성 중 음성 음성
11RA IgG2a 양성 강 중 강
상기 표 1을 통해 알 수 있듯이, 재조합 RtxA1 단백질을 면역원으로 이용하여 융합된 하이브리도마 세포 10개에서 생산된 각각의 단일클론항체 중 이소타입에 따른 대량생산가능성, 열변성 항원에 대한 반응성 및 RtxA1 항원과의 친화도 및 다른 종류의 비브리오 패혈증균에 대한 교차가능성 등을 종합하면 5RA, 11RA 가 가장 우수한 효과를 나타내었다. 따라서, 상기 5RA는 한국세포주연구재단(Korean Cell Line Research Foundation)에 기탁번호 KCLRF-BP-00261로 기탁하고, 11RA는 기탁번호 KCLRF-BP-00262로 기탁하였다.
본 발명을 통해 비브리오 패혈증균에 대한 진단, 예방 및 치료 용이하게 수행할 수 있으므로 의료산업에 폭넓게 이용될 수 있다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00262 20110328
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Monoclonal antibody specific to Vibrio vulnificus RtxA1, hybridoma producing the monoclonal antibody and diagnostic kit comprising the monoclonal antibody <130> P-1 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 acatgaattc atgcagagaa gtttggcgac ta 32 <210> 2 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 2 ctcctcgagc taatgatgat gatgatgatg caccgttata cccttttta 49 <210> 3 <211> 14106 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 3 atgggaaaac cattttggag aagtgttgaa tacttcttca cagggaacta ttccgccgac 60 gatggaaaca acagtattgt tgctatcggt tttggtggag aaatccatgc ctacggtggt 120 gatgatcatg tcactgtcgg atcgattggt gcaacggttt ataccggcag cggcaatgat 180 acggtcgtag gcggttcggc atatctaaga gtggaagaca ccacagggca cctttctgta 240 aaaggcgcag ctgggtatgc agacattaat aaaagtagcg atggcaatgt gtcattcgct 300 ggtgccgctg gcggtgtgtc gattgaccac ttaggtaatc atggtgatgt cagttacggc 360 ggtgccgcgg cttataatgg cattacccgc aaaggtttga gcggcaacgt cacctttaaa 420 ggcgctggcg gttacaatgc cctatggcat gaaaccaacc aaggtaatct ctcttttgct 480 ggcgcaggag cgggcaataa actagaccgt acttggttca accgttatca aggctcgcgt 540 ggtgatgtga cgtttgatgg cgctggcgcg gcaaacagca tcagttcacg tgttgacaac 600 attactttcc gtggggctgg tgctgacaac catttggtcc gtaaaggcaa agtgggcgac 660 attaccttgc aaggtgcggg cgcatcaaac cgcattgagc gtacacgcca agcggaagat 720 gtttacgcgc aaacacgcgg taacattcgc tttgaaggtg tcggtggtta caacagcctt 780 tactccgatg tggcacacgg tgacatccat ttctccggtg gcggtgctta taacaccatt 840 acacgaaaag gcagtggtag tagcttcgat gctcaaggta tggaatacgc gaaagcggaa 900 gacattgttc tcaccgcggc gcagatgcat ggtttatcga ttgataacgg caacaagttc 960 catgcggtta ccgctgtaaa atcagagcga gagccaaata cttatctgtt tgctatcgca 1020 gatggtactt acaccaaaat caacaaagtt cgtctctata acgatccaga aacgggcaaa 1080 ctcaaatact actctgaagc ttggttcaag cgcggtaatc atttagcgga gcttgctcgt 1140 tctgatgtct cttctgctgg tggttttgaa gtcaatccaa tcaatggtgg ttacaccctt 1200 tctaatattg ccgttgagca tcagcaatcg ttaaccgttc atgctgtcga gaaggacctg 1260 accgaatatg agtgggtgac ctacgccaat ggcgcactga ttgatgcgaa agatgtggca 1320 ttatcagatg cgaaaatggg cggtcacgct atctcgaccg atgggacgac agtcgatgtt 1380 caagcggtga aatcaaaccg aaaaccaaac acttatgttt acgcaaaagt gcttgggcct 1440 tacacaaaaa ttgtggtggt tgaacttgct aatgatccca aaacaggggc gcttaagtat 1500 caagctcgtt cttggtacaa agagggtaat cacaccgcaa acctagccaa tgaagatatt 1560 tcgtctgcaa acggatatca ctcgatgggc aaaggcggct actcactcag cgatctgcat 1620 tacagtgtga acgcggtaag aagcaccagc gaaaccgtgg ccgacatcga cgagtacacc 1680 gatcaaacct tgtttaagcc agcgaccgat agcggtgaaa gctctggtga tgtgcgcttc 1740 aatggtgcgg gtggcggtaa cgtcatcaag tccaatgtga ctcgcggcaa tgtctacttt 1800 aatggtggcg gtatcgctaa cgtcatcctc cacagttcgc aatttggtca taccgagttc 1860 aacggtggtg gcgcggcaaa cgtgattgtc aaaagtggcg aagaagggga tctcaccttc 1920 cgcggcgcgg gtttggcgaa cgtgttggta caccaaagca agcaaggcaa gatggatgtt 1980 tacgcgggcg gtgcggtaaa cgtactggtt cgtattggcg atggtcaata ccttgcgcat 2040 ttgctggctt acggcaacat ttccgtgcac aaaggcaatg gcaacagccg tgtcgttatg 2100 ctcggtggtt acaacaccca tacccaaatt ggctccggca acggcttgtg gttggcggcg 2160 ggcggcttca acgtgatgac gcaagtgggt aaaggtgatg tagcatcggt actggctggc 2220 ggcgccaacg tgctcaccaa agtgggtgac ggcgatctaa ccgcaggtat gttgggcggc 2280 gcaaacgtga ttacccgcat tagcggcgac aatgaaacct cgaataccac agccgtagcc 2340 ttaggcggtg ctaacattct caccaaaaaa ggcaaaggga atacccttgc ggtgatgggc 2400 ggtggcgcaa acgtgctgac gcatgtgggt gatggtacaa caactggcgt aatggtcggt 2460 ggtgcgaaca ttctcaccaa agtaggtaac ggcgacacga ccggcattat gcttggtgtt 2520 ggcaacgtgc taacgcatgt tggtgatggc caaactcttg gtgtgatggg cgcggcgggt 2580 aacatcttca ccaaagtggg tgatggaacc tctattgcgg tcatgattgg tgctggcaac 2640 atcttcaccc atgtgggaga agggaatgct tgggcgctga tgggcggctt gggtaacgtc 2700 tttaccaaag tcggcaacgg tgatgctctc gcgttaatgg tggcagaagc caacgtcttc 2760 actcacattg gtgatggcat gtcggtcgca ctaatgttag ccaaaggcaa cgttgcgaca 2820 aaagtgggta atggaaccac actcgctgca atggttggta acgccaatat cttcactcac 2880 gtaggcagtg gcagcacgtt tgctgcaatg atcggccaag ccaacatcat gaccaaagtg 2940 ggcaatgatc tcaccgcggc actgatggtc ggtaaagcca acatctacac ccatgtcggt 3000 gatgggacca gcctaggaat attcgcgggc gaagtgaacg tgatgactaa ggtcggtaac 3060 ggcacaacct tggcggcgat gttcggtaaa gccaacatca tgacgcatgt cggcgatggt 3120 ctaacgggcg tgttagcact gggcgaagcc aatattgtca ccaaagtggg tgatgatttc 3180 atgggtgttg tggcggcagc aaaagccaac gtcgtgactc atgttggtga tgcaacaacc 3240 gcggctgtgt tggctggtaa aggcaatttc ctaaccaaag tgggtgaagg caccacggta 3300 gggttgttga tttccgatat cggcaacgta atgacccacg tcggagatgg cacgaccatt 3360 ggtattgcca aaggcaaggc aaacatcatt accaaagtcg gtgatggttt gggcgtcaat 3420 gtcgcttggg ggcaagcaaa cgtgtttacc caagtgggcg acggtgatcg ctataacttt 3480 gccaaaggtg aagccaacat catcaccaaa gtaggtgatg gccaagaagt ctccgtggtg 3540 caaggtaaag ctaacatcat tactcatgtg ggcaatggcg acgactacac cggagcttgg 3600 ggtaaagcga acgtcattac taaagtgggt aatggccgta acgtggtact ggcaaaaggt 3660 gaagccaaca tcgtgaccca agtgggggat ggcgacagct ttaacgcact ttggagcaaa 3720 ggcaacatcg tcaccaaagt gggtgatggt atgcaggtga cggcagcaaa aggcaaagcc 3780 aatatcacta ccaccgttgg taatggcttg agtgtgacaa ccgcctatgg tgatgccaac 3840 atcaatacca aagtcggtga tggcgtatcc gtcaacgtcg cttggggcaa atataacatc 3900 aacacgaaag tgggtgatgg cctgaatgtt gccgtgatga aaggcaaagc taacgccaat 3960 attcacgtgg gcgatggcct caacatcaat gcctcttacg cacaaaacaa cgttgcaatc 4020 aaagttggta acggcgattt ttacagtttg gctgttgcgt caagcaacac cagcagcaac 4080 aagctctcag cactgtttga taatatcaag caaaccgtac ttggtgtcgg tggtagccaa 4140 gccatcaact acttggttca aggtgatgaa gcatcgtcat ccggtacgca aaaaggccgt 4200 ggtgcgattg caacaccgga aatcaccaag ctggatggtt tccaaatgga agccattgaa 4260 gaagtgggct cggacttggg cgatagccta accggcagtg ttactaaggt agatacccca 4320 gatctcaaca agatgcaaaa tgcactcgac gttgacggat cttctgatca aactcaagct 4380 ccgaatctca ttgtgaatgg tgattttgag caaggtgatc gtggttggaa atcgacacac 4440 ggtgttgaag cttcctattc gggcaatgtc tatggcgtga acggcgaagg tcacggcgca 4500 cgtgtgacgg aactggatac ctacaccaac accagtctct atcaagatct gaccgatctt 4560 acggaaggtg aagtcattgc tgtgagcttt gattttgcga aacgtgcagg tctatcgaat 4620 aacgaaggca ttgaagttct ttggaatggc gaagtcgtct tctcatcgtc tggtgatgcc 4680 tctgcttggc agcaaaaaac cttaaaactg accgcgcatg ctggcagtaa ccgaatcgaa 4740 ttcaaagcca caggccacaa tgatggactg ggctatatcc tagataacgt cgtggcgaaa 4800 tcggaatcgt cgcaacaagc caacgcagtg agtgagcacg cgacacaaaa tcaagcgtcg 4860 cagaatgtcc tatcagataa agagcgcgca gaagcggatc gccaacgtct tgaacaagaa 4920 aagcagaaac agcttgatgc tgtcgcaggg tcacaaagtc agttggagtc gaccgaccaa 4980 caagcgctag gaaataacgg tcaagctcaa cgtgatgcgg tgaaagaaga gtcggaagcc 5040 gtgaccgccg agttgacaaa actggcgcaa ggtctcgatg tgcttgatgg ccaagcaacg 5100 catactggcg agtcaggcga ccaatggcgc aatgattttg ccggtggtct gctcgatggc 5160 gttcaaagcc agctcgacga tgccaagcaa ctcgcgaatg acaagattgc tgcagcgaag 5220 cagacgcagt ttgacaataa cagcaaagtc aaagaatccg ttgcgaaatc tgaagcgggt 5280 gtggcacaag gtgagcaaaa tcgcgcaggt gcagagcaag acattgccga agctaaagcc 5340 gatgcagaaa cacgcaaagc cgatgctgtg gcgaaaagta acgatgcgaa acaggccgaa 5400 tctgacgcac acagcgccgc aaacgacgcg caatcgcgtg gtgatcgcga tgcgatgaat 5460 gccgaaaaca aagtcaacca agcgcagaat gatgccaaag ggaccaagca aaacgaaggc 5520 gatcgccctg accgtgaagg cgtggctggc agcggtcttt caggtaacgc tcatcgcgtg 5580 gaaggcgccg gcgaaacggg cagtcatgtc aacaccgaca gtccaaccaa cgccgatggt 5640 cgattcagtg aaggtctgag cgaacaagag caagaagcgc tggaaggtgc gacaaacgca 5700 gtgaaccgtc tgcaaattaa cgcaggtatt cgcggaaaga acagcggtag cacaatcacc 5760 tcaatgttca ccgaaacaaa ctccgacagc attgtggtgc caaccactgc gtctcaggat 5820 gtggttcgaa aagagattcg catttctggg gtgaatttag aaggacttgg tgaagcttcg 5880 catgactctg ctgaatcgct tgtggctgct cgcgcggaaa aagtggcgaa tctctatcgc 5940 tggctagaca ctgataatga cgtggcgacg gacaagtatg tacctgtccc tggctttgaa 6000 cgcgtcgatg ttgatgtctc tgatgaagtc aagcagcgca tgattcaatc tatgagcggt 6060 tacatcgaac acaccgacaa tcaagtaccg aaagatcaag cggaagcatt agccactttg 6120 tttgttgaat cgacgctcga ttatgactgg gacaaacgcg ttgagtttct cactaagctt 6180 gagagctatg gttatagttt tgaagcgcca cacgcagaga aaagcattgt ttccttctgg 6240 tctggtaaaa acttcaagca ataccgagac attctcgaca atgcccagac tgatggcaaa 6300 aaggtcgtgt acgacatcga tgttaaaggc aacgcatttg caatcgacct gaataagcat 6360 ttaatgcgtt ggggcggcct gttccttgac ccagataacg ccgagcaaaa tcagttgaaa 6420 tcatcaatcg atgcagcaac gttcagcaat acaggttttt ggagttcggt ctatgcgacg 6480 ggggcacaaa atgatgtgta tgtcatcgca gaaggtggtg tgcgtcttgg caactatttc 6540 tggaatgttg agctacctgc attacgccaa ttgcagcgtg aagggttagt cggtgaaatt 6600 cgactgcttg ataagccagt atccgagtac aaagatctac cagcagacca gattggacgc 6660 cgacttaccg atgcaggtgt tgccgttaaa gtacgctttg atgcgttgag tcacgagaga 6720 caagctgagc ttttggccga caatccagat ggttacaaag ccgatacgct ggttgagttg 6780 gatgtgaagc taagtgcgat cgatagcatg ttgcgtgaat ctctaccatt ctattcactt 6840 cgtactgagc gcaacctctt agtgcaagaa ggcgaagaag gatttgaagt tcgctcatgg 6900 ccgggaatcg atgaaaagag caagactatt ctgcttgata acccagaaga tgcagctcaa 6960 caaaaatcca ttgagcgctt tatcttggca aacttcgaca acttcgagca gatgccagat 7020 gaacttttct tagtggataa caaggtgctc tcgcatcacg atggccgcac gcgaattata 7080 gcgcaaaaag aagacggtgc ttggacgtac aacaccaatg ttgaactgat gtctgtcact 7140 gagctactcg atgctgctca tgtgaacggt aaagttcgcg gtgatagtta ccaacaagtg 7200 atcgacgccc tgacggagta tcatgcgagt acggttgaac acgcagatta cgaactagaa 7260 tctgtggaaa aactgctcaa cctgcgtaaa cagattgaag gttatgtact cgggcatccg 7320 gattctggcc gtgtggaagc aatgaactca ctgttaaatc aggtgaattc tcgtctggaa 7380 gaagtctctg ttcttgcggt ctctgagcaa agcatcaaag cgcacgatag ctttagccgc 7440 ctatatgacc agcttgataa tgccaactta aaagaaagta aacatctgta tctggatgga 7500 aacggcgatt tcgtcactaa gggcaaaggc aacctagcca ctatcgatca gctaggtggt 7560 agcgatgctg tacttgaaaa agtaaaagca gccgtaactc atgagtatgg tcaagtcgtt 7620 gccgatacga tcttcgcaag gctttctgca aacgatctgg caaaagatgg taaaggcatt 7680 gatattgctg gtttaaacaa agtacaccaa gcgattgaac agcacatgtc gccagtgagc 7740 gcgaccatgt acatctggaa gccgagtgat cacagcacac taggtcatgc cgcattgcaa 7800 attggccaag gtcgcacgca gcttgaaggt caagccgctg ctgacttcaa taagcagaat 7860 tacgtgagtt ggtggccact cggtagcaag tcatccaata tccgcaatat cttcaacgtt 7920 gctacagaag atcagccgga tcttaaacta cgttggagcg atttcagcca acctgctcat 7980 caaaatgaca cacttgagca cgatatggca tctgaagaaa acgacggctt tggtttgaaa 8040 gatggtgaaa ctaagctgaa gcgctttatc gaaaaactca acgccgcgaa aggtattgat 8100 gcttcataca aagatgcttc tgaaggctat gcgagtgtac tactgggcaa tccggatatg 8160 cttgcatcga caggcattcc agcgcatgtt ttccagccat tcgtcgacca atggaatgac 8220 accagctacg acatgatgga cgtagcaaat cgttttgctg aagagctaca gaaacaagct 8280 caggcaagcg gtgacccagc ccttgtggaa aaacgtatcg acaacgtggt tcgtctgttt 8340 gctgaaagag cgctagaaga aatcgaagcc tttaaggcca gccaagcaga tgaaggccga 8400 gtgttccgca ttaacctaga agggttggat gtggcggcga tgcaagctga atggaaacgt 8460 ctaagcaacg atccggatgc tcgatatcag ttattgacca aaaactgctc aagtaccgtc 8520 gcaaaagtgt tgaaagcggg tggtgctgac aaacttatcg gccacacatg gcgacctaag 8580 tttggtgttt ggacgccgac agagcttttc aactttggtc aggcgctgca ggaagctcag 8640 cttgaaattg ccgcgaagaa gcaaagtcat caagtcactg atgtccttga tgccttgtca 8700 ggcaatgaga agcacaaaga aaacgtggcg attgaaaatg atggcacgcc accgcgcgat 8760 aaagaatctc ttagcccact gactcgattc ctcaacaatg agttatatgg tgagaaagac 8820 gcacgtcgta agattggcga aatcacgcaa accttacttg accatgcggt agaaaatgga 8880 gaatcgcaga aagttaccct caaaggggaa gtgggccgtc taacggggta ttaccatcag 8940 ggagcggctt caagcgaagg tgaaacaagc gcgacaagcg gcaaagtcgt gttgttcctg 9000 catggttctg gttcttctgc tgaagagcaa gcgagcgaga ttcgcaacca ctaccaaaaa 9060 caaggtatcg acatgctcgc agtcaacctg cgtggctatg gtgaaagcga cggcggacca 9120 agcgaaaagg gcttgtacca agacgctcgc accatgttca actacctagt gaacgacaag 9180 ggtattgatc caagcaatat catcattcac ggctactcaa tgggtggtcc aattgccgca 9240 gatttagcac gttatgccgc gcaaaatggc caagcggtgt ctggcttatt gcttgaccgt 9300 cctatgccaa gcatgaccaa agccatcacc gctcatgaag tggcgaatcc agcgggcatt 9360 gtaggggcta tcgcgaaagc ggttaacggt cagttctcag tggagaagaa cctaaaaggc 9420 ttgccaaaag agacgccgat tctgctgcta acggacaacg aaggtttagg cgaagaaggc 9480 gagaagctac gagctaaact cgcgattgct ggctacaacg tcacgggtga acaaaccttc 9540 tatggccacg aagcgagcaa ccgcttgatg ggtcagtacg cggatcaaat tgtctccggt 9600 ctgttcaatg cagagcaagc agcggtagaa gcgggcgaag tgctgaaagg actagagaaa 9660 gactttaaac gctatggcga cgcgctgaaa ccagatacga gcgtaccggg taaatcgaaa 9720 gacattcgca ccactaaaga tttcctaaat ggttacaaaa atgaccatgc aaaagaaatc 9780 gttgacggct tccgctcaga tatgagtatc aagcaactgg tggatctgtt cgttaaaggt 9840 agctggagtg cacagcaaaa aggtgcgctt gcttgggaaa ttgaaagtcg tgcactgaaa 9900 gtgacgttcc agaacaagtc tgagaagtac aaccgattgt tccgtgagat tgcttctgct 9960 ggcgtggtgg atgcgaaagc gactgaacag cttgcgccac agttaatgct gttgaaccta 10020 tcgaatgacg gttttggtgg acgttgtgat ccactttcta aactcgtttt ggttgctaaa 10080 cagcttgaaa acgatggtca agttggcgtg gcaagacaac tgctagagaa gatgtactct 10140 gcggcagcgg tgctgagcaa tccaaccctt tactcagaca gtgaaaatgc caatgcaagc 10200 aagttgctca gcagcttggc ggccattcat gcgaagaacc caatgcatga tacgtcgatg 10260 aaagtgtggc aggaaaagct gaaaggaaag caagcactga ccgtaaacgg tgtggttgag 10320 aaaatcactg atgcatcggc taacggcaaa cctgtgttgt tggaacttga tgctccgggg 10380 catgcgatgg cagcttgggc aaaaggctca ggcgacgatc gtgtttacgg cttctacgat 10440 ccaaatgctg gcattgttga gttctcgtca gcagagaagt ttggcgacta cctaacgcgt 10500 ttcttcggca agtccgatct gaacatggct caaagctata agctgggtaa aaatgacgca 10560 ggtgaagcaa tcttcaaccg cgtggtggta atggatggca acacgttagc aagctacaag 10620 ccgaccttcg gtgacaagac caccatgcag gggatcctag atctacctgt gtttgacgct 10680 acaccgatga aaaagcccgg tacttcagat gtcgatggca atgcaaaagc cgtagatgat 10740 acgaaagaag cattggctgg tggaaagata cttcacaacc aaaatgtgaa tgactgggaa 10800 cgtgttgttg tgactccgac agcggacggc ggtgaaagcc gttttgatgg tcaaatcatc 10860 gtgcaaatgg agaacgatga tgtcgttgca aaagccgctg cgaaccttgc gggtaagcac 10920 ccagaaagca gtgtggtggt gcagatcgat tcagacggca actatcgcgt ggtgtatggc 10980 gatccgtcaa agctggatgg aaagctacgt tggcagttag taggtcatgg tcgagatgac 11040 tcagaaagta acaacacgcg tttaagtggc tacagtgccg acgagctggc agtgaaattg 11100 gccaagttcc aacagtcgtt taatcaagcg gaaaacatca acaataagcc tgatcatatc 11160 agtattgttg gttgttcttt ggtgagtgac gataagcaaa aaggctttgg tcatcagttt 11220 attaacgcga tggatgcgaa tggtcttcgt gtcgatgtct ctgtacgcag ttctgaactg 11280 gccgtagacg aggcagggcg taaacatacc aaggacgcga atggtgattg ggtccaaaaa 11340 gccgaaaaca acaaagtttc gctaagctgg gacgagcaag gtgaagttgt tgccaaggat 11400 gaacgtattc gcaacggtat tgcggaaggc gacatcgatc tctctcgtat tggtgtcagc 11460 gacgttgacg agccagctcg tggtgcaatc ggtgacaaca atgatgtgtt tgatgcgcca 11520 gaaaaacgca aagcggagac agaaacctca tcttcttctg caaacaataa actcagctac 11580 tcaggtaaca ttcaagtcaa tgtgggtgat ggtgagttta cggcagtgaa ctggggcaca 11640 tcgaatgtgg gcattaaagt cggcacgggt ggctttaagt cgctggcttt tggtgacaat 11700 aacgtcatgg ttcacatcgg caatggtgag agcaagcaca gcttcgatat tggtggttat 11760 caggcactgg aaggtgcgca aatgttcatc ggtaatcgta atgtgagctt caacttaggt 11820 cgaagtaatg atctgattgt gatgatggac aagtcgattc cgactccgcc attggttaat 11880 ccgttcgatg gtgccgctcg tatttcgggc gtactgcaaa gcattgccac ctcgggtgag 11940 ggccaagatt ggctagcggc tcaagagcag caatggacat tgtctggcgc caagaagttc 12000 gtcaaagata tgtctggttt ggatcagagc agcagtgttg attacaccag tttggttgaa 12060 ctggactcgc agaacgagcg aagcagccgt ggcttgaagc acgatgcaga agcggctctg 12120 aacaagcagt acaatcaatg gttaagtggc aatagcgatt ctgacaccag caagctcagc 12180 cgcgcagata agcttcgtca agccaatgaa aagcttgcgt ttaactttgc tgtgggtggt 12240 caaggtgcgg atatccaagt cacgacaggt aactggaact tcatgtttgg tgacaacatc 12300 cagtctattt tggataccaa cctaggttca ctgtttggcc tcatgacaca gcagttctct 12360 gctacgggtc aggccaagac aaccttcacc tacacgccag aagatttgcc tcgtcagctt 12420 aagaacaagc tacttgggca gttagcgggt gtaggagccg agaccacgct agcggatatt 12480 tttggtgtgg attacaccgc gtcaggtcaa attgtttcgc gtaatggtga agctgtcgat 12540 ggtgtagcga ttctcaaaga gatgttggag gtcattggtg agttcagtgg tgatcaactg 12600 caagcttttg tcgacccagc taagttactg gatagcttga aggcgggtat caacatgggt 12660 gcggatggca ttaagtcttt tgctgaaact catggactga aagagaaggc gccagaagag 12720 gaagaggaca actcttcggt ttctgttaat ggtgcgagcg taaacagtgc gcaaggcgcg 12780 acggtggctg atggcagcac tgaaacagca gaaacaccag atcgtgcctt tggctttaac 12840 tcgcttaacc tgccgaactt gttcgccact atctttagtc aagacaagca gaaagagatg 12900 aaatcgctgg tggaaaatct caaagagaat ctcaccgccg atctgctgaa tatgaaagag 12960 aaaacgtttg atttccttcg taacagtggt catctccaag gtgatggtga tatcaacatc 13020 tccctaggaa actacaactt caactggggt ggtgatggta aagatctcgg agcgtatcta 13080 ggagacaaca acaacttctg gggcggacga ggcgatgatg tgttctacgc aacaggcacg 13140 tcaaacatct tcacgggcgg cgaaggcaac gacatgggcg ttctgatggg acgtgaaaac 13200 atgatgtttg gcggtgatgg caacgacaca gcagtggttg caggacgcat taaccatgtc 13260 ttccttggtg ccggtgatga ccagtcgttt gtctttggtg agggcggtga aattgacacc 13320 ggttcaggcc gcgactacgt ggtgacgtct ggcaacttca accgtgtgga tacgggggac 13380 gatcaagact actccgtgac gattggcaac aacaaccaag tagagctagg cgctggcaat 13440 gactttgcta atgtcttcgg taactacaac cgtatcaatg caagcgctgg caacgatgtt 13500 gtgaagctaa tgggctatca cgccgtgttg aatggtggtg agggcgagga ccatctcatc 13560 gcagcggcca tctctaagtt cagtcaattc aacggtggcg aagggcgcga tctgatggtg 13620 ttgggtggtt atcaaaacac gttcaaaggt ggcacggatg tggacagctt tgtggtgagc 13680 ggtgatgtta tcgacaacct tgttgaagac attcgcagcg aagataacat tgtcttcaat 13740 ggcatcgatt ggcagaaact gtggttcgaa cgcagcggat atgacctgaa gttgtctatt 13800 cttcgtgacc cggcaagcga cagtgaccaa gcgaagtttg agcatattgg ttcggtgacg 13860 tttagtgatt actttaacgg taatcgagcg caggtgatca tcgcaatggg tgagaaagac 13920 gcgacgggtg aacgtgagta caccaccttg tctgagagtg caattgatgc gctggtacaa 13980 gccatgagtg gctttgaccc tcaggcgggt gacaatggat tcatcgataa cctagacagc 14040 aaatctcgcg tggcgattac cactgcgtgg gcagacgttg ttcataaaaa gggtataacg 14100 gtgtaa 14106 <210> 4 <211> 4701 <212> PRT <213> Vibrio vulnificus <400> 4 Met Gly Lys Pro Phe Trp Arg Ser Val Glu Tyr Phe Phe Thr Gly Asn 1 5 10 15 Tyr Ser Ala Asp Asp Gly Asn Asn Ser Ile Val Ala Ile Gly Phe Gly 20 25 30 Gly Glu Ile His Ala Tyr Gly Gly Asp Asp His Val Thr Val Gly Ser 35 40 45 Ile Gly Ala Thr Val Tyr Thr Gly Ser Gly Asn Asp Thr Val Val Gly 50 55 60 Gly Ser Ala Tyr Leu Arg Val Glu Asp Thr Thr Gly His Leu Ser Val 65 70 75 80 Lys Gly Ala Ala Gly Tyr Ala Asp Ile Asn Lys Ser Ser Asp Gly Asn 85 90 95 Val Ser Phe Ala Gly Ala Ala Gly Gly Val Ser Ile Asp His Leu Gly 100 105 110 Asn His Gly Asp Val Ser Tyr Gly Gly Ala Ala Ala Tyr Asn Gly Ile 115 120 125 Thr Arg Lys Gly Leu Ser Gly Asn Val Thr Phe Lys Gly Ala Gly Gly 130 135 140 Tyr Asn Ala Leu Trp His Glu Thr Asn Gln Gly Asn Leu Ser Phe Ala 145 150 155 160 Gly Ala Gly Ala Gly Asn Lys Leu Asp Arg Thr Trp Phe Asn Arg Tyr 165 170 175 Gln Gly Ser Arg Gly Asp Val Thr Phe Asp Gly Ala Gly Ala Ala Asn 180 185 190 Ser Ile Ser Ser Arg Val Asp Asn Ile Thr Phe Arg Gly Ala Gly Ala 195 200 205 Asp Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Val Gly Asp Ile Thr Leu Gln 210 215 220 Gly Ala Gly Ala Ser Asn Arg Ile Glu Arg Thr Arg Gln Ala Glu Asp 225 230 235 240 Val Tyr Ala Gln Thr Arg Gly Asn Ile Arg Phe Glu Gly Val Gly Gly 245 250 255 Tyr Asn Ser Leu Tyr Ser Asp Val Ala His Gly Asp Ile His Phe Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Ala Tyr Asn Thr Ile Thr Arg Lys Gly Ser Gly Ser Ser 275 280 285 Phe Asp Ala Gln Gly Met Glu Tyr Ala Lys Ala Glu Asp Ile Val Leu 290 295 300 Thr Ala Ala Gln Met His Gly Leu Ser Ile Asp Asn Gly Asn Lys Phe 305 310 315 320 His Ala Val Thr Ala Val Lys Ser Glu Arg Glu Pro Asn Thr Tyr Leu 325 330 335 Phe Ala Ile Ala Asp Gly Thr Tyr Thr Lys Ile Asn Lys Val Arg Leu 340 345 350 Tyr Asn Asp Pro Glu Thr Gly Lys Leu Lys Tyr Tyr Ser Glu Ala Trp 355 360 365 Phe Lys Arg Gly Asn His Leu Ala Glu Leu Ala Arg Ser Asp Val Ser 370 375 380 Ser Ala Gly Gly Phe Glu Val Asn Pro Ile Asn Gly Gly Tyr Thr Leu 385 390 395 400 Ser Asn Ile Ala Val Glu His Gln Gln Ser Leu Thr Val His Ala Val 405 410 415 Glu Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Glu Trp Val Thr Tyr Ala Asn Gly Ala 420 425 430 Leu Ile Asp Ala Lys Asp Val Ala Leu Ser Asp Ala Lys Met Gly Gly 435 440 445 His Ala Ile Ser Thr Asp Gly Thr Thr Val Asp Val Gln Ala Val Lys 450 455 460 Ser Asn Arg Lys Pro Asn Thr Tyr Val Tyr Ala Lys Val Leu Gly Pro 465 470 475 480 Tyr Thr Lys Ile Val Val Val Glu Leu Ala Asn Asp Pro Lys Thr Gly 485 490 495 Ala Leu Lys Tyr Gln Ala Arg Ser Trp Tyr Lys Glu Gly Asn His Thr 500 505 510 Ala Asn Leu Ala Asn Glu Asp Ile Ser Ser Ala Asn Gly Tyr His Ser 515 520 525 Met Gly Lys Gly Gly Tyr Ser Leu Ser Asp Leu His Tyr Ser Val Asn 530 535 540 Ala Val Arg Ser Thr Ser Glu Thr Val Ala Asp Ile Asp Glu Tyr Thr 545 550 555 560 Asp Gln Thr Leu Phe Lys Pro Ala Thr Asp Ser Gly Glu Ser Ser Gly 565 570 575 Asp Val Arg Phe Asn Gly Ala Gly Gly Gly Asn Val Ile Lys Ser Asn 580 585 590 Val Thr Arg Gly Asn Val Tyr Phe Asn Gly Gly Gly Ile Ala Asn Val 595 600 605 Ile Leu His Ser Ser Gln Phe Gly His Thr Glu Phe Asn Gly Gly Gly 610 615 620 Ala Ala Asn Val Ile Val Lys Ser Gly Glu Glu Gly Asp Leu Thr Phe 625 630 635 640 Arg Gly Ala Gly Leu Ala Asn Val Leu Val His Gln Ser Lys Gln Gly 645 650 655 Lys Met Asp Val Tyr Ala Gly Gly Ala Val Asn Val Leu Val Arg Ile 660 665 670 Gly Asp Gly Gln Tyr Leu Ala His Leu Leu Ala Tyr Gly Asn Ile Ser 675 680 685 Val His Lys Gly Asn Gly Asn Ser Arg Val Val Met Leu Gly Gly Tyr 690 695 700 Asn Thr His Thr Gln Ile Gly Ser Gly Asn Gly Leu Trp Leu Ala Ala 705 710 715 720 Gly Gly Phe Asn Val Met Thr Gln Val Gly Lys Gly Asp Val Ala Ser 725 730 735 Val Leu Ala Gly Gly Ala Asn Val Leu Thr Lys Val Gly Asp Gly Asp 740 745 750 Leu Thr Ala Gly Met Leu Gly Gly Ala Asn Val Ile Thr Arg Ile Ser 755 760 765 Gly Asp Asn Glu Thr Ser Asn Thr Thr Ala Val Ala Leu Gly Gly Ala 770 775 780 Asn Ile Leu Thr Lys Lys Gly Lys Gly Asn Thr Leu Ala Val Met Gly 785 790 795 800 Gly Gly Ala Asn Val Leu Thr His Val Gly Asp Gly Thr Thr Thr Gly 805 810 815 Val Met Val Gly Gly Ala Asn Ile Leu Thr Lys Val Gly Asn Gly Asp 820 825 830 Thr Thr Gly Ile Met Leu Gly Val Gly Asn Val Leu Thr His Val Gly 835 840 845 Asp Gly Gln Thr Leu Gly Val Met Gly Ala Ala Gly Asn Ile Phe Thr 850 855 860 Lys Val Gly Asp Gly Thr Ser Ile Ala Val Met Ile Gly Ala Gly Asn 865 870 875 880 Ile Phe Thr His Val Gly Glu Gly Asn Ala Trp Ala Leu Met Gly Gly 885 890 895 Leu Gly Asn Val Phe Thr Lys Val Gly Asn Gly Asp Ala Leu Ala Leu 900 905 910 Met Val Ala Glu Ala Asn Val Phe Thr His Ile Gly Asp Gly Met Ser 915 920 925 Val Ala Leu Met Leu Ala Lys Gly Asn Val Ala Thr Lys Val Gly Asn 930 935 940 Gly Thr Thr Leu Ala Ala Met Val Gly Asn Ala Asn Ile Phe Thr His 945 950 955 960 Val Gly Ser Gly Ser Thr Phe Ala Ala Met Ile Gly Gln Ala Asn Ile 965 970 975 Met Thr Lys Val Gly Asn Asp Leu Thr Ala Ala Leu Met Val Gly Lys 980 985 990 Ala Asn Ile Tyr Thr His Val Gly Asp Gly Thr Ser Leu Gly Ile Phe 995 1000 1005 Ala Gly Glu Val Asn Val Met Thr Lys Val Gly Asn Gly Thr Thr Leu 1010 1015 1020 Ala Ala Met Phe Gly Lys Ala Asn Ile Met Thr His Val Gly Asp Gly 1025 1030 1035 1040 Leu Thr Gly Val Leu Ala Leu Gly Glu Ala Asn Ile Val Thr Lys Val 1045 1050 1055 Gly Asp Asp Phe Met Gly Val Val Ala Ala Ala Lys Ala Asn Val Val 1060 1065 1070 Thr His Val Gly Asp Ala Thr Thr Ala Ala Val Leu Ala Gly Lys Gly 1075 1080 1085 Asn Phe Leu Thr Lys Val Gly Glu Gly Thr Thr Val Gly Leu Leu Ile 1090 1095 1100 Ser Asp Ile Gly Asn Val Met Thr His Val Gly Asp Gly Thr Thr Ile 1105 1110 1115 1120 Gly Ile Ala Lys Gly Lys Ala Asn Ile Ile Thr Lys Val Gly Asp Gly 1125 1130 1135 Leu Gly Val Asn Val Ala Trp Gly Gln Ala Asn Val Phe Thr Gln Val 1140 1145 1150 Gly Asp Gly Asp Arg Tyr Asn Phe Ala Lys Gly Glu Ala Asn Ile Ile 1155 1160 1165 Thr Lys Val Gly Asp Gly Gln Glu Val Ser Val Val Gln Gly Lys Ala 1170 1175 1180 Asn Ile Ile Thr His Val Gly Asn Gly Asp Asp Tyr Thr Gly Ala Trp 1185 1190 1195 1200 Gly Lys Ala Asn Val Ile Thr Lys Val Gly Asn Gly Arg Asn Val Val 1205 1210 1215 Leu Ala Lys Gly Glu Ala Asn Ile Val Thr Gln Val Gly Asp Gly Asp 1220 1225 1230 Ser Phe Asn Ala Leu Trp Ser Lys Gly Asn Ile Val Thr Lys Val Gly 1235 1240 1245 Asp Gly Met Gln Val Thr Ala Ala Lys Gly Lys Ala Asn Ile Thr Thr 1250 1255 1260 Thr Val Gly Asn Gly Leu Ser Val Thr Thr Ala Tyr Gly Asp Ala Asn 1265 1270 1275 1280 Ile Asn Thr Lys Val Gly Asp Gly Val Ser Val Asn Val Ala Trp Gly 1285 1290 1295 Lys Tyr Asn Ile Asn Thr Lys Val Gly Asp Gly Leu Asn Val Ala Val 1300 1305 1310 Met Lys Gly Lys Ala Asn Ala Asn Ile His Val Gly Asp Gly Leu Asn 1315 1320 1325 Ile Asn Ala Ser Tyr Ala Gln Asn Asn Val Ala Ile Lys Val Gly Asn 1330 1335 1340 Gly Asp Phe Tyr Ser Leu Ala Val Ala Ser Ser Asn Thr Ser Ser Asn 1345 1350 1355 1360 Lys Leu Ser Ala Leu Phe Asp Asn Ile Lys Gln Thr Val Leu Gly Val 1365 1370 1375 Gly Gly Ser Gln Ala Ile Asn Tyr Leu Val Gln Gly Asp Glu Ala Ser 1380 1385 1390 Ser Ser Gly Thr Gln Lys Gly Arg Gly Ala Ile Ala Thr Pro Glu Ile 1395 1400 1405 Thr Lys Leu Asp Gly Phe Gln Met Glu Ala Ile Glu Glu Val Gly Ser 1410 1415 1420 Asp Leu Gly Asp Ser Leu Thr Gly Ser Val Thr Lys Val Asp Thr Pro 1425 1430 1435 1440 Asp Leu Asn Lys Met Gln Asn Ala Leu Asp Val Asp Gly Ser Ser Asp 1445 1450 1455 Gln Thr Gln Ala Pro Asn Leu Ile Val Asn Gly Asp Phe Glu Gln Gly 1460 1465 1470 Asp Arg Gly Trp Lys Ser Thr His Gly Val Glu Ala Ser Tyr Ser Gly 1475 1480 1485 Asn Val Tyr Gly Val Asn Gly Glu Gly His Gly Ala Arg Val Thr Glu 1490 1495 1500 Leu Asp Thr Tyr Thr Asn Thr Ser Leu Tyr Gln Asp Leu Thr Asp Leu 1505 1510 1515 1520 Thr Glu Gly Glu Val Ile Ala Val Ser Phe Asp Phe Ala Lys Arg Ala 1525 1530 1535 Gly Leu Ser Asn Asn Glu Gly Ile Glu Val Leu Trp Asn Gly Glu Val 1540 1545 1550 Val Phe Ser Ser Ser Gly Asp Ala Ser Ala Trp Gln Gln Lys Thr Leu 1555 1560 1565 Lys Leu Thr Ala His Ala Gly Ser Asn Arg Ile Glu Phe Lys Ala Thr 1570 1575 1580 Gly His Asn Asp Gly Leu Gly Tyr Ile Leu Asp Asn Val Val Ala Lys 1585 1590 1595 1600 Ser Glu Ser Ser Gln Gln Ala Asn Ala Val Ser Glu His Ala Thr Gln 1605 1610 1615 Asn Gln Ala Ser Gln Asn Val Leu Ser Asp Lys Glu Arg Ala Glu Ala 1620 1625 1630 Asp Arg Gln Arg Leu Glu Gln Glu Lys Gln Lys Gln Leu Asp Ala Val 1635 1640 1645 Ala Gly Ser Gln Ser Gln Leu Glu Ser Thr Asp Gln Gln Ala Leu Gly 1650 1655 1660 Asn Asn Gly Gln Ala Gln Arg Asp Ala Val Lys Glu Glu Ser Glu Ala 1665 1670 1675 1680 Val Thr Ala Glu Leu Thr Lys Leu Ala Gln Gly Leu Asp Val Leu Asp 1685 1690 1695 Gly Gln Ala Thr His Thr Gly Glu Ser Gly Asp Gln Trp Arg Asn Asp 1700 1705 1710 Phe Ala Gly Gly Leu Leu Asp Gly Val Gln Ser Gln Leu Asp Asp Ala 1715 1720 1725 Lys Gln Leu Ala Asn Asp Lys Ile Ala Ala Ala Lys Gln Thr Gln Phe 1730 1735 1740 Asp Asn Asn Ser Lys Val Lys Glu Ser Val Ala Lys Ser Glu Ala Gly 1745 1750 1755 1760 Val Ala Gln Gly Glu Gln Asn Arg Ala Gly Ala Glu Gln Asp Ile Ala 1765 1770 1775 Glu Ala Lys Ala Asp Ala Glu Thr Arg Lys Ala Asp Ala Val Ala Lys 1780 1785 1790 Ser Asn Asp Ala Lys Gln Ala Glu Ser Asp Ala His Ser Ala Ala Asn 1795 1800 1805 Asp Ala Gln Ser Arg Gly Asp Arg Asp Ala Met Asn Ala Glu Asn Lys 1810 1815 1820 Val Asn Gln Ala Gln Asn Asp Ala Lys Gly Thr Lys Gln Asn Glu Gly 1825 1830 1835 1840 Asp Arg Pro Asp Arg Glu Gly Val Ala Gly Ser Gly Leu Ser Gly Asn 1845 1850 1855 Ala His Arg Val Glu Gly Ala Gly Glu Thr Gly Ser His Val Asn Thr 1860 1865 1870 Asp Ser Pro Thr Asn Ala Asp Gly Arg Phe Ser Glu Gly Leu Ser Glu 1875 1880 1885 Gln Glu Gln Glu Ala Leu Glu Gly Ala Thr Asn Ala Val Asn Arg Leu 1890 1895 1900 Gln Ile Asn Ala Gly Ile Arg Gly Lys Asn Ser Gly Ser Thr Ile Thr 1905 1910 1915 1920 Ser Met Phe Thr Glu Thr Asn Ser Asp Ser Ile Val Val Pro Thr Thr 1925 1930 1935 Ala Ser Gln Asp Val Val Arg Lys Glu Ile Arg Ile Ser Gly Val Asn 1940 1945 1950 Leu Glu Gly Leu Gly Glu Ala Ser His Asp Ser Ala Glu Ser Leu Val 1955 1960 1965 Ala Ala Arg Ala Glu Lys Val Ala Asn Leu Tyr Arg Trp Leu Asp Thr 1970 1975 1980 Asp Asn Asp Val Ala Thr Asp Lys Tyr Val Pro Val Pro Gly Phe Glu 1985 1990 1995 2000 Arg Val Asp Val Asp Val Ser Asp Glu Val Lys Gln Arg Met Ile Gln 2005 2010 2015 Ser Met Ser Gly Tyr Ile Glu His Thr Asp Asn Gln Val Pro Lys Asp 2020 2025 2030 Gln Ala Glu Ala Leu Ala Thr Leu Phe Val Glu Ser Thr Leu Asp Tyr 2035 2040 2045 Asp Trp Asp Lys Arg Val Glu Phe Leu Thr Lys Leu Glu Ser Tyr Gly 2050 2055 2060 Tyr Ser Phe Glu Ala Pro His Ala Glu Lys Ser Ile Val Ser Phe Trp 2065 2070 2075 2080 Ser Gly Lys Asn Phe Lys Gln Tyr Arg Asp Ile Leu Asp Asn Ala Gln 2085 2090 2095 Thr Asp Gly Lys Lys Val Val Tyr Asp Ile Asp Val Lys Gly Asn Ala 2100 2105 2110 Phe Ala Ile Asp Leu Asn Lys His Leu Met Arg Trp Gly Gly Leu Phe 2115 2120 2125 Leu Asp Pro Asp Asn Ala Glu Gln Asn Gln Leu Lys Ser Ser Ile Asp 2130 2135 2140 Ala Ala Thr Phe Ser Asn Thr Gly Phe Trp Ser Ser Val Tyr Ala Thr 2145 2150 2155 2160 Gly Ala Gln Asn Asp Val Tyr Val Ile Ala Glu Gly Gly Val Arg Leu 2165 2170 2175 Gly Asn Tyr Phe Trp Asn Val Glu Leu Pro Ala Leu Arg Gln Leu Gln 2180 2185 2190 Arg Glu Gly Leu Val Gly Glu Ile Arg Leu Leu Asp Lys Pro Val Ser 2195 2200 2205 Glu Tyr Lys Asp Leu Pro Ala Asp Gln Ile Gly Arg Arg Leu Thr Asp 2210 2215 2220 Ala Gly Val Ala Val Lys Val Arg Phe Asp Ala Leu Ser His Glu Arg 2225 2230 2235 2240 Gln Ala Glu Leu Leu Ala Asp Asn Pro Asp Gly Tyr Lys Ala Asp Thr 2245 2250 2255 Leu Val Glu Leu Asp Val Lys Leu Ser Ala Ile Asp Ser Met Leu Arg 2260 2265 2270 Glu Ser Leu Pro Phe Tyr Ser Leu Arg Thr Glu Arg Asn Leu Leu Val 2275 2280 2285 Gln Glu Gly Glu Glu Gly Phe Glu Val Arg Ser Trp Pro Gly Ile Asp 2290 2295 2300 Glu Lys Ser Lys Thr Ile Leu Leu Asp Asn Pro Glu Asp Ala Ala Gln 2305 2310 2315 2320 Gln Lys Ser Ile Glu Arg Phe Ile Leu Ala Asn Phe Asp Asn Phe Glu 2325 2330 2335 Gln Met Pro Asp Glu Leu Phe Leu Val Asp Asn Lys Val Leu Ser His 2340 2345 2350 His Asp Gly Arg Thr Arg Ile Ile Ala Gln Lys Glu Asp Gly Ala Trp 2355 2360 2365 Thr Tyr Asn Thr Asn Val Glu Leu Met Ser Val Thr Glu Leu Leu Asp 2370 2375 2380 Ala Ala His Val Asn Gly Lys Val Arg Gly Asp Ser Tyr Gln Gln Val 2385 2390 2395 2400 Ile Asp Ala Leu Thr Glu Tyr His Ala Ser Thr Val Glu His Ala Asp 2405 2410 2415 Tyr Glu Leu Glu Ser Val Glu Lys Leu Leu Asn Leu Arg Lys Gln Ile 2420 2425 2430 Glu Gly Tyr Val Leu Gly His Pro Asp Ser Gly Arg Val Glu Ala Met 2435 2440 2445 Asn Ser Leu Leu Asn Gln Val Asn Ser Arg Leu Glu Glu Val Ser Val 2450 2455 2460 Leu Ala Val Ser Glu Gln Ser Ile Lys Ala His Asp Ser Phe Ser Arg 2465 2470 2475 2480 Leu Tyr Asp Gln Leu Asp Asn Ala Asn Leu Lys Glu Ser Lys His Leu 2485 2490 2495 Tyr Leu Asp Gly Asn Gly Asp Phe Val Thr Lys Gly Lys Gly Asn Leu 2500 2505 2510 Ala Thr Ile Asp Gln Leu Gly Gly Ser Asp Ala Val Leu Glu Lys Val 2515 2520 2525 Lys Ala Ala Val Thr His Glu Tyr Gly Gln Val Val Ala Asp Thr Ile 2530 2535 2540 Phe Ala Arg Leu Ser Ala Asn Asp Leu Ala Lys Asp Gly Lys Gly Ile 2545 2550 2555 2560 Asp Ile Ala Gly Leu Asn Lys Val His Gln Ala Ile Glu Gln His Met 2565 2570 2575 Ser Pro Val Ser Ala Thr Met Tyr Ile Trp Lys Pro Ser Asp His Ser 2580 2585 2590 Thr Leu Gly His Ala Ala Leu Gln Ile Gly Gln Gly Arg Thr Gln Leu 2595 2600 2605 Glu Gly Gln Ala Ala Ala Asp Phe Asn Lys Gln Asn Tyr Val Ser Trp 2610 2615 2620 Trp Pro Leu Gly Ser Lys Ser Ser Asn Ile Arg Asn Ile Phe Asn Val 2625 2630 2635 2640 Ala Thr Glu Asp Gln Pro Asp Leu Lys Leu Arg Trp Ser Asp Phe Ser 2645 2650 2655 Gln Pro Ala His Gln Asn Asp Thr Leu Glu His Asp Met Ala Ser Glu 2660 2665 2670 Glu Asn Asp Gly Phe Gly Leu Lys Asp Gly Glu Thr Lys Leu Lys Arg 2675 2680 2685 Phe Ile Glu Lys Leu Asn Ala Ala Lys Gly Ile Asp Ala Ser Tyr Lys 2690 2695 2700 Asp Ala Ser Glu Gly Tyr Ala Ser Val Leu Leu Gly Asn Pro Asp Met 2705 2710 2715 2720 Leu Ala Ser Thr Gly Ile Pro Ala His Val Phe Gln Pro Phe Val Asp 2725 2730 2735 Gln Trp Asn Asp Thr Ser Tyr Asp Met Met Asp Val Ala Asn Arg Phe 2740 2745 2750 Ala Glu Glu Leu Gln Lys Gln Ala Gln Ala Ser Gly Asp Pro Ala Leu 2755 2760 2765 Val Glu Lys Arg Ile Asp Asn Val Val Arg Leu Phe Ala Glu Arg Ala 2770 2775 2780 Leu Glu Glu Ile Glu Ala Phe Lys Ala Ser Gln Ala Asp Glu Gly Arg 2785 2790 2795 2800 Val Phe Arg Ile Asn Leu Glu Gly Leu Asp Val Ala Ala Met Gln Ala 2805 2810 2815 Glu Trp Lys Arg Leu Ser Asn Asp Pro Asp Ala Arg Tyr Gln Leu Leu 2820 2825 2830 Thr Lys Asn Cys Ser Ser Thr Val Ala Lys Val Leu Lys Ala Gly Gly 2835 2840 2845 Ala Asp Lys Leu Ile Gly His Thr Trp Arg Pro Lys Phe Gly Val Trp 2850 2855 2860 Thr Pro Thr Glu Leu Phe Asn Phe Gly Gln Ala Leu Gln Glu Ala Gln 2865 2870 2875 2880 Leu Glu Ile Ala Ala Lys Lys Gln Ser His Gln Val Thr Asp Val Leu 2885 2890 2895 Asp Ala Leu Ser Gly Asn Glu Lys His Lys Glu Asn Val Ala Ile Glu 2900 2905 2910 Asn Asp Gly Thr Pro Pro Arg Asp Lys Glu Ser Leu Ser Pro Leu Thr 2915 2920 2925 Arg Phe Leu Asn Asn Glu Leu Tyr Gly Glu Lys Asp Ala Arg Arg Lys 2930 2935 2940 Ile Gly Glu Ile Thr Gln Thr Leu Leu Asp His Ala Val Glu Asn Gly 2945 2950 2955 2960 Glu Ser Gln Lys Val Thr Leu Lys Gly Glu Val Gly Arg Leu Thr Gly 2965 2970 2975 Tyr Tyr His Gln Gly Ala Ala Ser Ser Glu Gly Glu Thr Ser Ala Thr 2980 2985 2990 Ser Gly Lys Val Val Leu Phe Leu His Gly Ser Gly Ser Ser Ala Glu 2995 3000 3005 Glu Gln Ala Ser Glu Ile Arg Asn His Tyr Gln Lys Gln Gly Ile Asp 3010 3015 3020 Met Leu Ala Val Asn Leu Arg Gly Tyr Gly Glu Ser Asp Gly Gly Pro 3025 3030 3035 3040 Ser Glu Lys Gly Leu Tyr Gln Asp Ala Arg Thr Met Phe Asn Tyr Leu 3045 3050 3055 Val Asn Asp Lys Gly Ile Asp Pro Ser Asn Ile Ile Ile His Gly Tyr 3060 3065 3070 Ser Met Gly Gly Pro Ile Ala Ala Asp Leu Ala Arg Tyr Ala Ala Gln 3075 3080 3085 Asn Gly Gln Ala Val Ser Gly Leu Leu Leu Asp Arg Pro Met Pro Ser 3090 3095 3100 Met Thr Lys Ala Ile Thr Ala His Glu Val Ala Asn Pro Ala Gly Ile 3105 3110 3115 3120 Val Gly Ala Ile Ala Lys Ala Val Asn Gly Gln Phe Ser Val Glu Lys 3125 3130 3135 Asn Leu Lys Gly Leu Pro Lys Glu Thr Pro Ile Leu Leu Leu Thr Asp 3140 3145 3150 Asn Glu Gly Leu Gly Glu Glu Gly Glu Lys Leu Arg Ala Lys Leu Ala 3155 3160 3165 Ile Ala Gly Tyr Asn Val Thr Gly Glu Gln Thr Phe Tyr Gly His Glu 3170 3175 3180 Ala Ser Asn Arg Leu Met Gly Gln Tyr Ala Asp Gln Ile Val Ser Gly 3185 3190 3195 3200 Leu Phe Asn Ala Glu Gln Ala Ala Val Glu Ala Gly Glu Val Leu Lys 3205 3210 3215 Gly Leu Glu Lys Asp Phe Lys Arg Tyr Gly Asp Ala Leu Lys Pro Asp 3220 3225 3230 Thr Ser Val Pro Gly Lys Ser Lys Asp Ile Arg Thr Thr Lys Asp Phe 3235 3240 3245 Leu Asn Gly Tyr Lys Asn Asp His Ala Lys Glu Ile Val Asp Gly Phe 3250 3255 3260 Arg Ser Asp Met Ser Ile Lys Gln Leu Val Asp Leu Phe Val Lys Gly 3265 3270 3275 3280 Ser Trp Ser Ala Gln Gln Lys Gly Ala Leu Ala Trp Glu Ile Glu Ser 3285 3290 3295 Arg Ala Leu Lys Val Thr Phe Gln Asn Lys Ser Glu Lys Tyr Asn Arg 3300 3305 3310 Leu Phe Arg Glu Ile Ala Ser Ala Gly Val Val Asp Ala Lys Ala Thr 3315 3320 3325 Glu Gln Leu Ala Pro Gln Leu Met Leu Leu Asn Leu Ser Asn Asp Gly 3330 3335 3340 Phe Gly Gly Arg Cys Asp Pro Leu Ser Lys Leu Val Leu Val Ala Lys 3345 3350 3355 3360 Gln Leu Glu Asn Asp Gly Gln Val Gly Val Ala Arg Gln Leu Leu Glu 3365 3370 3375 Lys Met Tyr Ser Ala Ala Ala Val Leu Ser Asn Pro Thr Leu Tyr Ser 3380 3385 3390 Asp Ser Glu Asn Ala Asn Ala Ser Lys Leu Leu Ser Ser Leu Ala Ala 3395 3400 3405 Ile His Ala Lys Asn Pro Met His Asp Thr Ser Met Lys Val Trp Gln 3410 3415 3420 Glu Lys Leu Lys Gly Lys Gln Ala Leu Thr Val Asn Gly Val Val Glu 3425 3430 3435 3440 Lys Ile Thr Asp Ala Ser Ala Asn Gly Lys Pro Val Leu Leu Glu Leu 3445 3450 3455 Asp Ala Pro Gly His Ala Met Ala Ala Trp Ala Lys Gly Ser Gly Asp 3460 3465 3470 Asp Arg Val Tyr Gly Phe Tyr Asp Pro Asn Ala Gly Ile Val Glu Phe 3475 3480 3485 Ser Ser Ala Glu Lys Phe Gly Asp Tyr Leu Thr Arg Phe Phe Gly Lys 3490 3495 3500 Ser Asp Leu Asn Met Ala Gln Ser Tyr Lys Leu Gly Lys Asn Asp Ala 3505 3510 3515 3520 Gly Glu Ala Ile Phe Asn Arg Val Val Val Met Asp Gly Asn Thr Leu 3525 3530 3535 Ala Ser Tyr Lys Pro Thr Phe Gly Asp Lys Thr Thr Met Gln Gly Ile 3540 3545 3550 Leu Asp Leu Pro Val Phe Asp Ala Thr Pro Met Lys Lys Pro Gly Thr 3555 3560 3565 Ser Asp Val Asp Gly Asn Ala Lys Ala Val Asp Asp Thr Lys Glu Ala 3570 3575 3580 Leu Ala Gly Gly Lys Ile Leu His Asn Gln Asn Val Asn Asp Trp Glu 3585 3590 3595 3600 Arg Val Val Val Thr Pro Thr Ala Asp Gly Gly Glu Ser Arg Phe Asp 3605 3610 3615 Gly Gln Ile Ile Val Gln Met Glu Asn Asp Asp Val Val Ala Lys Ala 3620 3625 3630 Ala Ala Asn Leu Ala Gly Lys His Pro Glu Ser Ser Val Val Val Gln 3635 3640 3645 Ile Asp Ser Asp Gly Asn Tyr Arg Val Val Tyr Gly Asp Pro Ser Lys 3650 3655 3660 Leu Asp Gly Lys Leu Arg Trp Gln Leu Val Gly His Gly Arg Asp Asp 3665 3670 3675 3680 Ser Glu Ser Asn Asn Thr Arg Leu Ser Gly Tyr Ser Ala Asp Glu Leu 3685 3690 3695 Ala Val Lys Leu Ala Lys Phe Gln Gln Ser Phe Asn Gln Ala Glu Asn 3700 3705 3710 Ile Asn Asn Lys Pro Asp His Ile Ser Ile Val Gly Cys Ser Leu Val 3715 3720 3725 Ser Asp Asp Lys Gln Lys Gly Phe Gly His Gln Phe Ile Asn Ala Met 3730 3735 3740 Asp Ala Asn Gly Leu Arg Val Asp Val Ser Val Arg Ser Ser Glu Leu 3745 3750 3755 3760 Ala Val Asp Glu Ala Gly Arg Lys His Thr Lys Asp Ala Asn Gly Asp 3765 3770 3775 Trp Val Gln Lys Ala Glu Asn Asn Lys Val Ser Leu Ser Trp Asp Glu 3780 3785 3790 Gln Gly Glu Val Val Ala Lys Asp Glu Arg Ile Arg Asn Gly Ile Ala 3795 3800 3805 Glu Gly Asp Ile Asp Leu Ser Arg Ile Gly Val Ser Asp Val Asp Glu 3810 3815 3820 Pro Ala Arg Gly Ala Ile Gly Asp Asn Asn Asp Val Phe Asp Ala Pro 3825 3830 3835 3840 Glu Lys Arg Lys Ala Glu Thr Glu Thr Ser Ser Ser Ser Ala Asn Asn 3845 3850 3855 Lys Leu Ser Tyr Ser Gly Asn Ile Gln Val Asn Val Gly Asp Gly Glu 3860 3865 3870 Phe Thr Ala Val Asn Trp Gly Thr Ser Asn Val Gly Ile Lys Val Gly 3875 3880 3885 Thr Gly Gly Phe Lys Ser Leu Ala Phe Gly Asp Asn Asn Val Met Val 3890 3895 3900 His Ile Gly Asn Gly Glu Ser Lys His Ser Phe Asp Ile Gly Gly Tyr 3905 3910 3915 3920 Gln Ala Leu Glu Gly Ala Gln Met Phe Ile Gly Asn Arg Asn Val Ser 3925 3930 3935 Phe Asn Leu Gly Arg Ser Asn Asp Leu Ile Val Met Met Asp Lys Ser 3940 3945 3950 Ile Pro Thr Pro Pro Leu Val Asn Pro Phe Asp Gly Ala Ala Arg Ile 3955 3960 3965 Ser Gly Val Leu Gln Ser Ile Ala Thr Ser Gly Glu Gly Gln Asp Trp 3970 3975 3980 Leu Ala Ala Gln Glu Gln Gln Trp Thr Leu Ser Gly Ala Lys Lys Phe 3985 3990 3995 4000 Val Lys Asp Met Ser Gly Leu Asp Gln Ser Ser Ser Val Asp Tyr Thr 4005 4010 4015 Ser Leu Val Glu Leu Asp Ser Gln Asn Glu Arg Ser Ser Arg Gly Leu 4020 4025 4030 Lys His Asp Ala Glu Ala Ala Leu Asn Lys Gln Tyr Asn Gln Trp Leu 4035 4040 4045 Ser Gly Asn Ser Asp Ser Asp Thr Ser Lys Leu Ser Arg Ala Asp Lys 4050 4055 4060 Leu Arg Gln Ala Asn Glu Lys Leu Ala Phe Asn Phe Ala Val Gly Gly 4065 4070 4075 4080 Gln Gly Ala Asp Ile Gln Val Thr Thr Gly Asn Trp Asn Phe Met Phe 4085 4090 4095 Gly Asp Asn Ile Gln Ser Ile Leu Asp Thr Asn Leu Gly Ser Leu Phe 4100 4105 4110 Gly Leu Met Thr Gln Gln Phe Ser Ala Thr Gly Gln Ala Lys Thr Thr 4115 4120 4125 Phe Thr Tyr Thr Pro Glu Asp Leu Pro Arg Gln Leu Lys Asn Lys Leu 4130 4135 4140 Leu Gly Gln Leu Ala Gly Val Gly Ala Glu Thr Thr Leu Ala Asp Ile 4145 4150 4155 4160 Phe Gly Val Asp Tyr Thr Ala Ser Gly Gln Ile Val Ser Arg Asn Gly 4165 4170 4175 Glu Ala Val Asp Gly Val Ala Ile Leu Lys Glu Met Leu Glu Val Ile 4180 4185 4190 Gly Glu Phe Ser Gly Asp Gln Leu Gln Ala Phe Val Asp Pro Ala Lys 4195 4200 4205 Leu Leu Asp Ser Leu Lys Ala Gly Ile Asn Met Gly Ala Asp Gly Ile 4210 4215 4220 Lys Ser Phe Ala Glu Thr His Gly Leu Lys Glu Lys Ala Pro Glu Glu 4225 4230 4235 4240 Glu Glu Asp Asn Ser Ser Val Ser Val Asn Gly Ala Ser Val Asn Ser 4245 4250 4255 Ala Gln Gly Ala Thr Val Ala Asp Gly Ser Thr Glu Thr Ala Glu Thr 4260 4265 4270 Pro Asp Arg Ala Phe Gly Phe Asn Ser Leu Asn Leu Pro Asn Leu Phe 4275 4280 4285 Ala Thr Ile Phe Ser Gln Asp Lys Gln Lys Glu Met Lys Ser Leu Val 4290 4295 4300 Glu Asn Leu Lys Glu Asn Leu Thr Ala Asp Leu Leu Asn Met Lys Glu 4305 4310 4315 4320 Lys Thr Phe Asp Phe Leu Arg Asn Ser Gly His Leu Gln Gly Asp Gly 4325 4330 4335 Asp Ile Asn Ile Ser Leu Gly Asn Tyr Asn Phe Asn Trp Gly Gly Asp 4340 4345 4350 Gly Lys Asp Leu Gly Ala Tyr Leu Gly Asp Asn Asn Asn Phe Trp Gly 4355 4360 4365 Gly Arg Gly Asp Asp Val Phe Tyr Ala Thr Gly Thr Ser Asn Ile Phe 4370 4375 4380 Thr Gly Gly Glu Gly Asn Asp Met Gly Val Leu Met Gly Arg Glu Asn 4385 4390 4395 4400 Met Met Phe Gly Gly Asp Gly Asn Asp Thr Ala Val Val Ala Gly Arg 4405 4410 4415 Ile Asn His Val Phe Leu Gly Ala Gly Asp Asp Gln Ser Phe Val Phe 4420 4425 4430 Gly Glu Gly Gly Glu Ile Asp Thr Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Val Val 4435 4440 4445 Thr Ser Gly Asn Phe Asn Arg Val Asp Thr Gly Asp Asp Gln Asp Tyr 4450 4455 4460 Ser Val Thr Ile Gly Asn Asn Asn Gln Val Glu Leu Gly Ala Gly Asn 4465 4470 4475 4480 Asp Phe Ala Asn Val Phe Gly Asn Tyr Asn Arg Ile Asn Ala Ser Ala 4485 4490 4495 Gly Asn Asp Val Val Lys Leu Met Gly Tyr His Ala Val Leu Asn Gly 4500 4505 4510 Gly Glu Gly Glu Asp His Leu Ile Ala Ala Ala Ile Ser Lys Phe Ser 4515 4520 4525 Gln Phe Asn Gly Gly Glu Gly Arg Asp Leu Met Val Leu Gly Gly Tyr 4530 4535 4540 Gln Asn Thr Phe Lys Gly Gly Thr Asp Val Asp Ser Phe Val Val Ser 4545 4550 4555 4560 Gly Asp Val Ile Asp Asn Leu Val Glu Asp Ile Arg Ser Glu Asp Asn 4565 4570 4575 Ile Val Phe Asn Gly Ile Asp Trp Gln Lys Leu Trp Phe Glu Arg Ser 4580 4585 4590 Gly Tyr Asp Leu Lys Leu Ser Ile Leu Arg Asp Pro Ala Ser Asp Ser 4595 4600 4605 Asp Gln Ala Lys Phe Glu His Ile Gly Ser Val Thr Phe Ser Asp Tyr 4610 4615 4620 Phe Asn Gly Asn Arg Ala Gln Val Ile Ile Ala Met Gly Glu Lys Asp 4625 4630 4635 4640 Ala Thr Gly Glu Arg Glu Tyr Thr Thr Leu Ser Glu Ser Ala Ile Asp 4645 4650 4655 Ala Leu Val Gln Ala Met Ser Gly Phe Asp Pro Gln Ala Gly Asp Asn 4660 4665 4670 Gly Phe Ile Asp Asn Leu Asp Ser Lys Ser Arg Val Ala Ile Thr Thr 4675 4680 4685 Ala Trp Ala Asp Val Val His Lys Lys Gly Ile Thr Val 4690 4695 4700 <210> 5 <211> 3636 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 5 gcagagaagt ttggcgacta cctaacgcgt ttcttcggca agtccgatct gaacatggct 60 caaagctata agctgggtaa aaatgacgca ggtgaagcaa tcttcaaccg cgtggtggta 120 atggatggca acacgttagc aagctacaag ccgaccttcg gtgacaagac caccatgcag 180 gggatcctag atctacctgt gtttgacgct acaccgatga aaaagcccgg tacttcagat 240 gtcgatggca atgcaaaagc cgtagatgat acgaaagaag cattggctgg tggaaagata 300 cttcacaacc aaaatgtgaa tgactgggaa cgtgttgttg tgactccgac agcggacggc 360 ggtgaaagcc gttttgatgg tcaaatcatc gtgcaaatgg agaacgatga tgtcgttgca 420 aaagccgctg cgaaccttgc gggtaagcac ccagaaagca gtgtggtggt gcagatcgat 480 tcagacggca actatcgcgt ggtgtatggc gatccgtcaa agctggatgg aaagctacgt 540 tggcagttag taggtcatgg tcgagatgac tcagaaagta acaacacgcg tttaagtggc 600 tacagtgccg acgagctggc agtgaaattg gccaagttcc aacagtcgtt taatcaagcg 660 gaaaacatca acaataagcc tgatcatatc agtattgttg gttgttcttt ggtgagtgac 720 gataagcaaa aaggctttgg tcatcagttt attaacgcga tggatgcgaa tggtcttcgt 780 gtcgatgtct ctgtacgcag ttctgaactg gccgtagacg aggcagggcg taaacatacc 840 aaggacgcga atggtgattg ggtccaaaaa gccgaaaaca acaaagtttc gctaagctgg 900 gacgagcaag gtgaagttgt tgccaaggat gaacgtattc gcaacggtat tgcggaaggc 960 gacatcgatc tctctcgtat tggtgtcagc gacgttgacg agccagctcg tggtgcaatc 1020 ggtgacaaca atgatgtgtt tgatgcgcca gaaaaacgca aagcggagac agaaacctca 1080 tcttcttctg caaacaataa actcagctac tcaggtaaca ttcaagtcaa tgtgggtgat 1140 ggtgagttta cggcagtgaa ctggggcaca tcgaatgtgg gcattaaagt cggcacgggt 1200 ggctttaagt cgctggcttt tggtgacaat aacgtcatgg ttcacatcgg caatggtgag 1260 agcaagcaca gcttcgatat tggtggttat caggcactgg aaggtgcgca aatgttcatc 1320 ggtaatcgta atgtgagctt caacttaggt cgaagtaatg atctgattgt gatgatggac 1380 aagtcgattc cgactccgcc attggttaat ccgttcgatg gtgccgctcg tatttcgggc 1440 gtactgcaaa gcattgccac ctcgggtgag ggccaagatt ggctagcggc tcaagagcag 1500 caatggacat tgtctggcgc caagaagttc gtcaaagata tgtctggttt ggatcagagc 1560 agcagtgttg attacaccag tttggttgaa ctggactcgc agaacgagcg aagcagccgt 1620 ggcttgaagc acgatgcaga agcggctctg aacaagcagt acaatcaatg gttaagtggc 1680 aatagcgatt ctgacaccag caagctcagc cgcgcagata agcttcgtca agccaatgaa 1740 aagcttgcgt ttaactttgc tgtgggtggt caaggtgcgg atatccaagt cacgacaggt 1800 aactggaact tcatgtttgg tgacaacatc cagtctattt tggataccaa cctaggttca 1860 ctgtttggcc tcatgacaca gcagttctct gctacgggtc aggccaagac aaccttcacc 1920 tacacgccag aagatttgcc tcgtcagctt aagaacaagc tacttgggca gttagcgggt 1980 gtaggagccg agaccacgct agcggatatt tttggtgtgg attacaccgc gtcaggtcaa 2040 attgtttcgc gtaatggtga agctgtcgat ggtgtagcga ttctcaaaga gatgttggag 2100 gtcattggtg agttcagtgg tgatcaactg caagcttttg tcgacccagc taagttactg 2160 gatagcttga aggcgggtat caacatgggt gcggatggca ttaagtcttt tgctgaaact 2220 catggactga aagagaaggc gccagaagag gaagaggaca actcttcggt ttctgttaat 2280 ggtgcgagcg taaacagtgc gcaaggcgcg acggtggctg atggcagcac tgaaacagca 2340 gaaacaccag atcgtgcctt tggctttaac tcgcttaacc tgccgaactt gttcgccact 2400 atctttagtc aagacaagca gaaagagatg aaatcgctgg tggaaaatct caaagagaat 2460 ctcaccgccg atctgctgaa tatgaaagag aaaacgtttg atttccttcg taacagtggt 2520 catctccaag gtgatggtga tatcaacatc tccctaggaa actacaactt caactggggt 2580 ggtgatggta aagatctcgg agcgtatcta ggagacaaca acaacttctg gggcggacga 2640 ggcgatgatg tgttctacgc aacaggcacg tcaaacatct tcacgggcgg cgaaggcaac 2700 gacatgggcg ttctgatggg acgtgaaaac atgatgtttg gcggtgatgg caacgacaca 2760 gcagtggttg caggacgcat taaccatgtc ttccttggtg ccggtgatga ccagtcgttt 2820 gtctttggtg agggcggtga aattgacacc ggttcaggcc gcgactacgt ggtgacgtct 2880 ggcaacttca accgtgtgga tacgggggac gatcaagact actccgtgac gattggcaac 2940 aacaaccaag tagagctagg cgctggcaat gactttgcta atgtcttcgg taactacaac 3000 cgtatcaatg caagcgctgg caacgatgtt gtgaagctaa tgggctatca cgccgtgttg 3060 aatggtggtg agggcgagga ccatctcatc gcagcggcca tctctaagtt cagtcaattc 3120 aacggtggcg aagggcgcga tctgatggtg ttgggtggtt atcaaaacac gttcaaaggt 3180 ggcacggatg tggacagctt tgtggtgagc ggtgatgtta tcgacaacct tgttgaagac 3240 attcgcagcg aagataacat tgtcttcaat ggcatcgatt ggcagaaact gtggttcgaa 3300 cgcagcggat atgacctgaa gttgtctatt cttcgtgacc cggcaagcga cagtgaccaa 3360 gcgaagtttg agcatattgg ttcggtgacg tttagtgatt actttaacgg taatcgagcg 3420 caggtgatca tcgcaatggg tgagaaagac gcgacgggtg aacgtgagta caccaccttg 3480 tctgagagtg caattgatgc gctggtacaa gccatgagtg gctttgaccc tcaggcgggt 3540 gacaatggat tcatcgataa cctagacagc aaatctcgcg tggcgattac cactgcgtgg 3600 gcagacgttg ttcataaaaa gggtataacg gtgcat 3636 <210> 6 <211> 1211 <212> PRT <213> Vibrio vulnificus <400> 6 Ala Glu Lys Phe Gly Asp Tyr Leu Thr Arg Phe Phe Gly Lys Ser Asp 1 5 10 15 Leu Asn Met Ala Gln Ser Tyr Lys Leu Gly Lys Asn Asp Ala Gly Glu 20 25 30 Ala Ile Phe Asn Arg Val Val Val Met Asp Gly Asn Thr Leu Ala Ser 35 40 45 Tyr Lys Pro Thr Phe Gly Asp Lys Thr Thr Met Gln Gly Ile Leu Asp 50 55 60 Leu Pro Val Phe Asp Ala Thr Pro Met Lys Lys Pro Gly Thr Ser Asp 65 70 75 80 Val Asp Gly Asn Ala Lys Ala Val Asp Asp Thr Lys Glu Ala Leu Ala 85 90 95 Gly Gly Lys Ile Leu His Asn Gln Asn Val Asn Asp Trp Glu Arg Val 100 105 110 Val Val Thr Pro Thr Ala Asp Gly Gly Glu Ser Arg Phe Asp Gly Gln 115 120 125 Ile Ile Val Gln Met Glu Asn Asp Asp Val Val Ala Lys Ala Ala Ala 130 135 140 Asn Leu Ala Gly Lys His Pro Glu Ser Ser Val Val Val Gln Ile Asp 145 150 155 160 Ser Asp Gly Asn Tyr Arg Val Val Tyr Gly Asp Pro Ser Lys Leu Asp 165 170 175 Gly Lys Leu Arg Trp Gln Leu Val Gly His Gly Arg Asp Asp Ser Glu 180 185 190 Ser Asn Asn Thr Arg Leu Ser Gly Tyr Ser Ala Asp Glu Leu Ala Val 195 200 205 Lys Leu Ala Lys Phe Gln Gln Ser Phe Asn Gln Ala Glu Asn Ile Asn 210 215 220 Asn Lys Pro Asp His Ile Ser Ile Val Gly Cys Ser Leu Val Ser Asp 225 230 235 240 Asp Lys Gln Lys Gly Phe Gly His Gln Phe Ile Asn Ala Met Asp Ala 245 250 255 Asn Gly Leu Arg Val Asp Val Ser Val Arg Ser Ser Glu Leu Ala Val 260 265 270 Asp Glu Ala Gly Arg Lys His Thr Lys Asp Ala Asn Gly Asp Trp Val 275 280 285 Gln Lys Ala Glu Asn Asn Lys Val Ser Leu Ser Trp Asp Glu Gln Gly 290 295 300 Glu Val Val Ala Lys Asp Glu Arg Ile Arg Asn Gly Ile Ala Glu Gly 305 310 315 320 Asp Ile Asp Leu Ser Arg Ile Gly Val Ser Asp Val Asp Glu Pro Ala 325 330 335 Arg Gly Ala Ile Gly Asp Asn Asn Asp Val Phe Asp Ala Pro Glu Lys 340 345 350 Arg Lys Ala Glu Thr Glu Thr Ser Ser Ser Ser Ala Asn Asn Lys Leu 355 360 365 Ser Tyr Ser Gly Asn Ile Gln Val Asn Val Gly Asp Gly Glu Phe Thr 370 375 380 Ala Val Asn Trp Gly Thr Ser Asn Val Gly Ile Lys Val Gly Thr Gly 385 390 395 400 Gly Phe Lys Ser Leu Ala Phe Gly Asp Asn Asn Val Met Val His Ile 405 410 415 Gly Asn Gly Glu Ser Lys His Ser Phe Asp Ile Gly Gly Tyr Gln Ala 420 425 430 Leu Glu Gly Ala Gln Met Phe Ile Gly Asn Arg Asn Val Ser Phe Asn 435 440 445 Leu Gly Arg Ser Asn Asp Leu Ile Val Met Met Asp Lys Ser Ile Pro 450 455 460 Thr Pro Pro Leu Val Asn Pro Phe Asp Gly Ala Ala Arg Ile Ser Gly 465 470 475 480 Val Leu Gln Ser Ile Ala Thr Ser Gly Glu Gly Gln Asp Trp Leu Ala 485 490 495 Ala Gln Glu Gln Gln Trp Thr Leu Ser Gly Ala Lys Lys Phe Val Lys 500 505 510 Asp Met Ser Gly Leu Asp Gln Ser Ser Ser Val Asp Tyr Thr Ser Leu 515 520 525 Val Glu Leu Asp Ser Gln Asn Glu Arg Ser Ser Arg Gly Leu Lys His 530 535 540 Asp Ala Glu Ala Ala Leu Asn Lys Gln Tyr Asn Gln Trp Leu Ser Gly 545 550 555 560 Asn Ser Asp Ser Asp Thr Ser Lys Leu Ser Arg Ala Asp Lys Leu Arg 565 570 575 Gln Ala Asn Glu Lys Leu Ala Phe Asn Phe Ala Val Gly Gly Gln Gly 580 585 590 Ala Asp Ile Gln Val Thr Thr Gly Asn Trp Asn Phe Met Phe Gly Asp 595 600 605 Asn Ile Gln Ser Ile Leu Asp Thr Asn Leu Gly Ser Leu Phe Gly Leu 610 615 620 Met Thr Gln Gln Phe Ser Ala Thr Gly Gln Ala Lys Thr Thr Phe Thr 625 630 635 640 Tyr Thr Pro Glu Asp Leu Pro Arg Gln Leu Lys Asn Lys Leu Leu Gly 645 650 655 Gln Leu Ala Gly Val Gly Ala Glu Thr Thr Leu Ala Asp Ile Phe Gly 660 665 670 Val Asp Tyr Thr Ala Ser Gly Gln Ile Val Ser Arg Asn Gly Glu Ala 675 680 685 Val Asp Gly Val Ala Ile Leu Lys Glu Met Leu Glu Val Ile Gly Glu 690 695 700 Phe Ser Gly Asp Gln Leu Gln Ala Phe Val Asp Pro Ala Lys Leu Leu 705 710 715 720 Asp Ser Leu Lys Ala Gly Ile Asn Met Gly Ala Asp Gly Ile Lys Ser 725 730 735 Phe Ala Glu Thr His Gly Leu Lys Glu Lys Ala Pro Glu Glu Glu Glu 740 745 750 Asp Asn Ser Ser Val Ser Val Asn Gly Ala Ser Val Asn Ser Ala Gln 755 760 765 Gly Ala Thr Val Ala Asp Gly Ser Thr Glu Thr Ala Glu Thr Pro Asp 770 775 780 Arg Ala Phe Gly Phe Asn Ser Leu Asn Leu Pro Asn Leu Phe Ala Thr 785 790 795 800 Ile Phe Ser Gln Asp Lys Gln Lys Glu Met Lys Ser Leu Val Glu Asn 805 810 815 Leu Lys Glu Asn Leu Thr Ala Asp Leu Leu Asn Met Lys Glu Lys Thr 820 825 830 Phe Asp Phe Leu Arg Asn Ser Gly His Leu Gln Gly Asp Gly Asp Ile 835 840 845 Asn Ile Ser Leu Gly Asn Tyr Asn Phe Asn Trp Gly Gly Asp Gly Lys 850 855 860 Asp Leu Gly Ala Tyr Leu Gly Asp Asn Asn Asn Phe Trp Gly Gly Arg 865 870 875 880 Gly Asp Asp Val Phe Tyr Ala Thr Gly Thr Ser Asn Ile Phe Thr Gly 885 890 895 Gly Glu Gly Asn Asp Met Gly Val Leu Met Gly Arg Glu Asn Met Met 900 905 910 Phe Gly Gly Asp Gly Asn Asp Thr Ala Val Val Ala Gly Arg Ile Asn 915 920 925 His Val Phe Leu Gly Ala Gly Asp Asp Gln Ser Phe Val Phe Gly Glu 930 935 940 Gly Gly Glu Ile Asp Thr Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Val Val Thr Ser 945 950 955 960 Gly Asn Phe Asn Arg Val Asp Thr Gly Asp Asp Gln Asp Tyr Ser Val 965 970 975 Thr Ile Gly Asn Asn Asn Gln Val Glu Leu Gly Ala Gly Asn Asp Phe 980 985 990 Ala Asn Val Phe Gly Asn Tyr Asn Arg Ile Asn Ala Ser Ala Gly Asn 995 1000 1005 Asp Val Val Lys Leu Met Gly Tyr His Ala Val Leu Asn Gly Gly Glu 1010 1015 1020 Gly Glu Asp His Leu Ile Ala Ala Ala Ile Ser Lys Phe Ser Gln Phe 1025 1030 1035 1040 Asn Gly Gly Glu Gly Arg Asp Leu Met Val Leu Gly Gly Tyr Gln Asn 1045 1050 1055 Thr Phe Lys Gly Gly Thr Asp Val Asp Ser Phe Val Val Ser Gly Asp 1060 1065 1070 Val Ile Asp Asn Leu Val Glu Asp Ile Arg Ser Glu Asp Asn Ile Val 1075 1080 1085 Phe Asn Gly Ile Asp Trp Gln Lys Leu Trp Phe Glu Arg Ser Gly Tyr 1090 1095 1100 Asp Leu Lys Leu Ser Ile Leu Arg Asp Pro Ala Ser Asp Ser Asp Gln 1105 1110 1115 1120 Ala Lys Phe Glu His Ile Gly Ser Val Thr Phe Ser Asp Tyr Phe Asn 1125 1130 1135 Gly Asn Arg Ala Gln Val Ile Ile Ala Met Gly Glu Lys Asp Ala Thr 1140 1145 1150 Gly Glu Arg Glu Tyr Thr Thr Leu Ser Glu Ser Ala Ile Asp Ala Leu 1155 1160 1165 Val Gln Ala Met Ser Gly Phe Asp Pro Gln Ala Gly Asp Asn Gly Phe 1170 1175 1180 Ile Asp Asn Leu Asp Ser Lys Ser Arg Val Ala Ile Thr Thr Ala Trp 1185 1190 1195 1200 Ala Asp Val Val His Lys Lys Gly Ile Thr Val 1205 1210 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 acatgaattc ataccatggc agagaagttt ggcgactac 39 <210> 8 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 8 ccattctcga gctaatgatg atgatgatga tgcgtgcctg ttgcgtagaa cac 53 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 9 acatgaattc ataccatggc agagaagttt ggcgactac 39 <210> 10 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 10 ccattctcga gctaatgatg atgatgatga tgctcacccg aggtggcaat gc 52

Claims (10)

  1. 수탁번호 KCLRF-BP-00262의 하이브리도마 세포.
  2. 수탁번호 KCLRF-BP-00262의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원 및 열처리된 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 결합하는 단일클론항체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원의 3491번 내지 3980번 아미노산 부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
  4. 제2항의 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증균 검출을 위한 조성물.
  5. 제2항의 단일클론항체를 포함하는 비브리오 패혈증균 검출을 위한 진단키트.
  6. 제2항의 단일클론항체를 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 비브리오 패혈증균을 검출하는 방법.
  7. 제2항의 단일클론항체를 열처리된 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 비브리오 패혈증균을 검출하는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 검출은 ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 검출하는 방법.
  9. 제2항의 항체를 포함하는 비브리오 패혈증 치료제.
  10. (A) 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원 유래의 서열번호 6의 재조합 단백질 또는 그 융합단백질을 사용하여 생쥐를 면역화하는 단계;
    (B) 상기 면역화된 생쥐의 비장 세포를 마이엘로마 세포와 융합하여 배양하는 단계;
    (C) 상기 융합된 하이브리도마 세포에서 비브리오 패혈증균 RtxA1 항원에 결합하는 단일 클론항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00262의 하이브리도마 세포를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이브리도마 세포의 제조방법.
KR1020110031354A 2011-04-05 2011-04-05 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트 Expired - Fee Related KR101309485B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110031354A KR101309485B1 (ko) 2011-04-05 2011-04-05 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110031354A KR101309485B1 (ko) 2011-04-05 2011-04-05 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120113580A true KR20120113580A (ko) 2012-10-15
KR101309485B1 KR101309485B1 (ko) 2013-09-23

Family

ID=47283117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110031354A Expired - Fee Related KR101309485B1 (ko) 2011-04-05 2011-04-05 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101309485B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015122598A1 (ko) * 2014-02-13 2015-08-20 한국해양과학기술원 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도
CN108251379A (zh) * 2018-01-15 2018-07-06 福建省农业科学院生物技术研究所 一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和创伤弧菌检测试剂盒

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101613347B1 (ko) 2014-02-13 2016-04-19 전북대학교산학협력단 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6183973B1 (en) * 1997-06-19 2001-02-06 Umbi - University Of Maryland Biotechnology Institute Vibrio vulnificus molecular probes, antibodies, and proteins

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015122598A1 (ko) * 2014-02-13 2015-08-20 한국해양과학기술원 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도
CN108251379A (zh) * 2018-01-15 2018-07-06 福建省农业科学院生物技术研究所 一种杂交瘤细胞株、创伤弧菌膜蛋白单克隆抗体和创伤弧菌检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
KR101309485B1 (ko) 2013-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI803523B (zh) Ｔｉｇｉｔ抗體、其抗原結合片段及醫藥用途
RU2765306C2 (ru) Антитело против в7-н3, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение
JPH11514217A (ja) 結核の診断のための化合物および方法
WO2016173558A1 (zh) 抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体的制备和应用
KR102274759B1 (ko) 황색포도알균 장독소 b에 특이적인 항체 및 이의 용도
EA020544B1 (ru) АНТИТЕЛА ПРОТИВ PcrV
WO2011063346A1 (en) Targeting of the c-terminal segment of c. difficile toxin b for improved clinical diagnosis, prevention, and treatment
US11634481B2 (en) B-cell epitope of Trichinella spiralis cysteine protease inhibitor, hybridoma cell line, monoclonal antibody and uses thereof
US11459402B2 (en) Hybridoma cell strain and monoclonal antibody produced therefrom against serine protease of Trichinella spiralis in intestinal stage and application thereof
KR102822827B1 (ko) 칸디다에 대한 항체 및 이의 용도
KR101309485B1 (ko) 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트
JP2000506376A (ja) トキソプラズマ・ゴンジイ抗原Ｔｇ２０
CN110476065B (zh) 诊断法
KR20100034720A (ko) 피에이유에프(ｐａｕｆ) 특이적인 인간 단일클론항체, 이를 포함하는 암 치료용 조성물, 이를 이용하는 암의 진단방법
JPH10110000A (ja) 分泌Ｍａｃ−２結合糖タンパク質
KR101349413B1 (ko) 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원 항원에 결합하는 단일클론항체 제조와 진단 항원을 제공하기 위한 재조합 단백질 발현벡터
KR101309386B1 (ko) 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원에 특이적인 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 포함하는 진단키트
KR101613347B1 (ko) 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도
KR101372766B1 (ko) 비브리오 패혈증균 알티엑스에이원 항원에 결합하는 단일클론항체 제조와 진단 항원을 제공하기 위한 재조합 단백질 발현벡터
KR20130131342A (ko) 헤르페스바이러스 6 글리코프로테인 q1에 대한 중화 항체의 제조 및 그의 해석
KR102358642B1 (ko) 한국형 낭충봉아부패병 바이러스에 특이적으로 결합하는 단클론항체 및 이의용도
US20240085427A1 (en) AN AGR2Xcd3 BISPECIFIC ENGAGER FOR THE TREATMENT OF CANCER
CN110470845A (zh) 幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒及其检测方法
KR101553845B1 (ko) 비브리오 패혈증균 알티엑스에이-1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도
CN121203023A (zh) 一种抗跨膜蛋白ms4a7的单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
PA0109 Patent application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A12-nap-PA0109

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

D13-X000 Search requested

St.27 status event code: A-1-2-D10-D13-srh-X000

D14-X000 Search report completed

St.27 status event code: A-1-2-D10-D14-srh-X000

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R18-oth-X000

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

St.27 status event code: A-1-2-D10-D22-exm-PE0701

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U11-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R13-asn-PN2301

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160825

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 4

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-4-4-P10-P22-nap-X000

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170829

Year of fee payment: 5

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180829

Year of fee payment: 6

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 6

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R14-asn-PN2301

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R13-asn-PN2301

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

PC1903 Unpaid annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U13-oth-PC1903

Not in force date: 20190911

Payment event data comment text: Termination Category : DEFAULT_OF_REGISTRATION_FEE

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

PC1903 Unpaid annual fee

St.27 status event code: N-4-6-H10-H13-oth-PC1903

Ip right cessation event data comment text: Termination Category : DEFAULT_OF_REGISTRATION_FEE

Not in force date: 20190911

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R13-asn-PN2301

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R13-asn-PN2301

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000