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KR20120099440A - Ｇａｄｄ45β를 표적으로 하는 물질 - Google Patents

Ｇａｄｄ45β를 표적으로 하는 물질 Download PDF

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KR20120099440A
KR20120099440A KR1020127013065A KR20127013065A KR20120099440A KR 20120099440 A KR20120099440 A KR 20120099440A KR 1020127013065 A KR1020127013065 A KR 1020127013065A KR 20127013065 A KR20127013065 A KR 20127013065A KR 20120099440 A KR20120099440 A KR 20120099440A
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KR
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phe
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glu
phenyl
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귀도 프란조소
안제이 자사-카미엑-알베르트
캐롤라인 민리 레이첼 로우
시모나 마리아 몬티
메노티 루보
로라 토르나토레
캐서린 제인 트라라우-스튜어트
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임페리얼 이노베이션스 리미티드
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Abstract

테트라펩타이드(tetrapeptide), 트리펩타이드(tripeptide), 및 디펩타이드(dipeptide) 모이어티(moiety) 및 이에 상응하는 펩토이드(peptoid) 모이어티에 기초한 화합물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 암, 염증성 질환 및 그 외 다른 장애의 치료에 이용되는 관련된 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

Ｇａｄｄ45β를 표적으로 하는 물질{Gadd45beta targeting agents}
본 발명은 암 및 예를 들면 염증성 질병 및 장애와 같은 그 외 질병 및 장애, 및 이의 치료적 조절에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 세포예정사(programmed cell death) 및 암세포의 증식, 및 전염증성/자가면역 세포를 조절할 수 있는 짧은 펩타이드(short peptide)에 기초한 화합물에 관한 것이다.
세포 사멸은 오랫동안 전염증성, 자가면역 세포 및 그 외 질환 세포 뿐만 아니라, 암 세포 치료의 타겟으로 생각되어져 왔다. c-준 N-종결 카이나제 JNK 경로(c-Jun N-terminal kinase JNK pathway)을 포함한 세포 사멸을 일으키는 것과 관련된 다양한 세포 신호전달이 있다. JNK는 사이토카인에 반응하고, 가시광선 조사, 열 충격 및 삼투압 충격과 같은 스트레스 자극에 반응한다. 또한 사이토카인 및 세포 스트레스에 반응하여 활성화되는 것은 NF-κβ 경로이다. NF-κβ 경로는 미토겐 활성화된 단백질-카아나제 7(MKK7/KNKK2)인 JNK 카이나제 및 Gadd45β에 의해 매개되는 혼선에 의해 JNK 경로를 억제할 수 있다. MKK7 활성은 Gadd45β, Gadd45 패밀리(family)의 유도인자, NF-κβ의 직접적인 전사 타켓에 의해 억제된다. 이것은 Gadd45β가 MKK7에 결합하여 활성을 억제함으로써 JNK 신호의 NF-κβ의 억제를 매개한다는 것을 의미한다(Papa, et al. 2004, Nature Cell Biology 6(2):1462153).
NF-κβ 억제제의 이용은 암 및 염증성 질환의 치료에의 이용이 제안되어 왔다. 그러나, NF-κβ는 세포사멸, 면역, 염증 및 조직 발달 역할을 포함하는 활성 인자를 가지고 있기 때문에, NF-κβ자체를 억제하는 것보다, NF-κβ의 특정 기능을 억제하는 것이 선호된다.
본 발명은 염증성 질환, 유전적 질환 및 다양한 암에서의 상향조절되는 것을 알려진 Gadd45β의 억제에 관한 것이다.
형질세포 골수종(plasma cell myeloma) 또는 칼러스 질환(kahler's disease) 이라고도 알려진 다발성 골수종(multiple myeloma)은 형질세포의 암이다. 다발성 골수종은 현재까지는 치료를 할 수 없으며, 스테로이드, 화학요법, 탈리도마이드(thalidomide), 예를 들면, 보테조밉(brotezomib), 멜팔란(melphalan)과 같은 단백질분해효소복합체(proteasome) 억제제 및 줄기세포이식을 이용하여 일시적인 완화만을 할 수 있다. 미국 암 협회에 따르면, 미국에는 약 45,000명의 다발성 골수종 환자가 있으며, 매년 약 15,000명 가량이 새롭게 발생하고 있다. 진단 시기부터 평균 생존기간은 약 3년이다. 다발성 골수종은 비홉긴스 림프종(non-Hodgkin's lymphoma) 다음으로 두 번째로 많은 혈액암이고, 전체 암의 약 1%를 차지하고, 전체 암 사망의 약 2%를 차지한다. 다발성 골수종의 발생은 증가하는 추세이며, 질병이 발생하는 나이도 점점 낮아지고 있다는 증거가 있다. 그러므로, 다발성 골수종에 대한 치료를 향상시킬 수 있는 방법이 요구된다.
거의 대부분의 다발성 골수종 원발성 종양 및, 다발성 골수종 세포주는 NF-κβ 활성을 나타낸다. NF-κβ의 활성을 억제하는 것은 다발성 골수종 세포 사멸을 일으킨다. NF-κβ 타켓 전략의 결과로 인한 장기간 암 치료를 달성하는데 있어서 주요 장벽은 특이성의 부족이고, 이로 인한, 좋지 못한 치료 내성이다. 이것은 단백질분해효소복합체(proteasome)의 NF-κβ의 다변발현성 기능에 기인한 것이다. 더 특이적이고, 안전한 새로운 치료방법이 요구되며, 그러므로 더욱 효과적이다.
다발성 골수종에서의 NF-κβ의 주요 작용 중의 하나는 생존율을 상승시키는 것이다. Gadd45패밀리의 유도인자 구성원인 Gadd45β를 이용하여 JNK MAPK 캐스캐이드(cascade)를 억제함으로써, NF-κβ는 세포보호를 할 수 있다(De Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-313). Gadd45β는 다양한 자극에 반응하여 NF-κβ에 의해 상향조절되고, 직접적으로 JNK 카이나제 MKK7를 타겟팅 함으로써, 생존율을 상승시킨다(Papa, et al. 2004 Nature Cell Biology 6:146-153, Papa, et al. 2007) J. Biol. Chem. 282:19029-19041, Papa, et al. (2008) J. Clin.Invest. 118:191-1923).
단백질분해효소복합체(PIs) 및 직접적인 NF-κβ 억제제는 JNK 경로를 활성화함으로써 다발성 골수종 세포를 죽이나, 다발성 골수종의 치료에 있어서는 적합하지 않은데 그 이유는 완전한 억제 치료 용량으로 이용되지 못하게 하는 NF-κβ에 대한 비특이적인 효과 및/또는 단백질분해효소복합체에 대한 비특이적인 효과 때문이다.
다발성 골수종 이외에, GAdd45β는 간세포성 암종, 방광암, 뇌암 및 중추신경계암, 유방암, 두경부암(head and neck cancer), 폐암 및 전립선암을 포함하는 일부 고형종양뿐만 아니라, 대형 B 세포 림프종, 버킷스 림프종(Burkitt's lymphoma), 전단구성 백혈병(promonocytic leukemia) 및 다른 백혈병을 포함하는 종양에서 GAdd45β는 높은 수준으로 발현된다. 그러므로 이러한 암에서 GAdd45β 를 억제하는 것은 암세포 사멸을 유도할 수 있고, 치료적 효과를 가질 수 있다. 많은 혈액 악성암(다발성 골수종, 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), MALT 림프종, 대형 B 세포 림프종, 홉킨스 림프종, 골수이형성 증후군, 성인 T 세포 백혈병(HTLV-1), 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프성 백혈병을 포함) 및 고형 종양(유방암, 자궁경부암, 신장암, 폐암, 대장암, 간암, 식도암, 위암, 후두암, 갑상선암, 부갑상선암, 방광암, 난소암, 전립선암, 췌장암 및 다른 암을 포함) 또한 NF-κβ활성을 나타내는 것으로 알려졌으며, 이것은 증가된 종양 세포 사멸을 일으킬 수 있는 세포사멸의 능력을 잃어가면서 세포에 전-생존 신호를 제공한다(V. Baud and M. Karin 2009, Nat. Rev. Drug Dis. 8:33-40). 구성요소인 NF-κβ 활성은 또한, 흑색종, 원주종(cylindroma), 편평상피암, 자궁내막암, 망막아종(retinoblastoma), 성상세포종(astrocytoma) 및 교모세포종(glioblastoma)에서도 나타난다(V. Baud and M. Karin 2009, Nat. Rev. Drug Dis. 8:33-40). 비정상적인 높은 구성요소 NF-κβ 활성을 가지는 이러한 종양에서 Gadd45β를 억제하는 것은 또한 암성 세포에서 세포사멸을 유도함으로써 치료적 효과를 얻을 수 있다. Gadd45β를 통한 세포 생존에서의 NF-κβ의 신중한 전-생존(pro-survival) 작용을 타겟팅하는 것은 증가된 세포사멸(예를 들면, 자가면역 질환, 만성 염증성 질환, 퇴행성 질환, 허혈성 및 혈관성 질환)의 유도를 통해 치료될 수 있는 질병 또는 비정상적인 세포 생존에 의해 특징되어 지는 다른 질병 및 암을 포함한 질병 및 장애에 NF-κβ를 직접적으로 타겟팅하는 치료보다 더 안전하고 효과적인 치료방법을 제공한다는 것에 본 발명은 기반하고 있다.
많은 질환 및 장애가 NF-κβ의 활성에 의존하고 있다. 게다가 실제적으로 알려진 모든 인간 질병 또는 장애는 염증에 의존하는 병인론을 가지고 그러므로 NF-κβ에 관련되어 있다. 이러한 작용은 염증 반응의 주요 스위치(master switch)로서, 사이토카인, 수용체, 전사인자, 케모카인, 전염증성 효소, 및 염증을 시작하고 유지할 수 있는 전-생존 인자(pro-survival factors)를 인코딩하는 200개 이상의 유전자 배열의 발현과 함께 일어난다. 본 발명의 화합물은 염증에 있어서의 NF-κβ의 별개의 전-생존 활성을 억제한다. 그러므로, 이 화합물들로 치료될 수 있는 질병 및 장애는 통상적인 만성 염증성 질환(예를 들면, 염증성 장 질환, 류마티스 관절염 및 건서)을 제외하고, 주요 염증성 구성성분에 의존하는 질환 및 장애를 포함한다. 이러한 질환의 예는 항염증성 제제 또는 NF-κβ 억제제로 치료될 수 있는 질환 또는, NF-κβ억제제로 치료하기 적합한 것으로 제안된 질환, 본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 질환이며, 이것은 :
1. 호흡기계: 기관지성(bronchial), 알러지성(allergic), 내재성(intrinsic), 외재성(extrinsic), 운동-유도(exercise-induced), 약물 유도(drug-induced)(아스피린 및 NASID-유도) 천식(asthma) 및, 간헐적인 또는 지속적인 및 모든 심각도, 및 기도 과-반응성의 그외 원인을 포함하는 먼지-유도 천식(dust-induced asthma)을 포함하는 기도 폐쇄성 질환(obstructive disease of the airways); 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD); 감염성 및 호산구성 기관지염(eosinophilic bronchitis); 폐기종(emphysema); 기관지확장증(bronchiectasis); 낭포성 섬유증(cysitic fibrosis); 유육종증(sarcoidosis); 농부폐(farmer's lung) 및 관련된 질환; 과민감성 폐렴(hypersensitivity pneumonitis); 원인불명의 섬유 폐포염(crpytogenic fibrosing alveolitis), 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonias), 항함요법 및 만성 감염에 의한 섬유증, 결핵(tuberculosis) 및 아스퍼질러스증(aspergillosis) 및 다른 진균 감염을 포함하는 만성 감염에 의한 섬유증 및 항암요법에 의한 섬유증을 포함하는 폐 섬유증; 폐 이식의 합병증; 폐 맥관 구조(lung vasculature)의 맥관성 및 혈전성 장애, 및 폐 고혈압(pulmonary hypertension); 기도의 염증성 및 분비성 상태와 연관된 만성 기침의 치료 및 의원성 기침(iatrogenic cough)을 포함하는 진해(antitussive) 활성; 약물성 비염(rhinitis medicamentosa), 혈관운동신경성 비염(vasomotor rhinitis)을 포함하는 급성 및 만성 비염; 신경성 비염(rhinitis nervosa)(건초열)을 포함하는 지속적인 또는 계절성 알러지성 비염; 비용(nasal polyposis); 통상적인 감기, 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus), 독감, 코로나바이러스(중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 포함) 또는 아데노바이러스를 포함하는 급성 바이러스 감염; 또는 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis);
2. 골격 및 관절: 원발성 및 속발성 골관절염(osteoarthritis/osteoarthrosis), 예를 들면 선천성 고관절 이형성(congenital hip dysplasia)와 연관된 또는 이를 포함하는 관절염; 경추 및 요추 척추염, 및 요통(low back pain) 및 경부통(neck pain); 골다공증(osteoporosis); 류마티스성 관절염 및 스틸병(Still's disease); 강직성 척추여(ankylosing spondylitis), 건성관절염(psoriatic arthritis), 반응성 관절염(reactive arthritis) 및 미분화 척추관절증을 포함하는 혈청반응음성의 척추관절증(seronegative spondyloarthropathies); 포트병(potts' disease) 및 폰셋 증후군(poncet's syndrome)을 포함하는 패혈성 관절염(septic arthritis) 및 그 외 감염-관련 관절 질병 및 결핵과 같은 골격질환; 요산염 통품(urate gout), 칼슘 파이로포스페이트 침착증(calcium pyrophosphate deposition disease), 칼슘 아파타이트(calcium apatite) 관련 건(tendon), 활액낭(bursal), 활액(synovial) 염증을 포함하는 급성 및 만성 크리스탈-유도 활막염(crysta-induced synovitis); 베체트병(Behcet's disease); 원발성 및 속발성 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome); 전신성 경화증(systemic sclerosis) 및 제한형 경피증(limited scleroderma); 전신성 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus), 혼합형 결합 조직 질병(mixed connective tissue disease) 및 미분화 결합 조직 질병(undifferentiated connective tissue disease); 피부근염(dermatomyositis) 및 다발성근염(polymyositis)를 포함하는 염증성 근질환(inflammatory myopathies); 류마티스성 다발성 근육통(polymalgia rheumatica); 어떠한 관절 부위의 특발성 염증성 관절염 및 이와 관련된 증후군, 및 류마티스성 열(rheumatic fever) 및 이의 전신적 합병증을 포함하는 소아관절염(juvenile arthritis); 대형 세포 혈관염(giant cell arteritis), 타카야수 혈관염(Takayasu's arteritis), 처그스트라우스 증후군(chrug-strauss syndrome), 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 현미경적 다발성 동맥염(microscopic polyarteritis), 및 바이러스 감염, 과민감성 반응, 크리오글로불린(cryoglobulins), 및 파라단백질(paraprotein)과 관련된 혈관염을 포함하는 혈관염; 요통(low back pain); 가족성 지중해열(familial midterranean fever), 머클-웰스 증후군(muckle-wells syndrome), 및 가족성 동면성열(familial hibernian fever), 키쿠치 병(Kikuchi disease); 약물 유도 관절통(drug-induced arthalgias), 건염(tendonititides) 및 근육병(myopathies);
3. 부상(예를 들면 스포츠 활동에 의한 부상) 또는 질병에 의한 통증 및 근골격 질환의 결합 조직 재배치; 관절염(예를 들면 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍 또는 크리스탈 관절염), 그 외 관절 질병(예를 들면 퇴행성 추간판 질환(intervertebral disc degeneration), 또는 퇴행성 턱관절 질환(temporomandibular joint degeneration)), 골 재형성 질환(bone remodelling disease)(예를 들면 골다공증, 파제트 병(Paget's disease) 또는 골괴사), 다발성 연골염(polychondritis), 경피증(scleroderma), 혼합형 결합 조직 장애(mixed connective tissue disorder), 척추관절병증(spondyloarthropathies) 또는 치주질환(periodontal disease)(예를 들면 치주염(periodontitis));
4. 피부: 건선(psoriasis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis) 또는 그 외 습진성 피부염(eczematous dermatoses), 및 지연형 과민반응(delayed-type hypersensitivity reactions); 파이토 및 광선 피부염(phyto- and photodermatitis); 지루성피부염(seborrhoeic dermatitis), 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis), 편평태선(lichen planus), 경화태선(lichen sclerosus et atrophica), 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 피부유육종(skin sarcoid), 원판상홍반성 루푸스(discoid lupus erythematousus), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 수포성표피박리증(dpedermolysis bullosa), 피부묘기증(utricaria), 혈관신경부종(angioedema), 혈관염, 중독성홍반(toxic erythema), 호산구성 피부혈관염(cutaneous eosinophilias), 원형탈모증(alopecia areata), 남성형 대머리(male-pattern baldness), 스위트증후군(sweet's syndrome), 웨버-크리스티안 증후군(weber-christian syndrome), 다형 홍반(erythema multiforme); 감염성 및 비 감염성 봉와직염(cellulitis); 피부림프종(cutaenous lymphoma), 비-흑색종 피부암(non-melanoma skin cancer) 및 그 외 이형성 병소(dysplastic lesions); 고정된 약진(fixed drug eruption)을 포함하는 약물 유도 질환;
5. 눈: 안검염(blepharitis); 지속적인 또는 봄의 알러지성 결막염을 포함하는 결막염(conjunctivitis); 홍채염(iritis); 전안방성 및 후안방성 포도막염; 맥락막염(choroiditis); 자가면역; 망막에 영향을 주는 퇴행성 또는 염증성 장애; 자율신경성 안염을 포함하는 안염(ophthalmitis); 유육육종(srcoidosis); 바이러스, 진균 및 세균을 포함하는 감염;
6. 위장관계: 설염(glossitis), 치은염(gingivitis), 치근막염(periodontitis); 역류성 식도염을 포함하는 식도염(oesophagitis); 호산구성 위장염(eosinophici gastro-enteritis), 비만세포증(mastocytosis), 크로병(crohn's disease), 궤양성 대장염을 포함하는 대장염, 직장항문염, 항문소양증; 만성소화장애증(coeliac disease), 자극성 장 증후군(irritable bowel syndrome), 및 장과 관련없는 영향을 가지는 음식-관련 알러지(예를 들면, 편두통, 비염 또는 습진);
7. 복부: 자가면역, 알코올성 및 바이러스성을 포함하는 간염; 간의 섬유증 및 간경변; 담낭염(cholecystitis); 급성 및 만성의 췌장염(pancreatitis);
8. 비뇨생식기: 간질성 및 사구체신염(glomerulonephritis)을 포함하는 신장염(nephritis); 신증후군(nephrotic syndrome); 급성 및 만성(간질성) 방광염을 포함하는 방광염(cystitis) 및 후너 궤양(Hunner's ulcer); 급성 및 만성 요도염(urethritis), 전립선염(prosatitis), 부고환염(epididymitis), 난소염(oophoritis) 및 난관염(salpingitis); 외음-질염(vulvo-vaginitis); 페로니씨병(peryronie's disease); 발기부전(erectile dysfunction)(남성 및 여성);
9. 동종이식 거부(allograft rejection): 예를 들면, 신장, 심장, 간, 폐, 골수, 피부 또는 각막 이식 후의 급성 및 만성의 동종이식 거부, 수혈 후의 동종이식 거부 및 만성 이식편대 숙주질환(chronic graft versus host disease);
10. 중추신경계(CNS): 알츠하이머 질환 및 크로이츠-펠트 야콥병(CJD) 및 신변종 크로이츠-펠트 야콥병(nvCJD)을 포함하는 그 외 치매성 장애; 다발성 경화증 및 그 외 탈수초성 질환(demyelinating syndrome); 대뇌 죽상경화증(cerebral atherosclerosis) 및 혈관염(vaculitis); 측두 동맥염(temporal arteritis); 중증 근무력증(myasthenia gravis); 내장통(visceral pain), 두통, 편두통, 삼차 신경통, 비전형 안면통(atypical facial pain), 관절 및 골격통, 암 및 종양 침습에 의한 통증, 및 당뇨병, 간 후성, HIV-연관 신경병증을 포함하는 신경병증 통증 증후군(neuropathic pain syndrome) 급성 및 만성 통증(급성, 간헐성 또는 지속성, 중추기원 또는 말초 기원); 신경유육육종(neurosarcoidosis); 악성, 감염성 또는 자가면역 과정의 중추 및 말초 신경계 합병증;
11. 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroditis), 그래이브병(Gragve's disease), 에디슨병(addison's disease), 당뇨병, 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopanic purpura), 호산구성 근막염(eosinophilic fasciitis), 고-IgE 증후군(hyper-IgE syndrome), 항인지질항체증후군(antiphospholipid syndrome);을 포함하는 그 외 자가 면역 및 알러지성 장애;
12. 염증성 또는 면역 성분과 관련된 그 외 장애; 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 나병(leprosy), 쎄자리 증후군(Sezary syndrome), 및 방종양성증후군(paraneoplastic syndromes)을 포함;
13. 심혈관계: 관상 및 말초 순환에 영향을 주는 동맥경화증; 심막염(pericarditis); 심근염(myocarditis), 심근 유육종을 포함하는 염증성 및 자가면역 심근병증; 허혈성 재관류 손상; 심내막염, 판막염, 및 염증성(예를 들면 매독성)을 포함하는 대동맥염; 혈관염; 정맥염 및 혈전증을 포함하는, 심부정맥 혈전증 및 하지정맥류를 포함하는 근위 및 말초 정맥의 장애;
14. 위장관계; 만성소화장애증(coeliac disease), 직장항문염, 호산구성 위장염(eosinophici gastro-enteritis), 비만세포증(mastocytosis), 크론병(crohn's disease), 궤양성 대장염, 현미경적 장염, 불확정 대장염(indeterminate colitis), 자극성 장 증후군(irritable bowel syndrome), 비염증성 설사, 장과 관련없는 영향을 가지는 음식-관련 알러지(예를 들면, 편두통, 비염 또는 습진);
을 포함한다.
본 발명은 Gadd45β/MKK7 복합체의 신규한 억제제 및/또는 암, 염증, 자가면역 및 퇴행성, 허혈성, 혈관성 장애에서의 NK-κβ의 전-생존 작용을 억제하는데 이용될 수 있는 이 복합체의 신호의 신규한 억제제에 관한 것이다.
도 1은 TNF-R1 신호에 있어서, NF-κβ 및 JNK 경로사이의 보호적인 혼선을 나타내는 도이다; NF-κβ에 의해 유도된 생존 경로 및 MKK7과 JNK에 의해 유도된 사멸 경로 사이의 혼선을 Gadd45β가 매개한다는 것을 나타낸다; Gadd45β를 억제함으로써 이러한 혼선을 억제하는 것은 MKK7이 JNK를 활성화시키게 하고, 그러므로 종양 세포에서 사멸 경로를 촉발시킨다.
도 2는 Gadd45β-MKk7 복합체의 모형을 나타낸 도이다; 이 모형은 Papa S. et al. 2007, J Biol Chem 282:19029-19041에 보고된 방법으로 만들어졌다; 이 모형은 MKK7(pdb:2DYL)의 결정학상의 구조(crystallographic structure) 및, Gadd45γ(pdb:3FFM)의 결정학상의 구조에 기초하여 모형화된 Gadd45β의 구조를 이용하여 더 개량되었다; Gadd45β의 구조는 파란색(리본)이고, MKK7의 구조는 노란색(반 데르 발스 표면과 함께 리본 또한 표시됨)이다; Gadd45β의 억제성 산성 루프 60-71 및 104-118(Papa S. et al. 2007, J Biol Chem 282:19029-19041)을 강조표시하였다.
도 3A 는 납 D-테트라펩타이드(lead D-tetrapeptide) 1 및 2를 분리하기 위해 이용된 ELISA 스크린을 나타낸 도이다; X1 에서 X4의 각 위치로부터 12개의 아미노산 중의 하나를 이용하여 제조된 일반적 식 Fmoc-(βAla)2-X1-X2-X3-X4-CONH2(Marasco et al. 2008, Curr. Protein Pept. Sci. 9:447-67)의 단순화된 결합 라이브러리를 스크리닝함으로써 Gadd45β/MKK7 상호작용의 길항제를 선별하였다. 이 라이브러리는 124=20,736개의 서로 다른 펩타이드를 포함하고 있고, 각 단계에서 코팅된 인간 MKK7(42nM), 수용성 바이오틴-라벨된(biotin-labeled) 인간 (h)Gadd45β(21 nM) 및 42nM의 농도에서 각 12개의 서브 라이브러리를 이용하여 ELISA 경쟁 어세이(competition assay)에 의해 반복적으로 4 단계로 디콘볼루트(deconvolute)되었다.
도 3B는 첫 번째 선별에서 가장 활성이 좋은 펩타이드를 두 번째-선별 라이브러리의 합성에 이용한 것을 나타낸 도이다; 이 라이브러리의 스크리닝은 두 개의 높은 활성을 가지는 펩타이드를 제공한다(도 3B에 1 및 8로 표시되었다).
도 3C는 최적화된 펩타이드에서 Fmoc-(βAla)2-tag를 제거하고 D-이성질체(D-isomers)로 합성하였고, DTP1 및 DTP2를 생산하여, 이것이 각각 0.22 nM 및 0.19 nM의 IC50 값을 가지는 Gadd45β/MKK7 상호작용을 억제하는 것을 나타낸 도이다; 이 펩타이드의 L-이성질체(즉, LTP1 및 LTP2)가 ELISA 경쟁 어세이에서 DTPs와 비슷한 IC50값을 가지는 것을 알 수 있고, 반면에, 음성 대조군 펩타이드인 LNC 및 DNC는 Gadd45β/MKK7 복합체의 형성에 어떠한 억제 효과도 관찰되지 않은 것을 알 수 있다; LNC는 L-이성질체 음성 대조군이고; LTP1은 L-이설질체 테트라 펩타이드 1이고; LTP2는 L-이성질체 테트라펩타이드 2이고; DNC는 D-이성질체 음성 대조군이다.
도 4는 생물학적 유체(biological fluid)에서의 Z-DTPs의 안정성을 나타낸 도이다. ELISA 경쟁 어세이는 Z-보호된 DTPs(Z-DTP1, Z-DTP2)가 37℃에서 48시간 동안 인간 혈청으로 배양된 후에 완전한 억제 활성을 유지하고 있다는 것을 보여주고(IC50 = 0.19 nM, Z-DTP1; IC50 = 0.18 nM, Z-DTP2), 반면에 Z 보호된 LTPs(Z-LTP1, Z-LTP2)는 이러한 처리 후에 거의 완전하게 비활성화되었다(IC50s>10μM); 어세이는 코팅된 MKK7, 수용성 바이오틴-hGadd45β, 및 테트라펩타이드의 지시된 농도를 이용하여 도 3에 나타낸 방법과 동일하게 수행하였고, Z-LNC 및 Z-DNC는 각각 L- 및 D- 이성질체 음성 대조군이다.
도 5는 D-테트라펩타이드 1 및 2 (DTP1 및 DTP2)에 의해 효과적이고 특이적으로 Gadd45β/MKK7 상호작용이 억제되고, 음성대조군 D-테트라펩타이드(NC1, NC2, NC3 및 NC4)에 의해서는 억제되지 않는 것을 Co-면역침강법(co-IP)으로 검사한 도이다; Co-IP는 항-플라그(anti-FLAG)(MKK7) 항체를 이용하여 수행하였고, 웨스턴 블랏은 항-HA(HA-Gadd45β 탐지)(위쪽) 또는 항-MKK7(아래쪽) 항체를 지시된 데로 이용하여 수행하였다.
도 6은 MKK7 카이나제 어세이를 이용하여 D-테트라펩타이드 1 및 2(DTP1 및 DTP2)에 의해 효과적이고 특이적으로 Gadd45β/MKK7의 상호작용이 억제되고 MKK7 촉매 활성의 회복되고, 음성 대조군 D-테트라펩타이드(NC1, NC2, NC3 및 NC4)에 의해서는 일어나지 않는 것을 나타낸 도이다; 활성 MKK7은 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)/이오노마이신 (P/I)-처리 HEK-294T 세포(phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)/(ionomycin (P/I)-treated HEK-293T cells)로부터 항-플라그(anti-FLAG) 항체를 이용하여 면역침강되었고, 재조합 인간 (h)Gadd45β으l 존재(위쪽 패널) 또는 부존재(아래쪽 패널)하에서 D-테트라펩타이드와 함께 배양되었다; 표시된 되로, 납 D-테트라펩타이드 또는 대조군 NC 테트라펩타이드는 Gadd45β의 존재하에서 카이나제와 함께 배양되었을 때, MKK7 촉매 활성을 억제하지 않았다(아래쪽 패널).
도 7A, 7B, 7C는 [3H]티피민 인코포레이션 어세이(thymidine incorporation assays)를 나타낸 도로, DTP2의 Z-보호 유도체(Z-DTP2)가 종양 세포주에서 유의적인 종양세포 사멸 활성을 가지고, DTP2의 아세틸 유도체(Ac-DTP2) 또는 DTP2의 L-이성질체의 Z-보호 유도체(Z-LTP2)는 가지지 않음을 나타낸다; 데이타는 처리되지 않은 세포의 생존/증식에 대해 10 μM의 Z-DTP2(A), Ac-DTP2(B) 또는 Z-LTP2(C)(색칠된 막대기), 또는 Z-DNC(A), Ac-DNC(B) 및 Z-LNC(C)(색칠되지 않은 막대기)로 처리된 후의 종양세포의 생존/증식의 퍼센트로 표시되었다; 시간점이 표시되었다; 시험된 8개의 감수성 다발성 골수종 세포주 중의 3개가 표시되었고(즉, U266, KMS-11, NCIH929), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma)(BJAB), 및 전-단핵구성 백혈병(pro-monocytic leukaemia)(U937) 세포주가 표시되었다; 이러한 데이타는 Ac-DTP2(B)의 비활성에 비해 Z-DTP2(A)가 높은 세포독성 활성을 가지고, Z-LTP2(C)가 낮은 활성을 가진다는 것을 보여준다(도 8A, 8B, 8C 및 표 4에도 나타났다; 부가적인 다발성 골수종 세포주); (B) 다발성 골수종 세포주에서의 Ac-DTP2'의 종양세포 사멸 활성의 부존재는 CaCO2 어세이에서도 나타났듯이, 이 화합물의 낮은 세포 투과성과 관련되어 있다; 메틸(Me), 아세틸(Ac), 미리스틸(Myr), 3-메톡시, 4히드록시-벤조일(4-hydroxy-benzoyl), 벤조일(benzoyl), 6Cl-벤질옥시카보닐(6Cl-benzyloxycarbonyl(6Cl-Z)), 및 또는 플루오레닐메틸옥시카보닐(fluorenylmethyloxycarbonyl)(Fmoc) 기를 가지는 그 외 덜 효과적인 DPTs의 유도체(DTP의 세포적 흡수가 향상되게 제조한 것)를 처리한 후의 다발성 골수종 세포주의 생존율은 나타내지 않았다; (C) 비록 Z-LTP의 인비트로(in vitro) 효력 및 세포적 흡수는 Z-DTP와 비교할만 하지만, Z-LTP2는 생물학적 유체에서의 낮은 안정성 때문에, 다발성 골수종 세포에 낮은 활성을 보였다(도 4참조).
도 8은 구성성분 NK-κβ 활성과 함께 Z-DTP의 전-세포사멸 활성(proapoptotic activity)이 종양세포주에 대해 선택적이라는 것을 나타낸 도이다(A, B, C); [3H]티미딘 인코포레이션 어세이를 도 7에 나타낸 방법으로 수행하였고, 10μM Z-DTPs 또는 Z-DNC로 하기의 시간 동안 처리한 후에 종양세포주의 패널에서의 세포 생존율을 보여준다: 144 시간(A); 24시간, 72시간 또는 144시간(B,C); (A) 9개의 다발성 골수종 세포주 중의 8개에서의, 2개의 미만성 대형 B-세포 림프종(diffuse large B-cell Lymphoma)(DLBCL; LY3) 세포주 중의 1개에서의, 1개의 전-단핵구성 백혈병 세포주(U937) 중의 1개에서의, 및 6개의 버킷 림프종 세포주(BJAB) 중의 1개에서의 Z-DTP2의 강력한 종양세포사멸 활성을 보여준다(도 9참조); Z-DTP2는 활성화된 B-세포(ABC)-유사 서브타입(즉 LY3)의 DLBCL 세포주에서만 세포독성 활성을 보였고, 배중심(germinal center) B-세포(GCB)-유사 서브타입(즉 SUDHL6)의 DLBCL 세포주에서는 활성을 보이지 않았는데, 이것은 구성성분 NK-κβ 활성의 특징을 이루지 않는다(Ngo Vn, et al. Nature 441(7089):106-10; 또한 도 12의 Gadd45β 발현 수준 참고); 이것들은 또한 다발성 골수종 세포주에서 활성을 보였고, 실제적으로 이것들 모두는 구성성분 NK-κβ 활성의 특징을 이룬다; 10μM의 Z-DTP1, Z-DTP2 및 Z-DNC의 표시된 시간 동안(즉 24, 72 또는 144시간)의 처리 후의 다발성 골수종 및 DLBCL 세포주에서의 Z-DTP2(B), Z-DTP1(C)의 종양사멸 활성을 나타내었다; 결과는 트리판 블루 배제법(trypan blue exclusion assay) 및 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide(PI))법을 이용하여 확정하였다(도 10 참조; 결과는 나타내지 않음).
도 9는 [3H]티미딘 인코포레이션 어세이(thymidine incoporation assay)를 이용하여, 매우 높은 농도인 100μM에서도 Z-DTP2를 144시간 동안 처리한 후의 22개의 내성 종양 세포주에서의 Z-DTP2 세포독성의 부존재를 나타낸 도이다; Z-DNC는 Z-보호 D- 음성 대조군이다; 민감한 세포주 BJAB(버킷 림프종), KMS-11, 및 KMS-12(다발성 골수종)도 나타냈다; 이 세포주에서 Z-DTP2-유도 사멸에 대한 민감성 및 내인성 Gadd45β 발현의 수준 사이에 강한 연관관계가 있었다(도 12A 및 12B 참조).
도 10은 다발성 골수종 세포주에서의 Z-DTP2 유도 사멸은 세포사멸에 의한다는 것을 나타낸 도이다; 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide(PI)) 핵 염색법은 10μM의 Z-DTP2 또는 Z-DNC1을 72시간 또는 144시간 동안 처리한 후의 대표적인 다발성 골수종 세포주인 NCI-H929, KMS-11, ARH-77, JJN-3 및 U266에서의 세포사멸 유도(즉 서브 G1 DNA; FL2-A 참고)를 보여준다; 또한 같은 조건에서 배양된 처리되지 않은 세포의 DNA 양을 나타냈다; 세포사멸 퍼센트는 막대그래프로 나타냈다.
도 11은 다발성 골수종 세포주에서 Z-DTP2의 처리가 강한 JNK 활성을 일으키는 것을 나타낸 도이다; KMS11 및 NCI-H929 세포를 10μM의 Z-DTP2 또는 Z-DNC로 처리한 결과를 나타내고, JNK 활성은 표시된 시간에 항-포스포(P)-JNK-특이 항체(anti-phospho(P)-JNK-specific antibody)를 이용하여 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다; 증가된 JNK 인산화(JNK 활성의 마커)는 Z-DTP2로 처리했을 때만 나타났고, Z-보호 음성대조군 펩타이드(Z-DNC)로 처리했을 때는 나타나지 않았다; TNFα 자극(2,000U/ml)는 JNK 활성의 양성대조군으로 이용되었다; Z-DTP2의 비슷한 효과가 MKK7 활성에도 나타났다(결과는 나타내지 않음); 또한, Gadd45β의 생물학적 활성에서도 나타났듯이(De Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-313; Papa, S et al,, (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153;Papa, et al. 2007 J. Biol. Chem. 282:19029-19041;Papa, et al. (2008) J. Clin. Invest. 118:191-1923), 다발성 골수종세포주에서의 Z-DTP의 효과는 MKK7/JNK 경로에 특이적이고, 이 세포주에서의 IKK/NF-κβ, ERK 및 P38 경로에서의 활성에 대한 화합물의 효과는 관찰되지 않았다(결과는 나타내지 않음).
도 12는 Gadd45β 발현 수준 및 Z-DTP 유도 사멸에 대한 세포 민감성 사이의 종양세포주에서의 강한 상관관계를 나타낸 도이다; (A) 위쪽의 패널은 29개의 암 세포주 패널에서의 Gadd45β의 발현을 나타내고(qRT-PCR; 붉은색 막대기); 반면에 아래쪽 패널은 10μM의 Z-DTP2를 144시간 동안 처리한 후의 같은 세포주에서의 세포사멸 퍼센트를 나타낸다([3H]티미딘 인코포레이션; 검은색 막대기); (B) Gadd45β 대 (A)에서와 똑같은 방법으로 실험된 Z-DTP2 처리 후의 세포 생존율의 퍼센트의 상관관계 구성(correlation plot)을 나타낸다; 2가지 파라미터 영역 사이의 상관관계 계수의 유의성은 아주 높다(p<0.01)(GraphPad 소프트웨어를 이용하여 계산된 두 가지 변수간의 관계를 정량화한 피어슨 상관관계(Pearson correlation)); 이러한 결과는 세포에서의 Z-DTP의 높은 타겟 특이성을 확인시켜 준다; (A)(위쪽 패널)의 값은 β-액틴으로 정상화되었다.
도 13은 본 발명에서 개시된 관련된 화합물들의 화학적 구조 및 가능한 약물분자 구조의 묘사 및 이들의 평가를 위한 전략을 나타낸 도이다; (A) 본 발명 화합물 Z-DTP2(Z-D-Tyr-D-Glu-D-Arg-D-Phe-NH2)(서열번호 1) 및 Z-DTP2 유도체, mDTP1(p-hydroxy-benzoic acid D-Glu-D-Arg-phenetylamine), mDTP2(Ac-D-Tyr-D-Glu-D-Phe-NH2), 및 mDTP3(Ac-D-Tyr-D-Arg-Phe-NH2)의 화학적 구조를 나타낸다; 이러한 변형된 Z-DTP2 화합물(이하, mDTPs라 한다)은 인비트로(in vitro)(ELISA) 및 세포 내(사멸 어세이)에서 활성을 평가하였다; 인비트로 및 세포 내에서의 분자량(MW), IC50 값 및 Z-DPT2 및 변형된 대표 화합물의 리간드 효율을 나타내었다(표 5참조); (B) 생물활성 화합물의 가능한 약물분자구조를 동정하기 위한 전략의 주요 단계를 나타낸 도이다(Geeson MP. 2008 J Med Chem. 51:817-834); 대부분의 제안된 변화는 이미 밝혀졌다: N-말단기(N-terminal groups)(표 3참조); Tyr에서 사이클로헥실알라닌(cyclohexylalanin), Phe에서 사이클로헥실알라닌(cyclohexylalanine), 내부 Glu 및/또는 Arg의 제거, Glu에서 Asp, Asp 곁사슬에 있는 에스터 전구약물(ester prodrug)로의 치환(표 5참조); Tyr에서 Phe로의 치환, Arg 에서 His, Lys 또는 Pro로의 치환(표 6참조); 이와 함께, 데이타는 생물활성 약물분자구조가 다음과 같이 기재될 수 있음을 보여준다: Y1 위치에 요구되는 수소결합 공여/수용체와 함께 티로신 또는 방향족 고리; Y2 및/또는 Y3 위치에 요구되는 적어도 하나의 알파 아미노산, 바람직하게는 세포 흡수를 촉진시키는 기본 작용기를 포함할 수 있다; Y3 위치에서의 아르기닌(arginine)과 함께 또는 없이, Y2 위치에서의 프롤린(proline), 아스파라긴(asparagine) 또는 루신(leucine)은 생물활성을 유지할 수 있게 한다; 두 개의 방향족 고리사이 거리가 7 암스트롬(Angstrom)보다 큰 것은(즉, 하나의 알파 아미노산에 의해 부과된 것보다 큰 거리) 생물활성의 감소를 일으킨다; 생물활성의 보유를 위해서, 수소결합 공여/수용기와 함께 또는 없이, 방향족 고리는 Y4 위치에서 필요하다(표 6참조).
도 14 (A, B, C, D, E)은 5명의 환자에서 분리된 원발성 다발성 골수종세포에서의 Z-DTP의 세포독성 활성을 나타낸 도이다; 각각의 패널은 서로 다른 환자로부터 분리된 세포로부터 얻어진 결과를 나타낸다-즉 환자 1(A), 환자 2(B), 환자 3(C), 환자 4(D), 환자 5(E); (A, B, C, D, E) Z-DTP2, Z-DTP1 및 Z-DNC를 48시간 동안 표시된 농도로 처리하였다; 각 환자로부터 분리된 처리되지 않은 세포도 나타내었다(-); 어세이는 트리판 블루 배제법 및 세포 계산(cell counting); 값은 처리되지 않은 대조군 세포의 생존율에 대하여, Z-DTP2, Z-DTP1 또는 Z-DNC로 처리된 후에 관찰된 생존 세포의 퍼센트로 나타내었다.
도 15는 골수 기질세포(BMSCs)를 포함한 다발성 골수종-제거 개체로부터 분리된 원발성 변환되지 않은 세포(A), 말초혈 단핵세포(PBMNCs)(A), 및 마우스로부터 분리된 중간엽 줄기세포(MSCs)(B), 정제된 원발성 B- 및 T-림프구(B)에서의 Z-DTP의 세포독성 활성이 부존재함을 나타낸 도이다; Z-DTP2, Z-DTP1, 및 Z-DNC를 표시된 농도로 48시간(BMSCs, PBMNCs)(A), 72시간(마우스 B 및 T 세포)(B), 또는 144시간(MSCs)(B) 동안 처리하였다; 어세이는 트리판 블루 배제법 및 세포 계산(A) 또는 [3H]티미딘 인코포레이션(B)을 이용하여 수행하였다.
도 16은 Gadd45β 발현의 sh-RNA-매개 침묵(silencing) 후에 대표적인 다발성 골수종 세포에서 세포 사멸의 유도를 나타낸 도이다; (A, B, C)Z-DTP-민감성 다발성 골수종 세포주 ARH-77 (A) 및 NCI-H929(B) 및 Z-DTP-내성 다발성 골수종 세포주, RPMI-8226(C)를 렌티바이러스-발현 Gadd45β-특이적 sh-RNAs(즉, sh-Gadd45β-1, sh-Gadd45β-2, 또는 sh-Gadd45β-3), MKK7-특이적 sh-RNAs(즉, sh-MKK7-1, 또는 sh-MKK7-2), 또는 비특이적 sh-RNAs(즉, sh-NS-1 또는 sh-NS-2)로 감염시켰고, 유세포분석기-증가된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 발현하는 세포가 감염된 세포임을 나타낸다-및 세포 계산법을 이용하여 8일 이상동안 감염된 세포의 생존율을 측정하였다; 0일째에 똑같이 배양된 eGFP+ 다발성 골수종 세포의 생존율에 대하여 표시된 시간에서의 eGFP+(즉 감염된 것) 다발성 골수종 세포의 생존율의 퍼센터로 나타냈다; (A, B, C) 표준 방법(Yang H et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Jul 5;103(27):10397-402)을 이용하여, 세포를 eGFP 뿐만 아니라 표시된 sh-RNA를 발현하는 pLentiLox. 3.7 렌티바이러스로 감염시켰다; 5일 후에, eGFP+ 세포를 BD FACS AriaTM 세포 분류기를 이용하여 분류하였고, 세포 생존율의 분석을 시작하기 전에, 2일 동안 방치하였다; 이 시점(생존율 분석이 시작하는 시점)은 그래프 상에 day 0으로 표시하였다; 데이타는 Gadd45β 발현의 억제가 Z-DTP 유도 독성(즉 ARH-77, NCI-H929 세포 주)(A, B)에 민감한 다발성 골수종 세포주에서 빠르게 세포 사멸을 일으킨다는 것을 나타내고, 이 독성에 내성을 가지는 RPMI-8226 다발성 골수종 세포주에서는 나타나지 않았다; 이러한 데이타는 다발성 골수종 세포주에서의 Gadd45β/MKK7에 대한 Z-DTP의 타켓 특이성을 더 설명해준다; 또한 이러한 결과는 다발성 골수종 세포의 생존율에 대한 Gadd45β의 핵심적인 역할을 증명하고, 다발성 골수종에서 Gadd45β가 치료적 타겟임을 입증해준다.
도 17(A, B)은 MKK7의 sh-RNA-매개 침묵(silencing)이 아닌 Gadd45β의 sh-RNA-매개 침묵(silencing)이 Z-DTPs-유도 사멸(즉, ARH-77 및 NCI-H929 세포주; 도 7A, 7B, 7C 및 8 참조, Z-DTP-유도 사멸에 대한 민감성)에 감수성이 있는 다발성 골수종 세포주에서 강력한 종양사멸 활성을 가진다는 것을 보여주는 [3H]티미딘 인코로레이션 어세이를 나타낸 도이다; Z-DTP-내성 다발성 골수종 세포주, RPMI-8226의 생존율은 대신에 sh-RNA-매개 Gadd45β 억제에 의해 영향을 받지 않는다; (A) Gadd45β 또는 MKK7의 침묵(silencing) 후에, 대표적인 다발성 골수종 세포주, RPMI-8226, NCI-H929 및 ARH-77의 생존율을 나타낸다; (B) 서로 다른 3개의 Gadd45β-특이적 sh-RNAs(즉 sh-Gadd45β-1, sh-Gadd45β-2 또는 Gadd45β-3), 서로 다른 2개의 MKK7-특이적 sh-RNAs(즉 sh-MKK-1 또는 sh-MKK7-2), 및 서로 다른 2개의 비특이적 sh-RNAs(즉 sh-NS-1 또는 sh-NS-2)를 이용하여, Gadd45β 또는 MKK7의 침묵 후에, 다발성 골수종 세포주의 생존율을 나타낸다; (A, B)다발성 골수종 세포주는 표시된 sh-RNA-발현 pLentiLox 3.7 렌티바이러스로 감염시켰고, 도 16에서와 같이 BD FACSAriaTM Ⅱ 세포 분류기를 이용하여 eGFP+ 다발성 골수종 세포(즉 렌티바이러스에 감염된 세포)를 분류하였다; [3H]티미딘 인코포레이션 어세이를 도 16의 8일째에 대응되는, 세포 분류 10일 후에 수행하였다; 0일째(세포 분류 2일 후)에 세포에서 일어난 [3H]티미딘 인코포레이션에 대하여, 8일째(세포 분류 10일 후)에 똑같은 세포의 증식의 측정을 [3H]티미딘 인코포레이션의 퍼센트로 나타내었다; 이러한 결과는 다발성 골수종 세포(도 7, 8, 9 및 12 참조, Z-DTP-유도 사멸 및 Gadd45β 발현; 도 16, Gadd45β 및 MKK7 유전자 침묵)에서의 Gadd45β/MKK7 복합체에 대한 Z-DTP의 타겟 특이성을 설명하고, 다발성 골수종 세포의 생존율에서 Gadd45β의 필수적인 역할을 확인시켜 준다; 이와 함께, 이것은 다발성 골수종에서 Gadd45β가 치료적 타겟임을 입증해준다.
도 18(A, B, C)는 Z-DTP-내성 다발성 골수종 세포주, RPMI-8226(C)가 아닌, Z-DTP-민감성 다발성 골수종 세포주, ARH-77(A) 및 NCi-H929(B)에서 Gadd45β의 sh-RNA-매개 침묵(silencing)이 세포사멸을 유도한다는 것을 PI 핵 염색법(PI nuclear staining assay)로 측정한 것이다(도 16, 17 참조, sh-RNA-매개 침묵; 도 7, 8 및 12, Z-DTP-유도 사멸 및 Gadd45β발현에 민감한 다발성 골수종 세포주); (A, B, C) 렌티바이스 감염이 없거나(비감염), MKK7-특이적 sh-RNAs(즉, sh-MKK7-1, 및 sh-MKK7-2) 또는 비특이적 sh-RNAs(즉 sh-NS-1 및 sh-NS-2)의 발현 후에, 똑같은 다발성 골수종 세포주에서 유의적인 세포 사멸의 유도가 관찰되지 않았다; 다발성 골수종 세포주는 sh-RNA-발현 pLentiLox.3.7 렌티바이러스에 의해 감염되었고, 도 16에서와 같이 BD FACSAriaTM Ⅱ 세포 분류기를 이용하여 eGFP+ 다발성 골수종 세포(렌티바이러스에 감염된 세포)를 분류하였다; PI 핵 염색법은 도 16에서의 8일째에 대응하는 세포 분류 10일 후에 수행하였다; 사멸된 세포(즉 sub-G1 DNA 함량을 나타내는 세포)는 히스토그램으로 표시하였다; (A) 서로 다른 Gadd45β-특이-sh-RNAs(즉 sh-Gadd45β-1, sh-Gadd45β-2 및 Gadd45β-3)에 의해 유도된 세포사멸의 수준은 각각의 Gadd45β-특이적 sh-RNAs에 의해 유도된 Gadd45β 하향조절의 수준과 상관관계가 있다(결과는 나타내지 않음); (A, B, C) 이러한 결과는 다발성 골수종 세포에서 Gadd45β/MKK7 복합체에 대한 Z-DTPs의 타겟 특이성을 설명해주고(도 7, 8, 및 9 참조, Z-DTPs를 이용한 사멸어세이; 도 12, Z-DTP-유도 사멸에 민감한 암 세포 및 Gadd45β 사이의 통계적으로 유의적인 상관관계; 도 16, 17, MKK7에 의한 것이 아닌, Gadd45β의 하향조절에 의한 다발성 골수종 세포 사멸의 유도), 다발성 골수종 세포의 생존율에서 Gadd45β의 필수적인 역할을 확인시켜 준다; 이와 함께, 이것은 다발성 골수종에서 Gadd45β가 치료적 타겟임을 입증해준다.
도 19A, B, C는 다발성 골수종 세포주에서 MKK7 또는 Gadd45β의 sh-RNA-매개 침묵이 세포-주기 분배에 영향을 미치지 않는다는 것을 PI 핵 염색법을 통하여나타낸 도이다; 대표적인 렌티바이러스 감염 다발성 골수종 세포주, ARH-77(A), NCI-H929(B), 및 RPMI-8226(C)는 도 18에서 나타낸 똑같은 실험으로부터 얻어졌다; 도 18에서 나타낸 데이타와 다른 것은(도 18에서 PI 염색 프로파일(profile)은 대수 계산자(logarithmic scale)로 나타내었고, 세포사멸을 강조표시하였다), PI 염색(즉 FL2-A)은 직선 계산자(linear scale)로 나타내었고, 세포 주기 분배를 강조표시 하였다; 서로 다른 세포 주기의 기(즉, G1, S 및 G2/M)에서의 다발성 골수종 세포의 퍼센트는 히스토그램(histograms)으로 표시하였다; (A, B) 세포 주기 분석은 ARH-77(A) 및 NCI-H929(B) 다발성 골수종 세포주에서의 Gadd45β-특이적 sh-RNAs와 함께 수행하지 않았는데, 이것은 이러한 세포들에서의 대량 세포사멸 유도 때문이다(도 18A 및 18B 참조).
도 20A, B, C는 MKK7의 sh-RNA-매개 침묵이 Z-/mDTP-유도 사멸에 내성을 가지는 대표적인 Z-DTP 민감성 세포주, ARH-77을 제시한 것을 나타낸 도이다; [3H]티미딘 인코포레이션 어세이는 MKK7-특이적(sh-MKK7) 또는 비특이적 sh-RNAs(sh-NS)를 발현하는 ARH-77 다발성 골수종 세포에서 D-이성질체 음성 대조군 테트라펩타이드(Z-DNC)(A, B, C), Z-DTP1 (A), Z-DTP2(B) 또는 mDTP3(C)의 IC50 값을 나타낸다; ARH-77세포를 Z_DNC, Z-DTP1, Z-DTP2 또는 mDTP3으로 3일 동안 처리하였다; sh-NS-발현 ARH-77 세포는 Z-/mDTP 유도 사멸에 매우 높은 민감성을 나타냈고, 1.4μM(Z-DTP1;A), 302nM(Z-DTP2;B) 및 303nM(mDTP3;C)의 IC50 값을 나타냈고, 이것은 감염되지 않은 모체(parental) ARH-77세포에서 나타나는 것과 유사하다(표 4참조); (A, B, C)이와 반대로, sh-MKK7 발현 ARH-77 세포는 Z-/mDTP-유도 사멸에 완전하게 내성을 획득하였고, IC50 값은 >10μM이었으며, 이것은 Z-DNC-처리 ARH-77 세포에서 보이는 것과 유사하였다; IC50값은 실시예에 기재된 데로 계산되었고, 0.01 내지 10μM의 범위로 Z-DNC(A, B, C), Z-DTP1(A), Z-DTP2(B) 및 mDTP3(C)의 증가하는 농도로 계산되었다; 처치되지 않은 세포에서 얻어진 c.p.m 값에 대하여 펩타이드 처치된 세포로부터 얻어진 분당 카운트(counts per minute(c.p.m))의 퍼센트로 세포 증식을 측정하여 그래프에 나타내었다; U266, KMS-11, 및 KMS-12 세포주를 포함한 부가적인 Z-/mDTP-민감성 다발성 골수종 세포주에서 비슷한 결과를 얻었다(결과는 나타내지 않음); (A, B, C) 이러한 데이타는 다발성 골수종 세포에서 Gadd45β/MKK7 복합체에 대한 Z-/mDTPs의 매우 높은 타겟 특이성을 증명한다(도 12, Gadd45β 발현 민 Z-DTP-유도 사멸에 민감한 암세포 사이의 상관관계).
도 21A, B, C, D는 본 발명의 화합물이 독립된 Gadd45β 또는 MKK7과 결합하지 않음을 나타낸 도이다; 바이아코어 어세이(biacore assay)에서 결정된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 Gadd45β/MKK7 복합체의 형성과 결합하는 것이 요구된다; (A) 칩(chip)에 고정화된 MKK7(MKK7KD)의 카이나제 영역(kinase domain)에의 Gadd45β의 결합을 보여준다; 서로 다른 농도의 Gadd45β(20 내지 200nM의 범위)를 앞서서 MKK7KD가 고정화된 칩에 주입하였다; MKK7KD에의 Gadd45β의 용량 의존적 결합 및 Gadd45β/MKK7KD 복합체의 해리곡선(dissociastion curve)를 기록하였고, 평형 해리 상수(KD) 값 4.0±0.7nM은 각각의 곡선의 동태 파라미터(kinetic parameter)에 의해 결정된 값을 평균화하여 결정하였다; 요약하면, 터모디나믹(termodinamic) 평형 해리 상수(KD)는 각각 SRP 신호(반응 단위로 표현됨, RU)의 증가 또는 감소에 대응되는 결합(association)(Ka) 및 해리(dissociation) 상(Kd)을 고려하여 결정되었다; (B) Gadd45β가 칩에 고정화되었을 때, MKK7KD는 Gadd45β에 결합한다; 여기에서 KD 값은 MKK7KD를 고정화된 Gadd45β의 칩에 서로 다른 농도(1 내지 25nM의 범위)로 주압하였을 때 결정하였다; (A)에서와 같이, 용량-의존적인 곡선은 MKK7KD의 모든 시험된 농도에서 기록되었다; 이러한 분석의 결과로, 3.4±0.6nM의 값을 얻을 수 있었고, 이것은 (A)에서 얻어진 KD 값과 매우 유사하다; (C) mDTP3의 Gadd45β 또는 MKK7KD가 포함된 칩에의 주입을 나타낸다; mDTP3가 Gadd45β 및/또는 MKK7KD와 결합하는지 결정하기 위해, 1nM 및 10μM의 범위의 mDTP3를 함유하는 용액을 하나 또는 그 외 단백질로 유도화된 칩에 주입하였다; 도면에서 알 수 있듯이, 매우 높은 농도의 mDTP3(즉 10μM)에서도 mDTP3는 Gadd45β 또는 MKK7에 결합되는 것이 기록되지 않았다; (D) 수행된 Gadd45β/MKK7 복합체에의 mDTP3의 결합을 나타낸 도이다; 100nM 농도의 Gadd45β를 MKK7KD(60μL; 3분 간의 접촉시간)로 유도화된 칩에 주입하였다; Gadd45β 단백질은 약 10분 동안 해리되었고, Gadd45β의 약 50%가 여전히 MKK7KD와 결합되어 있을 때, mDTP3는 10nM, 100nM 또는 1μM의 농도로 주입되었다; 여기에서 알 수 있듯이, Gadd45β/MKK7KD 복합체 형성은 mDTP3가 세척되고 난 후에, 빠르게 회복되었다; 그러나, 높은 농도(예를 들면, 1μM)에서, mDTP3가 용량-의존적 결합곡선 및 해리곡선을 제공하였고, 이것은 mDTP3가 Gadd45β 및/또는 MKK7KD 또는 이들 단백질의 복합체에 결합한다는 것을 나타낸다; 이러한 결과는 DTP가 이들 단백질이 서로 접촉된 상태로 있을 때, 하나 및/또는 그 외 단백질 또는 두 단백질의 결합체와 결합하며, 독립된 상태로 Gadd45β 또는 MKK7 단백질에 결합하지 않는다는 점을 지지한다.
본 발명의 개요
화학식 I의 화합물을 제공하는 본 발명의 첫 번째 측면에 있어서:
I: X1-A-X2
상기에서,
A는 A'''',
또는 A''-[M-A'-]nM-A'''이고;
A''''는 A'',
A''',
또는 Z1-Y2-Y3-Z4이고, 상기에서 Y2-Y3는 올리고펩토이드 부위(moiety) 또는 잔기 Y2-Y3을 포함하는 올리고펩토이드(oligopeptoid) 부위이고 Z1은 Y2-Y3의 N-말단 질소에 부착되고(attached) Z4는 Y2-Y3의 C-말단 탄소에 부착되고;
A''는 A',
또는 Y1-Y2-Y3-Z4이고, 상기에서 Y1-Y2-Y3는 올리고펩토이드 부위 또는 잔기 Y1-Y2-Y3를 포함하는 올리고펩토이드 부위이고 Z4는 Y1-Y2-Y3의 C-말단 탄소에 부착되고;
A'''는 A',
또는 Z1-Y2-Y3-Y4이고, 상기에서 Y2-Y3-Y4는 올리고펩토이드 부위 또는 잔기 Y2-Y3-Y4를 포함하는 올리고펩토이드 부위이고 Z1은 Y2-Y3-Y4의 N-말단 질소에 부착되고;
A'의 각각의 존재(occurrence)는 독립하여 올리고펩타이드(oligopeptide) 부위 또는 잔기 Y1-Y2-Y3-Y4를 포함하는 올리고펩토이드 부위이고;
n은 0 내지 18의 정수이고;
Υ1 및 Y4는 독립하여 아미노산 잔기 또는 방향족 잔기를 포함하는 아미노산 유도체의 잔기이고;
Y2는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체의 잔기거나 없으며;
Y3는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체의 잔기거나 없으며;
Z1은 하기 화학식 (II)의 군(group):
Figure pct00001
Z1은 Y2의 N-말단 질소에 연결되고,
W는 없거나, 또는 산소, 또는 질소, 또는 C1 내지 C3의 알킨기(alkylene group)이고,
상기 C1 내지 C3의 알킨기는 C1 내지 C4의 알킬기, 또는 5 내지 10 원자의 탄소환기(carbocyclic) 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방향족 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;
J는 5 내지 10 원자의 탄소환기 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방향족 이고, 상기 방향족은 수산화기, 할로겐, C1 내지 C4의 알킬기, 또는 C1 내지 C4의 알콕시기 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;
Z4 는 하기 화학식 (III)의 군:
Figure pct00002
Z4는 Y3의 C-말단 탄소에 연결되고,
R은 수소 또는 C1 내지 C4의 알킬기이고;
W'는 없거나 C1 내지 C3의 알킨기이고,
상기 C1 내지 C3의 알킨기는 C1 내지 C4의 알킬기, 또는 5 내지 10 원자의 탄소환기 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방항족 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;
J'는 3 내지 10 원자의 지방족 카르복실산기 또는 5 내지 10 원자의 탄소환기 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방향족이고,
상기 지방족 카르복실산기 또는 방향족은 수산화기, 할로겐, C1 내지 C4의 알킬기, 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;
M은 선행(preceding) 올리고펩타이드 또는 올리고펩토이드 부위(Α',Α'' or A''')와 후행(following) 올리고펩타이드 또는 올리고펩토이드 부위(Α',Α'' or A''') 사이의 펩타이드 결합 또는 선행 올리고펩타이드 또는 올리고펩토이 부위(A', A'' 또는 A''')의 말단 카르복실기에 아마이드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 또는 황화에스테르 결합을 통해 연결된 링커(linker) 부위 및 후행 올리고펩타이드 부위(Α', A" or A'") 말단 아미노 그룹에 아마이드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 또는 황화에스테르 결합을 통해 연결된 링커 부위이고;
X1은 없거나, 또는 A의 아미노 말단에 첨가된 부위에 의해 자유 아미노기를 차단하고 ;
X2는 없거나 또는 A의 카르복실 말단에 첨가된 부위에 의해 자유 카르복실기를 차단하고 ;
조건부로 A가 Z1을 포함하면 X1은 없고 A가 Z4 를 포함하면 X2가 없고;
또는 이들의 유도체, 상기 유도체는 하기에 구성되는 군으로부터 선택되며:
a) 화학식 I의 화합물의 분자 올리고머 또는 다중체(multimers), 상기 올리고머 또는 다중체는 화학식 I의 화합물의 둘 또는 그 이상의 분자 를 포함하고 각각은 화학식 I의 화합물의 분자 내 존재하는 아미노기 또는 카복실산기와 스캐폴드 부위의 반대의 아미노기 또는 카르복실산 사이에 형성되는 아마이드 결합을 통해 공통의 스캐폴드 부위에 연결 되고 상기 스캐폴드 부위은 적어도 2 아마이드 결합을 이루고,
b) 화학식 I의 화합물의 분자를 포함하는 유도체 또는 아마이드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 황화에테르 결합을 통해 이하와 컨 쥬게이트된 상기 파트 a)에서 정의된 올리고머 또는 다중체:
PEG,
PEG에 기반한 화합물들,
세포-투과 펩타이드,
형광성 염료들,
비오틴 or 기타 태그(tag) 부위
지방산들,
별개 크기의 나노입자들
또는 금속성 또는 방사성 이온들과 복합체를 이루는
킬레이트 리간드.
c) 화학식 I의 화합물의 분자를 포함하는 유도체 또는 아미드화, 글 리코실화, 카르바밀화, 아실화, 황산화, 인산화, 고리화, 지질화, 페 길레이션에 의해 변형된 상기 파트 a)에서 정의된 올리고머 또는 다합 체 또는 펩타이드에 연결 또는 융합 펩타이드 또는 융합 펩티오 드(peptiod)를 형성하기 위하여 펩타이드 융합 파트너에 연결.
및
d) 화학식 I의 화합물의 분자의 유도체의 염 및 용매화합물 또는 상기 파트 a) 또는 b)에서 정의된 이들의 유도체의 염 및 용매 화합물.
본 발명의 두 번째 측면에 있어서, 본 발명의 첫 번째 측면에 있어서 화합물 또는 약학적으로 허용하는 운반체를 포함하는 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 세 번째 측면에 있어서, 본 발명의 두 번째 측면의 약학적 조성물을 그것이 필요한 개체 또는 본 발명의 첫 번째 측면에 있어서 화합물의 약학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 NF-kB 활성 및/또는 발현의 증가 및/또는 Gadd45β 활성 및/또는 발현의 증가로 규정되는 질병 또는 질환의 치료 방법으로 제공될 수 있다.
본 발명의 네 번째 측면에 있어서, 약제로 사용되기 위한 본 발명의 두 번째 측면에 있어서 조성물 또는 본 발명의 첫 번째 측면에 있어서 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 다섯 번째 측면에 있어서, NF-kB 활성 및/또는 발현의 증가 및/또는 Gadd45β 활성 및/또는 발현의 증가로 규정되는 질병 또는 질환을 치료하는 치료제의 제조를 위해서 본 발명의 두 번째 측면에 있어서 약학적 조성물 또는 본 발명의 첫 번째 측면에 있어서 화합물의 사용하는 방법으로 제공될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어의 정의
본 발명의 명세서의 많은 부분에서, 화합물은 LTP, DTP, LNC, DTP1 등과 같은 중요 코드로 기재되었다. "NC"를 포함하는 코드는 본 발명의 범위에 포함되지 않는 음성 대조군 화합물을 의미한다. "TP"를 포함하는 코드(비록 이것은 디-펩타이드/펩토이드 모티프(di-peptide/peptoid motifs)에 기초한 일부 화합물로 표시되어야 하지만, 이것은 테트라 또는 트리-펩타이드/펩토이드(tetra or tri-peptide/peptoids)의 약자이다)는 본 발명의 범위에 포함되는 것이다. 앞에 붙여진 "L" 또는 "D" 는 L 또는 D 광학 입체배치(optical configuration)에서의 잔기(residue)를 의미한다. 뒤에 붙여진 숫자는 다른 곳에서 자세하게 기술된 특정 번호가 붙여진 화합물을 의미한다. "Z-DTP"에서와 같이 앞에 붙여진 "Z"는 벤질옥실카보닐 N-말단기(benzyloxycarbonyl N-terminal group)을 의미한다. "mDTP"에서와 같이 앞에 붙여진 "m"은 N 및/또는 C 말단의 제거(예를 들면 mDTP1), mDTP2 및 mDTP3에서와 같이 각각 Z 기 및 Arg의 제거 또는 Z-DTP2에서의 Glu 잔기의 제거 와 같이, 세포 흡수, 세포 활성, 및/또는 약동학 프로파일(PK profile)을 촉진시킬 목적의 DTP의 어떠한 변형을 의미한다(도 13에 더 많은 실시예가 제공된다).
본 발명의 상세한 설명
본 발명에서 강조되는 전략은 NF-κβ- JNK 혼선(crosstalk)이 암세포를 포함한 세포의 생존 대(versus) 세포사멸을 통제한다는 이해에서 기인한 것이다. 유의적으로 Gadd45β는 NF-κβ 활성에 반응하여 상향 조절되고, 높은 수준으로 다발성 골수종 세포 및, 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 방광암, 뇌암, 중추신경계암, 유방암, 두경부암(head and neck cancer), 폐암, 및 전립선암을 포함하는 일부 고형암 뿐만 아니라 미만성 대형 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 전단핵구성 백혈병 및 그 외 백혈병을 포함하는 그 외 종양에서 필수구성 성분으로 발현된다. 본 발명은 세포에서 JNK 세포독성 신호를 증가시켜 NF-κβ-JNK 혼선(crosstalk)을 억제하는 Gadd45β/MKK7-타겟팅 화합물을 전달함으로써 세포사멸을 촉진하는 전략에 기초를 두고 있다.
본 발명의 물질 및 방법은 바람직하게는 Gadd45β의 비정상적인 상향-조절에 의해 특징되어 지는 질환의 치료에 적절할 수 있다. 또한 본 발명의 물질 및 방법은 NF-κβ가 비정상적으로 상향-조절되거나 활성화되는 질환 및 장애뿐만 아니라, Gadd45β가 비정상적으로 상향-조절되는 질환 및 장애, 및 Gaddβ-MKK7 신호를 통한 세포사멸의 유도제가 치료방법으로 제공될 수 있는 질환 및 장애의 치료에 적절할 수 있다.
NF-κβ의 비정상적인 상향 조절 또는 활성을 특징되어 지는 이러한 질환 및 Gadd45β-MKK7 신호를 통한 세포사멸의 유도제가 치료방법으로 제공될 수 있는 질환의 예는: 혈액 악성암(haematological malignancies)(다발성 골수종, 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), MALT 림프종, 미만성 대형 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 홉킨스 림프종(Hodgkin's lymphoma), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 성인 T 세포 백혈병(adult T-cell leukaemia, HTLV-1), 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukaemia), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenic leukaemia) 및 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukaemia)을 포함) 및 고형 종양(유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 신장암(renal cancer), 폐암(lung cancer), 대장암(colon cancer), 간암(liver cancer), 식도암(oesophageal cancer), 위암(gastric cancer), 후두암(laryngeal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 방광암(bladder cancer), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreatic cancer) 및 다른 암을 포함), 그 외 암(예를 들면 흑색종(melanoma), 원주종(cylindroma), 편평상피암(squamous cell carcinoma)[피부, 두경부], 구강암(oral carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 성상세포종(astrocytoma), 및 교모세포종(glioblastoma)), 및 자가면역 질환, 만성 염증성 질환, 퇴행성, 질환, 허혈성 질환, 혈관 질환과 같은 그 외 질병 및 장애를 포함한다.
많은 질환 및 장애가 NF-κβ의 활성에 의존하고 있다. 게다가 실제적으로 알려진 모든 인간 질병 또는 장애는 염증에 의존하는 병인론을 가지고 그러므로 NF-κβ에 관련되어 있다. 이러한 작용은 염증 반응의 주요 스위치(master switch)로서, 사이토카인, 수용체, 전사인자, 케모카인, 전염증성 효소, 및 염증을 시작하고 유지할 수 있는 전-생존 인자(pro-survival factors)를 인코딩하는 200개 이상의 유전자 배열의 발현과 함께 일어난다. 본 발명의 화합물은 염증에 있어서의 NF-κβ의 별개의 전-생존 활성을 억제한다. 그러므로, 이 화합물들로 치료될 수 있는 질병 및 장애는 통상적인 만성 염증성 질환(예를 들면, 염증성 장 질환, 류마티스 관절염 및 건서)을 제외하고, 주요 염증성 구성성분에 의존하는 질환 및 장애를 포함한다. 이러한 질환의 예는 항염증성 제제 또는 NF-κβ 억제제로 치료될 수 있는 질환 또는, NF-κβ억제제로 치료하기 적합한 것으로 제안된 질환, 본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 질환이며, 이것은 :
1. 호흡기계: 기관지성(bronchial), 알러지성(allergic), 내재성(intrinsic), 외재성(extrinsic), 운동-유도(exercise-induced), 약물 유도(drug-induced)(아스피린 및 NASID-유도) 천식(asthma) 및, 간헐적인 또는 지속적인 및 모든 심각도, 및 기도 과-반응성의 그외 원인을 포함하는 먼지-유도 천식(dust-induced asthma)을 포함하는 기도 폐쇄성 질환(obstructive disease of the airways); 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD); 감염성 및 호산구성 기관지염(eosinophilic bronchitis); 폐기종(emphysema); 기관지확장증(bronchiectasis); 낭포성 섬유증(cysitic fibrosis); 유육종증(sarcoidosis); 농부폐(farmer's lung) 및 관련된 질환; 과민감성 폐렴(hypersensitivity pneumonitis); 원인불명의 섬유 폐포염(crpytogenic fibrosing alveolitis), 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonias), 항함요법 및 만성 감염에 의한 섬유증, 결핵(tuberculosis) 및 아스퍼질러스증(aspergillosis) 및 다른 진균 감염을 포함하는 만성 감염에 의한 섬유증 및 항암요법에 의한 섬유증을 포함하는 폐 섬유증; 폐 이식의 합병증; 폐 맥관 구조(lung vasculature)의 맥관성 및 혈전성 장애, 및 폐 고혈압(pulmonary hypertension); 기도의 염증성 및 분비성 상태와 연관된 만성 기침의 치료 및 의원성 기침(iatrogenic cough)을 포함하는 진해(antitussive) 활성; 약물성 비염(rhinitis medicamentosa), 혈관운동신경성 비염(vasomotor rhinitis)을 포함하는 급성 및 만성 비염; 신경성 비염(rhinitis nervosa)(건초열)을 포함하는 지속적인 또는 계절성 알러지성 비염; 비용(nasal polyposis); 통상적인 감기, 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus), 독감, 코로나바이러스(중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 포함) 또는 아데노바이러스를 포함하는 급성 바이러스 감염; 또는 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis);
2. 골격 및 관절: 원발성 및 속발성 골관절염(osteoarthritis/osteoarthrosis), 예를 들면 선천성 고관절 이형성(congenital hip dysplasia)와 연관된 또는 이를 포함하는 관절염; 경추 및 요추 척추염, 및 요통(low back pain) 및 경부통(neck pain); 골다공증(osteoporosis); 류마티스성 관절염 및 스틸병(Still's disease); 강직성 척추여(ankylosing spondylitis), 건성관절염(psoriatic arthritis), 반응성 관절염(reactive arthritis) 및 미분화 척추관절증을 포함하는 혈청반응음성의 척추관절증(seronegative spondyloarthropathies); 포트병(potts' disease) 및 폰셋 증후군(poncet's syndrome)을 포함하는 패혈성 관절염(septic arthritis) 및 그 외 감염-관련 관절 질병 및 결핵과 같은 골격질환; 요산염 통품(urate gout), 칼슘 파이로포스페이트 침착증(calcium pyrophosphate deposition disease), 칼슘 아파타이트(calcium apatite) 관련 건(tendon), 활액낭(bursal), 활액(synovial) 염증을 포함하는 급성 및 만성 크리스탈-유도 활막염(crysta-induced synovitis); 베체트병(Behcet's disease); 원발성 및 속발성 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome); 전신성 경화증(systemic sclerosis) 및 제한형 경피증(limited scleroderma); 전신성 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus), 혼합형 결합 조직 질병(mixed connective tissue disease) 및 미분화 결합 조직 질병(undifferentiated connective tissue disease); 피부근염(dermatomyositis) 및 다발성근염(polymyositis)를 포함하는 염증성 근질환(inflammatory myopathies); 류마티스성 다발성 근육통(polymalgia rheumatica); 어떠한 관절 부위의 특발성 염증성 관절염 및 이와 관련된 증후군, 및 류마티스성 열(rheumatic fever) 및 이의 전신적 합병증을 포함하는 소아관절염(juvenile arthritis); 대형 세포 혈관염(giant cell arteritis), 타카야수 혈관염(Takayasu's arteritis), 처그스트라우스 증후군(chrug-strauss syndrome), 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 현미경적 다발성 동맥염(microscopic polyarteritis), 및 바이러스 감염, 과민감성 반응, 크리오글로불린(cryoglobulins), 및 파라단백질(paraprotein)과 관련된 혈관염을 포함하는 혈관염; 요통(low back pain); 가족성 지중해열(familial midterranean fever), 머클-웰스 증후군(muckle-wells syndrome), 및 가족성 동면성열(familial hibernian fever), 키쿠치 병(Kikuchi disease); 약물 유도 관절통(drug-induced arthalgias), 건염(tendonititides) 및 근육병(myopathies);
3. 부상(예를 들면 스포츠 활동에 의한 부상) 또는 질병에 의한 통증 및 근골격 질환의 결합 조직 재배치; 관절염(예를 들면 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍 또는 크리스탈 관절염), 그 외 관절 질병(예를 들면 퇴행성 추간판 질환(intervertebral disc degeneration), 또는 퇴행성 턱관절 질환(temporomandibular joint degeneration)), 골 재형성 질환(bone remodelling disease)(예를 들면 골다공증, 파제트 병(Paget's disease) 또는 골괴사), 다발성 연골염(polychondritis), 경피증(scleroderma), 혼합형 결합 조직 장애(mixed connective tissue disorder), 척추관절병증(spondyloarthropathies) 또는 치주질환(periodontal disease)(예를 들면 치주염(periodontitis));
4. 피부: 건선(psoriasis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis) 또는 그 외 습진성 피부염(eczematous dermatoses), 및 지연형 과민반응(delayed-type hypersensitivity reactions); 파이토 및 광선 피부염(phyto- and photodermatitis); 지루성피부염(seborrhoeic dermatitis), 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis), 편평태선(lichen planus), 경화태선(lichen sclerosus et atrophica), 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 피부유육종(skin sarcoid), 원판상홍반성 루푸스(discoid lupus erythematousus), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 수포성표피박리증(dpedermolysis bullosa), 피부묘기증(utricaria), 혈관신경부종(angioedema), 혈관염, 중독성홍반(toxic erythema), 호산구성 피부혈관염(cutaneous eosinophilias), 원형탈모증(alopecia areata), 남성형 대머리(male-pattern baldness), 스위트증후군(sweet's syndrome), 웨버-크리스티안 증후군(weber-christian syndrome), 다형 홍반(erythema multiforme); 감염성 및 비 감염성 봉와직염(cellulitis); 피부림프종(cutaenous lymphoma), 비-흑색종 피부암(non-melanoma skin cancer) 및 그 외 이형성 병소(dysplastic lesions); 고정된 약진(fixed drug eruption)을 포함하는 약물 유도 질환;
5. 눈: 안검염(blepharitis); 지속적인 또는 봄의 알러지성 결막염을 포함하는 결막염(conjunctivitis); 홍채염(iritis); 전안방성 및 후안방성 포도막염; 맥락막염(choroiditis); 자가면역; 망막에 영향을 주는 퇴행성 또는 염증성 장애; 자율신경성 안염을 포함하는 안염(ophthalmitis); 유육육종(srcoidosis); 바이러스, 진균 및 세균을 포함하는 감염;
6. 위장관계: 설염(glossitis), 치은염(gingivitis), 치근막염(periodontitis); 역류성 식도염을 포함하는 식도염(oesophagitis); 호산구성 위장염(eosinophici gastro-enteritis), 비만세포증(mastocytosis), 크로병(crohn's disease), 궤양성 대장염을 포함하는 대장염, 직장항문염, 항문소양증; 만성소화장애증(coeliac disease), 자극성 장 증후군(irritable bowel syndrome), 및 장과 관련없는 영향을 가지는 음식-관련 알러지(예를 들면, 편두통, 비염 또는 습진);
7. 복부: 자가면역, 알코올성 및 바이러스성을 포함하는 간염; 간의 섬유증 및 간경변; 담낭염(cholecystitis); 급성 및 만성의 췌장염(pancreatitis);
8. 비뇨생식기: 간질성 및 사구체신염(glomerulonephritis)을 포함하는 신장염(nephritis); 신증후군(nephrotic syndrome); 급성 및 만성(간질성) 방광염을 포함하는 방광염(cystitis) 및 후너 궤양(Hunner's ulcer); 급성 및 만성 요도염(urethritis), 전립선염(prosatitis), 부고환염(epididymitis), 난소염(oophoritis) 및 난관염(salpingitis); 외음-질염(vulvo-vaginitis); 페로니씨병(peryronie's disease); 발기부전(erectile dysfunction)(남성 및 여성);
9. 동종이식 거부(allograft rejection): 예를 들면, 신장, 심장, 간, 폐, 골수, 피부 또는 각막 이식 후의 급성 및 만성의 동종이식 거부, 수혈 후의 동종이식 거부 및 만성 이식편대 숙주질환(chronic graft versus host disease);
10. 중추신경계(CNS): 알츠하이머 질환 및 크로이츠-펠트 야콥병(CJD) 및 신변종 크로이츠-펠트 야콥병(nvCJD)을 포함하는 그 외 치매성 장애; 다발성 경화증 및 그 외 탈수초성 질환(demyelinating syndrome); 대뇌 죽상경화증(cerebral atherosclerosis) 및 혈관염(vaculitis); 측두 동맥염(temporal arteritis); 중증 근무력증(myasthenia gravis); 내장통(visceral pain), 두통, 편두통, 삼차 신경통, 비전형 안면통(atypical facial pain), 관절 및 골격통, 암 및 종양 침습에 의한 통증, 및 당뇨병, 간 후성, HIV-연관 신경병증을 포함하는 신경병증 통증 증후군(neuropathic pain syndrome) 급성 및 만성 통증(급성, 간헐성 또는 지속성, 중추기원 또는 말초 기원); 신경유육육종(neurosarcoidosis); 악성, 감염성 또는 자가면역 과정의 중추 및 말초 신경계 합병증;
11. 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroditis), 그래이브병(Gragve's disease), 에디슨병(addison's disease), 당뇨병, 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopanic purpura), 호산구성 근막염(eosinophilic fasciitis), 고-IgE 증후군(hyper-IgE syndrome), 항인지질항체증후군(antiphospholipid syndrome);을 포함하는 그 외 자가 면역 및 알러지성 장애;
12. 염증성 또는 면역 성분과 관련된 그 외 장애; 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 나병(leprosy), 쎄자리 증후군(Sezary syndrome), 및 방종양성증후군(paraneoplastic syndromes)을 포함;
13. 심혈관계: 관상 및 말초 순환에 영향을 주는 동맥경화증; 심막염(pericarditis); 심근염(myocarditis), 심근 유육종을 포함하는 염증성 및 자가면역 심근병증; 허혈성 재관류 손상; 심내막염, 판막염, 및 염증성(예를 들면 매독성)을 포함하는 대동맥염; 혈관염; 정맥염 및 혈전증을 포함하는, 심부정맥 혈전증 및 하지정맥류를 포함하는 근위 및 말초 정맥의 장애;
14. 위장관계; 만성소화장애증(coeliac disease), 직장항문염, 호산구성 위장염(eosinophici gastro-enteritis), 비만세포증(mastocytosis), 크론병(crohn's disease), 궤양성 대장염, 현미경적 장염, 불확정 대장염(indeterminate colitis), 자극성 장 증후군(irritable bowel syndrome), 비염증성 설사, 장과 관련없는 영향을 가지는 음식-관련 알러지(예를 들면, 편두통, 비염 또는 습진);
을 포함한다.
이것을 위하여 본 발명자들은 Gadd45β/MKK7 상호작용을 억제하는 테트라펩타이드, 트리펩타이드, 디펩타이드의 D-거울상이성질체 및 펩토이드 모이어티(peptoid moeties)를 포함하는 유사-펩타이드-모방체(similar-peptide-mimetics)에 기초한 다수의 합성 분자를 개발하였다. 중요한 것은, 이러한 화합물은 MKK7 카이나제(kinase) 작용을 억제하지 않으면서 Gadd45β 억제활성을 보인다는 것이다. 이것은 본 발명의 화합물이 Gadd45β/MKK7 복합체의 억제를 통해서 JNK 세포독성 신호를 유도할 수 있다는 것을 입증하기 때문에, 이러한 사실은 중요하다.
합성분자는 독립된 상태의 Gadd45β 또는 MKK7과 결합하지 않지만, 이들은 단백질들이 서로 결합되어 있거나 결합되지 않은 상태에서 서로 접촉하고 있을 때, 하나 또는 다른 단백질과 결합할 수 있으며, 짐작컨대, Gadd45β, MKK7 및/또는 Gadd45β, MKK7이 서로 접촉되었을 때 두 단백질의 복합체에 가능하게 된 표면을 인식함으로써, 두 단백질의 하나 또는 복합체에서의 구조적 변형을 일으켜 복합체의 해리를 촉발을 일으킨다. 이러한 특징은 특별한 것인데, 왜냐하면 이것은 화합물이 타겟(즉, Gadd45β/MKK7 복합체)에 대해 매우 높은 특이성을 가지며, 본 발명의 화합물이 상호작용하여, Gadd45β 또는 MKK7과 비슷한 구조를 가지는 단백질에 영향을 미칠 가능성을 줄인다는 것을 의미하기 때문이다. 본 발명의 화합물의 치료적 타겟이 두 단백질(즉, Gadd45β 및 MKK7) 사이의 접점(interface)이라는 특징은 본 발명의 화합물이 생체 내에서(in vivo), Gadd45β 또는 MKK7의 전반적인 생물학적 활성을 억제하지 않고, Gadd45β 또는 MKK7이 Gadd45β/MKK7 복합체의 일부분으로 가지고 있는 생물학적 작용을 선택적으로 억제한다는 것을 확인해 준다.
본 발명의 화합물은 현저하게 다발성 골수종 세포주, 원발성 종양 세포, 및 전단핵구성 백혈병(promonocytic leukaemia)뿐만 아니라, 미만성 대형 B-세포 림프종 및 버킷 림프종 세포주를 포함하는 그 외 종양 B 세포주에서 낮은 나노몰라(nanomolar) 범위의 IC50 값의 세포사멸을 보이는 것으로 나타났고, 변환되지 않은 섬유아세포, 골수 기질 세포(BMSCs), 말초혈 단핵 세포(PBMNCs), 중간엽 줄기 세포(MSCs), 또는 마우스로부터 분리된 원발성 B- 및 T-림프구와 같은 정상세포 및 종양 T-세포주에서는 매우 높은 농도에서도(즉, 100μM) 활성이 없는 것으로 나타났다. 이것은 비정상적으로 구성요소적인 활성형 NF-κβ을 가지는 세포에 대한 이들의 세포독성 활성에서의 특이성을 가짐을 증명해준다. 중요한 것은 본 발명의 화합물은 단백질분해에 내성을 가지고, 수용성이며, 인간 혈청에서의 장시간 배양 후에서 완전한 억제 활성을 보유하고 있어, 생물학적 유체에서 안정하므로 전신적 이용에 있어서 적절한 후보물질인 것으로 나타났다.
본 발명의 화합물은 세포 내의 Gadd45β/MKK7 복합체에 대하여 높은 타겟 특이성을 보이는 것으로 나타났다. 이것은 1) 종양 세포주의 많은 패널에 있어서 Gadd45β의 발현 수준 및 Z-/mDTP-유도 사멸에 민감한 종양세포 사이에 매우 유의적인 통계적 상관관계가 있음과; 2) Z-/mDTP 내성 세포주가 아닌 Z-/mDTP 민감 세포주에서 Gadd45β의 sh-RNA-매개 하향조절이 세포사멸을 유도하고, 이 세포주에서의 Gadd45β-특이적 sh-RNAs에 의한 세포 사멸 유도의 양상이 Z-/mDTPs에서 관찰된 것과 유사하다는 점; 3) MKK7의 sh-RNA-매개 하향조절이 Z-/mDTP 민감성 세포주를 Z-/mDTP-유도 사멸에 완전하게 내성을 갖게 만든다는 점; 4) 본 발명의 치료적 타겟은 Gadd45β 및 MKK7, 두 단백질 사이의 접점이고, 이것은 현존하는 치료법을 넘을 수 있는 중요 이점 및 높은 타겟 특이성을 제공한다는 점을 발견함으로써 증명하였다. 정상세포에서 Z-/mDTPs의 낮은 독성 및 마우스에서 Gadd45β의 낙아웃 제거는 내성을 가진다는 발견과 함께 이러한 결과는, Gadd45β/MKK7의 Z-/mDTP-매개 억제를 통한 세포 생존에서의 NF-κβ의 신중한 전-생존(pro-survival) 작용을 타겟팅하는 것은 더 많은 특이성, 더 적은 독성을 가지는 치료법을 제공한다는 것을 의미하고, 그러므로 NF-κβ 경로 및/또는 단백질분해효소복합체를 타겟팅하는 치료법보다 더 효과적이라는 것을 의미한다.
또한 본 발명의 화합물은 정상 세포에서 독성을 가지지 않고, Gadd45β의 억제는 부작용이 없거나/거의 없는 것으로 나타났는데, 그 이유는 Gadd45β 낙아웃 마우스는 생존하고 명백하게 건강하며, 이것은 완전한 Gadd45β 비활성이 생체 내에서 잘 관용된다는 것을 나타낸다. 본 발명의 화합물은 또한 안정하고, 수용성이며, 세포투과성을 가져 다발성 골수종, 미만성 대형 B-세포 림프종 및 그들의 생존에 NF-κβ에 의존하는 그 외 다른 암의 처치에 적절하다. 본 발명의 화합물은 또한 치료적 이용에 있어서 매력적인 약동학 프로파일(PK profile)을 가진다.
본 발명은 또한 환자에 있어서 Z-/mDTP 치료 반응을 예측하는 임상적으로 유용한 어세이의 개발에 이용될 수 있다. 종양세포주의 많은 패널의 데이타는 Z--/mDTP 유도 사멸이 Gadd45β 발현 수준과 높은 정도의 유의성으로 상관관계를 가짐을 나타내고(p<0.01), 그러므로 Gadd45β에 대한 Z-/mDTPs의 세포독성 작용의 높은 특이성을 확립하였다. 또한, Gadd45β의 낙다운은 다발성 골수종 세포에서의 세포 사멸을 유도하고, 반면에 MKK7의 낙다운은 다발성 골수종 세포가 Z-/mDTP-유도 사멸에 완전하게 내성을 갖게 한다. 이와 함께, 이러한 데이타는 Z-/mDTPS 치료요법이 임상적으로 이용되어야하고, 이것은 샘플 및 비용-효과적 qRT-PCR 분석을 통해 환자의 반응 인구를 예측하는 것을 가능하게 해줄 수 있다는 것을 나타낸다.
화학식 I의 화합물을 제공하는 본 발명의 첫번 째 측면에 있어서:
I: X1-A-X2
상기에서,
A는 A'''',
또는 A''-[M-A'-]nM-A'''이고;
A''''는 A'',
A''',
또는 Z1-Y2-Y3-Z4이고, 상기에서 Y2-Y3는 올리고펩토이드 부위(moiety) 또는 잔기 Y2-Y3을 포함하는 올리고펩토이드(oligopeptoid) 부위이고 Z1은 Y2-Y3의 N-말단 질소에 부착되고(attached) Z4는 Y2-Y3의 C-말단 탄소에 부착되고;
A''는 A',
또는 Y1-Y2-Y3-Z4이고, 상기에서 Y1-Y2-Y3는 올리고펩토이드 부위 또는 잔기 Y1-Y2-Y3를 포함하는 올리고펩토이드 부위이고 Z4는 Y1-Y2-Y3의 C-말단 탄소에 부착되고;
A'''는 A',
또는 Z1-Y2-Y3-Y4이고, 상기에서 Y2-Y3-Y4는 올리고펩토이드 부위 또는 잔기 Y2-Y3-Y4를 포함하는 올리고펩토이드 부위이고 Z1은 Y2-Y3-Y4의 N-말단 질소에 부착되고;
A'의 각각의 존재(occurrence)는 독립하여 올리고펩타이드(oligopeptide) 부위 또는 잔기 Y1-Y2-Y3-Y4를 포함하는 올리고펩토이드 부위이고;
n은 0 내지 18의 정수이고;
Υ1 및 Y4는 독립하여 아미노산 잔기 또는 방향족 잔기를 포함하는 아미노산 유도체의 잔기이고; 각각의 곁사슬을 포함하는 실시태양에 있어서 5 내지 10의 탄소환기 또는 헤테로 사이클릭 방향족에 한번 또는 두번 치환된 하나 내지 세개의 탄소원자의 알킬렌(alkylene)족 및 1 내지 4 탄소원자의 알킬에 선택적으로 치환된: 히드록시, 할로겐 또는 상기 방향족은 C1 내지 C4 알킬 또는 C1 내지 알콕시로 선택되는 적어도 하나의 치환기를 선택적으로 치환한다.
Y2는 없거나 또는 아미노산 잔기 또는 아니노산 유도체의 잔기 바람직하게는 L 또는 D 형의 20 천연 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체의 잔기 바람직하게는 pH7의 수용성 용액에서 음전하를 가지는 곁사슬을 가지는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체이다;
Y3은 아미노산 잔기 또는 아니노산 유도체의 잔기 바람직하게는 L 또는 D 형의 20 천연 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체의 잔기 바람직하게는 pH7의 수용성 용액에서 양전하를 가지는 곁사슬을 가지는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체이다,
Y2 및 Y3 에 있어서는 둘 다 바람직하게 염다리 일부의 구현에 있어서 존재하는 것은 곁사슬의 각각 양전하 및 음전하 사이에 형성 될 수 있는 및/또는 Y1 및 Y4 에서, 또는 X1 및 X4 에서, 또는 X1 및 Y4에서, 또는 Y1 및 X4 방향 중심 사이에서 거리가 10 또는 20 옹스트롬(Angstroms) 보다 크지 않고 3 옹스트롬(Angstroms) 보다 작지 않다. 바람직하게는 Y2 및 Y3 의 곁사슬은 30 이하의 원자로 이루어져 있다. Y2 및 Y3에 있어서 천적으로 발생한 아미노산 또는 L 또는 D 형의 M-메틸-아미노산이 될 수 있다.
Z1은 하기 화학식 (II)의 군(group):
Figure pct00003
Z1은 Y2의 N-말단 질소에 연결되고,
W는 없거나, 또는 산소, 또는 질소, 또는 C1 내지 C3의 알킨기(alkylene group)이고,
상기 C1 내지 C3의 알킨기는 C1 내지 C4의 알킬기, 또는 5 내지 10 원자의 탄소환기(carbocyclic) 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방향족 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;
J는 5 내지 10 원자의 탄소환기 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방향족 이고, 상기 방향족은 수산화기, 할로겐, C1 내지 C4의 알킬기, 또는 C1 내지 C4의 알콕시기 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;
Z4 는 하기 화학식 (III)의 군:
Figure pct00004
Z4는 Y3의 C-말단 탄소에 연결되고,
R은 수소 또는 C1 내지 C4의 알킬기이고;
W'는 없거나 C1 내지 C3의 알킨기이고,
상기 C1 내지 C3의 알킨기는 C1 내지 C4의 알킬기, 또는 5 내지 10 원자의 탄소환기 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방항족 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;
J'는 3 내지 10 원자의 지방족 카르복실산기 또는 5 내지 10 원자의 탄소환기 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방향족이고,
상기 지방족 카르복실산기 또는 방향족은 수산화기, 할로겐, C1 내지 C4의 알킬기, 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;
M은 선행(preceding) 올리고펩타이드 또는 올리고펩토이드 부위(Α',Α'' or A''')와 후행(following) 올리고펩타이드 또는 올리고펩토이드 부위(Α',Α'' or A''') 사이의 펩타이드 결합 또는 선행 올리고펩타이드 또는 올리고펩토이 부위(A', A'' 또는 A''')의 말단 카르복실기에 아마이드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 또는 황화에스테르 결합을 통해 연결된 링커(linker) 부위 및 후행 올리고펩타이드 부위(Α', A" or A'") 말단 아미노 그룹에 아마이드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 또는 황화에스테르 결합을 통해 연결된 링커 부위이고;
X1은 없거나, 또는 A의 아미노 말단에 첨가된 부위에 의해 자유 아미노기를 차단하고 ;
X2는 없거나 또는 A의 카르복실 말단에 첨가된 부위에 의해 자유 카르복실기를 차단하고 ;
일실시예에 있어서, W에 있어서는 없거나 또는 1 내지 3 탄소의 알킬렌(alkylene)이다.
바람직하게는 X1 및 X2는 30 (또는 바람직하게는 20 또는 10 이상) 원자들 이하의 부위이다.
조건부로 A가 Z1을 포함하면 X1은 없고 A가 Z4 를 포함하면 X2가 없고
(즉, 자유 아미노산이 없거나 또는 분자의 말단의 카르복실기, X1 및 X2는 필요로 하지 않는다);
또는 이들의 유도체, 상기 유도체는 하기에 구성되는 군으로부터 선택되며:
a) 화학식 I의 화합물의 분자 올리고머 또는 다중체(multimers), 상기 올리고머 또는 다중체는 화학식 I의 화합물의 둘 또는 그 이상의 분자 를 포함하고 각각은 화학식 I의 화합물의 분자 내 존재하는 아미노기 또는 카복실산기와 스캐폴드 부위의 반대의 아미노기 또는 카르복실산 사이에 형성되는 아마이드 결합을 통해 공통의 스캐폴드 부위에 연결 되고 상기 스캐폴드 부위은 적어도 2 아마이드 결합을 이루고,
b) 화학식 I의 화합물의 분자를 포함하는 유도체 또는 아마이드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 황화에테르 결합을 통해 이하와 컨 쥬게이트된 상기 파트 a)에서 정의된 올리고머 또는 다중체(multimer):
PEG,
PEG에 기반한 화합물,
세포-투과 펩타이드,
형광성 염료,
비오틴 or 기타 태그(tag) 부위
지방산들,
별개 크기의 나노입자
또는 금속성 또는 방사성 이온들과 복합체를 이루는
킬레이트 리간드.
c) 화학식 I의 화합물의 분자를 포함하는 유도체 또는 아미드화, 글 리코실화, 카르바밀화, 아실화, 황산화, 인산화, 고리화, 지질화, 페 길레이션에 의해 변형된 상기 파트 a)에서 정의된 올리고머 또는 다합 체 또는 펩타이드에 연결 또는 융합 펩타이드 또는 융합 펩티오 드(peptiod)를 형성하기 위하여 펩타이드 융합 파트너에 연결.
및
d) 화학식 I의 화합물의 분자의 유도체의 염 및 용매화합물 또는 상기 파트 a) 또는 b)에서 정의된 이들의 유도체의 염 및 용매 화합물.
일실시예에 있어서:
Y1는 D-트립토판,
L-트립토판,
D-티로신,
L-티로신,
D-3,3-디페닐-알라닌,
L-3,3-디페닐-알라닌,
D-H-3-(4-피리딜)알라닌,
L-H-3-(4-피리딜)알라닌,
D-H-3-(3-피리딜)알라닌
L-H-3-(3-피리딜)알라닌
D-H-3-(2-피리딜)알라닌,
L-H-3-(2-피리딜)알라닌,
D-2-아미노-4-페닐-부틸릭산(butirric acid),
L-아미노-4-페닐-부틸릭산(butirric acid),
D-H-4-히드록시-페닐-글리신,
L-H-4-히드록시-페닐-글리신,
D-3-(2-푸릴)-알라닌,
L-3 -(2-푸릴)-알라닌,
L-호모페닐알라닌,
D-모페닐알라닌,
D-3 -(4-퀴노릴)-알라닌,
L-3-(4-퀴노릴)-알라닌,
D-나프틸-알라닌,
L-나프틸-알라닌
p-히드록시-벤조산
p-히드록시-페닐-아세틱-산
3-(p-히드록시-페닐)-프로피온-산
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체
바람직하게 Y1 있어서:
D-페닐알라닌,
L-페닐알라닌,
D-트립토판,
L-트립토판,
D-티로신,
L-티로신,
D-3,3-디페닐-알라닌,
L-3,3-디페닐-알라닌,
D-H-3-(4-피리딜)알라닌,
L-H-3-(4-피리딜)알라닌,
D-H-3-(3-피리딜)알라닌
L-H-3-(3-피리딜)알라닌
D-H-3-(2-피리딜)알라닌,
L-H-3-(2-피리딜)알라닌,
D-2-아미노-4-페닐-부틸릭산(butirric acid),
L-아미노-4-페닐-부틸릭산(butirric acid),
D-페닐-글리신,
L-페닐-글리신,
D-H-4-히드록시-페닐-글리신,
L-H-4-히드록시-페닐-글리신,
D-3-(2-퓨리)-알라닌,
L-3-(2-퓨리)-알라닌,
L-싸이크로헥실알라닌,
D-싸이크로헥실알라닌,
L-호모페닐알라닌,
D-호모페닐알라닌,
D-3-(4-퀴노릴)-알라닌,
L-3 -(4-퀴노릴)-알라닌;
D-나프틸-알라닌
또는 L-나프틸-알라닌
일실시예에 있어서:
Y2는 없거나
D-글루탐산,
L-글루탐산,
D-아스파르트산,
L-아스파르트산,
L-류신
D-류신
L-글루타민
D-글루타민
L-메티오닌
D-메티오닌
D-2-아미노-헵타네디오산(heptanedioic acid),
L-2-아미노-헵타네디오산(heptanedioic acid),
상기 어느 화합물의 메틸 또는 에틸 에스테르,
L-호모세린,
D-호모세린;
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체
바람직하게 Y2 있어서:
D-글루탐산,
L-글루탐산,
D-아스파르트산,
L-아스파르트산,
D-2-아미노-헵타네디오산,
L-2-아미노-헵타네디오산,
상기 어느 화합물의 메틸 또는 에틸 에스테르,
L-호모세린,
또는 D-호모세린;
일부 구현에 있어서:
Y3는 D-아르기닌,
L-아르기닌,
L-프롤린
D-프롤린
D-히스티딘,
L-히스티딘,
D-리신,
D-A,β-디아미노프로피온산(D-Dap),
L-A,β-디아미노프로피온산(L-Dap),
L-A,δ-디아미노부틸릭산(L-Dab),
L-A,δ-디아미노부틸릭산(L-Dab),
L-오르니틴,
D-오르니틴,
L-리신;
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체
바람직하게 Y3 있어서:
D-아르기닌,
L-아르기닌,
D-히스티딘,
L-히스티딘,
D-리신,
D-A,β-디아미노프로피온산(D-Dap),
L-A,β-디아미노프로피온산(L-Dap),
L-A,δ-디아미노부틸릭산(L-Dab),
L-A,δ-디아미노부틸릭산(L-Dab),
L-오르니틴,
D-오르니틴,
L-리신;
일부 구현에 있어서:
Y4 는
D-페닐알라닌,
L-페닐알라닌,
D-트립토판,
L-트립토판,
D-티로신,
L-티로신,
D-3,3-디페닐-알라닌,
L-3,3-디페닐-알라닌,
D-H-3-(4-프리딜)알라닌,
L-H-3-(4-프리딜)알라닌,
D-H-3-(3-프리딜)알라닌,
L-H-3-(3-프리딜)알라닌,
D-H-3-(2-프리딜)알라닌,
L-H-3-(2-프리딜)알라닌,
D-2-아미노-4-페닐-부틸릭산,
L-2-아미노-4-페닐-부틸릭산,
D-페닐-글리신,
L-페닐-글리신,
D-H-4-히드록시-페닐-글리신,
L-H-4-히드록시-페닐-글리신,
D-3-(2-푸릴)-알라닌,
L-3-(2-푸릴)-알라닌,
L-호모페닐알라닌,
D-호모페닐알라닌,
D-3-(4-퀴노릴)-알라닌,
L-3-(4-퀴노릴)-알라닌;
D-나프틸-알라닌
L-나프틸-알라닌
L- 또는 D- 형의 이들의 N-메틸-유도체
D-배열
아닐린
벤질아민
또는 2-페닐-에틸-아민
바람직하게 Y4 에 있어서:
D-페닐알라닌,
L-페닐알라닌,
D-트립토판,
L-트립토판,
D-티로신,
L-티로신,
D-3,3-디페닐-알라닌,
L-3,3-디페닐-알라닌,
D-H-3-(4-프리딜)알라닌,
L-H-3-(4-프리딜)알라닌,
D-H-3-(3-프리딜)알라닌,
L-H-3-(3-프리딜)알라닌,
D-H-3-(2-프리딜)알라닌,
L-H-3-(2-프리딜)알라닌,
D-2-아미노-4-페닐-부틸릭산,
L-2-아미노-4-페닐-부틸릭산,
D-페닐-글리신,
L-페닐-글리신,
D-H-4-히드록시-페닐-글리신,
L-H-4-히드록시-페닐-글리신,
D-3-(2-푸릴)-알라닌,
L-3-(2-푸릴)-알라닌,
L-싸이크로헥실알라닌,
D-싸이크로헥실알라닌,
L-호모페닐알라닌,
D-호모페닐알라닌,
D-3-(4-퀴노릴)-알라닌,
L-3-(4-퀴노릴)-알라닌;
D-나프틸-알라닌
L-나프틸-알라닌
바람직하게 Y1 , Y2 , Y3 및 Y4 일부 구현에 있어서는 모든 것은 상기 기술되어있다. Y1 , Y2 , Y3 및 Y4 일부 구현에 있어서는 모든 것은 상기 기술되었다. Y2 의 조건으로든 것은 상기 기술되었다.
D-글루탐산,
L-글루탐산,
D-아스파르트산,
L-아스파르트산,
D-2-아미노-헵타네디오산,
L-2-아미노-헵타네디오산,
상기 어느 화합물의 메틸 또는 에틸 에스테르,
L-호모세린,
L-류신
D-류신
L-글루타민
D-글루타민
L-메티오닌
D-메티오닌
D-호모세린;
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체
및 Y3는
D-아르기닌,
L-아르기닌,
D-히스티딘,
L-히스티딘,
D-리신,
L-리신
D-A,β-디아미노프로피온산(D-Dap),
L-A,β-디아미노프로피온산(L-Dap),
L-A,δ-디아미노부틸릭산(L-Dab),
L-A,δ-디아미노부틸릭산(L-Dab),
L-오르니틴,
D-오르니틴,
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체
Y1 및 Y2 일부 구현에 있어서는 둘 다 기술되었지만 Y2의 하나 또는 둘 다 및 Y3 는 없다. 일부 구현의 M에 있어서는 펩타이드결합이다.
X1 일부 구현에 있어서는 할로겐 또는 X1는 아미드 결합의 형태로 올리고펩타이드 서열의 아미노 말단에 추가된 하기의 족 중의 하나이다:
아세틸,
벤질옥시카보닐,
2-클로로-벤질옥시카보닐,
3-메톡시,4-히드록시-벤조일,
3-히드록시,4-메톡시-벤조일,
벤조일,
또는 프루오레닐메톡시옥시카보닐
X2는 히드록시 족이다 또는 아미드 결합의 형태로 올리고펩타이드 서열의 카르보닐산 말단에 추가된 하기의 족 중의 하나이다:
아민,
D-페닐알라닌,
L-페닐알라닌,
D-트립토판,
L-트립토판,
D-티로신,
L-티로신,
D-3,3-디페닐-알라닌,
L-3,3-디페닐-알라닌,
D-H-3-(4-피리딜)알라닌,
L-H-3-(4-피리딜)알라닌,
D-H-3-(3-피리딜)알라닌
L-H-3-(3-피리딜)알라닌
D-H-3-(2-피리딜)알라닌,
L-H-3-(2-피리딜)알라닌,
D-2-아미노-4-페닐-부틸릭산,
L-아미노-4-페닐-부틸릭산,
D-페닐-글리신,
L-페닐-글리신,
D-H-4-히드록시-페닐-글리신,
L-H-4-히드록시-페닐-글리신,
D-3-(2-푸릴)-알라닌,
L-3-(2-푸릴)-알라닌,
L-싸이크로헥실알라닌,
D-싸이크로헥실알라닌,
L-호모페닐알라닌,
D-호모페닐알라닌,
D-3-(4-퀴노릴)-알라닌,
L-3-(4-퀴노릴)-알라닌,
D-나프틸-알라닌,
L-나프틸-알라닌
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체
일부 구현에 있어서:
Z1은 4-히드록시-벤조일,
(4-히드록시-페닐)-아세틸
3-(4-히드록시-페닐)-프로피오닐 벤조일,
벤질옥시카보닐,
2-페닐-아세틸
3-페닐-프로프로닐
3,3-디페닐-프로피오닐
3-(1H-인돌-3-일)-프로피오닐
(1H-인돌-3-일)-아세틸
푸란-2-일-아세틸
푸란-3-일-아세틸
3-피리딘-4-일-프로피오닐
3-피리딘-3-일-프로피오닐
3-피리딘-2-일-프로피오닐
3-피리미딘-4-일-프로피오닐
3-피리다진-4-일-프로피오닐
3-[1,3,5]트리아진-2-일-프로피오닐
2-피리딘-4-일-아세틸
2-피리딘-3-일-아세틸
2-피리딘-2-일-아세틸
2-피리미딘-4-일-아세틸
2-피리다진-4-일-아세틸
2-[l,3,5]트리아진-2-일-아세틸
나프탈렌-1-일-아세틸
나프탈렌-2-일-아세틸
2-나프탈렌-1-일-프로피오닐
또는 2-나프탈렌-2-일-프로피오닐
Y2는 D-글루탐산,
L-글루탐산,
D-아스파르트산,
L-아스파르트산,
L-류신
D-류신
L-글루타민
D-글루타민
L-메티오닌
D-메티오닌
D-2-아미노-헵타네디오산(heptanedioic acid),
L-2-아미노-헵타네디오산(heptanedioic acid),
상기 어느 화합물의 메틸 또는 에틸 에스테르,
L-호모세린,
D-호모세린;
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체
Y3는 D-아르기닌,
L-아르기닌,
D-히스티딘,
L-히스티딘,
L-프롤린,
D-프롤린,
D-리신,
L-리신
D-A,β-디아미노프로피온산(D-Dap),
L-A,β-디아미노프로피온산(L-Dap),
L-A,δ-디아미노부틸릭산(L-Dab),
L-A,δ-디아미노부틸릭산(L-Dab),
D-오르니틴,
L-오르니틴,
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체
Z4는 페닐아민,
벤질아민,
펜에틸아민
사이크로헥실-아민
2-사이크로헥실-에틸아민
3-사이크로헥실-프로필아민
4-(2-아미노-에틸)-페놀
4-아미노-페놀
4-아미노메틸-페놀
1H-인돌-3-일-아민
2-(1H-인돌-3-일)-에틸아민
C-(1H-인돌-3-일)-메틸아민
2,2-디페닐-에틸아민
2,2-디피리딘-4-일-에틸아민
2-피리딘-4-일-에틸아민
2-피리딘-3-일-에틸아민
2-피리딘-2-일-에틸아민
2-피리미딘-4-일-에틸아민
2-[1,3,5]트라이진-2-일-에틸아민
C-푸란-2-일-메틸아민
C-푸란-3-일-메틸아민
또는 C-나프탈렌-2-일-메틸아민.
본 발명의 모든 펩타이드 및 펩토이드 및 이의 영역에 있어서 N 말단 내지 C말단으로부터 기술되었다.
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 일 수 있다. 바람직하게는 일실시예에 있어서 n=0.
일실시예에 있어서 A는 바람직하게는 A'이다.
화합물에 일실시예에 있어서는 그것의 필수 테트라펩타이드, 트리펩타이드 또는 말단의 하나 또는 더 많은 X1 및 X2 족을 추가로 저해한 디펩타이드(또는 펩토이드와 상응하는)이다.
올리고펩타이드
올리고펩타이드는 A-아미노산의 축합에 의해 형성된 짧은 폴리머(polymer)이다(간단하게 "아미노산"으로 언급된 것과 같이). 하나의 아미노산 잔기 및 하기사이의 연결은 펩타이드 결합 또는 아미드 결합으로 알려져 있다.
아미노-산
"아미노산' 용어를 사용함에 있어서 그것의 D 및 L 추가형 둘다에서의 20개 표준 아미노산(아이소로이신, 알라닌, 류신, 아스파라긴, 라이신, 아스파라트산, 메티오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 글루타민, 트립토판, 글리신, 발린, 프롤린, 세린, 티로신, 아르기닌 및 히스티딘)을 포함한다. 일부 구현에 있어서 D형이 바람직하다.
아미노산 유도체
그것의 곁사슬이 A-아미노산으로부터 다른 N-치환 글리신 포함하는 용어를 사용함에 있어서는 질소 원자를 A-탄소 (아미노산으로) 보다 분자의 백본(backbone)의 질소를 함유하는 것이 더 낫다. 또한 용어에서 포함하는 것은 A-아미노산, β-아미노산 및 N-메티화A-아미노산의 메틸 및 에틸 에스테르이다.
올리고펩토이드
엄밀히 말하면, "올릭펩타이드" 용어는 단지 A-아미노산 올리고몰과 관련있다. 아미노산 유도체(예를 들면 N-치환 글리신)에 결합하는(모두 또는 몇몇의 잔기의 위치에서) 유사한 올리고머는 올리고펩토이드라고 알려져 있다.
유도체
바람직하게는, 본 발명의 첫번 째 측면의 화합물의 유도체는 작용성 유도체이다. "작용성 유도체" 용어는 동일한 생리적 작용을 가지는 화학식 I의 화합물의 화학적 유도체를 표시하기 위하여 본 발명에서 사용된 것이다(화학식 I의 사응하는 변형되지 않는 화합물로 또는 기능적 분석에서 동일한 시험관 내 작용을 선택적으로 가지는 것 (예를 들면, 다음과 같이 밝힌 예들 중 하나에서 설명된 분석중 하나에서).
본 발명의 화합물의 유도체는 아마이드화, 글리코실화, 카르바밀화, 아실화, 예를 들면 아세틸화, 설폰화, 포스폴리화, 고리화, 지질화 및 페길화를 포함하는 과정이 널리 알려진 변형된 화학식 I의 구조를 포함할 수 있다. 화학식 I의 구조는 분자에서의 무작위 위치에서, 분자 및 하나, 둘, 셋, 또는 그 이상 화학적 부위에 부착에서 미리 측정된 위치에서 변형될 수 있다. N-말단 NH2 을 다른 기로 대체한 화합물을 포함하는 유도체, 예를 들면 메톡시기. 본 발명의 화합물은 융합 단백질에서, 화학식 I의 구조는 다른 단백질 또는 당업계에 알려진 방법을 사용하는 폴리벱타이드(융합 파트너)를 합체할 수 있다. 적합한 펩타이드 또는 단백질 어떠한 것도 융합 파트너로 사용할 수 있다(예를 들어 셀륨알부민, 탄소 탈호효소, 글루타티온-S-전달효소 또는 티오레독신, 기타 등등.). 바람직하게 융하 파트너는 생체내에서 불리한 생물학적 활성을 가지지 않을 것이다. 그러한 융합 단백질은 화학식 I 또는 그 반대의 구조아미노산 말단에서 융합 파트너의 카르복시-말단에 연결로 만들 수 있다. 추가로, 절단성 링커는 화학식 I의 구조에서 융합 파트너로 연결에 사용할 수 있다. 절단성 융합 단백질의 결과에서 생체내에서 그러한 발명이 알려진 화합물의 활성 형태를 절단할 수 있다. 그러한 절단성 링커의 예를 포함하는, 그러나 제한하지 않는, 링커 D-D-D-D-Y [서열번호:227], G-P-R, A-G-G 및 H-P-F-H-L [서열번호:228], 각각 엔테로키나아제, 트롬빈, 유비퀴틴 절단 효소 및 레닌, 절단될 수 있다. 참고로, 예를 들면 U.S. Patent No. 6,410,707.
본 발명의 화합물은 화학식 I의 구조의 생리적으로 작용하는 유도체 일 수 있다. "생리적으로 작용하는 유도체" 용어는 화학식 I의 변형되지 않은 화합물에 연관됨으로 동일한 생리적 작용을 가지는 화학식 I의 화합물의 화학적 유도체 표시하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 생리적으로 작용하는 유도체는 화학식 I의 화합물로 신체 내에서 전환할 수 있다. 본 발명에서, 생리적으로 작용하는 유도체의 예를 들면 에스테르, 아미드, 및 카바마이트를 포함한다; 바람직하게는 에스테르 및 아마이드.
약학적으로 허용하는 본 발명의 화합물의 에스테르 및 아미드에서 C1 -20 알킬-, C2 -20 알케닐-, C5 -10 아릴-, C5 -10 또는 C1 -20 알킬- , 또는 아미노산-에스테르 또는 적당한 위치에 부착된 -아미드, 예를 들면 산 기를 포함할 수 있다. 적합한 부위의 예는 4 내지 26 탄소 원자의 소수성 치환기이다, 바람직하게는 5 내지 19 탄소 원자. 적합한 지방 기를 포함하고, 제한하지 않으며 하기에서: 아우릴(Ci2H23), 팔미틸 (C15H31), 오레일(C15H29), 스페아릴(C17H35), 콜산(cholate); 및 데옥시콜산(deoxycholate).
지방산 유도체의 설프히드릴을 포함하는 화합물의 지질화를 위한 방법은 미국 특허 번호. 5,936,092; 미국 특허 번호. 6,093,692; 및 미국 특허 번호.6,225,445.에 밝혀져 있다. 디설피드 결합에서 지방산에 연결된 발명의 화합물을 포함하는 발명의 화합물의 지방산 유도체는 신경 세포 및 조직에서 본 발명의 화합물 전달에 사용할 수 있다. 지질화는 화합물의 흡수를 현저하게 증가한다. 지질화 되지 않은 화합물과 상응하는 흡수율과 관련이 있을 뿐만 아니라, 혈액 및 조직에서 보유를 연장할 수 있다. 또한, 지질화된 유도체에서의 디설피드 연결은 세포에서 상대적으로 불안정하고 따라서 지방산 부위로부터 분자의 세포 내의 방출을 가능하게 할 수 있다. 적합한 지방-함유 부위는 4 내지 26 탄소 원자의 소수성 치환기이다, 바람직하게는 5 내지 19 탄소 원자이다. 적합한 지방 기를 포함하고, 제한하지 않으며 하기에서: 팔미틸 (C15H31), 오레일(C15H29), 스페아릴(C17H35), 콜산; 및 데옥시콜산이다.
고리화 방법은 고리화 수지를 사용한 디설피드 다리 및 머리-꼬리 고리화의 형성을 통한 고리화를 포함한다. 고리화된 펩타이드는 안전성, 저항성에서 효소 감소 증가함을 포함, 그 결과 그것의 형태적으로 제한의 증가를 가질 수 있다. 특히 고리화는 N-말단 시스테인 기를 포함하는 비고리화 펩타이드에서 편리할 수 있다. 적합한 고리화 펩타이드는 4 내지 26 탄소 원자의 소수성 치환기이다, 바람직하게는 5 내지 19 탄소 원자. 적합한 지방 기를 포함하고, 머리-꼬리 고리화 구조의 모노머 및 이합체를 포함한다. 고리화 펩타이드는 하나 또는 그 이상 추가적인 잔기, 특히 디설피드 결합의 형성을 목적으로 하는 적합한 시스테인 또는 수지-기본 수지화의 목적으로 하는 적합한 곁사슬을 추가로 포함할 수 있다.
.
본 발명의 화합물은 화학식 I의 활성화된 구조일 수 있다. 본 발명의 활성화된 화합물은 증가한 용해성, 안전성, 및 폴리펩타이드의 순환 시간, 또는 감소한 면역원성과 같은 추가적인 이점을 제공할 수 있다(참고 U.S. Patent No. 4, 179,337)
본 발명의 화합물의 유도에 위한 화학 부위는 또한 폴리에필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카복시메틸셀루로오스, 덱스트란, 프로비닐 알콜 및 이와 같은 수용성 중합체로부터 선택할 수 있다. 본 발명의 화합물의 유도에 위한 화학 부위는 어느 분자량 일 수 있고, 분지형 또는 비분지형 일 수 있다. 다른 분자량의 중합체는 제공된 치료 프로파일로 좌우될 수도 있으며, 예를 들면 생물학적 활성, 처리를 제거, 항원성의 수준 또는 부족 및 폴리에틸렌 글리콜의 다른 효과로 알려진 치료용 단백질 또는 성형물에서 어느 하나로 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 대략 평균분자량이 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000, 또는 100,000 kDa 일 수 있다.
본 발명의 화합물의 염과 용매화물은 약제로 사용하기 적합하고, 상대 이온 또는 관련된 용매화물은 약학적으로 허용가능한 것이다. 그러나, 비-약학적으로 허용가능한 상대이온 또는 관련된 용매를 가지는 염 및 용매화물은 본 발명의 스코프(scope)하에서, 예를 들면 화학식 I 및 그것이 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물의 화합물 중간체로 사용할 수 있다.
본 발명에 적합한 염에 있어서 유기물 또는 무기물 또는 산 또는 염기와 같은 형태를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 염 첨가 산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질소, 구연산, 주석, 아세트산, 인산, 젖산, 피루브산, 아세트산, 트리플루오르아세트산, 숙신산, 과염소산, 개미산, 말레산, 클리콜산, 젖산, 살리실산, 옥살로아세트산, 메탄설폰산, 에탄설포산, p-톨루엔설폰산, 개미산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2 설폰산, 벤젠설폰산, 이셀트리온산의 형태로 포함한다. 수산과 같은 다른 산은 그것을 약학적으로 허용하지 않는 반면에 본 발명의 화합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 중간체로 사용할 수 있다.
염기를 포함한 약학적으로 허용가능한 염은 암모늄염, 예를 들면 포타슘 및 나트륨염을 포함한 염기, 예를 들면 칼슘 및 마그네슘 염인 알칼리토 금속염, 및 예를 들면 디클로로헥실아민 및 N-메틸-D-글루코민의 유기물 염기을 포함한 염을 포함한다.
유기화학의 당업계에서 알려진 많은 유기화합물이 반응된 또는 침전된 또는 결정화된 용매를 포함한 복합체 형태가 될 수 있는 것을 평가할 수 있다. 그러한 복합체가 "용매"라고 알려진 것이다. 예를 들면, 물을 포함한 복합체는 "수화물"이라고 알려져 있다. 본 발명은 발명의 화합물로 용매를 제공한다.
바람직한 일실시예에 있어서, 적어도 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 더 바람직하게는 적어도 12 시간의 혈액 순환에서 반감기를 가지는 화합물이다.
바람직하게는, 화합물은 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 더 바람직하게는 시험관 내 결합 분석에서 평가함으로 Gadd45β 및/또는 MKK7(및/또는 둘다 관련) 결합할 수 있는 능력의 99 %, 또는 가장 바람직하게는 적어도 섭씨 37에서 24시간 정상 혈청 배양에 따르는 경합 결합 분석 시험관 내 경합 결합 분석에 따라 섭씨 37에서 24시간 정상 혈청 배양을 평가함으로 Gadd45β와 결합하는 MKK7을 저해하는 능력의 99%을 함유한다.
대신에 또는 추가로, 화합물은 적어도 하기의 반응 중 하나를 가진다:
a) 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 억제 능력 또는 가장 바람직하게는 예에서 설명된 분석 조건 하에서 Gadd45β와 결합하는 MKK7의 99%이다.
b) 시험과 내에서 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 죽이는 능력 또는 가장 바람직하게는,
U266, KMS-11, NCI-H929, ARH-77, JJN-3, KMS-12, KMS-18, 및 KMS-27구성하는 기로부터 선택된 인간 골수종 세포 배양에서 세포의 99%, 또는 DLBCL 세포주 LY-3 배양, 또는 친-골수종 세포주 U937 배양, 또는 버킷 임파종 세포주 BJAB 배양, 또는 T-세포주 JURKAT 80%가 사멸되지 않은 조건 하에서 원발성 종양(예를 들면 원발성 다발성 골수종 종양 세포)의 배양.
일부 구현에 있어서 바람직하게는 화합물의 올리고펩타이드 핵심 부위, 화학식 I에서 A로 확인된 것은 기(group)로 이루어져 있는 것으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다.
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(L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Phe),
(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Phe),
(L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Phe),
(L-Tyr)-(L-Arg)-(L-Phe),
(D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Phe),
(D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Phe),
(D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Phe)
(D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Phe),
(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Tyr),
(D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Tyr),
(D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Tyr),
(D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Tyr),
(D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Tyr),
(D-Phe)-(D-Pro)-(D-Phe)
(D-Phe)-(D-Leu)-(D-Phe),
(D-Phe)-(D-Arg)-(D-Tyr)
(D-Phe)-(D-Glu)-(D-Tyr),
(D-Phe)-(D-Asp)-(D-Tyr),
(D-Phe)-(D-Pro)-(D-Tyr)
(D-Phe)-(D-Leu)-(D-Tyr)
(D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp)
(D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp),
(D-Phe)-(D-Leu)-(D-Trp),
(D-Phe)-(D-Arg)-(D-Trp),
(D-Phe)-(D-Giu)-(D-Trp),
(D-Phe)-(D-Asp)-(D-Trp),
(D-Phe)-(D-Pro)-(D-Trp) 및
(D-Phe)-(D-Leu)-(D-Trp),
다른 구현인 A 부위에는 기로 이루어져 있는 것으로부터 선택된다.
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-(L-Arg)-아닐린
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-(L-Arg)-아닐린
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-(D-Arg)-아닐린
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-(D-Arg)-아닐린
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-(L-Arg)-벤질아민
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-(L-Arg)-벤질아민
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-(D-Arg)-벤질아민
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-(D-Arg)-벤질아민
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(L-Arg)-아닐린
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(L-Arg)-아닐린
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(D-Arg)-아닐린
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(D-Arg)-아닐린
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(L-Arg)-벤질아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(L-Arg)- 벤질아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(D-Arg)- 벤질아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(D-Arg)- 벤질아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(L-Arg)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-(L-Arg)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(D-Arg)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-(D-Arg)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(L-Arg)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-(L-Arg)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(D-Arg)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-(D-Arg)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
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3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
p-히드록시벤조산-(L-Arg)-아닐린
p-히드록시벤조산-(D-Arg)-아닐린
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-아닐린
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-아닐린
p-히드록시벤조산-(L-Arg)-벤질아민
p-히드록시벤조산-(D-Arg)- 벤질아민
p-히드록시벤조산-(L-Glu)- 벤질아민
p-히드록시벤조산-(D-Glu)- 벤질아민
p-히드록시벤조산-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
p-히드록시벤조산-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
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p-히드록시벤조산-(L-Glu)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시페닐)아세트산-(L-Arg)-아닐린
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2-(4-히드록시페닐)아세트산-(L-Glu)-벤질아민
2-(4-히드록시페닐)아세트산-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시페닐)아세트산-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시페닐)아세트산-(L-Glu)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시페닐)아세트산-(D-Glu)-2-페닐-에틸-아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Arg)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Arg)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Arg)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Arg)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-2-페닐-에틸-아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-2-페닐-에틸-아민
대신에, 화학식 I A'로 표시된 부위는 하기에 개시된 기로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 올리고펩타이드 일 수 있다.
A' 부위 일부 구현에서는 잔기를 가지는 펩타이드 또는 펩토이드이다.
본 발명에서 Xaa1 - Xaa2 - Xaa3 - Xaa4:
Xaa1는 L-Tyr, D-Tyr, N-메틸-L-Tyr, N-메틸-D-Tyr, p-하이드로벤조산, 2-(4-하이드로-페닐) 아세트산, 3-(4-하이드로-페닐) 프로피온산 또는 아세틸
Xaa2는 L-Glu, D-Glu, L-Asp 또는 D-Asp, N-methyl-L-Glu, N-methyl-D-Glu, N- methyl-L-Asp, N-methyl-D-Asp, L-Pro, D-Pro, N-methyl-L-Pro, N-methyl-D- Pro, L-Leu, D-Leu, N-methyl-L-Leu, N-methyl-D-Leu, 또는 없거나
Xaa3는 L-Arg, D-Arg, L-His 또는 D-His, L-Lys, D-Lys, N-methyl-L-Arg, N- methyl-D-Arg, N-methyl-L-His, N-methyl-D-His, N-methyl-L-Lys, N-methyl-D- Lys, 또는 없거나; 및
Xaa4는 아닐린, 벤질아민, 2-페닐-에틸-아민, L-Phe 또는 D-Phe, N-메틸- L-Phe, N-메틸-D-Phe, L-Trp, D- , N-메틸-L-Trp, N-메틸-D-Trp.
Xaa2 또는 Xaa3 일부 구현에서는 없지만 Xaa2 또는 Xaa3 둘 다 아니다.
M은 인접한 펩타이드 또는 펩토이드 부위 사이의 아미드 결합을 간단하게 하는 것이다. 대신에, 이것은 스페이서(spacer)로 도입된 분자 부위 및 아미노 결합으로 인접한 펩타이드 또는 펩토이드 부위에 부착될 수 있다.
M은 추가적인 아미노산 일 수 있다. 바람직하게는 비-벌키 곁사슬로 부가적인 아미노산, 예를 들면 글리신, 알라닌 또는 세린 또는 임의로 유도체일 수 있다. 대신에, M은 비-아미노산 잔기, 예를 들면 ε-아미노카프로산, 3-아미노-프로피온산, 4-아미노-부트릭산 일 수 있다. 다른 잔기는 메틸-아민, 에틸-아민, 프로필-아민, 부틸-아민, 메틸렌, 디-메틸렌, 트리-메틸렌 또는 테트라 메틸렌일 수 있다. 모든 경우에서 M은 A'잔기 및 Gadd45β 및/또는 MMK7 사이에 결합을 실제적으로 간섭 그것의 존재가 아니 여야만 한다. 잠재적인 간섭 범위는 하기에서 밝혀진 시헌관내 결합 분석의 사용함으로 평가할 수 있다.
올리고머 및 다중체
발명의 첫 번째 측면에서, 화학식 I의 화합물의 분자 올리고머 또는 다중체(multimers), 상기 올리고머 또는 다중체는 화학식 I의 화합물의 둘 또는 그 이상의 분자를 포함하고 각각은 화학식 I의 화합물의 분자 내 존재하는 아미노기 또는 카복실산기와 스캐폴드 부위의 반대의 아미노기 또는 카르복실산 사이에 형성되는 아마이드 결합을 통해 공통의 스캐폴드 부위에 연결되고 상기 스캐폴드 부위는 적어도 2 아마이드 결합을 이룬다
보통 스캐폴드 측면에서 아미노산 리신 일 수 있다. 리신은 3-작용성 아미노산 이고, 아미노산으로 정의하는 작용기를 추가로 가지며, 청구항 측면에서 아미노기이다. 그러므로 3-작용성 천연은 펩타이드, 펩토이드 또는 유사한 분자의 세개의 아마이드 결합 형태를 허용할 수 있다. 3-작용성 아미노산으로 보통 스캐폴드를 포함한 D-α,β-디-아미노프로피온산(D-Dap), D-α,β-디-아미노프로피온산(L-Dap), L-α,β-디아미노부트릭산(L-Dab), L-α,β-디아미노부트릭산(L-Dab), 및 L-오르니틴, D-오르니틴을 사용할 수 있다. 3-작용성 비-표준 아미노산은 발명에 따라 역시 이용할 수 있다. 보통 스캐폴드는 펩타이드를 포함하고, 펩토이드 또는 그들의 서열 내에 3-작용성 아미노산을 포함하는 유사한 분자이며, 아마이드 결합 형태가 가능한 세개의 작용성 활성 말단 기를 가질 수 있다.
세포-투과성 펩타이드
화학식 I의 일부 구현에 있어서는 세포 투과성 펩타이드(CPP)와 결합한 것이다.
상기의 펩타이드는 하나 또는 그 이상 공유결합 또는 비-공유결합에 부착될 수 있다.
CPP는 각각 바로 통과할 수 있고, 예를 들면 CPP는 Tat 또는 유도체일 수 있으며, 안테나페디아 서열로부터 유도된 펩타이드이고, 또는 폴리-아기닌 태그, PTD-4펩타이드, 또는 작용 등가 세포-투과성 펩타이드일 수 있다( A, Schwarze SR, Mermelstein SJ, Waksman G, Dowdy SF 2001 Synthetic protein transduction domains: enhanced transduction potential in vitro and in vivo. Cancer Res 61:474-477).
대신에, CPP는 세포에 매개한 엔도사이토시스 또는 매개한 일시적 막관통 구조 형성 을 통하여 들어갈 수 있다. 세포 투과성 펩타이드에 관한 논의는, 독자는 Wagstaff et al. (2006). Curr. Med. Chem. 13: 171-1387와 하기의 논문에서 지시되어 있다.
본 발명의 화합물 일부 구현에 있어서, 나노-입자(예를 들면 나노-금)를 세포로 흡수를 증가시키기 위해서 결합할 수 있다.
형광성 염료, 태그 부위 및 지질화된 유도체
화학식 I의 화합물은 타겟 조직 또는 모니터 될 수 있는 세포로 투과하기 위한 형광성 염료에 결합할 수 있다. 형광선 염료는 아미노산 기(즉, 숙신이미드, 이소티오시아네이트, 하이드라진), 카르복실기(즉, 카보디이미드), 티올기(즉, 말레이미드 및 아세틸 브로미드)를 얻을 수 있고, 아자이드 기는 화학식 I의 화합물의 펩타이드 부위와 선택적으로 반응할 수 있다. 형광성 염료의 예를 들면 형광성 및 그것의 유도체, 로다민 및 그것의 유도체를 포함할 수 있다.
화학식 I의 화합물은 하기의 Chithrani DB, Mol Membr Biol. 2010 Oct 7 기재된 별개의 크기의 나노입자와 결합할 수 있고, (전자논문상태) 100nm 이상의 별개의 크기이며, 펩타이드 또는 그것의 유도체는 디설파이드 다리에서 부착될 수 있으며 씨토졸의 감소하는 환경에서 구체적인 감소를 허용할 수 있다. 또한, 펩타이드-나노입자결한한 아마이드, 에테르, 에스테르, 싸이오에스테르 결합은 이러한 화합물의 저독성을 가진 같은 목적으로 사용할 수 있다. 나노입자는 적당한 세포 흡수 뿐만 아니라 형광 기술로 세포 흡수의 시각화 및 정량화의 수단을 제공할 수 있다(전자논문상태, Schrand AM, Lin JB, Hens SC, Hussain SM., Nanoscale. 2010 Sep 27,).
태그 부위는 유사한 수단으로 부착할 수 있고 타겟하는 조직 및 세포에 성공을 관찰하기 위해 유사하게 허용할 수 있다.
본 발명에서 지방산 유도체는 화학식 I의 화합물 포함하고, 디설피드 결합에서 지방산과 연결하며 본 발명에서 세포 및 조직의 화합물의 전달에 사용될 수 있다. 지질화는 화합물의 흡수를 현저하게 증가하고 지질화 되지 않은 화합물과 상응하는 흡수율과 관련이 있을 뿐만 아니라, 혈액 및 조직에서 보유를 연장할 수 있다. 또한, 지질화된 유도체에서의 디설피드 연결은 세포에서 상대적으로 불안정하고 따라서 지방산 부위로부터 분자의 세포 내의 방출을 가능하게 할 수 있다. 적합한 지방-함유 부위는 4 내지 26 탄소 원자의 소수성 치환기이다, 바람직하게는 5 내지 19 탄소 원자이다. 적합한 지방 기를 포함하고, 제한하지 않으며 하기에서: 팔미틸 (C15H31), 오레일(C15H29), 스페아릴(C17H35), 콜산; 및 데옥시콜산이다.
이온 결합
본 발명의 화학식 I의 화합물은 금속의 또는 방사선의 이온에 작용하게 부착되는 것을 또한 포함한다. 상기의 부착은 이온이 킬레이트된 이온 킬레이트제(예를 들면 EDTA)의 결합을 일반적으로 할 수 있다. 하기의 수단으로 방사선 이온(예를 들면 99 mTc, 111In, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 90Y, 117 mSn, 153Sm, 186Re, 188Re, 및 177Lu)은 방사선치료로 목적 세포로 전달될 수 있다. 비-방사선의 금속 이온(예를 들면 가돌리늄 이온)은 NMR-탐지 마커로 사용할 수 있다.
염과 용매화물
본 발명의 화합물의 염과 용매화물은 약제로 사용하기 적합하고, 상대 이온 또는 관련된 용매화물은 약학적으로 허용가능한 것이다. 그러나, 비-약학적으로 허용가능한 상대이온 또는 관련된 용매를 가지는 염 및 용매화물은 본 발명의 스코프(scope)하에서, 예를 들면 화학식 I 및 그것이 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물의 화합물 중간체로 사용할 수 있다.
본 발명에 적합한 염에 있어서 유기물 또는 무기물 또는 산 또는 염기와 같은 형태를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 염 첨가 산은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질소, 구연산, 주석, 아세트산, 인산, 젖산, 피루브산, 아세트산, 트리플루오르아세트산, 숙신산, 과염소산, 개미산, 말레산, 클리콜산, 젖산, 살리실산, 옥살로아세트산, 메탄설폰산, 에탄설포산, p-톨루엔설폰산, 개미산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2 설폰산, 벤젠설폰산, 이셀트리온산 의 형태로 포함한다. 수산과 같은 다른 산은 그것을 약학적으로 허용하지 않는 반면에 본 발명의 화합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 중간체로 사용할 수 있다.
염기을 포함한 약학적으로 허용가능한 염은 암모늄염, 예를 들면 포타슘 및 나트륨염을 포함한 염기, 예를 들면 칼슘 및 마그네슘 염인 알칼리토 금속염, 및 예를 들면 디클로로헥실아민 및 N-메틸-D-글루코민의 유기물 염기을 포함한 염을 포함한다.
유기화학의 당업계에서 알려진 많은 유기화합물이 반응된 또는 침전된 또는 결정화된 용매를 포함한 복합체 형태가 될 수 있는 것을 평가할 수 있다. 그러한 복합체가 "용매"라고 알려진 것이다. 예를 들면, 물을 포함한 복합체는 "수화물"이라고 알려져 있다. 본 발명은 발명의 화합물로 용매를 제공한다.
화학식 I의 화합물의 바람직한 예가 하기에 주어져 있다. 아미노산 잔기의 L/D형에 있어서 구체화하지 않고, 두 형을 포함될 수 있다.
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파라-히드록시벤조산-Glu-Arg-아닐린
파라-히드록시벤조산-Glu-Arg-벤질아민
파라-히드록시벤조산-Glu-Arg-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시페닐)아세트산-Glu-Arg-아닐린
2-(4-히드록시페닐)아세트산-Glu-Arg-벤질아민
2-(4-히드록시페닐)아세트산-Glu-Arg-2-페닐-에틸-아민
3-(4-히드록시페닐)아세트산-Glu-Arg-3-아닐린
3-(4-히드록시페닐)아세트산-Glu-Arg-벤질아민
3-(4-히드록시페닐)아세트산-Glu-Arg-2-페닐-에틸-아민
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파라-히드록시벤조산-Asp-His-아닐린
파라-히드록시벤조산-Asp-His-벤질아민
파라-히드록시벤조산-Asp-His-3-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시페닐)아세트산-Asp-His-아닐린
2-(4-히드록시페닐)아세트산-Asp-His-벤질아민
2-(4-히드록시페닐)아세트산-Asp-His-2-페닐-에틸-아민
3-(4-히드록시페닐)아세트산-Asp-His-아닐린
3-(4-히드록시페닐)아세트산-Asp-His-벤질아민
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아세틸-Tyr-His-Phe-NH2,
H-Tyr-Arg-Phe-NH2,
H-Tyr-Arg-Tyr-NH2,
H-Tyr-Glu-Phe-NH2,
H-Tyr-Glu-Tyr-NH2,
H-Tyr- Asp-Phe-NH2 ,
H-Tyr-Asp-Tyr-NH2,
H-Tyr-Pro-Phe-NH2,
H-Tyr-Lys-Phe-NH2,
H-Tyr-His-Phe-NH2,
벤질옥시카보닐-Tyr-Arg-Phe-NH2,
벤질옥시카보닐-Tyr-Arg-Tyr-NH2,
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벤질옥시카보닐-Tyr-Glu-Tyr-NH2,
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벤질옥시카보닐-(N-메틸)Tyr-Glu-(N-메틸)Phe-NH2,'
벤질옥시카보닐-Tyr-(N-메틸)Arg-(N-메틸)Phe-NH2,
벤질옥시카보닐-(N-메틸)Tyr-(N-메틸)Arg-Phe-NH2,
벤질옥시카보닐-Tyr-Glu-(N-메틸)Phe-NH2,
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벤질옥시카보닐-(N-메틸)Tyr-Glu-Phe-NH2,
아세틸-(N-메틸)Tyr-(N-메틸)Arg-(N-메틸)Phe-NH2,
아세틸-(N-메틸)Tyr-Glu-(N-메틸)Phe-NH2,
아세틸-Tyr-(N-메틸)Arg-(N-메틸)Phe-NH2,
아세틸-(N-메틸)Tyr-(N-메틸)Arg-Phe-NH2,
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아세틸-(N-메틸)Tyr-Glu-Phe-NH2,
H-(N-메틸)Tyr-(N-메틸)Arg-(N-메틸)Phe-NH2,
H-(N-메틸)Tyr-Glu-(N-메틸)Phe-NH2,
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아세틸-Tyr-Glu-(β-homo)Phe-NH2,
아세틸-Tyr-(β-homo)Glu-Phe-NH2,
아세틸-(β-homo)Tyr-Glu-Phe-NH2,
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아세틸-Phe-Tyr-NH2,
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벤질옥시카보닐-Phe-Tyr-NH2,
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H-Phe-Tyr-NH2,
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또한 본 발명의 화합물의 화합물을 포함하는 예:
Figure pct00005
화합물 Al
Ac-Tyr-Phe-NH2
Figure pct00006
화합물 A3
Ac-Tyr-bAla-Phe-NH2
Figure pct00007
화합물 A6
Ac-Tyr-(6-아미노-카프로-
산)-Phe-NH2
화합물 A7
Ac-Tyr-Tyr-NH2
화합물 A8
Ac-Phe-Tyr-NH2
화합물 A9
Ac-Phe-Arg-Phe-NH2
Figure pct00008
화합물 B2
Ac-Tyr-Lys-Phe-NH2
Figure pct00009

화합물 B13
Ac-Tyr-Pro-Phe-NH2
Figure pct00010
화합물 B 16
Ac-Tyr-His-Phe-NH2
화합물 H1
L-3,3 -디페닐-알라닌
화합물 H2
L-H-3(4-피리딜)-알라닌
화합물 H3
L-H-4-히드록시-페닐-글리신
화합물 H4
L-2-아미노-4-페닐-부틸릭산
화합물 H5
L-페닐-글리신
화합물 H6
L-H-4-히드록시-페닐-글리신
화합물 H7
L-호모페닐알라닌
화합물 H8
L-3-(2-푸릴)-아닐린
화합물 H9
L-3-(4-퀴노릴)-알라닌
화합물 H10
L-니프틸-알라닌
Figure pct00011
화합물 11
Ac-Tyr-Arg-(N-Me)Phe-NH2
Figure pct00012
화합물 12
Ac-Tyr-(N-Me)Arg-Phe-H2
Figure pct00013
화합물 13
Ac-(N-Me)Tyr-Arg-Phe-NH2
Figure pct00014
화합물 14
Ac-(N-Me)Tyr-(N-Me)Arg-(N-Me)Phe-NH2
Figure pct00015
화합물 15
Ac-(N-Me)Tyr-Arg-(N-Me)Phe-NH2
Figure pct00016
화합물 Ol
Ac-Phe-Arg-Tyr-NH2
Figure pct00017
화합물 02
Ac-Phe-Arg-Phe-NH2
Figure pct00018
화합물 03
Ac-Tyr-Arg-Tyr-NH2
Figure pct00019
화합물 05
H-Phe-His-Tyr-NH2
Figure pct00020
화합물 07
H-Phe-His-Phe-NH2
화합물 08
H-Phe-Arg-Tyr-NH2
화합물 09
H-Phe-Arg-Phe-NH2
화합물 O10
H-Tyr-Arg-Tyr-NH2
화합물 PI
4-(히드록실)-페닐-아세트산-Arg-3-페닐-에틸아민
화합물 P2
4-(히드록실)-페닐-아세트산-His-3-페닐-에틸-아민
화합물 P3
4-(히드록실)-페닐-아세트산-Glu-3-페닐-에틸-아민
Figure pct00021
화합물 Gl
싸이크로(Tyr-Arg-Phe)
화합물 G2
싸이크로(Phe-Arg-Tyr)
Figure pct00022
화합물 G3
싸이크로(Tyr-Phe)
및
화합물 Nl
나노골드-Tyr-Arg-Phe-NH2
본 발명의 화합물 일실시예에 있어서 구체적으로 이에 밝히고, 예를 포함하면, 바람직한 화합물 또는 화학식 I의 A' 부위의 구현에 바람직하다. 본 발명은 다중체 영역 또는 명시적으로 이에 밝혀진 구체적인 화합물을 고려해야한다. 예를 들면 본 발명은 3 또는 4 잔기 펩타이드 또는 이에 상응하는 화학식 I의 화합물의 잔기 A, A', A'', A''' 또는 A'''' 밝혀진 구체적인 화합물 펩토이드 잔기를 고려해야한다.
약학적 조성물
발명의 두 번째 측면에 있어서, 발명의 첫 번째 측면에 있어서 화합물 및 약학적으로 허용되는 운반체로 이루어진 약학적 조성물을 제공한다.
유효성분은 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 바람직하게는 약학적 제제 또는 조성물로 나타낸다. 따라서, 본 발명은 화학식 I의 화합물로 이루어진 약학적 제제 또는 이의 유도체, 또는 이의 염과 용매화물, 하기에 정의된 및 약학적으로 허용되는 운반체를 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 하기에 설명된 약학적 제제의 형태를 취할 수 있다.
본 발명에서 약학적 제제는 적합한 경구, 비경구(피하 지방, 피 내, 근육 내, 정맥 내 및 관절광 내), 흡입제(미터 용량 가압 에어로졸, 에뷸라이저 또는 취입기의 다양한 종류의 장치를 발생하는 미립자 또는 스프레이를 포함하고), 직장 및 국소(진피, 경피, 경점막, 협점막, 안구내, 및 혀밑) 투여를 포함하고, 그러나 가장 적합한 경로는 예를 들면, 수여자의 병태 및 장애 의존할 수 있다.
제제는 편리한 제형으로 존재할 수 있고 제약 업계에 널리 알려진 방법 중 하나로 제조될 수 있다. 모든 방법은 하나 또는 그 이상 부제를 구성하는 운반체와 관련된 유효성분을 가지는 단계를 포함한다. 일반적인 제제는 유효성분과 액상 운반체 또는 미세하게 나눈 고형 운반체 또는 둘 다 및 그때, 만약 필요하다면, 필요한 제제에 제품의 형태로 균일하게 및 충분하게 제공된다.
본 발명에서 경구 투여로 적합한 제제는 개별 유니드(units) 예로 각각이 미리 결정된 유효성분을 포함하는 캡술, 캅셀, 정제; 분말 또는 과립; 수성 또는 비수성에서 용액 또는 현탁액으로; 또는 수중유형 액정성 유화물 또는 유중수형 액정성 유화물을 나타낼 수 있다. 유효성분은 또한 환, 활제, 페이스트(paste)를 나타낼 수 있다. 다양하게 약학적으로 허용되는 운반체 및 그것의 제제는 표준 제제 논문, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. See also Wang, Y. J. and Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S, 1988 에 설명되어 있다.
정제는 하나 또는 그 이상 부제를 추가로 압축 또는 성형으로 만들어질 수 있다. 압축된 정제는 분말 또는 과립, 추가로 바인더, 윤활제, 희석제, 윤활, 표면 활성 또는 분산제와 같은 자유-유동성 형태에 유효성분을 적합한 기계로 압축하는 것에 의해 준비할 수 있다. 성형 된 정제는 액체 희석제의 보습 분말 화합물의 혼합에 적합한 기계로 성형하여 만들어질 수 있다. 정제는 추가로 부착 또는 스코어(scored) 및 더디게 또는 세심하게 이의 유효성분의 방출을 제공하기 위하여 제형화될 수 있다. 본 발명의 화합물은 예를 들면 즉각적인 방출 또는 길어진 방출에 형태로 투여에 적합 할 수 있다. 즉각적인 방출 또는 길어진 방출은 본 발명의 화합물을 이루는 적합한 약학적 조성물 사용으로 할 수 있고, 또는, 특히 길어진 방출의 경우 피하 이식제 또는 삼투 펌프와 같은 장치로 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 리포손 내로 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 조성물은 예를 들면 주사 투여용으로 피하 투여에 적합할 수 있다.
경구 투여로 바람직한 조성물은 예를 들면 대부분을 전달하는 미세결정 셀루로오스, 침강 방지제로 알긴산 또는 알긴산 나트륨(sodium alginate), 변형 증징제로 메틸셀루로오스, 및 당업계에서 알려진 바와 같이 감미제 또는 향미료를 포함할 수 있는 현탁액으로 제한한다; 및 즉각적인 방출 제제는 예를 들면 미세결정 셀루로오스, 인산이칼슘(dicalcium phosphate), 전분, 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 및/또는 유당 및/또는 당업계에서 알려진 바와 같이 부형제, 바인더, 익스텐더(extenders), 정제분해물질(disintegrants), 희석제 및 윤할제를 포함할 수 있다. 화학식 I의 화합물 또는 변이체, 유도체, 이의 염 또는 용매화물 설하용 및/또는 구강 투여로 결구를 통하여 전달될 수 있다. 성형 된 정제는 압축된 정제 또는 동결 건조 정제는 사용할 수 있는 바람직한 형태이다. 바람직한 조성물은 마니톨, 유당, 스크로스 및/ 또는 사이트로텍스트린과 같은 고속 용해 희석제로써의 본 발명의 화합물을 정제하는 것을 포함한다. 또한 이러한 제제를 포함하는 것은 셀루로오스(아비셀) 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols,PEG)와 같은 고분자량 부형제일 수 있다. 이러한 제제는 점막 유착 도와주는 하이드록시 프로필 셀룰로오스(HPC), 하이드록시 프로필 메틸 셀루로오스(HPMC), 소디움 카르복실 메틸 셀루로오스(SCMC), 말레산 무수물 중합체(예를 들어 Gantrez)와 같은 부형제, 및 폴리아크릴 중합체와 같은 조절제를 포함할 수 있다. 또한, 윤활제, 유동화제, 향신료, 착색제 및 안정제를 제조 및 사용의 편이를 위해 첨가할 수 있다.
비경구 제제는 산화 방지제, 완충제, 세균발육제지제 및 목적한 수혜자의 혈액과 함께 등장성의 제형을 만드는 용매; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수용성 및 비-수용성 무균 주사액을 포함할 수 있는 수용성 및 비-수용성 무균액을 포함한다. 제제는 단위-투약 또는 단위-투약 용기, 예를 들면 밀패된 앰플 및 바이알을 표시할 수 있고, 예를 들면 식염수 또는 주사용 증류수와 같이 즉시 사용 전에 무균 액정 운반체를 첨가하는 것을 요구하는 동결-건조(냉동 건조(lyophilised))조건에서 저장할 수 있다. 즉각적인 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기술된 종류의 무균 분말, 과립 및 정제로 제조될 수 있다. 비경구 투여로 바람직한 조성물은 주사용 식염수 또는 함유 가능한 현탁액을 포함한다. 예를 들면, 적합한 무독성, 마니톨, 1,3-부탄디올, 물, 링거, 생리 식염수와 같은 비경구로 허용가능한 희석제 또는 용제, 또는 합성 모노- 또는 디글라세이드, 올레산 또는 크레머포머를 포함하는 지방산을 포함하는 적합한 분산제 또는 웨팅제 및 현탁제. 수용성 운반체는 예를 들면 pH 약 3.0부터 약 8.0까지 등장 완충 용액 , 바람직하게는 pH 약 3.5부터 약 7.4까지, 예를 들면 3.5에서 6.0까지, 예를 들면 3.5에서 약 5.0까지. 사용하는 완충액은 구연산나트륨-구연산 및 인산나트륨-인산, 및 아세트산 완충액을 포함한다. 바람직하게는 조성물은 산화제 및 화학식 I의 화합물 및 관련된 분자가 유해하다고 알려져 있는 다른 화합물은 포함하지 않는다. 예를 들면 부형제는 인간 혈청 알부민 및 혈장 진단과 같은 다른 단백질을 포함할 수 있다. 만약 원한다면, 약학적 조성물은 웨팅 또는 유화제, 보존제와 같은 미량의 비-독성 보존 물질, 및 예를 들면 아세트산 나트륨 또는 소비르탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate)와 같은 pH 완충제를 포함할 수 있다.
바람직한 비강분무제 또는 흡입 투약을 위한 조성물은 예를 들면 벤질 알코올 또는 또 다른 적합한 보존제, 생체이용률 증가시키는 흡수 촉진제, 및/또는 당업계에서 알려진 바와 같은 가용제 또는 분산제를 포함할 수 있는 수용액 속에 셀라인(saline)을 포함한다. 본 발명의 화합물의 비강분무제 또는 흡입 투약을 위한 조성물 편리함에 있어서는 적합한 고압 가스 예를 들어, 디클로로디플루오르-메탄, 트리클로로플루오르메탄, 디클로로테트라플루오르에탄, 탄산 가스 또는 적합한 가스를 사용함으로 압축된 팩 또는 분무기로부터 분무제 스프레이 표시 형태로 전달될 수 있다. 압축된 분무제 단위 투여의 경우에서 밸브를 계량된 양의 전달을 제공함으로 측정될 수 있다. 캡슐 및 카트리지의 예를 들면, 흡입기 또는 취분기로 하용하기 위한 젤라틴은 화합물의 분말 혼합 및 예를 들면 유당 또는 녹말 적합한 분말제를 포함하기 위해 정제될 수 있다. 비-제한 예의 구체적인 한가지에서 본 발명의 화합물은 또한 자동 조절기로 알려진 에어졸 어뎁터를 통하여 계량 투여 밸브로부터 에어졸로 투여되었다. 추가적으로, 안정제 역시 포함되고, 및/또는 폐 심부 전달을 위한 다공질 입자가 포함된다(예를 들면, 참고 U.S. Patent No. 6,447,743)
경구 투여를 위한 제제는 코코아 버터, 합성글리세라이드 에스테르 또는 폴리에틸렌 글리콜와 같은 보통의 운반체로 관장제 또는 좌약으로 나타내어질 수 있다. 이러한 운반체는 통상적으로 상온에서 고체이지만 약물 방출은 하기 위한 직장의 구멍에서는 액상 및/또는 용해된다.
구강에서 예를 들면 협면으로 또는 설하로 국소 투여를 위한 제제는 수크로스(sucrose) 및 아카시아(acacia) 또는 트라가칸드(tragacanth)와 같은 맛이 나는 근거의 유효성분을 포함하는 정제, 및 젤라틴(gelatin) 및 글리세린(glycerine) 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 근거에 유효성분을 포함하는 패스틸(pastill)를 포함한다. 국소 투여를 위한 바람직한 조성물은 플라스티 베이스(Plastibase)와 같은 국소 운반체를 포함한다(광유겔화 된 폴리에틸렌).
바람직한 단위 투여 제제는 이전에 열거되었거나 또는 이의 유효성분으로 적합한 분획물의 효과적인 투약을 포함한다.
특히 상기에 언급한 성분을 첨가해는 것을 이해할 필요가 있다. 본 발명의 제제는 논의가 되는 제제의 종류에 대하여 당업자에게 자명한 물질을 포함하며 예를 들면 경구 투여에 적합한 향신료를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 방출-제어형으로 적합하게 투여될 수 있다. 본 발명의 방출제어형으로 적합한 예는 합한 폴리머 물질을 포함하며 예를 들면 성형품 형태에서 반-투과성 방출 제어형, 예를 들면, 필름, 또는 마이크로 캡슐: 적합한 친수성 물질, 예를 들면 에멀젼 속에 허용가능한 오일; 또는 이온 치환 수지; 예를 들면 불용성 염과 같은 본 발명의 불용성 유도체. 방출 제어형은 경구; 직장 내; 비경구; 질내; 복막 내; 국소, 예를 들면 분말, 연고, 겔, 점적 약 또는 경피 패치; 구강: 또는 경구 또는 코 분무로 투여될 수 있다.
투여용 제제는 본 발명의 조절 방출로 주어지기 위해 적합하게 제조될 수 있다. 예를 들면 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 다당 젤 타입 및/또는 생체적합성 중합체, 양쪽성 폴리머, 화학식 I의 화합물 입자의 계면 성질을 변경하게 할 수 있는 약제일 수 있다. 이러한 조성물은 유효 성분의 조절 방출을 허용하는 생체 친화성 특징을 드러낸다. 참조 U.S. Patent No. 5,700,486.
본 발명의 화합물은 펌프의 방법 (참조 Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989) 또는 예를 들면 작은 펌프를 사용함으로 연속 피하 침체로 전달될 수 있다. 또한 수액용기용으로 쓸 수 있다. 개시의 다른 측면에 있어서 본 발명의 화합물은 예를 들면 in U.S. Patent No. 6,436,091; U.S. Patent No. 5,939,380; U.S. Patent No. 5,993,414에서 기술된 주입식 펌프의 방법으로 전달될 수 있다.
이식 가능한 약물 주입 장치는 환자에게 지속적 및 장기 복용 또는 약물의 주입 또는 다른 치료제를 제공하기 위해 사용한다. 필수적으로 이와 같은 장치는 능동 또는 수동 둘 다 분류될 수 있다. 본 발명의 화합물은 저장소 제제로 제조될 수 있다. 상기 장기 지속 저장소 제제는 예를 들면 근육 내 또는 피하 내로 주입; 또는 근육 내 주사로 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 화합물은 예를 들면 에멀젼 속에 허용가능한 오일에 적합한 고분자 또는 소수성 물질; 또는 이온 치환 수지; 예를 들면 불용성 염과 같은 본 발명의 불용성 유도체를 제조될 수 있다.
본 발명의 치료 유효량은 단일 투약, 한 회분 투약 또는 초가 투여된 투여량으로 투여 될 수 있다. 따라서, 투여량에서 본 발명의 화합물의 한 회분 투여를 본 발명의 화합물이 아닌 시한은 개체에 투여됨에 따라서, 두 회분 투여에 따라서 제공한다. 구체적으로, 무-제한 예는 본 발명의 투여량은 하루 동안, 한 주 동안, 한 달 동안 투여될 수 있다.
하나의 구현에서 본 발명의 화합물의 치료 유효량은 또 다른 제제의 치료 유효량을 예를 들면 항-신생물 화학치료제(예를 들면 탈리도마이드, 텍사메타손, 보르테조입, 레나리도미드, 메팔란, 시스플라티움, 독소루비신, 5-프루오로우라실 외) 또는 빈혈 치료제(예를 들면 에리스포이에틴), 골절 보호제(예를 들면 파미드로네이트 또는 졸레드론산과 같은 비스포스포네이트)로 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물의 치료 유효량은 분자 활용, 치료 받는 개체, 혹독 및 고통의 종류 및 투여의 방식 및 경로에 의존할 수 있다.
본 발명의 세번 째 측면에 있어서, 본 발명의 첫번 째 또는 두번 째 측면에 있어서 화합물의 투여를 포함하는 장애 또는 질병의 치료 방법 또는 발명의 첫번 째 치료 측면에 있어서 화합물의 치료 유효량을 투여하는 발명의 두번 째 측면에 있어서 약학적 조성물 또는 그것이 필요한 개체에 발명의 두번 째 측면에 있어서 약학적 조성물을 제공한다.
장애 또는 질병
본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은 비정상 증가 발현 또는 Gadd45β의 활성을 특징으로 하거나 NF-κB 경로의 비 정상 활성을 특징으로하며 Gadd45β의 활성을 억제하는 세포예정사의 유도로 치료할 수 있는 질병 및 장애의 치료 및 예방에 적합할 수 있다.
치료 또는 예방을 할 수 있는 질병은 암을 포함한다. 바람직하게는 상기 암은 정상 건강 세포 또는 조직에 비해 Gadd45β의 발현이 증가 된 암이다. 암은 Gadd45β의 비정상적으로 높은 수준의 발현으로 알려져 있고 따라서 본 발명의 화합물의 적합한 치료는 다발성 골수종, 미만성 B-세포 임파종, 버킷 임파종, 전단구 백혈병 및 다른 백혈병뿐만 아니라 간세포 성종, 방광암, 뇌 및 중추신경계 암, 유방암, 머리 및 목 암, 폐암, 및 전립선암과 같은 고형 종양을 포함한다. 일부 구현에 있어서 암은 그것의 생존의 위해 NF-κB에 의존하는 암이다. 구체적으로 생존의 위해 NF-κB에 의존하는 상기 암은 치료 및 예방을 하기 위해 적합한 다발성 골수종, 외투막 세포 림프종, 점막연관림프조직(MALT lymphoma), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 미만성 거대 B세포 림프종, 버켓 림프종, 전골수구 백혈병, 골수 이형성 증후군, 성인 T 세포 백혈병(HTLV-1), 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈명, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 대장염 연관암, 대장암, 간암(예를 들면 Hepatocellular carcinoma 간세포암, 자궁경부암, 신장암, 폐암, 식도암, 위암, 후두암, 전립선암, 췌장암, 갑상선암, 부갑상선암, 방광암, 난소암, 유방암, 흑색종, 기관지 선종, 편평세포암(두경부), 구강암, 자궁 내막암, 망막아세포증, 성상 세포종 및 교모 세포종을 포함한다.
일부 바람직한 구현에 있어서 암은 다발성 골수종이다. 일부 구현에서 개체로부터 취해진 세포는(예를 들면 개체의 암에서 생검을 하고 또는 암에서 방출될 수 있는 혈액 또는 체액으로부터 추출함) NF-κB 활성을 확인할 수 있고 및/또는 본 발명의 방법, 화합물 및 조성물로 치료를 하기 위해 암의 적합성을 측정하기 위해 Gadd45β 활성을 증가시킬 수 있다.
치료 또는 예방에 적합한 다른 질병 및 질환은 자가 면역 질환(예를 들면 다발성 신경염, 루푸스, 제 1형 당뇨병), 알레르기성 질환(예를 들면 천식), 만성 염증 질환(예를 들면 염증성 장질환, 루마티스 관절염, 건선, 궤양성 대장염), 유전적 질환(예를 들면 색소실소증, 면역 결핍 및 원주세포종증을 가진 무한성 외배엽 이형성증, 허혈 및 혈관 질병(예를 들면 죽상동맥경화증, 협심증, 뇌졸증, 심경 근색), 및 퇴행성 질환(알츠하이머 및 파킨슨 질환), 간섬유화 및 간경변와 같은 간 질환을 포함한다.
많은 질환 및 장애가 NF-κβ의 활성에 의존하고 있다. 게다가 실제적으로 알려진 모든 인간 질병 또는 장애는 염증에 의존하는 병인론을 가지고 그러므로 NF-κβ에 관련되어 있다. 이러한 작용은 염증 반응의 주요 스위치(master switch)로서, 사이토카인, 수용체, 전사인자, 케모카인, 전염증성 효소, 및 염증을 시작하고 유지할 수 있는 전-생존 인자(pro-survival factors)를 인코딩하는 200개 이상의 유전자 배열의 발현과 함께 일어난다. 본 발명의 화합물은 염증에 있어서의 NF-κβ의 별개의 전-생존 활성을 억제한다. 그러므로, 이 화합물들로 치료될 수 있는 질병 및 장애는 통상적인 만성 염증성 질환(예를 들면, 염증성 장 질환, 류마티스 관절염 및 건서)을 제외하고, 주요 염증성 구성성분에 의존하는 질환 및 장애를 포함한다. 이러한 질환의 예는 항염증성 제제 또는 NF-κβ 억제제로 치료될 수 있는 질환 또는, NF-κβ억제제로 치료하기 적합한 것으로 제안된 질환, 본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 질환이며, 이것은 :
1. 호흡기계: 기관지성(bronchial), 알러지성(allergic), 내재성(intrinsic), 외재성(extrinsic), 운동-유도(exercise-induced), 약물 유도(drug-induced)(아스피린 및 NASID-유도) 천식(asthma) 및, 간헐적인 또는 지속적인 및 모든 심각도, 및 기도 과-반응성의 그외 원인을 포함하는 먼지-유도 천식(dust-induced asthma)을 포함하는 기도 폐쇄성 질환(obstructive disease of the airways); 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD); 감염성 및 호산구성 기관지염(eosinophilic bronchitis); 폐기종(emphysema); 기관지확장증(bronchiectasis); 낭포성 섬유증(cysitic fibrosis); 유육종증(sarcoidosis); 농부폐(farmer's lung) 및 관련된 질환; 과민감성 폐렴(hypersensitivity pneumonitis); 원인불명의 섬유 폐포염(crpytogenic fibrosing alveolitis), 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonias), 항함요법 및 만성 감염에 의한 섬유증, 결핵(tuberculosis) 및 아스퍼질러스증(aspergillosis) 및 다른 진균 감염을 포함하는 만성 감염에 의한 섬유증 및 항암요법에 의한 섬유증을 포함하는 폐 섬유증; 폐 이식의 합병증; 폐 맥관 구조(lung vasculature)의 맥관성 및 혈전성 장애, 및 폐 고혈압(pulmonary hypertension); 기도의 염증성 및 분비성 상태와 연관된 만성 기침의 치료 및 의원성 기침(iatrogenic cough)을 포함하는 진해(antitussive) 활성; 약물성 비염(rhinitis medicamentosa), 혈관운동신경성 비염(vasomotor rhinitis)을 포함하는 급성 및 만성 비염; 신경성 비염(rhinitis nervosa)(건초열)을 포함하는 지속적인 또는 계절성 알러지성 비염; 비용(nasal polyposis); 통상적인 감기, 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus), 독감, 코로나바이러스(중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 포함) 또는 아데노바이러스를 포함하는 급성 바이러스 감염; 또는 호산구성 식도염(eosinophilic esophagitis);
2. 골격 및 관절: 원발성 및 속발성 골관절염(osteoarthritis/osteoarthrosis), 예를 들면 선천성 고관절 이형성(congenital hip dysplasia)와 연관된 또는 이를 포함하는 관절염; 경추 및 요추 척추염, 및 요통(low back pain) 및 경부통(neck pain); 골다공증(osteoporosis); 류마티스성 관절염 및 스틸병(Still's disease); 강직성 척추여(ankylosing spondylitis), 건성관절염(psoriatic arthritis), 반응성 관절염(reactive arthritis) 및 미분화 척추관절증을 포함하는 혈청반응음성의 척추관절증(seronegative spondyloarthropathies); 포트병(potts' disease) 및 폰셋 증후군(poncet's syndrome)을 포함하는 패혈성 관절염(septic arthritis) 및 그 외 감염-관련 관절 질병 및 결핵과 같은 골격질환; 요산염 통품(urate gout), 칼슘 파이로포스페이트 침착증(calcium pyrophosphate deposition disease), 칼슘 아파타이트(calcium apatite) 관련 건(tendon), 활액낭(bursal), 활액(synovial) 염증을 포함하는 급성 및 만성 크리스탈-유도 활막염(crysta-induced synovitis); 베체트병(Behcet's disease); 원발성 및 속발성 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome); 전신성 경화증(systemic sclerosis) 및 제한형 경피증(limited scleroderma); 전신성 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus), 혼합형 결합 조직 질병(mixed connective tissue disease) 및 미분화 결합 조직 질병(undifferentiated connective tissue disease); 피부근염(dermatomyositis) 및 다발성근염(polymyositis)를 포함하는 염증성 근질환(inflammatory myopathies); 류마티스성 다발성 근육통(polymalgia rheumatica); 어떠한 관절 부위의 특발성 염증성 관절염 및 이와 관련된 증후군, 및 류마티스성 열(rheumatic fever) 및 이의 전신적 합병증을 포함하는 소아관절염(juvenile arthritis); 대형 세포 혈관염(giant cell arteritis), 타카야수 혈관염(Takayasu's arteritis), 처그스트라우스 증후군(chrug-strauss syndrome), 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 현미경적 다발성 동맥염(microscopic polyarteritis), 및 바이러스 감염, 과민감성 반응, 크리오글로불린(cryoglobulins), 및 파라단백질(paraprotein)과 관련된 혈관염을 포함하는 혈관염; 요통(low back pain); 가족성 지중해열(familial midterranean fever), 머클-웰스 증후군(muckle-wells syndrome), 및 가족성 동면성열(familial hibernian fever), 키쿠치 병(Kikuchi disease); 약물 유도 관절통(drug-induced arthalgias), 건염(tendonititides) 및 근육병(myopathies);
3. 부상(예를 들면 스포츠 활동에 의한 부상) 또는 질병에 의한 통증 및 근골격 질환의 결합 조직 재배치; 관절염(예를 들면 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍 또는 크리스탈 관절염), 그 외 관절 질병(예를 들면 퇴행성 추간판 질환(intervertebral disc degeneration), 또는 퇴행성 턱관절 질환(temporomandibular joint degeneration)), 골 재형성 질환(bone remodelling disease)(예를 들면 골다공증, 파제트 병(Paget's disease) 또는 골괴사), 다발성 연골염(polychondritis), 경피증(scleroderma), 혼합형 결합 조직 장애(mixed connective tissue disorder), 척추관절병증(spondyloarthropathies) 또는 치주질환(periodontal disease)(예를 들면 치주염(periodontitis));
4. 피부: 건선(psoriasis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis) 또는 그 외 습진성 피부염(eczematous dermatoses), 및 지연형 과민반응(delayed-type hypersensitivity reactions); 파이토 및 광선 피부염(phyto- and photodermatitis); 지루성피부염(seborrhoeic dermatitis), 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis), 편평태선(lichen planus), 경화태선(lichen sclerosus et atrophica), 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 피부유육종(skin sarcoid), 원판상홍반성 루푸스(discoid lupus erythematousus), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 수포성표피박리증(dpedermolysis bullosa), 피부묘기증(utricaria), 혈관신경부종(angioedema), 혈관염, 중독성홍반(toxic erythema), 호산구성 피부혈관염(cutaneous eosinophilias), 원형탈모증(alopecia areata), 남성형 대머리(male-pattern baldness), 스위트증후군(sweet's syndrome), 웨버-크리스티안 증후군(weber-christian syndrome), 다형 홍반(erythema multiforme); 감염성 및 비 감염성 봉와직염(cellulitis); 피부림프종(cutaenous lymphoma), 비-흑색종 피부암(non-melanoma skin cancer) 및 그 외 이형성 병소(dysplastic lesions); 고정된 약진(fixed drug eruption)을 포함하는 약물 유도 질환;
5. 눈: 안검염(blepharitis); 지속적인 또는 봄의 알러지성 결막염을 포함하는 결막염(conjunctivitis); 홍채염(iritis); 전안방성 및 후안방성 포도막염; 맥락막염(choroiditis); 자가면역; 망막에 영향을 주는 퇴행성 또는 염증성 장애; 자율신경성 안염을 포함하는 안염(ophthalmitis); 유육육종(srcoidosis); 바이러스, 진균 및 세균을 포함하는 감염;
6. 위장관계: 설염(glossitis), 치은염(gingivitis), 치근막염(periodontitis); 역류성 식도염을 포함하는 식도염(oesophagitis); 호산구성 위장염(eosinophici gastro-enteritis), 비만세포증(mastocytosis), 크로병(crohn's disease), 궤양성 대장염을 포함하는 대장염, 직장항문염, 항문소양증; 만성소화장애증(coeliac disease), 자극성 장 증후군(irritable bowel syndrome), 및 장과 관련없는 영향을 가지는 음식-관련 알러지(예를 들면, 편두통, 비염 또는 습진);
7. 복부: 자가면역, 알코올성 및 바이러스성을 포함하는 간염; 간의 섬유증 및 간경변; 담낭염(cholecystitis); 급성 및 만성의 췌장염(pancreatitis);
8. 비뇨생식기: 간질성 및 사구체신염(glomerulonephritis)을 포함하는 신장염(nephritis); 신증후군(nephrotic syndrome); 급성 및 만성(간질성) 방광염을 포함하는 방광염(cystitis) 및 후너 궤양(Hunner's ulcer); 급성 및 만성 요도염(urethritis), 전립선염(prosatitis), 부고환염(epididymitis), 난소염(oophoritis) 및 난관염(salpingitis); 외음-질염(vulvo-vaginitis); 페로니씨병(peryronie's disease); 발기부전(erectile dysfunction)(남성 및 여성);
9. 동종이식 거부(allograft rejection): 예를 들면, 신장, 심장, 간, 폐, 골수, 피부 또는 각막 이식 후의 급성 및 만성의 동종이식 거부, 수혈 후의 동종이식 거부 및 만성 이식편대 숙주질환(chronic graft versus host disease);
10. 중추신경계(CNS): 알츠하이머 질환 및 크로이츠-펠트 야콥병(CJD) 및 신변종 크로이츠-펠트 야콥병(nvCJD)을 포함하는 그 외 치매성 장애; 다발성 경화증 및 그 외 탈수초성 질환(demyelinating syndrome); 대뇌 죽상경화증(cerebral atherosclerosis) 및 혈관염(vaculitis); 측두 동맥염(temporal arteritis); 중증 근무력증(myasthenia gravis); 내장통(visceral pain), 두통, 편두통, 삼차 신경통, 비전형 안면통(atypical facial pain), 관절 및 골격통, 암 및 종양 침습에 의한 통증, 및 당뇨병, 간 후성, HIV-연관 신경병증을 포함하는 신경병증 통증 증후군(neuropathic pain syndrome) 급성 및 만성 통증(급성, 간헐성 또는 지속성, 중추기원 또는 말초 기원); 신경유육육종(neurosarcoidosis); 악성, 감염성 또는 자가면역 과정의 중추 및 말초 신경계 합병증;
11. 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroditis), 그래이브병(Gragve's disease), 에디슨병(addison's disease), 당뇨병, 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopanic purpura), 호산구성 근막염(eosinophilic fasciitis), 고-IgE 증후군(hyper-IgE syndrome), 항인지질항체증후군(antiphospholipid syndrome);을 포함하는 그 외 자가 면역 및 알러지성 장애;
12. 염증성 또는 면역 성분과 관련된 그 외 장애; 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 나병(leprosy), 쎄자리 증후군(Sezary syndrome), 및 방종양성증후군(paraneoplastic syndromes)을 포함;
13. 심혈관계: 관상 및 말초 순환에 영향을 주는 동맥경화증; 심막염(pericarditis); 심근염(myocarditis), 심근 유육종을 포함하는 염증성 및 자가면역 심근병증; 허혈성 재관류 손상; 심내막염, 판막염, 및 염증성(예를 들면 매독성)을 포함하는 대동맥염; 혈관염; 정맥염 및 혈전증을 포함하는, 심부정맥 혈전증 및 하지정맥류를 포함하는 근위 및 말초 정맥의 장애;
14. 위장관계; 만성소화장애증(coeliac disease), 직장항문염, 호산구성 위장염(eosinophici gastro-enteritis), 비만세포증(mastocytosis), 크론병(crohn's disease), 궤양성 대장염, 현미경적 장염, 불확정 대장염(indeterminate colitis), 자극성 장 증후군(irritable bowel syndrome), 비염증성 설사, 장과 관련없는 영향을 가지는 음식-관련 알러지(예를 들면, 편두통, 비염 또는 습진)를 포함한다.
본 발명의 네 번째 측면에 있어서, 본 발명의 첫 번째 측면에 있어서 화합물 또는 본 발명의 두 번째 측면에 있어서 약제로 사용하기 위한 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 다섯 번째 측면에 있어서, 본 발명의 첫 번째 측면에 있어서 화합물의 사용 또는 본 발명의 두 번째 측면에 있어서 질병 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 상기 질병 또는 질환 및 바람직한 구현에서 정의된 개체는 상기 본 발명의 세 번째 측면에 관해서 설명된다.
바람직하게 본 발명의 방법 및 물질은 인간의 질병 및 장애의 치료를 위한 것이다.
본 발명의 테라노스틱(Theranostic)의 측면
본 발명은 치료 방법의 다양한 구현에 있어서 약제 제조 발명의 화합물 또는 조성물의 사용 및 치료제로 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 조성물을 포함한다.
일부 구현에 따른 본 발명은 또한 포함할 수 있다:
a) 질병 및 장애에서 상기한 바와 같은 질병 및 장애의 치료 또는 예방 방법은 각각의 개체에서 암 및 개체로 의심된 암은 이전부터 표본 조사(예를 들면 조직 생검 또는 혈액 또는 객담(sputum)과 같은 체액)를 하였고 높은 수준 Gadd45β 발현 및/또는 활성 및/또는 높은 수준의 NF-κB 발현 및/또는 활성을 보여주기 위해 측정하였다.
b) 개개의 조직의 치료를 위한 약제로 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 조성물을 높은 수준 Gadd45β 발현 및/또는 활성 및/또는 높은 수준의 NF-κB 발현 및/또는 활성을 알아보기 위해 측정하였다.
c) 본 발명의 화합물 또는 조성물의 용도는 질병 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조이고, Gadd45β의 비정상적으로 증가 된 발현 및 활성으로 특징되며, NF-κB 경로의 비정상적 활성 및 Gadd45β활성의 저하로 세포예정사의 유도로 치료할 수 있으며 상기 질병 또는 장애는 암이고 상기 암세포는 높은 수준 Gadd45β 발현 및/또는 활성을 보여주기 위해 측정하였다.
"증가 된 수준"는 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 75%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 1000%로 같은 종 및 같은 개체 또는 건강한 개체로부터 추가적으로 획득한 건강한 세포 대조군의 수준에서 비교하여 증가함을 뜻할 수 있다. 발현 및 활성의 수준은 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 서던 블랏(Southern blotting), 노던 블랏(Northern blotting), 웨스턴 블랏(Western blotting), 효소결합 면역흡착분석법(ELISA; enzyme linked immunosorbent assay), 방사능 면역시험법(radio-immuno assay), 카이네이즈 분석(kinase assay) 및 다른 결합(binding), 기능적(functional), 및 /또는 발현 분석으로 나타낼 수 있다.
본 발명의 테라토스틱 측면은 도 12A 및 12B 로 나타내어진 결과를 주로 보여준다. 여기에서 보여준 결과는 종이 다른 조직의 29개의 암 세포주 패널, Z-DTP 유도 사멸에 대한 암 세포 민감성 사이의 종양세포주에서의 내 Gadd45β 발현 수준통계적 유의성의 강한 상관관계를 qRT-PCR 분석으로 평가하여 입증하였다. 사실, Z-DTP2로 치료 후 세포 생존/증식의 비율에 비해 Gadd45β의 발현의 상관관계 구성은 2가지 파라미터 영역 사이의 상관관계 계수의 유의성은 아주 높은 것을 보여준다.(p<0.01)(피어슨 상관관계(Pearson correlation)). 현저하게, Z-/mDTP-유도 사멸에 내화성이 있는 다발성 골수종 세포주 (총 9개 다발성 골수종 세포주로 시험), 뿐만 아니라 sh-RNA로 세포 사멸 유도하고 Gadd45β의 억제를 매개하며(도 16, 17 및 18), 가장 낮게-대부분 검출 불가능-수준의 Gadd45β 발현하는 RPMI-8226 세포주이다. 이러한 데이터는 DTP-기본 치료법으로 병원으로 들어갈 수 있는 것을 표시하고, 간편 및 비용 효과적 qRT-PCR 분석에 따라 환자 반응 밀도 예측이 가능하다. 예를 들면, 다발성 골수종 환자로부터 일차 세포를 Gadd45β 발현 수준을 분석 될 수 있고 및 발현의 수준이 높은 환자는 본 발명의 화합물로 가장 효과적인 치료를 받을 수 있는 사람으로 간주 될 수 있다. 이런 이유로, 본 발명의 중요한 측면은 테라토스틱 측면 - 환자에서 DTPs' 치료 반응을 예측하기 위해 의학적으로 유용한 분석을 적용해야한다.
본 발명의 테라토스틱 측면은 Gadd45β/MKK7 복합체를 위한 세포에서 본 발명의 화합물의 매우 높은 타겟 중요성으로 뒷받침된다. 이것은 세포에서 타켓(예를 들면 Gadd45β)의 발현 수준 더 높게 하고, 그러한 세포는 Gadd45β 생존에 의존할 수 있는 확률을 높게 하며, 이러한 이유로 그러한 세포는 Z-/mDTP-유도 사멸에 민감할 수 있는 확률을 더 높은 것을 표시한다. Z-/mDTP의 높은 중요성은 하기의 발견으로 입증된다: 1) 종양세포주의 큰 패널에서 Gadd45β 발현 수준 및 Z-DTP 유도 사멸에 대한 암 세포 민감성 사이 강한 상관관계가 있고(도 12); 2) Gadd45β의 sh-RNA-매게 민감성 감소는 세포사멸에서 Z-/mDTP-민감성을 급하게 유도 하지만 Z-/mDTP-저항 암 세포 주에서는 아니며(도 16, 17 및 18), 및 이러한 세포주에서 Gadd45β-특정한 sh-RNA로 세포 사멸 유도의 카이네틱은 Z-/mDTPs로 관찰된 것들과 유사하고(도 7A, 8A, 및 8C); 3) MKK7의 sh-RNA-매게 민감성 감소는 Z-/mDTPs-유도 사멸을 완전히 저항한 Z-/mDTPs-유도-사멸을 만들며(도 20A, 20B 및 20C); 4) 본 발명의 치료 타겟은 두개의 단밸질 Gadd45β 및 MKK7을 방해한다(도 21A, 21B, 21C 및21D)-잠재적인 놓은 타겟 선택성, 전반적으로 나타나는 치료법의 중요한 장점을 제공한다. 이러한 자료는, 정상적인 세포에서 Z-/mDTPs의 낮은 독성과 함께 및 Gadd45β의 유전자 제거의 발명은 쥐에서 내성이 있고(참조 논문 Papa, et al. (2008) J.Clin.Invest. 1 18: 191-1923), Gadd45β/MKK7의 억제 Z-/mDTP-매게에 따른 세포 생존에서 NF-κB의 분별적 프로-생존 기능을 타겟팅하는 것은 더 중요하고, 적은 독성, 및 그러한 이유로 NF-κB 경로 및 프로테아좀을 타겟팅하는 치료보다 더 효과적인 치료법을 제공할 수 있다.
실시예
하기의 비-제한적인 실시예들로 본 발명을 설명한다.
실시예 1. Z- DTP2 의 합성
실시예의 방법으로, Z-DTP2의 합성이 보고되었다. Z-DTP2은 D-티로신(D-tyrosine), D-글루타민(D-glutamine), D-아르기닌(D-arginine), 아마이드(amide) 결합 방법으로 N-말단에 결합된 벤질옥시카르보닐(benzyloxycarbonyl)(Z 기(group))이 달린 D-페닐알라닌(D-phenylalanine) 및 아마이드 결합 방법으로 C-말단에 결합된 아미노기로 구성된 테트라펩티드 코어(tetrapeptide core)를 포함한다.
재료 및 방법
Z-DTP2는 Fmoc/tBu 고체상 방법에 따라 수동으로 제조되었고(Fields G.B. and Noble R.L. 1990 Int J Pept Protein Res ; 35: 161-214; Bodansky, M. and Bodansky A. 1995. The practice of peptide synthesis, 2nd edn., Springer Verlag, Berlin) 500 μmoles(1000 mg)의 0.50 mmoles/g의 치환을 갖는 링크 아마이드 폴리스티렌 레진(Rink amide polystyrene resin)(Fmoc-RINK-AM-resin, GL Biochem, Shangai, China, Cat. 49001)으로 부터 출발하였다. 상기 레진은 20 μm 테플론 격벽(teflon septum), 폴리프로필렌 윗 뚜껑 및 폴리프로필렌 루어-잠금 아래 뚜껑을 지닌 30 mL 폴리프로필렌 용기에 두어졌다. 상기 레진은 50:50의 디클로로메탄(dichloromethane, DCM):디메틸 포름아미드(dimethyl formamide, DMF)(LabScan, Stillorgan, Ireland; DCM cat. N° H6508L; DMF cat. N° H33H1 IX) 10.0 mL와 함께 20분 동안 부풀었다. 진공하에 용매가 제거된 후, Fmoc 기는 상온(RT)에서의 DMF-피페리딘(Piperidine)(Piperidine, Pip, cat. N° Cat. N° 80641; Sigma- Aldrich, Milan, Italy) 8:2 혼합물 5.0 mL를 20분 동안 처리하여 잘려졌다. 반응물은 진공하에 제거되었으며 상기 레진은 DMF 5.0 mL로 3회 씻어졌다. 그 후, 2.5 mmole의 Fmoc-D-Phe-OH(GL Biochem, Shangai. Cat. N. 35702) 0.97 g은 5.0 mL의 DMF에 용해되었고 DCM에 녹아있는 벤조트리아졸-릴-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오르포스페이트(Benzotriazole-l-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate)(PyBOP, Novabiochem, cat. N° 01-62-0016) 0.5 M 용액 5.0 mL, 및 디-이소-프로필-에틸아민(di-iso-propyl-ethylamine)(5.0 mmoles; DIEA, Sigma- Aldrich, cat. N° D-3887) 0.90 mL로 활성화되었다. 활성화된 상기 용액은 레진에 부어졌고 30분 동안 강하게 교반되었다. 상기 용액은 진공하에 배수되었고 레진은 DMF 5.0 mL로 3번 씻어졌다. α-NH2상의 Fmoc 기는 상기에 기재된 바와 같이 20분 동안 8:2 DMF-Pip 용액(5.0 mL)을 이용하고 DMF 5.0 mL로 광범위하게 수세하여(3회) 절단되었다. Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(2.5 mmoles, 1.6 g in 5.0 mL DMF; GL Biochem, Shangai, Cat. N. 36404) 용액은 기재된 바와 같이 PyBOP 2.5 mmole 및 순수한 DIEA 5.0 mmole을 이용하여 활성화되었다. 상기 용액은 레진으로 옮겨졌으며 30분 동안 교반되었다. 8:2 DMF-Pip 용액 5.0 mL으로 Fmoc 기를 절단하고 DMF(3회, 5.0 mL)로 씻은 후에, 상기에 기재된 바와 같이 PyBOP 및 DIEA로 예비 활성화된(preactivated), DMF(2.5 mmoles, 1.1 g in 5.0 mL DMF; GL Biochem, Shangai, Cat. N. 36605)에 0.50 M로 녹아있는 Fmoc-(D)-Glu(tBu)-OH 용액은 레진에 첨가되었고 반응은 상온에서 30분 동안 진행되었다. 아미노산의 배수 후에, 상기 Fmoc-기는 상기에 기재된 바와 같이(8:2 DMF:Pip, 5.0 mL로 20분 동안 처리) 제거되었고 상기 레진은 DMF 5.0 mL로 3회 씻어졌다. DMF 5.0 mL에 용해된 2.5 mmole의 Fmoc-(D)-Tyr(tBu)-OH(1.2 g, GL Biochem, Shangai, Cat. N. 36906)는 상기에 기재된 바와 같이 PyBOP 및 DIEA로 예비 활성화되었으며, 레진으로 옮겨졌고 45분 동안 교반되었다. 상기 아미노산 용액은 진공 배수에 의해 제거되었고, 그 후에 상기 레진은 DMF 5.0 mL로 5회 씻어졌다. 5 mmole의 Z-OSu(benzyloxycarbonyl-N-hydroxy-succinimide, GL Biochem, Shangai, Cat. N. 10502)은 DMF 10 mL에 용해되었고 레진에 첨가되었다. DIEA 2.4 mL가 첨가되었고 반응은 하룻밤 동안 교반 상태에서 진행되었다. 용액의 배수 후에, 상기 레진은 DMF, DCM, 메틸 알코올(MeOH, LabScan, Cat. N° C2517) 및 에틸 에테르(Et20, LabScan, Cat. N° A3509E)로 광범위하게 씻어졌으며, 진공하에 건조되고 가중되었다. 상기 무게(weight)는 1.1 g이다. 펩타이드를 절단하기 위하여, 상기 레진에 TFA-H2O-TIS 90:5:5 (v/v/v) 혼합물(TFA, 트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid), Sigma- Aldrich, Italy Cat. N° 91700; TIS, 트리-이소-프로필실란(tri-iso-propylsilane), Sigma- Aldrich, cat. N. 23,378-1)로 구성된 혼합물 10.0 mL이 상온에서 3시간 동안 처리되었다. 상기 레진은 여과에 의해 제거되었고, 그 후에 하얀 침강물 형성을 유도하는 차가운 Et20 20 mL이 트리플루오르아세트(trifluoroacetic) 용액에 첨가되었다. 원심분리에 의한 용매의 제거 후에, 상기 침강물은 차가운 Et20 10.0 mL로 씻어졌고 H20/C¾CN 50:50 (v/v) 10.0 mL에 용해되었으며 동결건조되었다(lyophilized). 상기 펩타이드는 좁은 내경 50x2 mm ID ONYX C18 컬럼(Phenomenex, Torrance, CA, USA)을 이용한 LC-MS로 규정되었으며, 5% CH3CN, 0.05% TFA로 600 μL/min에서 평형이 유지되었다. 상기 분석은 CH3CN, 0.05% TFA의 5% 내지 70% 구배(gradient)에 3분 이상 적용하여 수행되었다. 상기 펩타이드는 10x1 cm CI 8 ONYX 컬럼(Phenomenex, Torrance, CA, USA)를 이용한 세미-프렙(semi-preparative) RP-HPLC에 의해 정제되었으며, 20 mL/min에서 평형이 유지되었고, 매 분석에 20 mg가 투입되었다. 펩타이드를 추출하기 위하여 8분 이상 동안 5% 내지 65%의 구배가 적용되었다. 순수한 분획은 모아졌고 LC-MS로 규정되었다. 측정된 펩타이드 A의 MW는 746.8 amu(theor. 746.83 amu)였으며 상기 산물은 95% 이상 순수했다(HPLC). 수득량의 약 60%이 모든 미가공 산물의 정제 후에 얻어졌다.
실시예 2. 일반식( general formula ) (I) 화합물의 선별에 의한 Gadd45 β 및 MKK7 상호작용의 농도 의존적 억제
펩타이드의 억제 특성을 평가하기 위하여, ELISA에 기본을 둔(ELISA-based) 분석이 수행되었다. 이런 분석에서, 비오틴화-hGadd45β(biotinylated-hGadd45β)가 용액에 사용된 반면, 글루타치온 S-전이효소(glutathione S-transferase, GST) 및 세포분열-촉진 단백질 인산화효소 인산화효소 7(mitogen-activated protein kinase kinase 7, MKK7) 융합 단백질은 96-웰 플레이트의 웰에 코팅되었다. hGadd45β는 Tomatore et al. (Tornatore L., et al. (2008). J Mol Biol;378:97-l 11)에 따라, EZ Link NHS-LC-비오틴 키트(Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 비오틴화되었다.
재료 및 방법
우선, Gadd45β 및 MKK7 사이의 상호작용은 Tornatore et al. (Tornatore L? et al. (2008). J Mol Biol;378:97-l 11)에 또한 보고된 것과 같이 ELISA 분석에 의해 연구되었다. 상기 GST-융합된 전장 인산화효소(kinase)는 버퍼 A(25 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT 및 1 mM EDTA)에 42 nM의 농도로, 4 ℃에서 16h 동안 96-웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트의 웰에 코팅되었다. 일부 웰들은 버퍼만으로 채워졌고 블랭크(blank)로서 사용되었다. 4 ℃에서 16h 동안 인큐베이션한 후, 상기 용액은 제거되었고 웰들은 PBS(phosphate buffered saline)에 1% (w/v)로 녹아있는 NFDM(탈지분유)(Non Fat Dry Milk) 용액 350 μL로 채워졌다. 상기 플레이트는 37 ℃의 어두운 곳에서 1h 동안 인큐베이션 되었다. T-PBS(0.004% (v/v) Tween 계면활성제가 녹아있는 PBS) 버퍼로 씻은 후에, 상기 웰들은 8.4 nM 내지 168 nM 범위의 농도인 비오틴화-hGadd45β 100 μL로 채워졌다. 각각의 측정점(data point)은 세배수로 수행되었다. 37 ℃의 어두운 곳에서 1hr 동안 인큐베이션한 뒤에 상기 용액은 제거되었고 상기 웰들은 다시 T-PBS로 씻어졌다. 그 후 홀스래디시 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 스트렙타비딘(horseradish peroxidase-conjugated streptavidin)이 1:10,000으로 희석되어 녹아 있는 버퍼 100 μL가 각 웰에 첨가되었으며 플레이트는 37 ℃의 어두운 곳에서 1hr 동안 인큐베이션되었다. 효소 용액의 제거 및 세척 후, 100 μL의 합성 기질(chromogenic substrate) o-페닐렌디아민(o-phenylendiamine)(과산화수소(hydrogen peroxide)에 녹아있는 0.4 mg/mL의 요소(urea)를 포함하는, 50 mM 소듐 포스페이트-시트레이트 버퍼(sodium phosphate-citrate buffer)에 0.4 mg/mL)이 첨가되었고 어두운 곳에서 5분 동안 색이 현상되었다. 상기 반응은 2.5 M H2SO4 50 uL의 첨가에 의해 멈췄다. 490 nm에서의 흡광도가 모든 웰에서 측정되었고 측정값들은 상응하는 블랭크를 뺀 후 평균화되었다. 그 후에 결합된 단백질은 상기에 기재된 바와 같이 검출되었다. 해리 상수(dissociation constant, KD)(Friguet B, Chaffotte AF, Djavadi-Ohaniance L, Goldberg ME.J Immunol Methods. 1985 Mar 18;77(2):305-19)에 해당하는 ELISA 신호 중간값(half-maximal)에서의 비오틴화-hGadd45β의 몰농도(molar concentration)가 검출되었다. 경합성 결합 분석(competition binding assay)은 기재된 바와 같이 42 nM로 코팅된 GST-MKK7, 21 nM 농도의 비오틴화-hGadd45β(1:0.5 mol/mol 비율의 예비-포화 상태) 및, 첫 실험에서, 21 nM의 경쟁자들을 이용하여 수행되었다. 비오틴화된 hGadd45β의 GST-MKK7과의 결합은 경쟁자 펩타이드(0.01 nM 내지 100 nM 범위의 농도) 양의 증가하에 분석되었으며, 경쟁자들과 함께 얻어진 측정값들은 경쟁자의 부재시 검출된 결합의 퍼센트로서 표현되었다. 분석 상태 하의 21 nM에서 억제 능력의 퍼센트로서 표현된 활성 데이터는 본 발명에 따른 화합물의 선택된 세트에 대한 하기의 표 I에 기재되었다. 관례에 따라 표에 채용된 "L-Xaa" 및 "D-Xaa"는 아미노산 Xaa의 L 및 D 형태를 말한다. 선택된 화합물의 IC50 데이터(즉, MKK7에 결합하는 Gadd45β의 50% 감소 달성에 요구되는 상기 화합물의 용량)는 도 3C에 나타냈다.
실시예 3. 선도( lead ) 테트라펩타이드(tetrapeptides)의 분리
재료 및 방법
ELISA 검색은 본 발명의 원하는 화합물이 유래될 수 있는 선도 D-테트라펩타이드를 확인하기 위하여 사용되었다. 간소화된 조합의 펩타이드 라이브러리(Marasco et al. 2008, Curr. Protein Pept. Sci. 9:447-67)는 Gadd45β/MKK7 상호작용의 길항제(antagonists)를 찾기 위해 검색되었다. 총 124=20,736의 다른 테트라펩타이드를 포함하는 상기 라이브러리는 하기의 아미노산 잔기, Gin (Q), Ser (S), Arg (R), Ala (A), Tyr (Y), Pro (P), Met (M), Cys (C), Phe (F), Leu (L), His (H) 및 Asp (D)의 조합에 의해 형성되었고, 각각의 단계에서 코팅된 MKK7(42 nM), 용해성-비오틴-hGadd45(21 nM) 및 각각의 12 서브-라이브러리(sub-libraries)(42 nM)를 이용한 ELISA 경합성 분석(ELISA competition assay)에 의해 네 단계로 반복되어 분해되었다. 검색 결과는 상기의 표 1에 보여진다(여기에서 표준 한 글자 아미노산 잔기 코드가 사용되었고 X2, X3 및 X4는 상기에 주어진 12개의 잔기의 혼합을 나타낸다)(도 3A 참조). 표 I에 기재된 가장 활성화되는 결과를 초래한 펩타이드(즉, Fmoc-(PAla)2-YDHF-NH2, 또한, Fmoc-LTP1라고도 말해진다)는 그 후 최적화 및 Fmoc-(PAla)2-tag 제거를 여러 차례 당했으며, Ac-LTPl 및 Ac-LTP2를 산출하였다(Table II 참조). 이런 테트라펩타이드들은 그 후에 동일한 아미노산의 D-이소머들(D-isomers)을 이용해 재합성되고, 궁극적으로 Gadd45β/MKK7 상호작용을 각각 0.22 nM 및 0.19 nM의 IC50로 방해하는 선도 테트라펩타이드 1 및 2(DTP1 및 DTP2)를 산출한다(도 3C).
DTP1 서열: 아세틸(Acetyl)-(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Phe)-NH2[서열번호: 38]
DTP2 서열: 아세틸(Acetyl)-(D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Arg)-(D-Phe)-NH2[서열번호: 37]
또한, 하기의 서열들은 음성대조군으로서 선택되었다(NC):
NCI 서열: 아세틸(Acetyl)-(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-His)-(D-Gln)-NH2[서열번호: 81]
NC2 서열: 아세틸(Acetyl)-(L-Tyr)-(L-Asp)-(L-His)-(L-Ala)-NH2[서열번호: 82]
NC3 서열: 아세틸(Acetyl)-(L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Lys)-(L-Trp)-NH2[서열번호: 83]
NC4 서열: 아세틸(Acetyl)-(L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Lys)-(L-Trp)-NH2[서열번호: 84]
도 3A, 3B 및 3C는 ELISA 경합성 결합 분석을 나타낸다. 아세틸화된(acetylated) 펩타이드 및/또는 변형된 펩타이드(즉, 아세틸 또는 다른 기 둘 중 하나에 컨쥬게이션된 펩타이드들)의 억제 퍼센트는 표 II 및 III(표준 한 글자 아미노산 잔기 코드(standard single letter amino acid residue codes))에 각각 표시되었다.
실시예 4. 면역침강 분석
재료 및 방법
인간 배아 신장(Human Embryonic Kidney, HEK-293)은 신생우아혈청(fetal calf serum, FCS) 10%, 페니실린(penicillin) 100 units/ml, 스트렙토마이신(streptomycin) 100 mg/mL, 및 글루타민(glutamine) 1%가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's 배지(DMEM)에서 배양되었다. HEK-293 세포들(2.2x106)은 10 cm2 조직-배양 접시에 분주되었고, 다음날, 표준 Ca3(P04)2 침강(precipitation) 기술(Papa, S et al ., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153)을 이용하여 pcDNA-FLAG-MKK7 및 pcDNA-HA-Gadd45β 플라스미드로 형질전환되었다. 형질전환 48 시간 후에, 세포들은 PBS로 한번 씻어졌고, 그 후 재부유되었으며 4 ℃에서 단백질 분해효소 억제제들(1 mM 페닐메틸설포닐플로라이드(phenylmethylsulfonylfluoride), 10 μΜ 키모스타틴(chymostatin), 2 μg/ml 아프로티닌(aprotinin), 및 2 μg/ml 류펩틴(leupeptin))이 첨가된 파쇄 버퍼(20 mM HEPES, 350 rnM NaCl, 20% 글리세롤(glycerol), 1 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Na3V04, 및 50 mM NaF)에 30분 동안 가끔씩 부드럽게 섞이면서 인큐베이션되었다. 파쇄된 세포들은 모아졌으며 그 후에 45,000xg로 40분 동안 원심분리되었다. 세포가 제거된 파쇄 결과물은 다음 분석에 이용되었다. 음성 대조군 테트라펩타이드들(NCI, NC2, NC3 및 NC4)을 포함한, 실시예 3에서 분리된 선도 테트라펩타이드 DTP1 및 DTP2는 활성화된 D-테트라펩타이드들이 Gadd45β/MKK7의 상호작용을 방해하나 음성대조군 테트라펩타이드들은 그렇지 않은 것을 입증하기 위하여 Gadd45β/MKK7과 함께 인큐베이션되었다. 면역침강(Immunoprecipitation)은 Papa, S et al., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 및 그 안의 참고문헌에 기재된 것과 근본적으로 같은 조건, 및 FLAG-태깅된 MKK7를 침강시키는 항-FLAG 항체를 이용하여 수행되었다. 웨스턴 블롯은 도 5(각각 아래 및 위 패널)에 나타낸 바와 같이, 항-MKK7 항체 또는 항-HA 항체(HA-hGadd45β 에 결합)를 이용하여 수행되었다.
결과
결과들은 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 웨스턴 블롯으로부터 HA-Gadd45β 및 FLAG-MKK7를 일시적으로 발현하는 HEK-293 세포들의 파쇄물과 항-FLAG 항체(특이적으로 FLAG-태깅된 MKK7에 결합하는)가 함께 공동-면역침강(co-immunoprecipitation)이 수행되었을 때 Gadd45β 및 MKK7 사이에 강한 상호작용이 있었다고 볼 수 있다. 이러한 결과는 테트라펩타이드가 없거나, 음성대조군(NC) D-테트라펩타이드 NCI, NC2, NC2 또는 NC4가 있는, 둘 중 하나의 경우에서 공동-면역침강이 수행되었을 때 얻어졌다. 1 또는 5 nM의 DTP1 또는 DTP2 존재하에 공동-면역침강이 수행되었을 때, 그러나, 침전된 복합체는 MKK7 및 Gadd45β 사이의 상호작용이 활성화된 DTP 화합물에 의해 방해 받은 것을 나타내는 Gadd45β를 포함하지 않거나 매우 적게 포함했으므로, 공동-면역-침강에서의 Gadd45β의 감소를 초래한다. 이러한 데이터는 도 3A, 3B 및 3C 및 도 4에서 나타난 ELISA 경합성 분석(ELISA competition assay)에서 관찰된 상기 결과를 확인 및 확장시켜준다.
실시예 5. 인간 혈청에서의 DTP 의 안정성( Stability )
재료 및 방법
도 4에서, 인간 혈청에서의 Z-컨쥬게이션된(conjugated) D-테트라펩타이드의 안정성을 측정하기 위하여 Gadd45β/MKK7 결합, ELISA 경합성 분석(ELISA competition assay)이 수행되었다. 상기의 목적을 위하여, 음성대조군 L-테트라펩타이드(즉, Z-LNC) 및 이에 상응하는 D-거울상체(enantiomer)(즉, Z-DNC)와 같이, 실시예 3에 기재된 조합 라이브러리 검색(combinatorial library screen)(즉, Z-LTPl, Z-LTP2, Z-DTPl, 및 Z-DTP2)으로부터 선별된 가장 활성화된 Gadd45β/MKK7 길항제의 활성이 37 ℃에서 인간 혈청에 48-시간 동안 예비-인큐베이션된 전 후로 ELISA 경합성 분석(ELISA competition assay)에서 비교되었다. ELISA는 도 3C에 기재된 바와 같이 수행되었다. 간단하게, 재조합(recombinant) GST-MKK7가 42 nM 들어있는 ELISA 버퍼(25mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA) 100 μL가 96-웰 플레이트에 4 ℃에서 하룻밤 동안 코팅되었다. 2% NFDM로 37 ℃에서 1시간 동안 차단된 후, 플레이트는 TPBS로 씻어졌고, 그 후에 나타낸 바와 같이, 재조합, 비오틴화된 인간 (h)Gadd45β 21 nM이 인간 혈청과 함께 예비-인큐베이션되거나 안된 농도가 증가하는 테트라펩타이드와 함께 웰에 첨가되었다. 경합성 ELISA를 위해 사용된 조건에 관련된 추가적 논의는, Tomatore et al 2008 JMB, 378: 97-11 1 및 그것의 참고문헌을 참조하라.
결과
도 3C는 ELISA 경합성 분석(ELISA competition assay)에서 DTPs 및 LTP의 IC50를 비교하여 나타낸 바와 같이, DTP1 및 DTP2에 상응하는 L-거울상체(즉, 각각 LTP1 및 LTP2)와 비교할만한 Gadd45β/MMK7 복합체의 형성을 억제하는 활성을 나타낸다. 도 4는 Z-DTPl 또는 Z-DTP2를 37 ℃에서 인간 혈청과 48-시간 동안 인큐베이션한 뒤에 활성이 손실이 일어나지 않는 것을 보여준다. 실제로, 데이터는 이런 예비-인큐베이션 뒤에, Z-DTP는 ELISA 경합성 분석(ELISA competition assay)에서 Gadd45β-MKK7의 상호작용을 방해하는 능력을 완전히 유지하고 있으나, Z-LTP는 아닌 것을 보여준다. 혈청과 함께 예비-인큐베이션한 후의 테트라펩타이드와 혈청과 함께 예비-인큐베이션 하지 않은 테트라펩타이드의 IC50 비교함으로써, Z-LTP1 and Z-LTP2는 아닌 반면, 후자의 테트라펩타이드들이 혈청과 예비-인큐베이션 한 후에 유의미하게 활성의 손실을 보인 것처럼(그것들의 IC50 >10 μΜ), Z-DTP1 및 Z-DTP2는 혈청과 예비인큐베이션한 뒤 완전히 안정하다고 볼 수 있다(Z-DTPl의 IC50 = 0.19 nM, 및 Z-DTP2의 IC50 = 0.18 nM). 모든 농도를 실험해보았을 때, 혈청과 예비-인큐베이션 되었던 D-테트라펩타이드의 억제 활성은 상기 예비-인큐베이션되지 않았던 D-테트라펩타이드들로부터 나온 분석(도 3C 및 4)에서 분명하지 않았다.
도 3C 및 4에서 보여진 농도-의존적인 패턴의 비교는 Z-LTP1 및 Z-LTP2는 아닌 반면, Z-DTP1 및 Z-DTP2가 37 ℃의 인간 혈청에서 안정하며 따라서 체내 이용에 적합한 것을 나타낸다. 또한, 음성대조군 테트라펩타이드들(예를 들어, Z-DNC 및 Z-LNC)이 인간 혈청과 예비-인큐베이션되었든 아니든, 앞서 언급한 ELISA 경합성 분석에서 활성이 결여되는 것을 볼 수 있다(도 3C 및 4). 또한, 도 3C 및 4에 묘사된 데이터는 벤질옥시카보닐 (Z)(benzyloxycarbonil (Z))기의 N-말단 첨가(아테틸기 대신에)가 DTP1 및 DTP2 또는 LTP1 및 LTP2 둘 중 하나의 Gadd45β/MKK7 복합체의 형성을 억제하기 위한 능력을 함유하지 않는 것을 보인다?또한, Z기의 첨가는 DTP의 세포 흡수를 현저하게 증가시킨다(데이터 생략), 이런 이유로 종양 사멸 분석에서의 DTP의 세포 활성을 현저하게 증가시킨다(도 7A 및 7B 참조).
실시예 6 다발성 골수종 세포주( multiple myeloma cell lines )의 패널에서 Z-DTPs의 IC 50 측정
재료 및 방법
다발성 골수종 세포주의 생존/증식에 대한 D-테트라펩타이드 처리 효과를 더 시험하기 위하여, Z-DTP-유도 사멸에 민감한 8 다발성 골수종 세포주(9 이외의 다발성 골수종 세포주가 실험됨)(즉, U266, KMS-l1, NC1-H929, ARH-77, JJN-3, KMS-12, KMS-18, K S-27 세포; 도 8 A, 8B, 8C, 및 12 참조)들은 증가하는 농도(0.01 내지 10μΜ 범위)의 Z-DTP1 또는 Z-DTP2로 24, 72 또는 144 hrs 동안 표 IV에 나타낸 것과 같이 처리되었다. 실시예 8에 기재된 바와 같이 다발성 골수종 세포들의 배양 및 Z-DTP 처리가 수행되었다(하기 참조). 다발성 골수종 세포들의 생존/증식에 대한 Z-DTP의 효과는 [3H] 티미딘(thymidine) 흡수(incorporation) 분석을 이용하여 평가되었고, 또한, 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행되었다. 사용된 Z-DTP의 각각의 농도가 사용된 및 처리되지 않은 배양 세포(즉, 오직 배지와 함께 배양된)로 측정된 세포 증식의 양은 세포 증식의 정도와 직접적으로 관련된 매분 카운트 수(counts per minute, c.p.m.)로서 나타냈다. 모든 실험들은 세배수로 수행되었다. 그 후, Z-DTP1 및 DTP2의 파생물처럼(예를 들어, mDTP3), 처리하지 않고 배양한 것과 함께 기록된 세포 증식에 관련된 세포 증식의 50% 억제(즉, IC50)를 초래한 Z-DTP1 및 DTP2의 농도 평균이 측정되었다. 나타낸 시간(즉, 1일, 3일 및 6일)에 시험된 8 민감한(sensitive) 다발성 골수종 세포주들에 대해 계산된 Z-DTP1 및 Z-DTP2의 IC50는 표 IV에 기재되었다. 31개의 추가적인 화합물(mDTP3와 같은 Z-DTP2 파생물들의 IC50를 포함한)의 IC50와 같이, KMS-11 및/또는 KMS-12 다발성 골수종 세포들에서 1일, 3일 및 6일에 계산된 상기 두 화합물의 IC50는 표 V에 기재되었다.
표 IV에서 보인 것과 같이, Z-DTP1 및 Z-DTP2는 농도-의존적인 방식으로 시험된 모든 다발성 골수종 세포주들(매우 낮은 수준의 Gadd45β을 보이는 RPMI-8226 세포주에서는 제외하고; 하기에서 더 논의된다; 도 12 참조)에서 [3H]-TdR 흡수가 현저하게 감소하였다(도 8A, 8B, 8C, 및 12 참조). Z-DTP1 및 Z-DTP2의 IC50가 트리판 블루 색소 배제법(Trypan blue exclusion assay)(세포 생존능력 측정)을 이용하여 계산되었을 때, 상기 다발성 골수종 세포주에서 유사한 결과가 얻어졌다(데이터 생략).
결과
표 IV에서 보여진 바와 같이, 시험된 모든 다발성 골수종 세포주들은 세포 생존/증식의 Z-DTP-공급성(Z-DTP-afforded) 억제에 높은 민감도를 나타냈다. 또한, 표 IV에서 보여진 바와 같이, 그러나, 이런 세포주들은 Z-DTP1 및 Z-DTP2에 대해 다양한 민감도를 보였다. 실제로, 일부 세포주들은 이러한 화합물들의 처리 24-hr 후에 세포 생존/증식의 DTP-공급성(Z-DTP-afforded) 억제에 이미 매우 민감했으며(예를 들어, Z-DTP2 24 hrs 처리시 KMS-12 세포의 IC50 = 1.3 μΜ, 및 KMS-11 세포의 IC50 = 2.88 μΜ), 그들 모두는 144 hrs동안 처리한 후에, 이때, Z-DTP1 에 대한 10.1 nM 내지 4.9 μΜ의 IC50 범위, Z-DTP2에 대한 10 nM 내지 4.5 μΜ의 IC50 범위에서 Z-DTP1 및 Z-DTP2 둘 다에 매우 민감했다(표 IV). 특히, Z-DTP2 파생물, mDTP3(화합물 17)은 KMS-11 및 KMS-12 세포주에서 시험되었고, 상기 세포주들에서 6일째에, Z-DTP1(즉, 각각 316 nM 및 10.1 nM) 및 Z-DTP2(즉, 각각 66 nM 및 10 nM)의 IC50에 비해 각각 IC50 16 nM 및 25 nM로 증가된 세포 활성을 보였다(표 V 참조)(도 20A, 20B, 및 20C 참조). 따라서, 음성대조군인 Z-DNC들은 아닌, 활성 DTP들은 대부분의 다발성 골수종 세포주들에서 강한 세포 독성(cytotoxic activity)을 가진다. 또한, 가장 최근의 파생물들(예를 들어, mDTP3)은 실험관내(in vitro) 다발성 골수종 세포에서 높은 효능을 유지하나, 많이 감소된 MW(-500 대 >700)와 함께 향상된 세포 활성을 보이므로, 리간드 효율이 증가했다(표 V 참조)(도 13 참조).
실시예 7. 테트라펩타이드에 의한 Gadd45 β-억제 MKK7 촉매 활성의 복구
재료 및 방법
도 6에서, HEK-293 세포로의 pcDNA-FLAG-MKK7의 일시적인 형질전환이 근본적으로 Papa, S et al ., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 및 이의 참고문헌에 기재된 바와 같은 Ca3(P04)2 침전 방법을 이용하여 수행되었다. 형질전환 36 hrs 뒤에, 상기 세포들에 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13 ?acetate, PMA) 100 ng/ml 및 이오노마이신 1 μΜ을 37 ℃에서 30분 동안 처리하였다. 세포 추출물은 실시예 4에 기재된 바와 같이 준비되었고 Papa, S et al, (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 및 이의 참고문헌에 기재된 바와 같이 항-FLAG 항체(FLAG-MKK7에 결합)와 함께 면역침강을 위해 사용되었다. 구체적으로, PMA-이오노마이신(P/I)-처리 또는 미처리된 일시적으로 FLAG-MKK7을 발현하고 있는 HEK-293 세포의 파쇄물 50 μg은 항-FLAG M2 친화겔(SIGMA) 10 μL와 함께 4 ℃에서 4 hr 순환하는 동안 인큐베이션되었다. 면역침강물은 그 후 파쇄 버퍼(lysis buffer)로 3회 및 두 번 더 인산화 효소 버퍼(kinase buffer)(10 mM HEPES, 5 mM MgCl2, 1 mM MnCl2,12.5 mM β-glycerophosphate, 2 mM DTT, 4 mM NaF 및 0.1 mM Na3V04)로 씻어졌다. MKK7 촉매 활성은 최종적으로 Papa, S et al, (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153 및 이의 참고문헌에 기재된 바와 같이, FLAG-MKK7 면역침강물을 30 ℃에서 20분 동안 재조합 GST-JNK1 2 μΜ 및 [γ-32P]ATP 5 μCi를 포함하는 인산화 효소 20 μL와 함께 인큐베이션함으로서(인산화 효소 반응) 인산화 효소 분석(kinase assays)으로 측정되었다.
몇몇 반응에서, Gadd45β-MKK7의 상호작용을 방해하여 Gadd45β-공급성 억제로부터 MKK7의 촉매 활성을 해방시키기 위한 D-테트라펩타이드 길항제의 능력을 시험하기 위하여, FLAG-MKK7 면역침강물은 1) 30 ℃에서 10분 동안 1 nM 또는 5 nM의 DTP1, DTP2 또는 음성대조군(NC) D-테트라펩타이드들인, NCI, NC2, NC3 및 NC4 중 어느 하나와 함께 예비-인큐베이션하며, 2) 그 후, 상기에 기재된 인산화 효소 반응에 이용하기 전에, 도 6에 나타낸 바와 같이, 5 μΜ의 재조합 인간 (h)Gadd45β의 GST-융합 단백질(GST-hGadd45β; Papa, S., (2007) J. Biol. Chem. 282, 19029-19041에 기재된 바와 같이 세균 파쇄물로부터 정제된)과 함께 또는 없이 30 ℃에서 10분 동안 인큐베이션한다. 모든 경우에, 인산화 효소 반응은 램리 샘플 버퍼(Laemmli sample buffer)의 첨가에 의해 종료되었다. 그 후에 단백질들은 10% SDS-PAGE에 의해 용해되었으며, MKK7 인산화 효소 활성은 자기방사법(autoradiography)에 의해 확인되었다. MKK7 인산화 효소 분석 조건에 관련된 추가적 논의는, Papa, S et at ., (2007) J. Biol. Chem. 282, 19029-19041 및 Papa, S et al ., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-1531 및 그것의 참고문헌을 참조하라.
결과
결과들은 도 6에 보여졌고, 여기에서 밴드의 강도는 MKK7에 의해 기질인 GST-JNK1으로 포함된 [γ-32P]ATP의 양에 비례하므로, 측정된 MKK 인산화 효소 활성의 정도에 상응한다. 도 3C, 4, 및 5에 보이는 바와 같이, 음성대조군(NC) 테트라펩타이드들인 NCI, NC2, NC3 또는 NC4과의 인큐베이션은 그러지 않은 반면, DTP1 또는 DTP2와의 인큐베이션은 효과적 및 특이적으로 MKK7과 Gadd45β와의 상호작용 및 그의 결과를 방해하였고, 도 6에 보이는 바와 같이, MKK7의 촉매 활성이 완전히 회복되었다(도 6, 위쪽 패널). 또한, 도 6으로부터 대조군 테트라펩타이드인 NCI, NC2, NC3 및 NC4, 및 활성 테트라펩타이드인 DTP1 및 DTP2, 어느 것도 재조합 GST-hGadd45β 없이 MKK7와 함께 인큐베이션 되었을 때 MKK7 촉매 활성의 억제를 제공하지 못했다고 볼 수 있다(도 6, 아래쪽 패널). 이런 결과들은 NC1, NC2, NC3 또는 NC4는 아니고 오직 DTP1 및 DTP2들이 ELISA 또는 공동-면역침강 분석에서 MKK7-Gadd45β 상호작용을 방해할 수 있었던 도 3C, 4, 및 5에서 보여진 결과들과 일관적이었다.
실시예 8. 테트라펩타이드에 의한 NF -кB의 지속적인 활성 및/또는 Gadd45 β의 높은 발현 정도의 특징을 갖는 종양 세포주의 특이적 사멸
재료 및 방법
본 실시예는 대조군 테트라펩타이드(즉, Z-DNC, Z-LNC, 및 Ac-DNC) 및 실험관내 생리활성 선도 펩타이드(즉, Z-DTPl, Z-DTP2, Z-LTP2 및 Ac-DTP2)의 인간 및 쥐 기원의 다양한 조직의 종양 세포주의 넓은 패널의 사멸을 위한 용도를 밝힌다. 상기에서 시험된 종양 세포주는 하기를 포함한다: 다발성 골수종 세포주 U266, KMS-11, NC1-H929, ARH-77, JJN-3, KMS-12, KMS-18, KMS-27, RPMI-8226; 미만성 대형 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma cell) 세포주 LY-3 및 SUDHL6; 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma cell) 세포주 BJAB, ST486, RAJI, RAMOS, 나말와(Namalwa), 및 HS-SULTAN; 전-단구성 백혈병(pro-monocytic leukaemia) 세포주 U937; T-세포 백혈병 및 림프종 세포주 JURKAT, HUT-78, MT-2, MT-4, MOLT4, MT2-HTLV-I, 및 CEM; 유방암(breast cancer) 세포주 MCF7, MD-MDA-231, 및 MD-MDA-486; 전-B-세포 림프종(pre-B-cell lymphoma) 세포주 NALM-6(인간) 및 70Z/3(마우스); 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenic leukemia) 세포주 K652; B-세포 림프종 세포주 KARPAS(인간) 및 A20(마우스); 인간 배아 신장(human embryonic kidney) 세포주 HEK-293T. 종양 세포주들은 이전에 기재된 바와 같이(Zazzeroni et al. 2003, Blood 102: 3270-3279) 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1% 글루타민(glutamine), 100 U/mL 페니실린(penicillin), 및 100 g/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 보충된 RPMI-1640 (다발성 골수종(multiple myeloma), 미만성 대형 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma cell), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 전-단구성 백혈병(pro-monocytic leukaemia), T-세포 백혈병(leukaemia) 및 림프종(lymphoma), 전-B-세포 림프종(pre-B-cell lymphoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenic leukemia), 및 B-세포 림프종(B-cell lymphoma) 세포주) 또는 DMEM 배지에서(유방암 및 배아 신장 세포주) 37 ℃의 5% C02 가습 공기(humidified atmosphere)하에 배양되었다.
증식 억제(도 7, 8 및 9) 및 세포 사멸(cell death assays)(도 10) 분석을 위하여, 세포들은 96-웰 플레이트의 웰에 1.O x lO4 cells/ml(증식 분석(proliferation assay))로 분주되거나 24-웰 플레이트의 웰에 4 x 105 cells/ml(세포 사멸 분석(apoptosis assays))로 분주되었고 6일 까지 배양되었다. 나타낸 바와 같이, 10 μΜ 또는 100 μΜ의 농도의 배양 세포에서 테트라펩타이드들의 최종 농도를 얻기 위해 상기 배양 시간 동안, 세포들은 배지에서만(처리 안된 배양 세포) 배양되거나 다른 대조군(예를 들면, Z-DNC) 또는 활성 테트라펩타이드들(예를 들면, Z-DTP2)이 보충된 배지(처리된 배양 세포)에서 배양되었다. 종양 세포의 생존/증식에서 테트라펩타이드의 효과를 재는 것을 목표로 한 증식 억제 분석을 위해, 배양 세포는 나타낸 바와 같이, 트리판 블루 색소 배제법(Trypan blue exclusion assay)(산 세포 및 죽은 세포 간의 식별) 및 세포 카운팅(데이터 생략) 또는 [3H]티미딘 흡수(incorporation) 분석(Figures 7A, 7B, 7C, 8A, 8B, 8C 및 9)으로 매일 분석되었다. 상기 후자의 분석들에서, 종양 세포주의 생존/증식에서 Z-DTPs, Ac-DTPs 및 Z-LTPs의 효과가 표준 삼중 수소화된 티미딘(standard tritiated thymidine)([3H]thymidine; [3H]-Td) 흡수 분석을 이용한 DNA 합성 측정에 의해 조사되었다. 보여진 상기 분석들에서, 세포들은 24, 72, 120 또는 144 hrs 동안 37 ℃에서 나타낸 바와 같이, 대조군 또는 생물활성(bioactive) 테트라펩타이드의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션되었고, [3H]-TdR(0.037 MBq/웰, 0.5 μCi/웰과 같음)와 함께 18 hrs 동안 추가적으로 배양되었다. 방사선 측정 용액(scintillation fluid)이 첨가된 뒤에, 세포들은 그 결과로서 96-웰 플레이트 자동 세포 수득기(96-well plate automated cell harvester)를 이용하여 glass fibre filter mats에 수득되었으며, [3H]thymidine 흡수(incorporation)가 베타 계수기(beta counter)에 있는 방사선 용액 분광기(liquid scintillation spectroscopy)에 의해 측정되었다. 상기 결과들은 배지만으로 인큐베이션된 상응하는 배양 세포(처리되지 않은 세포들 extent)로 측정된 c.p.m에 관련된 테트라펩타이드-처리된 배양 세포로 측정된 매분 카운트 수(counts per minute, c.p.m.)의 퍼센트(세포 증식 정도와 직접적으로 연관된)로서 표현되었다. 모든 실험은 3 배수로 수행되었다. 비록 Z-DTP2가 Z-DTP1 보다 약간 높은 활성을 나타냈을지라도(데이터 생략; 표 IV 참조), 나중에 더 논의된 바와 같이, 상기 생존/증식 분석에서 Z-DTP2, Z-LTP2 및 Ac-DTP2는 Z-DTP1, Z-LTP1 및 Ac-DTPl 결과와 유사하게 각각 산출되었다.
세포 사멸은 배양 세포에서 sub-G1 DNA 함량(즉, 세포 사멸세포들)로 세포들을 확인하기 위하여 이전에 기재된 바와 같이(Riccardi and Nicoletti (2006) Nature Protocols 1, - 1458 - 1461) 근본적으로 수행된 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI) 핵 염색 및 유세포 분석기(flow cytometry, FC)의 이용으로 나타낸 때에 측정되었다(도 10). 상기 분석을 위하여, 세포들(4xl05 cells/ml)은 도 10에 나타낸 바와 같이 24-웰 플레이트에서 72 또는 144 hrs 동안 배양되었고, 원심분리되고 그 후에 RNAase A 100 μg/mL를 포함한 1X PBS로 재부유된 후에, 1X인산완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 두 번 씻어졌으며 -20 ℃에서 16 hrs 동안 70% 차가운(ice-cold) 에탄올로 고정되었다. 상기 단계 후에, 세포들은 상온에서 30분 동안 인큐베이션되었고 원심분리되었으며, 그 후에 PI 50 μg/mL으로 재부유되었고, 4 ℃ 어두운 곳에서 45분 동안 인큐베이션되었다. FACsCalibur 자동 시스템(automated system을 이용하여 유세포 분석기(flow cytometry, FC)가 최종적으로 수행되었고, 데이터는 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석되었다.
종양 세포주의 Z-DTP-유도 사멸에 대한 민감도 차이의 근거를 측정하기 위해, 본 발명자들은 29 종양 세포주의 패널 또는 기원의 다른 조직에서 정량적 실-시간 중합 효소 연쇄 반응(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCT)을 이용하여 Gadd45 발현 정도 및 이러한 세포주들의 Z-DTP의 세포 독성 활성에 대한 민감성(susceptibility) 정도와 연관된 이러한 정도들을 측정하였다. 도 12에서 보여진 상기 분석들을 위하여, 다른 모든 세포주들은 상기에 기재된 바와 같이 6-웰 플레이트의 웰에서 5xl05 cells/well로 RPMI-1640 배지에서 배양된 반면, 유방암 및 HEK-293T 세포주들이 75 cm2 플라스크(5xl06 cells/flask)에서 완전 DMEM 배지(complete DMEM medium)로 배양되었다. 총 RNA는 트리졸(Trizol)로 추출되었고 PureLike RNA mini-kit(Invitrogen)를 이용하여 정제되었다. RNA 1 μg이 GeneAmp RNA PCR Kit(Applied Biosystems)를 이용하여 수행된 역-전사(reverse-transcriptase, RT) 반응에 주형으로서 첨가되었다. qRT-PCR은 상기 결과로 초래된 cDNA와 함께 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems), 표 VII에 나열된 Gadd45β-특이적 프라이머 및 ABI 7900 실-시간 PCR 기계를 사용하여 트리플리케이트로 수행되었다. 실험의 Ct 값은 β-actin에 대해 정규화(normalize)되었고, 관련 mRNA 발현은 참고 샘플(즉, HEK-293T 세포의 mRNA)에 대비하여 계산되었다. 암 세포주의 Z-DTP-유도 사멸에 대한 민감도는 상기에 기재된 바와 같이 세포에 10 μΜ의 Z-DTP2를 144 hrs 처리한 후에 [3H]티미딘 흡수 분석을 수행하여 분석되었다. 또한, 도 12에서 Z-DTP2 처리 후의 세포 생존 퍼센트에 대비한 Gadd45β mRNA 발현의 상관도(correlation plot)를 보여준다. 2 변수(parameter)들의 도메인 사이의 상관계수(correlation coefficient)의 유의성이 GraphPad 소프트웨어를 이용하여 두 변수(variable) 사이 관련 정도를 정량하는 피어슨 상관계수(Pearson correlation)에 의해 측정되었다.
암 세포주의 Z-DTP-유도 사멸이 세포 독성 JNK 신호의 유도 때문인지 측정하기 위하여, 본 발명자들은 두 대표, 민감한 다발성 골수종 세포주(즉, KMS1 1 및 NCI-H929 세포주)에 Z-DTP2를 처리한 후의 JNK 활성을 관찰하였다(도 11). 이것을 위하여, 본 발명자들은 JNK 인산화(phosphorylation)-JNK 활성의 지표(indicator)의 평가를 위한 웨스턴 블롯(Western blots) 분석을 수행하였다. 상기 KMS11 및 NCI-H929 다발성 골수종 세포주들은 6-웰 플레이트에서 5x10s cells/well로 완전 RPMI-1640 배지에서 상기에서 기재한 바와 같이 배양되었고, Z-DTP2 또는 음성대조군 테트라펩타이드인 Z-DNC 10 μM로 3, 6, 12 또는 24 hr 동안 처리되었다(도 11). 테트라펩타이드 처리 후, 세포 파쇄물은 근본적으로 실시예 4에 기재된 바와 같이 준비되었고 웨스턴 블롯은 항-포스포(phospho)(P)-JNK-특이적 항체를 이용하여 수행되었다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 사용된 방법론은 참고문헌 Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-313; Papa, S et al ., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153; Papa, et al. 2007 J.Biol.Chem. 282:19029-19041; Papa, et al. (2008) J.Clin.Invest. 118: 191-1923에 기재되어 있다. β-액틴(β-actin) 정도는 β-액틴-특이적 항체를 이용하여 측정되었고 로딩 컨트롤(loading control)로서 제공되었다(도 11). KMS11 및 NCI-H929 세포의 TNFα 자극(2,000 U/ml)이 5, 10 또는 30 분 동안 수행되었고 JNK 활성화를 위한 양성 대조군으로 사용되었다(도 11). 상기 분석들은 JNK 활성화가 Z-DNC 처리에 의해서가 아닌, 오직 Z-DTP2 처리에 의해서만 초래되는 것을 보여주었다. Z-DTP2의 유사한 효과가 MKK7 활성화에서 보여졌다(데이터 생략). 중요하게, 이 화합물(Z-DTP2)이 IKK/NF-кB, ERK 및 p38 경로의 활성화에는 아무 효과가 없지만(데이터 생략), Gadd45β의 생물학적 활성에서 보여진 바와 같이(참고 문헌: De Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-313; Papa, S et al ., (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153; Papa, et al. 2007 J.Biol.Chem. 282: 19029-19041; Papa, et al. (2008) J.Clin.Invest. 1 18: 191-1923), 다발성 골수종 세포에서의 Z-DTP2의 효과는 MKK7/JNK 경로에 대해 특이적이었다.
결과
도 7A, 7B 및 7C는 DTP2 Z-보호 파생물(Z-DTP2)이 시험된 8의 민감한 다발성 골수종 세포주 중에서 세 대표 다발성 골수종 세포주(즉, U266, KMS-11, 및 NCI-H929), 버킷 림프종 세포주(Burkitt's lymphoma cell line), BJAB, 및 전-단구성 백혈병(pro-monocytic leukaemia) 세포주, U937의 증식을 현저하게 억제하는 것을 보여주나, 아세틸(acetly) 파생물(Ac-DTP2) 또는 Z-DTP2의 L-이성질체(Z-LTP2), 또는 음성대조군 테트라펩타이드인 Z-DNC, Ac-DNC 및 Z-LNC는 아니다(도 8 및 12, 및 표 IV 참조; 추가적인 다발성 골수종 세포주들). 세포들은 나타낸 바와 같이, 10 μΜ의 Z-DTP2 또는 Z-DNC(도 7A), 및 Ac-DTP2 또는 Ac-DNC(도 7B), 및 Z-LTP2 또는 Z-LNC(도 7C) 중 하나와 함께 배양되었다. 처리된 세포들의 [3H]-tTdR 흡수(DNA 합성 측정)가 측정되었고 오직 배지와 함께 배양된 세포들의 그것과 비교되었다. 데이터들은 오직 배지와 함께 배양한 세포에서 측정된 c.p.m.에 상대적인(미처리 세포), Z-DTP2, Ac-DTP2 또는 Z-LTP2(가득 찬 컬럼), 또는 Z-DNC, Ac-DNC 또는 Z-LNC(빈 컬럼) 처리 후에 종양 세포와 함께 관찰되는 c.p.m.의 퍼센트로서 표현되었다. 세포 증식의 현저한 억제가 Z-DTP2를 처리한 다발성 골수종 및 다른 종양 세포주에서 관찰되었으나, Z-DNC를 처리한 세포주에서는 관찰되지 않았다. 도 7B에서, 다발성 골수종 세포주에서 CaC02 분석에서 확실히 한 것과 같이, Ac-DTP2의 종양세포치사(tumoricidal) 활성이 없는 것은 상기 화합물의 낮은 세포 투과도와 관련된다(데이터 생략). 메틸(methyl, Me), 아세틸(acetyl, Ac), 미리스틸(myristyl, Myr), 3-메톡시(methoxy),4-하이드록시(hydroxyl)-벤조일(benzoyl), 벤조일(benzoyl), 6C1-벤질옥시카르보닐(benzyloxycarbonyl) (6C1-Z), 및/또는 플루오레닐메틸옥시카르보닐(fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc) 기를 가지는 것을 포함하는 더 적게 효과적인 다른 DTP 파생물들(또한 DTP의 세포 흡수를 증진시키기 위하여 디자인된) 처리 후의 다발성 골수종 세포주의 생존 능력은 보여지지 않았다. Z-LTP의 실험관내의 효능 및 세포내 흡수가 Z-DTP들의 그것과 비슷하였으나(도 3C 참조; 또한 데이터 생략), Z-LTP2는 에서의 생체액(biological fluid)에서의 낮은 안정성 때문에(도 4 참조), 다발성 골수종 세포에서 낮은 활성을 보였다(도 7C). 세포 증식의 유사한 억제가 Ac-DTPl 또는 Z-LTP1를 처리한 것에서는 아닌(데이터 생략), Z-DTP1을 처리한 종양 세포주에서 관찰되었다(도 3C 및 4 참조)?상기 두 Ac-DTPl 및 Z-LTP1 화합물들이 Z-DTP1 실험관내 효능에 비슷했음에도 불구하고(또한 DTP2 파생물들에서 보여준 것과 같이). 동시에, 상기 데이터는 Ac-DTP의 비활성(도 7B 및 데이터 생략) 및 Z-LTP의 낮은 활성(도 7C 및 데이터 생략)에 비해 Z-DTP의 높은 세포 독성 활성(도 7A 및 데이터 생략)을 수립한다.
도 8A, 8B 및 8C에서, 본 발명자들은 다발성 골수종 세포주(즉, U266, KMS-11, JJN-3, NCI-H929, ARH-77, KMS-27, KMS-18, KMS-12, 및 RPMI-8226)의 대형 패널의 증식에 대한 D-테트라펩타이드의 처리 효과를 시험하였다. 시험된 다른 종양 세포주들은 미만성 대형 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma) 세포주, LY-3 및 SUDHL6, 버킷 림프종 세포주(Burkitt's lymphoma cell line), BJAB, ST486 및 RAJI, 및 전-단구성 백혈병 세포주(pro-monocytic leukemia cell line), U937를 포함한다. 상기 세포들은 보여진 바와 같이, 10 μΜ의 Z-DTP2, Z-DTP1 또는 Z-DNC 중 하나로 기재된 시간(즉, 24, 72 또는 144 hrs) 동안 처리되었다. 처리된 세포의 [3H]티미딘 흡수는 도 7에서와 같이 측정되었고 오직 배지와 함께 배양한 세포들의 측정값과 비교되었다. 데이터들은 미처리 세포에서 측정된 c.p.m.에 상대적인, Z-DTP2 또는 Z-DTP1(가득 찬 컬럼)로 처리된, 또는 Z-DNC(빈 컬럼)로 처리된 종양 세포와 함께 관찰되는 c.p.m.의 퍼센트로서 표현되었다. 도 8A는 Z-DNC는 아닌, Z-DTP2가 시험된 9 다발성 골수종 세포들 중에서 8(즉, U266, KMS-11, JJN-3, 및 NC1-H929, ARH-77, KMS-27, KMS-18, KMS-12)의, 버킷 림프종 세포주(Burkitt's lymphoma cell line), BJAB의, 미만성 대형 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) 세포주, LY-3의, 및 전-단구성 백혈병 세포주(pro-monocytic leukemia cell line), U937의 생존/증식을 현저하게 억제하는 것을 보여준다(도 12 참조). 특히, Z-DTP2는 활성화된-B-세포(activated-B-cell, ABC)-유사 아형(즉, LY3)의 생존을 위해 NF-кB 에 의존하는 오직 DLBCL 세포주에서 세포 독성 활성을 보였고, 항시 NF-+B 활성화가 특징이 아닌 배심 B-세포(germinal center B-cell, GCB)-유사(즉, SUDHL6) 아형에선 보이지 않았다(Ngo VN, et al. Nature 441(7089): 106- 10; 도 12 참조). 또한, Z-DTP의 강한 세포 독성 활성이 시험된 방대한 다수의 다발성 세포주에서 보였다-모든 세포주가 생존을 위해 NF-кB에 의존한다. 도 8B 및 8C에서 보여진 바와 같이, Z-DTP1 및 Z-DTP2의 종양 세포 증식에 대한 억제 효과는 시간과 함께 증가하였다-비록 상기 효과가 이미 24 hrs 동안 처리한 뒤에 보일지라도, 증식의 최대 억제는 144 hrs 동안 테트라펩타이드 처리 후에 관찰되었다. 상기 데이터들은 트리판 블루 색소 배제법(Trypan blue exclusion assay)에서의 세포 카운팅(데이터 생략) 및 DNA 함량을 위한 PI 핵 염색 분석에 의해 얻어진 데이터들과 일치한다(도 10 참조; 또한, 데이터 생략). 동시에, 상기 및 다른 데이터는 Z-DTP의 세포 독성 활성이 항시 NF-кB 활성을 나타내는 종양 세포에 대해 선택적임을 보인다(도 12 참조; 또한 데이터 생략).
Z-DTP의 세포 독성 활성의 특이성은 도 9에서 보여진 [3H] 티미딘 증식 분석에 의해 추가적으로 제공되었다. 상기 도는 상기 화합물이 매우 높은 농도-즉 100 μΜ로 사용되었을 때라도, 144 시간 동안 처리 후 22 저항성 종양 세포주의 패널에서 Z-DTP2-유도 세포 독성이 없는 것을 보인다. 도 9에서 보여진 상기 [3H] 티미딘 증식 분석(thymidine proliferation assay)은 도 8에 기재된 바와 같이 수행되었다.
도 9에서 보여진 바와 같이, Z-DTP2는 T-세포 백혈병 및 림프종 세포주, JURKAT, HUT-78, MT-2, MT-4, MOLT4, MT2-HTLV-I, 및 CEM, 버킷 림프종 세포주 BJAB, ST486, RAJI, RAMOS, Namalwa, 및 HS-SULTAN, 유방암 세포주 MCF7, MD-MDA-231, 및 MD-MDA-486, 전-B-세포 림프종 세포주 NALM-6 및 70Z/3, B-세포 림프종 세포주 KARPAS 및 A20, 만성 골수성 백혈병 세포주 K652, 인간 배아 신장 세포주 HEK-293T, 및 다발성 골수종 세포주 RPMI-8226에서 세포 독성이 없음을 나타내었다(도 12 참조). 또한, 도 9는 민감한 세포주 BJAB(버킷 림프종), KMS-11 및 KMS-12(다발성 골수종)를 보여준다. 특히, 상기 세포주들에서 Z-DTP2-유도 사멸에 대한 민감성 및 내인성 Gadd45β 발현 정도 사이에 강한 상관관계가 있다(도 12 참조). 그 중에서도 특히, 상기 RPMI-8226 세포주-Z-/mDTP-유도 사멸에 저항성을 가진 시험된 오직 하나의 다발성 골수종 세포주(도 8A 및 9)-는 매우 낮은 정도의 Gadd45β를 보이며(도 12 참조), 또한 DTP의 암에서의 세포 독성 활성을 확인하는 것은 항시 Gadd45β 발현의 정도에 의존적이다.
도 10에서, 배양 배지 홀로(미처리) 또는 최종 농도 10 μΜ의 Z-DTP2 또는 Z-NC2 중 하나를 전달하는 배양 배지와 함께 나타낸 시간(즉, 72 또는 144 hrs) 동안 처리 후에, 내포된 패널들은 DNA의 sub-G1 양을 보여주는 프로피티움 요오드화물(propidium iodide, PI) 염색을 나타내는 세포들(즉, 죽거나 세포사멸에 의해 죽어가는 세포들)의 퍼센트를 보인다. 세포 사멸 세포의 퍼센트는 히스토그램(histogram)에 그려졌다. 다섯 대표 민감성 다발성 골수종 세포주인 NCI-H929, KMS-11, ARH-77, JJN-3, 및 U266가 보여졌다. 보여진 바와 같이, 다발성 골수종 세포의 Z-DTP2-유도 사멸은 세포 사멸의 유발 때문이고, 상기 화합물에 세포가 노출된 후에 보이는 세포 사멸의 부분은 처리 시간에 따라 증가한다. 도 11은 Z-DTP2 처리가 다발성 골수종 세포주에서 JNK의 강한 활성을 유발하는 것을 보여준다. 상기 두 대표 민감성 다발성 골수종 세포주들 KMS11 및 NCI-H929은, 보여진 바와 같이 Z-DTP2 또는 Z-DNC 10 μΜ로 처리되었다. JNK 활성이 기재된 시간에 항-포스포(P)-JNK-특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 관찰되었다. JNK 인산화(JNK 활성의 마커)는 오직 Z-DTP2를 처리한 후에 증가되는 것으로 볼 수 있으나, Z-보호된(Z-protected) 음성 대조군 펩타이드(Z-DNC)를 처리한 후에는 증가하지 않았다. 실제로, Z-DTP2는 TNFα 자극-본 발명의 양성 대조군이 한 것(2,000 U/ml) 보다 훨씬 더 강한 JNK의 활성을 유발했다. Z-DTP2의 유사한 효과가 MKK7 활성에서 보였으며 JNK 및 MKK7 활성을 관찰하기 위한 인산화 효소 분석을 이용했다(데이터 생략). 특히, Gadd45β의 생물학적 활성과 함께 보여진 것과 같이(참고 문헌 참조: De Smaele, et al. (2001) Nature 414:306-313; Papa, S et al. (2004) Nat. Cell Biol. 6, 146-153; Papa, et al. (2007) J.Biol.Chem. 282: 19029-19041; Papa, et al. (2008) J. Clin. Invest. 118:191-1923), 다발성 골수종 세포에서의 Z-DTPl 및 mDTP3(데이터 생략)의 효과뿐만 아니라, Z-DTP2의 효과는 상기 화합물이 IKK/NF-кB, ERK 및 p38 경로에서는 효과가 관찰되지 않는 것과 같이(데이터 생략), MKK7/JNK 경로에 대해 특이적이었다. 중요하게, Z-DTP의 처리가 다발성 골수종 세포주, Z-DTP-유도 사멸에 저항성을 가지는 RPMI-8226에서 JNK 활성화에 실패하였다(도 8A 및 9 참조). 상기 및 다른 데이터(도 20 참조)는 Z-DTP가 JNK 세포 독성 신호 활성화에 의해 종양 세포주에서 세포사멸을 유발한다는 견해를 뒷받침한다.
결정적으로, 도 12A 및 12B에 나타내어진 상기 데이터는 암 세포주의 Z-DTP-유발 사멸에 대한 민감성이 매우 높은 정도의 통계적 유의성(statistical significance)으로 내인성 Gadd45β 발현 정도와 상관관계가 있는 것을 보여준다(p<0.01). Gadd45β mRNA 발현은 29 암 세포주의 패널에서 qRT-PCR 분석을 이용하여 평가되었다(도 12A, 위쪽 패널, 붉은 컬럼). 값은 β-액틴으로 정규화되었다. 같은 암 세포주에서의 생존 능력/증식(Viability/proliferation)은 Z-DTP2를 10 μΜ 144 hrs 동안 처리한 후의 [3H] 티미딘 흡수 수행에 의해 측정되었다. 상기 결과는 도 12A의 아래쪽 패널에서 보여졌다(검은 컬럼). 본 발명에서 보고한 값은 미처리된 세포에서 측정된 c.p.m.에 상대적인 Z-DTP로 처리된 세포에서 측정된 c.p.m.의 퍼센트를 나타낸다. 도 12B는 도 12A에서 보여준 같은 실험으로서 Z-DTP2 처리 후에 관찰된 세포 생존/증식 퍼센트에 비한 Gadd45β 발현의 상관도를 보여준다. 2 지표들의 도메인 사이의 상관 계수의 유의성은 매우 높다고 보여질 수 있다(p<0.01)(GraphPad 소프트웨어를 이용하여 계산된 두 변수(variable) 사이 관련 정도를 정량한 피어슨 상관 계수(Pearson correlation)). 이것이 인간에서 성공적인 치료의 개발을 위한 중요 문제이다. 상기 데이터는 세포에서의 Gadd45β에 대한 Z-DTP의 높은 타겟 특이성을 입증한다. 상기 결론의 추가적 지지에서, MKK7의 sh-RNA-매개된 침묵(silencing)이 상기 세포들의 Z-DTP-유도 사멸에 대한 완벽한 저항을 만드는 반면, Gadd45β의 sh-RNA-매개된 침묵이 다발성 골수종에서 세포 사멸을 유발한다(도 16, 17, 18, 및 20). 동시에, 상기 데이터는 또한 DTP-에 근거를 둔(DTP-based) 치료가 임상에 들어가야 하며, 간단하고 비용-효율이 높은 qRT-PCR 분석을 통한 환자 응답자 개체군(patient responder populations)을 예측하는 것이 가능할 것임을 보여준다. 따라서, 다발성 골수종 환자 기원의 원발성 세포(primary cell)가 Gadd45β 발현 정도에 대해 분석될 수 있으므로, Gadd45β 발현 정도가 높은 환자는 본 발명의 화합물을 이용한 치료에서 가장 혜택을 받을 것으로 여겨질 수 있다. 그러므로, 본 발명의 중요한 측면은 테라노스틱(theranostic) 측면이다-즉, 환자에서의 DTP의 치료 반응을 예측하기 위한 임상적인 유용한 분석의 적용이다.
실시예 9. Z- DTP 파생물의 패널의 실험관내 및 세포에서의 IC 50
본 발명자들은 출발 지점으로서의 최근의 리드를 이용한 암 및 다른 질병 및 질환의 치료를 위한 안전하게 전달하기 위한 최적화 유도 및 효과적인 새로운 치료의 광범위한 계획을 개발해왔다. Z-DTP2는 실험관내에서 이미 높은 안정성, 높은 용해성, sub-nM 활성, 및 다발성 골수종 세포(원발성 및 세포주) 및 다른 암세포들에서 높은 타겟 특이성 및 일반 세포에서의 세포 독성이 없는 좋은 활성을 보인다. Z-DTP2는 실험관내에서 이미 높은 안정성, 높은 용해도, sub-nM 활성을 보이고 다발성 골수종 세포(원발성 및 세포주) 및 다른 암세포에서 높은 타겟 특이성 및 일반 세포에는 세포독성이 없이 좋은 활성을 보인다(도 3C, 4, 8, 9, 12, 14 및 15; 표 IV; 데이터 생략). 또한, Z-DTP2는 생체내에서 탁월한 시작 DMPK(starting DMPK) 및 안전한 특성을 보인다(단일 정맥 볼루스(bolus)로 쥐에 투여)(표 VIII 및 IX 참조). 본 발명자들은 높은 생물활성을 유지하는 동안 향상된 ADMET 특성을 가진 DTP 파생물을 생산하기 위해 합리적인 분자 디자인을 수행했다(Geeson MP. 2008 J Med Chem. 51 :817-834). 상기 접근에서, 본 발명자들은 생체내에서 생물활성의 원인이 되는 구조 요소(structural elements)를 보존하기 위해 ADMET 특성에 영향을 미치는 분자의 중요 큰 특성인 사이즈(MW), 친유성(lipophilicity)(LogP), 및 이온화 상태(ionization state)(분자 전하(molecular charge))를 본 발명자들의 약물특이분자단(pharmacophore) 모델을 이용하여 변형하였다(도 13 참조). 본 실시예에서 기재한 바와 같이, 본 발명자들의 가장 최근 파생물들(예를 들어, mDTP3 및 mDTP4)은 실험실내에서 높은 능력을 유지하나, 주로 감소된 MW(~500 대 >700)와 함께 다발성 골수종 세포에서 향상된 사멸 활성을 보이므로 리간드 효율을 증가시킨다(도 13). 또한, 고리화(cyclization), 내재화(internalize)된 취약한(vulnerable) 아미드(amides)에 차단 기(blocking groups)의 첨가, 및/또는 비-아미드 연결(linkages)로 대체(replacement)한 것을 포함한, 펩타이드들의 향상된 세포 활성 및 PK 값의 추가적인 의미를 적용하였다.
재료 및 방법
33 화합물이 라이브러리 검색으로부터 도출된 Tyr-Glu-Arg-Phe 및 Tyr-Asp-His-Phe 선도 테트라펩타이드 서열를 기초로 디자인되었다(도 3 참조). 모든 화합물들-화합물 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 및 16를 제외한(표 V 참조)-은 고전적인 Fmoc/tBu 화학(as described in the reference by Fields GB, Noble RL. Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxy-carbonil amino acids. Int J Pept Protein Res 1990;35:161-214)에 따른 고체상 방법에 의해 제조되었다. 오직 D-입체배치(configuration)의 아미노산들만이 표 V에 나타낸 펩타이드에 조립하기 위해 사용되었다. N-말단 아세틸화(acetylation)가 5% DIE A(디-이소프로필-에틸아민(di-isopropyl-ethylamine))를 함유한 디메틸포름아마이드(dimethylformammide, DMF)에 녹아있는 10% 아세트산무수물(acetic anhydride)처리에 의해 수행되었다. 필요한 곳에, DMF/5% DIEA에 녹아있는 0.5 M Z-OSu(Benzyloxycarbonyl-N-hydroxysuccinimide)를 처리한 레진(on-resin)에 의해 Z 기가 도입되었다. 화합물들은 TFA(트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid)) 및 스캐빈저(scavengers) 처리를 이용하여 레진으로부터 잘렸으며, 그 후 균질화하기 위해 정제(preparative) 역상(reverse phase)(RP)-PLC에 의해 정제되었다. 화합물 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 및 16(표 V)의 합성은 외부에 위탁하였다. 화합물 동일성 및 순도는 LC-MS 및 NMR 분석을 이용하여 평가되었다. X1은 벤조산(benzoic acid), X2은 벤질산(benzylic acid), Y1은 아닐린(aniline), Y2은 벤질아민(benzylamine), 및 Y3는 펜에틸아민(phenetylamine)이었다. 상기 화합물들은 모두 스탁 농도 5 mM로 DMSO에 용해되었고, 부분 표본(aliquots)은 그 후에 ELISA 경합성 분석(ELISA competition assays)을 위해 바람직한 농도를 얻기 위해 버퍼에 순차적으로 희석되었다. 단백질들은 Tornatore L, et al. (2008). JMol Biol;378:97-l 11에서 보고된 바와 같이 제조되었다.
ELISA 경합성 결합 분석(ELISA competition binding assays)이 참고문헌인Tornatore L, et al. (2008). J Mol Biol; 378:97-111(또한, 실시예 2 및 3에 기재된 방법 참조)에서 보고된 바와 같이, 0.01 nM 내지 10 nM의 범위의 증가하는 농도의 펩타이드를 이용하여 수행되었다. 구체적으로, GST-MKK7은 42 nM에서 96-웰 마이크로타이터 플레이트(microtiter plates)의 웰에 고정되었다. 경합하는 화합물들은 비오틴- hGadd45β(21 nM)와 미리 인큐베이션되었고 그 후에 코팅된 인산화효소와 함께 인큐베이션되었다. 각각의 화합물에 대하여, 실험실내 IC50은 Gadd45β와 MKK7의 결합을 경쟁자들이 없을 때 관찰되는 결합에 비해 50% 감소시킨 농도로서 계산되었다.
본 발명자들은 각각의 화합물의 두 대표적인 민감한 다발성 골수종 세포주인 KMSl 2 및 KMS-11에서 DTP 파생물의 생존능력/증식에 대한 효과를 밝혔다. 실시예 6 및 8에 기재된 바와 같이 KMSl1 및 KMSl2 다발성 골수종 세포주에서 [3H]티미딘 흡수 분석이 수행되었다(도 7A, 7B, 7C, 8A, 8B, 및 8C, 및 표 IV). 구체적으로, 세포들은 96-웰 플레이트에서 배양되었고 기재된 화합물이 0.1 nM 내지 10 μΜ 범위의 증가하는 화합물 농도로 96-웰의 웰에 각각 처리되었다. 또한, 세포 배양 및 화합물 처리가 도 7A, 7B, 7C, 8A, 8B, 및 8C, 및 표 IV 에 기재된 바와 같이 수행되었다. [3H]티미딘 흡수, 세포 생존능력/증식이 나타낸 바와 같이 화합물을 1,3 또는 6일 동안 처리한 후에 측정되었다. 이때, 각각 화합물의 IC50이 실시예 6에 기재된 바와 같이 화합물이 처리안된 세포에서 관찰된 생존/증식에 비해 세포 생존/증식의 50% 억제를 초래한 농도 측정에 의해 계산되었다. 실험실내(ELISA) 및 세포(KMS-11 및 KMS-12 세포)에서의 본 발명의 실시예에 기재된 33 화합물의 IC50는 표 V에 나타냈다.
결과
표 V에 라이브러리 검색 및 선도 물질 최적화 화학(lead optimization chemistry)에서 창출된 공통 염기서열(consensus sequences)인 Tyr-Glu-Arg-Phe 및 Tyr-Asp-His-Phe에 기초하여 디자인된 테트라- 및 트리-펩타이드의 패널의 실험관내 및 세포내 IC50 값을 나타냈다.
상기 화합물들은 다른 농도에서 화합물의 활성을 시험하여 비오틴-Gadd45β의 코팅된 GST-MKK7으로의 결합의 변위(displacement)가 측정되는 실험실내에서 ELISA 경합성 분석을 이용하여 검색되었다. 선별된 화합물의 그룹에 대한 생체내 IC50는 화합물의 종양세포치사(tumoricidal) 활성을 평가하기 위해 [3H]티미딘 흡수 분석을 이용하여 KMS-11 및 KMS-12 다발성 골수종 세포주에서 측정되었다. 세포에서의 기재된 화합물의 IC50는 1, 3 또는 6일 동안 처리한 후에 측정되었다. Z는 벤질옥시카르보닐기(benzyloxycarbonyl group)를 의미한다. 표 V에서 나타낸 바와 같이, 세포에서 가장 활성을 갖는 화합물은 Z-DTP2를 의미하는 화합물 9(KMS-11 세포에서 IC50 = 10 nM; KMS-12 세포에서 IC50 = 66 nM) 및 mDTP3를 의미하는 화합물 17(KMS-11 세포에서 IC50 = 25 nM; KMS-12 세포에서 ICS0 = 16 nM)이다.
본 실시예에 기재된 33 화합물은 Gadd45β/MKK7 상호작용을 방해하는 그들의 능력에 대해 모두 실험실내 ELISA 경합성 분석에서 검색되었다(표 V). 또한, 화합물 18, 20, 21, 22, 32, 및 33은 제외한 상기 화합물들의 대부분은 KMS-11 및/또는 KMS-12 다발성 골수종 세포주에서 [3H]티미딘 흡수 분석을 이용하여 세포에서 검색되었고, 화합물들의 ICS0가 1, 3 및 6일째에 상기 세포에서 측정되었다. 표 V에서 나타내는 바와 같이, 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 15 및 17은 두 세포주 모두에서 시험되었다. 화합물 15 및 19는 오직 KMS-12 세포에서만 시험되었다. 화합물 10, 11, 12, 13, 14, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 및 31은 오직 KMS-11 세포주에서만 시험되었다. 화합물 18, 20, 21, 22, 32, 및 33은 실험실내의 그들의 상대적으로 낮은 활성 때문에 시험되지 않았다.
표 V는 시험된 화합물의 실험실내 ICS0는 100 pM(화합물 7, X2-Asp-His-Y3; 화합물 15, X2-Glu-Arg-Y3; 및 compound 19, Z-Tyr-Arg-Phe 참조) 및 >10 nM(화합물 24, 27, 30, 31, 32, 및 33 참조) 사이의 범위이다. 보이는 바와 같이, 실험실내에서 활성을 갖는 화합물의 일부가 세포내 흡수가 어렵기 때문에 세포내에서 상대적으로 낮은 활성을 가질지라도, 실험실내에서 존재하는 화합물의 활성은 그들의 세포내의 활성에 반영된다, 예를 들어, 화합물 15(실험실내 IC50 = 100 pM, 및 KMS-11 세포에서 IC5o = 263 nM를 보이는)와 화합물 9(Z-DTP2; 실험실내 IC50 = 190 pM 및 KMS- 11 세포에서 IC50 = 10 nM를 보이는)의 비교. 또한, 세포에서의 데이터는 증가한 세포 흡수 때문에, N-말단에 세포내 높은 활성을 야기하는 Z 기 및/또는 이온 측쇄(basic side chains)의 존재를 보여준다. 이온 측쇄의 관련성의 예는, 화합물 19(Z-Tyr-Arg-Phe-NH2; KMS-12 세포에서 3일째에 IC50 = 81 nM)의 세포내 ICs0를 화합물 8(Z-Tyr-Asp-Phe-NH2; KMS-11 세포에서 3일째에 IC50 >10 μΜ)(즉, Arg에서 Asp으로 교환)의 ICs0와, 또는 화합물 16(Z-Tyr-Glu-Phe-NH2; KMS-11 세포에서 3일째에 IC50 = 3.0 μΜ)(즉, Arg에서 Glu로 교환)의 ICs0와 비교한다; 또한 모두 sub-nM 범위에 있는 상기 세 화합물의 실험실내 낮은 IC50과 비슷한 것을 기재한다(표 V). Z 기의 관련성의 예는, Z-DTP2의 U266, KMS-11, 및 NCI-H929 세포에서의 IC50(도 7A)를 Ac-DTP2의 IC50(도 7B)와 비교한다; 또한 상기 두 화합물의 실험실내 유사한 IC50 참조(도 3C 및 4; 데이터 생략). 또한, 상기 데이터는 양 말단에 방향족 고리가 없는 화합물(예를 들어, 화합물 20 및 21)이 실험실내 및 방향족 고리들이 생물 활성을 위해 전적으로 요구되는 것을 나타내는 세포내 모두에서 불활성함을 보여준다(표 V).
실시예 10. 추가의 Z- DTP 의 파생물들의 패널의 실험실내 IC 50
재료 및 방법
18개의 추가 화합물의 패널은 1) 두 방향족 고리 사이의 거리; 2) 가운데 위치한 아미노산의 특성; 3) N-말단에 아세틸기 존재; 4) 및 방향족 고리의 치환이 존재의 생물활성에 대한 관련성을 조사하기 위해, 선도 트리펩타이드 서열 Tyr-Arg-Phe(즉, mDTP3)을 기반으로 디자인되었다(표 VI 참조). 모든 화합물들은 고전적인 Fmoc/tBu 화학에 따른 고체상 방법에 의해 제조되었다(참고 문헌 Fields GB, Noble RL. Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxy-carbonil amino acids. Int. J. Pept. Protein Res. 1990;35:161-214에 기재된 바와 같이). N-말단 아세틸화는 5% DIEA (di-isopropyl-ethylamine)를 포함한 디메틸포름아마이드(dimethylformammide, DMF)에 녹아있는 10% 아세트산 무수물(acetic anhydride) 처리에 의해 수행되었다. 화합물들은 TFA(trifluoroacetic acid) 및 스캐빈저 처리를 이용하여 레진으로부터 잘렸으며, 그 후에 균질화를 위해 제조 역상(RP)-PLC에 의해 정제되었다. 화합물 동정 및 정제는 LC-MS 및 NMR 분석에 의해 평가되었다. 화합물은 RP-HPLC를 이용하여 정제되었고, 그 후에 모두 DMSO에 스탁 농도 5 mM로 용해되었으며 사용되기 전까지 보관되었다. 부분표본들은 ELISA 경합성 분석에 기재된 농도를 얻기 위해 그 후에 버퍼에 순차적으로 희석되었다. ELISA 경합성 결합 분석은 참고문헌 Tornatore L., et al. (2008). JMol Biol;378:97-l 11에 보고된 바와 같이(또한 실시예 2 및 3 참조) 펩타이드를 0.01 nM 내지 10 nM 사이의 증가하는 농도에서 이용하여 수행되었다. 구체적으로, GST-MKK7가 42 nM로 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 고정되었다. 경쟁하는 화합물들은 biotin-hGadd45β(21 nM)와 함께 예비인큐베이션되었고 그 후에 코팅된 인산화효소와 함께 인큐베이션되었다. 화합물 각각에 대해, 실험실내 IC50가 경쟁자의 부재시 관찰된 결합에 비해 MKK7에 결합하는 Gadd45β가 50% 감소하는 농도로서 계산되었다.
결과
표 VI는 mDTP3(Ac-D-Tyr-D-Arg-D-Phe)에 기초하여 디자인된 18 트리펩타이드(tripeptides) 및 디펩타이드(dipeptides) 패널의 IC50 값을 보여준다. 화합물은 하기 지표의 생물활성에 대한 영향을 조사하기 위해 디자인되었다: 1) N- 및 C-말단에서 두 방향족 고리 사이의 거리(화합물 Al, Al bis, A3, A6, A7, 및 A8 참조); 2) 중심에 위치한 아미노산의 특성(화합물 B2, B13, B16, B16 bis, 05, 및 05 bis 참조); 3) 잔기의 방향족 고리 위치 1 및 4에 수산기(hydroxyl group)의 존재 또는 부재(화합물 A9, Ol, 03, 05, 05 bis, 06, 07, 및 08); N-말단에서의 아세틸 기의 존재(화합물 A9 및 07; B16 및 B16 bis; 01 및 OS; 03 및 06; 05 및 05 bis 참조). 상기 18 추가의 화합물들은 활성에 대해 실험실내에서 ELISA 경합성 분석 및 0.01 nM 내지 100 nM 범위로 증가하는 화합물 농도를 이용해서 시험되었다. 표 VI에 보이는 바와 같이, 시험된 모든 디펩타이드(dipeptides)는 N-말단 또는 C-말단 모두에서 Phe 또는 Tyr 아미노산의 존재에 관계없이 불활성(inactive)이었다(화합물 Al, Al bis, A7 및 A8 참조). 또한, 트리펩타이드의 중심에 위치한 알파-아미노산보다 긴 스패이서의 도입은 결과를 실험실내에서 활성의 결여를 초래했다(β-알라닌(alanine) 및 ε-카프로산(caproic acid)을 각각 가운데 자리에 갖는, 화합물 A3 및 A6 참조). 테트라펩타이드의 위치 Y2 및 Y3가 Asp/Glu 또는 His/Arg에 의해 차지된 것은 사실이 아니다-화합물 9(즉, Z-DTP2)의 실험실내 IC50을 화합물 16(즉, mDTP2)의 실험실내 IC50과 비교하고, 화합물 1(즉, Z-DTP1)의 실험실내 IC50을 화합물 8(즉, Z-Tyr-Asp-Phe-NH2)의 실험실내 IC50과 비교한다. 이것이 실험실내에서 두 활성 방향족 기 사이에 여분의-아미노산을 포함한 Z-DTP2 및 Z-DTP1가 높은 능력을 유지한 이유이다(표 V의 IC50 참조). 현저하게, 표 VI에서 보여진 바와 같이, N-말단 티로신(tyrosine)에서 수산기의 제거는 아세틸기의 존재와 관계없이 또한 VI 실험실내에서 생물 활성의 완전한 결여를 초래했다(화합물 A9, 01, 05, 05 bis, 07, 및 08 참조). 의미 있게도, 중요한 기여에 대한 이와 같은 관찰은 수산기의 활성 화합물과 타겟 단백질의 상호작용에 중요한 기여를 강조한다. 사실, 상기 기는 아마 H-결합 또는 극성 상호작용의 형성에 관련되었을 것이다. 대조적으로, C-말단에서 방향족 고리의 수산기의 존재는 화합물의 활성에 영향을 미치지 않았다(화합물 A9, 01, 03, 05, 05 bis, 06, 07 및 08 참조). 마찬가지로, 아르기닌을 히스티딘 또는 라이신과 같은 다른 염기성 아미노산으로 또는 프롤린으로 교체하는 것은 실험실내에서 생물활성을 바꾸지 않아(B2, B 13, B 16, B 16 bis, 05, 및 05 bis 참조), Gadd45β/MKK7 상호작용을 방해하는 화합물의 능력에서 상기 잔기의 측쇄가 중요하지 않은 역할을 함을 암시한다.
실시예 11. 다발성 골수종 세포 생존에서 Gadd45 β의 필수적인 역할을 수립하는 렌티바이러스 감염( Lentiviral infections )
재료 및 방법
다발성 골수종 세포주의 생존에서 Gadd45β 및 MKK7의 역할을 측정하기 위해, 본 발명자들은 상기 세포에서 Gadd45 또는 MKK7의 발현 하향-조절의 효과를 조사하였다(도 16A, 16B, 16C, 17A, 17B, 18A, 18B, 18C, 19A, 19B, 19C 참조). 이것을 위하여, Gadd45β 및 MKK7 유전자의 침묵을 각각 초래하는 Gadd45β- 및 MKK7-타겟팅하는 sh-RNAs를 발현하는 렌티바이러스(lentiviruses)로 감염을 수행하였다. 표적 작은 헤어핀(small hairpin)(sh)-RNAs를 암호화하는 DNA 서열은 표 VII에 기재되었다. 표적 sh-RNA 서열(즉, sh-Gadd45β-l, sh-Gadd45β-2, sh-Gadd45β-3, sh-MKK7-l, 및 sh-MKK7-2) 및 비-특이적 대조군 서열 sh-NS-1 및 sh-NS-2는 렌티바이러스 벡터 LentiLox3.7의 BamHl 및 Hpal 제한효소 자리 사이에 도입되었다(참고문헌 Yang et all 2006 PNAS 103, 10397-10402 참조). HEK-293T 세포에서 높은-역가(titer)의 렌티바이러스 제조의 산물은 근본적으로 참고문헌 Pham et all 2004 Cell 116, 529-542 및 Yang et all 2006 PNAS 103, 10397-10402에 기재된 같은 조건을 이용하여 수행되었다. Gadd45β- 및 MKK7-표적 sh-RNA 서열 및 비-특이적 대조군 sh-RNA 서열의 도입을 위해, 참고문헌 Yang et all 2006 PNAS 103, 10397-10402에 기재된 바와 근본적으로 같은 출판된 프로토콜에 보고된 바와 같이, 다섯 개의 대표적인 Z-DTP-민감성 다발성 골주송 세포주 ARH-77, NCI-H929, U266, KMS11 및 KMS12, 및 Z-DTP-저항성 다발성 골수종 세포주 RPMI-8226가 LentiLox3.7 렌티바이러스로 감염되었다. 감염 5일 후, eGFP□ 다발성 골수종 세포들은 BD FACSAria™ II 세포 분류기(cell sorter)를 이용하여 분류되었고, 그 후에 세포 생존 및 세포 증식 분석을 시작하기 전에 2일 동안 그대로 두었다. 감염된 다발성 골수종 세포의 생존 능력이 8일을 기울여 강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, eGFP)(감염된 세포 표지)의 발현을 측정하는 유세포 분석기(flow cytometry) 및 세포 계수(cell counting)에 의해 관찰되었다(도 16A, 16B, 16C, 17A, 17B). 세포사멸(도 18A, 18B, 및 18C) 및 세포 주기 조절(cell cycle distribution)(도 19A, 19B, 및 19C)은 Riccardi C. and Nicoletti I 2006 Nature Protocols 1, 1458 - 1461에 기재된 바와 같이(실시예 8에 기재된 방법 참조) PI 핵 염색 분석 수행에 의해 측정되었다.
결과
16A, 16B, 및 16C는 Z-DTP-저항성 다발성 골수종 세포주인 RPMI-8226(도 16C)에서와 달리, Z-DTP-민감성 다발성 골수종 세포주인 ARH-77(도 16A) 및 NCI-H929(도 16B) 각각에서 Gadd45β 발현의 sh-RNA-매개 침묵이 빠른 세포 사멸, 감소된 증식을 초래하는 것을 보여준다. 도 16A, 16B, 및 16C 에서 보여준 실험에서, 다발성 골수종 세포주는 Gadd45β-특이적 sh-RNAs(sh-Gadd45β-l, sh-Gadd45β-2, 또는 sh-Gadd45β-3), MKK7-특이적 sh-RNAs(sh-MKK7-l 또는 sh-MKK7-2), 또는 비-특이적 sh-RNAs(sh-NS-1 또는 sh-NS-2)를 각각 발현하는 렌티바이러스로 감염되었고, 감염된 세포들의 생존 능력은 8일에 걸쳐 강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, eGFP)를 발현하는 세포, 즉 감염된 세포를 나타내는 유세포분석기 및 세포 계수를 이용하여 관찰되었다. 같은 시간 나타낸 eGFP+ 다발성 골수종 세포의 같은 배양 0일째의 생존능력에 비해 eGFP+(렌티바이러스-감염된) 다발성 골수종 세포의 생존 퍼센트를 나타냈다. 세포들은 표준 방법(Yang H et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Jul 5;103(27): 10397-402에 보고된)을 이용하여 기재된 sh-RNA 및 eGFP를 발현하는 pLentiLox.3.7 렌티바이러스로 감염되었다. 5일 후, eGFP+ 세포들은 BD FACSAria™ II 세포 분류기를 이용하여 분류되었고, 그 뒤에 세포 생존 능력 분석을 시작하기 전에 2일 동안 그대로 두었다. 0일째로서의 상기 시간(즉, 생존 능력 분석 시작)은 도 16A, 16B, and 16C에 나타냈다. 데이터는 MKK7 발현의 억제가 아닌, Gadd45β 발현의 억제가, 세포 독성에 저항성이 있는 RPMI-8226 다발성 골수종 세포주에서가 아닌(도 16C), Z-DTP-유도 세포 독성에 민감한 다발성 골수종 세포주(즉, ARH-77 및 NCI-H929 세포주)(각각, 도 16A 및 16B)에서 빠른 세포 사멸을 유발하는 것을 보여준다. 상기 데이터는 다발성 골수종에서 Gadd45β/MKK7 복합체에 대한 Z-DTP의 표적 특이성(target specificity)를 추가로 수립한다(도 7, 8, 9, 및 12 참조; 사멸 및 qRT-PCR 분석). 실제로, 본 결론과 더욱 일치하여, Gadd45β의 침묵 후에 관찰된 다발성 골수종 세포 증식 억제의 동역학(kinetic)은 Z-DTP를 처리한 후에 세포에서 관찰된 것과 매우 유사하다(도 7A, 8B, 및 8C 참조). 또한, 데이터는 Gadd45β이 다발성 골수종 세포 생존에서 필수적인 역할을 하는 것을 입증하므로, 다발성 골수종에서 치료적 표적으로서 Gadd45β 추가적으로 검증한다.
Gadd45β의 sh-RNA-매개 침묵을 보여주는 도 17A 및 17B은, 오직 Z-DTP-유도 사멸에 민감한 다발성 골수종 세포주(예를 들면, ARH-77 및 NCI-H929 세포주; 도 7 및 8 참조, Z-DTP-유도 사멸 민감성)의 생존/증식에 강력한 억제 활성을 갖는다. 두드러지게 대조적으로, Z-DTP-저항성 다발성 골수종 세포주 RPMI-8226의 생존 능력은 sh-RNA-매개 Gadd45β 억제에 의해 완전히 영향을 받지 않았다. 도 17A 및 17B에서 세포 증식/생존이 실시예 6 및 8에 기재된 바와 같이 수행된 [3H]티미딘 흡수 분석을 이용하여 측정되었다. 도 17A에 보여진 것은 Gadd45β 또는 MKK7의 침묵 후의 세 대표적 다발성 골수종 세포주 RPMI-8226, NCI-H929 및 ARH-77의 생존 능력이다. 도 17B는 세 개의 다른 Gadd45β-특이적 sh-RNA(sh-Gadd45β-l, sh-Gadd45β-2, 또는 sh-Gadd45β-3), 두 개의 다른 MKK7-특이적 sh-RNA(sh-MKK7-l 또는 sh- KK7-2), 및 두 개의 다른 비-특이적 sh-RNA(sh-NS-1 또는 sh-NS-2)를 이용한 Gadd45β 또는 MKK7의 침묵 후 다발성 골수종 세포 ARH-77의 생존 능력/증식을 보여준다. 다발성 골수종 세포주는 나타낸 sh-RNA-발현 pLentiLox.3.7 렌티바이러스로 감염되었고, 그 후에 eGFP+ 다발성 골수종들(즉, 렌티바이러스로 감염된 세포들)은 도 16에 나타낸 바와 같이 BD FACSAria™ II 세포 분류기를 이용하여 분류되었다. 도 17A 및 17B에 나타낸 [3H]티미딘 흡수 분석은, 도 16에서 8일째에 상응하는 세포 분류 10일 후에 수행되었다. 세포 증식의 측정으로 보여진 [3H]티미딘 흡수 퍼센트(즉, c.p.m.)는, 8일째에(즉, 세포 분류 10일 후) 동일한 세포에서 0일째(즉, 세포 분류 2일 후)에 발생한 [3H]티미딘 흡수에 비례한다. 상기 데이터는 다발성 골수종에서 Z-DTP의 Gadd45β/MKK7 복합체에 대한 표적 특이성을 더욱 수립하며(도 7, 8, 9, 12, 및 16 참조), Gadd45β의 다발성 골수종 세포 생존에서의 필수적인 역할을 확인한다. 동시에, 추가적으로 다발성 골수종에서 치료적 표적으로서의 Gadd45β를 입증한다.
도 18A, 18B, 및 18C은 Gadd45β의 sh-RNA-매개 침묵이 Z-DTP-민감한 다발성 골수종 세포주 ARH-77(도 18A) 및 NCI-H929(도 18B)에서 효과적으로 세포 사멸을 유도하나, Z-DTP-저항성 다발성 골수종 세포주인 RPMI-8226(도 18C)에서는 아닌 것을 보여준다(도 16 및 17, sh-RNA-매개 침묵; 도 7, 8, 및 12, Z-DTP-유도 사멸에 대한 다발성 골수종 세포주 민감성 및 Gadd45β 발현 정도, 참조). 도 18A, 18B, 및 18C에서 세포 사멸 유도가 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행된 PI 핵 염색 분석의 이용에 의해 측정되었다. 상기 데이터는 도 16 및 17에서 관찰된 Gadd45β 발현 하향-조절에 의해 유발된 다발성 골수종 세포 생존/증식의 억제가 세포사멸(apoptosis) 경로에 의해 매개된 예정세포사(programmed cell death)의 유도 때문임을 입증했다. 특히, 세포사멸의 유효한 유도가 같은 렌티바이러스 감염 또는 MKK7-특이적 sh-RNA(sh-MKK7-l 및 sh-MKK7-2) 또는 비특이적 sh-RNA(sh-NS-1 및 sh-NS-2) 없이 다발성 골수종 세포주에서 관찰되었다(도 18A, 18B, 및 18C). 다발성 골수종 세포주는 sh-RNA-발현 pLentiLox.3.7 렌티바이러스로 감염되었고, eGFP+ 다발성 골수종 세포(즉, 렌티바이러스로 감염된 세포)는 도 16에서와 같이 BD FACSAria™ II 세포 분류기를 이용하여 분류되었다. PI 핵 염색 분석은 도 16에서 8일째에 상응하는 세포 분류 10일 후에 수행되었다. 세포 사멸 퍼센트(즉, sub-G1 DNA 함량을 나타내는 세포)는 히스토그램에 나타냈다. 중요한 것은, 다른 Gadd45β-특이적 sh-RNAs(즉, sh-Gadd45β-l, sh-Gadd45β-2, 및 sh-Gadd45β-3)에 의해 유도된 세포 사멸의 정도는 각각의 상기 Gadd45β-특이적 sh-RNAs에 의해 유도된 Gadd45β 하향조절(downregulation)의 정도와 연관된다(도 18A; 데이터 생략). 도 18A, 18B, 및 18C의 데이터는 다발성 골수종 세포에서 Z-DTP의 Gadd45β/MKK7 복합체에 대한 표적 특이성을 추가적으로 수립하고(도 7, 8 and 9, Z-DTP로 사멸 분석; 도 12, Gadd45β 발현 및 암 세포의 Z-DTP-유도 사멸 민감성 사이의 관련 통계적 유의성(statistically significant); 도 16 및 17, MKK7의 하향조절에 의해서는 아닌, Gadd45β의 하향 조절에 의한 다발성 골수종 세포주 사멸의 유도, 참조), Gadd45β가 다발성 골수종 세포 생존에서 필수적인 역할을 함을 확인한다. 동시에, 추가적으로 다발성 골수종에서 치료적 표적으로서의 Gadd45β를 입증한다.
도 19A, 19B, 및 19C는 각각 MKK7 또는 Gadd45β의 sh-RNA-매개 침묵이 다발성 골수종 세포주에서 세포-주기조절(cell-cycle distribution)에 영향을 끼치지 않는 것을 보여준다. 보여진 대표적인 렌티바이러스-감염된 다발성 골수종 세포주-즉, ARH-77(도 19A), NCI-H929(도 19B), 및 RPMI-8226(도 19C)-는 도 18에서 같은 실험으로부터 나타내졌다. 도 19A, 19B, 및 19C에서 보여준 세포 주기 분석은 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행된 PI 핵 염색 분석 이용에 의해 수행되었다(도 18 참조). 도 18에서 보여진 데이터(PI 염색 특성은 세포사멸을 강조하는 로그자(logarithmic scale)로 나타냈다)와는 다르게, 상기 도에서 PI 염색(즉, FL2-A)은 세포-주기 조절을 강조하는 직선자(linear scale)로 나타냈다. 세포 주기(즉, G S, 및 G2/M)의 다른 주기에 있는 다발성 골수종 세포의 퍼센트는 히스토그램으로 나타냈다. 세포-주기 분석은 다발성 골수종 세포주 ARH-77(도 19 A) 및 NCI-H929(도 19B)의 경우에 상기 sh-RNA의 발현 후의 엄청난 세포사멸의 유도 때문에, Gadd45β-특이적 sh-RNA와 함께 수행될 수 없었다(도 18A 및 18B 참조). 그럼에도 불구하고, 도 19A에서 보이는 바와 같이, Gadd45β 하향-조절은 Z-DTP-저항성 세포주 RPMI-8229에서 세포-주기 조절에 영향을 미치지 않았다.
실시예 12. MKK7 발현의 하향 조절은 정상적으로 민감한 다발성 골수종 세포주가 Z- DTP -유도 사멸에 대해 완전히 저항을 가지게 만든다 .
재료 및 방법
Z-/mDTP의 Gadd45β/MKK7 복합체에 대한 표적 특이성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 Z-/mDTP-유도 사멸에 민감한 다발성 골수종 세포주의 민감성에 대한 MKK7의 발현 하향-조절의 효과를 조사했다(도 20A, 20B, 및 20C). 그것을 위하여, 대표적인 다발성 골수종 세포주인 ARH-77를 MKK7 유전자의 침묵을 초래하는 MKK7-특이적 sh-RNA 또는 대조군 비-특이적 sh-RNA를 발현하고있는 렌티바이러스로 감염시켰다. 표적 작은 헤어핀(small hairpin)(sh)-RNAs를 암호화하는 상기 DNA 서열은 표 VII에 기재하였다. MKK7-표적 sh-RNA(MKK7-targeting sh-RNA) 서열 및 비-특이적 대조군 서열은 렌티바이러스 벡터인 LentiLox3.7의 BamHl 및 Hpal 제한효소 자리(restriction sites) 사이에 실시예 11에 기재된 바와 같이 도입되었다(참고문헌 Yang et all 2006 PNAS 103, 10397-10402 참조). HEK-293T 세포에서의 렌티 바이러스 제조(lentiviral preparation)의 높은-역가(hig-titer)의 산물은 참고문헌 Yang et all 2006 PNAS 103, 10397-10402에 기재된 조건과 근본적으로 동일하게 수행되었다. MKK7-표적 및 비-특이적 대조군 sh-RNA 서열의 도입을 위해, 대표적인 Z-DTP-민감한 다발성 골수종 세포주인 ARH-77가 발간되어 보고된 참고문헌 Yang et all 2006 PNAS 103, 10397-10402에 기재된 바와 근본적으로 같은 프로토콜로, MKK7-특이적 sh-RNAs(sh-MKK7) 또는 비-특이적 sh-RNAs(sh-NS)를 발현하고있는 LentiLox3.7 렌티바이러스로 감염되었다. 감염 5일 후, eGFP□ ARH-77 세포들은 BD FACSAria™ II 세포 분류기를 이용하여 분류되었다. 그 뒤에, 세포 분류 10일 후, 렌티바이러스-감염된 다발성 골수종 ARH-77 세포들은 실시예 8에 기재된 바와 같이, Z-DTPl, Z-DTP2, mDTP3 또는 Z-NC 각각이 37 ℃에서 72 hr 동안 처리되거나, 펩타이드의 처리 없이 같은 조건에서 배양되었다. Z-DTPl, Z-DTP2, mDTP3 또는 Z-NC 처리는 하기의 최종 펩타이드 농도로 수행되었다: 0.01 μΜ, 0.03 μΜ, 0.1 μΜ, 0.3 μΜ, 1 μΜ, 3 μΜ, 및 10 μΜ. 이와 같은 처리 후, ARH-77 생존/증식은 실시예 6 및 8에 기재된 바와 같이 [3H]티미딘 흡수 분석 수행에 의해 측정되었다. 상기 실험들로부터의 결과는 펩타이드 처리 안한 각각의 렌티바이러스-감염된 세포들의 생존/증식에 상대적인, Z-DTPl, Z-DTP2, mDTP3 또는 Z-NC가 처리된 렌티바이러스-감염된 다발성 골수종 세포들에서 관찰된 생존/증식의 퍼센트로서(즉, c.p.m.) 표현되었다. 세포 생존/증식의 50% 억제(IC5o)를 초래한 Z-DTPl, Z-DTP2, mDTP3, 및 Z-DNC의 평균 농도는 [3H]티미딘 흡수 분석 수행에 의해 측정되었고 실시예 6에 기재된 바와 같이 계산되었다. 상기 실험에서 도출된 결과는 도 20A, 20B, 및 20C 에 보여졌다.
결과
도 20A, 20B, 및 20C는 MKK7의 sh-RNA-매개 침묵이 대표적인 Z-/mDTP-민감한 세포주, ARH-77,를 Z-/mDTP-유도 사멸에 대해 완전한 저항성을 갖도록 만들어 주는 것을 보여준다. 도에 나타내어진 [3H]티미딘 흡수 분석은 D-이소머(isomer) 음성 대조군 테트라펩타이드 Z-DNC(도 20A, 20B, 및 20C), Z-DTPl(도 20A), Z-DTP2(도 20B), 및 mDTP3(도 20C)의 MKK7-특이적(sh-MKK7) 또는 비-특이적 sh-RNAs(sh-NS) 각각을 발현하는 ARH-77 다발성 골수종 세포에서의 IC5o를 보여준다. ARH-77 세포는 다른 농도의 상기 펩타이드들이 처리되었고 3일 후에 [3H]티미딘 흡수 분석에 의해 세포 생존능력/증식이 분석되었다. sh-NS-발현하는 ARH-77 세포가 1.4 μΜ(Z-DTP1; 도 20A), 302 nM(Z-DTP2; 도 20B), 및 303 nM(mDTP3; 도 20C)의 IC50 값에 의해 보여진 Z-/mDTP-유도 사멸에 대해 높은 민감도를 갖는 것은 감염되지 않은 부모 ARH-77 세포에서 보인 것과 유사하다고 볼 수 있다(표 IV 참조). 두드러지게 대조적으로, 그러나, >10 μΜ의 Z-DTP1, Z-DTP2, 및 mDTP3의 IC50 값에 의해 보여진 Z-/mDTP-유도 사멸에 대해 완전히 저항성을 갖게 된 sh-MKK7-발현 ARH-77 세포는 Z-DNC-처리한 ARH-77 세포에서 보인 것과 유사하다(도 20A, 20B, 및 20C). IC50는 실시예 6에 기재된 바와 같이 0.01 내지 10μΜ 범위로 증가하는 농도의 Z-DNC(도 20A, 20B, 및 20C),Z-DTP1(도 20A), Z-DTP2(도 20B), 및 mDTP3(도 20C)를 이용하여 계산되었다. 그래프에 나타낸 것은 처리 안된 세포에서 얻어진 c.p.m. 값에 비해 처리된 세포에서 얻어진 세포 생존/증식의 측도(measure)인 매분 카운트 수의 퍼센트이다. 유사한 데이터가 U266, KMS-11, 및 KMS-12 세포주를 포함한 추가의 Z-/mDTP-민감한 다발성 골수종 세포주에서 얻어졌다(데이터 생략). 도 12에서 보여진 데이터(즉, Gadd45β 발현 및 암 세포의 Z-DTP-유도 사멸에 대한 민감도 사이의 강한 상관성)와 함께 상기 데이터(즉, MKK7의 침묵에 의한 민감한 다발성 골수종 세포에서 Z-/mDTP 민감성의 손실)는, 다발성 골수종 세포에서 결과적으로 Z-/mDTP의 Gadd45β/MKK7 복합체에 대한 매우 높은 표적 특이성을 입증한다.
실시예 13. Z- DTP 는 환자 유래의 원발성 다발성 골수종 세포에서 강하고 특이적인 세포 독성을 유지한다
재료 및 방법
Z-/mDTP가 원발성 다발성 골수종 세포에서 세포 독성을 유지하는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 임상적으로 다발성 골수종으로 진단된 환자에게서 분리된 다발성 골수종 세포의 생존에서 Z-DTP1 및 Z-DTP2의 효과를 시험했다. 이것을 위하여, 다발성 골수종 세포들은 근본적으로 참고문헌 Hideshima T. et all 2006, Blood 107: 4053-4062에 기재된 바와 같이, 음성 선택에 의해(negative selection)다발성 골수종 환자의 골수(bone marrow, BM) 천자(aspirate)로부터 CD138-컨쥬게이션된 마그네틱 비드(CD138-coniugated magnetic bead)를 이용하여 정제되었다. 다발성 골수종 세포들의 순도는 유세포 분석기에 의해 CD 138 및 항-CD45 항체를 이용하여 근본적으로 참고문헌 Hideshima T. et all 2006, Blood 107: 4053-4062에 기재된 과정에 따라 확인되었다. 정제된 CD138+ BM 세포들은 그 후에 4xl05 cells/ml의 농도로 96-웰 플레이트의 웰에서 배양되었고 1 μΜ 또는 10 μΜ의 Z-DTP1, Z-DTP2 또는 Z-DNC가 각각 48 hr 동안 처리되었다. 세포 생존 능력은 트리판 블루 색소 배제법(Trypan blue exclusion assay) 분석을 이용한 세포 계수에 의해 측정되었다(도 14A, 14B, 14C, 14D, 및 14E).
또한, Z-/mDTP의 실험실내 치료적 지수를 측정하기 위하여, 10 μΜ 또는 100 μΜ의 Z-DTP1, Z-DTP2 및 Z-DNC를각각 처리한 후, 존 능력 및 증식 분석이 두 인간 및 마우스 기원의 형질전환되지 않은 원발성 세포와 함께 수행되었다. 이것을 위하여, 피콜-하이파크 밀도 분리(Ficoll-Hypaque density separation) 후에, 골수기질세포(bone marrow stromal cells, BMSCs), 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cells, PBMNCs) 및 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 참고문헌 Piva R . et all 2008 Blood 1 11: 2765-2775)에 기재된 프로토콜에 따라 건강한 개인에게서 정제되었다. BMSCs, PBMNCs, 및 MSCs 세포들은 그 뒤에 기재한 시간 동안 도 15A 및 15B에 명시한 농도의 펩타이드와 함께 처리되었다. 또한, 암세포에 대한 Z-/mDTP의 세포 독성의 특이성을 더 수립하기 위해, 본 발명자들은 마우스의 비장 및 림프구로부터 정제된 원발성 B 및 T 림프구 각각을 참고문헌 Shirakawa et al 2010 Cell Mol immunology 1-12에 기재된 바와 근본적으로 같이 이용하였다. B 및 T 세포들은 그 후에 1 ng/mL의 LPS를 16시간 동안 자극한 것에 의해 활성화되었고, 그 뒤에 100 μΜ의 Z-DTP1, Z-DTP2 또는 Z-DNC가 72 hr 동안 도 15B에 나타낸 바와 같이 처리되었다.

결과
도 14A, 14B, 14C, 14D, 및 14E는, Z-DNC는 아닌, Z-DTP1 및 Z-DTP2가 대표적인 5 환자로부터 분리된 원발성 다발성 골수종 세포에 강한 세포 독성 활성을 나타내는 것을 보여준다. 각각의 패널은 다른 환자 유래?즉, 환자 1(도 14A), 환자 2(도 14B), 환자 3(도 14C), 환자 4(도 14D), 및 환자 5(도 14E)-의 다발성 골수종 세포에서 얻어진 데이터를 묘사한다. Z-DTP2, Z-DTPl 및 Z-DNC는 기재된 농도에서(즉, 1 μΜ 또는 10 μΜ) 48 hr 동안 처리되었다. 분석은 트리판 블루 색소 배제법(Trypan blue exclusion assay)을 이용하여 수행되었다. 값은 처리하지 않은 대조군 세포의 생존 능력에 비례한 Z-DTP2, Z-DTPl 또는 Z-DNC 처리 후 산 세포의 퍼센트를 나타낸다. 또한, Z-DTP2 및 Z-DTPl의 세포 독성에 비해 강력한 세포 독성이 유사한 실험 조건 하에서 mDTP3 처리한 환자 유래의 원발성 다발성 골수종 세포에서 관찰되었다(데이터 생략). 이러한 발견들은 Z-/mDTP이 원발성 다발성 골수종 세포에서 활성을 유지하는 것을 입증하고 Z-/mDTP-기초한 치료가 환자에게서 다발성 골수종을 치료하기 위해 이용될 수 있음을 나타낸다.
도 15A 및 15B는 Z-DTPl 및 Z-DTP2가 매우 높은 농도(100 μΜ)를 사용했을 때 조차, 마우스 또는 인간 유래의 정상적인 원발성 세포에 대해 세포 독성을 나타내지 않는 것을 보여준다. 시험된 원발성 세포는 다발성 골수종-없는 개인으로부터 분리된 정상 골수기질세포(bone marrow stromal cells, BMSCs)(도 15A), 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cells, PBMNCs)(도 15A) 및 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)(도 15B), 및 마우스로부터 분리된 정제된 원발성 B 및 T 림프종(primary B and T lymphocyte)(도 15B)을 포함한다. Z-DTP2, Z-DTPl 및 Z-DNC는 기재된 농도로 각각 48 hr 동안(BMSCs, PBMNCs) (도 15A), 72 hr 동안(쥐 B 및 T 세포)(도 15B), 또는 144 hr 동안 MSCs(도 15B) 처리되었다. 분석은 트리판 블루 색소 배제법(Trypan blue exclusion assay)(도 15A) 또는 [3H]티미딘 흡수(도 15B)를 이용하여 수행되었다. 도 14 및 15에서 나타낸 데이터는 Z-DTP가 높은 실험실내 치료적 징후들(즉, 암세포에서 높은 세포 독성을 가지는 것에 대비한 정상 세포에서 세포 독성의 없음)을 가짐을 나타냈다. 실제로, Z-DNC는 아닌, Z-DTP1 및 Z-DTP2는 환자 유래의 다발성 골수종 세포에서 강한 종양세포치사(tumoricidal) 활성을 보이나(도 14), 건강한 개인 또는 마우스 유래의 원발성 정상 세포에서는 100 μΜ와 같은 매우 높은 농도를 사용했을 때 조차(도 15B 참조) 세포 독성을 보이지 않는다(도 15A). 상기 데이터는 Z-DTP가 세포에 무차별적인(indiscriminated) 세포 독성 효과를 가지지 않음을 입증한다-오히려 그들의 세포 독성 효과가 암세포 및/또는 Gadd45β의 발현 또는 활성 정도가 높은 및/또는 항상 NF-кB의 높은 발현 또는 활성 정도가 높은 특성을 가진 세포에 특이적이다.
원발성 인간 BMSCs, MSCs, PBMNCs 및 마우스 B 및 T 림프구를 포함한, 정상 원발성 세포에서 높은 농도(즉, 100 μΜ)로 사용될 때 조차, 그들의 세포 독성이 없는 것과 더불어, 다발성 골수종 및 다른 암세포에서 Z-/mDTP의 높은 활성은 본 발명의 화합물이 월등한 실험실내 치료적 징후를 가지는 것을 입증한다(도 9, 생존을 위해 NF-кB에 의존하지 않는 세포주에서 세포 독성의 결여; 도 12, Gadd45β 발현 및 Z-DTP에 대한 암세포 민감성 사이의 상관 관계; 도 14 및 15, 원발성 세포에서의 사멸 분석 참조)-기존의 치료를 뛰어넘는 본 발명의 중요 이점. 또한, 본 발명의 화합물은 T-세포 백혈병, 버킷 림프종 및 다른 많은 암세포주와 같은 생존을 위한 NF-кB에 의존적이지 않은 암세포주에서 세포 독성의 결여(100 μM을 사용했을 때 조차; 도 9 참조)는 그들의 활성이 항상 NF-кB가 활성화된 세포에 대한 내재적인 특이성을 갖는 것을 보여준다. 또한, 기원의 다른 조직의 암세포주의 큰 패널에서, Gadd45β에 대한 Z-/mDTP의 세포 독성 작용의 높은 특이성을 수립하기 때문에(p<0.01; 도 12), Gadd45β 발현 및 Z-/mDTP-유도 사멸에 대한 민감성 정도 사이의 높은 통계적 유의성 상관관계가 있다. 결정적으로, sh-RNA-매개된 Gadd45β의 하향-조절은 Z-/mDTP와 함께 보인 것과 유사한 동역학으로 Z-/mDTP-저항성 다발성 골수종 세포주에서는 아닌, Z-/mDTP-민감한 다발성 골수종 세포주(예를 들어, ARH-77 및 NCIH929)에서 세포 사멸을 초래하며, MKK7의 sh-RNA-매개된 하향-조절은 민감한 다발성 골수종 세포주에서 Z-/mDTP-유도 사멸에 대한 민감성의 손실의 결과를 야기한다(예를 들어, ARH-77)(도 20 참조). 동시에, 본 발명의 데이터는 Z-/mDTP의 세포 독성 활성이 항상 NF-кB가 활성화된 및/또는 Gadd45β의 발현 또는 활성이 높은 특성의 종양 세포를 제한하는 것을 보인다-Z-/mDTP는 민감한 다발성 종양 세포주에서 nM 수준에서 세포 독성을 보이나, 생존을 위해 NF-кB에 의존적이지 않은 또는 Gadd45β 낮은 수준의 발현을 보이는 저항성 종양 세포주에서는 100 μΜ를 사용했을 때 조차, 세포 독성을 보이지 않는다. 게다가, IKK/NF-кB 경로의 코어 구성요소가 없는 마우스에서와는 대조적으로, 완전한 Gadd45β 불활성(프로테아좀(Proteasome) NF-кB 전부 봉쇄와는 달리)이 생체내에서 잘 허용된 것을 나타내는(Papa et all 2008 J Clin Invest 1 18, 191 1-1923) Gadd45β-/- 마우스는 생존 가능하며 외관상으로 건강하였다(Papa et all 2008 J Clin Invest 118, 1911-1923). 동시에, 상기 발견은 Z-/mDTP-기초한 치료가 안전 및 특이적일 것임을 나타낸다(도 9 및 15, NF-кB-비의존적 종양 세포주 및 정상적인 원발성 세포에서 세포 독성의 결여; 도 12, Gadd45β 발현 및 Z-/mDTP-유도 사멸에 대해 민감한 암세포 사이의 상관 관계; 도 14, 원발성 다발성 골주송 세포의 Z-/mDTP-유도 사멸).
또한, 보르테조이브(bortezomib)와 같은 프로테아좀(Proteasome) 억제제들(Pis) 및 다른 다발성 골수종 치료법들은 JNK 활성화에 의해 다발성 골수종 세포들을 죽이나(Chauhan et al 2008 Blood 1 11, 1654-1664), 낮은 치료적 징후 때문에 치료는 할 수 없다(Lauback et al 2009 Leukemia 23, 2222-2232; Ludwing et al 2010 Oncologist 15, 6-25 및 www.cancecare.on.ca/). Gadd45를 통한 다 발성 골수종 생존에서 별개의 NF-кB의 기능 표적화 는 면역, 염증 및 생존에서 NF-кB의 기능을 분리할 수 있게 할 것이므로, 치료를 위해 요구되는 용량에서 견딜 수 있는 더 안전한, 더 특이적인 치료를 제공할 수 있다. Z-/mDTP은 다발성 골수종, 및 잠재적으 로 다른 암 및 생존을 위해 NF-кB에 의존하는 질병 또는 질환에서 신규한 경로를 표적화하는 완전히 새로운 치료적 약제의 클래스를 정의한다
실시예 14. Gadd45 β/ MKK7 복합체의 분리 및 부분에서 mDTP3 의 Gadd45 β 및 MKK7 단백질에 대한 결합 성질
예로서, Gadd45β, MKK7의 인산화 효소 도메인(MKK7KD) 및 Gadd45β/MKK7 복합체에 대한 mDTP3의 결합 실험이 표면플라즈몬공명(Surface Plasmon Resonance) 기술을 이용하여 수행되었다.
재료 및 방법
어떻게 DTP가 Gadd45β/MKK7 복합체에 결합하는지 측정하기 위하여, 실험이 4-channels CM5 센서 칩(GE Healthcare, Milan, Italy)를 이용한 Biacore3000 SPR 기기(GE Healthcare, Milan, Italy)로 수행되었다. 전장의 인간 Gadd45β는 참고문헌 Tomatore L., et al. (2008). J Mol Biol;378:97-l 1 1에 기재된 바와 같이 제조 및 정제되었다. 항시 활성화된 101 내지 405 잔기 폭(spanning residues)의 S287D 및 T291D 돌연변이를 갖고 있는 MKK7의 인산화 효소 도메인(MKK7KD)은 E.Coli에서 His6 융합 단백질로서 발현되었다. 상기 단백질은 균질화를 위해 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)(Ni-NTA support) 및 겔 여과(gel filtration)(Superdex G75)의 두 연이은 단계에 의해 정제되었고, 그 후에 정체(identity) 및 순도(purity)를 확인하기 위한 SDS-PAGE, LC-MS 및 접힘을 평가하기 위한 Circular Dichroism에 의해 특징지어졌다.
MKK7KD는 Biacore 센서칩에 고전적인 EDC/NHS 커플링 화학을 통해 pH 5(protein pi, ~9)의 5 uL/min의 유속에서 고정되었다. 약 8000 응답 단위(Response Unit) 정도의 고정화가 얻어졌다. 약 4.5의 pI를 가진 본질적으로 산성 단백질인 Gadd45β는 pH 3.5에서 분리된 채널로 고정되었다(6000 RU 정도 고정화). Gadd45β 및 MKK7KD 채널 둘 다에서 잔여 반응기는 최종적으로 에탄올아민(ethanolamine)을 처리하여 불활성화되었다. 또 다른 채널에서 EDC/NHS으로 활성 및 에탄올아민으로 불활성의 같은 과정 이 수행되었다. 상기 채널은 참조로서 사용되었고 채널로부터의 신호 전달은 블랭크로서 고려되었고, 칩 표면의 비-특이적 결합을 제거하기 위해 그에 상응하는 Gadd45β 및 MKK7KD 단백질 채널 감지 실험값에서 빼졌다. 두 단백질이 효과적으로 고정되었는지 측정하기 위해, 본 발명자들은 Gadd45β(20-200 nM) 및 MKK7KD(1-25 nM)의 주입을 증가하는 단백질 농도로 반복 수행했다(3 분 접촉 시간; 60 μL). 1M NaCl 주입(1 분, MKK7KD 피복(derivatized)된 채널) 또는 20 mM NaOH(30 초, Gadd45β-피복된 채널) 중 하나를 이용하여 재생되었다.
트리펩타이드 mDTP3(Ac-D-Tyr-D-Arg-D-Phe-NH2)의 증가하는 농도가 칩위에 1 nM 내지 10 μΜ 범위의 농도로 최종적으로 주입되었다. 분리된 실험에서, mDTP3가 고정된 MKK7KD로부터 Gadd45β가 분리된 또는 고정된 Gadd45β로부터 MKK7KD가 분리된 분리상 동안 주입되었다. 결과는 상기 분석으로부터 도 21A, 21B, 21C, 및 21D에 기재되었다.
결과
도 21A에 보이는 바와 같이, 고정된 MKK7KD에 Gadd45β의 결합은 매우 효과적이었다. 용량-반응(Dose-response) 결합(association) 및 해리(dissociation) 커브가 사용된 모든 농도에서 관찰되었다. Gadd45β/MKK7KD상호작용의 해리 상수(dissociation constant) KD는 각각의 다른 커브로 측정된 계산된 값 평균에 의해 추산되었고 4.0±0.7 nM로 측정되었다(도 21A 참조). 유사하게, 3.4±0.6 nM 의 K D 로부터 용량-반응(Dose-response) 결합(association) 및 해리(dissociation) 커브가 제공된 Gadd45β 채널에 MKK7KD의 반복된 주입이 수행되었다.
mDTP3가 MKK7KD 및/또는 Gadd45β에 결합하는지 측정하기 위하여, 펩타이드의 샘플들(즉, mDTP3)이 Gadd45β 및 MKK7KD-피복된 채널 위로 주입되었다. 놀랍게도, 도 21C에 보이는 바와 같이, 데이터는 상기 펩타이드가 분리된 상태의 Gadd45β 또는 MKK7KD 둘 다에 결합하지 않는 것을 보여준다. 그러나, 현저하게, MKK7KD로부터 Gadd45β의 해리상(도 21D) 또는 Gadd45β로부터 MKK7KD의 해리상(데이터 생략) 동안 mDTP3가 주입되었을 때, 결합이 관찰되었고 용량-반응(Dose-response) 결합(association) 및 해리(dissociation) 커브가 기록되었다. 도 21D는 mDTP3가 10 nM 또는 100 nM의 낮은 농도에서 주입되었을 때, 상기 펩타이드가 Gadd45β/MKK7KD 복합체의 빠른 해리를 유도함을 보여준다. 또한, 보이는 바와 같이, Gadd45β/MKK7KD 복합체 형성이 펩타이드가 씻겨져 나간 후에 빠르게 재생되었다. 또한, 도 21D는 mDTP3가 높은 농도(즉, 1 μΜ)로 주입되었을 때, mDTP3가 Gadd45β 및/또는 MKK7KD 또는 두 단백질의 복합체에 결합하는 것을 나타내는 용량-반응(Dose-response) 결합(association) 및 해리(dissociation) 커브가 기록되는 것을 보여준다. 동시에, 상기 데이터는 mDTP3가 높은 농도가 사용되었을 때 조차, Gadd45β/MKK7KD 복합체의 형성을 위해 요구되는 Gadd45β, MKK7KD 둘 다, 또는 두 단백질의 상호작용에 의해 형성된 표면에의 결합 보다는, 분리된 상태의 Gadd45β 또는 MKK7KD 둘 다에 결합할 수 없는 것을 입증한다. 기존의 치료를 넘어선 본 발명의 중요한 이점인 세포에서의 강력한 높은 표적 선택성을 제공하는, 상기 데이터는 본 발명의 치료적 표적이 두 단백질(즉, Gadd45β 및 MKK7) 사이 접점이라는 것을 보여주기 때문에 중요하다.
실시예 15. Z- DTP2 및 mDTP3 의 생체내 약력학적인 ( pharmacokinetical , DMPK ) 특성
생체내 치료적 이용을 위한 Z-DTP2 및 mDTP3의 민감성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 마우스에서 약력학적 분석을 수행하였다.
재료 및 방법
마우스 약력학적 연구:
프로토콜 요약:
Z-DTP2 및 Z-mDTP3는 마우스에 정맥주사로 투여되었다. 혈액 샘플들은 화합물들의정맥(i.v.) 주사 후 8 hr 후에 7번의 시간(time point)까지 수득되었고, 혈장은 매 시간에 화합물의 농도를 측정하기 위해 LC-MS/MS로 분석되었다.
실험 과정:
각각 25-30 그람의 세 수컷 CD1 마우스가 화합물 당, 시간 당 투여 루트(administration route per time-point)가 투여되었다. 시험 화합물은 정맥주사로 투여되었다(체중량 kg 당 10 mg 화합물의 일반적인 투여량 정도로). 동물들은 연구 내내 음식 섭취가 자유로웠다.
하기의 시간에, 상기 동물들은 마취되었고, 혈액이 헤파린나이즈드(heparinised) 튜브에 모아졌으며, 동물들은 희생되었다:
● 정맥내의(i.v.) 투여: 투여-후 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 및 8 hrs
샘플 준비:
혈액 샘플들은 혈장을 얻기 위해 원심분리되었고, 그 뒤에 분리하기 위해 라벨링된 용기에 옮겨졌다. 세 동물에게서 각각의 시간에 분리된 부분 표본은 단일 분석되었다. 단백질들은 3배의 메탄올 첨가에 의해 침전되었고 4 ℃에서 30분 동안 원심분리되었다. 상등액 결과물의 부분 표본들 100 μl는 HPLC 수준의 증류수 200 μl로 96-웰 플레이트의 웰에 희석되었다.
양적 분석:
표준 커브(Standard curves)가 블랭크 혈장 기질(plasma matrices)에서 준비되었고 똑같은 방식으로 샘플들에 처리되었다. 혈장 샘플들은 LC-MS/MS에 의해 정량되었고, 혈장 내의 각각의 화합물의 농도가 μg/mL로 기재되었다.

약력학적 분석:
약력학적 변수(parameter)들이 웹사이트 http://www.pharsight.com/main.php에 기재된 바와 같이, 비-구획 모델(non-compartmental model) 분석을 이용하여 계산되었다.
활성분석(Bioanalysis):
프로토콜 요약:
혈장 샘플내의 시험 화합물 농도가 LC-MS/MS에 의해 측정되었다. 상기 데이터는 3-3000 ng/mL의 범위를 넘는 다섯-점 표준 커브(five-point standard curve)를 이용하여 정량화되었다.
실험 과정:
단백질들은 50μL의 개개인의 혈장의 부분 표본으로부터 150 μL 메탄올에 의해 침전되었다. 단백질 침전 후에, 혈장 샘플들은 30분 동안 4 ℃에서 원심분리되었다. 상등액의 결과물 100 μL의 부분 표본은 96 웰 플레이트에 HPLC 수준의 증류수 200 μL로 희석되었다. 시험 화합물들은 그 후에 DMSO에 용해되어 최종 농도 범위 3-3000 ng/mL (final DMSO concentration 1%)인 다양한 농도의 시험 화합물과 혈장 스파이킹(spiking)에 의해 준비된 다섯-점 표준 커브(five-point standard curve)로부터 LC-MS/MS에 의해 정량되었고, 상기에 기재된 바와 같이 시험 샘플들에 같은 방식으로 처리되었다..
결과
수컷 CD1 마우스에서의 약력학적 연구는 Z-DTP2 및 mDTP3가 모두 마우스에서 급성 세포 독성이 없이 정맥내 주입(intravenous(i.v.) infusion)을 통한 투여에 적합한 생체내 DMPK 특성을 가지는 것을 보여준다(표 VIII, IX [A], 및 IX [B] 참조). 표 VIII는 Z-DTP2 및 mDTP3와 함께 얻어진 혈장내 반감기(half-life)(T1 /2), 정상 상태(steady state) (Vss) 및 분배 종료 부피(Vβ)를 포함하는 생체내 약력학적 변수, 총 제거율(total clearance) (tot CL), 혈장 농도 곡면하 곡선(area under the plasma concentration versus time curve)(AUC), 및 첫 농도(concentration at time point 0)(C0)에서 가장 중요한 값을 나타낸다. 값들은 분석의 비-구획 및 구획 방법에 기초한 혈장 농도 곡선(plasma concentration versus time curves)의 데이터로부터 계산되었다(Groulx A. 2006 ScianNew 9: 1-5 및 DiStefano 3rd 1982 Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 243: 1-6)(데이터 생략). 보여진 각각의 변수는 화합물의 체중량 kg 당 10 mg의 용량 단일 정맥(i.v.) 주사에 따른 세 마리의 다른 수컷 CD1 마우스 풀(pool)로부터 얻어진 실험 값의 평균을 나타낸다. 세 마리의 수컷 CD1 마우스(체중량 25-30 gr)는 정맥내 투여를 통해 Z-DTP2 또는 mDTP3 각각이 약품 주입(dosing)되었다. 혈액 샘플들은 보여진 바와 같이 7 시점에 수득되었고(즉, 주사 후 0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 및 8 hrs) 혈장은 각각의 시점에서의 두 화합물의 혈액 농도를 측정하기 위해 액상 크로마토그래피 질량 분광기(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS)로 분석되었다. 혈장 농도 대 시간 프로파일의 Z-DTP2 및 mDTP3 둘 다에 대한 도표(plot)가 추정되었다. 상기 결과는 Z-DTP2 및 mDTP3 둘 다가 정맥내 주사 후에 다면성 배열(multiphasic disposition)을 이끄는 것을 보여준다(데이터 생략). 실제로, 화합물의 정맥내 투여의 농도-대-시간 커브는 배출 개시 상(initial distribution phase) 단계에서 다른 생물-지수 프로파일(bio-exponential profile)을 및 긴 종료(terminal T1 /2)를 나타낸다(데이터 생략).
혈장 농도-시간 커브의 데이터(즉, Co, 마지막까지의 AUC, T½ , Vβ, Vss, 및 CL)로부터 추정된 주요한 약력학적 변수들은 약의 원하는 전신 안정 상태 농도(systemic steady state concentrations)(즉, 치료적 전신 농도(therapeutic systemic concentrations))를 얻기 위해 요구되는 약품 주입(dosing) 수준 및 투여 요법 계산에 대해 결정적이다. 표 VIII에서 보이는 바와 같이, Z-DTP2 및 mDTP3는 각각 거의 2 hrs 및 거의 1 hr 및 20분의 생체내 반감기를 나타낸다.
흥미롭게도, Z-DTP2 및 mDTP3 둘 다는 빠른 조직/세포내 흡수가 가능하지만, 또는 혈장 단백질에 결합이 가능한 거의 5 분의 개시 분포 반감기(initial distributive half-life)를 보인다. 가장 중요하게, 두 화합물은 거의 8 hrs의 반감기의 종료에 의해 반영된 조직으로부터 매우 느린 제거를 보인다(표 VIII 및 데이터 생략)(http://www.pharsight.com/main.php 및 http://www.meds.corn/leukemia/idamycin/adriamycin.html and Kupperman et al 2010 Cancer Res 70 1970-1980). 또한, 상기 데이터는 총 배포 볼륨(volume distribution)의 상기 값들이 안정 상태 배포 볼륨보다 높은 발견에 의해 나타내어진 바와 같이, Z-DTP2 및 mDTP3 둘 다가 일반적인 선형 약력학적 시스템(Berezhkovskiy (2007) J Pharm Sci. 96, 1638-52)을 따르는 것을 보여준다(즉, Vβ >Vss).
두 화합물의 종료 반-감기처럼 상기 종료 및 안정 상태 배포 볼륨은 상승 작용에 의해 신체에서 항률 투입(constant rate of infusion)을 위해 요구되는 약의 양 수립에 기여한다.
중요하게, Z-DTP2 및 mDTP3는 두 화합물에 대해 느린 대사 및 담즙 배설율(biliary excretion rate)을 시사하는 각각 66 to 90 mL/ min/kg 범위 및 22 to 27 mL/ min/kg 범위의 총 제거 값을 보여준다(표 VIII 및 데이터 생략).
표 IX [A] 및 IX [B]는 Z-DTP2 및 mDTP3 각각의 생체내 투여에 대한 두 화합물의 전신적 치료 농도를 얻기 위해 요구되는 예상된 약품 주입(dosing)을 보여준다. 값은 Z-DTP (Table IX [A]) 또는 mDTP3 (Table IX [B]) 각각에 대해 원하는 1, 5 or 10 μΜ 의 안정 상태 혈장 농도를 얻기 위해 요구되는 mg/hr로 나타낸 약품 주입(dosing)을 기재한다. 중요하게, Z-DTP2, mDTP3에 대해 비슷한 종료 반-감기처럼 비슷한 반-감기를 가짐에도 불구하고, mDTP3는 Z-DTP2보다 3배 낮은 총 제거 값을 나타낸다(표 VIII 및 데이터 생략). 그 중에서도, 이와 같은 결정적인 약력학적 변수의 작은 차이 조차 Z-DTP2 및 mDTP3에 대해 예상되는 약물 주입이 다르게 보이는 것처럼, 화합물의 원하는 안정 상태 혈장 농도를 얻기 위해 요구되는 약물 주입 사이즈 및 요법(regimen)에 꽤 영향을 미칠 수 있다(표 IX [A] 및 IX [B], 각각). 실제로, 표 IX [A] 및 IX [B](모델링 분석)은 요구되는 약물 주입이 Z-DTP2에 대해 요구되는 것 보다 매우 낮은 1, 5, 또는 10 μΜ의 안정 상태 혈장 농도를 얻기 위해 보여준다. 따라서, 상기 약력학적 결과 및 두 화합물에 대해 다발성 골수종 세포주에서 10 μΜ까지의 안정 상태 혈장 농도를 얻기 위해 측정된 IC50 값(표 IV참조)에 기초하여, 각각 0.976 mg/hr 및 0.218 mg/hr의 비율료 정맥내 투여를 통한 Z-DTP2 및 mDTP3 투여가 필수적일 것이다(표 IX [A] 및 IX [B]).
그 중에서도, Z-/mDTP 합성은 간결하고 간단하기 때문에, 만성적 이용에 대해서 조차 비용 효율(cost-effective)적이다. 따라서, 낮은 T1 /2로 조차, 투입에 의한 Z-/mDTP 치료는 이미 화학요법중인 입원한 환자에게 적합할 것이다. 또한, 본 발명의 화합물은 기존의 펩타이드 치료에 비해 성공적인 이용으로서 매우 가용성이고 매우 높은 특이성 및 좋은 안전성을 가지기 때문에 극대화된 치료 효과를 위해 낮은 볼륨에서, 높은 용량(doses)에서 전달될 수 있다.
Figure pct00023
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Claims (25)

1. 하기 화학식 I의 화합물:

I: X1-A-X2
상기에서,

A는 A'''',
또는 A''-[M-A'-]nM-A'''이고;

A''''는 A'',
A''',
또는 Z1-Y2-Y3-Z4이고, 상기에서 Y2-Y3는 올리고펩토이드 부위(moiety) 또는 잔기 Y2-Y3을 포함하는 올리고펩토이드(oligopeptoid) 부위이고 Z1은 Y2-Y3의 N-말단 질소에 부착되고(attached) Z4는 Y2-Y3의 C-말단 탄소에 부착되고;

A''는 A',
또는 Y1-Y2-Y3-Z4이고, 상기에서 Y1-Y2-Y3는 올리고펩토이드 부위 또는 잔기 Y1-Y2-Y3를 포함하는 올리고펩토이드 부위이고 Z4는 Y1-Y2-Y3의 C-말단 탄소에 부착되고;

A'''는 A',
또는 Z1-Y2-Y3-Y4이고, 상기에서 Y2-Y3-Y4는 올리고펩토이드 부위 또는 잔기 Y2-Y3-Y4를 포함하는 올리고펩토이드 부위이고 Z1은 Y2-Y3-Y4의 N-말단 질소에 부착되고;

A'의 각각의 존재(occurrence)는 독립하여 올리고펩타이드(oligopeptide) 부위 또는 잔기 Y1-Y2-Y3-Y4를 포함하는 올리고펩토이드(oligopeptoid) 부위이고;

n은 0 내지 18의 정수이고;
Υ1 및 Y4는 독립하여 아미노산 잔기 또는 방향족 잔기를 포함하는 아미노산 유도체의 잔기이고;
Y2는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체의 잔기거나 없으며;
Y3은 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체의 잔기거나 없으며;
Z1은 하기 화학식 (II)의 군(group):
Figure pct00033

Z1은 Y2의 N-말단 질소에 연결되고,

W는 없거나, 또는 산소, 또는 질소, 또는 C1 내지 C3의 알킨기(alkylene group)이고,
상기 C1 내지 C3의 알킨기는 C1 내지 C4의 알킬기, 또는 5 내지 10 원자의 탄소환기(carbocyclic) 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방향족 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;

J는 5 내지 10 원자의 탄소환기 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방향족 이고, 상기 방향족은 수산화기, 할로겐, C1 내지 C4의 알킬기, 또는 C1 내지 C4의 알콕시기 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;

Z4 는 하기 화학식 (III)의 군:
Figure pct00034

Z4는 Y3의 C-말단 탄소에 연결되고,
R은 수소 또는 C1 내지 C4의 알킬기이고;
W'는 없거나 C1 내지 C3의 알킨기이고,
상기 C1 내지 C3의 알킨기는 C1 내지 C4의 알킬기, 또는 5 내지 10 원자의 탄소환기 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방항족 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;

J'는 3 내지 10 원자의 지방족 카르복실산기 또는 5 내지 10 원자의 탄소환기 또는 헤테로 사이클릭(heterocyclic) 방향족이고,
상기 지방족 카르복실산기 또는 방향족은 수산화기, 할로겐, C1 내지 C4의 알킬기, 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중에서 선택되는 적어도 하나의 치환기로 임의로 치환되고;

M은 선행(preceding) 올리고펩타이드 또는 올리고펩토이드 부위(Α',Α'' or A''')와 후행(following) 올리고펩타이드 또는 올리고펩토이드 부위(Α',Α'' or A''') 사이의 펩타이드 결합 또는 선행 올리고펩타이드 또는 올리고펩토이 부위(A', A'' 또는 A''')의 말단 카르복실기에 아마이드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 또는 황화에스테르 결합을 통해 연결된 링커(linker) 부위 및 후행 올리고펩타이드 부위(Α', A" or A'") 말단 아미노 그룹에 아마이드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합, 또는 황화에스테르 결합을 통해 연결된 링커 부위이고;

X1은 없거나, 또는 A의 아미노 말단에 첨가된 부위에 의해 자유 아미노기를 차단하고 ;

X2는 없거나 또는 A의 카르복실 말단에 첨가된 부위에 의해 자유 카르복실기를 차단하고 ;
조건부로 A가 Z1을 포함하면 X1은 없고 A가 Z4 를 포함하면 X2가 없고;
또는 이들의 유도체, 상기 유도체는 하기에 구성되는 군으로부터 선택되며:

a) 화학식 I의 화합물의 분자 올리고머 또는 다중체(multimers), 상기 올리고머 또는 다중체는 화학식 I의 화합물의 둘 또는 그 이상의 분자 를 포함하고 각각은 화학식 I의 화합물의 분자 내 존재하는 아미노기 또는 카복실산기와 스캐폴드 부위의 반대의 아미노기 또는 카르복실산 사이에 형성되는 아마이드 결합을 통해 공통의 스캐폴드 부위에 연결 되고 상기 스캐폴드 부위은 적어도 2 아마이드 결합을 이루고,

b) 화학식 I의 화합물의 분자를 포함하는 유도체 또는 아마이드 결합, 에스테르 결합, 에테르 결합 또는 황화에테르 결합을 통해 이하와 컨 쥬게이트된 상기 파트 a)에서 정의된 올리고머 또는 다중체:
PEG,
PEG에 기반한 화합물,
세포-투과 펩타이드,
형광성 염들,
비오틴 or 기타 태그(tag) 부위
지방산들,
별개 크기의 나노입자
또는 금속성 또는 방사성 이온들과 복합체를 이루는
킬레이트 리간드.

c) 화학식 I의 화합물의 분자를 포함하는 유도체 또는 아미드화, 글 리코실화, 카르바밀화, 아실화, 황산화, 인산화, 고리화, 지질화, 페 길레이션에 의해 변형된 상기 파트 a)에서 정의된 올리고머 또는 다합 체 또는 펩타이드에 연결 또는 융합 펩타이드 또는 융합 펩티오 드(peptiod)를 형성하기 위하여 펩타이드 융합 파트너에 연결.
및
d) 화학식 I의 화합물의 분자의 유도체의 염 및 용매화합물 또는 상기 파트 a) 또는 b)에서 정의된 이들의 유도체의 염 및 용매 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 Y2는 수용액 pH7에서 음전하를 띠는 곁사슬을 가지는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체의 잔기, 및 상기 Y3 은 수용액 pH7에서 양전하를 띠는 곁사슬을 가지는 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체의 잔기 및 상기 Y3 및 Y4 는 염다리가 곁사슬의 각각의 양전하와 음전하 간에 형성될 수 있는 것을 특징으로 하는 화합물.
제1항 또는 제 2항에 있어서, 상기
Y1는 D-트립토판,
L-트립토판,
D-티로신,
L-티로신,
D-3,3-디페닐-알라닌,
L-3,3-디페닐-알라닌,
D-H-3-(4-피리딜)알라닌,
L-H-3-(4-피리딜)알라닌,
D-H-3-(3-피리딜)알라닌
L-H-3-(3-피리딜)알라닌
D-H-3-(2-피리딜)알라닌,
L-H-3-(2-피리딜)알라닌,
D-2-아미노-4-페닐-부틸릭산(butirric acid),
L-아미노-4-페닐-부틸릭산,
D-H-4-히드록시-페닐-글리신,
L-H-4-히드록시-페닐-글리신,
D-3-(2-푸릴(furyl))-알라닌,
L-3-(2-푸릴)-알라닌,
L-호모페닐알라닌,
D-호모페닐알라닌,
D-3-(4-퀴노릴(quinolyl))-알라닌,
L-3-(4-퀴노릴)-알라닌,
D-나프틸-알라닌,
L-나프틸-알라닌
p-히드록시-벤조산
p-히드록시-페닐-아세트-산
3-(p-히드록시-페닐)-프로피온-산
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체

Y2는 없거나
D-글루탐산,
L-글루탐산,
D-아스파르트산,
L-아스파르트아스파르트류신
D-류신
L-글루타민
D-글루타민
L-메티오닌
D-메티오닌
D-2-아미노-헵타네디오산(heptanedioic acid),
L-2-아미노-헵타네디오산(heptanedioic acid),
상기 어느 화합물의 메틸 또는 에틸 에스테르,
L-호모세린,
D-호모세린;
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체

Y3는 D-아르기닌,
L-아르기닌,
L-프롤린
D-프롤린
D-히스티딘,
L-히스티딘,
L-리신,
D-A,β-디아미노프로피온산(D-Dap),
L-A,β-디아미노프로피온산(L-Dap),
L-A,δ-디아미노부틸릭산(L-Dab),
L-A,δ-디아미노부틸릭산(L-Dab),
L-오르니틴,
D-오르니틴,
L-리신;
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체

Y4 는
D-페닐알라닌,
L-페닐알라닌,
D-트립토판,
L-트립토판,
D-티로신,
L-티로신,
D-3,3-디페닐-알라닌,
L-3,3-디페닐-알라닌,
D-H-3-(4-프리딜) 알라닌,
L-H-3-(4-프리딜)알라닌,
D-H-3-(3-프리딜)알라닌,
L-H-3-(3-프리딜)알라닌,
D-H-3-(2-프리딜)알라닌,
L-H-3-(2-프리딜)알라닌,
D-2-아미노-4-페닐-부틸릭산(butirric acid),
L-2-아미노-4-페닐-부틸릭산,
D-페닐-글리신,
L-페닐-글리신,
D-H-4-히드록시-페닐-글리신,
L-H-4-히드록시-페닐-글리신,
D-3-(2-푸릴(furyl))-알라닌,
L-3-(2-푸릴)-알라닌,
L-호모페닐알라닌,
D-호모페닐알라닌,
D-3-(4-퀴노릴(quinolyl))-알라닌,
L-3-(4-퀴노릴)-알라닌;
D-나프틸-알라닌
L-나프틸-알라닌
L- 또는 D- 형의 이들의 N-메틸-유도체
D-배열
아닐린
벤질아민
또는 2-페닐-에틸-아민

Z1은 4-히드록시-벤조일,
(4-히드록시-페닐)-아세틸
3-(4-히드록시-페닐)-프로피오닐 벤조일,
벤질옥시카보닐,
2-페닐-아세틸
3-페닐-프로프로닐
3,3-디페닐-프로피오닐
3-(1H-인돌-3-일)-프로피오닐
(1H-인돌-3-일)-아세틸
푸란-2-일-아세틸
푸란-3-일-아세틸
3-피리딘-4-일-프로피오닐
3-피리딘-3-일-프로피오닐
3-피리딘-2-일-프로피오닐
3-피리미딘-4-일-프로피오닐
3-피리다진-4-일-프로피오닐
3-[1,3,5]트리아진-2-일-프로피오닐
2-피리딘-4-일-아세틸
2-피리딘-3-일-아세틸
2-피리딘-2-일-아세틸
2-피리미딘-4-일-아세틸
2-피리다진-4-일-아세틸
2-[l,3,5]트리아진-2-일-아세틸
나프탈렌-1-일-아세틸
나프탈렌-2-일-아세틸
2-나프탈렌-1-일-프로피오닐
또는 2-나프탈렌-2-일-프로피오닐

Z4는 페닐아민,
벤질아민,
펜에틸아민
사이크로헥실-아민
2-사이크로헥실-에틸아민
3-사이크로헥실-프로필아민
4-(2-아미노-에틸)-페놀
4-아미노-페놀
4-아미노메틸-페놀
1H-인돌-3-일-아민
2-(1H-인돌-3-일)-에틸아민
C-(1H-인돌-3-일)-메틸아민
2,2-디페닐-에틸아민
2,2-디피리딘-4-일-에틸아민
2-피리딘-4-일-에틸아민
2-피리딘-3-일-에틸아민
2-피리딘-2-일-에틸아민
2-피리미딘-4-일-에틸아민
2-[1,3,5]트라이진-2-일-에틸아민
C-푸란-2-일-메틸아민
C-푸란-3-일-메틸아민
또는 C-나프탈렌-2-일-메틸아민인 화합물.
제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 M은 펩타이드 결합인 화합물.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 항에 있어서, 상기 X1은 수소 또는 X1은 아마이드 결합을 형성하기 위하여 올리고펩타이드 또는 올리고펩토이드 서열의 아미노 말단에 하기의 군 중에 어느 하나가 첨가된 화합물:
아세틸,
벤질옥실카보닐,
2- 클로로-벤질옥실카보닐,
3- 메톡시,4-히드록시-벤조일,
3-히드록시,4-메톡시-벤조일,
벤조일,
또는 플루오레닐메톡시카보닐(fluorenylmethoxycarbonyl);
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X2는 아마이드 결합을 형성하기 위하여 올리고펩타이드 또는 올리고펩토이드 서열의 카르보닐기 말단에 하기의 군 중에 하나가 첨가된 화합물:
아민,
D-페닐알라닌,
L-페닐알라닌,
D-트립토판,
L-트립토판,
D-티로신,
L-티로신,
D-3,3-디페닐-알라닌,
L-3 ,3 -디페닐-알라닌,
D-H-3-(4-프리딜)-알라닌,
L-H-3-(4-프리딜)-알라닌,
D-H-3-(3-프리딜)-알라닌,
L-H-3-(3-프리딜)-알라닌,
D-H-3-(2-프리딜)-알라닌,
L-H-3-(2-프리딜)-알라닌,
D-2-아미노-4-페닐-부틸릭산(butirric acid),
L-2-아미노-4-페닐-부틸릭산(butirric acid),
D-페닐-글리신,
L-페닐-글리신,
D-H-4-히드록시-페닐-글리신,
L-H-4-히드록시-페닐-글리신,
D-3-(2-푸릴(furyl))-알라닌,
L-3-(2-푸릴(furyl))-알라닌,
L-사이크로헥실알라닌,
D-사이크로헥실알라닌,
L-호모페닐알라닌,
D-호모페닐알라닌,
D-3-(4-퀴노릴(quinolyl))-알라닌,
L-3-(4-퀴노릴(quinolyl))-알라닌;
D-나프틸-알라닌
L-나프틸-알라닌
또는 상기 어느 L- 또는 D- 형의 N-메틸-유도체
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, n = 0인 화합물
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기의 화합물은 혈액순환(human circulation)에서 적어도 15분 반감기를 가지는 화합물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 시험관 내(in vitro) 결합측정법으로 평가시 Gadd45β 및/ 또는 MKK7 결합력의 적어도 20%, 또한 시험관 내 결합측정법으로 평가시 Gadd45β와 MKK7 상호작용 차단하는 능력을 적어도 20%를 보유하고, 또한 예를 들어 실시예 7에 주어진 조건에 있어서 상기 화합물은 MKK7 활성 저해하지 않는 조건 하에서 평가시 MKK7의 Gadd45β-억제 촉매활성의 적어도 20%를 회복하는 능력을 가지는 화합물.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 하기의 활성력 중 적어도 하나를 가지는 화합물.
a) 실시예 1, 2, 3, 4 또는 7에서 설명된 분석 조건하에서 Gadd45β와 MKK7 상호작용은 적어도 20%를 저해하고, 상기 분석 조건은 바람직하게는 상기 화합물이 MKK7 활성을 저해하지 않는 능력.
b) T-세포주 JURKAT 80%가 사멸되지 않은 조건하에서 U266, KMS-11, NCI-H929, ARH-77, JJN-3, KMS-12, KMS-18, 및 KMS-27 세포들로 이루어지는 군으로 부터 선택된 인간의 골수종 세포주 배양에서 세포의 적어도 20%를 살상시키는 시험관 내 능력.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A 는 하기의 구성되는 군으로 선택되는 아미노산 서열을 가지는 올리고펩타이드(oligopeptide):
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(L-Tyr)-(L-Asp)-(L-Phe),
(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Phe),
(L-Tyr)-(L-Glu)-(L-Phe),
(L-Tyr)-(L-Arg)-(L-Phe),
(D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Phe),
(D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Phe),
(D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Phe)
(D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Phe),
(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Tyr),
(D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Tyr),
(D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Tyr),
(D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Tyr),
(D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Tyr),
(D-Phe)-(D-Pro)-(D-Phe)
(D-Phe)-(D-Leu)-(D-Phe),
(D-Phe)-(D-Arg)-(D-Tyr)
(D-Phe)-(D-Glu)-(D-Tyr),
(D-Phe)-(D-Asp)-(D-Tyr),
(D-Phe)-(D-Pro)-(D-Tyr)
(D-Phe)-(D-Leu)-(D-Tyr)
(D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp)
(D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Asp)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Glu)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Arg)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Leu)-(D-Trp),
(D-Tyr)-(D-Pro)-(D-Trp),
(D-Phe)-(D-Leu)-(D-Trp),
(D-Phe)-(D-Arg)-(D-Trp),
(D-Phe)-(D-Giu)-(D-Trp),
(D-Phe)-(D-Asp)-(D-Trp),
(D-Phe)-(D-Pro)-(D-Trp),
(D-Phe)-(D-Leu)-(D-Trp),
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-(L-Arg)-아닐린
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-(L-Arg)-아닐린
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-(D-Arg)-아닐린
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-(D-Arg)-아닐린
p-히드록시벤조산-(L Glu)-(L-Arg)-벤질아민
p-히드록시벤조산-(D Glu)-(L-Arg)-벤질아민
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-(D-Arg)-벤질아민
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-(D-Arg)-벤질아민
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
p-히드록시벤조산-(L-Glu)-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
p-히드록시벤조산-(D-Glu)-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(L-Arg)-아닐린
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(L-Arg)-아닐린
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(D-Arg)-아닐린
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(D-Arg)-아닐린
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(L-Arg)-벤질아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(L-Arg)- 벤질아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(D-Arg)- 벤질아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(D-Arg)- 벤질아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(L-Glu)-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
2-(4-히드록시-페닐)아세트산-(D-Glu)-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(L-Arg)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-(L-Arg)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(D-Arg)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-(D-Arg)-아닐린
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(L-Arg)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-(L-Arg)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(D-Arg)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-(D-Arg)-벤질아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(D-Glu)-(L-Arg)-2-페닐-에틸-아민
3-(4-히드록시-페닐)프로피온산-(L-Glu)-(D-Arg)-2-페닐-에틸-아민
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Figure pct00035

화합물 Al
Ac-Tyr-Phe-NH2
Figure pct00036

화합물 A3
Ac-Tyr-bAla-Phe-NH2
Figure pct00037

화합물 A6
Ac-Tyr-(6-아미노-카프로-
산)-Phe-NH2
화합물 A7
Ac-Tyr-Tyr-NH2

화합물 A8
Ac-Phe-Tyr-NH2

화합물 A9
Ac-Phe-Arg-Phe-NH2

Figure pct00038

화합물 B2
Ac-Tyr-Lys-Phe-NH2
Figure pct00039


화합물 B13
Ac-Tyr-Pro-Phe-NH2

Figure pct00040

화합물 B 16
Ac-Tyr-His-Phe-NH2

화합물 H1
L-3,3 -디페닐-알라닌

화합물 H2
L-H-3(4-피리딜)-알라닌

화합물 H3
L-H-4-히드록시-페닐-글리신

화합물 H4
L-2-아미노-4-페닐-부틸릭산(butirric acid)

화합물 H5
L-페닐-글리신

화합물 H6
L-H-4-히드록시-페닐-글리신

화합물 H7
L-호모페닐알라닌

화합물 H8
L-3-(2-푸릴(furyl))-아닐린

화합물 H9
L-3-(4-퀴노릴(quinolyl))-알라닌

화합물 H10
L-니프틸-알라닌
Figure pct00041

화합물 11
Ac-Tyr-Arg-(N-Me)Phe-NH2

Figure pct00042

화합물 12
Ac-Tyr-(N-Me)Arg-Phe-H2

Figure pct00043

화합물 13
Ac-(N-Me)Tyr-Arg-Phe-NH2

Figure pct00044

화합물 14
Ac-(N-Me)Tyr-(N-Me)Arg-(N-Me)Phe-NH2

Figure pct00045

화합물 15
Ac-(N-Me)Tyr-Arg-(N-Me)Phe-NH2

Figure pct00046

화합물 Ol
Ac-Phe-Arg-Tyr-NH2

Figure pct00047

화합물 02
Ac-Phe-Arg-Phe-NH2

Figure pct00048

화합물 03
Ac-Tyr-Arg-Tyr-NH2

Figure pct00049

화합물 05
H-Phe-His-Tyr-NH2
Figure pct00050

화합물 07
H-Phe-His-Phe-NH2

화합물 08
H-Phe-Arg-Tyr-NH2

화합물 09
H-Phe-Arg-Phe-NH2

화합물 O10
H-Tyr-Arg-Tyr-NH2

화합물 PI
4-(히드록실)-페닐-아세트산-Arg-3-페닐-에틸아민
화합물 P2
4-(히드록실)-페닐-아세트산-His-3-페닐-에틸-아민
화합물 P3
4-(히드록실)-페닐-아세트산-Glu-3-페닐-에틸-아민

Figure pct00051

화합물 Gl
싸이크로(Tyr-Arg-Phe)

화합물 G2
싸이크로(Phe-Arg-Tyr)
Figure pct00052

화합물 G3
싸이크로(Tyr-Phe)
및
화합물 Nl
나노골드-Tyr-Arg-Phe-NH2
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 화합물 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 약학적 조성물
제 12항에 있어서, 치료제 또는 다른 치료제의 조합, 예를 들면 항 종양성 화학치료제(예를 들어, 탈리오마이드, 덱사메사손, 벨케이드, 및 레날리도마이드) 또는 빈열 치료제(예를 들어 에리스로포이에틴) 또는 뼈 골절 예방제(예를 들어 파미드로네이트 또는 조메타와 같은 비스포스네이트)를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 화합물의 약학적으로 유효한 양, 또는 제 12항 또는 제 13항의 약학적 조성물을 이것을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방방법.
제 14항에 있어서 상기 질병 또는 장애는 생존 및/또는 생장을 위하여 NF-κB 및/또는 Gadd45β에 의존하는 인간의 암인 방법.
제 14항에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 NF-κB 및/또는 Gadd45P에 의존하는 인간의 염증성 질병 또는 장애인 방법.
제 14항 또는 제 15항 또는 제 16항에있어서, 화합물 또는 약학적 조성물의 상기 투여에 앞서서 개체의 의심되는 암세포 또는 염증성 세포에 Gadd45β의 발현 및/또는 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
약제로 사용을 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제 12항 또는 제 13항의 조성물.
제 18항에 있어서, Gadd45β 발현 및/또는 활성이 평가된 수준을 나타냄으로 이전에 확인된 암을 치료하거나 또는 개체의, 상기 개체의 조직은 Gadd45β 발현 및/또는 활성이 평가된 수준을 나타냄이 이전에 확인된, 염증질환을 치료하는 약제로서의 사용을 위한 화합물 또는 조성물

Gadd45β 비정상적으로 증가된 발현 및/또는 활성으로 특징되어지고/되어지거나 NF-κB 경로의 비정상적 활성화로 특징되어지고 Gadd45β활성의 저해에 의해 세포예정사의 유도에 의해 치료가 가능한, 개체의 질병 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 제 12항 또는 제 13항의 약학적 조성물의 용도.
제 20항에서 있어서, 상기 질병 또는 장애는 다양한 골수종인 용도.
제 20항에서 있어서, 상기 질병 또는 장애는 버킷 임파종인 용도.
제 20항에서 있어서, 상기 질병 또는 장애는 전단구 백혈병인 용도.
제 20항에서 있어서, 상기 질병 또는 장애는 광범성 B-세포 림프종인 용도.
제 20항, 제 21항, 제 22항, 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 상기의 개체는 Gadd45β 활성 및/또는 발현의 상승된 수준을 나타내는 암을 가짐이 확인된 용도.
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