KR20120081938A

KR20120081938A - 스핑고마이엘린을 포함하는 리포좀 시스템

Info

Publication number: KR20120081938A
Application number: KR1020117010536A
Authority: KR
Inventors: 이체즈켈 바렌홀즈; 리브카 코헨
Original assignee: 이섬 리서치 디벨러프먼트 컴파니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘 엘티디.
Priority date: 2008-10-07
Filing date: 2009-10-11
Publication date: 2012-07-20
Also published as: CN102223878A; US20210093566A1; WO2010041256A3; CA2739822A1; US20110250266A1; WO2010041256A2; US20170281540A1; EP2344132A2; AU2009302042A1; CN102231978A; CN102231978B; EP2344133A2; US9713591B2; US20240058269A1; WO2010041255A2; EP2344133B1; WO2010041255A3; US11839685B2; US20110244029A1; US20190151243A1

Abstract

본 발명은 리포솜내 수성 구획 내에서 적어도 하나의 활성 제제를 캡슐화하는 리포솜이 분산되어 있는 수성 매질을 포함하고, 상기 수성 매질은 상기 리포솜내 수성 구획과 등장 평형에 있으며, 상기 리포솜은 리포솜형성 리피드들를 포함하는 막을 가지고, 상기 리포솜형성 리피드들 중 적어도 하나는 스핑고마이엘린(SPM)인 리포솜 시스템에 있어서, 상기 리포솜 시스템은 SPM이 없는 동일한 리포솜(즉, 상기 리포솜 형성 막 내에 SPM이 없음)과 비교하여 안정성이 증가된 것인, 리포솜 시스템을 제공하고, 하나의 실시태양에 따르면, 상기 리포솜 시스템은 장기간 저장 동안에 안정하고, 상기 안정(성)은 상기 저장 후에 상기 수성 매질 내에 상기 적어도 하나의 활성 제제가 30% 이하로 존재한다는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 리포솜 시스템을 이용하는 리포솜 저장 방법; 의학적 상태의 치료 또는 진단을 위한 상기 리포솜 시스템의 용도; 상기 리포솜 시스템을 포함하는 약학적 또는 진단용 조성물; 및 환자에게 상기 리포솜 시스템을 투여하여 의학적 상태를 치료 또는 진단하는 방법을 제공한다.

Description

스핑고마이엘린을 포함하는 리포좀 시스템{LIPOSOMAL SYSTEMS COMPRISING SPHINGOMYELIN}

본 발명은 리포좀 기술 분야에 관한 것이다.

다른 응용분야 중에서, 리포좀은 다양한 메카니즘을 통한 약물 전달 운반체로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 소형 단층 소포(small unilamellar vesicle, SUV), 대형 단층 소포(large unilamellar vesicle, LUV), 다층 소포(multilamellar vesicle, MLV), 다소포성 소포(multivesicular vesicle, MVV), 대형 다소포성 소포(large multivesicular vesicle, LMVV, 때때로 거대 다소포성 소포(giant multivesicular vesicle(GMVV)라고도 함), 올리고층 소포(oligolamellar vesicle, OLV) 등의 다양한 형태의 리포좀이 사용된다. LMVV는 다양한 크기 및 "양파 유사" MLV 구조를 갖는 단층 소포와 다소 다르다는 사실은 당업자에게 알려져 있다. LMVV에서 지질의 양 당 수성 상을 형성하는 수성 매질의 양은 MLV에서 보다 크고, 이는 잠재적으로, 비슷한 크기 분포를 갖는 MLV 시스템과 비교하여, 상기 LMVV에 있어서 상기 수성 상에 보다 많은 양의 약물 충전, 즉 보다 높은 약물 대 지질 몰비율을 가능하게 한다. 이 차이는 Grant 등(Grant et al., 2004, Anesthesiology 101(1):133-7,　2004) 및 미국 특허 번호 6,162,462호에 예시되어 있다. MLV와 LMVV 간의 구조적 차이에 의해 상기 리포솜 내로 보다 많은 약물 충전뿐만 아니라 상기 LMVV 시스템으로부터 장기간의 약물 방출이 가능하다는 사실을 발견하였다.

상세하게는, 미국 특허 번호 6,162,462호는, 부피바카인이 투과막 암모늄 설페이트 구배에 의해 충전되는 리포솜(성) 부피바카인 조성물을 공개하고 있는데, 상기 리포솜은 캡슐화된 약물 대 지질 몰비율이 적어도 1.0인 거대 다소포성 소포(GMV, LMVV와 동의어)이다. US 6,162,462의 리포솜 내에 캡슐화된 특정 약물은 양친매성 진통제 부피바카인(BUP)이다. 이러한 부피바카인으로 충전된 LMVV는 마우스 및 인간에게 보다 우수한 진통(무통증) 효과를 제공하는 것으로 나타나 있다[Grant et al. 2004 및 US　6,162,462, ibid.]. 그러나 4℃ 또는 실온에서 저장하는 동안 상기 LMVV로부터 부피바카인의 누출과 관련하여 이러한 LMVV와 관련하여 여전히 풀리지 아니한 현상이 존재한다는 것이다. 따라서 시간이 흐른 후에, 유리 약물이 상기 시스템 내에 함유되고(양은 약물 MTD 이상임) 이러한 유리 약물을 함유하는 리포솜 시스템의 투여는 독성 및 원치않는 부작용(유리 약물에 과도하게 노출됨으로 인한 것), 바람직하지 아니한 약물동력학 및 짧은 치료효능 지속 시간을 초래할 수 있다. 따라서 당업계에는 저장 동안에 약물을 캡슐화하는 리포솜으로부터 약물의 누출이 감소되거나 방지되는 시스템에 대한 요구가 있다.

[발명의 요약]

본 발명은, 감소된 BUP 누출의 관점에서, 상기 리포솜의 막이 스핑고마이엘린을 포함하고 상기 LMVV가 리포솜내 수성 매질과 등장 평형에 있는 수성 매질 내에 존재한다면, 많은 양의 양친매성 약물(부피바카인, BUP)으로 충전된 대형 다소포성 소포(LMVV)가 안정화될 수 있다는 발견에 기초한다.

따라서, 본 발명은 이의 제1 측면에 따라, 리포솜내 수성 구획(intraliposomal aqueous compartment) 내에서 적어도 하나의 활성 제제(active agent)를 캡슐화하는 리포솜이 분산되어 있는 수성 매질(aqueous medium)을 포함하고, 상기 수성 매질은 상기 리포솜내 수성 구획과 등장 평형(ios-osmotic equilibrium)에 있으며, 상기 리포솜은 리포솜형성 리피드들(liposome forming lipids)를 포함하는 막을 가지고, 상기 리포솜형성 리피드들 중 적어도 하나는 스핑고마이엘린(sphingomyelin, SPM)인 리포솜 시스템에 있어서, 상기 리포솜 시스템은 SPM이 없는 동일한 리포솜(즉, 상기 리포솜 형성 막 내에 SPM이 없음)과 비교하여 안정성이 증가된 것인, 리포솜 시스템을 제공한다. 하나의 실시태양에 따르면, 상기 리포솜 시스템은 장기간 저장 동안에 안정하고, 상기 안정(성)은 상기 저장 후에 상기 수성 매질 내에 상기 적어도 하나의 활성 제제가 30% 이하로 존재한다는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 이의 제2 측면에 따라, 리포솜내 수성 구획 내에서 적어도 하나의 활성 제제를 캡슐화하고, 적어도 하나의 리포좀 형성 지질이 스핑고마이엘린(SPM)인 리포솜 형성 지질을 포함하는 리포솜 저장 방법에 있어서, 상기 방법은, 상기 리포솜의 리포솜내 수성 구획과 등장 평형에 있는 수성 매질 내에 상기 리포솜이 분산되어 있는 리포솜 시스템을 형성하는 단계 및 상기 리포솜 시스템을 저장하는 단계를 포함하고, 상기 리포솜 시스템은 SPM이 없는 동일한 리포솜과 비교하여 안전성이 증가된 것인, 리포솜 저장 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 일부 측면에 따라, 약학적 또는 진단용 조성물 제조를 위한, 본 명세서에서 정의된 리포솜 시스템의 용도; 그리고 의학적 상태(medical condition)의 치료 또는 의학적 상태의 진단을 위한 용도로 사용하기 위한, 본 명세서에서 정의된 리포솜 시스템이 제공된다.

또한, 본 발명의 하나의 측면에 따라, 본 명세서에서 정의된 상기 리포솜 시스템 및 적어도 하나의 생리학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는 약학적 또는 치료용 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명은, 본 명세서에서 정의된, 유효량의 리포솜 시스템을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 의학적 상태의 치료 또는 진단 방법을 제공한다.

하나의 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 활성 제제는, 원격 충전 기술에 의해 상기 리포솜 내로 충전되는 양친매성 화합물이고; 상기 SPM은 합성 또는 반합성 C16 또는 C18 SPM이며 상기 리포솜은 대형 다소포성 소포(LMVV)이다.

본 발명에 따른 하나의 구체적인 리포솜 시스템은 적어도 수소화된 대두 포스포티딜콜린(HSPC), C16SPM, 콜레스테롤 및 캡슐화(encapsulating) BUP의 조합에 의해 형성된 LMVV를 포함한다.

본 발명을 이해하고 본 발명이 실제로 어떻게 수행되는지 알기 위하여, 첨부된 도면을 참조하여 비제한적인 실시예들 만으로 실시태양이 설명될 것이다.
도 1A 및 1B는, 4℃(도 1A) 또는 37℃(도 1B)에서 저장하는 동안, 막통과 암모늄 설페이트(ammonium sulfate(AS)) 구배에 의한 원격 충전에 의해서 BUP로 충전된 다른 지질 조성물들(각각의 BUP 대 인지질 몰비율이 주어져 있음)의 대형 다소포성 소포(LMVV)로부터의 부피바카인(BUP)의 방출을 보여주는 그래프이다.
도 2A 및 2B는, 4℃(도 2A) 또는 37℃(도 2B)에서 저장하는 동안, 막통과 칼슘 아세테이트(calcium acetate(CA)) 구배에 의한 원격 충전에 의해서 BUP로 충전된 다른 지질 조성물들(각각의 BUP 대 인지질 몰비율이 주어져 있음)의 대형 다소포성 소포(LMVV)로부터의 부피바카인(BUP)의 방출을 보여주는 그래프이다.
도 3A 및 3B는, 4℃(도 3A) 또는 37℃(도 3B)에서 저장하는 동안, 수동 충전 방법에 의해서 BUP로 충전된 다른 지질 조성물들(HSPC/CHOL은 6/4 몰비율; HSPC/C16SPM/CHOL은 3/3/4 몰비율; 및 HSPC100/CHOL은 6/4 몰비율, 각 조성물의 BUP 대 인지질 몰비율이 주어져 있음)의 대형 다소포성 소포(LMVV)로부터의 부피바카인(BUP)의 방출을 보여주는 그래프이다.
도 4A 내지 4C는, 표 8에서 1번 제형 내지 8번 제형(대응하는 제형 번호 "x"는 도면에서 "lip x"로 표시되어 있음)의 다양한 리포솜 시스템을 사용한 경우에서 마우스의 무통증 동안(duration of analgesia)을 보여주는 그래프로서, 도 4A는, BUP의 양이 6 mg/mouse로 일정한 상태에서, 리포솜성 BUP 또는 유리 형태의 BUP의 주입부피의 효과를 보여주고; 도 4B는, BUP의 양이 3 mg으로 일정한 상태에서, 5가지 다른 LMVV 제형의 효과를 보여주며; 도 4C는, 3 mg/mouse의 투여량에서, 8가지 다른 LMVV 제형(표 8)의 비교결과를 보여준다.
도 5A 내지 5F는, 표 8의 5가지 다른 LMVV 제형에 대한 두가지 다른 BUP 투여량(3 mg/mouse 및 6 mg/mouse)(도 5A 내지 5E에서 "lip x") 및 캡슐화되지 아니한 (유리) BUP의 2가지 다른 양(0.375 mg/mouse 및 0.75 mg/mouse)의 무통증 동안을 비교한 그래프로서; 도 5A는 lip 2(3 mg BUP/mouse 및 6 mg BUP/mouse)의 효과를 비교한 것이고, 도 5B는 lip 3(3 mg BUP/mouse 및 6 mg BUP/mouse)의 효과를 비교한 것이며, 도 5C는 lip 4(3 mg BUP/mouse 및 4.5 mg BUP/mouse)의 효과를 비교한 것이고, 도 5D는 lip 5(3 mg BUP 및 6 mg BUP)의 효과를 비교한 것이며, 도 5E는 lip 8(3 mg BUP/mouse 및 6 mg BUP/mouse)의 효과를 비교한 것이고, 도 5F는 두가지 부피(150 μl 및 300 μl)를 사용한 0.375 mg/mouse 및 150 μl의 부피를 사용한 0.75 mg/mouse의 유리(비리포솜성) BUP의 효과를 비교한 것이다.
도 6은, HSPC:C16SPM:콜레스테롤 [3/3/4]인 3 mg의 BUP를 포함하는 LMVV, Grant 등(2004)에 개재된 LMVV, 및 유리 BUP 0.75 mg/mouse(최대허용투여량(maximal tolerated dose, MTD))의 생체내 무통증 20시간 후를 보여주는 그래프이다.
도 7은, HSPC:C16SPM:콜레스테롤 [3/3/4]인 3 mg의 BUP를 포함하는 LMVV, 및 유리 BUP 0.75 mg/mouse(최대허용투여량(maximal tolerated dose, MTD))의 생체내 무통증 40시간 후를 보여주는 그래프이다.
도 8A 내지 8E는, 다양한 저장 매질(식염수, 0.5% BUP 또는 2.0% BUP) 내에 저장될 때, 막투과 AS에 의하여 부피바카인으로 충전된 HSPC100/C16SPM/CHOL (3/3/4 몰비율) LMVV의, 4℃에서 표시된 저장 기간동안 유리 부피바카인의 (저장 매질 내의 %) 농도 변화를 비교한 그래프이다.

[비제한적인 실시태양에 대한 상세한 설명]

본 발명은, US 6,126,462 및 Grant 등(Grant et al. 2004, ibid.)에 기재되어 있는 종래의 부피바카인 리포솜 제형(bupivacaine liposomal formulation)이 저온에서 장기간 저장하는 동안 누출(leak)하는 경향이 있고, 이로 인하여 상기 약물을 환자에게 투여할 경우에 독성의 위험이 있다는 사실에 대한 이해를 바탕으로 한 것이다. 이러한 부피바카인 리포솜 제형은 대형 다소포성 소포(LMVV, US 6,126,462에서는 거대(giant) 다소포성 소포(GMV)이라 함) 내에 높은 약물 대 인지질 비율(＞0.5 mole/mole)을 함유하였고, 그럼에도 불구하고, 이후의 저장에서 상당한 양의 캡슐화된 약물이 외부 매질에 존재한다는 것이 발견되었다. 따라서, 이제까지의 종래의 부피바카인 리포솜 제형과 비교하였을 때, 4℃에서 장기간 저장 후에 상기 리포솜에 대하여 외부의 매질 내에 유리(free) 부피바카인의 양이 상당히 감소된 신규한 리포솜 시스템이 설계되었다. 또한, 상기 리포솜 시스템이 4℃에서 저장되는 동안에 안정한 반면에, 생리학적 조건, 즉 37℃에서는 부피바카인이 상기 리포솜 시스템으로부터 제어되고 연장된 속도로 방출되어 장기간(연장된) 무통증(analgesia)을 달성하기에 충분하다는 것도 발견되었다.

상세하게는, 리포솜의 이중층(bilayer)에서 상기 리포솜의 이중층을 형성하는 전체 인지질의 75%(또는 전체 지질(약 33 mole%의 콜레스테롤 함유)의 50%)에 달하는 양만큼의 스핑고마이엘린을 포함하는 리포솜이, 37℃에서 상기 리포솜으로부터의 부피바카인의 방출 속도를 떨어뜨리지 아니하고, 또한 상기 리포솜에의 상기 약물의 높은 충전을 방해하지 아니하면서 누출량을 감소시켰다.

따라서 본 발명의 제 1 측면에 따라, 본 발명은, 리포솜내 수성 구획(intraliposomal aqueous compartment) 내에서 적어도 하나의 활성 제제(active agent)를 캡슐화하는 리포솜이 분산되어 있는 수성 매질(aqueous medium)을 포함하고, 상기 수성 매질은 상기 리포솜내 수성 구획과 등장 평형(ios-osmotic equilibrium)에 있으며, 상기 리포솜은 리포솜형성 리피드들(liposome forming lipids)를 포함하는 막을 가지고, 상기 리포솜형성 리피드들 중 적어도 하나는 스핑고마이엘린(sphingomyelin, SPM)인 리포솜 시스템에 있어서, 상기 리포솜 시스템은 SPM이 없는 동일한 리포솜과 비교하여 안정성이 증가된 것인, 리포솜 시스템을 제공한다.

상기 SPM 함유 리포솜의 안정성은 지질막 내에 SPM을 함유하지 아니하는 리포솜의 안정성보다 현저히 크다는 사실을 발견하였다. 또한, 상기 리포솜 시스템의 안정성은 장기간 저장에 의해 결정되는데, 상기 안정성은, 상기 저장 후에 상기 수성 매질 내에 상기 시스템의 상기 적어도 하나의 활성 제제가 30% 이하, 때때로, 20% 이하, 심지어는 10% 이하로 존재한다는 점을 특징으로 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "리포솜 시스템(liposomal system)"은, 적어도 하나의 형태의 리포솜을 형성하고 적어도 하나의 리포솜내 수성 구획을 둘러싸는 지질의 유기적인 집합체(organized collection)를 포함하는 시스템을 지칭한다. 상기 리포솜 외에, 상기 시스템은 상기 리포솜이 분산되거나 현탁되는 수성 매질을 포함한다.

상기 수성 매질은 원하는 오스몰농도(osmolarity) 및 이온 농도를 갖는 물 기반 완충용액(water based buffer solution)이고 다양한 생리학적으로 허용가능한 완충용액을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 완충 시스템은 일반적으로 약산과 이 약산의 염, 예를 들면, 소듐 사이트레이트(sodium citrate)/시트르산(citric acid)의 혼합물이거나; 이염기산(dibasic acid)의 단일양이온(monocation) 또는 이양이온(dication) 염, 예를 들면, 포타슘 하이드로겐 타르타레이트(potassium hydrogen tartarate), 소듐 하이드로겐 타르타레이트, 인산(phosphoric acid)/포타슘 디하이드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate), 및 인산/디소듐 하이드로겐 포스페이트의 혼합물이다. 약산 완충용액은 4 내지 7의 일정한 pH를 갖는 완충용액이고 약염기 완충용액은 7 내지 10의 일정한 pH를 갖는 완충용액이다. 본 발명에 따른 수성 매질을 제조하기 위해 사용될 수 있는 몇가지 비제한적인 완충용액의 예는 생리학적 식염수(0.9% NaCl), 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline(PBS)), 자당 완충용액(sucrose buffer), 히스티딘 완충용액(histidine buffer) 등을 포함하고, (리포솜 약물 전달 시스템에서 전형적으로 사용되는 바와 같이) pH 값이 약 4 내지 8, 또는 5.5 내지 7에 맞추어져 있다.

하나의 실시태양에 있어서, 상기 수성 매질은 상당량의 유리(free) 활성 제제를 포함하는데, 상기 수성 매질 내에 상기 유리 활성 제제가 존재함으로써 상기 등장 평형을 이루거나 상기 등장 평형에 참여하게 된다. 유리 활성 제제의 양은 상기 등장 평형을 이룰 정도에서 결정된다. 또한, 본 명세서의 실시예에 나타난 바와 같이, 상기 수성 매질 내에 상기 유리 제제가 존재함으로써 상기 리포솜으로부터 상기 제제의 누출이 감소된다(이러한 것은 상기 수성 매질 내에 유리 약물이 없는 동일한 제형에 필적하게 된다).

리포솜은 상기 수성 매질 내에 분산된다. "분산(dispersed)"이라는 용어는 상기 리포솜이 상기 수성 매질 내에 분포(distribution) 또는 현탁(suspension)되는 것을 가리키기 위해 사용된다.

이해하고 있는 바와 같이, 리포솜은, 아래에서 논의될 리포솜 형성 지질(liposome forming lipid)을 포함하는 지질 이중층(lipid bilayer), 및 수성 리포솜내 코어(acqueous intraliposomal core)를 포함한다. 본 발명에 따르면, 상기 리포솜 외부의 수성 매질 및 상기 리포솜내 수성 구획은 등장 평형에 있다. 상기 등장 평형은, 상기 수성 매질 및 상기 리포솜내 수성 구획의 매질이 유사한 오스몰농도를 가지고, 상기 유사한 오스몰농도는 50 mOsmole 이하의 오스몰농도 차이에 의하여 정의된다는 의미로 이해되어야 한다. 하나의 실시태양에 따르면, 상기 수성 매질의 오스몰농도 및 상기 리포솜내 수성 상(intraliposomal acqueous phase)의 오스몰농도는 약 50 mOsm/kg 내지 약 600 mOsm/kg, 또는 한층 더하여 약 250 mOsm/kg 내지 약 550 mOsm/kg의 범위이다. 상기 등장 평형은, 상기 활성 제제를 캡슐화하는 리포솜을 상기 리포솜내 수성 구획의 오스몰농도와 유사한 오스몰농도를 갖는 완충용액으로 세척함으로써 달성될 수 있다. 구체적으로, 상기 활성 제제가 상기 리포솜 내로 충전되면, 캡슐화되지 아니한 제제는 선택된 완충용액에 의해 씻겨 나간다.

상기 리포솜 막은 이중층 막이고 다양한 생리학적으로 허용가능한 리포솜 형성 지질을 포함하도록 제조될 수 있다. 본 명세서에서 "리포솜 형성 지질(liposome forming lipid)"이란 용어는 주로 글리세로인지질(glycerophospholipid) 및 스핑고마이엘린을 가리키는 데 사용된다. 상기 글리세로인지질은, 머리 부분(head group)에서 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 하이드록시기(hydroxyl group)가 하나 또는 두 개의 아실기, 알킬 또는 알케닐 사슬, 포스페이트기(phosphate group), 또는 이들의 조합, 및/또는 이들의 유도체로 치환된 글리세롤 골격(glycerol backbone)을 가지고 있고 상기 머리 부분에서 (아민기, 산, 에스테르, 알데히드 도는 알콜과 같은) 화학적으로 반응성 있는 작용기를 포함할 수 있으며, 이로써 상기 지질에 극성(polar) 머리 부분을 제공한다. 상기 스핑고마이엘린은, 1번 위치에 결합된 포스포릴콜린 부분(phosphorylcholine moiety)을 갖는 세라미드 단위(ceramide unit)으로 이루어져 있고, 따라서, 실제로는 N-아실 스핑고신(N-acyl sphingosine)이다. 스핑고마이엘린 내의 상기 포스포릴콜린 부분은 상기 스핑고마이엘린의 극성 머리 부분에 기여한다.

상기 리포솜 형성 지질에서, 상기 아실 사슬은 길이에 있어서 전형적으로 14개 내지 약 24개의 탄소 원자를 갖고, 완전히 수소화되거나, 부분적으로 수소화되거나 또는 수소화되지 아니한 지질인 다양한 포화도를 갖는다. 또한, 상기 지질 매트릭스(matrix)는 천연 공급원(natural source), 반합성(semi-synthetic) 또는 완전 합성 지질일 수 있고, 중성, 음성 또는 양성으로 하전될 수 있다.

리포솜 형성 글리세로인지질의 예에는 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(dimyristoyl phosphatidylglycerol, DMPG)을 포함하는 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, PG); 난황 포스파티딜콜린(egg yolk phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine, DMPC), 1-팔미토일-2-올레오일포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine, POPC), 수소화 대두 포스파티딜콜린(hydrogenated soy phosphatidylcholine, HSPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC)을 포함하는 포스파티딜콜린(phatidylcholine, PC); 포스파티드산(phosphatidic acid, PA), 포스파티딜리노시톨(phosphatidylinositol, PI), 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)이 포함되지만, 이에 한정되지 아니한다.

이해하고 있는 바와 같이, 상기 리포솜 형성 지질은 양이온성 지질(단일양이온성 또는 다양이온성(polycationic) 지질)도 포함할 수 있다. 전형적으로 스테롤(sterol) 또는 두 개의 아실 사슬 또는 두 개의 알킬 사슬, 또는 하나의 아실 사슬 및 하나의 알킬 사슬이 결합된 동일한 글리세롤 골격과 같은, 친유성 부분(lipophilic moiety)을 포함하는 양이온성 지질은 상기 양친매성 분자의 소수성 부위에 기여하여, 총괄적으로 양상 전하를 띠는 지질을 형성한다. 바람직하게는, 상기 지질의 머리 부분은 양성 전하를 띤다.

단일양이온성 지질은, 예를 들면, 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판(1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium propane, DMTAP); 1,2-디올레일옥시-3-(트리메틸아미노) 프로판(1,2-dioleyloxy-3-(trimethylamino) propane, DOTAP); N-[1-(2,3-디테트라데실옥시)프로필]-N,N-디메틸-일-N-하이드록시에틸암모늄 브로마이드(N-[1-(2,3-ditetradecyloxy)propyl]-N,N-dimeth-yl-N-hydroxyethylammonium bromide, DMRIE); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-하이드록시 에틸-암모늄 브로마이드(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxy ethyl-ammonium bromide, DORIE); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(N-[1-(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride, DOTMA); 3β[N-(N',N'-디메틸아미노에탄) 카바모일] 콜레스테롤(3β[N-(N',N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol, DC-Chol); 및 디메틸-디옥타데실암모늄(dimethyl-dioctadecylammonium, DDAB)을 포함할 수 있다.

다양이온성 지질은, 상기 단일양이온성 지질에서와 같이, 스페르민(spermine) 또는 스페르미딘(spermidine)이 결합된 유사한 친유성 부분을 포함할 수 있다. 이러한 것은 N-[2-[[2,5-비스(3-아미노프로필)아미노]-1-옥소펜틸]아미노]에틸-N,N-디메틸-2,3-비스[(1-옥소-9-옥타데세닐)옥시]-1-프로팜아미늄(N-[2-[[2,5-bis(3-aminopropyl)amino]-1-oxopentyl]amino]ethyl]-N,N-dimethyl-2,3-bis[(1-oxo-9-octadecenyl)oxy]-1-propanaminium, DOSPA), 및 세라미드 카바모일 스페르민(ceramide carbamoyl spermine, CCS)을 포함하지만, 이에 제한되지 아니한다. 상기 양이온성 지질은, 폴리리신(polylysine)으로 유도되어 양이온성 지질중합체(lipopolymer)를 형성하는, 중성 지질인, 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(dioleoylphosphatidyl ethanolamine, DOPE)와 같은 유도된(derivatized) 인지질의 일부를 형성할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 리포솜 형성 지질은 적어도 스핑고마이엘린을 포함한다. 본 명세서에서 "스핑고마이엘린(sphingomyelin)" 또는 "SPM"이란 용어는 포스포콜린 작용기에 접합된(conjugated) N-아세틸 스핑고신(N-acetyl sphingosine)을 가리키며, 후자는 상기 스핑고마이엘린의 극성 머리 부분을 형성한다 (N-아세틸스핑고실포스포릴콜린(N-acetylsphingosylphosphorylcholine)). 상기 스핑고신의 1차 아미노기에 결합된 아실 사슬(acyl chaine)은 포화 또는 불포화, 분지 또는 비분지(unbranched)일 수 있다. 하나의 실시태양에 있어서, 상기 아실 사슬은 12개 내지 24개의 탄소 원자, 때로는 14개 내지 20개의 탄소 원자를 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 SPM은 C16:0 또는 C18:0 스핑고마이엘린, 즉 포화 C16 또는 C18 SPM이다. 상기 SPM은 바람직하게는 합성 또는 반합성 SPM, 즉 자연적으로 발생하는 SPM의 유도체이고, 비록 자연적으로 발생하는 이성질체(isomer)가 바람직하기는 하지만, 자연적인(천연) D-에리쓰로(erythro) (2S,3R) 이성질체 및 자연적으로 발생하지 않는 L-쓰레오(threo) (2S, 3S) 이성질체를 포함할 수 있다.

또한, 본 명세서에서, 상기 스핑고마이엘린은 대응하는 디하이드로 종(dihydro specie), 즉 위에서 정의된 상기 SPM에 대응하는 디하이드로스핑고마이엘린(DHSM)을 가리키기 위해 사용되기도 한다.

하나의 실시태양에 있어서, 상기 리포솜 시스템은, 리포솜 막 내의 총 인지질(리포솜 형성 지질)의 25 mole% 내지 75 mole%의 양, 또는 콜레스테롤을 포함하는 경우에는 총 지질의 약 50 mole% 만큼의 상기 리포솜 막에서의 SPM 함량을 포함한다.

또 다른 실시태양에 있어서, SPM 이외의 리포솜 형성 지질과 상기 SPM 간의 몰비율은, 본 발명에 따라 사용되는 SPM과 무관하게, 전형적으로 1:1 내지 2:1의 범위이다.

전형적으로, 상기 리포솜 형성 지질은, 상기 리포솜 막 내부로 조립될(assembled) 때, 고체 정렬 상(solid ordered(SO) phase)에서 액체 정렬 상(liquid ordered(LO) phase)로의 상전이 온도가 T_m ＞ 37℃와 같이 정의되는 특징적인 온도를 갖는다. T_m은 SO에서 LD로의 상전이온도 범위 이내의 온도이며, 이 온도에서 상전이의 열용량(heat capacity)에서의 최대 변화가 발생한다. 흥미롭게도, 약 53℃의 SO에서 LO로의 상전이 온도 T_m을 갖는 HSPC와 약 41.4℃에서 T_m을 갖는 C16SPM을 조합함으로써 안정한 리포솜 시스템을 형성하였다는 사실을 발견하였고 아래에서 이를 보였는데, 이는 곧, C16SPM이 없는 덜 안정한, 즉 4℃ 저장시에 높은 약물 유출 속도를 보이는 리포솜 시스템과 비교하여, 4℃ 저장시(즉, 동일 저장 조거)에 약물 유출을 감소시켰다는 점이다.

본 명세서에서 "안정(성)(stability)"이란 용어는, SPM이 없는, 즉 리포솜 막이 리포솜 형성 지질의 일부로서 SPM을 포함하지 아니하는 동일한 리포솜과 비교했을 때, 제조된 리포솜이 보다 안정하다는 점(저장시 또는 저장 후에 보다 적은 양의 제제가 리포솜으로부터 누출되고, 누출에 있어서의 차이는 통계적으로 의미가 있음)을 가리키기 위해 사용된다. 또한, 상기 안정성은 약물로 충전된 리포솜이 4℃에서 적어도 3개월 동안 저장될 때 화학적 및 물리적으로 변하지 아니하는 것으로 정의될 수 있다. 예를 들면, 상기 안정성은 상기 리포솜외(extra-liposome) 수성 매질에 존재 또는 방출된(누출된) 유리 활성 제제, 즉 캡슐화되지 아니한 활성 제제의 양을 측정함으로써 결정되는데, 안정성을 나타내는 양은 상기 리포솜 시스템 내의 활성 제제의 총량(캡슐화된 제제 및 캡슐화되지 아니한 제제를 포함하는 총량)의 30% 이하, 20% 이하, 및 때때로 심지어 10% 이하이다. 놀랍게도, 본 명세서에 나타난 결과에 의하면, 예를 들어 HSPC 및 콜레스테롤을 포함하는 리포솜 제형(liposome formulation)을 동일한 제형에서 캡슐화된 제제의 누출량과 비교했을 때, 비록 상기 지질 막 내에 SPM이 존재한 경우라도, 상기 제제의 누출량이 감소되었다.

또한, 상기 리포솜은, 예를 들면 안정화를 위해, 표면 전하, 막 유동성에 영향을 주기 위해, 및/또는 상기 활성 제제의 상기 리포솜 내 충전을 위해, 리포솜 형성에 전형적으로 사용되는 다른 지질을 포함할 수 있다. 이러한 지질의 예에는 콜레스테롤, 콜레스테릴 헤미석시네이트(cholesteryl hemisuccinate), 콜레스테릴 설페이트(cholesteryl sulfate), 또는 다른 콜레스테롤 유도체와 같은 스테롤이 포함될 수 있다.

상기 리포솜은 지질중합체를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "지질중합체(lipopolymer)"란 용어는 극성 머리부분에서 친수성 고분자로 변경된(modified) 지질 물질(lipid substance)을 가리킨다. 지질중합체의 고분자 머리 부분은 전형적으로 수용성이고, 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 소수성 지질 부위에 결합될 수 있다. 전형적으로, 상기 친수성 고분자는 750 Da 이상의 분자량을 갖고, 극성 또는 비극성일 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 것들과 같은 지질중합체는 장기순환(long-circulating) 리포솜을 형성하기에 효과적인 것으로 알려져 있다. 지질에 결합하여 이러한 지질중합체를 형성할 수 있는 수많은 고분자는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산(polysialic acid), 폴리락트산(polylactic acid(또는 polylactide)), 폴리글리콜산(polyglycolic acid(또는 polyglycolide)), 폴리락트-폴리글리콜산(apolylactic-polyglycolic acid), 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리메톡사졸린(polymethoxazoline), 폴리에틸록사졸린(polyethyloxazoline), 폴리하이드록시에틸록사졸린(polyhydroxyethyloxazoline), 폴리하이드록시프로필록사졸린(polyhydroxypropyloxazoline), 폴리아스파르타미드(polyaspartamide), 폴리하이드록시프로필 메타크릴아미드(polyhydroxypropyl methacrylamide), 폴리메틸메타크릴아미드(polymethacrylamide), 폴리디메틸아크릴아미드(polydimethylacrylamide), 폴리비닐메틸에테르(polyvinylmethylether), 폴리하이드록시에틸 아크릴레이트(polyhydroxyethyl acrylate), 하이드록시메틸셀룰로오스(hydroxymethylcellulose) 또는 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose)와 같은 셀룰로오스 유도체(derivatized celluloses)이지만, 이에 한정되지 아니한다. 상기 고분자는 단일중합체(homopolymer) 또는 블록 또는 랜던 공중합체(block or random copolymer)로서 사용될 수 있다. 지질중합체로 유도된 지질은 중성, 음성은 물론 양성으로 하전될 수 있다. 지질중합체로 유도된 가장 널리 사용되고 상업적으로 이용가능한 지질은 포스포티딜 에탄올아민(PE), 대개는 디스테아릴포스파티딜에탄올아민(distearylphosphatidylethanolamine, DSPE)에 기반한 것들이다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 하나의 구체적인 지질중합체 패밀리(family)는 DSPE에 결합된 (다른 PEG 사슬 길이를 갖는) 모노메틸레이티드 PEG(monomethylated PEG)이고, 여기에서 상기 PEG 고분자는 카바메이트 결합(carbamate linkage)을 통하여 상기 지질에 결합되어 음성으로 하전된 지질중합체, 또는 중성 메틸 폴리에틸렌글리콜 다스테아로일글리세롤(neutral methyl polyethyleneglycol distearoylglycerol (mPEG-DSG)) 및 중성 메틸 폴리에틸렌글리콜록시 카르보닐-3-아미노-1,2-포로판디올 디스테아로일에스테르(neutral methyl poly ethyleneglycoloxy carbonyl-3 -amino- 1,2-propanediol distearoylester (mPEG-DS))를 형성한다[Garbuzenko O. et al., Langmuir. 21:2560-2568 (2005)]. 또 다른 지질중합체는 포스파티드산 PEG(phosphatidic acid PEG (PA-PEG))이다.

상기 PEG 부분(moiety)은 상기 머리 부분의 분자량을 가지며 약 750 Da 내지 약 20,000 Da, 때로는 약 750 Da 내지 약 12,000 Da 및 전형적으로는 약 1,000 Da 내지 약 5,000 Da이다. 리포솜에 일반적으로 사용되는 하나의 구체적인 PEG-DSPE는, PEG가 2,000 Da의 분자량을 가지는 것으로서, 본 명세서에서는 ²⁰⁰⁰PEG-DSPE 또는 ² ^kPEG-DSPE로 지칭한다.

상기 리포솜 시스템의 리포솜은 적어도 하나의 활성 제제를 캡슐화한다. 캡슐화(encapsulation)는 리포솜내 상(intraliposomal phase) 내에서 적어도 하나의 활성 제제의 포획/포위(entrapment/enclosure)를 포함한다. 상기 포획은 비공유결합적 포획, 즉 상기 리포솜내 수성 상에서 상기 활성 제제가 자유롭게 분산되는 것이고, 적절한 조건 하에서, 제어된 방식(controlled manner)으로 상기 리포솜으로부터 방출될 수 있다.

상기 활성 제제는 고분자(예를 들면, 펩타이드, 단백질, 핵산 서열 등)뿐만 아니라 작은 분자량의 화합물일 수 있다. "활성 제제(active agent)"란 용어는, 캡슐화된 제제가, 투여 후 이로운 효과, 예를 들면, 치료제, 조영제(예를 들면, 방사성핵 염료(radionuclei dyes), 또는 운반체에 대한 염료-접합체, 발색단(chromophore) 또는 형광단(fluorophore) 생성제 등), 기능식품 화합물(nutraceutical compound) 등으로서의 효과를 갖는 것을 가리키기 위해 사용된다. 상기 활성 제제는 양친매성 화합물뿐만 아니라, 수용성, 친수성 화합물일 수 있다.

하나의 실시태양에 있어서, 상기 활성 제제는 양친매성 화합물이다. "양친매성 화합물(amphipathic compound)"이란 용어는 친수성 및 친유성 특성을 함께 갖는 활성 제제를 가리킨다. 당업계에 생물학적으로 활성인 양친매성 화합물이 많이 알려져 있다. 한 예로서 항암 화합물인 독소루비신(doxorubicin)이 있다. 미리형성된 리포솜 내에 독소루비신을 충전하는 것은 막투과 암모늄 설페이트 구배(transmembrane ammonium sulfate gradient)에 의해 유도된다(US 5,192,549, US 5,316,771 및 Haran 등[Haran G, et al. (1993) Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases . Biochim Biophys Acta. 1151(2):201-15]).

또 다른 실시태양에 있어서, 상기 양친매성 활성 제제는 진통제(analgesic drug)이다. 상기 진통제는 전형적으로 국소 진통제이다. 진통제에 대한 비제한적인 예들은 벤조카인(benzocaine), 클로로포로카인(chloroprocaine), 코카인(cocaine), 사이클로메티카인(cyclomethycaine), 디메토카인(dimethocaine), 프로폭시카인(propoxycaine), 프로카인(procaine), 프로파라카인(proparacaine), 테트라카인(tetracaine), 아티카인(articaine), 부피바카인(bupivacaine), 카티카인(carticaine), 신초카인(cinchocaine), 에티도카인(etidocaine), 레보부피바카인(levobupivacaine), 리도카인(lidocaine), 메피바카인(mepivacaine), 피페로카인(piperocaine), 프리로카인(prilocaine), 로피바카인(ropivacaine), 트리메카인(trimecaine), 색시토신(saxitoxin) 및 테트로도톡신(tetrodotoxin)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 진통제에 대한 바람직한 예는 부피바카인(bupivacaine), 리도카인(lidocaine), 로피바카인(ropivacaine), 레보부피바카인(levobupivacaine), 프로카인(procaine), 클로로프로카인(chloroprocaine), 벤조카인(benzocaine), 에티도카인(etidocaine), 메피바카인(mepivacaine), 프리로카인(prilocaine), 시프로카인(ciprocaine), 테트라카인(tetracaine), 디부카인(dibucaine), 헵타카인(heptacaine), 메소카인(mesocaine), 프로파노카인(propanocaine), 카비소카인(carbisocaine), 및 부타카인(butacaine)을 포함하지만, 이들에 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 구체적인 진통제는 부피바카인(이하에서 "BUP"라 하기도 한다)이다.

또 다른 실시태양에 있어서, 상기 활성제제는, 예를 들면, 사이토카인(cytokine), 항체(antibody), 면역활성 올리고뉴클레오타이드(immunostimulating nucleotide, ISS-ODN), siRNA 등을 포함하는, 펩타이드, 단백질 또는 핵산 서열과 같은 수용성 분자이다.

이해하고 있는 바와 같이, 리포솜은 일반적으로 다양한 형태 및 크기를 갖는다. 상기 리포솜은 다층 소포(MLV) 또는 다소포성 소포(MVV)일 수 있다. MVV 리포솜은, 지질 막의 네트웍(network)에 의해 분리되고 지질 막 내에 포위되어 있는, 수많은 이심(non-concentric), 밀집된(closely packed) 내부 수성 체임버의 형태를 갖는다. 본 발명의 명세서에서, 상기 MVV는 대형 다소포성 소포(LMVV)라 하는데, 당업계에서는 거대 다소포성 소포(GMV)라고도 한다. 하나의 실시태양에 따라서, 상기 리포솜은 적어도 200 nm의 직경, 전형적으로는 200 nm 내지 25 μm의 직경을 가지며, 때로는 250 nm 내지 25 μm의 직경을 갖는다.

상기 리포솜이 MVV 또는 LMVV인 경우, 상기 제제를 상기 LMVV 내에 충전하면, 상기 지질 막에 의해 형성된 하나 이상의 수성 구획, 그리고 또한, 전형적으로, 상기 이심 지질 막(non-concentric lipid membrane)을 둘러싸는 수성 환경(acqueous environment)에서 상기 제제가 오염된다. 종종, 상기 제제는, 예를 들면 상기 활성 제제가 친유성 화합물인 경우에 상기 지질 막 내에 포획될 수 있다.

본 발명의 리포솜 시스템은 높은 활성 제제 대 지질 비율, 즉 리포솜 당 높은 활성 제제 농도를 특징으로 한다. 배타적이지는 아닐지라도, 고충전(high loading)은 전형적으로 사용된 리포솜의 형태, 그 크기, 충전 조건 등에 의존한다. 하나의 실시태양에 있어서, 높은 초기 활성 제제 농도 조건하에서 상기 활성 제제를 LMVV로 능동 충전(active loading, 아래 참조)함으로써 고충전시킬 수 있다. 본 명세서에서, 고충전은, 리포솜 시스템이 리포솜 형성 인지질 1몰 당 약물 약 0.5몰의 비율이 되도록 하는 활성 제제 대 지질 비율로 충전하는 것을 가리킨다(이는 본 발명에 따른 LMVV의 특징이다).

상기 활성 제제를 상기 리포솜에 충전하는 것은 당업계에 알려진 어떠한 기술에 의해서도 수행될 수 있다. 이러한 기술은 전형적으로 제제를 상기 리포솜 내부로 수동 충전(passive loading) 또는 능동 충전("원격 충전(remote loading)")하는 것을 포함한다.

제제를 리포솜 내로 캡슐화하는 수동 충전 기술은 전형적으로, 예를 들면 건조한 리포솜 형성 지질을 상기 활성 제제 용액으로 수화(hydrating)함으로써 상기 리포솜 제조 도중에 상기 제제를 충전하는 단계를 포함한다. 수동 충전에 의해, 상기 제제는 상기 리포솜 막과 결합하거나 상기 수성 코어 내에 포획될 수 있다. 수동 충전에 대한 하나의 방법이 Bangham 등[Bangham AD, Standish MM, Watkins JC (1965) Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. J MoI Biol. 13(l):238-52]에 기재되어 있는데, 관련 활성 제제를 함유하는 수성 상(acqueous phase)을 반응기 벽에 침착된 건조된 리포솜 형성 지질 필름과 접촉시킨다. 기계적 수단에 의해 교반하면, 상기 지질이 팽창(swelling)하여 다층 소포(MLV)가 형성된다. 또 다른 수동 충전 방법은 Szoka 및 Papahadjopoulos[Szoka F.C. Jr₅ Papahadjopoulos D. (1978) Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse - phase evaporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 75(9):4194-8.]에 의한 역상 증발법(reverse phase evaporation)인데, 이에 따르면, 불수용성 유기 용매에 녹인 지질 용액이 수성 운반체 상(acqueous carrier phase) 내에서 유화되고, 이어서 상기 유기 용매는 감압하에서 제거된다. 다른 수동 충전 방법들은, 리포솜을 연속적으로 탈수(dehydration) 및 재수화(rehydration) 처리하는 단계, 또는 냉동 및 해동하는 단계를 포함한다. 탈수는 증발 또는 냉동건조[Kirby C and Gregoriadis G (1984) Dehydration - Rehydration Vesicles : A Simple Method for High Yield Drug Entrapment in Liposomes . Nat. Biotechnol. 2, 979-984]에 의하거나, 수용액 내에서 초음파 분쇄(sonication)에 의한 리포솜을 캡슐화될 용제와의 혼합하고, 상기 혼합물을 질소 분위기하의 회전 플라스크 내에서 건조함으로써 수행된다. 재수화하면, 용제의 상당량이 캡슐화되는 대형 리포솜이 생성된다[Shew RL, Deamer DW. (1985) A novel method for encapsulation of macromolecules in liposomes. Biochim Biophys Acta. 816(l):l-8]. 상기 활성 제제를 상기 건조된 리포솜 형성 지질과 함께 냉동건조함으로써, 충전이 향상될 수 있다[국제특허공개번호 WO03000227].

또한, 능동 충전 기술도 사용된다. 예를 들면, 미리형성된(pre-formed) 리포솜 충전 구동력으로서 이온 구배(ion gradient) 또는 pH 구배를 사용하여 리포솜이 충전될 수 있다. pH 구배를 사용하는 충전은 미국특허번호 5,616,341, 5,736,155 및 5,785,987, US 5,192,549, US 5,316,771 및 Haran 등[Haran G, et al. (1993) Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases . Biochim Biophys Acta. 1151(2):201-15]에 기재되어 있는 방법들에 따라 수행될 수 있는데, 본 명세서에 참조로서 포함되어 있다. 상기 pH 구배는 칼슘 시트레이트-기반 또는 암모늄 설페이트-기반 구배일 수 있다.

하나의 실시태양에 따르면, 상기 리포솜은 다층 소포(MLV), 또는 다소포성 소포(MVV), 바람직하게는 대형 다소포성 소포(LMVV)의 형태를 갖는다.

또한, 본 발명은 위에서 정의된 바와 같은 리포솜 저장 방법, 즉 리포솜내 수성 구획 내에서 적어도 하나의 활성 제제를 캡슐화하고, 적어도 하나의 리포좀 형성 지질이 스핌고마이엘린(SPM)인 리포솜 형성 지질을 포함하는 리포솜 저장 방법에 있어서, 상기 방법은, 상기 리포솜의 리포솜내 수성 구획과 등장 평형에 있는 수성 매질 내에 상기 리포솜이 분산되어 있는 리포솜 시스템을 형성하는 단계 및 상기 리포솜 시스템을 저장하는 단계를 포함하고, 상기 리포솜 시스템은 SPM이 없는 동일한 리포솜과 비교하여 안전성이 증가된 것이며, 이로써 상기 저장 후에 상기 적어도 하나의 활성 제제의 30% 이하, 때로는 20% 이하 및 심지어 10%이하가 상기 수성 매질 내에 존재하는 것인, 리포솜 저장 방법을 제공한다.

상기 방법에 의해 (저온, 예를 들어 4℃에서) 상기 리포솜의 장기간 안정한 저장이 가능하다. 최소 안정 저장은 3개월이지만, 다음의 비제한적인 실시예에서 보이는 바와 같이, 4℃에서 4개월(120일), 4.5개월 및 6개월까지도 안정한 저장이 가능하였다. 그러나 위에 나타난 바와 같이, 생리학적 온도보다 낮은 온도, 즉 37℃ 이하에서도 상기 안정성이 유지된다. 저온을 언급하는 경우에는, 합리적인 저장 온도가 체중심 온도(body core temperature)보다 적어도 15℃ 낮은 온도, 즉 22℃ 이하라는 것을 이해해야 한다. 하나의 실시태양에 따르면, 저장이 2℃ 내지 8℃ 사이의 온도에서 이루어진다.

SPM 함유 LMVV의 저장 동안의 낮은 활성 제제 누출로 인하여, 리포솜 시스템을 환자에게 투여하기 전에 세척할 필요가 없다는 것을 발견하였다. 상기 리포솜 시스템은 환자에게 그대로 투여하거나 생리학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 투여될 수 있다.

따라서 본 발명은, 전술한 바와 같이, 의학적 상태(medical condition)의 치료 또는 진단 목적 각각을 위한 약학적 또는 진단용 조성물 제조를 위한 리포솜 시스템의 용도 또한 제공한다. 상기 조성물은 전형적으로, 상기 리포솜 시스템 이외에도, 적어도 하나의 생리학적으로 허용가능한 첨가제를 포함한다.

또한, 본 발명은, 상기 치료 또는 진단이 필요한 환자에게 전술한 바와 같은 상기 리포솜 시스템 또는 이를 포함하는 생리학적으로 허용가능한 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 의학적 상태의 치료 또는 진단 방법을 제공한다.

상기 리포솜 시스템은 단독으로 또는 생리학적으로 허용가능한 첨가제와 조합으로 당업계에서 허용되는 모든 경로를 통하여 투여될 수 있다. 하나의 실시태양에 따르면, 상기 리포솜 시스템은 비경구 주사 또는 주입(parenteral injection or infusion)을 통해 투여될 수 있다. 이는 정맥내, 동맥내, 근육내, 뇌내(intracerebral), 뇌실내(intracerebroventricular), 심장내(intracardiac), 피하, 골내(intraosseous), 진피내, 척수강내(intratheacal), 복강내(intraperitoneal), 방광내(intravesical), 그리고 해면체내(intracavernosal) 및 경막외(epiduaral, peridural) 주사 또는 주입을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 아니한다. 또한, 비경구 투여는 경피(예를 들어, 경피 패치(transdermal patch)), 점막관통(transmucosal)(예를 들어, 복막(peritoneum)으로의 확산 또는 주사), 흡입 및 유리체내(intravitreal) 주사 또는 주입을 포함할 수 있다.

상기 활성 제제가 진통제인 경우에, 바람직한 투여 방식은, 의사에 의해 결정될 수 있는 것과 같은, 어떠한 허용가능한 경로를 통한 국소 투여이다.

리포솜 시스템의 투여량, 그리고 이에 따른 상기 리포솜 시스템 내에 캡슐화된 활성 제제의 양은 목표 부위에서 상기 활성 제제에 의해 원하는 효과를 달성하기에 유효한 양이 되어야 한다. 예를 들면, 상기 활성 제제가 약물이면, 상기 리포솜 시스템의 양은, 상기 목표 부위에서 상기 약물의 양이 원하는 치료 효과를 달성하기에 충분하도록 결정되어야 한다. 이러한 원하는 치료 효과는 의학적 상태와 관련된 증상의 개선, 의학적 상태와 관련된 증상의 예방, 의학적 상태의 진행 상황의 완화, 완화 기간(remission period) 시작(onset)의 향상, 의학적 상태에 의한 비가역적 손상의 예방 또는 완화, 의학적 상태의 중증도(severity) 경감, 의학적 상태의 치료 또는 의학적 상태의 전개(developing) 예방, 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다. 상기 리포솜 시스템에 의해 치료될 의학적 상태는, 본 발명에 따라 상기 리포솜에 캡슐화될 활성 제제에 의해 치료될 수 있는 의학적 상태일 수 있다.

또한, 상기 활성 제제가 진단제(diagnostic agent)이면, 상기 리포솜 시스템의 양은 상기 목표 부위에서 마커(marker)를 영상화할 수 있을 정도가 되어야 한다.

상기 리포솜 시스템의 양은 당업계에 알려져 있는 고려사항들, 전형적으로 적절히 설계된 임상시험(복용량 범위 연구 등)을 사용하여 결정될 것이다.

본 명세서에서 단수 표현 또는 "상기"를 사용한 표현은, 본문에서 명백히 지시하지 않는 한, 단수는 물론 복수의 표현을 포함한다. 예를 들면, "리포솜 형성 지질"이란 용어는 리포솜을 형성할 수 있는 하나 이상의 지질을 포함한다.

또한, 본 명세서에서 "포함"이란 용어는, 상기 리포솜 시스템이 인용된 구성요소, 즉 상기 리포솜 형성 지질, SPM 및 상기 활성 제제를 포함하지만, 생리학적으로 허용가능한 운반체 및 부형제는 물론 다른 활성 제제와 같은 다른 구성요소를 배제하지는 않는 것을 뜻한다. "필수적으로 이루어진(구성된)"이란 용어는, 인용된 구성요소를 포함하는 리포솜 시스템을 정의하기 위해 사용되지만, 상기 리포솜 시스템에 의해 달성될 효과에 필수적인 중요성을 갖는 다른 구성요소를 배제한다. "이루어진(구성된)"이란 용어는 미량의 다른 구성요소도 배제하는 것을 의미한다. 이러한 연결 용어(transition term)의 각각에 의해 정의되는 실시태양은 본 발명의 범위 내에 있다.

또한, 예를 들어, 인용된 구성요소를 포함하는 리포솜 시스템을 구성하는 구성요소들의 양 또는 범위를 언급하는 경우, 모든 수치는 언급된 값으로부터 ±20%, 종종 ±10% 내에서 변할 수 있는 근사값이다. 심지어 명백히 언급되지 아니한 경우에도, 모든 수치는 "약(대략)"이라는 용어가 선행하는 것으로 이해되어야 한다.

이제 본 발명은, 본 발명에 따라 수행된 실험에 대한 다음의 기재에 예시될 것이다. 이러한 실시예들은 제한이 아닌 예시라는 성질로 이해되어야 한다. 명백하게, 이러한 실시예들에 대한 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 교시에 비추어 이루어질 수 있다. 따라서 첨부된 청구항의 범위 내에서 본 발명이 실시될 수 있고, 아래에 구체적으로 기재된 것보다 수많은 방법들로도 실시될 수 있다는 점을 이해해야 한다.

[비제한적인 실시예에 대한 설명]

물질(재료)

약물:

부피바카인 하이드로클로라이드(bupivacaine hydrochloride, BUP) USP XXIII (Orgamol, SA, Evionnaz, Switzerland).

메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트(methylprednisolone sodium succinate, MPS) (PHARMACIA NV/SA Puurs-Belgium)

지질:

콜레스테롤(CHOL) (NF; Solvay Pharmaceuticals (Veenedaal, Netherlands).

완전히 수소화된 대두 포스파티딜콜린(fully hydrogenated soy phosphatidylcholine, HSPC-100) (Lipid Gmbh, Ludwigshafen, Germany). 98.0 순수(98.0 pure), 즉 1.2% 미만의 lysoPC 및 약 1%의 지방산 포함.

완전 합성 N-팔미토일-D-에리쓰로-스핑고신-1-포스포콜린(N-palmitoyl-D-erythro-sphingosine-1-phosphocholine), N-팔미토일 스핑고마이엘린(N-palmitoyl sphingomyelin) (C16-SPM) ＞98% 순순, 로트 번호 546701(Biolab Ltd., POB 34038 Jerusalem 91340).

완충용액:

암모늄 설페이트(AS, MERCK);

칼슘 아세테이트 모노하이드레이트(CA, Aldrich);

칼슘 클로라이드-디하이드레이트(MERCK)

방법

약물로 충전된 LMVV 의 제조

대형 다소포성 소포( LMVV )의 제조

원하는 몰비율(구성성분 및 몰비율에 관한 자세한 사항은 표 1 참조)의 지질 분말 혼합물을 60℃ 내지 65℃에서 에탄올에 용해하였고 이를 수용액(아래에 나타낸 바와 같이, 암모늄 설페이트(AS), 칼슘 아세테이트(CA) 또는 다른 완충용액)에 첨가하여 최종 인지질(PL) 농도 60 mM 및 최종 에탄올 농도 10%로 만들었다.

이렇게 얻은 용액을 65℃에서 30분 동안 혼합하여 다층 소포(MLV)를 얻었다. MLV를 제조하기 위한 다른 방법도 사용될 수 있다(예를 들면, Barenholz & Crommelin, 1994, In: Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. (Swarbrick, J. and Boylan, J.C., Eds.), Vol. 9, Marcel Dekker, NY pp.　1-39 참조).

원하는 수성 상(예를 들면, 암모늄 설페이트 250 mM 또는 127 mM, 칼슘 아세테이트 250 mM 또는 200 mM; 또는 원하는 완충용액)을 사용하여 상기 MLV로부터 LMVV를 제조하거나, 상기 MLV를 액체 질소 내에서 냉동하고 60℃의 수조(water bath) 내에서 해동하는 것을 10 싸이클 반복하여 상기 MLV로부터 LMVV를 제조하였다. 각 싸이클에서, 1 ml의 분산된 LMVV 용액을 상기 액체 질소 내에 1분간 유지하였다. 예를 들면, 3 ml의 분산액을 액체 질소 내에 3분간 유지하였다.

구배 생성( gradient creation )

상기 리포솜외 수성 상으로부터 (각각) AS 또는 CA를 제거하고 이를 NaCl로 치환함으로써, 막투과(transmembrane) AS 또는 CA 구배를 생성하였다.

pH 구배를 생성하기 위해 세가지 방법을 사용하였다:

(i) AS 및 CA 모두에 대해 4℃에서 5분간 1000g로 원심분리(Grant 등 2004, ibid.). 상등액(supernatant)을 제거하였고 펠렛을 4℃에서 식염수(saline)로 세척하였다. 상기 세척 과정을 7회 반복하였다.

(ii) MWCO 12-14000 Dalton 투석 튜브를 사용한 투석(dialysis)

(iii) 중공 섬유 카트리지(hollow fiber cartridge) 500000 NMWC(GE Healthcare Bio-Science Corp. Westborough, MA 01581 USA)를 사용하는 Midjet 벤치탑(benchtop) 시스템을 이용한 투석여과(diafiltration).

부피바카인의 충전

두가지 대체적인 방법으로 LMVV에 부피바카인(BUP)을 충전하였다:

(i) 상기 LMVV(Grant 등 2004, ibid.)에 맞도록 변형된 막투과 암모늄 설페이트( AS ) 구배(Haran et al., (1993), BBA, 1151 201-215)를 갖는 미리형성된 리포솜; 또는 막투과 칼슘 아세테이트( CA ) 구배(Clerc & Barenholz. (1995), BBA, 1240, 65-257, Avnir et al (2008) Arthritis & Rheumatism, 58, 119-129)를 갖는 미리형성되 LMVV로의 원격 충전( remote loading ). 이 방법은, 독소루비신과 유사하게, BUP가 양친매성 약염기라는 사실을 이용한다.

(ii) BUP 수용액을 사용하는 지질 수화(hydration)에 의해 수행되는 수동 충전( passive loading )으로 BUP로 충전된 MLV를 형성하고, 이로부터 전술한 바(LMVV 제조)대로 BUP로 충전된 LMVV를 제조하였다.

두 가지 방법 모두에서 충전을 60℃ 내지 65℃에서 수행하였는데, 이 온도는 HSPC 및 C16SPM의 고체정렬(SO)에서 액체정렬(LO) 상전이 온도 범위(T_m)를 넘는다. HSPC 및 C16SPM은 본 명세서에 기재된 상기 LMVV의 리포솜 형성 지질이다.

원격 충전을 위해, 식염수(0.9% 중량/부피), 또는 상기 리포솜 외부 수상으로서의 증류수 내의 6% BUP에 상당하는(equivalent), 4.5%, 5.5% 또는 5.7% BUP를 사용하여 60℃ 내지 65℃에서 30분간 충전을 수행하였다. 0.5 ml의 습윤(wet) LMVV 펠렛 및 2 ml의 BUP 용액을 사용하여 원격 충전을 수행하였다. 이후 상기 혼합물을 밤새 4℃로 냉각하였다.

4.5% (231 mOsm/kg), 또는 5.5% (285 mOsm/kg), 또는 6% (301 mOsm/kg) 또는 7% (346 mOsm/kg), 또는 8% (373 mOsm/kg) 또는 10% (454 mOsm/kg) BUP (W/V)를 함유하는 증류수 수용액으로 65℃에서 30분간 상기 에탄올 지질 용액을 수화함으로써, BUP의 수동 충전을 수행하였다. 이 과정을 위하여, 225 mg의 인지질 및 77 mg의 CHOL을 함유하는 에탄올 지질 용액 0.5 ml를 사용하였다. 이 용액을, 5 ml의 전술한 BUP 수용액들 중 하나와 혼합하였다. 상기 현탁액을 냉동 및 해동 10 싸이클(전술하였음)로 처리하였고 차가운 방(4℃ 내지 6℃)에서 밤새 보관하였다.

유리 약물 제거( free drug removal )

식염수(1 ml 리포솜/4 ml 식염수)로 세척하고 4℃ 내지 5℃에서 5분간 1000g로 상기 분산액을 원심분리함으로써, 캡슐화되지 아니한 BUP를 제거하였다. 상기 세척 과정을 7회 반복하였다. CA 구배로 충전된 리포솜으로부터 세포외의 것을 대체하기 위해 사용된 최종 매질(이하 "수성 매질"이라 함)은 PBS이었다. PBS를 사용하는 것이 식염수를 사용하는 것보다 더 좋았다. AS 및 리포솜의 수동 충전을 위해 사용된 상기 매질을 교체하였고 LMVV를 완충되지 아니한(un-buffered) 식염수로 세척하였다.

상기 수동 충전 및 AS 구배 충전을 위하여 최종 2% BUP 용액이 되도록 상기 LMVV를 농축하였다. 이러한 LMVV의 부피가 크기 때문에, CA 구배 충전을 위해, 1% 최종 BUP 농도의 LMVV를 사용하였다. 이러한 농도들은 BUP 주사용으로 사용된 가장 높은 농도에 근접한 것이었다.

이렇게 형성된 LMVV의 안정성을, 4℃에서의 저장 동안에 리포솜으로부터 BUP의 방출 속도에 관하여 측정하였다.

등장 조건 하에서의 부피바카인의 충전

등장 조건(iso-osmotic condition)을 언급할 때, 상기 리포솜내 수성 코어, 및 상기 리포솜 안팎의 외부 매질의 오스몰농도가 필수적으로 동일 또는 근접하다는 것을 의미한다고 이해해야 한다.

세가지 오스몰농도를 시험하였다:

(i) 생리학적 식염수(0.9 NaCl)와 등장인(iso-osmotic) 280 mOsm/kg: AS 또는 CA 용액을 사용하여 280 mOsm/kg으로 조정된 약 20 mg/ml의 AS 또는 CA 용액을 사용하여 상기 AS 및 CA 구배 LMVV를 제조하였다. BUP 충전 농도를 물에서 5.7% BUP 또는 NaCl 용액에서 4.5% BUP로 하여 280 mOsm/kg을 달성하였다.

(ii) 250 mM의 AS와 등장인 550 mOsm/kg: 상기 AS 구배를 형성하기 위한 세척용액 및 충전 후 상기 유리 약물을 제거하기 위한 용액은 550 mOsm/kg으로 조정된 NaCl 용액이었다. 상기 약물 충전 농도를 NaCl 용액에서 4.5% BUP, 또는 자당 용액에서 4.5% BUP로 하여 550 mOsm/kg을 만들었다.

(iii) 250 mM CA와 등장인 650 mOs.

부피바카인 대 지질 비율

세가지의 BUP 대 지질 v/v 비율을 사용하여 BUP를 AS-LMVV로 충전하였다:

(i) 습윤 LMVV 펠렛:5.7% BUP:지질, 1:4 vol/vol.

(ii) 습윤 LMVV 펠렛:5.7% BUP:지질, 1:2 vol/vol.

(iii) 습윤 LMVV 펠렛:5.7% BUP:지질, 1:1 vol/vol.

결과로 얻은 LMVV의 특성은 표 1에 나타나 있다:

[표 1] BUP로 충전된 LMVV

또한, 도 1A 및 1B는 BUP-LMVV(H100을 사용함에도, 유사한 방법에 의해 제조됨)의 충전 안정성을, 4℃(도 1A) 및 37℃(도 1B)에서의 방출 속도에 대하여 측정하여, 비교하고 있다. 상기 비교는 다음과 같이 LMVV의 다른 지질 조성물과 관련한다:

(i) US 6,162,462(본 명세서에 참고로서 포함됨)에 기재된 바와 같은 (Lipoid GmbH의) 이전 HSPC 제형 및 CHOL;

(ii) HSPC-100(Phospholipids GmbH, Germany) 및 CHOL;

(iii) HSPC/C16SPM 및 CHOL;

(iv) HSPC 100/C16SPM 및 CHOL.

도 1A 및 1B에 나타난 데이터는, 상기 HSPC/CHOL 리포솜의 4℃에서의 60일간 저장시 BUP 방출 속도가 가장 높고, 이어서 HSPC100/CHOL 리포솜으로부터의 방출 속도가 그 다음이라는 것을 보여준다. 가장 낮은 방출 속도는 HSPC100/C16SPM/CHOL 리포솜의 경우이었다. 24시간 후에, 37℃에서의 방출은 상기 리포솜으로부터의 BUP의 60% 내지 70% 수준에 도달하는데, 이는 평탄부(plateau)가 없다. 따라서, HSPC100/C16SPM/CHOL로 이루어진 LMVV에 대해 BUP 충전이 약간 더 낮았지만, 4℃에서 이 제형의 낮은 BUP 방출 속도는 이러한 조합이 바람직한 제형이라는 결론에 도달하였다. 따라서 SPM이 존재하는 경우에, SPM이 없는 동일한 제형과 비교하여 누출이 감소한다는 또 다른 결론에 도달하였다.

다른 충전 기술, 다른 활성 제제(BUP 또는 MPS, "약물") 및 다른 수성 매질(세척 완충용액)을 채택한 HSPC100/C16SPM/CHOL 3/3/4(SUV 또는 LMVV 중 하나)를 포함하는 리포솜으로부터의 방출 속도를 검사하였다. 이 결과는 표 2에 나타나 있다.

[표 2] 약물 대 지질 비율 및 HSPC100/C16SPM/CHOL 3/3/4로부터 형성된 지질의 안정성 충전(4℃)

도 2A 및 2B는, BUP가 칼슘 아세테이트 구배를 사용하여 원격 충전된 것인, 도 1A 및 1B에서 사용된 것과 동일한 지질 조성물을 포함하는 LMVV로부터의 4℃(도 2A) 및 37℃(도 2B)에서의 BUP 방출 속도를 예시한다. 사용된 SPM은 C16SPM이었고, 또한 HSPC/SPM/CHOL 및 HSPC100/SPM/CHOL의 비교도 4℃에서 이루어졌다.

상기 CA 구배 충전에 대한 비율 BUP/PL은 상기 AS 구배 충전에 대해 얻은 것보다 더 낮았다. 4℃에서의 방출로부터 안정성을 측정하였다. 또한, 이 비율은 37℃에서 AS 구배에 의해 원격 충전된 LMVV에 대해 얻은 것보다 더 낮았다(즉, 더 높은 방출 속도). 상기 방출 속도는, 처음 10시간에서 방출 속도가 더 빠르고 이어서 평탄화된다는 점을 제외하고는, AS 구배에 의해 LMVV로 충전된 BUP의 방출 속도와 유사하다. 도 2A로부터, HSPC100 LMVV가 HSPC 기반의 LMVV보다 더 높은 안정성(즉, 4℃에서 더 낮은 누출)을 갖고, 안정성 향상에 대한 C16 SPM의 영향이 상기 두 개의 HSPC 제제 간의 차이보다 더 크다는 사실이 명백하다. 또한 C16 SPM은 두 가지 HSPC 조성물 모두에 대해 비슷한 정도로 누출을 감소시킨다.

도 3A 및 3B는, LMVV가 BUP로 수동 충전된 것인, 도 1A 및 1B에서 사용된 것과 동일한 지질 조성물인 BUP로 충전된 LMVV의 4℃(도 3A) 및 37℃(도 3B)에서의 BUP 방출 속도를 예시한다. 사용된 SPM은 C16SPM이었고, 또한 HSPC/SPM/CHOL 및 HSPC100/SPM/CHOL의 비교도 4℃에서 이루어졌다.

일반적으로, 사용된 3개의 지질 조성물의 수동 충전된 LMVV에 대하여, 4℃에서의 방출 속도는 CA 구배를 통한 원격 충전에 대한 것보다 더 높았고, 심지어 AS 원격 충전 LMVV의 경우와 비교하여도 더 높았다.

그러나 4℃ 및 37℃에서의 방출 속도에 대한 LMVV 조성물의 효과는 AS 및 CA 구배에 의한 원격 충전에 대해 관찰된 것과 유사하였고(그러나 크기는 더 컸다), 따라서 이는 이온 구배에 의한 원격 충전이 4℃에서의 충전 안정성을 증가시킨다는 것을 의미한다.

LMVV 최적화

다른 HSPC100:C16SPM 몰비율을 갖는 다양한 제형들을 제조하여 이러한 두 구성성분 간의 최적화된 몰비율을 결정하였다. 상기 다른 제형들은 표 3A 및 3B에 나타나 있다.

[표 3A] AS 구배로 능동 충전되어 형성된 HSPC100/C16SPM/CHOL LMVV에서의 HSPC100:C16SPM 몰비율의 효과

[표 3B] CA 구배로 능동 충전되어 형성된 HSPC100/C16SPM/CHOL LMVV에서의 HSPC100:C16SPM 몰비율의 효과

또한, 미리형성된 LMVV를 4℃에서 5분간 원심분리하여 밀집된(packed) LMVV를 제조하였다. 원격 충전하기 위해, 상기 밀집된 LMVV를 다양한 부피의 5.7% BUP 내에 현탁시켰다. BUP 대 LMVV 또는 PL의 부피비율은 표 4에 주어져 있다.

[표 4] 5.7% BUP 대 밀집된 LMVV의 부피비율(충전시)에 대한 수동 충전의 최적화

생체내 실험

부피바카인으로 충전된 LMVV 제조:

8가지 제형이 멸균 조건 하에서 제조되었고(아래에 나타나 있음), 이스라엘 예루살렘의 Hadassah 병원의 Clinical Microbiology Department에서 멸균성 시험을 하였다. 상기 리포솜을, 2℃ 내지 8℃의 조절된 온도에서, 이스라엘 예루살렘에서 선적하여 미국 뉴욕 뉴욕주립대학교 의과대학의 Department of Anesthesiology의 G.J. Grant 박사에게 보냈다. 선적 전 및 목적지 도착 후의 HPLC 분석(나타나 있지 않음)에 의하면 선적 동안에 누출이 없었다.

[표 7] 리포솜 조성물 특성

모든 리포솜 조성물에 대해 생체내 실험 전에 유리 BUP 및 전체(총) BUP에 대한 분석을 하였고 2%(w/w) BUP(리포솜 제형 #1, 2, 3, 5, 6, 8) 또는 1%(w/w) BUP(리포솜 제형 #4, 7)의 농도로 농축하였다. 능동 충전(CA 또는 AS 구배) 또는 수동 충전 중 어느 한 방법에 의해 BUP를 상기 리포솜 내로 충전하였다.

[표 8] 생체내 실험 전의 리포솜 조성물 분석

마우스 모델( mouse model )에서의 진통 효능:

전류 발생기(current generator, model S48, Grass Instruments)를 사용하여 주사 부위에서 복부 바로 위의 피부에 전기 자극을 가하여 무통증(진통, analgesia) 시험을 실시하였다.

주사 전에 마우스들(수컷 Swiss-Webster, 26±3 gr)을 시험하여 캡슐화 BUP 리포솜이 주사된 때의 발성 역치(vocalization threshold) 및 무통증 기간(analgesic duration)을 결정하였다(G.J. Grant et al, pharmaceutical research, vol 18, no.3, 336-343, 2001).

주요 생체내 선별검사 연구(screening study) 기간은 2일이었고, 제형 #4의 두 개의 다른 주사 부피(표 9A에서 PILOT이라 함)를 사용한 예비 연구를 수행한 후에 시작하였다.

주사액의 부피 및 BUP 농도 변화의 효과를 평가하기 위하여, 각 그룹에서, 세마리의 마우스는 2% 제형 150 μL를 주사맞았고 세마리의 마우스는 1:1 희석된 2% 제형 300 μL를 주사맞았다.

LMVV(GMV)로 캡슐화된 BUP는 주사 후 약 75분간의 무통증 효과를 제공한다는 사실이 종래에 결정되었다(Grant et al. 2004, ibid., Bolotin et al. 2000, ibid. and US6,162,462).

다른 BUP 농도, 다른 주사 부피 등에서 다양한 1 내지 8번 제형의 진통(무통증) 효능이 표 9A 내지 9C에 나타나 있다. 이 표에서, 수치 "1"은 완전 진통, 수치 "0"은 진통 효능이 없는 경우를 가리키며, 수치 "10"은 부분 진통 효능이 있는 경우이다. 다음의 표에서 수치 "10"은 "0.5"로 대체된다.

표 9A의 LMVV 제형 #4로 주사 맞은 마우스들에 대한 결과에서, 300 μL를 주사맞은 두 마리의 마우스 및 150 μL를 주사맞은 두 마리의 마우스를 "PILOT 1-4"로 나타내었다. 시험은 주사 후 4시간, 7시간 및 21시간에서 행해졌다.

도 4A 내지 4C, 5A 내지 5F, 6 및 7은 무통증(진통) 기간을 보여준다. 이 도면들에서의 차이는 사용된 제형에 있는데, 도 4 및 5는 표 8에 나타난 다양한 제형을 사용하고, 도 6 및 7은 HSPC100/C16SPM/CHOL (3/3/4)를 사용한다. 상기 생체내 결과에 따르면, 상기 SPM 함유 리포솜은 유리 BUP와 비교하여 현저하게 큰 진통 효능을 보여준다. 이러한 결과는, 선행기술에 따른 제형과 비교하여, SPM이 상기 리포솜 내로 포함되는 것이 상기 시스템의 진통 효과를 감소시키지 아니한다는 사실을 구체적으로 보여준다(Grant et al. 2004, ibid.).

[표 9A] 다른 BUP 농도(리포솜성-BUP로서 투여) 및 다른 주사 부피에서의 진통(무통증) 기간

2007년 8월 9일

"1"은 무통증 하의 마우스, "0"은 무통증 효과가 없는 마우스; 그리고 "10"은 부분적 무통증 하의 마우스를 나타낸다.

주: 2007년 8월 9일에, 본 발명자들은 4마리의 마우스에 LMW 제형 #4(2마리는 300 μL 그리고 2마리는 150 μL)를 주사하였고; 시험(testing)은 4, 7, 21시간에서 행하였다. 이러한 것들은 아래 표에서 "PILOT"이라 하였다.

[표 9B] 다른 BUP 및 다른 주사 부피에서의 진통 효능

2007년 8월 13일

표준 부피바카인(대조군) 1=진통(무통증); 0=진통 없음; 10=부분적 진통

리포솜성(LMVV) 부피바카인 파일럿(PILOT) 연구

[표 9C] 다른 BUP 농도 및 다른 주사 부피에서의 진통(무통증) 효능

2007년 8월 13일

리포솜성(LMVV) 부피바카인 파일럿(PILOT) 연구

위에 나타난 바와 같이, 상기 표에서 수치는 다양한 리포솜 제제의 생체내 성능에 있어서의 진통 효과를 평가하기 위하여 도입되었다: 각 시간 기간 동안(예를 들면, 4시간, 8시간 등), 수치 1은 진통이 완전한 경우에 주어지고; 10 또는 0.5는 진통이 부분적인(불완전한) 경우에 주어지며; 0은 진통 효과가 없는 경우에 주어진다. 각 하부그룹에 대한 평균을 독립적으로 계산하였다(즉 1% 300 μL, 2% 150 μL).

상기 결과에 의하면, 비록 상기 다양한 제형들 간의 차이가 현저하지 않더라도, 참조 리포솜성 GMV 제형[Grant et al. 2004, ibid., Bolotin et al. 2000, ibid. and US　6,162,462]과 같은 BUP 제형과 비교하여, 진통에 있어서 10배의 증가와 비교하면, CA 구배로 BUP를 LMVV로 능동 충전하고 상기 등장 수성 매질이 식염수인 제형 #4가 가장 우수한 진통 효과를 보였다.

별도의 실험에서, 부피바카인으로 충전된 LMVV를 마우스에게 반복적으로 주사한 경우의 효과를 평가하였다. 이 실험결과(데이터는 나타나 있지 아니함)에 따르면, 두번째 (반복된) 주사 후의 진통 효과는 아무런 부작용 없이 첫번째 주사 후의 진통 효과와 동일하였다. 결론은, 반복된 주사에 의해 진통이 연장될 수 있고, 두번째 주사 후의 진통(무통증) 기간은 첫번째 주사 후에 얻은 진통 기간과 적어도 동일하다는 것이다.

Claims

리포솜내 수성 구획(intraliposomal aqueous compartment) 내에서 적어도 하나의 활성 제제(active agent)를 캡슐화하는 리포솜이 분산되어 있는 수성 매질(aqueous medium)을 포함하고, 상기 수성 매질은 상기 리포솜내 수성 구획과 등장 평형(ios-osmotic equilibrium)에 있으며, 상기 리포솜은 리포솜형성 리피드들(liposome forming lipids)를 포함하는 막을 가지고, 상기 리포솜형성 리피드들 중 적어도 하나는 스핑고마이엘린(sphingomyelin, SPM)인 리포솜 시스템에 있어서, 상기 리포솜 시스템은 SPM이 없는 동일한 리포솜과 비교하여 안정성이 증가된 것인, 리포솜 시스템.
제 1항에 있어서, 장기 저장시 안정하고, 상기 안정성은, 상기 장기 저장 후에 상기 적어도 하나의 활성 제제의 30% 이하만이 상기 수성 매질 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 2항에 있어서, 상기 저장 후에 상기 적어도 하나의 활성 제제의 10% 이하만이 상기 수성 매질 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 SPM은 C12-C24 SPM인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 SPM은 C16 SPM인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 SPM은 합성(synthetic) SPM 또는 반합성(semi-synthetic) SPM인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 막은, 상기 막 내의 전체 인지질의 25 mole% 내지 75 mole% 양만큼 SPM을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 하나의 항에 있어서, SPM 이외의 리포솜형성 지질과 상기 SPM 간의 몰비율이 1:1 내지 2:1의 범위인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리포솜 형성 지질은 37℃ 이상의 고체정렬에서 액체정렬로의 상전이 온도(T_m)를 갖는 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 막은 스테롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 10항에 있어서, 상기 스테롤은 콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 같은 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리포솜은 다층 소포(MLV) 또는 다소포성 소포(MVV)인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 12항에 있어서, 상기 MVV는 직경이 200 nm 내지 25 μm인 대형 MVV(LMVV)인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 수성 매질 및 상기 리포솜내 수성 구획은 50 mOsm/kg 내지 600 mOsm/kg의 오스몰농도인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 14항에 있어서, 상기 수성 매질 및 상기 리포솜내 수성 구획은 275 mOsm/kg 내지 550 mOsm/kg의 오스몰농도인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 수성 매질 및 상기 리포솜내 수성 구획은 50 mOsmole의 오스몰농도 차이를 보이는 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 수성 매질은 상당한 양의 상기 적어도 하나의 활성 제제를 유리 형태(free form)로 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 수성 매질은 생리학적으로 허용가능한 매질인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성 제제는 양친매성 화합물(amphipathic compound)인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 19항에 있어서, 상기 양친매성 화합물은 진통제인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 20항에 있어서, 상기 진통제는, 벤조카인(benzocaine), 클로로포로카인(chloroprocaine), 코카인(cocaine), 사이클로메티카인(cyclomethycaine), 디메토카인(dimethocaine), 프로폭시카인(propoxycaine), 프로카인(procaine), 프로파라카인(proparacaine), 테트라카인(tetracaine), 아티카인(articaine), 부피바카인(bupivacaine), 카티카인(carticaine), 신초카인(cinchocaine), 에티도카인(etidocaine), 레보부피바카인(levobupivacaine), 리도카인(lidocaine), 메피바카인(mepivacaine), 피페로카인(piperocaine), 프리로카인(prilocaine), 로피바카인(ropivacaine), 트리메카인(trimecaine), 색시토신(saxitoxin) 및 테트로도톡신(tetrodotoxin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 국소진통제인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 21항에 있어서, 상기 진통제는 부피바카인(bupivacaine), 리도카인(lidocaine), 로피바카인(ropivacaine), 레보부피바카인(levobupivacaine), 프로카인(procaine), 클로로프로카인(chloroprocaine), 벤조카인(benzocaine), 에티도카인(etidocaine), 메피바카인(mepivacaine), 프리로카인(prilocaine), 시프로카인(ciprocaine), 테트라카인(tetracaine), 디부카인(dibucaine), 헵타카인(heptacaine), 메소카인(mesocaine), 프로파노카인(propanocaine), 카비소카인(carbisocaine), 및 부타카인(butacaine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 제제 및 상기 리포솜 형성 지질 간의 몰비율이 0.5 mole/mole 이상인 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저장은 4℃에서 적어도 3개월간의 저장을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 시스템.
리포솜내 수성 구획 내에서 적어도 하나의 활성 제제를 캡슐화하고, 적어도 하나의 리포좀 형성 지질이 스핑고마이엘린(SPM)인 리포솜 형성 지질을 포함하는 리포솜 저장 방법에 있어서, 상기 방법은, 상기 리포솜의 리포솜내 수성 구획과 등장 평형에 있는 수성 매질 내에 상기 리포솜이 분산되어 있는 리포솜 시스템을 형성하는 단계 및 상기 리포솜 시스템을 저장하는 단계를 포함하고, 상기 리포솜 시스템은 SPM이 없는 동일한 리포솜과 비교하여 안전성이 증가된 것인, 리포솜 저장 방법.
제 25항에 있어서, 상기 적어도 하나의 활성 제제의 30% 이하만이 상기 수성 매질내에 존재하는 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 26항에 있어서, 상기 적어도 하나의 활성 제제의 10% 이하만이 상기 수성 매질내에 존재하는 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성 제제를 상기 리포솜내 수성 구획 내로 충전하는 단계를 포함하고, 상기 충전하는 단계는 능동 충전(active loading) 또는 수동 충전(passive loading)을 포함하는 것인, 리포솜 저장 방법.
제 28항에 있어서, 상기 활성 제제는 PH 구배를 이용하여 상기 리포솜내 수성 구획 내로 능동적으로 충전되는 양친매성 화합물인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 29항에 있어서, 상기 PH 구배는 암모늄 설페이트 구배 또는 칼슘 아세테이트 구배인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 30항 중 어느 하나의 항에 있어서,상기 SPM은 C12-C24 SPM인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 31항에 있어서, 상기 SPM은 C16 SPM인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 SPM은 합성 SPM 또는 반 합성 SPM인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 막은, 상기 막 내의 전체 지질이 25 mole% 내지 75 mole% 양만큼 SPM을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항 내지 제 34항 중 어느 하나의 항에 있어서, SPM 이외의 리포솜 형성 지질과 상기 SPM 간의 몰비율 1:1 내지 2:1의 범위인 것을 특징으로하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리포솜 형성 지질은 37℃.이상의 고체정렬에서 액체정렬로의 상전이 온도(T_m)를 갖는 것을 특징으로 하는 리포솜 저장방법.
제 25항 내지 제 26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 막은 스테롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 37항에 있어서, 상기 스테롤은 콜레스테롤인것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 리포솜은 다층 소포(MLV) 또는 다소포성 소포(MVV)인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 39항에 있어서, 상기 MVV는 직경이 200 nm 내지 25 um 인 대형 MVV(LMVV)인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 수성 매질 및 상기 리포솜내 수성 구획은 50 mOsm/kg 내지 600 mOsm/kg의 오스몰농도인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 41항에 있어서, 상기 수용성 매질 및 상기 리포솜내 수성 구획은 275 mOsm/Kg 내지 295 mOsm/kg의 오스몰농도인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 42항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 수성 매질 및 리포솜내 수성 구획은 50 mOsmole의 오스몰농도 차이를 보이는 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 수성 매질은 상당한 양의 상기 적어도 하나의 활성 제제를 유리 형태로 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 44항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 수성 매질은 생리학적으로 허용가능한 매질인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 양친매성 제제는 진통제인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 46항에 있어서, 상기 진통제는 벤조카인, 클로로프로카인, 코카인, 사이클로메티카인, 디메토카인, 프로폭시카인, 프로카인, 프로파라카인, 테트라카인, 아티카인, 부피바카인, 카티카인, 신초카인, 에티도카인, 레보부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 피페로카인, 프리로카인, 로피바카인, 트리메카인, 색시토신, 및 테트로도톡신으로 이루어진 군으로부터 선택되어 국소 진통제인 것을특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 47항에 있어서, 상기 진통제는 부피바카인, 리도카인, 로피바카인, 레보부피바카인, 프로카인, 클로로프로카인, 벤조카인, 에티도카인, 메피바카인, 프리로카인, 시프로카인, 테트라카인, 디부카인, 헵타카인, 메소카인, 프로파노카인, 카비소카인 및 부타카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항 내지 제 48항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 활성 제제, 및 상기 제조된 리포솜 내의 상기 리포솜 형성 지질 간의 몰비율은 0.5 mole/mole 이상인 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
제 25항과 제 49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 4℃에서 적어도 3개월 동안 상기 리포솜을 저장하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 저장 방법.
약학적 또는 진단용 조성물 제조를 위한, 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 리포솜 시스템의 용도.
의학적 상태(medical condition)의 치료 또는 의학적 상태의 진단을 위한 용도로 사용하기 위한, 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 리포솜 시스템.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 리포솜 시스템 및 생리학적으로 허용가능한 운반체(carrier)를 포함하는 약학적 또는 진단용 조성물.
유효량의 제1항 또는 제2항의 리포솜 시스템 또는 제53항의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 의학적 상태의 치료 또는 진단 방법.