[go: up one dir, main page]

KR20120078661A - 양이온성 지질을 포함하는 음이온성 약물 전달체 및 그 제조방법 - Google Patents

양이온성 지질을 포함하는 음이온성 약물 전달체 및 그 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20120078661A
KR20120078661A KR1020110147557A KR20110147557A KR20120078661A KR 20120078661 A KR20120078661 A KR 20120078661A KR 1020110147557 A KR1020110147557 A KR 1020110147557A KR 20110147557 A KR20110147557 A KR 20110147557A KR 20120078661 A KR20120078661 A KR 20120078661A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
formula
cationic lipid
complex
anionic drug
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020110147557A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101308591B1 (ko
Inventor
최성원
나문호
손지연
서민효
Original Assignee
주식회사 삼양바이오팜
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 삼양바이오팜 filed Critical 주식회사 삼양바이오팜
Publication of KR20120078661A publication Critical patent/KR20120078661A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101308591B1 publication Critical patent/KR101308591B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/595—Polyamides, e.g. nylon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 화학식 1로 표기되는 양이온성 지질을 포함하는 음이온성 약물 전달체 및 그 제조방법이 개시된다. 또한, 음이온성 약물 및 화학식 1로 표기되는 양이온성 지질을 포함하며, 상기 음이온성 약물과 상기 양이온성 지질이 복합체를 형성하는 음이온성 약물을 함유하는 약제학적 조성물이 개시된다. 본 발명의 조성물은 국소 또는 전신 투여 이후 음이온성 약물의 체내 안정성을 높일 수 있으며, 세포내 전달을 가능케 하여 음이온성 약물의 치료 효능을 향상시키는 용도로 유용하게 사용된다.

Description

양이온성 지질을 포함하는 음이온성 약물 전달체 및 그 제조방법{Carrier for negative charged drugs comprising a cationic lipid and a preparation method thereof}
본 발명은 양이온성 지질을 포함하는 음이온성 약물 전달체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 음이온성 약물이 본 발명 화학식 1의 양이온성 지질과 복합체를 형성하는 음이온성 약물 전달체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
음이온성 약물, 특히 핵산 물질을 이용한 치료에 있어서, 안전하고 효율적인 약물 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다. 특히, 아데노바이러스나 레트로바이러스 등을 이용한 바이러스성 전달체, 및 양이온성 지질, 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 전달체를 이용한 전달기술들이 개발되어 왔다.
그러나, 바이러스를 이용한 전달체를 이용하는 기술은, 비특이적 면역 반응 등의 위험성에 노출되어 있으며 생산 공정이 복잡하여 상용화하는 데 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최근 연구 방향은 양이온성 지질이나 양이온성 고분자를 이용하는 비바이러스성 전달체를 이용하여 그 단점을 개선하는 방향으로 진행되고 있다. 이러한 비바이러스성 전달체는, 바이러스성 전달체에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다.
비바이러스성 전달체 제형 중에서, 핵산 물질과 정전기적 결합을 핵산-고분자 복합체를 형성하는 폴리양이온성(polycation) 고분자가 사용되어 왔으나, 다가 양이온 전하에 기인한 세포독성이 있어 실제 사용하기에는 문제점이 있다.
또한, 양이온성 지질을 사용할 수 있는데, 핵산-양이온성 지질 복합체의 경우, 혈중에서의 안정성이 낮아 실제 생체 내에서의 사용이 어렵다. 또한, 양이온성 지질, 중성 지질 및 용해성 지질 (fusogenic lipid)을 포함하는 이온성 리포좀은 전신 전달체로 시도되어 왔으나, 사용되는 양이온성 지질의 합성 방법이 복잡하고, 세포 독성이 여전히 있고, 세포내 핵산 전달 효율이 낮다.
양이온성 지질을 이용하여 siRNA와 복합체를 형성시킨 후 이것을 양친성 블록 공중합체의 미셀 내부에 봉입하는 기술이 알려져 있다. 그러나, 이들 기술에서 사용된 양이온성 콜레스테롤 지질은 합성과 정제 공정이 복잡하다는 단점이 있다.
한편, 많은 질병은 여러 요인으로 인하여 질병 유전자의 발현이 증가하거나 돌연변이에 의해 비정상적인 활성이 나타남으로써 발생하게 된다. siRNA(small interfering RNA)는, 전사 후 공정에서 서열 특이적으로 특정 유전자의 발현을 억제하므로, 유전자 치료제로서 많은 관심이 집중되고 있다. 특히, siRNA의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해, 기존의 안티센스 뉴클레오티드나 리보자임 등의 문제점을 해결할 수 있는 핵산 치료제로 기대되고 있다. siRNA는 15 개 이상 30 개 미만의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 이중 나선의 RNA 가닥으로, 이들과 염기 서열이 상보적인 유전자의 mRNA를 절단함으로써 해당 유전자의 발현을 억제시킨다.
그러나, siRNA는 혈중에서 핵산분해효소에 의해 빠르게 분해될 뿐만 아니라 음전하를 띄어 세포막을 쉽게 통과하지 못하므로 siRNA를 치료제로 사용하기 위해서는 siRNA를 혈액에서 안정하게 장시간 순환시키면서 표적 세포 또는 장기 내부에 효율적으로 전달될 수 있게 하는 전달체가 필요하다.
이에, 본 발명의 일례는 화학식 1로 표기되는 양이온성 지질을 포함하는, 음이온성 약물을 전달하기 위한 약물 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예는 지방산의 아실할라이드와 올리고알킬렌아민을 반응시켜 화학식 1의 양이온성 지질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다
본 발명의 또 다른 예는 음이온성 약물 및 화학식 1로 표기되는 양이온성 지질을 포함하며, 상기 음이온성 약물과 상기 양이온성 지질이 복합체를 형성하는 것인 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예는 음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 양친성 블록 공중합체를 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 미셀 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 미셀 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예는 음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 세포 융합성 인지질을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체가 세포 융합성 인지질로 구성된 리포좀에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예는 음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 계면활성제를 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체가 계면활성제의 미셀 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 미셀 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예는 음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 계면활성제를 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체가 에멀젼 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 에멀젼 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 화학식 1로 표기되는 양이온성 지질을 포함하는, 음이온성 약물을 전달하기 위한 약물 전달체를 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 식에서,
n과 m은 독립적으로 0 내지 12이되 2 ≤ n + m ≤ 12이며, a와 b는 독립적으로 1 내지 6이며, 및 R1과 R2는 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 또는 불포화 탄화수소이다.
상기 화학식 1로 표시되는 양이온성 지질은 양전하를 띠는 올리고알킬렌아민과 소수성인 탄소수 12 내지 26개의 포화 또는 불포화 지방산이 아미드결합을 한 형태이다. 본 발명에서, 상기 양이온성 지질은 음이온성 약물과 정전기적 상호작용을 통해 결합하여 복합체를 형성할 수 있고, 상기 복합체 형성으로 음이온성 약물의 생체 내 안정성을 향상시키고 세포 내로 전달시킬 수 있도록 한다.
본 발명의 한 예에서, 바람직하게 n과 m은 독립적으로 1 내지 9이며, 2 ≤ n+m ≤ 10이다. 더 바람직하게는 n과 m은 독립적으로 1 내지 3이며, 3 ≤ n + m ≤ 6이다. 상기 올리고알킬렌아민은 지방산의 밀도를 높게 유지하고 양이온으로부터 유발되는 세포독성을 최소화 하기 위해 n과 m은 상기와 같은 수치 및 범위를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명에서 a와 b는 바람직하게 각각 2 내지 4이며, 더 바람직하게는 a와 b는 2이다. a와 b가 1보다 작으면 아민 간의 거리가 너무 가까워 양이온성 지질과 음이온성 약물간의 정전기적 상호작용이 떨어진다. 또한, 6보다 크면 아민간의 거리가 멀어지고 양이온의 밀도가 낮아져 음이온성 약물과의 정전기적 상호작용이 떨어져 안정한 복합체를 형성할 수 없다.
본 발명의 올리고알킬렌아민은 구체적으로 올리고에틸렌아민이며, 더 구체적으로 디에틸렌트리아민 (diethylenetriamine), 트리에틸렌테트라민 (triethylenetetramine), 테트라에틸렌펜타민 (tetraethylenepentamine), 펜타에틸렌헥사민 (pentaethylenehexamine), 헥사에틸렌헵타민 (hexaethyleneheptamine), 헵타에틸렌옥타민 (heptaethyleneoctamine), 옥타에틸렌노나민 (octaethylenenonamine), 노나에틸렌데카민 (nonaethylenedecamine), 데카에틸렌운데카민 (decaethyleneundecamine), 운데카에틸렌도데카민 (undecaethylenedodecamine), 도데카데틸렌트리데카민 (dodecaethylenetridecamine) 및 트리데카에틸렌테트라데카민 (tridecaethylenetetradecamine)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 트리에틸렌테트라민, 테트라에틸렌펜타민, 펜타에틸렌헥사민 및 헥사에틸렌헵타민이다.
상기 R1과 R2는 바람직하게 각각 탄소수 11 내지 25개의 포화 또는 불포화 탄화수소이며, 더 바람직하게는 탄소수 13 내지 21개의 불포화 탄화수소일 수 있다. 탄소수가 11보다 작으면 탄화수소 사슬간의 소수성 상호 작용의 감소로 안정한 제형을 형성할 수 없다. 반면, 탄소수가 25보다 크면 탄화 수소간의 소수성 상호 작용의 증가로 과도하게 안정한 제형을 형성하여 체내에서 음이온성 약물의 해리 저하에 의한 효능 감소를 유발시킨다. 또한, 시스 (cis) 이중결합 증가에 의한 탄화수소 사슬의 만곡도 증가로 밀도가 낮은 제형을 형성하여 제형 안정성이 감소하게 된다.
상기 포화 탄화수소는 구체적으로 라우릴 (lauryl), 미리스틸 (myristyl), 팔미틸 (palmityl), 스테아릴 (stearyl), 아라키딜 (arachidyl), 베헨닐 (behenyl), 리그노세릴 (lignoceryl), 세로틸 (cerotyl)기 등을 들 수 있고, 불포화 탄화수소는 시스 결합을 가지는 것이 바람직한데, 구체적으로 미리스트올레일 (myristoleyl), 팔미트올레일 (palmitoleyl), 사피에닐 (sapienyl), 올레일 (oleyl), 리놀레일 (linoleyl), 아라키도닐 (arachidonyl), 에이코사펜타에닐 (eicosapentaenyl), 에루실 (erucyl) 및 도코사헥사에닐 (docosahexaenyl) 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한 하기 화학식 2의 올리고알킬렌아민을 하기 화학식 3의 지방산 아실 할라이드 및 하기 화학식 4의 지방산의 아실 할라이드와 반응시켜 화학식 1의 양이온성 지질을 제조하는 단계를 포함하는 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00002
[화학식 2]
Figure pat00003
[화학식 3]
Figure pat00004
[화학식 4]
Figure pat00005
상기 화학식 1 내지 화학식 4에서,
n과 m은 독립적으로 0 내지 12이되 2 ≤ n + m ≤ 12이며,
a와 b는 독립적으로 1 내지 6이며,
R1과 R2는 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 또는 불포화 탄화수소이고, 및 X는 할로겐이다.
본 발명의 일례에서, 상기 화학식 1의 물질에 대응되는 지방산의 아실할라이드와 올리고알킬렌아민을 반응시켜 화학식 1의 양이온성 지질을 제조할 수 있다. 구체적으로 다음과 같은 반응을 통해 제조할 수 있다.
[반응식 1]
Figure pat00006
상기에서, R1과 R2, a,b, n, 및 m은 상기에서 화학식 1에서 정의한 바와 같고, X는 플루오로, 염소, 브롬 또는 요오드를 포함하는 할로겐이다.
즉, 본 발명의 양이온성 지질은 친수성인 올리고알킬렌아민과 소수성인 지방산이 아미드 결합으로 결합된 양친매성 화합물로서 촉매 없이 올리고에틸렌아민 말단의 1차 아민기 (-NH2)과 지방산 간에 아미드 결합을 생성시킬 수 있다.
상기 제법에서 지방산의 아실 할라이드는 탄소수 12 내지 26개의 지방산 유래의 아실 할라이드이며, 포화 지방산의 아실 할라이드로는 바람직하게 라우로일(lauroyl) 클로라이드, 미리스토일 (myristoyl) 클로라이드, 팔미토일 (palmitoyl) 클로라이드, 스테아로일 (stearoyl) 클로라이드, 아라키도일 (arachidoyl) 클로라이드, 베헨노일 (behenoyl) 클로라이드, 리그노세로일 (lignoceroyl) 클로라이드, 세로토일 (cerotoyl) 클로라이드 등이며, 더 바람직하게는 팔미토일 (palmitoyl) 클로라이드, 스테아로일 (stearoyl) 클로라이드, 아라키도일 (arachidoyl) 클로라이드, 베헨노일 (behenoyl) 클로라이드이다.
또한, 불포화 지방산의 아실 클로라이드는 시스 (cis) 이중결합을 갖는 것이 바람직하며, 구체적으로 미리스트올레오일 (myristoleoyl) 클로라이드, 팔미트올레오일 (palmitoleoyl) 클로라이드, 사피에노일 (Sapienoyl) 클로라이드, 올레오일 (oleoyl) 클로라이드, 리놀레오일 (linoleoyl) 클로라이드, 아라키도노일 (arachidonoyl) 클로라이드, 에이코사펜타에노일 (eicosapentaenoyl) 클로라이드, 에루코일 (erucoyl) 클로라이드, 도코사헥사에노일 (docosahexaenoyl) 클로라이드 등이며, 더 바람직하게는 미리스트올레오일 (myristoleoyl) 클로라이드, 팔미트올레오일 (palmitoleoyl) 클로라이드, 사피에노일 (Sapienoyl) 클로라이드, 올레오일 (oleoyl) 클로라이드, 리놀레오일 (linoleoyl) 클로라이드, 아라키도노일 (arachidonoyl) 클로라이드, 에이코사펜타에노일 (eicosapentaenoyl) 클로라이드이다.
본 발명의 일실시예는 음이온성 약물 및 화학식 1로 표기되는 양이온성 지질을 포함하며, 상기 음이온성 약물과 상기 양이온성 지질이 복합체를 형성하는 것인 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 음이온성 약물 및 화학식 1로 표기되는 양이온성 지질은 정전기적 결합을 하여 복합체를 형성하여 음이온성 약물의 생체내 안정성을 향상시키고 세포 내로 전달을 매개하는 역할을 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 음이온성 약물은 수용액 중에서 분자 내에 음전하를 띄는 약리학적 활성 갖는 모든 물질을 포함하는 개념이다. 일실시예에서, 상기 음이온성은, 카르복시기, 포스페이트기 및 설페이트기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기로부터 부여될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 음이온성 약물은 다중 음이온성 약물 또는 핵산일 수 있다. 다중 음이온성 약물의 예로는 헤파린, 칼시토닌 등을 들 수 있다.
상기 핵산은 디옥시리보 핵산, 리보 핵산, 또는 백본 (backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 핵산의 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 핵산 약물일 수 있으며, 보다 구체적으로는 RNA, DNA, siRNA (small interfering RNA), 압타머 (aptamer), 안티센스 ODN (antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA (antisense RNA), 리보자임 (ribozyme) 및 디엔에이자임 (DNAzyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 백본 (backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식될 수 있다. 구체적으로, 핵산의 포스포다이에스테르 (phosphodiester) 결합의 일부를 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트 (boranophosphate) 결합으로 대체하거나, 일부 리보오스의 2'-OH 위치에 메틸기, 메톡시에틸기, 불소 등의 다양한 작용기가 도입된 수식된 뉴클레오티드를 1종 이상 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 핵산의 하나 이상의 말단은 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식될 수 있다. 예를 들어, siRNA의 경우 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5' 말단, 또는 3' 말단, 또는 양 말단에 수식될 수 있으며, 바람직하게 센스 가닥의 말단에 수식될 수 있다. 상기 콜레스테롤, 토코페롤 및 지방산에는 콜레스테롤, 토코페롤 및 지방산의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
본 발명의 음이온성 약물은, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.001 내지 10 중량%, 구체적으로는 0.01 내지 5 중량%로 포함되는 것이 좋다. 상기 음이온성 약물의 함량이 0.001 중량% 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고, 10 중량%을 초과하면, 전달체의 안정성이 저하되거나 크기가 너무 커져 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 양이온성 지질과 음이온성 약물은, 정전기적 상호작용을 통해 결합하여, 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체를 형성한다. 일실시예에서, 상기 양이온성 지질 (N)과 음이온성 약물 (P)의 전하량의 비율 (N/P; 음이온성 약물의 음이온 전하에 대한 양이온성 지질의 양이온 전하 비율)은, 0.1 내지 128이며, 구체적으로는 0.5 내지32이고, 보다 구체적으로는 1 내지 16인 것이 좋다. 상기 비율 (N/P)이 0.1 미만인 경우에는 충분한 양의 음이온성 약물을 포함하는 복합체를 형성하기 어렵기 때문에, 0.1 이상이어야 충분한 양의 음이온 약물을 포함하는 복합체를 형성할 수 있어서 유리하다. 반면, 비율(N/P)이 128 초과시에는 독성을 유발할 우려가 있으므로, 128 이하로 하는 것이 좋다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 전달체는 상기 핵산의 세포 내 운반 및 음이온성 활성물질의 생체내 안정성 향상 및 전달을 매개한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 리포좀, 미셀, 에멀젼 및 나노입자로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형일 수 있다. 구체적으로 상기 음이온성 약물 및 상기 양이온성 지질이 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 미셀, 리포좀, 에멀젼, 나노입자 내부에 봉입 또는 표면에 결합된 형태일 수 있다.
상기 제형에서, 본 발명의 음이온성 약물은, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.001 내지 10 중량%, 구체적으로는 0.01 내지 5 중량%로 포함되는 것이 좋다. 상기 음이온성 약물의 함량이 0.001 중량% 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고, 10 중량%을 초과하면, 전달체의 안정성이 저하되거나 크기가 너무 커져 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
또한, 상기 제형에서, 상기 양이온성 지질은, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.01 내지 50중량%, 구체적으로는 0.1 내지 10 중량% 포함될 수 있다. 상기 양이온성 지질의 함량이 0.01% 미만이면 음이온성 약물과 복합체를 형성할 수 있는 충분한 양이 되지 못하고, 50 중량%을 초과하면, 전달체의 크기가 너무 커져 생체내 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질뿐만 아니라 과량의 양이온에 의한 독성을 유발할 우려가 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 미셀 제형은 음이온성 약물, 양이온 지질 복합체 및 양친성 블록 공중합체를 포함한다. 즉, 본 발명은 음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 세포 융합성 인지질을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체가 세포 융합성 인지질로 구성된 리포좀에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.
상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체일 수 있다. 수용액 상에서, 상기 양친성 A-B 형 블록 공중합체는 수용액에 용해되지 않는 소수성 B 블록이 내부로 화합하면서 음이온성 약물/양이온성 지질 복합체가 내부에 봉입된 코어 (core)를 형성하고 친수성 A 블록이 코어 외부에 노출된 쉘을 형성하는 코어-쉘 타입의 고분자 미셀을 형성한다.
일실시예에서, 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 바람직하게는, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 친수성 A 블록은 수평균분자량이 200 내지 50,000 달톤, 보다 바람직하게는 1,000 내지 20,000 달톤, 보다 더 바람직하게는 1,000 내지 5,000 달톤인 것일 수 있다.
또한, 필요에 따라 친수성 A 블록의 말단에 특정 조직이나 세포에 도달할 수 있는 작용기나 리간드, 또는 세포내 전달을 촉진할 수 있는 작용기를 화학적으로 결합시켜 고분자 미셀 전달체의 체내 분포를 조절하거나 고분자 미셀 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다. 상기 작용기나 리간드는 단당류, 다당류, 비타민, 펩타이드, 단백질 및 세포 표면 수용체에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 바람직하게 아니사마이드(anisamide), 비타민 B9 (엽산), 비타민 B12, 비타민A, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 히알루론산, RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체에 대한 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 소수성 B 블록은, 생체적합성 생분해성이 우수한 고분자로서, 일실시예에서, 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 일실시예에서, 상기 소수성 B 블록은 수평균 분자량이 50 내지 50,000달톤, 보다 구체적으로는 200 내지 20,000달톤이고, 보다 더 바람직하게는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다. 또한, 소수성 블록의 소수성을 증가시키켜 미셀의 안정성을 향상시키기 위하여 토코페롤, 콜레스테롤, 또는 탄소수 10 내지 26개의 지방산을 소수성 블록 말단의 히드록시기에 화학적으로 결합시킬 수 있다.
상기 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)을 포함하는 양친성 블록 공중합체의 함량은, 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 40 내지 99.98 중량%이며, 바람직하게는 85 내지 99.8 중량%, 더 바람직하게는 90 내지 99.8중량%이인 것이 좋다. 상기 양친성 블록 공중합체의 함량이 40 중량% 미만이면 미셀의 크기가 너무 커져 미셀의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있고, 함량이 99.98 중량%를 초과하면 함입할 수 있는 음이온성 약물의 함량이 너무 적어지게 된다.
또 다른 일실시예에서, 상기 양친성 블록 공중합체에 있어서, 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)의 조성비는, 공중합체 중량을 기준으로, 친수성 블록(A)이 40 내지 70 중량%, 바람직하게는 50 내지 60 중량% 범위일 수 있다. 친수성 블록(A)의 비율이 40 중량% 미만이면 고분자의 물에 대한 용해도가 낮아서 미셀을 형성하기 어렵기 때문에, 공중합체가 미셀을 형성하기에 충분한 물에 대한 용해도를 갖기 위하여 친수성 블록(A)의 비율이 40 중량% 이상인 것이 좋은 한편, 70 중량%를 초과하면 친수성이 너무 높아서 고분자 미셀의 안정성이 낮아서 음이온성 약물/양이온성 지질 복합체의 가용화 조성물로 사용하기 어려우므로, 미셀 안정성을 고려하여 친수성 블록(A)의 비율이 70중량% 이하인 것이 좋다.
일실시예에서, 상기 양친성 블록 공중합체는 수용액 상에서 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체를 미셀 구조 내부에 봉입시키는데, 이 때 양친성 블록 공중합체의 중량 (b) 대비 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체의 중량 (a) 비율 [a/b X 100; (음이온성 약물 중량+양이온성 지질 중량)/양친성 블록 공중합체 중량 X 100]은, 0.001% 내지 100%, 구체적으로는 0.01 내지 50%, 보다 구체적으로는 0.1 내지 10%일 수 있다. 상기 중량 비율이, 0.001 중량% 미만인 경우에는 음이온성 약물 및 양이온성 지질 복합체의 함량이 낮아져서 음이온성 약물에 대한 유효 함량을 충족시키기 어려우며, 반대로 100 중량% 초과시에는 양친성 블록 공중합체의 분자량과 음이온성 약물 및 지질 복합체의 양을 고려할 때 적절한 크기의 미셀 구조를 형성하지 못하기 때문이다.
또한, 본 발명에 따른 미셀 조성물의 제조 방법은
(a) 음이온성 약물과 화학식 1의 양이온성 지질을 수혼화성 유기용매 또는 수용액과 유기용매의 혼합 용매에서 용해하여 상분리시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 유기용매층을 분리하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 유기용매층에 양친성 블록 공중합체를 혼합하고 유기용매를 제거하는 단계; 및
(d) 상기 유기용매가 제거된 혼합물에 수용액을 첨가하여 미셀화하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계에서, 수혼화성 유기용매, 또는 수용액과 유기용매의 혼합 용매에서 음이온성 약물과 양이온성 지질을 혼합하여 복합체를 형성한다. 구체적으로는, 상기 수혼화성 유기용매는 아세톤, 에탄올, 메탄올 및 아세트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 상기 혼합 용매의 유기용매는 아세트산 에틸, 아세토니트릴, 메틸렌클로라이드, 클로로포름 및 다이옥산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 수용액은 증류수, 주사용수, 또는 완충액일 수 있다. 상기 용매에 용해시킨 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체의 양은, 사용한 용매량의 0.1-100중량%, 바람직하게는 0.1-10 중량%, 보다 바람직하게는 0.1-1중량%가 되도록 사용할 수 있다. 만약 100 중량% 이상이면 하기 (b) 단계에서 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체를 유기용매로 추출할 때, 수율이 급격히 떨어지는 단점이 있다.
상기 (b) 단계에서 상분리를 통하여 음이온성 약물과 양이온성 지질의 복합체를 회수한다. 상기 단계 (a)의 용매에 수용액과 유기 용매를 추가하여 상분리를 유도할 수 있다. 또한, 상분리 시간을 단축시키기 위하여 원심분리 단계를 추가할 수 있다.
상기 (c) 단계에서, 추출된 유기용매에 양친성 블록 공중합체를 첨가하여 혼합한 후, 유기용매를 증발시킴으로써 제거한다.
상기 (d) 단계는 유기용매가 증발되고 남은 혼합물을 수용액 중에 용해시킴으로써, 음이온성 약물과 양이온성 지질 복합체를 양친성 블록 공중합체의 미셀 구조 내부에 봉입시키게 된다. 상기 수용액은 증류수, 주사용수, 또는 완충액일 수 있으며 사용량은 양친성 블록 공중합체의 농도가 10 내지 300 mg/mL 정도되게 할 수 있다 상기 고분자의 농도가 10 mg/mL 미만이면 수용액의 부피가 커져서 제조공정상의 취급에 어려움이 있고, 300 mg/mL을 초과하면 수용액의 점도가 높아져서 원활한 미셀 제조가 어렵다. 융합성 지질을 추가로 포함하는 경우, 융합성 지질은 양친성 블록 공중합체를 첨가할 때 첨가될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시예에서, 음이온성 약물, 화학식 1의 양이온성 지질 및 양친성 블록 공중합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법은,
(a') 음이온성 약물, 화학식 1의 양이온성 지질 및 양친성 블록 공중합체를 수혼화성 유기용매 또는 수용액과 유기용매의 혼합 용매에서 용해시키는 단계;
(b') 상기 (a') 단계의 유기용매층를 제거하는 단계;
(c') 상기 (b') 단계의 유기용매가 제거된 혼합물에 수용액을 첨가하여 미셀화하는 단계를 포함한다.
상기 (a') 단계에서, 수혼화성 유기용매 또는 수용액과 유기용매의 혼합 용매에서 음이온성 약물, 양이온성 지질 및 양친성 블록 공중합체를 혼합하여 복합체를 형성한다. 구체적으로는, 상기 수혼화성 유기용매는 아세톤, 에탄올, 메탄올 및 아세트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 상기 혼합 용매의 유기용매는 아세트산 에틸, 아세토니트릴, 메틸렌클로라이드, 클로로포름 및 다이옥산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 수용액은 증류수, 주사용수, 또는 완충액일 수 있다.
상기 (b') 단계에서, 유기용매를 증발시킴으로써 제거한다.
상기 (c') 단계는 유기용매가 증발되고 남은 혼합물을 수용액 중에 용해시킴으로써, 음이온성 약물과 양이온성 지질과의 복합체를 양친성 블록 공중합체의 미셀 구조 내부에 봉입시킨다. 상기 수용액, 그 사용량은 상기에서 기재한 바와 같다. 융합성 지질을 추가로 포함하는 경우, 융합성 지질는 단계 (a')에 첨가될 수 있다
또 다른 일실시예에서, 상기 (d) 단계, 또는 (c') 단계 이후에, (e) 동결건조 보조제를 가하여 동결건조 하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일실시예에서, 본 발명에 따른 제조방법은, 상기 (e) 단계의 동결 건조 전에 (d) 단계, 또는 (c') 단계에서 얻은 고분자 미셀 수용액을 멸균 필터로 멸균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일실시예에서, 상기 동결건조 보조제는 락토스, 만니톨, 솔비톨 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 동결건조 보조제는, 동결건조된 조성물이 케이크 형태를 유지할 수 있도록 하기 위해서 첨가된다. 또 다른 일실시예에서, 상기 동결건조 보조제의 함량은, 동결건조 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 1 내지 90 중량%, 더 바람직하게는 10 내지 60 중량% 이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 제형은 상기 음이온성 약물, 상기 양이온성 지질 및 계면활성제를 함유하는 미셀 형태일 수 있다. 즉, 본 발명은 음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 계면활성제를 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체가 계면활성제의 미셀 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 미셀 조성물을 제공한다.
상기 계면활성제는 예를 들어 트윈-20 (Tween-20), 폴리에틸렌 글리콜 모노올레일 에테르 (polyethylene glycol monooleyl ether), 에틸렌글리콜 모노도데실 에테르 (ethylene glycol monododecyl ether), 디에틸렌글리콜 모노헥실 에테르 (diethylene glycol monohexyl ether), 트리메틸헥사데실 암모늄 클로라이드 (trimethylhexadecyl ammonium chloride), 도데실트리메틸 암모늄 클로라이드 (dodecyltrimethyl ammonium bromide), 사이클로헥실 베타 말토사이드 (cyclohexylmethyl β-D-maltoside), 펜타에리스리틸 팔미테이트 (pentaerythrityl palmitate), 라우릴에메틸아민옥사이드 (lauryldimethylamine-oxide), 또는 라우로살 코신 소듐염(N-lauroylsarcosine sodium salt) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 리포좀 제형은 상기 음이온성 약물 및 양이온 지질의 복합체 및 세포 융합성 인지질을 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 음이온성 약물의 세포 내 전달 효율을 증가시키기 위하여 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.01 내지 50 중량%, 구체적으로는 0.1 내지 10 중량%의 세포 융합성 인지질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 복합체는 리포좀의 내부 또는 표면에 결합된 형태일 수 있다.
즉, 본 발명은 음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 세포 융합성 인지질을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체가 세포 융합성 인지질로 구성된 리포좀에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 리포좀 조성물을 제공한다.
상기 세포 융합성 인지질은 디올레오일 포스파티딜에탄올 아민 (dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE), 디팔미토올레오일포스포콜린 (1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 디올레오일포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 디팔미토 올레오일포스포 에탄올아민 (1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE)등을 예로 들 수 있다. 상기 세포 융합성 지질은 리포좀의 체내 안정성을 향상시키기 위해 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 다당류 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 물질로 수식된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 수식 물질은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리비닐피롤리돈 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 제형은 상기 음이온성 약물 및 양이온성 지질의 복합체 및 계면활성제를 함유하는 에멀젼 형태일 수 있다. 즉, 본 발명은 음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 계면활성제를 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및 상기 복합체가 에멀젼 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 에멀젼 조성물을 제공한다.
에멀젼 제형에 포함되는 계면활성제는 양이온성 (cationic), 양쪽성 (zwitterionic), 비이온성 (nonionic)을 들 수 있다. 양이온성 계면활성제로는 예를 들어 세틸 브롬화 트리메틸암모늄염 (cetyl trimethylammonium bromide), 헥사데실 브롬화 암모늄염 (hexadecyl trimethyl ammonium bromide) 등을 사용할 수 있으며, 양쪽성 계면활성제로는 예를 들어 도데실 베타인 (dodecyl betaine), 도데실디메틸아민 산화물 (dodecyl dimethylamine oxide), 디메틸팔미토일암모니오프로판 설포네이트 (3-(N,Ndimethylpalmitylammonio) propane sulfonate) 등을 사용할 수 있으며, 비이온성 계면활성제로는 예를 들어 트윈-20 (Tween-20), 트윈-80 (Tween-80), 트리톤 X-100 (Triton-X-100), 폴리에틸렌 글리콜 모노올레일 에테르 (polyethylene glycol monooleyl ether), 트리에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 (triethylene glycol monododecyl ether), 옥틸 글루코사이드 (octyl glucoside), 노나노일메틸글루카민 (N-nonanoyl-Nmethylglucamine) 등을 사용할 수 있다.
양이온성 리포좀, 미셀, 에멀젼 등의 제형으로 이루어진 본 발명의 음이온성 약물 전달체는 동물 세포 내에 목적하는 음이온성 약물의 수송 효율을 현저히 증강시킬 수 있으며 세포에 대한 독성도 감소시킨다.
일실시예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 수용액, 분말 또는 정제의 형태로 제제화될 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 조성물은 주사용 제제일 수 있다. 또한, 분말의 경우 주사용 증류수, 0.9% 생리식염수, 5% 덱스트로스 수용액 등으로 재건하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 제법을 통해 형성된 약제학적 조성물은, 혈중에서 안정하며, 입자크기는 10 내지 200 nm이며, 더욱 구체적으로는 10 내지 150 nm이다.
본 발명에 따른 음이온성 약물 함유 조성물은, 정맥 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 구강 투여, 골수 내 투여, 경피 투여 또는 국소 투여 등으로 투여될 수 있고, 용액, 현탁 주사제, 정제 또는 캡슐제 등의 다양한 형태로 제형화 할 수 있다.
본 발명의 양이온성 지질은 핵산 또는 음이온성 활성물질과 같은 음이온성 약물 복합체를 형성하여 세포 내 전달이 가능하고 또한 추가 조성물과 함께 리포좀, 미셀, 에멀젼 및 나노입자를 형성하여 음이온성 약물의 혈중 또는 체액 내 안정성을 높일 수 있다. 또한, 상기 전달체들은 양이온성 지질의 양전하 유래의 세포 독성을 감소시킬 뿐만 아니라 핵산의 세포 내 전달 효능을 현저히 증가시킨다. 따라서 상기 양이온성 지질은 핵산 또는 음이온성 활성 물질의 치료 효능을 증강시킬 수 있는 전달체의 용도로 유용하게 사용된다.
또한, 상기 화학식 1의 양이온성 지질은 저렴한 올리고알킬렌아민을 사용하여 지방산 유도체와 높은 수율로 쉽게 합성이 가능하며 기존의 지질 합성물과 달리 정제 공정이 매우 간단한 장점이 있다.
특히, 본 발명의 조성물이 음이온성 약물로서 핵산을 포함하는 경우 병인성 단백질의 이상발현 또는 과다발현이 발병 원인이 되는 종양, 관절염, 심혈관계, 내분비계 질환 등의 각종 질환 치료를 위해 세포 내로 도입될 수 있다.
도 1은 실시예 1의 1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드의 1H NMR 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2은 실시예 2의 1,8-디리놀레오일 테트라에틸렌펜타마이드의 1H NMR 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 3의 1,4-디미리스톨레오일 디에틸렌트리아마이드의 1H NMR 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 4의 1,10-디스테아로일 펜타에틸렌헥사마이드의 1H NMR 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 5의 1,10-디올레오일 펜타에틸렌헥사마이드의 1H NMR 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 제조예 1의 합성된 mPEG-PLA 블록 공중합체에 대한 1H NMR 측정결과이다.
도 7은 제조예 2의 합성된 mPEG-PLA-토코페롤 블록 공중합체에 대한 1H NMR 측정결과이다.
도 8은 제조예 3의 AC-콜레스테롤의 1H NMR 측정 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (1,6- dioleoyl triethylenetetramide )의 합성
트리에틸렌테트라민 (triethylenetetramine)과 올레오일 클로라이드 (oleoyl chloride)간의 친핵성 첨가반응 (nucleophilic addition)에 의해 다음과 같이 합성하였다.
1.12 g (7.5 mmol)의 트리에틸렌테트라민을 25 mL의 디클로로메탄에 넣고 5 얼음물 중탕에서 30분 동안 교반하면서 용해시켰다. 별개의 반응 용기에서 20 mL의 디클로메탄에 용해된 2.00g (6.0 mmol)의 올레오일 클로라이드 용액을 상기 용액에 천천히 적하시키면서 5℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 진행되면서 생성된 염화수소에 의한 미반응 트리에틸렌테트라민 염화염이 석출되었다. 반응종료 전 상층액을 취하여 에탄올:클로로포름 (2:1) 이동상에서 박막층 크로마토그래피법 (thin layer chromatography, TLC)로 반응여부를 확인하였다. 반응 확인 후 종이필터를 이용 석출물을 제거하였다.
이후 여과된 상층액을 회전증류농축장치(rotary evaporator)를 이용하여 용매를 제거하고 콜드 트랩 (cold trap)이 장착된 진공펌프로 건조시켰다. 여기에 35 mL의 디에틸 에테르 (diethyl ether)를 넣어 용해시킨 후 분액 깔데기에서 10 mL의 0.5 M NaOH 용액으로 2회 추출하였다.
이후 상부의 유기용매 층을 증류농축장치에서 가온, 감압 증류하여 용매를 완전히 제거한 후 박막층 크로마토그래피법을 이용하여 정제여부를 확인하였다. 최종적으로 얻어진 생성물의 구조 및 올레오일기의 도입 정도를 수소핵자기공명 분광기 (1H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다. 수율은 89.1%였고, 2.1 당량의 올레오일기가 트리에틸렌테트라민에 도입되었다.
실시예 2. 1,8- 디리놀레오일 테트라에틸렌펜타마이드 (1,8- dilinoleoyl tetraethylenepentamide )
트리에틸렌테트라민와 올레오일 클로라이드 대신 6.2 mmol의 리놀레오일 클로라이드 (linoleoyl chloride)를 4.1 mmol의 테트라에틸렌펜타민 (tetraethylenepentamine)에 첨가하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법을 거쳐 1,8-디리놀레오일 테트라에틸렌펜타마이드의 합성 및 정제를 하였다. 최종적으로 얻어진 생성물의 구조 및 리놀레오일기의 도입 정도를 수소핵자기공명 분광기를 이용하여 확인하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 수율은 78.9%였고, 1.9 당량의 리놀레오일기가 테트라에틸렌펜타민에 도입되었다.
실시예 3. 1,4- 디미리스톨레오일 디에틸렌트리아마이드 (1,4- dimyristoleoyl diethylenetriamide )
트리에틸렌테트라민와 올레오일 클로라이드 대신 8.1 mmol의 미리스톨레오일 클로라이드 (myristoleolinoleoyl chloride)를 13.5 mmol의 디에틸렌트리아민 (tetraethylenepentamine)에 첨가하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법을 거쳐 1,4-디미리스톨레오일 디에틸렌트리아마이드의 합성 및 정제를 하였다. 최종적으로 얻어진 생성물의 구조 및 미리스톨레오일기의 도입 정도를 수소핵자기공명 분광기를 이용하여 확인하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다. 수율은 80.4%였고, 2.1 당량의 미리스톨레오일기가 디에틸렌트리아민에 도입되었다.
실시예 4. 1,10-디스테아로일 펜타에틸렌헥사마이드 (1,10-distearoyl pentaethylenehexamide)
트리에틸렌테트라민와 올레오일 클로라이드 대신 4.2 mmol의 스테아로일 클로라이드 (stearoyl chloride)를 6.9 mmol의 펜타에틸렌헥사민 (pentaethylenehexamine)에 첨가하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법을 거쳐 1,10-디스테아로일 펜타에틸렌헥사마이드의 합성 및 정제를 하였다. 최종적으로 얻어진 생성물의 구조 및 스테아로일기의 도입 정도를 수소핵자기공명 분광기를 이용하여 확인하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다. 수율은 87.1%였고, 2.0 당량의 스테아로일기가 펜타에틸렌헥사민에 도입되었다.
실시예 5. 1,10- 디올레오일 펜타에틸렌헥사마이드 (1,10- dioleoyl pentaethylenehexamide )
트리에틸렌테트라민 대신 10.0 mmol의 펜타에틸렌헥사민 을 사용하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법을 거쳐 1,10-디올레오일 펜타에틸렌헥사마이드의 합성 및 정제를 하였다. 최종적으로 얻어진 생성물의 구조 및 올레오일기의 도입 정도를 수소핵자기공명 분광기를 이용하여 확인하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다. 수율은 88.2%였고, 2.1 당량의 올레오일기가 펜타에틸렌헥사민에 도입되었다.
제조예 1. 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 - 폴리락타이드 ( mPEG - PLA ) 블록 공중합체 (A-B)의 중합 ( 수평균 분자량 5,000-4,000 달톤 )
10 g의 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 (monomethoxy poly(ethylene glycol), 분자량 5,000달톤)을 100 mL 2-구 환저플라스크에 넣고, 감압 (1mmHg) 하에서 5시간 동안 120℃에서 진공 건조하였다. 반응 플라스크에 건조 질소를 채우고, 50% 농도로 톨루엔에 용해되어 있는 스태노스 옥토에이트 (Sn(Oct)2) 반응 촉매를 주사기로 DL-락타이드 (DL-lactide)의 0.3wt% (30mg) 주입하였다. 반응 혼합물을 30 분간 교반하고, 120℃에서 1시간 동안 1mmHg로 감압하여 톨루엔을 제거하였다. 8.46 g의 정제된 락타이드를 첨가하고, 혼합물을 6시간 동안 130℃로 가열하였다. 상기 과정을 통해 얻어진 mPEG-PLA의 수평균분자량은 5,000-4,000달톤이며, 도 6의 1H-NMR 에 의해 A-B 타입인 것으로 확인되었다.
제조예 2. mPEG - PLA -토코페롤의 중합 (분자량 5,000-4,000-530 달톤 )
제조예 1에서 합성한 mPEG-PLA 5g을 100 ml 2-구 환저플라스크에 넣고, 감압하에서 3시간 동안 120℃에서 진공 건조하였다. 여기에 3 mL의 톨루엔에 용해되어있는 35.5mg (645μmol)의 토코페롤 석시닐클로라아드 (tocopherol succinylchloride)을 투입하여 100℃에서 8시간 동안 감압조건에서 반응시켰다. 얻어진 고분자를 디클로로메탄 (dichloromethane)에 녹이고 헵탄에 침전시켜 정제를 실시하였다. 정제된 고분자는 진공 건조하여, 백색의 가루입자 형태를 얻었다. 수율은 94.2%였고, 도 7의 1H-NMR 분석에서 순도는 97.0% 이상이고 토코페롤 도입율은 99.9%였다.
제조예 3. AC -콜레스테롤(3- beta [N-( aminoethane ) carbamoyl ] cholesterol )의 합성
본 발명의 양이온성 지질과 세포전달 효능을 비교하기 위해 공지된 AC-콜레스테롤 양이온성 지질을 다음과 같이 합성하였다.
1g (2.23mmol)의 콜레스테릴 클로로포메이트 (cholesteryl chloroformate) 을 20ml의 클로로포름에 녹였다. 콜레스테릴 클로로포메이트 용액을 4℃의 30ml의 클로로포름에 희석되 있는 20배 당량의 에틸렌디아민 용액에 천천히 넣어준 뒤, 상온에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응종료 후 증류농축장치를 이용하여 용매를 제거하고, 다시 소량의 클로로포름에 녹인 뒤, NaCl 포화용액과 NaCO3으로 추출하여 클로로포름층을 회수하였다.
이후 증류농축장치로 용매를 제거하고, 클로로포름에 재용해 시킨 후 실리카겔 크로마토그래피 (silica-gel chromatography)로 분리하였다. 클로로포름:메탄올=9:1(v/v)에서 용출된 분획에 염산 용액을 콜레스테릴 클로로포메이트의 50배 당량으로 을 첨가하고, 단일상이 형성될 때까지 메탄올을 조금씩 첨가하여 AC-콜레스테롤 염산염을 형성하였다.
증류농축장치로 용매를 완전히 제거하고 얻은 AC-콜레스테롤 염산염을 60℃의 메탄올에 녹인 후 4℃로 냉각하여 재결정을 얻었다. 수율은 51%였다. 수소핵자기공명 분광기를 이용하여 AC-콜레스테롤의 합성 여부를 확인하였으며 그 결과는 도 8에 나타내었다.
실시예 6. 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드를 함유하는 양이온성 리포좀의 제조
6-1. 양이온성 지질를 포함하는 양이온성 리포좀의 제조
실시예 1에서 합성한 양이온성 지질인 1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 1.3 mg과 세포 융합성 인지질인 DOPE (Avanti polar lipids) 1.7 mg를 각각 1 mL의 클로로포름에 녹인 후 1-구 환저플라스크에서 혼합한 후 느린 속도로 회전증류농축장치(rotary evaporator)에서 클로로포름을 제거하여 얇은 지질필름을 제조하였다. 얻어진 지질필름에 인산완충용액 (phosphate buffered saline) 1 mL을 첨가하고 37℃에서 3분간 교반하여 상기 지질로 이루어진 리포좀을 제조하였다. 얻어진 리포좀 용액을 공극크기 0.2um의 폴리카보네이트 막이 장착된 압출기 (extruder)에 수회 반복 통과시켜 입자 크기가 균일한 리포좀을 제조하였다. 이렇게 제조된 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
6-2. GFP siRNA 의 포함
Opti-MEM 혈청배양액 (Invitrogen) 17.5uL에 실시예 6-1에서 제조된 양이온성 리포좀 용액 0.5uL를 가하고 혼합하였다. 상기 리포좀 용액에 삼천리 제약에서 구매한 하기의 서열번호 1 및 2의 GFP siRNA 2uL (34ng/uL)을 가하고 교반기로 혼합하였다. 상기 리포좀 제형은 20분간 실온에서 보관 후 세포주 배양액에 가하였다.
GFP siRNA (삼천리):
센스 가닥: 5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUdTdT-3'(서열번호 1-dTdT)
안티센스 가닥: 5'-AACUUCAGGGUCAGCUUGCdTdT-3'(서열번호 2-dTdT)
실시예 7. 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드를 함유하는 mPEG - PLA 미셀 제조
siRNA의 음이온 전하에 대한 양이온성 지질의 양이온 전하 비율(N/P 비율)을 6으로 하여 다음과 같이 siRNA-양이온성 지질 복합체를 함유하는 미셀을 제조하였다.
1-구 환저플라스크에서 실시예 1에서 제조한 1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 33ug에 클로로포름 100uL 및 에탄올 100uL를 혼합하여 실온에서 완전히 녹인 후, 실시예 6-2의 5ug siRNA을 포함하는 수용액 100uL을 첨가하였다. 여기에 증류수 100uL와 클로로포름 100uL를 가하여 상분리시켰다. 상분리 후 클로로포름 층만 수거하여 siRNA-양이온성 지질 복합체를 수득하였다.
제조예 1의 mPEG-PLA 9mg과 DOPE 34ug을 넣고 60℃서 5분간 교반하였다. 이때 mPEG-PLA에 대한 siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 복합체의 비율이 0.42wt%가 되도록 하였다. 혼합물을 증류농축장치에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 300uL를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 고분자 미셀 전달체를 제조하였다.
실시예 8. 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라마이드를 함유하는 mPEG - PLA -토코페롤 미셀 제조
실시예 7과 같은 방법을 사용하되, mPEG-PLA 대신 제조예 2의 mPEG-PLA-토코페롤을 사용하여 siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드/mPEG-PLA-토코페롤 미셀 전달체를 제조하였다. 이때 mPEG-PLA-토코페롤에 대한 siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 복합체의 비율이 0.42wt%가 되도록 혼합하였다. 이 혼합물을 회전증류농축장치에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 300uL를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 고분자 미셀 전달체를 제조하였다.
비교예 1. AC -콜레스테롤을 함유하는 mPEG - PLA -토코페롤 미셀 제조
본 발명의 양이온성 지질 제형과 세포전달 효능을 비교하기 위해 실시예 6-2의 5ug siRNA에 대하여 N/P 비율이 6이 되도록 제조예 3에서 합성된 AC-콜레스테롤 46ug을 사용하여 실시예 7과 동일한 방법으로 mPEG-PLA-토코페롤 미셀을 제조하였다. 이때 mPEG-PLA-토코페롤에 대한 siRNA/AC-콜레스테롤 복합체의 비율이 0.57wt%가 되도록 혼합하였다.
실시예 9. 1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드를 함유하는 양이온성 에멀젼 제조
실시예 1에서 제조한 양이온성 지질인 1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라미드 5.5mg에 0.1배 몰비율의 Tween-80 1.0mg을 혼합하였다. 여기에 인산완충용액 10mL을 첨가하고, 균질기(homogenizer)를 이용하여 상온에서 약 2분간 균질화시켜 유상이 수상 내에 분산된 수중유형 (O/W형) 양이온성 에멀젼을 제조하였다. Opti-MEM 혈청배양액 (Invitrogen) 15.5uL에 상기의 양이온성 에멀젼 용액 2.5uL를 가하고 혼합하였다. 여기에 실시예 6-2의 GFP siRNA 2uL (34 ng/uL)을 가하고 교반기로 혼합하여 에멀젼을 얻었다. 상기 에멀젼 제형은 20분간 실온에서 보관 후 세포주 배양액에 가하였다.
실험예 1. 단백질 발현 확인을 통한 양이온성 지질 함유 전달체의 siRNA 전달 효능 평가
실시예 6~9 및 비교예 1에서 제조된 제형에 대해 다음과 같이 녹색형광단백질 (GFP, Green fluorescence protein)을 안정하게 발현하는 A549 GFP 세포주에 처리하고 GFP 단백질 발현 정도를 확인하였다.
96웰 세포 배양판에 웰당 1104 개의 세포를 분주하고 24시간 후 각 웰의 세포가 60-70% 정도 균일하게 성장한 것을 확인 후 웰안의 배지를 제거하고 최종 부피 10%의 혈청을 함유하는 새 배지를 80uL씩 첨가하였다. 여기에 15nM의 농도로 siRNA가 함유되어 있는 실시예 6~9 및 비교예 1의 조성물을 20uL 용액을 상기의 세포배양 배지에 각각 가하고 인산완충액만을 처리한 대조군과 함께 37℃의 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양 후 배지를 교환하였다
다시 24 시간 후에, 각 웰의 세포배양 배지를 제거 후 인산 완충용액로 3회 세척하였다. 각 GFP siRNA 전달체들에 의한 GFP 단백질의 발현억제 정도를 평가하기 위해 마이크로 플레이트 검출기 (BioTek, Synergy HT Multi-mode microplate reader)를 이용하여 GFP 형광을 측정(excitation 파장: 485/20 nm, emission 파장: 528/20 nm)하였다. 대조군으로 인산완충액만을 처리한 것을 평가하였다. GFP 형광을 측정한 후에 세포 효소의 활성도를 측정하는 sulforhodamine B 시약에 의한 방법 (SRB viability assay)으로 처리 후 540 nm에서 UV 흡광도를 측정하여 세포 생존률을 구하였다. GFP 형광값을 세포 생존률로 나누어 보정한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 또한, 상업적 전달체 제품인 리포펙타민 (LipofectAMINE 2000, Invitrogen, USA)과 비교 시험을 하였다.
조성물 GFP형광 (%) 세포 생존률 (%) GFP형광
/세포 생존률 (%)
대조군 99.1 99.9 99.2
리포펙타민 46.9 72.1 65.0
비교예 1 65.4 90.2 72.5
실시예 6 51.0 89.5 57.0
실시예 7 51.5 91.5 56.3
실시예 8 51.3 97.0 52.9
실시예 9 55.4 98.1 56.5
상기 표에서와 같이, 본 발명의 실시예에서 제조된 제형들은 매우 낮은 siRNA 투여 농도에서도 siRNA를 효율적으로 세포 내로 전달하여 표적 단백질인 GFP의 발현을 35~50% 정도 억제하였음을 알 수 있다. 또한, 리포펙타민과 유사하거나 향상된 수준으로 GFP 단백질의 발현을 억제하면서도 세포 생존률이 더 높음을 알 수 있다. 이는 본 발명의 조성물이 리포펙타민보다 독성 대비 활성이 더 뛰어남을 의미한다. 아울러, 비교예 1 보다 약 30%의 siRNA 전달 효능이 향상된 것을 알 수 있다.
실험예 2. mRNA 발현 확인을 통한 양이온성 지질 함유 전달체의 siRNA 전달 효능 평가
본 발명의 실시예 6~9 및 비교예 1의 제형에 대하여 세포주에 대한 siRNA 전달 효능을 mRNA 수준에서 각각 확인하였다. 각 전달체들을 실험예 1과 같은 조건으로 처리하되, siRNA 투여농도를 5 nM 및 15 nM로 달리하여 qRT-PCR (quantitative Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction)을 이용해 다음과 같은 방법으로 GFP mRNA 발현양을 측정하였다.
세포에 각 전달체 처리 48 시간 후, 각 웰의 세포배양 미디어를 제거 후 인산완충용액로 3회 세척하였다. Trizol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 세포내에 존재하는 전체 리보핵산 (RNA)를 분리하고, 분리된 RNA는 High Capacity RNA-to-cDNA MasterMix (Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 역전사(RT)하였다. 역전사된 cDNA 이용하여 PCR을 행하였다. 이와 함께 동일한 방법으로 상기의 분리된 RNA로부터 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) mRNA를 증폭하여 GFP mRNA의 발현양을 보정하여 정량하였다. 대조군은 인산완충액만을 처리한 것이다. 정량한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
조성물 siRNA 투여농도
(nM)		 GFP mRNA 발현
(%)
대조군 0 100.0
리포펙타민 5 60.2
15 14.1
비교예 1 5 88.3
15 38.9
실시예 6 5 56.7
15 6.2
실시예 7 5 61.2
15 9.5
실시예 8 5 49.1
15 3.6
실시예 9 5 55.2
15 6.3
표 2를 통해, 본 발명의 실시예에서 제조된 제형들은 siRNA 투여량에 비례하여 GFP mRNA의 양이 감소하였으며, 5 nM과 같은 낮은 siRNA 농도에서도 약 50%의 GFP mRNA 발현 억제 효능을 보이며, 특히 15 nM 에서는 GFP mRNA를 최대 95% 이상 억제하였다. 표 2의 결과로부터 본 발명 조성물의 유전자 발현 억제 수준이 리포펙타민과 유사하고, 특히 5 nM의 저농도에서는 리포펙타민보다 약 2배 이상의 우수함을 알 수 있다. 이는 실시예의 조성물이 리포펙타민보다 효율적으로 표적 mRNA의 발현을 억제 시킨다는 것을 의미한다. 또한, 비교예 1의 결과와 비교할 때, 5 nM siRNA 저농도에서는 본 발명의 양이온성 지질을 사용함으로써 siRNA 전달 효능이 10 배 이상 향상된 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 양이온성 지질이 기존의 양이온성 지질보다 더 적은 양의 siRNA를 사용하여도 높은 siRNA 전달 효능을 얻을 수 있음을 알 수 있다.
<110> SAMYANG BIOPHARMACEUTICALS CORPORATION <120> Carrier for negative charged drugs comprising a cationic lipid and a preparation method thereof <130> DPP20116449KR <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense sequence of GFP siRNA with dTdT attached to the 3' end <400> 1 gcaagcugac ccugaaguu 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense sequence of GFP siRNA with dTdT attached to the 3' end <400> 2 aacuucaggg ucagcuugc 19

Claims (15)

  1. 하기 화학식 1의 양이온성 지질을 포함하는, 음이온성 약물을 전달하기 위한 약물 전달체:
    [화학식 1]
    Figure pat00007

    상기 식에서,
    n과 m은 독립적으로 0 내지 12이되 2 ≤ n + m ≤ 12이며,
    a와 b는 독립적으로 1 내지 6이며, 및
    R1과 R2는 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 또는 불포화 탄화수소이다.
  2. 제1항에 있어서, n과 m은 독립적으로 1 내지 9이며, 2 ≤ n+m ≤ 10인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  3. 제1항에 있어서, a와 b가 독립적으로 2 내지 4인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  4. 제1항에 있어서, R1과 R2는 독립적으로 탄소수 13 내지 21개의 불포화 탄화수소인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  5. 제1항에 있어서, R1과 R2는 독립적으로 라우릴 (lauryl), 미리스틸 (myristyl), 팔미틸 (palmityl), 스테아릴 (stearyl), 아라키딜 (arachidyl), 베헨닐 (behenyl), 리그노세릴 (lignoceryl), 세로틸 (cerotyl), 미리스트올레일 (myristoleyl), 팔미트올레일 (palmitoleyl), 사피에닐 (sapienyl), 올레일 (oleyl), 리놀레일 (linoleyl), 아라키도닐 (arachidonyl), 에이코사펜타에닐 (eicosapentaenyl), 에루실 (erucyl), 도코사헥사에닐 (docosahexaenyl) 및 세로틸 (cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 약물이 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 압타머, 또는 작은 간섭 리보핵산 (siRNA, small interfering RNA)인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  7. 하기 화학식 2의 올리고알킬렌아민을 하기 화학식 3의 지방산의 아실 할라이드 및 하기 화학식 4의 지방산의 아실 할라이드와 반응시켜 화학식 1의 양이온성 지질을 제조하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 약물 전달체를 제조하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00008

    [화학식 2]
    Figure pat00009

    [화학식 3]
    Figure pat00010

    [화학식 4]
    Figure pat00011

    상기 화학식 1 내지 화학식 4에서,
    n과 m은 독립적으로 0 내지 12이되 2 ≤ n + m ≤ 12이며,
    a와 b는 독립적으로 1 내지 6이며,
    R1과 R2는 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 또는 불포화 탄화수소이고, 및 X는 할로겐이다.
  8. 음이온성 약물 및 화학식 1로 표기되는 양이온성 지질을 포함하며, 상기 음이온성 약물과 상기 양이온성 지질이 복합체를 형성하는 것인 약제학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00012

    상기 식에서,
    n과 m은 독립적으로 0 내지 12이되 2 ≤ n + m ≤ 12이며,
    a와 b는 독립적으로 1 내지 6이며, 및
    R1과 R2는 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 또는 불포화 탄화수소이다.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조성물이 리포좀, 미셀, 에멀젼 및 나노입자로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것인 약제학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 음이온성 약물(N)과 양이온성 지질(P)의 전하량의 비율(N/P)은 0.1 내지 128인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 양이온성 지질이 전체 조성물의 0.001 내지 10 중량%인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제8항에 있어서,
    음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 양친성 블록 공중합체를 포함하며,
    상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및
    상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 미셀 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 미셀 제형을 가지는 약제학적 조성물.
  13. 제8항에 있어서, 음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 세포 융합성 인지질을 포함하며,
    상기 음이온성 약물은 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및
    상기 복합체가 세포 융합성 인지질로 구성된 리포좀에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 리포좀 제형을 가지는 약제학적 조성물.
  14. 제8항에 있어서, 음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 계면활성제를 포함하며,
    상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및
    상기 복합체가 계면활성제의 미셀 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 미셀 제형을 가지는 약제학적 조성물.
  15. 제8항에 있어서, 음이온성 약물; 화학식 1의 양이온성 지질; 및 계면활성제를 포함하며,
    상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 지질과 복합체를 형성하고, 및
    상기 복합체가 에멀젼 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 에멀젼 제형을 가지는 약제학적 조성물.
KR1020110147557A 2010-12-30 2011-12-30 양이온성 지질을 포함하는 음이온성 약물 전달체 및 그 제조방법 Active KR101308591B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20100138427 2010-12-30
KR1020100138427 2010-12-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120078661A true KR20120078661A (ko) 2012-07-10
KR101308591B1 KR101308591B1 (ko) 2013-09-13

Family

ID=46383774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110147557A Active KR101308591B1 (ko) 2010-12-30 2011-12-30 양이온성 지질을 포함하는 음이온성 약물 전달체 및 그 제조방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9220779B2 (ko)
EP (2) EP2658577A4 (ko)
JP (1) JP5836394B2 (ko)
KR (1) KR101308591B1 (ko)
CN (1) CN103476431B (ko)
AU (1) AU2011353233B2 (ko)
CA (1) CA2823182C (ko)
NZ (1) NZ611439A (ko)
WO (1) WO2012091523A2 (ko)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140107995A (ko) 2013-02-28 2014-09-05 주식회사 종근당 키토산 및 액상결정 형성 물질을 포함하는 유전자 전달용 조성물
WO2017048018A1 (ko) * 2015-09-15 2017-03-23 주식회사 삼양바이오팜 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법
WO2017105138A1 (ko) * 2015-12-18 2017-06-22 주식회사 삼양바이오팜 음이온성 약물을 함유하는 고분자 미셀의 제조방법
KR20180008854A (ko) * 2015-09-15 2018-01-24 주식회사 삼양바이오팜 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법
KR20180052083A (ko) * 2016-11-09 2018-05-17 주식회사 삼양바이오팜 Kras를 표적으로 하는 핵산 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법
WO2019098691A3 (ko) * 2017-11-16 2019-07-11 주식회사 삼양바이오팜 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물의 동결건조 조성물 및 방법

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE037173T2 (hu) 2006-08-08 2018-08-28 Univ Bonn Rheinische Friedrich Wilhelms 5'-Foszfát-oligonukleotidok szerkezete és alkalmazása
US9738680B2 (en) 2008-05-21 2017-08-22 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn 5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof
EP2508530A1 (en) 2011-03-28 2012-10-10 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags
WO2013151326A1 (en) * 2012-04-04 2013-10-10 Samyang Biopharmaceuticals Corporation Method of preparing composition for delivering an anionic drug
EP2712870A1 (en) 2012-09-27 2014-04-02 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Novel RIG-I ligands and methods for producing them
CN103599549A (zh) * 2013-11-22 2014-02-26 大连民族学院 一种siRNA/抗癌药物联合转运复合载体及其制备方法和应用
CN103760428B (zh) * 2014-01-24 2016-01-27 上海同耀通信技术有限公司 人体组织液的模拟液
CN104628885B (zh) * 2015-03-11 2017-04-19 中国科学院长春应用化学研究所 一种改性葡聚糖及其制备方法、葡聚糖胶束及其制备方法、载药颗粒及其制备方法和水凝胶
CN106188223B (zh) * 2015-05-07 2019-12-31 内蒙古大学 一种含有二肽类脂质阳离子的化合物及其制备方法与应用
KR101949453B1 (ko) * 2015-12-30 2019-02-18 주식회사 삼양바이오팜 양이온성 지질의 선택적 합성 방법
JP7679175B2 (ja) 2017-04-20 2025-05-19 エータイアー ファーマ， インコーポレイテッド 肺の炎症を治療するための組成物および方法
EP3778572B1 (en) * 2018-03-27 2025-05-21 NOF Corporation Novel cationic lipid exhibiting improved intracellular dynamics
SG11202012043RA (en) 2018-07-03 2021-01-28 Gilead Sciences Inc Antibodies that target hiv gp120 and methods of use
JP7295283B2 (ja) 2019-06-25 2023-06-20 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｆｌｔ３ｌ－ｆｃ融合タンパク質及び使用方法
JP7454645B2 (ja) 2019-07-16 2024-03-22 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｈｉｖワクチン並びにその作製方法及び使用方法
HRP20241379T1 (hr) 2019-09-30 2024-12-20 Gilead Sciences, Inc. Cjepiva za hbv i postupci za liječenje hbv
US20230017360A1 (en) * 2019-11-22 2023-01-19 Samyang Holdings Corporation Kit for preparing nanoparticle composition for drug delivery
JP7626405B2 (ja) * 2020-03-27 2025-02-04 日油株式会社 シスチン骨格を有する新規カチオン性脂質
EP3954393A1 (en) 2020-08-13 2022-02-16 Bioasis Technologies Inc. Combination therapies for delivery across the blood brain barrier
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
EP4554628A1 (en) 2022-07-12 2025-05-21 Gilead Sciences, Inc. Hiv immunogenic polypeptides and vaccines and uses thereof
US20250381150A1 (en) 2024-03-08 2025-12-18 Genzyme Corporation Lipid nanoparticles

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3658718A (en) 1970-04-23 1972-04-25 Jon Michael Clumpner Cationic emulsifier system
DE3336753A1 (de) * 1983-10-08 1985-04-18 Rhein-Chemie Rheinau Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zum vernetzen von chloriertem polyethylen
HU200093B (en) * 1983-12-20 1990-04-28 Adam Kovacs Process for production of medical compositions against tumour
JP3330245B2 (ja) 1994-12-28 2002-09-30 新日本石油株式会社 すべり案内面用潤滑油組成物
US5744335A (en) * 1995-09-19 1998-04-28 Mirus Corporation Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein
JP4053190B2 (ja) * 1999-06-24 2008-02-27 東邦化学工業株式会社 剥離防止性に優れた加熱型舗装材料の製造方法
DE102004054730A1 (de) * 2004-03-28 2006-05-11 Novosom Ag Serumstabile amphotere Liposomen
GB0512751D0 (en) * 2005-06-22 2005-07-27 Glaxo Group Ltd New adjuvant
JP4764107B2 (ja) 2005-08-26 2011-08-31 日華化学株式会社 紙用低密度化剤及び低密度紙の製造方法
JP4885533B2 (ja) 2005-12-20 2012-02-29 出光興産株式会社 冷凍機油組成物、これを用いた冷凍機用圧縮機及び冷凍装置
WO2008042973A2 (en) * 2006-10-03 2008-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid containing formulations
TW200927915A (en) * 2007-10-25 2009-07-01 Croda Int Plc Laundry formulations and method of cleaning
JP5258354B2 (ja) * 2008-03-31 2013-08-07 大王製紙株式会社 衛生薄葉紙
KR101209265B1 (ko) * 2008-12-26 2012-12-06 주식회사 삼양바이오팜 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140107995A (ko) 2013-02-28 2014-09-05 주식회사 종근당 키토산 및 액상결정 형성 물질을 포함하는 유전자 전달용 조성물
WO2017048018A1 (ko) * 2015-09-15 2017-03-23 주식회사 삼양바이오팜 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법
KR20180008854A (ko) * 2015-09-15 2018-01-24 주식회사 삼양바이오팜 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법
RU2721558C2 (ru) * 2015-09-15 2020-05-20 Самьянг Байофармасьютикалз Корпорейшн Фармацевтическая композиция, содержащая анионное лекарственное средство, и способ ее получения
US11253598B2 (en) 2015-09-15 2022-02-22 Samyang Holdings Corporation Pharmaceutical composition containing anionic drug, and preparation method therefor
WO2017105138A1 (ko) * 2015-12-18 2017-06-22 주식회사 삼양바이오팜 음이온성 약물을 함유하는 고분자 미셀의 제조방법
US20180344638A1 (en) * 2015-12-18 2018-12-06 Samyang Biopharmaceuticals Corporation Method for preparing polymeric micelle containing anionic drug
AU2016372321B2 (en) * 2015-12-18 2019-01-24 Samyang Holdings Corporation Method for preparing polymeric micelle containing anionic drug
KR20180052083A (ko) * 2016-11-09 2018-05-17 주식회사 삼양바이오팜 Kras를 표적으로 하는 핵산 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법
WO2018088719A1 (ko) * 2016-11-09 2018-05-17 주식회사 삼양바이오팜 Kras를 표적으로 하는 핵산 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법
WO2019098691A3 (ko) * 2017-11-16 2019-07-11 주식회사 삼양바이오팜 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물의 동결건조 조성물 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014502615A (ja) 2014-02-03
KR101308591B1 (ko) 2013-09-13
AU2011353233B2 (en) 2016-02-11
EP2658577A2 (en) 2013-11-06
WO2012091523A2 (en) 2012-07-05
EP2658577A4 (en) 2016-08-24
US9220779B2 (en) 2015-12-29
EP3695850B1 (en) 2025-05-21
AU2011353233A1 (en) 2013-07-11
WO2012091523A8 (en) 2013-10-10
CN103476431B (zh) 2015-08-26
NZ611439A (en) 2015-05-29
EP3695850C0 (en) 2025-05-21
CA2823182C (en) 2016-02-23
CN103476431A (zh) 2013-12-25
CA2823182A1 (en) 2012-07-05
EP3695850A1 (en) 2020-08-19
JP5836394B2 (ja) 2015-12-24
US20130266641A1 (en) 2013-10-10
WO2012091523A3 (en) 2012-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101308591B1 (ko) 양이온성 지질을 포함하는 음이온성 약물 전달체 및 그 제조방법
US20220125929A1 (en) Pharmaceutical composition containing anionic drug, and preparation method therefor
KR101209265B1 (ko) 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물 및 그 제조방법
AU2012330819B2 (en) Single use system for sterilely producing lipid-nucleic acid particles
KR101296326B1 (ko) 폴리락트산을 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물 및 그 제조 방법
KR101870316B1 (ko) 음이온성 약물을 함유하는 고분자 미셀의 제조방법
KR20130112794A (ko) 음이온성 약물 전달체의 제조 방법
US10292932B2 (en) Polymeric micelle particle comprising anionic drugs and method of preparing the same
WO2017158093A1 (en) Nanoparticle compositions comprising plga derivatives and a lipid
KR102259513B1 (ko) 음이온성 약물 함유 약제학적 조성물의 동결건조 조성물 및 방법
KR100986604B1 (ko) 신규한 아미노지질을 함유하는 에스아이알엔에이 수송용 유전자 조성물 및 제조방법
KR20240159310A (ko) 신규한 이온화지질을 이용한 지질나노입자 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20111230

PA0201 Request for examination
PG1501 Laying open of application
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20130621

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20130829

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20130909

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20130910

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160601

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20160601

Start annual number: 4

End annual number: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170605

Year of fee payment: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20170605

Start annual number: 5

End annual number: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180605

Year of fee payment: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20180605

Start annual number: 6

End annual number: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20200610

Start annual number: 8

End annual number: 8

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20210607

Start annual number: 9

End annual number: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20220607

Start annual number: 10

End annual number: 10

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20230605

Start annual number: 11

End annual number: 11