KR20120063766A

KR20120063766A - 미세조류 나비쿨라 인세르타의 가수분해물 및 이를 포함하는 항산화 조성물

Info

Publication number: KR20120063766A
Application number: KR1020100124891A
Authority: KR
Inventors: 강경화; 첸 중-지; 류보미; 김세권
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2010-12-08
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2012-06-18

Abstract

본 발명은 미세조류 가수분해물 및 이 가수분해물을 포함하는 항산화 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세조류 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 최적 성장 조건 및 이의 가수분해물 및 이를 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

Description

미세조류 나비쿨라 인세르타의 가수분해물 및 이를 포함하는 항산화 조성물{Microalgae Navicula incerta hydrolysate and antioxidant composition comprising same}

본 발명은 미세조류 가수분해물 및 이 가수분해물을 포함하는 항산화 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세조류 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 가수분해물 및 이를 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

해양 미세조류는 높은 단백질, 지질, 비타민 및 그외 영양성분 함량으로 인해 주로 건강식품으로 제조되고 판매되고 있다. 게다가, 바이오디젤과 바이오수소 제조, 및 가스로부터 CO₂ 제거에 미세조류를 사용하는 것이 특히 주목을 받고 있다. 최근에는 약학적 유효성분의 유용한 새로운 소스로서 미세조류를 다루는 많은 연구가 진행되고 있다. 예를 들어 Botryococcus braunii, Chlorella sp., Dunaliella primolectal, Nannochloris sp., Neochloris oleoabundans, and Parietochloris sp.와 같은 많은 미세조류 종이 적절한 조건 하에서 미세조류 세포 내에 높은 함량의 단백질을 나타낼 수 있음이 보고되었다. 그러므로, 미세조류가 기능성 물질로서 매우 유용한 것으로 여겨지고 있다. 미세조류 중에서, 규조류가 다양한 먹이그물에서 주요한 성분으로, 계절에 따른 재배량, 변동량 및 성장률을 평가하는 것이 해양과학 연구 분야에서 중요한 사항이 될 것이다. 치료학적 가능성을 갖는 신규한 화합물의 발견으로 많은 효과가 밝혀졌으며 많은 종류의 미세조류가 항균, 항진균 및 항암 특성을 갖는다고 보고되었다. 저생 규조류(Benthic diatom)는 식물 플랑크톤의 주요 성분이며 또한 재배하기가 상대적으로 쉽다. 저생 규조류(Benthic diatom)인 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)는 식물플랑크톤의 주요 성분이며 또한 상대적으로 재배하기가 쉬워 수중환경에서 살아있는 먹이공급원으로서 사용된다. 이는 조개 양식에서 살아있는 먹이로서 사용되며 수생환경에서 일반적인 먹이공급원이다. 그러나, 미세조류의 생화학적 조성은 이의 성장률, 환경 조건(온도, 영양상태, pH, 광주기 및 빛 강도 포함) 및 이의 생주기 단계에 따라 달라질 수 있다. 사실, 일부 종은 극한 조건(예를 들어 염도, 온도, 영양분의 변화)의 복합 서식지에서 생존하므로, 이러한 환경에 적응하여 살아남기 위해 다른 생물에서는 발견되지 않은 매우 다양한 이차(생물학적으로 활성인) 대사산물을 생산한다. 온도 및 빛 강도는 자연 환경에서 조류 성장을 조절하는 중요한 인자이며 또한 온도에 대한 성장 반응은 식물플랑크톤 종의 증식을 조절하는데 필수적일 수 있다. 염도는 식물플랑크톤 성장에 영향을 미치는 중요한 비생물적 요소임이 널리 알려져 있다. 따라서, 성장 특성은 수산양식 목적으로 사용될 N. incerta의 양식 가능성을 평가하는데 중요한 요소이다. 세포수 또는 바이오매스; 및 생화학적 조성 면에서의 성장률은 필수 영양소에 의해 최적화될 수 있다.

자유 라디칼 및 반응 산소종(reactive oxygen species; ROS)은 다양한 형태의 활성 산소이며 종종 생물학적 반응 또는 외재성 인자의 산화에 의해 발생한다. 생물시스템에서의 산화방지제는 산화 손상을 방어하고 세포의 주요 시그널링 경로에 관여하는 것을 포함하는 많은 기능을 갖는다. 세포 내에서 산화방지제의 주요한 작용은 ROS의 작용에 의해 야기된 손상을 예방하는 것이다. 최근에는, 산화방지제가 풍부한 음식을 섭취함으로써 산화 스트레스 및 노화-관련 질환을 예방하는 것에 대해 관심이 집중되고 있다. 게다가, 천연 산화방지제가 다양한 식물로부터 분리되고 있으나, 미세조류는 천연 산화방지제의 공급원으로서 관심을 받고 있지 않다. 입증된 산화방지제에 기인하여, 미세조류를 ROS 분자에 의해 야기된 산화 손상을 예방하거나 지연시킬 수 있는 중요한 천연 항산화 물질의 대안으로서 간주할 수 있었다.

효소적 단백질 가수분해물이 이의 위장관 흡착에 의해 본연의 단백질 및 유리 아미노산 둘 다 보다 좀더 효과적인 것으로 보이므로 인간의 영양섭취에서 적합한 단백질 공급원으로서 보고되었다. 그러므로, 단백질 가수분해물이 영양학적 및 기능적 특성을 개선시키기 위해 특정 제형의 형태로 널리 사용되고 있다. 이들은 단백질 성분이 유리 아미노산의 혼합물로만 구성된 기본식에 대해 중요한 이점을 나타낸다. 영양학적 산물에서 가장 일반적으로 사용되는 단백질 공급원은 카제인, 유장 단백질 및 대두 단백질이다. 이러한 점에서, 미세녹조류 바이오매스는 약리학적 영양물에 적합한 효소적 단백질 가수분해물을 개발하기 위한 혁신적인 단백질 생공급원을 대표할 것이다. 살아있는 세포의 산화 손상을 최소화하고 식품의 산화 훼손을 방지하기 위해 식물 물질과 같은 자연물질로부터 신규하고 안전한 항산화제를 찾고자 하는 시도가 전세계적으로 이루어지고 있다. 최근에는, 미세조류에서 항균 또는 항산화 화합물과 같은 높은 가치의 화합물의 존재 여부 및 생리학적 특성에 초점을 맞춘 많은 연구가 실행되고 있다. 미세조류 가수분해물에서의 단백질의 질 및 기능적 특성에 대한 지식이 늘어감에 따라 식품이나 식이요법 제품의 잠재적인 첨가제로서의 용도를 이해하는데 유용할 것이다. 그러나, 미세조류의 다양한 생물학적 기능에도 불구하고, 미세조류의 효과적인 적용방법은 비효율적인 배양 방법 및 높은 생산비용 때문에 여전히 제한되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-0889973호는 미세녹조류 Tetraselmis suecica를 이용한 항산화, 주름개선, 항여드름ㆍ항염증 및 미백효능을 가지는 기능성 추출물 및 그의 제조방법에 관한 것이며, 대한민국 공개특허 제10-2002-0042014호는 해양미세조류의 규조류인 한치시아 마리나(Hantzschia marina)로부터 분리한 자유라디칼 소거능을 갖는 푸코키산틴 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이나, 저생 규조류인 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)에 관한 연구 및 이의 활성에 대하여는 아직 보고된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로, 미세조류 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 최적 성장 조건을 확립하고, 항산화 활성을 갖는 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 가수분해물 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 상기 목적은 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 염도, 온도, pH 및 빛 강도 조건에 따른 성장률 및 세포밀도를 측정하여 최적 성장 조건을 확립하고, 이의 가수분해물을 제조한 후 이들의 항산화 활성을 평가하여 우수한 항산화 활성을 갖는 가수분해물을 선별함으로써 달성하였다.

본 발명은 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 대량생산을 위한 최적의 성장 조건을 확립하고, 우수한 항산화 효능을 갖는 이의 가수분해산물 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 연속 대량 배양 시스템의 공정도를 나타낸 것이다.
도 2는 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)에서의 다양한 온도의 효과를 나타낸 것이다. A는 N. incerta 의 온도에 따른 성장률을 나타낸 것이고, B는 N. incerta 의 최대 세포 농도 및 특이 성장률을 나타낸 것이다.
도 3은 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)에서의 다양한 염도의 효과를 나타낸 것이다. A는 N. incerta 의 염도에 따른 성장률을 나타낸 것이고, B는 N. incerta 의 최대 세포 농도 및 특이 성장률을 나타낸 것이다.
도 4는 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)에서의 다양한 빛 강도의 효과를 나타낸 것이다. A는 N. incerta 의 빛 강도에 따른 성장률을 나타낸 것이고, B는 N. incerta 의 최대 세포 농도 및 특이 성장률을 나타낸 것이다.
도 5는 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)에서의 다양한 pH의 효과를 나타낸 것이다. A는 N. incerta의 pH에 따른 성장률을 나타낸 것이고, B는 N. incerta 의 최대 세포 농도 및 특이 성장률을 나타낸 것이다.
도 6은 최적 조건 하에서 2주 동안 배양된 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 세포 밀도를 나타낸 것이다. A: 1일, B: 3일, C: 6일, D: 9일, E: 12일 및 F: 14일(A, B, C, D: ×400 및 E, F: ×200의 배율로 현미경으로 관찰).

본 발명은 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 가수분해물 및 이를 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 항산화 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 가수분해물을 20 내지 30 중량%, 바람직하게는 30 내지 40 중량%로 포함한다.

본 발명의 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 가수분해물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 가수분해물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘, 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)의 가수분해물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제제; 외용제; 좌제; 및 멸균 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 세신 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있다. 추출물 및 분획물의 투여량은 질환의 종류 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이므로, 본 발명을 이에 한정하는 것으로 해석해서는 안 된다.

저생 규조류 나비쿨라 인세르타(Navicula incerta) (strain KMMCC B-001)는 한국 해양 미세조류 배양 센터(Korea Marine Microalgae Culture Center)에서 분양받아 사용하였다. 배양 배지는 표준 F/2 (Guillard's) 배지로 유지하였다. 세포벽 분해 효소는 셀룰로오스를 사용하였다. 그외 배양에 필요한 모든 물질은 Gibco (Grand Island, NY)에서 입수하였으며 그외 모든 시약은 구입가능한 가장 높은 등급의 것을 사용하였다. 알칼라아제(alcalase) 및 뉴트라아제(neutrase)는 Novo Co. (Bagsvaerd, Copenhagen, Denmark)에서 구입하였다. 셀룰라아제(cellulose), 프로나아제-E(pronase-E), α-키모트립신(α-chymotrypsin), 파파인, 펩신, 트립신, 리놀레산, 티오시안산암모늄 및 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라질 (DPPH), 5,5-디메틸-1-피롤린-N-옥사이드 (DMPO), FeSO₄, H₂O₂ 및 리보플라빈을 포함하는 라디칼 테스팅 화합물은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

최적 조건 실험실 배치 배양 데이터는 3회 측정치의 평균 ± 표준편차로 나타냈다. Student's t-test를 유의차 수준을 결정하는데 사용하였다(P < 0.05).

실시예 1. 최적 성장 조건의 결정

N. incerta의 성장을 위한 최적 조건을 결정하기 위해 N. incerta을 100ml 배양 배지를 갖는 250 ml 플라스크에 접종하였다. 성장 특성 실험에서, N. incerta은 F/2 배지 (표 1)에서 배양하였다. 실험은 성장-발광 상관관계, 성장의 온도, 염도, 빛 강도 및 pH 의존도를 확립하기 위하여 실시하였다. 계대배양된 저생 균조류 N. incerta 를 확인하기 위해, ×400 배율에서 phase-contrast Zeiss Axioplan microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)로 관찰하였다.

최적 성장 조건 설정을 위해 실행된 모든 실험을 2주 동안의 성장 기간 후에 종료하였다. 고정된 시료를 3개씩 제조하고, 세포를 카운팅 챔버(Sedgewick-Rafter^® chamber or a multidish well)에서 24시간 마다 계수하였다. 세포를 Leica CTR 6000 microscope (Wetzlar, Germany)로 관찰하였다. 영양 제한을 피하기 위해 모든 실험 배양물을 명-암 주기에서 동일 시간에 일차 실험에 의해 결정된 바와 같은 성장의 후기 로그-기에서 수확하였다. 수확한 배양물을 동결건조하고 건조중량을 기록한 후 미세조류 세포를 화학 분석 전까지 -70 ℃에서 보관하였다.

특이 성장률(μ)을 단위 시간 당 세포 밀도에서의 증가로 규정하였으며 식은 다음과 같다:

위 식에서 X ₀ 및 X ₁ 은 각각 접종 및 최대 세포 밀도 사이의 선택된 시간 간격의 시작(t ₀) 및 마지막(t ₁)에서의 세포 밀도이다. 각 시료의 성장 곡선에서 3회 반복 계수하고 평균 수치로서 사용하였다.

온도 및 염도가 성장에 미치는 효과

온도 구배 성장 챔버를 사용하여 4개의 염도 조건 (23, 27, 33 및 40 ‰) 하에서 4가지의 온도 (15, 20, 25 및 30 ℃) 조건과 병행하여 배양을 실시하였다. 배양 실험을 12:12 명:암 (L:D) 주기, pH 8.3±0.5 조건에서 2주 동안 형광(250 Ｂμmolm^-2·s^-1) 하에서 실시하였다. 34 이하의 염도는 탈-이온수 (Milli-Q ; Millipore)로 숙성해수를 희석하여 제조하였으며, 34 이상의 염도는 50 ℃에서 건조 오븐에 해수를 증발시켜 제조하였다. 1 ml 시료를 매일 각각의 배양 플라스크로부터 수집하여 Lugol's iodine 용액으로 고정시켰다.

다양한 온도 하에서 N. incerta의 초기 세포 밀도는 3.4 × 10⁵였으며, 일반적으로 최대 세포 밀도 및 특이 성장률은 온도에 의해 영향을 받는다. 20 ℃에서, N. incerta 는 우수한 S자형 성장곡선을 나타냈다(도 2의 A). 도 2의 A에서 보여지는 바와 같이, 세포 밀도는 20 ℃의 온도 조건에서 가장 높았으며 25 ℃, 30 ℃ 및 15 ℃가 그 뒤를 이었다. 최대 세포 밀도(89 ×10⁵ cells ml^-1)는 배양 후 11일 또는 12일 이후에 나타났다. 가장 높은 성장률은 20℃에서 관찰된 반면(μ= 0.57 d^-1), 가장 낮은 성장률은 15℃에서 관찰되었다(μ=0.42 d^-1). 25 ℃에서의 최대 세포 밀도 및 특이 성장률은 각각 85 × 10⁵ cells ml^-1, 0.50 d^-1이었다(도 2의 B). 20℃ 및 25℃ 배양에서의 성장률은 거의 유사하였다.

다양한 염도 조건(23, 27, 33 및 40 ‰) 하에서 성장률은 유의차(p < 0.05)를 나타냈다. N. incerta 의 초기 세포 밀도는 3.1 × 10⁵ cells ml^-1이었다. 네 개의 염도 조건 중에서, 33‰의 염도에서 최대 세포 밀도(81 × 10⁵ cells ml^-1) 및 특이 성장률(= 0.60 d^-1)을 나타냈다. 반면에, 가장 낮은 세포 밀도 및 성장률은 23 ‰에서 나타났다(각각 43 ×10⁵ cells ml^-1, 0.44 d^-1) (도 3의 A 및 B). 27 ‰에서, 세포 밀도는 77 ×10⁵ cells ml^-1이고 성장률은 0.58 d^- ¹로관찰되었다. 세포 배양 동안에, 세포수는 10일까지 증가하였으나 그 이후로는 감소하였다. 40 ‰에서, 세포 밀도와 성장률은 각각 67 ×10⁵ cells ml^-1및 0.53 d^- ¹이었다. N. incerta 의 성장에 최적인 온도 및 염도 조건은 각각 20℃ 및 33 ‰이다.

성장에서 빛 강도 및 pH 의 효과

각각의 빛 강도(50, 100, 150, 200 및 250 μmol m^-2·s^-1) 및 pH 수준 (7.5, 8.3 및 9.2)으로 배양 원액을 단계적으로 이동시키는 실험 조건을 미리 설정하여 실시하였다. 성장에서의 빛 강도 및 pH의 효과를 20℃ 및 33 ‰, 12:12 명:암 (L:D) 주기의 성장률의 최적 조건에 근접하여 평가하였다. pH 효과를 배양 플라스크로 옮기면서 평가하였으며 pH를 최초 pH가 유지되는 1개 플라스크를 제외하고 0.2 M HCl 또는 NaOH를 첨가하면서 변화시켰다. 세포를 각 플라스크에 첨가한 후 pH를 측정하였다. 1 ml 시료를 매일 각 플라스크로부터 수집하여 Lugol's iodine 용액으로 고정시켰다.

다양한 빛 강도 하에서의 결과는 도 4의 A와 같다. 대체적으로, 성장률은 모든 빛 강도 하에서 수득하였다. 배양시에,N. incerta의 초기 세포 밀도는 3.5 ×10⁵ cells ml^-1이었다. 세포 밀도는 250 μmol m^-2·s^-1의 빛 강도에서 가장 높았으며, 100, 50, 150 및 200μmol m^-2·s^-1에서 그 뒤를 이었다(도 4의 A). 최대 세포 밀도는 배양 후 11일 내지 12일에 나타났다. 최적 조건의 빛 강도는 250 μmol m^-2·s^-1이다. 최대 세포 밀도 및 특이 성장률은 각각 88 × 10⁵ cells ml^-1및 0.50 d^-1이었다(도 4의 B). 세포의 성장은 더 높은 빛 강도에서 증가하였으며, 최종 세포 농도는 실험한 빛 강도 범위 전반에서 거의 같은 수준이었고 증식 상수는 250 μmol m^-2·s^-1의 빛 강도에서 최대였다.

20 ℃의 온도, 250 μmol m^-2·s^-1의 빛 강도, 33 ‰의 염도 조건 하에서 다양한 pH에 따른 N. incerta의 성장실험 결과는 도 5와 같다. N. incerta 의 초기 세포 밀도는 2.3 ×10⁵ cells ml^-1이었다. 가장 높은 성장률은 pH 8.3 ± 0.5 부분에서 관찰되었으며(도 5의 A), 최대 세포 밀도인 79 × 10⁵ cells ml^- ¹는 배양 10일째에 0.78 d^- ¹에서 나타났다. 그러나, 성장률은 pH 7.5 ± 0.5 수준 (각각 73 ×10⁵ cells ml^-1, 0.50 d^-1) 및 pH 9.2 ± 0.5 수준 (각각 73 ×10⁵ cells ml^-1, 0.73 d^-1)에서 약간 변화하였다(도 5의 B). 그러므로, 다양한 조건 중에서, 가장 높은 세포 밀도는 10일 내지 12일째에 20 ℃, 33 ‰, 250 μmol m^-2·s^-1, pH 8.3, F/2 배양액에서 나타났다. 증식 상수 및 최종 세포 농도는 이러한 범위에서 일정하게 나타났다.

실시예 2. 대량 배양 및 동결건조

저생 규조류 N. incerta을 F/2 영양배지, (Na₂SiO₃) 및 미량 금속 용액이 풍부한 고압멸균된 인공 해수 배지가 충진된 20L 폴리카보네이트 탱크 및 5L 폴리카보네이트 병(10 주기)에 10주 동안 대량배양하였다(도 1). 대량배양 조건은 본 발명에서 결정된 최적의 성장 조건 (각각 20 ℃, 33 ‰, pH 8.3±0.5, 12:12 L:D, 및 250 μmol m^-2·s^-1의 배양 조건) 하에서 유지되었다. 증류수를 대량 배양 병 및 탱크에 주기적으로 첨가하여 염도를 유지하고, 배양 기간 동안 계속해서 통기를 시켰다. N. incerta 바이오매스를 Millipore peristaltic pump를 사용하여 GF/A Whatman 필터 상에서 각 처리로부터 농축시켜 수득하였다. 바이오매스를 -70℃의 냉동고에서 24시간 동안 저장하였다. 그런 다음 시료를 -50 ℃, 5 m torr에서 동결건조시켰다. 동결건조된 시료를 화학 분석을 할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

N. incerta의 대량 배양에서, 병에서의 평균 세포 밀도는 배양 2주 후에 8.7 ×10⁶ cells ml^-1이었다. 그런 다음 10주 배양 동안 5 L 폴리카보네이트 병에 계대배양하고 20 L 폴리카보네이트 탱크에 농축시켰다 (도 6). 세포 밀도는 표면보다는 바닥 근처에서 더 높았다. 농축된 시료를 여과하고 동결건조시켜 수득하였다.

실시예 3. N. incerta 의 조성 및 아미노산 분석

N. incerta 의 조성

동결건조된 N. incerta의 조성을 측정하였다. N. incerta의 조지질, 회분, 탄수화물 및 단백질 함량을 AOAC (1995) 방법에 따라 측정하였다.

미세조류는 단백질(6-52%), 탄수화물(5-23%) 및 지질(7-23%)의 비율로 구성되어 있다. 대량 배양에서 동결건조된 N. incerta의 조성은 다음과 같다: 건조 ㅈ중량 기준으로 50.38±0.03 % 단백질, 8.76±0.04 % 지질, 10.84±0.03% 탄수화물, 19.67±0.05% 회분, 및 9.81±0.09 % 수분(표 2).

N. incerta 의 아미노산 분석

동결건조된 N. incerta (50 mg)을 진공상태, 110 ℃ 에서 0.1% 티오글리콜산을 함유하는 6 N HCl 내에서 24시간 동안 가수분해시켰다. 페닐이소티오시아네이트로 유도된 아미노산을 자동 아미노산 분석기 (Biochrom 20, Pharmacia Biotech, UK)를 사용하여 확인하고 정량하였다.

단백질은 여러 다른 아미노산으로 이루어져 있으므로 단백질의 영양적 품질은 이들 아미노산의 함량, 비율 및 이용가능성에 근거하여 결정된다. N. incerta 의 아미노산 조성은 표 3과 같으며 아미노산 잔기/1000 총 아미노산 잔기로 나타냈다. N. incerta의 아미노산 잔기는 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파트산), 리신 및 아르기닌이 풍부하며 이들 아미노산이 총 아미노산 잔기의 51.3%를 구성하고 있다. 이들 아미노산은 가수분해물에 존재하는 항산화 화합물의 음전하 성질에 대하여 더 좋은 적용성을 제공한다.

실시예 4. 효소적 가수분해물의 제조

동결건조된 Navicula incerta 을 미세 분말로 분쇄한 후 100 g을 5 L 증류수와 혼합하였다. 세포벽을 파손시키는 효소인 셀룰라아제를 원 재료 중량에 대해 2중량%에 필적하는 건조 분말 농도로 첨가한 후 50℃에서 2시간 동안 가수분해하였다. 동결건조된 N. incerta로부터 항산화 펩티드를 추출하기 위해, 최적 조건(표 4) 하에서 다양한 효소 (알칼라아제, α-키모트립신, 뉴트라아제, 파파인, 펩신, 프로나아제-E 및 트립신)를 사용하여 효소적 가수분해를 실시하였다. 각 반응 혼합물의 최적 pH를 1M HCl/NaOH로 조정하였다. 사용된 각 효소에 대한 최적 pH 및 온도 조건은 Heo 등의 문헌 [Heo, S. J., E. J. Park , K. W. Lee, and Y. J. Jeon. 2005. Antioxidant activities of enzymatic extracts from brown seaweeds. Bioresource Technol. 14: 1613-1623]에 기재된 조건과 유사하다. 1/100 (w/w)의 효소/기질 비율로, 1% 기질 및 효소를 혼합하였다. 그런 다음, 각 가수분해물의 pH를 1M HCl/NaOH을 사용하여 pH 7로 조정하였다. 혼합물을 각각의 최적 온도에서 교반하면서 8시간 동안 배양한 후 효소를 불활성화시키기 위해 끓는 물 수조에서 10분 동안 가열하였다. 동결건조한 후 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

실시예 5. ESR ( Electron Spin Resonance Spectrometer )에 의한 항산화 검정

DPPH 라디칼에서의 소거능

DPPH 라디칼 소거능을 Nanjo 등의 문헌 [Nanjo, H., M. Adachi, T. Aketa, T. Mizoguchi, and T. Nishihara. 1995. The role of cysteine in the alteration of bovine liver dihydrodiol dehydrogenase 3 activity. Biochem . J. 310: 101-107]에 의해 기재된 방법을 사용하여 측정하였다. 30 ㎕의 가수분해 용액(또는 대조군으로 에탄올 자체)을 에탄올 용액에 용해된 30 ㎕의 DPPH (60 μM)에 첨가하였다. 10초 동안 강하게 혼합한 후, 용액을 100 μL 석영 모세관 튜브로 옮기고 JESFA ESR spectrometer (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 DPPH 라디칼에서의 펩티드의 소거능을 측정하였다. ESR spectrometer로 정확히 2분 후에 spin adduct를 측정하였다. 실험 조건은 다음과 같다: 자기장, 336.5±5 mT; 전력, 5 mW; 변조 주파수, 9.41 GHz; 진폭, 1×1000; 스윕 타임, 30 s. DPPH 라디칼 소거능을 하기 식에 따라 계산하였으며, 이 식에서 H 및 H ₀ 는 각각 시료 유무시 라디칼 신호의 상대적 피크 높이를 나타낸다.

히드록시 라디칼 소거능

히드록시 라디칼을 철-촉매 Fenton Haber-Weiss 작용에 의해 생성되며 생성된 히드록시 라디칼은 질소 스핀 트랩 DMPO와 급격하게 반응한다 [Rosen, G. M. and E. J. Rauckman. 1984. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radicals. Methods Enzymol .105: 198-209.]. 결과적으로 생성된 DMPO-OH 부가물을 ESR spectrometer로 검출하였다. 가수분해 용액 (20 ㎕)을 인산염 완충용액(pH 7.4)에 용해된 DMPO (0.3 M, 20 ㎕), FeSO₄ (10 mM, 20 ㎕) 및 H₂O₂ (10 mM, 20 ㎕)와 혼합한 후 100 ㎕ 석영 모세관 튜브로 옮겼다. 2.5 분 후에, ESR 스펙트럼을 ESR spectrometer로 기록하였다. 실험 조건은 다음과 같다: 자기장, 336.5±5 mT; 전력, 1 mW; 변조 주파수, 9.41 GHz; 진폭, 1 × 200; 스윕 타임, 4 min. 히드록시 라디칼 소거능을 하기 식에 따라 계산하였으며, 이 식에서 H 및 H ₀ 는 각각 시료 유무시 라디칼 신호의 상대적 피크 높이를 나타낸다.

수퍼옥사이드 라디칼 소거능

수퍼옥사이드 음이온 라디칼을 UV 조사 리보플라빈/EDTA 시스템으로 생성하였다 [Guo, Q., B. Zhao, S. Shen, J. Hou, J. Hu, and W. Xin. 1999. ESR study on the structure antioxidant activity relationship of tea catechins and their epimers. Biochem . Biophys . Acta. 1427: 13-23]. 0.3 mM 리보플라빈, 1.6 mM EDTA, 800 mM DMPO 및 지정 농도의 가수분해물 분획을 포함하는 반응 혼합물을 365 nm의 VU 램프 아래에서 1분 동안 조사되도록 하였다. 반응 혼합물을 100 ㎕ 석영 모세관 튜브로 옮기고 ESR spectrometer로 측정하였다. 실험 조건은 다음과 같다: 자기장, 336.5±5 mT; 전력, 10 mW; 변조 주파수, 9.41 GHz; 진폭, 1 × 1000; 스윕 타임, 1 min. 수퍼옥사이드 라디칼 소거능을 하기 식에 따라 계산하였으며, 이 식에서 H 및 H ₀ 는 각각 시료 유무시 라디칼 신호의 상대적 피크 높이를 나타낸다.

상기 라디칼 소거능 측정 실험 결과는 표 5와 같다. 항산화 활성은 DPPH 라디칼, 히드록시 라디칼 및 수퍼옥사이드 라디칼의 소거를 통해 발휘되며 이들의 가장 높은 IC₅₀ 수치는 각각 196.0 ㎍/ml (펩신), 102.0 ㎍/ml (α-키모트립신) 및 169.0 ㎍/ml (누트라아제)이었다.

게다가, 기질의 항산화 활성은 산화 시스템에서 발생하는 자유 라디칼의 소거능을 평가함으로써 좀더 정확하게 확인할 수 있다. 히드록시 라디칼의 소거는 DPPH 및 수퍼옥사이드 라디칼의 소거에 비해 좀더 효과적으로 이루어졌으며, α-키모트립신 가수분해물이 다른 가수분해물에 비해 가장 잠재적인 효과를 나타냈다. 그러나, 수퍼옥사이드 라디칼에서의 펩신 및 누트라아제 가수분해물의 소거능은 α-키모트립신 가수분해물에서보다 더 높았다. 그러나, 대부분의 경우에서, 프로나아제-E, α-키모트립신 가수분해물이 DPPH, 히드록시 및 수퍼옥사이드 라디칼에서 다른 가수분해물에 비해 더 높은 항산화 활성을 나타낸다.

Claims

나비쿨라 인세르타(Navicula incerta)를 20 ℃, 33 ‰, pH 8.3±0.5, 12:12 L:D, 및 250 μmol m^-2·s^-1의 배양 조건에서 인공 해수 배지에 10주 동안 배양하는 단계;
상기 나비쿨라 인세르타 배양액을 여과하고 농축한 후 동결건조시키는 단계;
동결건조된 나비쿨라 인세르타를 미세 분말로 분쇄한 후 증류수와 혼합하는 단계;
상기 혼합액에 셀룰라아제를 첨가한 후 50℃에서 2시간 동안 가수분해하는 단계;
상기 가수분해액에 알칼라아제, α-키모트립신, 뉴트라아제, 파파인, 펩신, 프로나아제-E 및 트립신 중에서 선택한 효소를 첨가하여 효소적 가수분해를 실시하는 단계;
상기 가수분해물의 pH를 1M HCl/NaOH을 사용하여 pH 7로 조정하는 단계; 및
상기 가수분해물을 교반하면서 8시간 동안 배양한 후 효소를 불활성화시키기 위해 끓는 물 수조에서 10분 동안 가열하는 단계
를 포함하는 나비쿨라 인세르타의 가수분해물 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 효소는 α-키모트립신 또는 프로나아제-E 인 것을 특징으로 하는 나비쿨라 인세르타의 가수분해물 제조방법.
제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조된 나비쿨라 인세르타의 가수분해물.
제3항의 나비쿨라 인세르타의 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물.