KR20120031944A - 신경보호성 건강 보조식품 - Google Patents

Abstract

신경보호 활성을 갖는 신규 건강 보조식품 혼합물은 서열 : NMVPFPR 로 정의된 펩티드 제제를 포함한다.

Description

신경보호성 건강 보조식품{Neuroprotective dietary supplement}

본 발명은 신경보호제로 유용하고 또 경구투여될 수 있는 신규 건강 보조식품에 관한 것이다.

노인 인구의 수는 전세계적으로 점점 증가하고 있다. 실제로 지금의 노인들은 더 오래 살 것이다. 따라서 노화 관련 기억력 손상, 인지력 감퇴 등과 같은 노화-관련 결함이 중요한 공중 건강 문제로 되고 있다.

EP 1 325 747 A2호는 항염증성 및 산화방지성과 당대사 및 지질대사 조절 특성을 갖는 화합물과 비타민 B군과 조합된 균형잡힌 양의 α-리포익산 및 γ-리놀레산 또는 콩 인지질과 같은 신경보호 활성을 갖는 천연 물질을 포함하는 건강 보조식품을 개시하고 있다.

본 발명의 목적은 개선된 신경보호 활성을 갖고 또 신경퇴화를 예방, 완화 또는 방해하며 또 인지 작용 감퇴를 예방, 방해 및/또는 개선하는 신규 건강 보조식품 혼합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 경구 투여 형태로 투약되는 건강 보조식품을 제공하는 것이다.

신경보호 활성을 갖는 신규 건강 보조식품 혼합물은 서열 1: NMVPFPR 또는 서열 2: ASAFQGIGSTHWVYDGVGNS로 정의된 2개의 펩티드 중의 1 이상을 포함하는 펩티드 제제를 포함한다.

상기 신규 건강 보조식품 혼합물은 노화-관련 신경퇴화, 노화-관련 인지 감퇴 및 노화-관련 기억력 손상을 예방 또는 완화할 수 있다. 이것은 또한 인간에서, 바람직하게는 노인에서 기억력, 주의력 및 경계력을 향상시키는 물질로 작용한다.

이러한 신규 건강 보조식품 혼합물은 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자로 구성되며 하기 서열로 정의되는 펩티드 중의 1 이상을 포함한다:

서열 1: NMVPFPR

서열 2: ASAFQGIGSTHWVYDGVGNS

서열결정은 질량 분광광도계, 탄뎀 질량 분광광도계, 전기영동, 크로마토그래피 분리에 이은 서열결정과 같은 일반적으로 공지된 수법으로 실시하였다.

이 신규 건강 보조식품 혼합물은 또한 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 부가적인 펩티드를 더 포함할 수 있다. 이것은 또한 아미노산을 더 포함할 수 있다. 적합한 아미노산은 예컨대 아스파라긴(N), 메티오닌(M), 글루탐산(E), 발린(V), 프롤린(P), 아르기닌(R), 알라닌(A), 시스테인(C), 페닐알라닌(F), 글루타민(Q), 글리신(G), 트레오닌(T), 이소로이신(I), 트립토판(W), 티로신(Y), 트레오닌(T), 세린(S), 히스티딘(H), 아스파르트산(D), 리신(K), 로이신(L) 등이다. 아미노산은 바람직하게는 활성 형태, 가장 바람직하게는 L-아미노산 형태로 사용된다.

신규 건강 보조식품 혼합물은 또한 비타민 A, 상이한 비타민 B군, 비타민 C, 비타민 D, E 및/또는 K와 같은 비타민을 더 포함할 수 있다. 이것은 또한 무기물 및/또는 칼슘, 마그네슘, 철, 구리, 나트륨, 아연, 망간, 요오드, 칼륨, 셀렌, 크롬, 몰리브덴, 플루오르, 염소, 인과 같은 미량 원소도 포함할 수 있다. 다른 성분은 카페인 및 타우린; Ω-지방산과 같은 지방산, 알파 리포익산, 인지질, 포스파티딜세린; 은행나무, 후페르진과 같은 식물 추출물, DMAE(디메틸아미노에탄올)와 같은 신경전달물질의 전구체일 수 있다.

신규 건강 보조식품은 또한 풍미물질; 산화 티탄, 산화철과 같은 착색제, 및/또는 보존제를 더 포함할 수 있다. 보존제는 다음일 수 있다:

- 에틸파라벤(p-히드록시벤조산 에틸 에스테르)

- 벤즈알코늄 클로라이드

- 벤즈에토늄 클로라이드

- 벤조산

- 부틸파라벤 (p-히드록시벤조산 부틸 에스테르)

- 메틸파라벤 (p-히드록시벤조산 메틸 에스테르)

- 칼륨 소르베이트

- 프로피온산

- 프로필파라벤 (p-히드록시벤조산 프로필 에스테르)

- 벤조산 나트륨

- 프로피온산 나트륨

- 소르브산

상기 혼합물은 또한 허용가능한 첨가제, 충전제 및/또는 부형제, 예컨대 미세결정성 셀룰로오스, 말토덱스트린, 스테아르산 마그네슘, 콜로이드성 실리카, 이산화 실리콘, 락토오스, 말토오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 변성 셀룰로오스, 식물성 셀룰로오스, 인산 칼슘, 인산 나트륨, 식물성 글리세린, 나트륨 녹말, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐폴리피롤리돈, 셀룰로오스 검, 스테아르산, 젤라틴, 만니톨, 아스코르브산 나트륨, 글리세린, 쌀가루, 말토덱스트린 이-칼륨 포스페이트 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 건강 보조식품 혼합물은 10 내지 30중량%의 펩티드, 2 내지 20 중량%의 아미노산 및 2 내지 76중량%의 부가 성분, 충전제 등을 포함한다.

본 발명의 건강 보조식품 혼합물은 정제, 코팅된 정제, 캅셀, 페이스트, 츄잉 정제 또는 드링크액 형태로 경구 투여된다. 코팅된 정제가 사용되면, 상기 제제는 위액에 대해 내성일 수 있으므로, 장용정제 형태가 사용될 수 있다. 본 발명의 건강 보조식품 혼합물은 그의 경구 투여 형태로 하루에 1회 이상 투약될 수 있다.

본 발명의 건강 보조식품 제품은 포유동물, 특히 사람, 가장 바람직하게는 노인에서 노화 과정과 관련된 결핍증을 방지, 완화, 방지하는데 유용하다.

본 발명의 건강 보조식품 제품은 노화 과정에 따른 대사결핍 및 스트레스로부터 뉴런을 보호하고, 저산소증 또는 허혈 예후로 인한 노화 관련 뉴런 손상, 세포내 칼슘 과잉부하로 인한 노화 관련 뉴런 손상, L-글루타메이트에 의해 유도된 노화 관련 뉴런 손상 예후, 산화 스트레스에 기인한 노화 관련 뉴런 손상의 예후를 예방, 방해 및/또는 완화하기 위한 물질로서 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 보조식품 제품은 노화 관련 신경퇴화의 예후를 방지, 방해 및/또는 완화하고, 세포 스트레스에 기인한 신경 세포 치사, 신경퇴화 및 중독을 방지하며, 노화 과정 동안 정상적인 뉴런 세포구축을 유지하고 보존하며, 시냅스 작용 및 시냅스 밀도를 지지하고 및/또는 향상시키며, 시냅스 유연성 및 시냅스 밀도의 노화 관련 감퇴 예후를 방지, 방해 및/또는 완화하며, 주의력 및 기억력과 관련된 뇌 메카니즘을 활성화하며, 인지 작용 감퇴를 방지, 방해 및/또는 개선하며, 주의력 결핍을 예방, 방해 및/또는 개선하며, 노화 과정과 관련된 경계력 감소를 방지, 방해 및/또는 개선하며, 또 장기간 기억력 및 과정 기억력 뿐만 아니라 학습 능력, 주의력 및 경계력을 지지, 유지 및/또는 개선하고 또 노화 과정 동안 정신 건강을 보존/지지하는데 특히 유용하다.

도 1은 시안화나트륨 노출에 의해 유도된 세포독성 저산소증 24시간 후 신경 생존율에 대한 본 발명의 상이한 투여량의 효과를 도시한다.
도 2는 시안화나트륨 노출에 의해 유도된 세포독성 저산소증 48시간 후 신경 생존율에 대한 본 발명의 상이한 투여량의 효과를 도시한다.
도 3은 콜히친 노출에 의해 유도된 세포구조 파괴 24시간 후 신경 생존율에 대한 본 발명의 상이한 투여량의 효과를 도시한다.
도 4는 콜히친 노출에 의해 유도된 세포구조 파괴 48시간 후 신경 생존율에 대한 본 발명의 상이한 투여량의 효과를 도시한다.
도 5는 본 발명의 혼합물로 처리된 군과 생리적 식염수로 처리된 대조군에서 제1일 및 제5일 사이의 탈출 잠재시간의 차이를 도시한다.
도 6은 시험일 1-4, 5-8 및 9-12에서 모리스 수중 미로에서 수영 경로의 길이를 도시한다. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. * = P<0.01 [MOI = 본 발명의 혼합물; con = 대조군]
도 7은 대조 값 %에서 상이한 해마 형성 영역에서 시냅토피신 면역활성 영역을 도시한다. 100% = 염수 대조군에서 계수된 면역반응성 도트. 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. * = P < 0.05 [MOI = 본 발명의 혼합물; CON = 대조군]
도 8은 기억력에 대한 본 발명의 혼합물의 효과를 도시한다. 이것은 건강한 노인 검체에서 ADAS의 기억력 아이템을 이용하여 기억력에 대한 본 발명의 혼합물을 효과를 평가하였다. ADAS 기억력 점수(생략)는 단어 회상 및 단어 인지의 합을 나타낸다.

분말 혼합물의 제조:

- 6.7% 펩티드, 17.5% 아미노산 및 75.8% 락토오스를 포함하는 분말 49.490 kg

- 카르복시메틸셀룰로오스 6.738 kg

- 미세결정성 셀룰로오스 9.607 kg

- 콜로이드성 무수 실리카 0.525 kg

를 1.2 mm 체 스크린으로 체질해서 스테인레스강 드럼에 넣고 텀블형 혼합기를 이용하여 혼합 속도 6 rpm으로 10분간 혼합하였다(혼합물 1).

1.015 kg 스테아르산 마그네슘을 1.2 mm 체 스크린으로 체질하여 상기 혼합물 1을 함유하는 스테인레스강 드럼에 넣었다. 이어, 전체 과립을 텀블형 혼합기를 이용하여 혼합 속도 4 rpm으로 5분간 혼합하였다(최종 혼합물).

분말 혼합물의 압축 (정제화)

상기 혼합물은 시간당 약 40,000 정제의 타정 속도를 갖는 타정기(tablet press)를 이용하여 압축하였다. 직경 11 mm의 둥근 이중면 볼록 펀치 형상을 사용하였다.

이하 특성을 갖는 정제를 얻었다:

- 평균 중량: 385.0 +/- 7.7 mg

- 경도: 40-70N

- 붕괴: 15.00 분 이하

- 파쇄성: 1.00% 이하

(모든 시험 방법은 Ph. Eur.에 따름)

실시예 2:

정제의 코팅

실시예 1에서 얻은 정제는 코팅할 수 있다. 이하의 성분을 프로펠러 혼합기에서 혼합하여 필름 코팅 현탁액을 얻었다:

- 23.810 kg의 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 (30% 수용액)

- 0.595 kg의 활석

- 0.833 kg의 이산화티탄

- 1.429 kg의 트리에틸 시트레이트

상기 정제들은 드럼 피복기에서 필름정제당 428.0 mg의 최종 중량을 갖도록 필름-코팅 현탁액으로 코팅하였다.

코팅된 정제는 왁스 또는 파라핀으로 광택을 가질 수 있다.

이렇게 필름-코팅된 백색 정제는 다음과 같은 변수를 갖는 것으로 밝혀졌다:

- 평균 중량: 428.0 +/- 8.6 mg

- 붕괴: 30.00 분 이하

- 파쇄율: 1.00% 이하

(모든 시험 방법은 Ph. Eur.에 따름)

실시예 3:

정제화하기 위해 사용된 분말 혼합물(실시예 1 참조)을 경질젤라틴 캅셀에 충전시킬 수 있다.

크기 0 또는 #1의 경질젤라틴 캅셀에 385 mg의 분말 혼합물을 충전시켰다. 이렇게하여 다음과 같은 변수를 갖는 캅셀을 얻었다:

- 평균 중량: 462.0 +/- 28.8 mg (크기 1)

- 평균 중량: 481.0 +/1 28.8 mg (크기 0)

- 붕괴: 15.00 분 이하

크기 2 및 3의 경질 젤라틴 캅셀은 동일 함량의 과립과 함께 사용될 수 있다.

실시예 4:

드링크액의 제조:

- 6.7% 펩티드, 17.5% 아미노산 및 75.8% 락토오스를 포함하는 분말 70.72 g

- 사카로오스 400.00 g

- 벤조산 5.00 g

을 프로펠러 혼합기를 구비한 유리 플라스크 중의 1500 g의 물에 용해시켰다. 거의 투명한 용액이 형성되었다(용액 1).

- 리보플라빈 85.0 mg

- 스트로베리향 17.00 g

- 아로마 밀크-카라멜 10.00 g 또는 아로마 오렌지 2.6 g

을 프로펠러 혼합기를 구비한 유리 플라스크 중의 용액 1에 용해시켰다. 거의 투명한 용액이 형성되었다(용액 2).

- 비타민 E 125.0 mg

을 프로펠러 혼합기를 구비한 유리 플라스크 중의 200.00 g 물에 현탁시켰다. 이 현탁액을 용액 2에 부가하였다(용액 3).

- 알긴산 나트륨 5.00 g

을 500.00 g 온수에 용해시키고 이것을 용액 3에 부가하였다(용액 4).

용액 4를 물과 함께 5000 ml까지 충전시키고 프로펠러 혼합기를 구비한 유리 플라스크에서 혼합하였다. 거의 투명한 용액이 형성되며, 이것은 0.45 ㎛ 막 필터를 통하여 여과함으로써 정화시켰다. 이 용액을 스크류 캡이 있는 20 ml 유리병에 넣었다.

실시예 5:

신경보호 효과 - 상이한 노화 관련 손상으로부터 배양액 중의 피질 뉴런의 보호

5. 1. 방법

필요한 모든 것은 실험 전에 멸균시켰다. 저장액은 이미 멸균된 것을 구입하였고 또 최종 용액은 층상 기류(laminar airflow) 캐비넷에서 혼합하였다.

손상 분석용 배양 배지는 배지에 4.5 g 글루코오스/l, 5% 소태아 혈청, 0.01% 겐타마이신 및 2 mM L-글루타민을 갖는 둘베코 변성 이글 배지(DMEM)로 구성된다. 배지 중의 L-글루타민은 생장 및 분화에 필요하고 또 겐타마이신은 미코플라스마 또는 에테르를 필요로하지 않는 미생물에 의한 감염으로부터 세포 배양액을 보호하기 위해 부가되어야 한다. 각 실험의 경우 영양 배지는 멸균 조건하의 층상 기류 캐비넷에서 새로 제조하였다.

각 실험에 사용한 세포는 로만 브라운(Lohman Brown) 닭 배아 하이브리드였다. 지역 닭 사육자로부터 1일된 수정란을 구입(Schlierbach Gefluegel GmbH, 오스트리아)하고 적합한 조건(12±0.3℃ 및 80± 5% 습도)하의 실험실에 저장하였다. 배아 일수 0일에 수정란들을 사육 인큐베이터에 넣고 38±0.5℃ 및 55± 5% 습도에서 배아 일수 8일이 될 때까지 영구 터닝(permant turning)하에 저장하였다. 뉴런을 분리하기 위해 3 내지 4개 닭 배아를 실험에 사용하였다. 배아의 연령은 아주 중요한데, 이는 발달의 특정 시기에서만 뇌가 신경 세포 및 5% 미만의 아교세포를 함유하기 때문이다(Pettmann, B., Louis, J.C. and Sensenbrenner, LM. (1979) Nature 281: 378-380).

상기 계란을 70% 에탄올로 닦아내고 대형 겸자를 이용하여 한쪽 끝을 파쇄시켰다. 배아의 태아머리를 제거한 후, 종뇌(telencephalon)를 덮는 조직을 제거하고 반구를 수집하였다. 존재할 수 있는 다른 조직이나 잔류하는 수막을 제거한 후, 반구를 영양 배지를 함유하는 접시로 전달하였다. 그후, 1 ml 피펫을 사용하는 것에 의해 또 포어 크기가 100 ㎛ 인 멸균 나일론 체를 통하여 3회 압착하는 것에 의해 상기 조직을 기계적으로 분리시켰다.

표준 트립판 블루 염료 배제 시험(PM 라보라토리스)를 이용하여, 세포의 수 및 세포 생존율을 측정할 수 있다. 세포 개수를 세기 위하여 세포 현탁액의 일부를 9부의 트립판 블루 용액(270IJ IPBS 및 180IJI 0.5% 트립판 블루 용액)으로 희석시켜야 한다. 생존 세포 및 청색으로 염색된 사멸 세포의 수는 뷔르커-튀르크-혈구계로 측정하였다. 세포의 전체 개수에서 염색된 사멸 세포의 수를 빼면 살아있는 세포의 개수를 알 수 있다.

손상 분석을 위해, 원래의 조직 배양 배지를 세포로부터 제거하고 저장하였다. 시안화나트륨 또는 콜히친을 함유하는 신규 배지(시안화나트륨 0.01 mM; 0.1 mM; 1 mM; 콜히친 0.1μM; 1μM; 10μM)를 부가하고 세포와 함께 30분간 유지시켰다. 이어 손상 배지를 제거하여 버리고, 원래의 배양 배지를 교체한 다음 배양액을 24 또는 48시간의 회수 시간 동안 유지시켰다. 그후 생존율 분석을 실시하였다. 이 실험에서는 폴리-D-리신 피복된 96-웰 마이크로티터 플레이트를 사용하였다. 6 x 105 세포/ml를 함유하는 80_1 배지를, 80_1 물질 보충된 배지를 함유하는 앞서 제조한 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 부가하였다. 따라서, 각 웰에서 세포의 최종 양은 3 x 105 ml 영양 배지이다. 손상 및 비손상 대조군은 전체 실험 동안 영양 배지에 생장하였다. 플레이트를 제조할 때; 평소 외부 웰에 영양 배지를 충전시켜 증발을 예방하였다. 플레이트는 실험이 끝날 때까지 배지의 변경없이 37℃, 95% 습도 및 5% CO2에서 유지시켰다. 배양액에서 수시간 지난 후 뉴런은 과정을 연장하기 시작한다.

본 발명에 따른 혼합물은 사용하기 쉬운 앰플 중의 용액으로 사용되었다. 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 ㎕/ml 배지의 농도를 달성하기 위하여, 상기 혼합물을 DIV 1에서 적합한 농도로 웰에 1회 부가하고 실험이 끝날 때 까지 뉴런을 유지시켰다. DIV 8에서 손상이 시작되었으며, 세포 생존율의 평가는 DIV 9 및 DIV 10에서 각각 실시하였다. 손상이 생긴 후 나머지 배양 기간 동안 더 이상 물질을 부가하지 않았다.

손상 분석에서, 본 발명의 혼합물은 상이한 두 날에 동일 조건하에서 시험하였다. 각 실험에서, 손상 및 비손상 대조용에 대해 6개 이상의 특정 값 및 각 농도에 대해 2개의 값(전체 n = 12)을 생성하였다. 본 발명의 혼합물은 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 ㎕/ml 배지의 농도로 보충되었다. 상이한 손상를 갖는 상이한 실험 군을 조사하였다.

각 실험의 종료 시에 잔류하는 신경 세포의 생존율을 비색측정 MTT-환원 분석법으로 측정하였다. 이 분석은 황색 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드)가 미토콘드리아 탈수소효소(숙시네이트 탈수소효소)에 의해 짙은 청색 포르마잔 결정으로 환원되는 것을 기초로 한다. 상기 기재한 반응은 살아있는 세포에서 촉진될 수 있기 때문에, 그 분석만이 세포 생존율의 정량을 위해 이용될 수 있다. 세포 생존율을 측정하기 위하여 MTT 용액을 각 웰에 0.5 mg/ml으 최종 농도로 부가하였다. 2시간 후, MTT 함유 배지는 애스파이어되었다. 3% SDS, 이소프로판올/HCl중에 용해된 포르마잔 결정에 의해 세포를 용해시켰다. 광학 밀도를 측정하기 위해, 플레이트 판독기(Anthos HT II)를 이용하였다(570 nm). 신경 생존율은 광학 밀도(OD)로 표현한다.

분석을 위해 통계적 방법을 이용하였다. MTT 값(OD)는 평균 ± 표준 편차로 표현한다.

5.2. 결과

먼저 상이한 농도의 손상 화합물(시안화나트륨 및 콜히친)을 사용하여 비손상 뉴론과 비교하여 약 50% 신경 손상을 달성하였다. 적합한 손상 유발 투여량 및 손상 시간은 전체 손상이 현저하지만 뉴런이 여전히 생존하여 회복될 수 있는 정도로 선택하였다. 투여량이 너무 높으면 신속한 뉴런 치사를 초래하여 이들을 구제하는 신경보호성 물질의 가능성을 제한하며; 투여량이 너무 낮으면 손상 및 비손상 대조군 사이의 상이함이 너무 적어서 보호 화합물의 신뢰성 있는 평가를 할 수 없다.

시안화나트륨으로 30분간 중독시킨지 48시간 후 세포 생존율의 평가는 본 발명의 중요한 신경보호 효과를 여전히 나타내지만, 24시간 후 관찰한 것보다 약간 낮은 정도였다(도 1 및 도 2). 콜히친에 의한 세포 구조 파쇄는 또한 대량 시경 퇴화를 초래한다. 24시간 후 0.4 mg의 낮은 투여량의 본 발명의 화합물은 현저한 구제를 나타낼 수 없지만, 모든 다른 투여량은 손상입은 대조용의 수준을 약 50% 정도 신경 생존율을 증가시켰다. 손상 개시한 지 48시간 후 모든 투여량은 분명한 신경보호 효과를 나타내며, 3.2 mg의 높은 투여량 군에서 생존율은 손상되지 않는 대조군의 생존율 100%이며, 이는 신경의 대다수가 구제될 수 있음을 나타낸다(도 3 및 도 4).

도 1 내지 도 4는 미처리 손상 대조용(=100%)과 대조한 본 발명의 혼합물을 투여함으로 인한 생존율의 상대적 변화를 나타낸다.

상기 실험으로부터 얻은 전체적 결론은 본 발명이 신경 세포를 살아있는 그대로 유지할 수 있고, 이들을 대사성 스트레스 및 손상으로부터 보호할 수 있으며 또 세포 생존, 신경염 과정 및 이들의 분지의 증식을 자극함을 분명히 보여준다. 시험관 내에서 상이한 독소에 의해 유도된 신경 손상이 너무 심하면 보호 정도가 적고, 약하거나 중간 정도의 손상 조건인 경우, 두드러진 투여량 의존 효과가 평가될 수 있었다.

그러나, 본 발명의 착물 조성물은 펩티드가 상승작용적 방식으로 작용하여서 향신경 자극을 조합하고, 항세포자살 인자와 구조 단백질의 합성을 증가하며, 비정상적으로 상향 조절된 프로테아제 및 대사 조절을 억제함을 제시한다. 이들 효과의 요약은 시험관내에서 굉장히 약한 세포를 보호하기 위한 건강 보조식품의 효능을 나타낸다.

실시예 6:

나이든 쥐의 장기간 치료(생리학적 염수의 경구 투여한 것과 대조적으로 경구적 위관 영양공급에 의한 3개월간 매일 치료)

6.1. 방법

6.1.1. 치료 및 거동 시험

모든 실험은 18개월된(± 1개월) 롱 에반스(Long Evans) 쥐에서 실시하였다. 이들 쥐는 본 발명의 혼합물로 처리되는 군 또는 대조 군으로서 생리적 식염수 처리된 군 등 상이한 군으로 임의로 나누었다. 군 당 동물의 수는 12 내지 15마리였다. 양쪽 실험 군에서 동물은 3개월간에 걸쳐 실시예 5에서 정의된 바와 같은 본 발명의 혼합물 또는 염수로 매일 1회 경구 위장관 투여처리하였다. 매달 마지막 4번 처리(처리일 27 내지 30 = 시험일 1-4; 처리일 56-60 = 시험일 5-8 및 처리일 87-90 = 시험일 9-12) 거동 시험을 MWM에서 실시하여 동물의 학습 및 기억 능력을 평가하였다.

사용된 MWM은 직경 170 센티미터 및 높이 45 센티미터의 둥근 수영 푸울로 구성된다. 추가의 내부 알루미늄 링은 컴퓨터 시스템을 숨겨진 플랫폼에 접속하는 모든 케이블을 숨기기 위해 사용하였다. 이것은 정상 학습 거동에 영향을 줄 수 있는 내부 미로 마크를 동물에 제공하지 않도록 하기 위해 필요하다. 푸울의 내부 표면은 흑색으로 페인팅하여서 투명한 플렉시글래스( Plexiglas) 플랫폼이 외부에서 확인될 수 있도록 한다. 물속에 가라앉은 플랫폼(직경 15 센티미터)은 푸울에서 정확하게 동일한 위치, 즉 남동 4반부에 언제나 위치한다. 각 쥐의 수영 흔적은 광발광 다이오드를 이용하여 검출하였으며, 이들 시그널은 개인용 컴퓨터에 부착된 비데오 카메라에 의해 검출되어서 수영 경로의 연속 추적이 가능하다. 특별히 고안된 소프트 웨어 (ART3)는 수영 경로의 길이, 숨겨진 플랫폼에 도달하는 잠재시간, 4반부에서 소요 시간, 표적 영역 상에서 경로 및 학습 및 기억력 작용을 평가하기에 적합한 모든 다른 변수의 산출을 가능하게 한다. 플랫폼을 찾기 위한 탈출 잠재시간 뿐만 아니라 수영장 경로의 길이는 학습 작용에 대한 본 발명의 혼합물의 효과에 대한 통계적 산출을 위해 사용하였다. 각 시험(훈련) 일에 각 동물에 대해 4번 수영 시험을 실시하였다. 퉁계적 분석은 Kruskal 및 Wallis에 따른 h-시험을 이용하여 실시하거나 또는 정상적으로 분포된 값의 경우 포스트 hoc 분석을 위한 ANOVA 및 Scheffe 시험을 이용하여 실시하였다.

6.1.2. 조직학적 검사

MWM에서 거동 실험을 완료한 직후 각 군의 4 내지 6마리 쥐에 넴부탈을 과량 주입하여 치사시켰다. 적합한 조직 준비를 위해, 생리적 식염수 및 포르말린을 사용한 경심 관류(transcardial perfusion)를 실시하였다. 완전히 고정한 후 뇌를 10% 포르말린에 놓고 나중에 파라핀에 끼워넣었다. 3㎛ 두께의 슬라이스(Bregma Level ~ -4.00 mm)를 마이크로톰으로 절단하고 혈관 단백질 시냅토피신에 대한 항체와 배양하였다. 면역반응은 효소반응(APC-법, 퍼옥시다아제 결합 이차 항체, 디아미노벤지딘을 기질로 사용하였다)을 이용하여 가시화하였다.

시냅스 밀도와 시냅토피신 면역반응성 사이에 상관관계가 있다는 사실로 인하여, 상 분석 시스템(JUCIA-Nikon Photo Systems, AUSTRIA)을 이용하여 시냅스 개수의 광 현미경 정량을 실시하였다. 상 분석은 해마의 분명히 정의된 지역(subarea)(CA1 고막 방사층, CA2 고막 방사층, CA3 고막 방사층, CA3 투명층, 치아이랑 외측 블레이드 및 치아이랑 중간 블레이드) 뿐만아니라 뇌후각뇌피질(층 2 및 3)에서 실시하였다. 이를 위하여 시냅토피신 면역반응성 도트의 개수와 도트의 전체 영역을 측정하고 통계학적으로 계산하였다(Kruskal-Wallis ANOVA).

6.2. 결과

6.2.1. MWM에서 거동 시험

6.2.1.1. 탈출 잠재시간 (Escape Latency)

탈출 잠재시간은 동물을 수영 푸울에 두고 MWM에 있는 숨겨진 플랫폼을 찾아내는 시간으로 정의된다. 동물은 상기 기재한 바와 같이 여분의 미로 경계표지를 이용하여 방향을 잡아야한다. 탈출 잠재시간은 학습 및 기억력의 측도이다.

1개월간의 투여 후 첫 훈련 코스 동안에는 양쪽 실험 군 사이에는 유의한 차이가 검출되지 않았다. 그러나 본 발명의 혼합물로 처리된 쥐가 과제를 더 신속하게 습득하는 경향이 있지만, 4일간의 훈련 후 결과는 동일하였다.

2개월 말 첫 훈련일에 본 발명의 혼합물 처리 군과 식염수 처리 대조군 사이에는 통계적으로 유의한 차이(p=0.0049)가 확인되었다. 이는 장기간 기억의 안정화가 아마도 향상된 과정 학습임을 나타낸다. 본 발명의 화합물로 처리된 쥐들은 제1 시험시부터 원래 플랫폼 위치를 기억하며, 즉 이들은 1개월 시간 내의 위치를 잊지 않았음을 의미하며 또 이들이 과제의 수순에 대해 이미 알고 있기 때문에 이들은 대조용에 비하여 훨씬 잘 수행한다. 이들은 또한 2개월 말기 첫 훈련일에서부터 아주 낮은 탈출 잠재시간을 나타내기 때문에 수영 속도에서의 한계로 인한 천정효과 때문에 더 이상의 개선은 불가능하다. 대조용 동물은 훈련일에서부터 점점 연속적인 개선을 나타내지만 시험 마지막날에 이들은 본 발명의 혼합물로 처리된 동물에 비하여 여전히 나빴다. 3개월간의 처리 말기에 본 발명의 혼합물로 처리된 쥐들은 대조용 군에 비하여 더 낮은 잠재시간을 나타낸다. 그러나, 양쪽 군 모두 매우 양호한 성능을 나타내며 더 이상의 개선의 여지는 없었다.

6.2.1.2. 장기간 기억력에 대한 조사

4일 시험 4 및 5일 시험 1 뿐만 아니라 8일 시험 4 및 9일 시험 1 사이에서 탈출 잠재시간의 차이 분석:

장기간 기억력의 평가(첫째 달의 말기 마지막 시험일의 마지막 실험과 두번째 달의 말기에 첫번 훈련 일의 첫째 실험 사이의 잠재시간 차이; 두번째 달의 말기에 시험일의 마지막 시험과 세번째 처리 기간의 말기에 첫째 실험일의 첫번 째 실험 사이의 차이)는 본 발명의 혼합물로 처리된 쥐에서 장기간 기억력이 향상되는 분명한 경향을 나타낸다. 본 발명의 혼합물로 처리된 동물은 첫째 달의 마지막 훈련일에 마지막 실험의 탈출 잠재시간을 2개월 기간에서 첫 훈련일의 첫번째 실험의 탈출 잠재시간과 비교하면 거의 10초 정도 성적 향상을 나타낸다. 이와 대조적으로 대조군 동물은 약간 더 늦다. 2달 기간의 말기 마지막 훈련일의 마지막 실험의 성능을 처리 기간의 말기 첫째 훈련일의 첫째 실험의 성능을 비교하면 본 발명의 혼합물로 처리된 군에서 10초 이상 향상을 나타내었다. 염수로 처리된 대조군은 아무런 변화를 나타내지 않으며, 이는 본 발명의 혼합물로 처리된 쥐에서 장기간 기억력이 향상되었음을 나타낸다.

1개월 기간 후 첫 훈련일의 탈출 잠재시간과 2개월 처리후 첫 훈련일의 탈출 잠재시간 및 3개월 처리 기간 후 첫 훈련일의 탈출 잠재시간의 분석

장기간 기억력에 대한 제2 측도로서, 2개월 및 3개월 처리 후 바로 첫 학습일에서 첫 훈련일까지의 차이를 평가하였다. 이것은 재차 훈련 상황에 대한 천연 상태와 비교한 탈출 잠재시간의 전체적 향상의 측도로 작용한다. 차이가 더 클수록 더 우수한 장기간 기억력을 나타낸다; 차이가 작으면 동물은 훈련없이 처리 기간 동안 플랫폼 위치를 잊는다는 것을 나타낸다.

도 5(훈련일 1 (1개월 처리) 및 훈련일 5 (2개월 처리) 사이의 탈출 잠재시간의 차이를 도시한다; 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다. ** = P < 0.01)는 훈련 바로 첫날(천연 쥐가 처음으로 MWM에 놓여짐)과 2개월의 처리후 재훈련시 차이를 도시한다. 본 발명에 따른 화합물로 처리된 동물은 훈련 첫날과 비교하여 거의 25초 또는 50% 정도 향상되는 반면에, 염수로 처리된 대조군은 대충 12초 또는 25% 미만의 향상을 나타내었다. 훈련 첫날 및 처리 말기(3개월)의 학습 첫날에 재훈련 사이의 탈출 잠재시간의 차이의 대조는 이들 군 사이에 유의한 차이가 없음을 나타낸다. 본 발명의 화합물로 처리한 군에서 유리한 경향이 있지만, 데이터를 보면 모든 처리 군에서 훈련을 반복하면 결국 성공에 이름을 보여준다. 모든 실험은 노인에서 실시되었지만, 눈에 띄는 신경 장애를 갖지 않는 건강한 동물에서도 실시하였다. 따라서, 훈련 연장은 양쪽 처리 군에서 인지 성능을 연속적으로 향상시킬 것이라고 예상되었다.

6.2.1.3. 수영 경로의 길이의 평가

탈출 잠재시간은 근육운동성의 차이에 의해 한쪽으로 기울게 될 수 있고 그에 따라 수영 경로의 길이를 산출하였다. 증가된 수영 속도 또는 감소된 수영 속도는 학습 및 기억의 변화와 흡사할 것이다. 수영 흔적의 길이는 수영 속도와는 독립적으로 학습 및 기억 성능의 독립적인 측도이다.

이 데이터는 2개월의 처리 기간 말기 첫 훈련일에서 본 발명의 혼합물로 처리된 쥐와 대조용 쥐에서 통계학적으로 유의한 차이를 확인하여 준다. (p = 0.0133). 이것은 전에 분석한 데이터가 일치되며 또 본 발명에 따른 혼합물 처리는 근육운동성 거동에서의 차이와 독립적으로 인지 성능을 향상시킨다는 것을 나타낸다.(도 6).

4일 실험 4 및 5일 실험 1 뿐만아니라 8일 실험 4와 9일 실험 1 사이의 수영 경로의 길이 차의 분석:

훈련 기간의 제1 시리즈에서 마지막 실험과 2개월의 처리 후 제2 훈련 기간에서 제1 실험 사이의 수영 경로의 길이의 대조는 탈출 잠재시간의 평가에서 무엇이 보였는지를 정확하게 반영한다. 수영 경로의 길이는 본 발명의 혼합물 처리 군에서 약 2.1 미터 짧았고 이는 이들이 훈련 없이 4주 후에도 보다 더 정확하게 방향을 잡는 것을 의미한다. 대조군은 플랫폼을 찾는데 1.4 미터 더 길게 필요로 하며, 이는 초기 검색에서 약간의 어려움을 반영하거나, 또는 이들이 표적으로 가는 정확하고 최단 방향을 재학습해야함을 의미한다.

제2 코스의 마지막 시험일의 마지막 훈련 실험의 성적(2개월의 처리 후)을 3개월 처리 말기 첫 훈련일의 첫 실험에서의 성적과 비교하면 수영 경로의 길이는 거의 2 미터 더 짧았다. 이것은 본 발명의 혼합물이 장기간 기억력 작용에 강한 영향을 줌을 시사한다. 대조용 동물은 더 이상의 향상을 나타내지 않는다.

6.2.2. 시냅스 밀도의 조직학적 평가

시냅토피신 면역반응성 "도트"의 개수

본 발명의 혼합물을 사용한 3개월 처리 코스는 조사된 영역 4개에서 시냅스 밀도의 통계학적으로 유의한 증가를 초래하였다. CA3 고막 방사층 및 치아이랑 측면 블레이드에서, 본 발명의 혼합물로 처리된 동물에서 시냅스 밀도 증가에 대한 강한 경향이 있었고 또 CA3 투명층에서만 상기 처리는 시냅스 밀도 증가를 초래하지 않았다.

시냅토피신 면역반응성 영역의 평가

모든 단일한 면역반응성 도트를 계수한 전의 평가와 대조적으로, 시냅토피신 면역반응성에 의해 포함되는 전체 영역을 혈관 및 조직 파괴를 보정한 후 뇌 조작의 전체 영역과 대조하여 측정하였다. 그 결과는 뇌후각피질에서의 효과가 유의한 값보다 약간 낮은 것을 제외하고는 면역반응성 도트의 계수로 얻은 데이터를 반영한다. (p = 0.0550). 모든 다른 차이도 중요하며 본 발명의 혼합물로 처리된 쥐에서 시냅스 밀도의 일반적인 증가 경향이 확인되었다.

모리스 수중 미로에서 거동 시험의 결과는 2개월의 처리 기간 말기에서 본 발명의 혼합물 처리 군 및 대조군 사이에는 통계학적으로 유의한 차이를 나타낸다. 본 발명의 혼합물로 처리된 동물은 대조군에 비하여 모리스 수중 미로에서 감추어진 플랫폼을 더 빨리 찾는다. 이는 본 발명의 혼합물이 건강한 노령 쥐에서 장기간 기억력을 향상시킴을 나타낸다. 이 데이터는 생장인자 유사 펩티드를 장기간 섭취하는 것이 용인되고 뇌에 대한 영양요구 자극을 제공할 수 있음을 제시한다. 요컨대, 본 발명은 노화 되는 동안 기억 및 학습 능력을 보조할 수 있고 또 노화 과정과 관련된 인지 능력 상실의 우려를 감소시킬 수 있는 신규 건강 보조식품을 구성한다.

실시예 7:

건강한 노인에서 인지 능력 향상

7.1. 방법

63.0: 3.6 세 (범위 51-76세)의 6명의 건강한 성인(4명 여성 및 2명 남성)을 이 연구에 포함시켰다. 검체의 체중, 키, BMI (체질량 지수) 및 기타 생물학적 특징을 기록하였다.

연구에 앞서 의학적 및 심리학적 평가, 정량 EEG 및 ECG 뿐만아니라 실험적 분석을 모든 검체에 대해 실시하였다. 어떤 검체도 노인성 치매에 대한 DSM-IV 및/또는 NINCDS-ADRDA 기준(American Psychiatric Association, 1994; McKhann et al., 1984)을 만족하지 않았다. 모든 검체는 이 연구 전 및 연구 동안 약물을 전혀 섭취하지 않았다. 모든 연구 지원자로부터 정보제공하여 동의서를 받았다. 이 연구는 Institutional Review Board에 의해 실시되었고 훌륭한 의사의 지도에 따라 실행하였다.

이 연구는 본 발명 혼합물의 효과를 평가하기 위한 개방표지 시험이며, 건강한 노인에서 뇌 능력에 대해 알아보기 위해 경구투여로 1회 투여하였다. 50세 이상의 6명 검체를 포함시켰다. 각 지원자에 대해 연구 지속 시간은 2일이었다. 지원자는 제1일, 본 발명의 혼합물을 투여하기 24시간 전 및 제2일 두번째 후-처리 평가, 본 발명의 혼합물을 투여한지 6시간 후에 인지 평가를 받았다. 모든 연구 지원자는 본 발명의 혼합물을 단일 경구 투여량을 받았다(180 mg).

7.2. 결과

기저라인에서 평균 MMSE 점수는 연구한 검체에 대해 28.4±0.4 점이었다. 보본 발명의 혼합물을 처리한 후 ADAS-기억력 점수의 유의한 향상이 관찰되었다(기저라인에서 6.9± 1.0 누락 대 처리후 4.9± 1.0 누락; p < 0.01). 이 기억력 향상은 단어 인지에 대해서는 통계적으로 유의하였다(2.8±0.6 누락 대 1.5±0.7 누락; p<0.05)-도 8.

상기 연구 결과에 따르면, 본 발명의 혼합물은 단일 투여한 후 건강한 노인 검체에서 기억력을 지지하고 향상시킨다. 본 발명의 혼합물에 의해 유도된 향상은 단어 인지 작업 및 ADAS의 전체 기억 점수에서 현저한 값에 도달하였지만, 단어 회상 면에서는 그렇지 않았다. 본 발명의 혼합물은 또한 주의력 및 기억력 모두에 관련된 SKT의 인지 작업에서 수행력을, 유의할 정도는 아니지만, 향상시켰다. 본 발명의 혼합물로 처리한 후 가장 훌륭한 효과가 나타난 개별 SKT 작업은 블록 정리, 기호 세기 및 인지 기억을 포함하였다. 이들 효과는 본 발명의 혼합물이 인지 손상없이 성인에서 주의력 및 기억력을 강화시킬 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 결과는 본 발명의 혼합물이 건강한 노인 지원자에서 뇌 작용을 지지하며, 인지 수행(기억 및 주의력)에 대해 분명히 긍정적인 효과를 가짐을 시사한다. 따라서 본 발명의 혼합물은 노인에서 인지 수행 및 주의력을 지지 및 향상시키는 유용한 건강 보조식품을 구성하는 것으로 본다.

Claims (15)

1. 서열 : NMVPFPR로 정의된 펩티드 제제를 포함하는 신경보호 활성을 갖는 건강 보조식품 혼합물.
2. 제1항에 있어서, 부가적 아미노산을 더 포함하는 건강 보조식품 혼합물.
3. 제1항에 있어서, 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 펩티드를 더 포함하는 건강 보조식품 혼합물.
4. 제1항에 있어서, 미량 원소, 무기질, 비타민, 카페인, 타우린, 지방산, 인지질, 포스파티딜세린 또는 식물 추출물을 포함하는 건강 보조식품 혼합물.
5. 제1항에 있어서, 허용되는 첨가제, 부형제, 충전제, 착색 물질 또는 풍미물질을 더 포함하는 건강 보조식품 혼합물.
6. 제5항에 있어서, 용매를 더 포함하고, 경구 투여 방식으로 사용되는 건강 보조식품 혼합물.
7. 제1항에 있어서, 2 내지 20중량% 펩티드를 더 포함하고, 경구 투여 방식으로 사용되는 건강 보조식품 혼합물.
8. 제7항에 있어서, 10 내지 30 중량% 아미노산을 더 포함하는 건강 보조식품 혼합물.
9. 제1항에 있어서, 노화 관련 기억력 손상, 노화 관련 인지 감퇴 또는 양성 노인성 건망증을 예방, 완화 또는 개선하기 위한 건강 보조식품 혼합물.
10. 제1항에 있어서, 노화 과정과 관련된 대사 결함 및 스트레스로부터 뉴런을 보호하기 위한 건강 보조식품 혼합물.
11. 제1항에 있어서, 저산소증 또는 허혈증으로 인한 노화 관련 뉴런 손상의 예후, 세포내 칼슘 과잉부하로 인한 노화 관련 뉴런 손상의 예후, L-글루타메이트에 의해 유도된 노화 관련 뉴런 손상 및 흥분독성의 예후, 산화 스트레스에 기인한 노화 관련 뉴런 손상의 예후를 예방, 방해 또는 완화하기 위한 건강 보조식품 혼합물.
12. 제1항에 있어서, 노화 관련 신경퇴화의 예후를 방지, 방해 또는 완화하고, 세포 스트레스에 기인한 신경 세포 치사, 신경퇴화 및 중독을 방지하며, 노화 과정 동안 정상적인 뉴런 세포구축을 유지하고 보존하며, 시냅스 작용 및 시냅스 밀도를 지지 또는 향상시키며, 시냅스 유연성 및 시냅스 밀도의 노화 관련 감퇴 예후를 방지, 방해 또는 완화하는 건강 보조식품 혼합물.
13. 제1항에 있어서, 주의력 및 기억력과 관련된 뇌 메카니즘을 활성화하는 건강 보조식품 혼합물.
14. 제1항에 있어서, 인지 작용 감퇴, 기억력 감퇴, 주의력 결핍, 노화 과정과 관련된 경계력 감소를 방지, 방해 또는 개선하며; 또 장기간 기억력 및 과정 기억력뿐만 아니라 학습 능력, 주의력 및 경계력을 지지, 유지 또는 개선하기 위한 건강 보조식품 혼합물.
15. 제1항에 있어서, 노화 과정 동안 건강한 정신 작용을 보존/지지하기 위한 건강 보조식품 혼합물.

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