KR20120009774A

KR20120009774A - 각질내 세라마이드류의 구성비율과 보습능과의 관계 연구를 통한 피부 보습력 평가법

Info

Publication number: KR20120009774A
Application number: KR1020100070444A
Authority: KR
Inventors: 주경미; 남개원; 박선영; 한지연; 임경민; 정혜진; 김한곤
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2010-07-21
Filing date: 2010-07-21
Publication date: 2012-02-02

Abstract

본 발명은 CER[NS]의 구성비와 피부보습능과의 비교 분석을 통하여 피부보습능에 주요한 세라마이드 성분을 규명하고 피부 보습을 평가할 수 있는 평가법에 관한 것으로, 상세하게는 UPLC-MS/MS-ESI를 이용하여 빠르고 정확하며 선택적으로 각질 내 CER[NS]를 지방산 사슬별로 구분할 수 있는 정량법을 개발하여 사람 각질내 CER[NS]의 구성비를 정량하고 피부보습능(TEWL)과의 관계분석을 통하여 피부보습을 평가할 수 있는 보습력 평가법 및 상기 보습력 평가법을 이용하여 보습력을 상승시키는 제품을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

각질내 세라마이드류의 구성비율과 보습능과의 관계 연구를 통한 피부 보습력 평가법{Method for evaluating moisturising ability of skin through determining component ratio of ceramides in stratum corneum}

피부의 가장 외층인 표피는 외부 환경과 항상 접하고 있는 기관으로 보호장벽의 역할을 하고 있다. 표피의 각질층에 존재하는 피부장벽은 수분과 전해질의 소실을 억제하고 외부의 물질적 손상과 화학물질로부터 인체를 보호하며, 세균 및 바이러스 등이 피부로 침투하는 것을 방지하는 역할을 한다. 각질층은 두 가지 성분으로 이루어져 있는데, 죽은 각질세포로 이루어진 단백질과 각질세포 사이에 존재하는 지질로 이들 중 각질세포간 지질이 피부장벽의 유지에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Elias, P. M., 1983. Epidermal lipids, barrier function, and desquamation. J. Invest . Dermatol. 80: 44-49). 각질세포간 지질은 세라마이드(ceramides), 콜레스테롤(cholesterol), 유리 지방산(free fatty acids) 등의 지질혼합체로 세포간 층상구조(intercellular lamellae)를 이루고 있다.

세라마이드는 각질을 구성하는 주요 지질 성분으로서 피부의 보습능 형성과 피부장벽질환 발생에 중요한 역할을 한다. 세라마이드는 스핑고신 또는 파이토스핑고신에 지방산이 연결되어 있는 구조를 가지고 있는 스핑고 지질의 일종으로 피부 각질층을 구성하는 각질 세포간 지질 중 약 40~50% 이상을 차지하며 각질층의 구조 형성이나 기능을 나타내는데 필수적인 성분으로 각질층에서 수분증발을 억제하는 지질 장벽 역할과 각질층의 정연한 구조를 유지하게 하는 기능을 하고 있다.

피부의 건조(dryness)는 겨울철에 흔히 발생하나 그 병인에 대해서는 현재까지도 완전히 설명되지 않고 있다. 사전적인 의미로의 건성피부란 단지 피부에 수분이 부족하거나 없는 상태를(10% 이하) 가리키며, 임상적으로 건성피부의 정의는 약간의 홍반과 균열이 있으며 인설이 있는 표면이 거친 피부를 지칭한다.

건조 피부는 표피, 진피, 피하지방층을 포함한 피부 전층에 걸쳐 일어나는 변화라기보다는 주로 표피의 상부층에서 일어나는 변화 때문에 생기는 것으로 알려져 있으며, 표피 상층부 중에서도 표피장벽의 역할을 하는 각질층에서 일어나는 변화가 건조피부의 중요한 원인으로 생각되고 있다. 건조피부 발생의 생화학적 측면에서 많은 연구가 이루어지고 있는데, 특히 세가지 요소들, 피지, 각질 세포간 지질, 각질 세포 내 자연함습 인자(natural moisturizing factor, NMF) 및 교소체(desmosome)의 분해에 의한 각질세포의 탈락 등이 중요하고 이러한 정상 생화학적 과정에 장애가 발생할 때 피부는 건조해진다.

세라마이드는 디하이드로스핑고신, 스핑고신, 피토스핑고신, 6-하이드록시스핑고신 등의 스핑고신 베이스와 비하이드록시 지방산, α-하이드록시 지방산, 에스테르-결합 ω-하이드록시 지방산 등의 지방산이 결합하여 형성된다. 이렇게 다양한 스핑고신 베이스와 지방산류들이 결합하여 세라마이드를 구성하기 때문에 다양한 종류의 세라마이드가 각질 층에 존재할 수 있으나 그 분석적 어려움 때문에 세라마이드에 대한 정량적이며 상세한 연구는 진행되지 못하고 있었다.

기존에 보고 되어 있는 세라마이드의 확인 및 정량법으로 다양한 분석 방법들이 사용되고 있다. 기체크로마토그래피(GC 또는 GC-MS, Gaver R. C., Sweeley, C. C. 1965. Methods for methanolysis of sphingolipids and direct determination of long-chain bases by Gas Chromatography. J. Am . Oil Chem . Soc. 42: 294-8), 박층크로마토그래피(TLC, Weerheim, A., Pone, M., 2001. Determination of stratum corneum lipid profile by tape stripping in combination with high-performance thin-layer chromatography. Arch . Dermatol . Res. 293: 191-9.), 고속액체크로마토그래피(HPLC, Gaudin, K., Chaminade, P., Ferrier, D., Baillet, A., Tchapla, A., 1999. Analysis of commercial ceramides by non-aqueous reversed-phase liquid chromatography with evaporative light-scattering detection. Chromatogr . 49 : 241-8) 및 효소- 또는 항체-기반 분석(Edsall, L. C., Spiegel, S., 1999. Enzymatic Measurement of Sphingosine 1-Phosphate. Anal . Biochem . 272: 80-86) 등의 분석방법들이 개발되었으나 이들 방법들은 비특이적이고 미량 분석이 어려우며 많은 시간이 소비되는 등의 단점이 있었다. 최근에는 질량분석방법 특히 LC/MS(Lee, MH, GH Lee, JS Yoo. 2003. Analysis of ceramides in cosmetics by reversed-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry with collisioninduced dissociation. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17: 64-75)나 LC/MS/MS(Mano, N., Oda, Y., Yamada, K., Asakawa, N., Katayama, K., 1997. Simultaneous quantitative determination method for sphingolipid metabolites by liquid chromatography/ion spray ionization tandem mass spectrometry. Anal . Biochem. 244: 291-300) 등을 이용한 방법들이 개발되고 있으며 일본 KAO 사의 Masukawa 등은 순상의 조건을 이용하는 NPLC-ESI-MS(normal phase liquid chromatography-elecrospray ionization-mass spectrometry) 방법으로 세라마이드들을 분석하였다. 그러나 NPLC 조건은 일반적인 LC-MS(liquid chromatography-mass spectrometry) 조건에 그대로 적용하기 어렵고 대부분 역상 컬럼을 사용하는 RPLC-MS(reverse phase liquid chromatography-Mass spectrometry) 방법들이 주를 이루고 있다. 최근에는 순상 컬럼의 특성을 지니면서 역상 조건에서 사용할 수 있는 컬럼들이 개발되고 있는 실정이다. 그외 종래에 사용되고 있는 방법들은 복잡한 시료 매트릭스에서 정량적인 재현성과 정밀성을 제공하는데 한계가 있으며 다양한 지방산 사슬별 세라마이드들을 동시적이면서도 신속하게 분석하는데 어려움이 있었다.

다양한 세라마이드류 중 비하이드록시 지방산(nonhydroxy fatty acids)과 스핑고신(sphingosine)의 결합사슬 CER[NS](세라마이드[비하이드록시 지방산 스핑고신, ceramide[nonhydroxy fatty acid sphingosine])는 그 구조의 단순함과 합성의 용이성 때문에 모델 세라마이드로서 광범위하게 연구되고 있다(Novotny, J, B Janusova, M Novotny, A Hrabalek, K Vavrova. 2009. Short-chain ceramides decrease skin barrier properties. Skin Pharmacol. Physiol. 22: 22-30). 뿐만 아니라 CER[NS]는 각질층에 존재하는 전체 세라마이드의 25%를 차지하고 있어 각질층 세라마이드의 성분 패턴을 대표할 수 있다(Ponec et al 2003).

UPLC(Ultra performance liquid chromatography)는 2μm 이하의 작은 입자 크기의 고정상을 사용함으로써 짧은 시간내에 효과적으로 다성분들을 분리할 수 있는 장점이 있으며 복잡한 생체 시료내에서 빠른 시간내에 고분해능, 고감도, 높은 피크용량의 특성으로 신속 정확한 분석이 가능하다.

본 발명자들은 RPLC-MS 방법으로UPLC-MS/MS-ESI를 이용하여 빠르고 정확하며 선택적으로 각질 내 CER[NS]를 지방산 사슬별로 구분할 수 있는 정량법을 개발하고 이를 통하여 사람 각질내 CER[NS]의 구성비를 정량하였다. 또 이 결과를 피부보습능(TEWL) 측정결과와 주성분분석법(Principal Component Analysis)을 이용하여 비교 분석하여 피부보습능에 주요한 세라마이드 성분을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 빠르고 정확하며 선택적으로 각질 내 CER[NS]를 지방산 사슬별로 구분할 수 있는 정량법을 개발하고 이를 통하여 사람 각질내 CER[NS]의 구성비를 정량하여 피부보습능(TEWL) 측정결과와 비교 분석하여 피부 보습평가법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 피부 보습평가법을 이용하여 보습력을 상승시키는 제품을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 피험자 피부 각질 시료를 수득하는 단계; b) 상기 수득된 각질 시료의 경피수분증발량(TEWL)을 측정하는 단계; c) 크로마토그램을 이용하여 상기 단계 a)에서 수득된 각질 시료 내 포함된 8종 세라마이드(C16Cer, C18Cer, C18:1Cer, C20Cer, C24Cer, C24:1Cer, C16SM 및 C18SM)의 각 함량을 측정하는 단계; d) 통계분석을 통해 상기 경피수분증발량(TEWL) 및 각 세라마이드 함량과의 상관관계 함수를 도출하는 단계; 및 e) 상기 도출된 상관관계 함수를 이용하여, 피부 보습력 평가 대상자의 피부 각질 내 세라마이드 함량으로부터 대상자의 피부 보습력을 수치화하는 단계;를 포함하는, 피부 내 보습력 평가 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 피부 각질 시료를 수득하여 상기 수득된 각질 시료 내 포함된 세라마이드 중 C12 내지 C18의 짧은 사슬 세라마이드 및 C20 내지 C30의 긴 사슬 세라마이드의 각 함량을 측정하는 단계; 2) 피부에 시험 대상 화장료를 도포한 후 피부 각질 시료를 수득하여 수득된 각질 시료 내 포함된 세라마이드 중 C12 내지 C18의 짧은 사슬 세라마이드 및 C20 내지 C30의 긴 사슬 세라마이드의 각 함량을 측정하는 단계; 및 3) 상기 1) 단계 및 2) 단계에서 측정한 C12 내지 C18의 짧은 사슬 세라마이드 및 C20 내지 C30의 긴 사슬 세라마이드의 각 함량 변화로부터 도포된 화장료의 보습력을 결정하는 단계;를 포함하는, 보습력을 상승시키는 화장료의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 CER[NS] 8종을 지방산 길이에 따라 분리하여 사람의 각질중 CER[NS]의 구성비를 정량하고 피부보습능(TEWL) 측정결과와 비교 분석하여 피부보습능에 주요한 세라마이드 성분을 규명하였으며, 본 발명의 시험법은 피부보습을 평가할 수 있는 보습평가방법 및 보습력을 상승시키는 제품을 스크리닝하는 방법으로 활용될 수 있다.

도 1은 8종의 세라마이드인 C16Cer(CER[N(16)S(18)]), C18Cer(CER[N(18)S(18)]), C18:1Cer(CER[N(18:1)S(18)]), C20Cer(CER[N(20)S(18)]), C24Cer(CER[N(24)S(18)]), C24:1Cer(CER[N(24:1)S(18)]), C16SM(([N(16)S(18)]), 및 C18SM(([N(18)S(18)]) 의 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 C16Cer(CER[N(16)S(18)])의 농도와 신호세기(피크면적비)에 대한 검정곡선을 나타낸다.
도 3은 사람 각질중 CER[NS] 세라마이드들의 양(amount)을 나타낸다.
도 4는 사람 각질중 CER[NS] 세라마이드들의 비(ratio)를 나타낸다.
도 5는 C18Cer 비와 TEWL 사이의 피어슨 상관관계 분석(Pearson's correlation analysis)을 이용한 상관관계 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 C20Cer 비와 TEWL 사이의 피어슨 상관관계 분석을 이용한 상관관계 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 건강한 지원자들(N=20)의 각질시료로부터 구한 각 지원자들의 CER[NS] 비의 주성분 분석(Principal component analysis) 결과를 나타낸다.
도 8은 각 지원자들의 각질 중 C16Cer, C24Cer 비와 보습능(TEWL)과의 상관관계도를 나타낸 것이다.
도 9는 추가 지원자들(N=14)의 상박부위 각질 중 얻은 C20Cer 비와 TEWL의 상관관계도 및 피어슨 상관관계 분석을 이용한 통계적 상관관계 분석 결과를 나타낸다.

본 발명은 하기 화학식 1을 포함하는 지방산 사슬별 CER[NS] 세라마이드 6종(N-팔미토일-D-에리트로-스핑고신[N-Palmitoyl-D-erythro-Sphingosine(C16 Ceramide, d18:1/16:0)], N-스테아로일-D-에리트로-스핑고신[N-Stearoyl-D-erythro-Sphingosine(C18 Ceramide, d18:1/18:0)], N-올레오일-D-에리트로-스핑고신[N-Oleoyl-D-erythro-Sphingosine(C18:1 Ceramide, d18:1/18:1(9Z))], N-아라키도일-D-에리트로-스핑고신[N-Arachidoyl-D-erythro-Sphingosine(C20 Ceramide, d18:1/20:0)], N-리그노세로일-D-에리트로-스핑고신[N-lignoceroyl-D-erythro-sphingosine(C24 Ceramide, d18:1/24:0)], N-네보노일-D-에리트로-스핑고신[N-nervonoyl-D-erythro-sphingosine(C24:1 Ceramide, d18:1/24:1(15Z))]) 및 화학식 2를 포함하는 지방산 사슬별 세라마이드 2종(N-팔미토일-D-에리트로-스핑고실포스포릴콜린[N-palmitoyl-D-erythro-sphingosylphosphorylcholine(C16SM, d18:1/16:0)], N-스테아로일-D-에리트로-스핑고실포스포릴콜린[N-stearoyl-D-erythro-sphingosylphosphorylcholine(C18SM, d18:1/18:0)]을 포함하여 총 8종의 세라마이드를 사람 각질중에서 정량하고 피부보습능(TEWL) 측정결과와 비교 분석하여 피부보습능에 주요한 세라마이드 성분을 규명 및 피부 보습효능을 평가하는 방법을 제공한다.

C24 세라마이드(d18:1/24:0)

16:0 SM(팔미토일 스핑고미엘린)

한편, 피부의 보습효능을 평가하는 방법은 매우 다양하다. 크게 분류해 보면, 피부세포를 이용하여 평가하는 방법, 동물을 이용하여 보습효능을 평가하는 방법, 실제 인체피부에서의 보습효능을 평가하는 방법으로 분류해 볼 수 있는데, 세라마이드 등을 정량하는 지질분석시험은 세포시험, 동물시험 및 인체시험 모두에 적용할 수 있는 범용적인 방법이다.

보습효능 평가법의 종류

종류	방법 및 내용
세포시험	각질형성능 시험 피부세포분화인자 확인 시험: FG, TGase, 지질생합성 효소 활성 및 정량시험 지질분석 시험: 세라마이드 정량
동물시험	장벽회복능 시험: 무모생쥐 피부세포분화 확인 시험: 면역조직화학염색 (H&E, FG, INV) 지질생합성 효소 활성 및 정량시험 지질분석 시험: 세라마이드, 콜레스테롤 등.
임상시험	수분증발량 측정: TEWL 수분력 측정: 피부수분측정기(Corneometer) 각질 턴오버(turn-over) 측정 시험: DS 각질형성 시험: D-squame？, Hi-scope 각질층 지질 분석 시험 각질층 채취 분석(SSB): SEM, 염색

본 발명에서는 피부 보습효능을 평가하기 위하여, a) 피험자 피부 각질 시료를 수득하는 단계; b) 상기 수득된 각질 시료의 경피수분증발량(TEWL)을 측정하는 단계; c) 크로마토그램을 이용하여 상기 단계 a)에서 수득된 각질 시료 내 포함된 8종 세라마이드(C16Cer, C18Cer, C18:1Cer, C20Cer, C24Cer, C24:1Cer, C16SM 및 C18SM)의 각 함량을 측정하는 단계; d) 통계분석을 통해 상기 경피수분증발량(TEWL) 및 각 세라마이드 함량과의 상관관계 함수를 도출하는 단계; 및 e) 상기 도출된 상관관계 함수를 이용하여, 피부 보습력 평가 대상자의 피부 각질 내 세라마이드 함량으로부터 대상자의 피부 보습력을 수치화하는 단계;를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 CER[NS] 세라마이드 6종(C16Cer, C18Cer, C18:1Cer, C20Cer, C24Cer, C24:1Cer) 및 스핑고미엘린 세라마이드 2종(C16SM, C18SM)을 포함하여 총 8종의 세라마이드를 이용하며, 이들 세라마이드는 UPLC-MS/MS-ESI를 이용하여 성분별로 분석한다. 구체적인 분석조건은 하기 실시예 1 및 2에 기재되어 있다.

UPLC(Ultra performance liquid chromatography)는 2μm 이하의 작은 입자 크기의 고정상을 사용함으로써 짧은 시간내에 효과적으로 다성분들을 분리할 수 있으며 검출기로 질량분석기를 사용함으로써 선택성과 감도를 높일 수 있다.

부모이온(parent ion)에 충돌 에너지(collision enrgy)를 가하여 조각화 과정을 거친후 선택된 조각화이온(daughter ion)에 대해 질량 대 하전비(m/z)로 모니터링하는 MRM(multiple reaction monitoring)모드는 선택된 이온의 질량 대 하전비 (m/z) 값에 대해 더 많은 시간 이온 샘플링이 가능하여 감도를 높일 수 있으며 시료중 방해물질의 영향을 받지 않는 신호를 얻을 수 있기 때문에 높은 정밀성과 낮은 검출한계를 제공한다. ESI(electrospray ionization)는 LC-MS에서 가장 많이 사용되는 이온 소스로 본 발명에 사용된 세라마이드는 양이온(positive ion)모드에서 [M+H]⁺이온을 생성하였으며 충돌 에너지(collision enrgy)를 가하여 MS/MS 조각화를 유도할시 CER[NS] 세라마이드는 264질량의 조각화이온(daughter ion)이, 스핑고미엘린 세라마이드는 184질량의 조각화이온이 우세하게 생성되어 MS조건을 선정하였다.

각 세라마이드들의 최적 분리조건은 역상컬럼인 C8컬럼을 사용하고 5mM 암모늄 포메이트/메탄올(3/7, 0.1% 포름산) 및 메탄올 내의 5mM 암모늄 포메이트/이소프로판올(7/3, 0.1% 포름산)의 이동상 조성을 적용할 때 최적의 피크모양과 선택성을 나타내었으며 8종의 세라마이드는 6분 이내에 효과적으로 잘 분리되었다.

본 발명에서는 각 세라마이드의 함량과 경피수분증발량(Transepidermal Water Loss, TEWL)의 상관관계 함수로부터 피험자의 피부 내 보습력을 평가할 수 있다. 구체적으로, 짧은 지방산을 갖는 세라마이드는 높은 극성으로 인해 보습에는 부정적인 효과를, 긴 지방산을 갖는 세라마이드는 낮은 극성으로 인해 긍정적인 효과를 발휘할 수 있으며, 본 발명에서 분석하는 세라마이드류에서 C16cer과 C18cer이 짧은 사슬의 세라마이드에 속하고 그 이외의 것은 긴 사슬의 세라마이드에 속한다.

따라서, 분석결과 C16cer과 C18cer의 피부 각질 내 함량이 높으면 피부 보습력이 떨어지는 것으로 평가할 수 있고, 그 이외의 세라마이드류의 함량이 높으면 피부 보습력이 우수한 것으로 평가할 수 있다.

각 세라마이드의 함량과 경피수분증발량의 상관관계에 대한 통계분석 결과 세라마이드 중 C18 이하 길이의 세라마이드는 양의 상관관계를, C20 이상의 길이의 세라마이드는 음의 상관관계를 가져 긴 사슬 세라마이드와 짧은 사슬 세라마이드의 비율이 피부 보습력을 결정하는데 크게 작용함을 알 수 있다.

따라서, C18 이하, 바람직하게는 C12 내지 C18의 짧은 사슬 세라마이드 및 C20 이상, 바람직하게는 C20 내지 C30의 긴 사슬 세라마이드의 함량의 비율로부터 대략적인 피부 보습력을 추정할 수 있다. 특히 화장료의 적용 후 이들 세라마이드의 함량 변화에 있어서 C18 이하의 짧은 사슬 세라마이드의 감소 또는 C20 이상의 긴 사슬 세라마이드의 증가가 있다면, 사용한 화장료가 피부 보습력을 증가시킨 것으로 평가할 수 있으므로 경피수분증발량을 직접적으로 측정하지 않고서도 피부 보습력을 상승시키는 제품의 스크리닝이 가능하다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다.

[실시예1] 세라마이드 8종의 동시분석

CER(NS)(C16Cer, C18Cer, C18:1Cer, C20Cer, C24Cer, C24:1Cer) 및 스핑고미엘린(C16SM, C18SM) 분석을 위해 UPLC-MS는 Waters사 AQUITY UPLC 시스템과 연결된 Quattro Premier XE MS 모델을 사용하였으며 데이터 처리는 Waters Masslynx 4.1 소프트웨어를 사용하였다.

(1) 분석조건

각각의 분석조건은 하기와 같다.

- UPLC 조건

컬럼 : ACQUITY BEH C8(2.1mm × 50mm, 1.7μm)

- 이동상:

A : 5mM 암모늄 포메이트/메탄올(3/7, 0.1% 포름산)

B : 메탄올 내의 5mM 암모늄 포메이트/이소프로판올(7/3, 0.1% 포름산)

UPLC-MS의 이동상 조건

시간(분)	이동상 (%)		커브
시간(분)	A	B	커브
0	20	80	6
0.5	20	80	6
2.5	0	100	6
4.5	0	100	6
6.0	20	80	1

유속 : 0.35mL/분

주입 부피 : 5μL

컬럼 온도 : 50℃

자동시료주입기 트레이 온도 : 4℃

위크 니들 세척(Weak needle wash) : 70% 메탄올

스트롱 니들 세척(Strong needle wash) : 100% 메탄올

MS 분석조건

이온화 모드	ESI 양이온 모드
공급원 온도 (℃)	120
탈용매화 온도 (℃)	350
탈용매화 기체 유속 (L/h)	800
콘 가스(Cone gas) 유속 (L/h)	100
모세관 전압 (kV)	3.2
배율기	700
이온 모니터(Ion monitored)	MRM
충돌 기체(아르곤) 유속 (mL/분)	0.25

MRM 파라미터

세라마이드류	선택 이온 (m/z)^a	콘 전압 (V)	충돌 에너지
C12Cer(IS)	482.3 > 264	20	18
C16Cer	538.4 > 264	20	20
C18:1Cer	564.6 > 264	20	20
C18Cer	566.3 > 264	20	22
C20Cer	594.5 > 264	20	25
C24:1Cer	648.6 > 264	20	22
C24Cer	650.5 > 264	22	25
C16SM	703.6 > 184	20	24
C18SM	731.6 > 184	20	24

^a MRM에 대하여 선택된 이온, 부모 이온 > 토막 이온

(2) 내부표준액, 표준액의 제조

내부표준액은 C12Cer으로 하였으며 표준품을 1000㎍/mL의 농도가 되도록 하여 메탄올/CHCl₃(2:1)혼합액에 녹인 다음 20ng/mL의 농도가 되도록 메탄올 /CHCl₃(2:1)혼합액으로 희석하여 내부표준액으로 사용하였다.

세라마이드 표준액은 CER[NS](C12Cer, C16Cer, C18Cer, C18:1Cer, C20Cer, C24Cer, C24:1Cer) 및 스핑고미엘린(C16SM, C18SM)의 각 표준품 5mg 씩을 정밀하게 달아 메탄올/CHCl₃(2:1)혼합액에 녹여 농도가 1000㎍/mL이 되도록 한 후 각 표준액 100μL 씩을 취하여 농도가 100㎍/mL로 되도록 하여 표준혼합원액으로 하였다. 표준혼합원액을 이용하여 검량선(1, 5, 10, 20, 50, 100, 250ng/mL) 범위에 맞게 희석하여 표준액으로 하였다.

[실시예 2] 8종 세라마이드 성분들의 동시분석법 검증

세라마이드 6종 CER[NS](C12Cer(내부표준물질), C16Cer, C18Cer, C18:1Cer, C20Cer, C24Cer, C24:1Cer) 및 스핑고미엘린(C16SM, C18SM) 동시분석법을 검증하고자 특이성(Specificity), 직선성(Linearity), 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)에 대한 실험을 하기와 같이 실시하였다.

1) 특이성 (Specificity, selectivity)

크로마토그램상 분석대상물질의 피크가 다른 방해물질로부터 충분히 분리되어 정확히 측정될 수 있는지를 표준액, 블랭크(공 D-squame 테이프 추출액)시료와 검액을 분석한 크로마토그램으로부터 확인하였다. CER[NS] 7종 이온들의 피크와 스핑고미엘린(C16SM, C18SM) 2종의 이온피크가 다른 성분의 방해 없이 잘 검출됨을 확인하였다(도 1).

2) 직선성

상기 8종 세라마이드 성분들의 함량 실험시의 정량 농도 범위의 직선성을 알아보기 위해 표준액(사용용매는 클로로포름:메탄올=1:2의 부비피)을 농도별로 제조하여 성분들 각각의 농도와 신호의 세기를 이용하여 검정곡선을 작성하였고, 이 중 C16cer에 대한 결과를 도 2에 나타내었다. 각 성분별 상관관계 계수는 0.99 이상으로 직선성을 확인하였다. 각 성분에 대한 상관관계 계수(R²)는 표 5에 나타내었다.

3) 검출한계(LOQ) 및 정량한계(LOD)

정량한계 및 검출한계는 각 피크의 S/N 비를 비교하여 검출한계는 S/N = 3, 정량한계는 S/N = 10을 기준으로 하여 산출하였다. 각 성분별로 0.2~0.5ng/mL(S/N 비 =10), 검출한계는 0.1~0.2ng/mL(S/N 비 = 3)이었으며, 이는 표 5에 나타내었다.

세라마이드류	정량한계(ng/mL)	검출한계(ng/mL)	직선성(R²)
C12 Cer(IS) C16 Cer C18:1 Cer C18 Cer C20 Cer C24:1 Cer C24 Cer SM C16 SM C18	- 0.3 0.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2	- 0.1 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1	- 0.9980 0.9956 0.9936 0.9936 0.9944 0.9952 0.9962 0.9944

[실시예 3] 경피수분증발량(TEWL) 측정 및 각질 채취

건강한 지원자 34명을 각각 20명, 14명씩 두 군으로 나누어 피부보습능을 TEWL(Trans-epithelial Water Loss)로 측정하여 평가한 후 동일 부위의 피부각질을 채취하였다. 시험부위는 전박 내측면에 반지름 1.1cm의 원형 한곳을 정하여 측정하였다. 측정방법으로는 전박 내측을 비누로 세척하고 항온항습실(온도 24±2℃, 상대습도 40±2%)에서 20분간 적응한 후 각 측정부위를 3회 측정하였으며 측정시 프로브는 피부 표면에서 수직이 되도록 접촉하였다. 측정값은 단위면적당 증발되는 수분량(g?m²/h)으로 표시하였다. 경피수분증발량(TEWL) 측정 후 D-squame 표준 테이프를 부착하여 같은 부위에서 10장의 테이프를 사용하여 연속적으로 각질을 채취하였다.

[실시예 4] 각질시료중 세라마이드 분석

(1) 각질시료 중 단백질량 분석

각 테이프 한 장씩을 각각 이등분하여 1/2장의 각질 시료 테이프를 이용하여 단백질 정량에 사용하였다. 이등분한 테이프 5장씩을 20mL 유리 바이알에 넣고 0.1%(w/v) 소듐 도데실 셀퍼이트/2%(w/v) 프로필렌 글리콜 PBS 버퍼 용액 5mL를 넣어 실온에서 60분간 교반추출한 후 1mL를 취하여 원심분리(12,000rpm, 4℃, 5 분)하여 상등액을 검액으로 하였다. 정량용 표준품은 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석 키트의 BSA를 사용하여 25~500㎍/mL의 검량선용 표준액을 제조하였다. 시료 및 표준액 각 25μL씩을 취하여 BCA 단백질 분석법을 이용하여 단백질량을 분석하였다.

(2) 각질시료 중 세라마이드 분석

나머지 1/2장의 각질 시료 테이프를 이용하여 각질시료 중 세라마이드 분석에 사용하였다. 이등분한 테이프 5장씩을 20mL 유리 바이알에 넣고 메탄올/CHCl₃ (2:1)혼합액 4.8mL 및 20ng/mL의 내부표준액(C12Cer) 200μL(최종농도 12ng/mL)를 넣어 실온에서 30분간 교반추출한 다음 상등액 3mL를 취하여 농축기(speedvac)를 이용하여 40℃, 30분간 감압 건조하였다. 건조된 시료는 메탄올 100μL를 넣어 재용해 후 5분간 흔들어준 다음 원심분리(12,000rpm, 4℃, 5분)하고 상등액을 검액으로 하여 UPLC-MS/MS로 분석하여 세라마이드 함량 결과를 얻었으며 각질중 단백질양으로 보정하였다.

각 함량 결과는 도 3에 표시하였다. 세라마이드 함량 결과를 표준화하기 위하여 전체 CER[NS]양으로 세라마이드 함량을 나누어 세라마이드 비(Ratio)를 얻었으며 각 표준편차가 상당히 줄어들었음을 확인하였다(도 4). C18SM의 경우 정량한계 이하 또는 거의 검출되지 않아 함량결과에서 제외하였다.

[실시예 5] 통계분석

(1) 피어슨(Pearson’s) 상관분석

상관관계 분석(correlation analysis)은 변수간의 관계의 정도와 방향을 파악하는 것으로 변수의 관계 정도는 관계성의 강도라 할 수 있다. 상관은 상관계수(correlation coefficient, r)로 표시하며 상관계수 r이 크다는 것은 두 변수가 강한 관계성이 있다는 것을 의미한다. 상관계수의 절대값이 높을수록 두 변수간의 관계가 높다고 할 수 있으나 계수의 절대값이 작다고 해서 그 가치가 중요하지 않다고는 말할 수 없다. 보통 일반적인 통계분석에서는 상관계수 값이 ±0.7~0.9 인 경우 ‘상관관계가 높다’, ±0.4~0.7인 경우 ‘상관관계가 있다’ 라고 볼 수 있으나 생물학적 데이터의 통계처리시 ±0.6 이상이면 상관관계가 높은 것으로 해석할 수 있다.

세라마이드 함유비와 TEWL과의 상관성을 피어슨(Pearson’s) 분석법으로 평가하였다. C18Cer는 양의 상관관계(Pearson’s Coef = 0.414, p = 0.07)를, C20Cer는 강한 음의 상관관계(Pearson’s Coef = -0.747, p = 0.00)를 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 5 및 6). 각 성분에 대한 상관관계 결과를 표 6에 나타내었다.

세라마이드류	피어슨 계수
C16 Cer C18:1 Cer C18 Cer C20 Cer C24:1 Cer C24 Cer SM C16	0.262 0.02 0.414 -0.747 -0.346 -0.306 -0.117

(2) 주성분 분석(Principle Component Analysis, PCA)

주성분 분석이란 다차원 변수들을 축소, 요약하는 차원의 단순화와 더불어 일반적으로 서로 상관되어 있는 변수 상호간의 복잡한 구조를 분석하는 것이 그 목적이다. 원데이타(raw data)에 p개의 변수가 있을 때 p보다 작은 k개의 주성분으로 전체변동 중 상당 부분을 설명할 수 있으며 축소된 주성분을 통해 자료를 해석하여 원데이타에서 나타나지 않은 새로운 관계들을 찾을 수 있는 통계방법이다. 이를 위하여 주성분 분석은 변수들을 변환시켜, 주성분이라는 서로 독립적인 새로운 변수를 유도한다. 이때 각 주성분이 보유하는 변이의 크기를 기준으로 그 중요도의 순서를 생각할 수 있는데, 그들 중 첫 소수 몇 개의 주성분에 의해 원래 데이터에 내재하는 전체변이 중 가능한 많은 부분이 보유되도록 변환시킨다. 즉, 상관구조를 파악, 중복되는 정보를 분리, 차원의 축소, 변수구조의 단순화(해석적인 구조)를 통해 모집단이나 시스템에서 의미있는 결과를 도출하여 현상을 이해하는 것이다.

각 세라마이드 함유비와 TEWL의 관계를 알아보기 위하여 세라마이드 함유비를 주성분 분석법(Principle Component Analysis, PCA)을 통해 분석하였으며 Minitab 14 프로그램을 사용하여 통계처리 하였다. 각 세라마이드 함유비들의 PCA 분석을 통해 얻어진 주성분1(PC1)은 세라마이드 함유비의 전체 변동(Variance)의 51%, 주성분2 (PC2)는 16% 기여하여 PC1과 PC2가 전체 변동의 68%를 설명하는 것으로 나타났다. 각 지원자들의 세라마이드 함유비에 대한 PC1과 PC2의 상관도를 그려보았을 때(도7) PC1으로서 TEWL이 낮은 지원자들과 높은 지원자들이 대략적으로 구분될 수 있음을 알 수 있었다. 주목할 점은 짧은 사슬의 CER[NS](C16Cer 및 C18Cer)는 주성분1(PC1)에 양(positive)의 관계로, 긴 사슬의 CER[NS](C20Cer, C24Cer 및 C24:1Cer)는 음(negative)의 관계로 기여함을 확인하였다(도 8). C18:1Cer는 매우 약한 양의 관계로, 스핑고미엘린 C16SM은 약한 음의 관계로 확인되어 상관성에 영향력이 적은 것으로 확인되었다.

이는 상대적으로 짧은 지방산을 갖는 세라마이드는 높은 극성으로 인해 보습에는 부정적인 효과를, 긴 지방산을 갖는 세라마이드는 낮은 극성으로 인해 긍정적인 효과를 발휘할 수 있기 때문으로 사료된다. 이는 긴 지방산 사슬 구조의 세라마이드는 분자들 사이의 강한 반데르발스힘을 생성하여 더 단단한 분자 스태킹(molecular stacking)을 형성할 수 있다는 이전의 연구 결과와도 일치한다(Munoz-Garcia et al 2008, Novotny et al 2009).

1차 20명의 시료분석을 통해 얻어진 주성분1(PC1)의 계수를 이용하여 도출된 결과를 확인하기 위하여 추가적으로 14명의 각질 시료를 분석하였다. 각 세라마이드 CER[NS] 함유비를 계산하여 얻어진 PC1과 TEWL과의 상관관계를 평가해 본 결과 이전 시험과 마찬가지로 유사한 유의적 상관관계를 얻을 수 있었으며 긴 사슬의 CER[NS](C20Cer)는 강한 음의 상관관계가 있음을 확임함으로써 앞에서 얻은 결론을 재확인할 수 있었다(Pearson’s coeff.= -0.598, p = 0.024, 도10).

상기 결과를 통해 피부 각질 내 존재하는 세라마이드류 중 상대적으로 짧은 지방산을 갖는 세라마이드인 C16Cer 및 C18Cer의 함량이 많으면 피부 보습력이 저하되지만, 상대적으로 긴 지방산을 갖는 세라마이드인 C20Cer, C24Cer 및 C24:1Cer의 함량이 많으면 우수한 피부 보습력을 갖는 것으로 평가할 수 있다.

또한, 상기한 바와 같이 피부 보습력에 대하여 세라마이드류 중 C16Cer 및 C18Cer는 양의 관계, C20Cer, C24Cer 및 C24:1Cer은 음의 관계로 기여하며, 특히 C20Cer는 강한 음의 상관관계를 갖는다. 또한 C18:1Cer는 매우 약한 양의 관계로, C16SM은 약한 음의 관계로 기여하므로, 피부 내에 존재하는 전체 세라마이드의 함량보다는 존재하는 세라마이드의 종류의 함유비가 보습력에 직접적으로 영향을 미친다.

따라서, 본 발명은 세라마이드의 종류에 따라서 가지는 피부 보습력과의 상관관계를 제시함으로써 피부 내에 존재하는 세라마이드의 전체 양을 측정하는 것보다 훨씬 정확한 피부 보습력 측정 방법을 제공할 수 있다.

Claims

a) 피험자 피부 각질 시료를 수득하는 단계;
b) 상기 수득된 각질 시료의 경피수분증발량(TEWL)을 측정하는 단계;
c) 크로마토그램을 이용하여 상기 단계 a)에서 수득된 각질 시료 내 포함된 8종 세라마이드(C16Cer, C18Cer, C18:1Cer, C20Cer, C24Cer, C24:1Cer, C16SM 및 C18SM)의 각 함량을 측정하는 단계;
d) 통계분석을 통해 상기 경피수분증발량(TEWL) 및 각 세라마이드 함량과의 상관관계 함수를 도출하는 단계; 및
e) 상기 도출된 상관관계 함수를 이용하여, 피부 보습력 평가 대상자의 피부 각질 내 세라마이드 함량으로부터 대상자의 피부 보습력을 수치화하는 단계;
를 포함하는, 피부 내 보습력 평가 방법.
제 1항에 있어서, 상기 세라마이드 함량 측정은 UPLC-MS/MS-ESI를 이용하여 이루어지는 방법.
1) 피부 각질 시료를 수득하여 상기 수득된 각질 시료 내 포함된 세라마이드 중 C12 내지 C18의 짧은 사슬 세라마이드 및 C20 내지 C30의 긴 사슬 세라마이드의 각 함량을 측정하는 단계;
2) 피부에 시험 대상 화장료를 도포한 후 피부 각질 시료를 수득하여 수득된 각질 시료 내 포함된 세라마이드 중 C12 내지 C18의 짧은 사슬 세라마이드 및 C20 내지 C30의 긴 사슬 세라마이드의 각 함량을 측정하는 단계; 및
3) 상기 1) 단계 및 2) 단계에서 측정한 C12 내지 C18의 짧은 사슬 세라마이드 및 C20 내지 C30의 긴 사슬 세라마이드의 각 함량 변화로부터 도포된 화장료의 보습력을 결정하는 단계;
를 포함하는, 보습력을 상승시키는 화장료의 스크리닝 방법.