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KR20110081862A - 축삭 변성의 조절 - Google Patents

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KR20110081862A
KR20110081862A KR1020117011606A KR20117011606A KR20110081862A KR 20110081862 A KR20110081862 A KR 20110081862A KR 1020117011606 A KR1020117011606 A KR 1020117011606A KR 20117011606 A KR20117011606 A KR 20117011606A KR 20110081862 A KR20110081862 A KR 20110081862A
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KR
South Korea
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antibody
dlk
neurons
protein
antibodies
Prior art date
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Application number
KR1020117011606A
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English (en)
Inventor
라이언 와츠
마크 첸
조세프 웨슬리 류콕
크리스틴 포즈니악
아룬드하티 센굽타-고쉬
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 일반적으로 신경학적 장애 및 신경계 손상의 치료에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 특정 표적 단백질의 조절자를 사용하여 뉴런 또는 이의 일부분, 예컨대 축삭의 변성을 조절하는 방법을 제공한다.

Description

축삭 변성의 조절{MODULATION OF AXON DEGENERATION}
본 발명은 일반적으로 신경학적 장애 및 신경계 손상의 치료에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 특정 표적 단백질 및 프로세스의 조절자의 뉴런 및 축삭 변성을 억제하는 방법에서의 용도에 관한 것이다.
뉴런 또는 축삭 변성은 신경계의 적절한 발달에서 중요한 역할을 하고, 근육위축성 측삭 경화증 (ALS), 알츠하이머(Alzheimer) 질환 및 파킨슨(Parkinson) 질환이 예를 들어 포함되는 다수의 신경변성 질환, 뿐만 아니라 뇌 및 척수에 대한 외상성 손상의 특징이다. 이러한 질환 및 손상은 환자 및 간병인에게 치명적이고, 또한 막대한 재정적 부담을 초래하여, 현재 연간 비용이 미국에서만 수천억을 넘는다. 이러한 질환 및 상태에 대한 대부분의 현재의 치료는 부적절하다. 많은 이같은 질환이 연령과 관련된다는 사실이 이러한 질환에 의해 생성되는 문제점들의 위급성에 더해지고 있고, 따라서 인구 통계가 변함에 따라 이들의 발병률이 급속히 증가하고 있다. 신경변성 질환 및 신경계 손상을 치료하는 것에 대한 효과적인 접근법의 개발이 매우 요구된다.
<발명의 요약>
본 발명은 뉴런 또는 이의 일부분 (예를 들어, 뉴런 세포체, 축삭, 또는 가지돌기)의 변성을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (i) 뉴런 또는 이의 일부분 내의 표적 단백질의 활성 또는 발현, 또는 (ii) 뉴런 또는 이의 일부분에서의 프로세스를 조절하는 작용제를 뉴런 또는 이의 일부분에 투여하는 단계를 수반한다.
본 발명의 방법이 표적으로 할 수 있는 단백질의 예로는 이중 류신 지퍼-보유 키나제 (DLK), 글리코겐 신타제 키나제 3β (GSK3β), p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (p38 MAPK), β-카테닌, 전사 인자 4 (TCF4), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K), 시클린-의존적 키나제 5 (cdk5), 아데닐릴 시클라제, c-Jun N-말단 키나제 (JNK), BCL2-회합 X 단백질 (Bax), Ih 채널, 칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 키나제 (CaMKK), G-단백질, G-단백질-커플링 수용체, 전사 인자 4 (TCF4), 또는 β-카테닌이 포함되는 한편, 표적으로 할 수 있는 프로세스의 예는 전사 및 단백질 합성이다.
뉴런 또는 이의 일부분은 소뇌 과립 뉴런, 후근 신경절 뉴런, 피질 뉴런, 교감신경 뉴런, 및 해마 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴런으로 구성될 수 있거나, 또는 이러한 뉴런 내에 있을 수 있다.
작용제는, 예를 들어, 표적 단백질 또는 프로세스의 억제제일 수 있다. 추가로, 작용제는, 예를 들어, 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티바디(peptibody), 핵산 분자, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 폴리뉴클레오티드, 압타머(aptamer), 소분자, 및 폴리사카라이드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 항체의 경우, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 또는 항체 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', 또는 F(ab')2 단편)일 수 있다. 소분자의 경우, 작용제는, 예를 들어, MG132, SB 415286, GSK3β 억제제 I, GSK3β 억제제 VII, GSK3β 억제제 VIII, GSK3β 억제제 XII, 염화리튬, SB 202190, SB 239063, SB 239069, SB 203580, SB 203580 HCl, AG 556, AG 555, AG 494, PD168393, 티르포스틴(Tyrphostin) B44, 티르포스틴 B42 (AG 490), LY 294022, 아니소마이신(Anisomycin), 시클로헥시미드(Cycloheximide), 로스코비틴(Roscovitine), 포르스콜린(Forskolin), NKH 477, 악티노마이신(Actinomycin) D, SP600125, 백스(Bax) 채널 차단제, ZD7288, STO-609, 보르테조미드, 디술피람, 파마피모드, 제피티닙, 에를로티닙, 라파티닙 디토실레이트, 데메클로시클린 히드로클로라이드, 젠타마이신 술페이트, 네오마이신 술페이트, 파로모마이신 술페이트, 및 이들의 제약상 허용되는 염으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
뉴런 또는 이의 일부분은 대상체, 예컨대 인간 대상체 내에 존재할 수 있다. 대상체는, 예를 들어, (i) 신경계의 장애, (ii) 신경계 외부에 1차 효과가 있는 질환, 상태 또는 치료법에 대해 2차적인 신경계의 상태, (iii) 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상, (iv) 통증, (v) 눈-관련 신경변성, (vi) 기억 상실, 및 (vii) 정신과 장애로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 상태에 걸렸거나 또는 이러한 질환 또는 상태가 발생할 위험이 있을 수 있다.
신경계의 장애의 예로는 근육위축성 측삭 경화증 (ALS), 삼차 신경통, 혀인두 신경통, 벨(Bell) 마비, 중증 근육무력증, 근육 퇴행위축, 진행성 근육 위축, 원발성 측삭 경화증 (PLS), 거짓 연수 마비, 진행성 연수 마비, 척수 근육 위축, 유전성 근육 위축, 추간판 증후군, 경추증, 얼기 장애, 흉곽 출구 파괴 증후군, 말초 신경병증, 포르피린증, 알츠하이머 질환, 헌팅톤(Huntington) 질환, 파킨슨 질환, 파킨슨-플러스 질환, 다계통 위축, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 루이체(Lewy body) 치매, 전두측두엽 치매, 탈수초성 질환, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth) 질환, 프리온 질환, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob) 질환, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커(Gerstmann-Straussler-Scheinker) 증후군 (GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 소 해면상 뇌병증, 픽(Pick) 질환, 간질, 및 AIDS 치매 복합증이 포함된다.
통증의 예로는 만성 통증, 섬유근육통, 척추 통증, 수근관 증후군, 암으로 인한 통증, 관절염, 좌골신경통, 두통, 수술로 인한 통증, 근육 연축, 요통, 내장 통증, 손상으로 인한 통증, 치통, 신경성 또는 신경병성 통증과 같은 신경통, 신경 염증 또는 손상, 대상포진, 추간판 탈출, 인대 파열, 및 당뇨병이 포함된다.
신경계 외부에 1차 효과가 있는 질환, 상태 또는 치료법에 대해 2차적인 신경계의 상태의 예로는 당뇨병, 암, AIDS, 간염, 신장 기능이상, 콜로라도 진드기 열, 디프테리아, HIV 감염, 나병, 라임 질환, 결절성 다발동맥염, 류머티스성 관절염, 사르코이드증, 쇼그렌 증후군, 매독, 전신성 홍반 루푸스, 및 아밀로이드증에 의해 야기되는 말초 신경병증 또는 신경통이 포함된다.
물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상의 예로는 독성 화합물, 중금속, 공업용 용매, 약물, 화학치료제, 댑손, HIV 약제, 콜레스테롤 저하 약물, 심장 또는 혈액 압력 약제, 및 메트로니다졸에의 노출에 의해 야기되는 신경 손상이 포함된다. 추가적인 예로는 화상, 상처, 수술, 사고, 허혈, 저온에의 장기 노출, 졸중, 두개내 출혈, 및 뇌 출혈이 포함된다.
정신과 장애의 예로는 정신분열증, 망상 장애, 정신분열정동 장애, 정신분열형 장애, 공유 정신병적 장애, 정신병, 편집성 인격 장애, 분열성 인격 장애, 경계성 인격 장애, 반사회성 인격 장애, 자기애성 인격 장애, 강박 장애, 섬망, 치매, 기분 장애, 양극성 장애, 우울증, 스트레스 장애, 공황 장애, 광장공포증, 사회 공포증, 외상후 스트레스 장애, 불안 장애, 및 충동 조절 장애가 포함된다.
눈-관련 신경변성의 예로는 녹내장, 격자 이영양증, 색소성 망막염, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 건식 또는 습식 AMD와 관련된 광수용체 변성, 기타 망막 변성, 시신경 드루젠, 시각 신경병증, 및 시신경염이 포함된다. 녹내장의 예로는 원발성 녹내장, 저안압 녹내장, 원발성 폐쇄각 녹내장, 급성 폐쇄각 녹내장, 만성 폐쇄각 녹내장, 간헐성 폐쇄각 녹내장, 만성 개방각 폐쇄 녹내장, 색소성 녹내장, 비늘 녹내장, 발육이상 녹내장, 속발성 녹내장, 수정체성 녹내장, 안내 출혈에 대해 속발성인 녹내장, 외상성 녹내장, 신생혈관 녹내장, 약물-유도 녹내장, 독성 녹내장, 및 안내 종양, 망막 박리, 눈의 중증 화학적 화상 및 홍채 위축과 관련된 녹내장이 포함된다.
본 발명의 방법에 따라, 뉴런 또는 이의 일부분을 작용제와 접촉시키는 단계는 작용제를 포함하는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 수반할 수 있다. 투여는, 예를 들어, 정맥내 주입; 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사; 또는 국소 또는 안구 적용에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 대상체에게 하나 이상의 추가적인 제약 작용제를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리되는 뉴런 또는 이의 일부분은 생체 외 또는 시험관 내에 존재한다 (예를 들어, 신경 이식편 또는 신경 이식물).
본 발명은 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 억제하는데 사용하기 위한 약제를 확인하는 방법을 또한 포함한다. 이러한 방법은 뉴런 또는 이의 일부분을 축삭 또는 뉴런 변성 분석법 (예를 들어, 항-신경 성장 인자 (NGF) 항체, 혈청 결핍/KCl 감소, 및 로테논 처리)에서 후보 작용제와 접촉시키는 단계를 수반한다. 대조군에 비해 후보 작용제의 존재 하에 뉴런 또는 이의 일부분의 변성 감소가 검출되는 것은 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 억제하는데 사용하기 위한 작용제의 확인을 지시한다. 후보 작용제는, 예를 들어, 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티바디, 핵산 분자, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 폴리뉴클레오티드, 압타머, 소분자, 및 폴리사카라이드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같은, 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 억제하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 작용제를 함유하는 제약 조성물 또는 키트를 또한 포함한다. 제약 조성물 및 키트는, 예를 들어, MG132, SB 415286, GSK3β 억제제 I, GSK3β 억제제 VII, GSK3β 억제제 VIII, GSK3β 억제제 XII, 염화리튬, SB 202190, SB 239063, SB 239069, SB 203580, SB 203580 HCl, AG 556, AG 555, AG 494, PDl 68393, 티르포스틴 B44, 티르포스틴 B42 (AG 490), LY 294022, 아니소마이신, 시클로헥시미드, 로스코비틴, 포르스콜린, NKH 477, 악티노마이신 D, SP600125, 백스 채널 차단제, ZD7288, STO-609, 보르테조미드, 디술피람, 파마피모드, 제피티닙, 에를로티닙, 라파티닙 디토실레이트, 데메클로시클린 히드로클로라이드, 젠타마이신 술페이트, 네오마이신 술페이트, 파로모마이신 술페이트, 및 이들의 제약상 허용되는 염으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 제약 조성물 및 키트는 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 임의적으로 포함할 수 있다. 추가로, 제약 조성물 및 키트는 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 억제하기 위한 방법에서의 조성물 또는 키트의 사용을 위한 설명서를 임의적으로 포함할 수 있다.
임의의 본 발명의 방법, 조성물 및 키트에서, 작용제는 DLK 신호전달 억제제 (예를 들어, 바람직하게는
Figure pct00001
,
Figure pct00002
,
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, 또는
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, 또는
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,
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, 또는
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의 서열을 예를 들어 포함하는, DLK를 표적으로 하는 siRNA 분자; 항체, 예컨대 항체 317, 항체 318, 항체 319, 항체 320, 항체 321, 항체 322,
Figure pct00009
의 JNK1 서열을 표적으로 하는 siRNA 분자,
Figure pct00010
또는
Figure pct00011
의 JNK2 서열을 표적으로 하는 siRNA 분자,
Figure pct00012
의 JNK3 서열을 표적으로 하는 siRNA, SP600125, JNKV 억제제, JNKVIII 억제제, SC-202673, SY-CC-401, SP600125, As601245, XG-102, 미리세틴, T278A DLK, S281A DLK, S152A DLK, 및 DLK의 류신 지퍼 도메인), GSK3β 억제제 (예를 들어, SB415287, GSK3β 억제제 I, GSK3β 억제제 VII, GSK3β 억제제 VIII, GSK3β 억제제 XII, 및 염화리튬), EGFR 경로 억제제 (예를 들어, 에를로티닙, 티르포스틴 B44, 티르포스틴 B42/AG490, AG555, AG494, PD168393, SB203580, SB239063, SB202190, SB239069, STO-609, 및 SP600125), 또는 G-단백질 억제제 (예를 들어, SCG292676 및 백일해 독소)일 수 있다.
임의의 상기 기술된 방법에서, 작용제의 투여는 신경계의 장애; 신경계 외부에 1차 효과가 있는 질환, 상태 또는 치료법에 대해 2차적인 신경계의 상태; 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상; 통증; 눈-관련 신경변성; 기억 상실; 또는 정신과 장애의 하나 이상 (예를 들어, 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 또는 10가지)의 증상에서의 10％ 이상의 감소 (예를 들어, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％; 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 이상, 또는 심지어 100％의 감소)를 초래한다. 이같은 증상의 비-제한적인 예로는 떨림, 느린 동작, 운동실조, 균형 상실, 우울증, 인지 기능 감소, 단기 기억 상실, 장기 기억 상실, 혼란, 성격 변화, 언어 곤란, 감각 인지 상실, 접촉 과민, 팔다리 무감각, 근육 쇠약, 근육 마비, 근육 경련, 근육 연축, 상당한 식습관 변화, 과도한 공포 또는 걱정, 불면증, 망상, 환각, 피로, 요통, 흉통, 소화 문제, 두통, 빠른 심박수, 어지러움, 시야 흐림, 시야의 그림자 또는 누락 영역, 변시증, 색각 장애, 밝은 빛에의 노출 후 시력 기능의 회복 감소, 및 시각적 대비 감도 상실이 포함된다.
임의의 상기 기술된 방법에서, 투여는 상기 작용제가 투여되지 않은 대조군 대상체 집단과 비교하여, 신경계의 장애; 신경계 외부에 1차 효과가 있는 질환, 상태 또는 치료법에 대해 2차적인 신경계의 상태; 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상; 통증; 눈-관련 신경변성; 기억 상실; 또는 정신과 장애가 발생할 가능성에서의 10％ 이상의 감소 (예를 들어, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 이상, 또는 심지어 100％의 감소)를 초래한다.
본 발명은 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 활성화하는 방법을 또한 제공한다. 이러한 방법은 (i) 뉴런 또는 이의 일부분 내의 표적 단백질의 활성, 또는 (ii) 뉴런 또는 이의 일부분에서의 프로세스를 조절하는 작용제를 뉴런 또는 이의 일부분에 투여하는 단계를 수반한다. 표적 단백질은, 예를 들어, 이중 류신 지퍼-보유 키나제 (DLK), 글리코겐 신타제 키나제 3β (GSK3β), p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (p38 MAPK), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K), 시클린-의존적 키나제 5 (cdk5), 아데닐릴 시클라제, c-Jun N-말단 키나제 (JNK), BCL2-회합 X 단백질 (Bax), Ih 채널, 칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 키나제 (CaMKK), G-단백질, G-단백질-커플링 수용체, 전사 인자 4 (TCF4), 또는 β-카테닌으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는 한편, 프로세스는, 예를 들어, 전사 및 단백질 합성일 수 있다. 추가로, 작용제는, 예를 들어, 표적 단백질 또는 프로세스의 활성화제일 수 있다 (아데닐릴 시클라제를 제외한, 상기 열거된 표적들에 대한 경우에서와 같이). 상기 기술된 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 활성화하는 방법에서, 표적 단백질의 조절은 GSK3β의 활성 또는 발현의 증가, β-카테닌의 활성 또는 발현의 감소, 및/또는 TCF4의 활성 또는 발현의 감소일 수 있다.
본 발명은 또한 인산화된 형태의 DLK에 특이적으로 결합하는 정제된 항체 (예를 들어, 항체 318, 항체 319, 항체 320, 항체 321, 또는 항체 322), 및 DLK 발현의 감소를 매개하는, 바람직하게는
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의 서열을 포함하는 억제성 핵산 (예를 들어, siRNA)을 또한 제공한다.
도 1은 뉴런을 20시간 동안 항-NGF 항체로 처리하는 것이 축삭 변성을 초래한다는 것을 나타낸다. 상부의 2개의 영상은 Tuj1 (뉴런 특이적 β-튜불린) 항체로 가시화된, 항-NGF 항체로 20시간 동안 처리된 뉴런 및 항-NGF 항체로 처리되지 않은 뉴런을 나타낸다. 하부의 2개의 영상은 액틴 항체로 가시화된, 50 ㎍/㎖ 항-NGF 항체와 함께 인큐베이션된 뉴런 또는 항-NGF 항체 없이 인큐베이션된 뉴런 (대조군)을 나타낸다.
도 2는 1시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간, 또는 16시간 동안 항-NGF 항체와 함께 배양된 뉴런에서의 염주(varicosity) 형태를 나타낸다.
도 3은 항-NGF 항체와 함께 16시간 동안 배양된 축삭에 신장된 미토콘드리아가 없음을 나타내고, 염주에서의 미토콘드리아의 축적을 나타낸다.
도 4는 0시간 내지 48시간 동안 항-NGF 항체와 함께 배양된 축삭에서, 미세관 네트워크가 액틴 또는 신경미세섬유 네트워크 전에 분해되지 않음을 나타낸다.
도 5는 뉴런 세포체로부터 절단된 축삭에서 일어나는 왈러 변성(Wallerian degeneration)을 나타내고 (상부 패널; 문헌 [Raff et al., Science 296(5569):868-871, 2002]), 대조군과 비교하여 저속 왈러 변성 (WldS) 돌연변이체에서 손상 후 축삭 변성에서 상당한 지연이 있음을 나타낸다 (하부 패널; 문헌 [Araki et al., Science 305(5686):1010-1013, 2004]).
도 6A-6D는 프로테아솜 억제제 및 GSK 억제제가 항-NGF 항체-기반 NGF 중단 분석법에서 축삭 변성을 방지한다는 것을 나타낸다.
도 7A-7D는 p38 MAPK 억제제 및 아데닐릴 시클라제 활성화제가 항-NGF 항체-기반 NGF 중단 분석법에서 축삭 변성을 방지한다는 것을 나타낸다.
도 8A-8D는 전사 억제제 및 EGFR 키나제 억제제가 항-NGF 항체-기반 NGF 중단 분석법에서 축삭 변성을 방지한다는 것을 나타낸다.
도 9A-9D는 JNK 억제제 및 백스 채널 차단제가 항-NGF 항체-기반 NGF 중단 분석법에서 축삭 변성을 방지한다는 것을 나타낸다.
도 10A-10D는 Ih 채널 차단제 및 CAMKK 억제제가 항-NGF 항체-기반 NGF 중단 분석법에서 축삭 변성을 방지한다는 것을 나타낸다.
도 11은 NGF 중단 시점 (t = 0) 또는 NGF 중단 후 3시간, 6시간, 9시간 또는 12시간에 첨가된 GSK3 (30 μM SB415286), EGFR 키나제 (10 μM AG555), p38 MAPK (30 μM SB239063), CAMKK (15 μM STO-609), 및 JNK (10 μM SP600125)의 억제제의 활성을 나타내는 그래프이다.
도 12는 몸통 (세포체) 환경 및 축삭 환경이 분리된 캠페놋(Campenot) 챔버를 도해한다.
도 13은 축삭-함유 챔버에서 NGF 중단이 발생한 캠페놋 챔버 연구에서 축삭 변성이 국소화되고 아폽토시스 없이 진행된다는 것을 나타낸다. 튜불린 면역형광에 의해 변성이 가시화된다.
도 14는 도 13에 도해된 캠페놋 챔버-기반 분석법에서 세포체 구획에서 변성의 징후가 없음을 나타낸다.
도 15는 30 μM SB415 (GSK 억제제; GSKi) 또는 15 μM Act D (전사 억제제; TXNi)의 존재 하에 세포체 (왼쪽 패널)가 국소적인 변성으로부터 보호되었지만 축삭 (오른쪽 패널)은 그렇지 않았음을 나타낸다.
도 16은 10 μM AG555 (EGFR 억제제; EGFRi) 또는 30 μM SB239 (p38 억제제; p38i)의 존재 하에 항-NGF 항체에 노출된 축삭 (오른쪽 패널)이 국소적인 변성으로부터 보호되었지만, 세포체 (왼쪽 패널)는 그렇지 않았음을 나타낸다.
도 17은 축삭 환경 (축삭) 또는 몸통 환경 (세포) 내의 15 μM 악티노마이신 D (ActD), 30 μM SB415286 (SB415), 10 μM AG555, 또는 30 μM SB239063 (SB239)의 존재 또는 부재 (DMSO) 하에 축삭 환경에 항-NGF 항체가 첨가된 캠페놋 챔버에서의 축삭 변성의 정량을 나타내는 그래프이다.
도 18은 본원에 기술된 스크린으로부터의 데이터를 기초로 하는 모델이다.
도 19는 캠페놋 챔버 내의 축삭 구획으로부터 NGF가 제거되는 경우 세포체가 더 작게 보인다는 것을 나타낸다.
도 20은 축삭 구획 내의 NGF가 결핍된 다수의 뉴런이 카스파제(caspase)-3의 절단이 증가되고 핵 응축을 나타낸다는 것을 나타낸다. (뉴런 건강이 막 염색 DiI에 의해 영향을 받을 수 있다.)
도 21은 세포체 또는 축삭 구획 내의 NGF 중단 시작 (t = 0) 및 NGF 중단 1시간 후, 3시간 후, 6시간 후, 9시간 후 및 12시간 후의 GSK3 활성 (인산화된 GSK3β의 수준 감소에 의해 측정됨)을 나타내는 그래프이다.
도 22는 세포체 또는 축삭 구획 내의 NGF 중단 시작 (t = 0) 및 NGF 중단 1시간 후, 3시간 후, 6시간 후, 9시간 후 및 12시간 후의 JNK 활성 (인산화된 JNK의 수준 감소에 의해 측정됨)을 나타내는 그래프이다.
도 23은 세포체 억제제 (30 μM SB415 (GSKi) 및 15 μM Act D (TXNi))가 세포체 구획에 첨가되었을 때 다수의, 염주가 있는 축삭, 뿐만 아니라 단편화된 축삭이 관찰되었음을 나타낸다. 축삭 억제제 (10 μM AG555 (EGFRi) 및 30 μM SB239 (p38i))가 축삭 구획에 첨가되었을 때 더 적은 염주가 나타났고, 축삭이 단편화로 직행하는 것으로 보였다.
도 24는 GSK, EGFR 및 p38 억제제로 처리된 NGF-결핍 뉴런에서 더 많은 기능성 미토콘드리아가 있을 수 있지만, 신장된 미토콘드리아는 여전히 없음을 나타낸다.
도 25는 GSK 억제제 SB415가 손상 후 축삭 변성을 지연시킬 수 있음을 나타낸다.
도 26은 전반적인 NGF 중단 후 10 μM 또는 25 μM GSK 억제제가 축삭 변성을 차단하지만 세포 사망을 차단하지는 않는다는 것을 나타낸다.
도 27은 비-트랜스제닉(transgenic) 대조군 (NTG; 왼쪽 패널)과 비교하여, 항-EGFR 항체로 염색된 SOD1 마우스 (Tg) 척수의 절편 (오른쪽 패널)에서 EGFR 발현이 증가되는 것을 나타낸다.
도 28은 EGFR이 뉴런 (운동 뉴런)에서 정상적으로 발현된다는 것과 인산화된 EGFR (pEGFR)의 수준이 비-트랜스제닉 대조군 (비-Tg)과 비교하여 ALS SOD1 마우스 모델 (SOD1-Tg)에서 증가된다는 것을 나타낸다.
도 29는 축삭 개수가 비-트랜스제닉 대조군 (비-Tg)과 비교하여 ALS SOD1 마우스 모델 (SOD1-Tg)에서 감소된다는 것과 ALS SOD1 모델에서의 인산화된 EGFR (pEGFR)이 부분적으로 축삭과 공동-국소화된다는 것을 나타낸다.
도 30은 JNK (5 μM SP600125), CaMKK (5 μM STO-609), EGFR (1 μM 또는 10 μM AG555), p38 (5 μM SB239063), 및 GSK (10 μM SB415286)의 소분자 억제제가 혈청 결핍/KCl 감소로부터 소뇌 과립 뉴런을 보호한다는 것을 나타낸다.
도 31은 EGFR, GSK, CaMKK, JNK, 및 p38의 소분자 억제제가 10 μM 로테논에 대해 해마 뉴런을 보호한다는 것을 나타낸다.
도 32는 EGFR, GSK, CaMKK, JNK, 및 p38의 소분자 억제제가 10 μM 로테논에 대해 피질 뉴런을 보호한다는 것을 나타낸다.
도 33은 EGFR (상부 왼쪽 패널), Her2 (상부 오른쪽 패널), Her3 (하부 왼쪽 패널), 및 Her4 (하부 오른쪽 패널)에 대해 특이적인 항체를 사용하는 면역세포화학에 의해 후근 신경절 뉴런 내의 축삭 상에서 ErbB 수용체가 검출된다는 것을 나타낸다.
도 34는 면역세포화학을 사용하여 EGFR이 후근 신경절 뉴런의 축삭에서 발현된다는 것을 나타낸다.
도 35는 100 ㎍/㎖ EGF가 후근 신경절 뉴런에 첨가되는 경우 축삭 변성을 유도하지 않는다는 것과 100 ㎍/㎖ EGF의 첨가가 처리된 뉴런에서 ERK의 인산화를 유도한다는 것을 나타낸다.
도 36은 EGFR 엑토도메인(ectodomain) (50 ㎍/㎖)이 후근 신경절 뉴런에서 NGF 중단에 의해 유도된 축삭 변성을 차단하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 37은 3.4 μM, 11.1 μM, 33.3 μM, 및 100 μM 타르세바(Tarceva)® (에를로티닙)가 등쪽 척수 체외이식편에서의 변성을 차단한다는 것을 나타낸다.
도 38은 이중 류신 지퍼-보유 키나제 (DLK)가 축삭 변성에서 JNK의 상류에서 작용한다는 것을 나타낸다. 293 세포에서의 야생형 DLK를 코딩하는 플라스미드의 형질감염은 대조군 플라스미드 또는 키나제-데드(dead) DLK (DLK-KD)를 코딩하는 플라스미드로 허위-형질감염된 세포와 비교하여 JNK 활성화를 초래한다 (인산화된 JNK의 수준 증가에 의해 측정됨). 후근 신경절 뉴런에서의 siRNA에 의한 DLK 발현의 녹다운(knockdown)이 NGF 중단에 의해 유도되는 변성으로부터 축삭을 보호한다. DLK siRNA를 사용한 DLK 발현의 녹다운이 대조군 siRNA와 비교하여 정량적 PCR을 사용하여 확인되었다 (하부 오른쪽 패널).
도 39는 DLK 신호전달의 siRNA 녹다운이 국소적인 축삭 변성을 지연시킨다는 것을 나타낸다.
도 40A 및 40B는 뉴런을 가시화하도록 위상차 현미경검사를 사용하여 NGF 중단-유도 교감신경 뉴런 변성에 대한 DLK 녹다운의 영향을 평가하는 실험의 결과를 묘사한다.
도 41은 DLK siRNA (DLK)를 사용한 DLK 발현의 녹다운이 대조군 siRNA (NT)로 처리된 뉴런과 비교하여 캄프토테신- 및 빈크리스틴-유도 아폽토시스로부터 교감신경 뉴런을 보호한다는 것을 나타낸다.
도 42는 키나제-데드 DLK (KD)를 코딩하는 플라스미드로의 교감신경 뉴런의 형질감염이 야생형 DLK (DLK)를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 뉴런과 비교하여 NGF 중단-유도 아폽토시스로부터 뉴런을 보호한다는 것을 나타낸다.
도 43A-43D는 실시예 15A에 기술된 항-pDLK 항체들의 결합 특이성을 평가하는 실험의 결과를 나타낸다. 도 43A는 본원에 기술된 항-pDLK 항체 각각의 DLK, 우성 음성 DLK의 존재 하의 DLK, 및 대조군 키나제 MLK3에 대한 결합의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 나타낸다. 도 43B는 DLK (상부의 2개의 영상) 또는 대조군 키나제 MLK3 (하부의 2개의 영상)으로 형질감염된 배양된 293T 세포에 대한 항-pDLK 항체 318 및 319의 결합의 면역형광 현미경 영상을 나타낸다. 도 43C 및 43D는 JNK 및 포스포-JNK 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 44A 및 44B는 질환 말기 (도 43A) 및 증상 개시 (도 44B) 시의 야생형 및 SOD1 돌연변이체 마우스에서의 척수 절편에 대한 항-pDLK 항체 (항체 318)의 결합을 나타낸다. 도 44C는 인간 알츠하이머 질환 환자 피질 샘플 내의 pDLK, pJNK, 및 pcJUN 수준의 웨스턴 블롯 분석을 묘사한다.
도 45A 및 45B는 실시예 15C 및 실시예 14B에 기술된 바와 같이, 교감신경 뉴런 및 후근 신경절 뉴런에서의 NGF 중단 스트레스, 및 피질 뉴런에서의 빈크리스틴-유도 스트레스에 응답한 JNK의 인산화에 대한 DLK 침묵화의 영향을 평가하는 실험의 결과를 묘사한다.
도 46은 실시예 15C에 기술된 바와 같이, NGF 중단 스트레스에 적용된 DRG 체외이식편에 대한 JNK 억제제의 보호 효과를 나타낸다.
도 47은 실시예 15C에 기술된 바와 같이, NGF 중단 스트레스 시 관찰된 축삭 변성에 대한 DRG 뉴런에서 JNK1, JNK2, JNK3을 개별적으로, 그리고 JNK2 및 JNK3를 함께 침묵화시키는 것의 영향을 평가하는 실험의 결과를 묘사한다.
도 48A는 피질 뉴런의 생존에 대한 DLK siRNA 및 대조군 siRNA의 영향을 나타낸다. 도 48B는 교감신경 뉴런의 생존에 대한 DLK siRNA 및 대조군 siRNA의 영향을 나타낸다.
도 49는 DRG에서 NGF 중단-유도 변성을 방지하는 G-커플링 단백질 수용체의 억제제 (SCH 202676; 10 μM 또는 100 μM)의 능력을 나타내는 면역현미경사진 세트이다.
도 50은 DRG에서 NGF 중단-유도 변성을 방지하는 SCH 202676 (0.1 μM 또는 1 μM)의 능력을 나타내는 면역현미경사진 세트이다.
도 51은 DRG에서 NGF 중단-유도 변성을 방지하는 0.01 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 또는 1 ㎍/㎖ 백일해 독소 (G-단백질 신호전달의 억제제)의 능력을 나타내는 면역현미경사진 세트이다.
도 52는 변성에 대한 활성 돌연변이체 GSK (GSK3S9A), 야생형 TCF4, 및 불활성 돌연변이체 TCF4의 발현의 효과를 나타내는 래트 해마 뉴런의 면역현미경사진 세트이다.
A. 정의
용어 "표적"은 자신의 활성에 영향을 미치는 작용제에 의해 조절되는 경우 축삭 변성을 억제하거나 감소시키는 단백질 및 프로세스를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 대부분의 본원에 기술된 표적은 이의 활성을 억제하는 작용제와 접촉되는 경우 축삭 변성을 억제하거나 감소시키지만, 본 발명의 표적은 활성화되는 경우 축삭 변성을 억제하거나 감소시키는 단백질 및 프로세스를 또한 포함한다. 예시적인 본 발명의 표적은 하기와 같다: 이중 류신 지퍼-보유 키나제 (DLK), 글리코겐 신타제 키나제 3β (GSK3β), p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (p38 MAPK), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 포스포이노시티드 3 키나제 (PI3K), 시클린-의존적 키나제 5 (Cdk5), 아데닐릴 시클라제, c-Jun N-말단 키나제 (JNK), BCL2-회합 X 단백질 (Bax), Ih 채널, 칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 키나제 (CaMKK), G-단백질, G-단백질 커플링 수용체, 전사 인자 4 (TCF4), β-카테닌, 전사, 및 단백질 합성. 여러 이러한 표적에 대한 통상적인 별법적인 명칭의 선집이 표 1에 열거된다. 표적은 천연의 인간 서열, 및 이러한 서열의 원숭이, 마우스, 래트 및 기타 비-인간 포유동물로부터의 유사체 (모든 천연 발생 변이체, 예컨대 별법적으로 스플라이싱(splicing)된 변이체 및 이소형(isoform) 및 대립유전자 변이체 및 이소형, 뿐만 아니라 이들의 가용성 형태 포함)를 포함한다. 예시적인, 비-제한적인 참조 서열이 표 1에서 또한 제공된다. 다양한 표적 이소형, 변이체, 유사체 및 단편의 서열이 포함되는 추가적인 서열 또한 본 발명에 따라 표적으로 간주될 수 있다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
"단리된"은, 본원에 개시된 다양한 단백질을 기술하도록 사용되는 경우에, 이의 천연 환경의 성분으로부터 확인되어 분리 및/또는 회수된 단백질을 의미한다. 이의 천연 환경의 오염물 성분은 단백질에 대한 용도 (예를 들어, 치료법 또는 항체 생산에서의 용도)를 방해할 수 있는 물질이고, 여기에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 단백질은 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하는데 충분한 정도로, 및/또는 (2) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 균질성으로, 및/또는 (3) 질량분광법 기술 또는 펩티드 지도작성(mapping) 기술에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 단백질에는 재조합 세포 내의 원위치 단백질이 포함되는데, 이는 당해 단백질의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 단백질은 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. 본원에 기술된 바와 같은 단리된 표적 단백질 (또는 이의 단편)은 표적 단백질에 대한 본원에 기술된 바와 같은 항체를 제조하는데 사용될 수 있다.
"단리된" 핵산 분자는 당해 핵산의 천연 공급원 내에서 통상적으로 회합되는 1개 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 환경 이외의 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포 내에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 있는 경우, 이같은 핵산을 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함한다. 단리된 핵산 분자의 예는 천연 환경에서는 이와 연속적인 5' 및/또는 3' 플랭킹(flanking) 서열이 없는 핵산 분자이다.
본원에서 사용된 용어 "길항제" 및 "억제제"는 표적의 활성 중 하나 이상을 차단, 중화, 억제, 폐기, 감소 및/또는 방해할(시킬) 수 있고/있거나 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 표적 단백질의 발현 (또는 하나 이상의 표적 단백질을 코딩하는 핵산의 발현)을 감소시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. 이는, 예를 들어, 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산 분자, 짧은 간섭 RNA (siRNA) 및 기타 억제성 RNA, 소분자 (예를 들어, 소형 유기 분자), 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오티드, 압타머, 및 펩티바디를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 특정 표적 (즉, 아데닐릴 시클라제 이외의 표적)의 길항제 또는 억제제는 본원에 기술된 바와 같이 일반적으로 축삭 변성을 억제하거나 감소시킨다 (예를 들어, 억제제로 처리되지 않은 대조군과 비교하여 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 이상, 또는 심지어 100％의 감소). 억제제는 억제제로 처리되지 않은 표적 단백질의 발현 및/또는 활성과 비교하여 표적 단백질의 활성 및/또는 발현을 10％ 이상 만큼 감소시킬 수 있다 (예를 들어, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 심지어 100％의 감소). "DLK 신호전달 억제제"는 DLK 단백질 (또는 DLK 단백질을 코딩하는 핵산)의 활성 (예를 들어, 키나제 활성) 또는 발현을 감소시킬 수 있고/있거나 DLK 신호전달 경로에서 수반되는 하나 이상의 단백질 (예를 들어, JNK1, JNK2, JNK3, cJun (예를 들어, cJun-63 및 cJun-73), MKK4, 및 MKK7)의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있는 작용제이다. DLK 신호전달 억제제의 예로는 DLK (예를 들어, 바람직하게는,
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,
Figure pct00025
,
Figure pct00026
, 또는
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, 또는
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,
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,
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, 또는
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의 서열), JNK1 (예를 들어,
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의 JNK1 서열을 표적으로 하는 서열), JNK2 (예를 들어,
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또는
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의 JNK2 서열을 표적으로 하는 서열), JNK3 (예를 들어,
Figure pct00035
의 JNK3 서열을 표적으로 하는 서열), cJun (예를 들어, cJun-63 및 cJun-73), MKK4, 및 MKK7을 코딩하는 핵산의 발현을 감소시키는 siRNA 분자가 포함된다. DLK 억제제의 추가적인 예로는 DLK 단백질 (예를 들어, 인산화되지 않은 DLK 또는 인산화된 DLK를 인식하는 항체, 예컨대 본원에 기술된 317, 318, 319, 320, 321, 및 322 항체), JNK1, JNK2, JNK3, cJun (예를 들어, cJun-63 및 cJun-73), MKK4, 및/또는 MKK7에 결합하는 항체; JNK 활성의 억제제 (예를 들어, SC-202673, SY-CC-401, SP600125, JNKV 억제제, JNKVIII 억제제, AS601245, 및 XG-102, 뿐만 아니라 <EMD Biosciences>의 카탈로그 # 420119, 420130, 420131, 420123, 420116, 420118, 420136, 420129, 420135, 420134, 420133, 420140, 및 420128); MKK4 활성의 억제제 (예를 들어, 미리세틴 및 WO 04/058764에 기술된 억제제), 및 MKK7 활성의 억제제 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,195,894 및 WO 04/002532에 기술된 억제제)가 포함된다. 또한 DLK 억제제는 우성 음성 형태 또는 키나제-데드 형태의 DLK 단백질 (또는 우성 음성 형태 또는 키나제-데드 형태의 DLK 단백질을 코딩하는 핵산), 예컨대 T278A DLK, S281A DLK, S152A DLK, 및 DLK의 류신 지퍼 도메인일 수 있다.
억제제의 또 다른 예는 "GSK3β 억제제"이다. GSK3β 억제제는 GSK3β (또는 GSK3β를 코딩하는 핵산)의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있고/있거나 GSK3β를 활성화시키는 하나 이상의 단백질 (또는 이러한 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산)의 활성 및/또는 발현 또는 GSK3β의 하나 이상의 기질의 발현 또는 활성을 감소시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. GSK3β 억제제의 비-제한적인 예로는 SB415286, GSK3β 억제제 I, GSK3β 억제제 VII, GSK3β 억제제 VIII, GSK3β 억제제 XII, 및 염화리튬이 포함된다.
억제제의 추가적인 예는 "G-단백질 억제제"이다. G-단백질 억제제는 하나 이상의 G-단백질 또는 G-단백질-커플링 수용체 (GPCR)의 활성 및/또는 발현 (또는 G-단백질 또는 GPCR을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 발현)을 감소시킬 수 있고/있거나, G-단백질 또는 GPCR의 하류의 하나 이상의 단백질의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. G-단백질 억제제의 비-제한적인 예로는 G-단백질 또는 GPCR을 코딩하는 핵산의 발현 수준을 감소시키는 siRNA 분자, G-단백질 또는 GPCR에 결합하는 항체 또는 펩티바디, 또는 G-단백질 또는 GPCR의 활성을 억제하는 소분자 또는 펩티드 (예를 들어, SCH202676 및 백일해 독소)가 포함된다.
억제제의 또 다른 예는 "EGFR 경로 억제제"이다. EGFR 경로 억제제는 EGFR 단백질 (또는 EGFR을 코딩하는 핵산)의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있고/있거나, 세포 내에서 EGFR의 하류에서 기능하는 하나 이상의 단백질 (예를 들어, p38 MAPK, CAMKK, 및 JNK)의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. EGFR 경로 억제제의 비-제한적인 예로는 EGFR의 억제제 (예를 들어, 에를로티닙, 티르포스틴 B44, 티르포스틴 B42/AG 490, AG555, AG494, 및 PD168393), p38 MAPK의 억제제 (예를 들어, SB203580, SB239063, SB202190, 및 SB239069), CAMKK의 억제제 (예를 들어, STO-609), 및 JNK의 억제제 (예를 들어, SP600125)가 포함된다. EGFR 경로 억제제의 추가적인 예로는 EGFR, p38 MAPK, CAMKK, 및/또는 JNK에 결합하는 항체 및 펩티바디; 및 세포 내에서 EGFR의 하류에서 기능하는 단백질 (예를 들어, EGFR, p38 MAPK, CAMKK, 및/또는 JNK)을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 발현을 감소시키는 siRNA 분자가 포함된다.
억제제의 추가적인 예는 "CAMKβ 억제제"이다. CAMKβ 억제제는 CAMKβ 단백질 (또는 CAMKβ를 코딩하는 핵산)의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있고/있거나 세포 내에서 CAMKβ의 하류에서 기능하는 하나 이상의 단백질의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. CAMKβ 억제제의 비-제한적인 예로는 CAMKβ에 특이적으로 결합하는 항체 및 펩티바디, 및 CAMKβ 또는 CAMKβ의 하류에서 기능하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 발현을 감소시키는 siRNA 분자가 포함된다.
억제제의 또 다른 예는 "cdk5 억제제"이다. cdk5 억제제는 cdk5 단백질 (또는 cdk5를 코딩하는 핵산)의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있고/있거나 세포 내에서 cdk5의 하류에서 기능하는 하나 이상의 단백질의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. cdk5 억제제의 비-제한적인 예로는 cdk5에 특이적으로 결합하는 항체 및 펩티바디, 및 cdk5 또는 cdk5의 하류에서 기능하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 발현을 감소시키는 siRNA 분자가 포함된다.
억제제의 추가적인 예는 "TCF4 억제제"이다. TCF4 억제제는 TCF4 단백질 (또는 TCF4를 코딩하는 핵산)의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있고/있거나 TCF4 단백질에 의해 조절되는 유전자의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. TCF4 억제제의 비-제한적인 예로는 TCF4 또는 TCF4에 의해 조절되는 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 펩티바디, 및 TCF4를 코딩하는 하나 이상의 핵산의 발현을 감소시키거나 TCF4에 의해 조절되는 유전자에 의해 코딩되는 mRNA의 발현을 감소시키는 siRNA 분자가 포함된다.
억제제의 추가적인 예는 "β-카테닌 억제제"이다. β-카테닌은 β-카테닌 단백질 (또는 β-카테닌을 코딩하는 핵산)의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있고/있거나 β-카테닌 단백질에 의해 조절되는 유전자의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. β-카테닌 억제제의 비-제한적인 예로는 β-카테닌 또는 β-카테닌에 의해 조절되는 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 펩티바디, 및 β-카테닌을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 발현을 감소시키거나 β-카테닌에 의해 조절되는 유전자에 의해 코딩되는 mRNA의 발현을 감소시키는 siRNA 분자가 포함된다.
억제제의 추가적인 예는 "아데닐 시클라제 억제제"이다. 아데닐 시클라제 억제제는 아데닐 시클라제 단백질 (또는 아데닐 시클라제를 코딩하는 핵산)의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있고/있거나 세포 내에서 아데닐 시클라제 단백질의 하류에서 기능하는 하나 이상의 단백질의 활성 및/또는 발현을 감소시킬 수 있는 작용제를 지칭한다. 아데닐 시클라제 억제제의 비-제한적인 예로는 아데닐 시클라제에 특이적으로 결합하는 항체 및 펩티바디, 및 아데닐 시클라제 또는 아데닐 시클라제의 하류에서 기능하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 발현을 감소시키는 siRNA 분자가 포함된다. 아데닐 시클라제 억제제의 추가적인 예로는 아데닐 시클라제의 활성을 억제하는 소분자 (예를 들어, 포르스콜린 및 NKH 477)가 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "효능제" 또는 "활성화제"는 본원에 기술된 바와 같은 표적의 활성 중 하나 이상을 증가 또는 활성화시킬 수 있는 작용제를 지칭하고, 예를 들어, 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산 분자, 짧은 간섭 RNA (siRNA) 또는 기타 억제성 RNA, 소분자 (예를 들어, 소형 유기 분자), 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오티드, 압타머, 및 펩티바디를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 아데닐릴 시클라제의 효능제 또는 활성화제는 일반적으로 축삭 변성을 억제하거나 감소시키는 한편, 본원에 기술된 다른 특정 표적들의 효능제 또는 활성화제는 축삭 변성을 활성화시키는 것으로 간주될 수 있다.
본원에서의 용어 "항체"는 당업계에서 이해되는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로, 예를 들어, 무손상 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일특이적 항체, 2개 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 항체 단편 (단, 이는 원하는 생물학적 활성을 나타냄), 및 인트라바디(intrabody)를 포함한다
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위 또는 에피토프에 대해 지시되어 고도로 특이적이다. 또한, 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 오염되지 않도록 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 항체들의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 가리키고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는, 예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991] 및 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991]에 기술된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 또한 단리될 수 있다.
항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 이같은 항체의 단편 (단, 이는 원하는 생물학적 활성을 나타냄)을 명확하게 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984]). 본원에서 관심 대상인 키메라 항체에는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구대륙 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 영장류화(primatized) 항체가 포함된다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부분, 예컨대 이의 항원-결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; 및 단일쇄 항체 분자가 포함된다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, VH VL 단위가 다중에피토프(polyepitopic) 특이성이 있는 (즉, 하나 이상의 생물학적 분자 상의 1개를 초과하는 상이한 에피토프들에 결합할 수 있는), 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항체를 명확하게 포함한다. 다중특이적 항체가 2개의 에 에피토프에 결합한다면, 이는 "이중특이적 항체"로 명시될 수 있다. 다중특이적 항체에는 전장 항체, 2개 이상의 VL 및 VH 도메인이 있는 항체, 항체 단편 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디(triabody), 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 연결된 항체 단편들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. "다중에피토프 특이성"은 동일하거나 상이한 표적(들) 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 지칭한다.
"무손상" 항체는 항원-결합 가변 영역, 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 한 예에서, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성 및 친화력이 있는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종의 초가변 영역 (공여자 항체)으로부터의 잔기로 교체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 정련시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고 (Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv), 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 임의적으로, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. 추가적인 상세사항에 대해, 예를 들어, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525, 1986]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329, 1988]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992] 참조.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 서열 면에서 초가변성이고/이거나 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34, 50-56 및 89-97 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35, 50-65 및 95-102; 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32, 50-52 및 91-96 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32, 53-55 및 96-101; 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987])를 포함한다. 양쪽 모두의 경우에, 가변 도메인 잔기는 하기에 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 번호가 매겨진다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 내의 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"어버이 항체" 또는 "야생형" 항체는 본원에 개시된 바와 같은 항체 변이체와 비교하여 하나 이상의 아미노산 서열 변경이 없는 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 따라서, 일반적으로 어버이 항체는 항체 변이체의 상응하는 초가변 영역의 아미노산 서열과 아미노산 서열 면에서 상이한 하나 이상의 초가변 영역을 갖는다. 어버이 폴리펩티드는 천연 서열 (즉, 천연 발생) 항체 (천연 발생 대립유전자 변이체 포함), 또는 천연 발생 서열의 선재성 아미노산 서열 변형 (예컨대 삽입, 결실 및/또는 기타 변경)이 있는 항체를 포함할 수 있다. "야생형", "WT", "wt", 및 "어버이" 또는 "어버이의" 항체라는 용어들은 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "항체 변이체" 또는 "변이체 항체"는 아미노산 서열이 어버이 항체의 아미노산 서열과 상이한 항체를 지칭한다. 한 예에서, 항체 변이체는 천연에서 발견되지 않는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이같은 변이체는 어버이 항체와의 서열 동일성 또는 유사성이 반드시 100％ 미만이다. 한 실시양태에서, 항체 변이체의 아미노산 서열은 어버이 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 중 하나의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성이 약 75％ 내지 100％ 미만, 예를 들어, 약 80％ 내지 100％ 미만, 약 85％ 내지 100％ 미만, 약 90％ 내지 100％ 미만, 또는 약 95％ 내지 100％ 미만일 것이다. 일반적으로 항체 변이체는 이의 하나 이상의 초가변 영역 내에 또는 이에 인접하여 하나 이상의 아미노산 변경을 포함하는 것이다.
"아미노산 변경"은 미리 결정된 아미노산 서열의 아미노산 서열에서의 변화를 지칭한다. 예시적인 변경에는 삽입, 치환 및 결실이 포함된다. "아미노산 치환"은 미리 정해진 아미노산 서열 내의 기존의 아미노산 잔기를 또 다른 상이한 아미노산 잔기로 교체하는 것을 지칭한다.
"교체" 아미노산 잔기는 아미노산 서열 내의 다른 아미노산 잔기를 교체하거나 치환하는 아미노산 잔기를 지칭한다. 교체 잔기는 천연 발생 아미노산 잔기 또는 비-천연 발생 아미노산 잔기일 수 있다.
"아미노산 삽입"은 미리 정해진 아미노산 서열 내로의 하나 이상의 아미노산 잔기의 도입을 지칭한다. 아미노산 삽입은 펩티드 결합(들)에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드가 미리 정해진 아미노산 서열 내로 도입되는 경우인 "펩티드 삽입"을 포함할 수 있다. 아미노산 삽입이 펩티드의 삽입을 수반하는 경우, 삽입된 펩티드는 천연에서 존재하지 않는 아미노산 서열을 갖도록 무작위 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. "초가변 영역에 인접한" 아미노산 변경은 삽입 또는 교체 아미노산 잔기(들) 중 하나 이상이 당해 초가변 영역의 N-말단 또는 C-말단 아미노산 잔기와 펩티드 결합을 형성하도록 하나 이상의 아미노산 잔기가 초가변 영역의 N-말단 및/또는 C-말단 끝부분에 도입 또는 치환되는 것을 지칭한다.
"천연 발생 아미노산 잔기"는 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신(Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 라이신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 구성된 군으로부터 일반적으로 선택되는, 유전자 코드에 의해 코딩되는 잔기이다.
본원에서 지칭된 "비-천연 발생 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 사슬 내의 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유결합으로 결합할 수 있는, 상기 열거된 천연 발생 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기이다. 비-천연 발생 아미노산 잔기의 예로는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, 및 기타 아미노산 잔기 유사체 예컨대 문헌 [Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336, 1991]에 기술된 것들이 포함된다. 이같은 비-천연 발생 아미노산 잔기의 생성을 위해, 문헌 [Noren et al., Science 244:182, 1989] 및 [Ellman et al., 상기 문헌]의 절차를 사용할 수 있다. 간략하게, 이러한 절차들은 비-천연 발생 아미노산 잔기로 억제인자 tRNA를 화학적으로 활성화시키는 것에 이은 RNA의 시험관내 전사 및 번역을 수반한다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 문헌 [Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 & 1991)]으로부터의 번호매김 시스템을 참조한다. 이러한 개론에서, 카밧(Kabat)은 각각의 서브클래스의 항체들에 대한 다수의 아미노산 서열을 열거하였고, 이러한 서브클래스 내의 각각의 잔기 위치에 대해 가장 통상적으로 발생하는 아미노산을 열거하였다. 카밧은 열거된 서열 내의 각각의 아미노산에 잔기 번호를 할당하는 방법을 사용하였고, 이러한 잔기 번호 할당 방법이 당업계에서 표준이 되었다. 본 명세서에서 카밧 번호매김 체계를 따른다. 본 발명의 목적을 위해, 카밧 개론에 포함되지 않은 후보 항체 아미노산 서열에 잔기 번호를 할당하기 위해, 하기의 단계들을 따른다. 일반적으로, 후보 서열을 카밧 내의 임의의 면역글로불린 서열 또는 임의의 컨센서스(consensus) 서열과 정렬한다. 수동으로, 또는 통상적으로 허용되는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 얼라인(Align) 2 프로그램을 사용하여 컴퓨터에 의해 정렬할 수 있다. 대부분의 Fab 서열에 공통적인 일부 아미노산 잔기를 사용하여 정렬을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 경쇄 및 중쇄 각각에는 잔기 번호가 동일한 2개의 시스테인이 있다; VL 도메인에서는 2개의 시스테인이 전형적으로 잔기 번호 23 및 88에 있고, VH 도메인에서는 2개의 시스테인 잔기가 전형적으로 22 및 92로 번호가 매겨진다. 항상은 아니지만 일반적으로 프레임워크 잔기에는 대략적으로 동일한 개수의 잔기가 있지만, CDR들은 크기가 변할 것이다. 예를 들어, 자신과 정렬된 카밧 내의 서열의 CDR보다 후보 서열로부터의 CDR이 더 긴 경우, 전형적으로 첨자가 잔기 번호에 부가되어, 추가적인 잔기의 삽입을 가리킨다. 예를 들어 잔기 34 및 36에 대해서는 카밧 서열과 정렬되지만, 이들 사이에는 잔기 35와 정렬된 잔기가 없는 후보 서열에 대해서는, 간단하게 번호 35가 잔기에 할당되지 않는다.
본원에서 사용된, "고-친화력"이 있는 항체는 KD 또는 해리 상수가 나노몰 (nM) 범위이거나 이보다 양호한 항체이다. "나노몰 범위 또는 이보다 양호한" KD는 X nM로 표시될 수 있고, 이때 X는 약 10 미만의 숫자이다.
용어 "필라멘트성 파지"는 이종성 폴리펩티드를 자신의 표면 상에 디스플레이할 수 있는 바이러스 입자를 지칭하고, 여기에는 f1, fd, Pf1, 및 M13이 비제한적으로 포함된다. 필라멘트성 파지는 선별성 마커 예컨대 테트라시클린 (예를 들어, "fd-tet")을 함유할 수 있다. 다양한 필라멘트성 파지 디스플레이 시스템이 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Zacher et al. Gene 9:127-140, 1980], [Smith et al. Science 228:1315-1317, 1985]; 및 [Parmley et al., Gene 73:305-318, 1988] 참조).
용어 "패닝(panning)"은 표적에 대한 높은 친화력 및 특이성이 있는 화합물, 예컨대 항체를 보유하는 파지의 확인 및 단리에서 사용되는 여러 회의 스크리닝 프로세스를 지칭하도록 사용된다.
용어 "짧은 간섭 RNA (siRNA)"는 유전자 발현을 간섭하는 소형 이중-가닥 RNA를 지칭한다. siRNA는 이중 가닥 RNA가 상동성 유전자를 침묵시키는 프로세스인 RNA 간섭의 매개물이다. 전형적으로 siRNA는 단일 가닥 오버행(overhang)(들)을 포함할 수 있는 듀플렉스(duplex)를 형성하는, 뉴클레오티드 약 15-25개 길이의 2개의 단일 가닥 RNA로 구성된다. 이중 가닥 RNA가 효소 복합체, 예를 들어, 중합효소로 프로세싱되면, 이중 가닥 RNA가 절단되어 siRNA가 형성된다. siRNA의 안티센스 가닥이 RNA 간섭 (RNAi) 침묵화 복합체에 의해 사용되어 mRNA 절단으로 안내함으로써, mRNA 분해를 촉진한다. 예를 들어 포유류 세포에서, siRNA를 사용하여 특정 유전자를 침묵시키기 위해, 관련되지 않은 mRNA에 대한 우연한 상보성을 피하도록 염기 쌍형성 영역이 선택된다. 예를 들어, 문헌 [Fire et al., Nature 391 :806-811, 1998] 및 [McManus et al., Nat. Rev. Genet. 3(10):737-747, 2002]에 의해, RNAi 침묵화 복합체가 당업계에서 확인되었다.
용어 "간섭 RNA (RNAi)"는 특정 mRNA의 촉매적 분해를 초래하고, 따라서 특정 유전자의 발현 억제/저하를 위해 사용될 수 있는 이중 가닥 RNA를 지칭하도록 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "장애"는 유효량의 본원에 기술된 표적의 억제제 (또는 아데닐릴 시클라제의 경우에는 활성화제)로 치료될 수 있는 임의의 질환 또는 장애가 포함되는, 본 발명의 작용제 또는 억제제로의 치료가 이로울 임의의 상태를 일반적으로 지칭한다. 본원에서 치료될 장애의 비-제한적인 예로는 하기의 본 출원의 섹션 E에서 열거되는 것들이 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "치료하는", "치료" 및 "치료법"은 치유 요법, 예방 요법, 및 방지 요법을 지칭한다. 연속 치료 또는 투여는 1일 이상 치료가 중단되지 않으면서 적어도 매일 치료하는 것을 지칭한다. 간헐 치료 또는 투여, 또는 간헐 방식의 치료 또는 투여는 연속적이지 않고, 사실상 주기적인 치료를 지칭한다. 본 발명의 방법에 따른 치료는 질환 또는 상태의 완전한 경감 또는 치유, 또는 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상의 부분적인 개선을 초래할 수 있고, 일시적 또는 영구적일 수 있다.
본원에서 사용된 "축삭 변성 방지", "뉴런 변성 방지", "축삭 변성 억제" 또는 "뉴런 변성 억제"라는 구절은 (i) 신경변성 질환에 걸린 것으로 새롭게 진단되었거나 새로운 신경변성 질환이 발생할 위험이 있는 환자에서 축삭 또는 뉴런 변성을 억제 또는 방지하는 능력, 및 (ii) 신경변성 질환을 이미 앓고 있거나 신경변성 질환의 증상이 있는 환자에서 추가적인 축삭 또는 뉴런 변성을 억제 또는 방지하는 능력을 포함한다. 축삭 또는 뉴런 변성 억제는 축삭 또는 뉴런 변성을 감소시키거나 억제하는 것을 포함하고, 이는 뉴런 또는 축삭 변성의 완전한 또는 부분적인 억제를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 신경학적 기능의 분석에 의해, 이를 평가할 수 있다. 상기 열거된 용어들은 시험관내 및 생체외 방법을 또한 포함한다. 추가로, "뉴런 변성 방지" 및 "뉴런 변성 억제"라는 구절은 전체 뉴런 또는 이의 일부분, 예컨대 뉴런 세포체, 축삭, 및 가지돌기에 관한 억제를 포함한다. 하나 이상의 본원에 기술된 바와 같은 작용제의 투여는 하나 이상의 본원에 기술된 작용제가 제공되지 않은 대조군 대상체 또는 집단과 비교하여 대상체 또는 집단에서 신경계의 장애; 신경계 외부에 1차 효과가 있는 질환, 상태 또는 치료법에 대해 2차적인 신경계의 상태; 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상; 통증; 눈-관련 신경변성; 기억 상실; 또는 정신과 장애의 하나 이상 (예를 들어, 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지 또는 9가지)의 증상 (예를 들어, 떨림, 느린 동작, 운동실조, 균형 상실, 우울증, 인지 기능 감소, 단기 기억 상실, 장기 기억 상실, 혼란, 성격 변화, 언어 곤란, 감각 인지 상실, 접촉 과민, 팔다리 무감각, 근육 쇠약, 근육 마비, 근육 경련, 근육 연축, 상당한 식습관 변화, 과도한 공포 또는 걱정, 불면증, 망상, 환각, 피로, 요통, 흉통, 소화 문제, 두통, 빠른 심박수, 어지러움, 시야 흐림, 시야의 그림자 또는 누락 영역, 변시증, 색각 장애, 밝은 빛에의 노출 후 시력 기능의 회복 감소, 및 시각적 대비 감도 상실)에서의 10％ 이상의 감소 (예를 들어, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％ 이상, 또는 심지어 100％의 감소)를 초래할 수 있다. 하나 이상의 본원에 기술된 바와 같은 작용제의 투여는 하나 이상의 본원에 기술된 작용제가 투여되지 않은 뉴런 집단 또는 대상체에서 변성되는 뉴런 (또는 이의 뉴런 세포체, 축삭 또는 가지돌기)의 개수와 비교하여 뉴런 집단 또는 대상체에서 변성되는 뉴런 (또는 이의 뉴런 세포체, 축삭 또는 가지돌기)의 개수에서의 10％ 이상의 감소 (예를 들어, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 이상, 또는 심지어 100％의 감소)를 초래할 수 있다. 하나 이상의 본원에 기술된 바와 같은 작용제의 투여는 하나 이상의 본원에 기술된 작용제로 처리되지 않은 대조군 대상체 또는 집단과 비교하여 대상체 또는 대상체 집단에서 신경계의 장애; 신경계 외부에 1차 효과가 있는 질환, 상태 또는 치료법에 대해 2차적인 신경계의 상태; 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상; 통증; 눈-관련 신경변성; 기억 상실; 또는 정신과 장애가 발생할 가능성에서의 10％ 이상의 감소 (예를 들어, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 이상, 또는 심지어 100％의 감소)를 초래할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "투여"는 뉴런 또는 이의 일부분을 본원에 기술된 바와 같은 억제제와 접촉시키는 것을 지칭한다. 이는 뉴런 또는 이의 일부분이 내부에 존재하는 대상체에게 억제제를 투여하는 것, 뿐만 아니라 뉴런 또는 이의 일부분이 배양되는 배지 내로 억제제를 도입하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "뉴런"은 중앙의 세포체 또는 몸통, 및 2가지 유형의 신장물 또는 돌출물 (일반적으로 대부분의 뉴런 신호가 이에 의해 세포체로 전달되는 가지돌기, 및 일반적으로 대부분의 뉴런 신호가 이에 의해 세포체로부터 이펙터 세포, 예컨대 표적 뉴런 또는 근육으로 전달되는 축삭)을 포함하는 신경계 세포를 의미한다. 뉴런은 조직 및 장기로부터의 정보를 중추 신경계 내로 전달할 수 있고 (구심성 또는 감각 뉴런), 신호를 중추 신경계로부터 이펙터 세포로 전송할 수 있다 (원심성 또는 운동 뉴런). 개재뉴런으로 명시되는 또 다른 뉴런은 중추 신경계 (뇌 및 척주) 내의 뉴런들을 연결한다. 본 발명에 따른 치료에 적용될 수 있는 뉴런 유형의 특정한 구체적인 예로는 소뇌 과립 뉴런, 후근 신경절 뉴런, 및 피질 뉴런이 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "포유동물"은 인간, 비-인간 고등 영장류, 설치류, 가축 및 농장 동물, 예컨대 소, 말, 개 및 고양이가 포함되는, 포유동물로 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
하나 이상의 추가적인 치료제와의 "조합" 투여는 동시 (공동) 투여 및 임의 순서의 연속 투여를 포함한다.
"유효량"은 이로운 또는 원하는 치료 (방지 포함) 결과를 일으키는데 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이라는 표현들은 상호교환가능하게 사용되고, 모든 이같은 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 표현은 1차 대상체 세포 및 전달 회수와 관계없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 고의적인 또는 우연한 돌연변이로 인해, DNA 함량 면에서 모든 자손이 정확하게 동일하지 않을 수 있음이 또한 이해된다. 용어 "자손"은 원래의 형질전환된 세포 또는 세포주에 대한 모든 후속 세대의 임의의 모든 후손을 지칭한다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성이 있는 돌연변이체 자손이 포함된다.
"소분자"는 분자량이 약 1000 돌턴 미만, 예를 들어, 약 500 돌턴 미만인 것으로 본원에서 정의된다. 소분자는 유기 또는 무기 분자일 수 있고, 예를 들어, 화합물 라이브러리 또는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 또는 공지된 화합물의 유도체화에 의해 수득될 수 있다.
"압타머"는 표적 분자, 예컨대 본원에 기술된 표적에 특이적으로 결합하는 3차 구조를 형성하는 핵산 분자이다. 압타머의 생성 및 치료적 사용이 당업계에 잘 확립되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,475,096 참조). 본 발명에서 사용되는 압타머는 생체 내에서 변형으로부터 안정적인 변형된 뉴클레오티드 (예를 들어, 핵산 유사체 또는 유도체)를 포함할 수 있다. 최소한, 치료적 작용이 분해 및/또는 제거 전에 일어나기 위해, 충분한 기간 동안 생체 내에서 충분히 안정적이도록 핵산 분자가 디자인된다. 비-제한적인 예로서, 이같은 뉴클레오티드 유사체는 포스포로티오에이트, 보라노포스페이트, 메틸-포스포네이트, 및 2'-O-메틸 유사체, 및 이들의 유사체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적인 예로서, 유사체는 2'-데옥시-2'-플루오로-RNA (2'-F-RNA)일 수 있다.
"펩티바디"는 면역글로불린 분자의 단편 또는 일부분을 코딩하는 아미노산 서열에 연결된 펩티드 서열이다. 이러한 펩티드 서열은 파지 디스플레이 기술을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 방법에 의해 특이적 결합에 대해 선택된 무작위화 서열들로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 선택된 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 부분을 코딩하는 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 본원에 기술된 표적에 특이적으로 결합하고 이를 조절하여, 뉴런 변성의 억제에 이르는 펩티바디가 본 발명의 방법에서 또한 유용하다.
용어 "제약상 허용되는 염"은 안전한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적절하고 합리적인 이익/위험 비율이 균형을 이룬 염을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 제약상 허용되는 염은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Berge et al., J Pharm. Sci. 66:1-19, 1977]에 제약상 허용되는 염이 상세하게 기술되어 있다. 염은 본 발명의 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 원위치에서 제조될 수 있거나, 또는 별도로 유리 염기 기를 적절한 유기 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가염에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 바이술페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄페르술포네이트, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 히드로요오다이드, 2-히드록시-에탄술포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 술페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔술포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등이 포함된다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염에는 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등, 뿐만 아니라 비-독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온 (암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등이 포함되지만 이에 한정되지 않음)이 포함된다.
B. 뉴런 변성의 억제제의 확인 및 특성화를 위한 스크리닝 분석법
본 발명은 상기 섹션 A의 표 1에 열거된 표적 단백질 및 활성 (이중 류신 지퍼-보유 키나제 (DLK), 글리코겐 신타제 키나제 3β (GSK3β), p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (p38 MAPK), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 포스포이노시티드 3 키나제 (PI3K), 시클린-의존적 키나제 5 (Cdk5), 아데닐릴 시클라제, c-Jun N-말단 키나제 (JNK), BCL2-회합 X 단백질 (Bax), Ih 채널, 칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 키나제 (CaMKK), G-단백질, G-단백질 커플링 수용체, 전사 인자 4 (TCF4), β-카테닌, 전사, 및 단백질 합성)의 특정 조절자가 뉴런 (예컨대 축삭) 변성의 효과적인 억제제라는 발견을 부분적으로 기초로 한다. 활성화제인 아데닐릴 시클라제 조절자를 제외하고는, 이러한 조절자들은 표적 단백질 및 활성의 억제제로서 기능한다. 뉴런 또는 축삭 변성의 억제제들은, 뉴런 또는 축삭 변성의 억제제이기 때문에, 이들 각각의 표적에 대한 효과와 관계없이 본원에서 "억제제"로 지칭된다. 이들은 뉴런 또는 축삭에서 표적 단백질 또는 활성의 활성을 조절하여 뉴런 또는 축삭 변성의 억제에 이르는 "작용제"로서 본원에서 또한 지칭된다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 억제제의 사용에 의해 뉴런 또는 축삭 변성을 억제하는 방법을 포함한다. 하기에 추가로 상세히 기술되는 바와 같이, 이러한 방법은 생체 내에서, 예컨대 신경학적 장애 또는 신경계에 대한 손상의 치료에서 수행될 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내에서 또는 생체 외에서, 예컨대 뉴런 기능의 실험실 연구 및 신경 이식편 또는 이식물의 치료에서 또한 수행될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 억제제의 확인 및 테스트를 위한 방법의 기술 후에, 이러한 방법이 하기에 추가로 기술된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 억제제는 본원에 기술된 분석법에서 뉴런 또는 축삭 변성을 방지하는 것으로 나타난 표 2 (하기 섹션 C)에 열거된 것들을 포함할 뿐만 아니라, 추가적인, 본원에 기술된 표적의 공지된 억제제들 (예를 들어, 표 3 참조)을 포함한다. 하기 개요된 바와 같이, 각각의 표적에 대해 특이적인 표준 스크리닝 방법을 사용하여 본 발명에서 사용하기 위한 추가적인 억제제를 확인할 수 있다. 이러한 분석법은 표준 의약 화학 접근법에 따라 디자인된, 원하는 활성을 지니는 것으로 발견된 화합물의 유도체의 활성을 확인하는데 또한 사용될 수 있다. 억제제 (또는 아데닐릴 시클라제의 경우의 활성화제)가 특정 표적과 관련하여 활성인 것으로 확인된 후, 본원에 기술된 바와 같이 뉴런 또는 축삭 변성 모델에서, 뿐만 아니라 적합한 동물 모델 시스템에서 억제제를 테스트할 수 있다.
표 1에 열거된 표적들의 억제제의 확인, 뿐만 아니라 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는, 뉴런 또는 축삭 변성의 추가적인 억제제의 확인 및 특성화를 위한 예시적인 분석법이 하기와 같이 간략하게 기술된다.
i) 뉴런 또는 축삭 변성의 억제제에 대한 세포-기반 및 시험관내 분석법
본원에 기술된 표적들의 억제제가 뉴런 또는 축삭 변성을 또한 억제한다는 것의 확증, 뿐만 아니라 뉴런 또는 축삭 변성의 추가적인 억제제의 확인을 위한 분석법이 하기 실시예에서 상세하게 기술되고, 간략하게 하기와 같이 요약된다. 이러한 분석법에는 (i) 항-신경 성장 인자 (항-NGF) 항체 분석법, (ii) 혈청 결핍/염화칼륨 (KCl) 감소 분석법, (iii) 로테논 변성 분석법, 및 (iv) 빈크리스틴 변성 분석법이 포함된다. 당업계에 공지된 뉴런 또는 축삭 변성을 평가하기 위한 추가적인 분석법들을 본 발명에서 또한 사용할 수 있다.
NGF는 표적 뉴런의 분화 및 생존에서 수반되는 소형 분비 단백질이다. 배양된 뉴런을 NGF로 처리하면 축삭의 증식이 초래되는 한편, 이같은 뉴런을 항-NGF 항체로 처리하면 축삭 변성이 초래된다. 뉴런을 항-NGF 항체로 처리하면 현미경검사에 의해 검출가능하고 후보 억제제의 효과를 관찰하기 위해 모니터링할 수 있는 여러 상이한 형태학적 변화가 또한 초래된다. 실시예 1에 추가로 기술되고 예를 들어 도 1-4에 도해된 이러한 변화에는 염주 형성, 신장된 미토콘드리아 상실, 염주 내의 미토콘드리아 축적, 세포골격 분해, 및 축삭 단편화가 포함된다. 항-NGF 항체에 의해 유도되는 형태학적 변화 중 임의의 변화에 대항하는 것으로 발견된 작용제는 뉴런 또는 축삭 변성의 후보 억제제로서 간주될 수 있고, 원한다면 이를 추가적인 시스템, 예컨대 본원에 기술된 시스템에서 테스트할 수 있다.
혈청 결핍/KCl 감소 분석법은 마우스 (예를 들어, P7 마우스) 뇌로부터 단리된 소뇌 과립 뉴런 (CGN)의 배양물의 사용을 기초로 한다. 이러한 분석법에서, 뉴런이 KCl을 포함하는 배지에서 배양된 후, KCl을 덜 함유하는 배지 (5 mM KCl을 포함하는 이글(Eagle) 기본 배지)로 전환되고, 이는 뉴런 변성을 유도한다. 뉴런 마커 (예를 들어, 항-클래스 III 베타-튜불린)로 염색된 고정된 뉴런의 영상의 분석에 의해 예를 들어 검출될 수 있는, KCl 중단 시 뉴런 변성을 차단하거나 감소시키는 것으로 발견되는 작용제가 뉴런 또는 축삭 변성의 후보 억제제로서 간주될 수 있고, 원한다면 이를 추가적인 시스템, 예컨대 본원에 기술된 시스템에서 테스트할 수 있다.
뉴런 또는 축삭 변성의 또 다른 모델은 배양된 뉴런을 여러 식물의 뿌리 및 줄기에서 천연적으로 발생하는 구충제 및 살충제이고, 미토콘드리아 전자 수송을 방해하며, 래트에게 주사되는 경우 파킨슨 질환-유사 증상을 야기하는 로테논 (2R,6aS,12aS)-1,2,6,6a,12,12a-헥사히드로-2-이소프로페닐-8,9-디메톡시크로메노[3,4-b] 푸로(2,3-h)크로멘-6-온)과 접촉시키는 것을 수반한다. 뉴런 특이적 베타 III 튜불린에 대한 항체로 예를 들어 염색된 고정된 뉴런의 영상의 분석에 의해 예를 들어 검출될 수 있는, 로테논의 존재 하에 배양된 뉴런의 변성을 차단하거나 감소시키는 것으로 발견되는 작용제가 뉴런 또는 축삭 변성의 후보 억제제로서 간주될 수 있고, 원한다면 이를 추가적인 시스템, 예컨대 본원에 기술된 시스템에서 테스트할 수 있다.
뉴런 또는 축삭 변성의 추가적인 모델은 배양된 뉴런을 튜불린 이량체에 결합하고 미세관 구조의 조립을 방지하는 알칼로이드인 빈크리스틴과 접촉시키는 것을 수반한다. 뉴런 특이적 베타 III 튜불린에 대한 항체로 예를 들어 염색된 고정된 뉴런의 영상의 분석에 의해 예를 들어 검출될 수 있는, 빈크리스틴의 존재 하에 배양된 뉴런의 변성을 차단하거나 감소시키는 것으로 발견되는 작용제가 뉴런 또는 축삭 변성의 후보 억제제로서 간주될 수 있고, 원한다면 이를 추가적인 시스템, 예컨대 본원에 기술된 시스템에서 테스트할 수 있다.
뉴런 또는 축삭 변성의 억제를 판독하는 상기 기술된 분석법들에 더하여, 본 발명은 예를 들어 표적 결합 또는 표적 활성을 판독하는, 표 1에 열거된 표적들의 억제제를 검출하는 것에 지시된 분석법을 또한 사용한다. 따라서, 본 발명은 표 1에 열거된 표적들의 억제제에 대한 스크리닝 분석법의 사용을 포함하고, 이는 표적과 결합하거나 복합체를 이루는, 또는 다른 방식으로 표적의 활성을 방해하는 화합물을 확인하도록 디자인될 수 있다. 스크리닝 분석법은 화학적 라이브러리의 고처리량 스크리닝에 적용가능하여, 이를 소분자 약물 후보물을 확인하는데 적절하게 하는 분석법을 포함한다. 일반적으로, 결합 분석법 및 활성 분석법이 사용된다. 분석법은 대상체 표적을 기초로 적합한 것으로 결정되는, 키나제 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법, 및 세포-기반 분석법이 비제한적으로 포함되는 다양한 양식으로 수행될 수 있다.
결합 분석법에서, 상호작용은 결합이고, 형성된 복합체는 단리될 수 있거나 또는 반응 혼합물 내에서 검출될 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 폴리펩티드 또는 약물 후보물이 공유결합 또는 비-공유결합 부착에 의해 고체 상, 예를 들어 미량역가 플레이트에 고정된다. 비-공유결합 부착은 고체 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시킴으로써 일반적으로 달성된다. 별법적으로, 고정될 표적 폴리펩티드에 대해 특이적인 고정된 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체를 사용하여 폴리펩티드를 고체 표면에 앵커링(anchoring)시킬 수 있다. 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 고정되지 않은 성분을 고정된 성분, 예를 들어, 앵커링된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 분석법이 수행된다. 반응이 완료되면, 미반응 성분을, 예를 들어, 세정에 의해, 제거하고, 고체 표면 상에 앵커링된 복합체를 검출한다. 원래의 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 보유하는 경우, 표면 상에 고정된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 가리킨다. 원래의 고정되지 않은 성분이 표지를 보유하지 않는 경우, 예를 들어, 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용함으로써, 복합체 형성을 검출할 수 있다.
후보 화합물이 표적과 상호작용하지만 이에 결합하지는 않는 폴리펩티드인 경우, 표적과 각각의 폴리펩티드의 상호작용을 단백질-단백질 상호작용의 검출에 대해 주지된 방법에 의해 분석할 수 있다. 이같은 분석법에는 전통적인 접근법, 예를 들어, 가교, 공동-면역침전, 및 구배 또는 크로마토그래피 칼럼을 통한 공동-정제가 포함된다. 또한, 문헌 [Chevray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5789-5793, 1991]에 개시된 바와 같이 필즈(Fields) 및 공동 작업자 (문헌 [Fields et al., Nature (London) 340:245-246, 1989]; [Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9578-9582, 1991])에 의해 기술된 효모-기반 유전자 시스템을 사용함으로써 단백질-단백질 상호작용을 모니터링할 수 있다. 다수의 전사 활성화제, 예컨대 효모 GAL4는 물리적으로 분리된 2개의 모듈형 도메인으로 구성되는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 도메인은 전사-활성화 도메인으로 작용한다. 상기 간행물들에 기술된 효모 발현 시스템 (일반적으로, "2-하이브리드 시스템"으로 지칭됨)은 이러한 성질의 이점을 취하고, 2개의 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나에서는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인에 융합되고, 다른 하나에서는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 융합된다. GAL4로 활성화된 프로모터의 제어 하에서의 GAL1-lacZ 리포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 좌우된다. 상호작용하는 폴리펩티드들을 함유하는 콜로니가 β-갈락토시다제(galactosidase)에 대한 발색 기질로 검출된다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2개의 특정 단백질들 간의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완성형 키트 (매치메이커(MATCHMAKER)™)가 클론테크(Clontech)에서 시판된다. 또한, 이러한 시스템을 확장시켜, 특정 단백질 상호작용에 수반되는 단백질 도메인의 지도를 작성할 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 상호작용에 결정적인 아미노산 잔기를 정확하게 알아낼 수 있다.
표적과 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물을 하기와 같이 테스트할 수 있다. 일반적으로, 표적 및 세포내 또는 세포외 성분을 함유하는 반응 혼합물을 두 물질의 상호작용을 허용하는 조건 및 시간 하에 제조한다. 표적의 상호작용을 억제하는 후보 화합물의 능력을 테스트하기 위해, 테스트 화합물의 존재 및 부재 하에 반응을 실행시킨다. 또한, 양성 대조군으로서 작용하도록, 플라시보(placebo)를 제3의 반응 혼합물에 첨가할 수 있다.
단백질 키나제의 활성에 대한 후보 억제제의 영향을 측정하기 위한 분석법이 당업계에 공지되어 있고, 여기에는 직접적인 인산화 분석법 (전형적으로, 방사성-표지 포스페이트, 기질에 대한 인산화-특이적 항체를 통해 해석됨), 및 키나제 활성의 하류 결과, 예를 들어, 리포터 유전자의 활성화를 측정하는 세포-기반 분석법이 포함된다. 형광 편광을 기초로 하는 별법적인 분석법에 더하여, 이러한 주요 전략 양쪽 모두 억제제를 확인, 입증 또는 특성화하기 위해 소규모 또는 고-처리량 방식으로 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Favata et al., J. Biol. Chem. 273:18623-18632, 1998]; [Parker et al., J. Biomol. Screening 5:77-99, 2000]; [Singh et al., Comb. Chem. High Throughput Screen 8:319-325, 2005]; [Garton et al., Meth. Enz. 439:491-500, 2008]; 및 [Kupchko et al., Anal. Biochem. 317:210-217, 2003] 참조).
본원에서 구체적으로 논의되는 스크리닝 분석법은 단지 설명을 위한 것이다. 스크리닝되는 길항제 후보물 (예를 들어, 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 비-펩티드 소형 유기 분자, 핵산 분자 등)의 특정 표적 및 유형에 따라 선택될 수 있는 다양한 기타 분석법이 당업자에게 주지되어 있고, 본 발명에서 또한 사용될 수 있다.
본원에 기술된 분석법은 무작위 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 소형 유기 분자로 구성된, 화학적 라이브러리, 천연 생성물 라이브러리 (예를 들어, 미생물, 동물, 식물 등의 선집) 및 조합형 라이브러리를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 화합물들의 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원의 분석법은 나이브(naive) 인간 항체, 재조합 항체, 합성 항체 및 반합성 항체 라이브러리가 비제한적으로 포함되는 항체 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된다. 항체 라이브러리는, 예를 들어, 파지 입자 당 평균적으로 1개의 단일쇄 항체 또는 항체 단편을 디스플레이하는 1가 라이브러리, 및 바이러스 입자 당 평균적으로 2개 이상의 항체 또는 항체 단편을 디스플레이하는 다가 라이브러리가 포함되는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 그러나, 본 발명에 따라 스크리닝될 항체 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리에 한정되지 않는다. 또 다른 디스플레이 기술에는, 예를 들어, 리보솜 또는 mRNA 디스플레이 (문헌 [Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9022-9026, 1994]; [Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4937-4942, 1997]), 미생물 세포 디스플레이, 예컨대 박테리아 디스플레이 (문헌 [Georgiou et al., Nature Biotech. 15:29-34, 1997]), 또는 효모 세포 디스플레이 (문헌 [Kieke et al., Protein Eng. 10:1303- 1310, 1997]), 포유류 세포 상의 디스플레이, 포자 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 예컨대 레트로바이러스 디스플레이 (문헌 [Urban et al., Nucleic Acids Res. 33:e35, 2005]), 단백질-DNA 연결을 기초로 하는 디스플레이 (문헌 [Odegrip et al., Proc. Acad. Natl. Sci. U.S.A. 101:2806-2810, 2004]; [Reiersen et al., Nucleic Acids Res. 33:e10, 2005]), 및 마이크로비드 디스플레이 (문헌 [Sepp et al., FEBS Lett. 532:455-458, 2002])가 포함된다.
본원에서의 1차 결합/상호작용 분석법에서 수득된 결과가 축삭 변성의 시험관내 및/또는 생체내 분석법에서 확증될 수 있다. 별법적으로, 축삭 변성의 시험관내 및/또는 생체내 분석법이 본원에서 기술된 바와 같이 억제제 및 길항제를 확인하기 위한 1차 분석법으로 사용될 수 있다.
ii) 뉴런 또는 축삭 변성의 동물 모델
본 발명에서 사용하기 위한 생체내 분석법은 다양한 신경변성 질환의 동물 모델, 예컨대 근육위축성 측삭 경화증 (ALS), 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 및 다발성 경화증의 동물 모델 (예를 들어, 마우스에서의 실험적 자가면역 뇌염 (EAE))을 포함한다. 또한, 척수 및 외상성 뇌 손상 모델이 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 억제제를 특성화하는데 사용될 수 있는 생체내 분석법의 비-제한적인 예가 하기에 기술된다.
근육위축성 측삭 경화증 (ALS)의 경우, 돌연변이체 형태의 과산화물 디스뮤타제(dismutase) 1 (SOD1)을 발현하는 트랜스제닉 마우스는 ALS의 표현형 및 병리학을 재현한다 (문헌 [Rosen et al., Nature 362(6415):59-62, 1993]). SOD1 마우스에 더하여, 근육위축성 측삭 경화증 (ALS)의 여러 마우스 모델이 개발되었고, 본 발명에서 사용될 수 있다. 이는 운동 뉴런 변성 (Mnd), 진행성 운동 신경병증 (pmn), 워블러(wobbler) (문헌 [Bird et al., Acta Neuropathologica 19(1):39-50, 1971]), 및 TDP-43 돌연변이체 트랜스제닉 마우스 (문헌 [Wegorzewska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.] (2009년 10월 15일 전자 공개))를 포함한다. 또한, 개과 모델이 개발되었고, 본 발명에서 사용될 수 있다 (유전성 개 척수 근육 위축 (HCSMA)).
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 억제제를 특성화하는데 사용될 수 있는, 파킨슨 질환의 병원성, 조직학적, 생화학적 및 임상적 특색을 모의하는 동물 모델에는 레세르핀 (토끼; 문헌 [Carlsson et al., Nature 180:1200, 1957]); 메탐페타민 (설치류 및 비-인간 영장류; 문헌 [Seiden et al., Drug Alcohol Depend 1:215-219, 1975]); 6-OHDA (래트; 문헌 [Perese et al., Brain Res. 494:285-293, 1989]); MPTP (마우스 및 비-인간 영장류; 문헌 [Langston et al., Ann. Neurol. 46:598-605, 1999]); 파라콰트/마넵 (마우스; 문헌 [Brooks et al., Brain Res. 823:1-10, 1999] 및 [Takahashi et al., Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 66:167-170, 1989]); 로테논 (래트; 문헌 [Betarbet et al., Nat Neurosci. 3:1301-1306, 2000]); 3-니트로티로신 (마우스; 문헌 [Mihm et al., J Neurosci. 21:RC149, 2001]); 및 돌연변이된 α-시누클레인 (마우스 및 초파리; 문헌 [Polymeropoulos et al., Science 276:2045-2047, 1997]) 모델이 포함된다.
마우스, 파리, 어류, 및 벌레가 포함되는 유전자-변형 동물이 알츠하이머 질환의 이면의 병원성 메커니즘을 연구하는데 사용되었다. 예를 들어, β-아밀로이드에 대한 트랜스제닉 마우스에서 알츠하이머 질환에 부합하는 기억 손상이 발달된다 (문헌 [Goetz et al., Mol. Psychiatry 9:664-683, 2004]). 이와 같은 모델이 억제제를 특성화하는데 사용될 수 있다.
마우스, 래트, 저빌(gerbil), 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지 및 원숭이가 포함되는 여러 동물 모델이 졸중을 연구하기 위해 당업계에서 사용된다. 대부분의 국소적인 대뇌 허혈 모델은 중간 대뇌 동맥과 같은 1개의 주요 대뇌 혈관의 폐색을 수반한다 (예를 들어, 문헌 [Garcia, Stroke 15:5-14, 1984] 및 [Bose et al., Brain Res. 311:385-391, 1984] 참조). 이러한 모델들 중 임의의 모델이 본 발명에서 또한 사용될 수 있다.
C. 뉴런 또는 축삭 변성의 억제제
하기에 실시예에서 추가로 기술되는 바와 같이, 하기 표 2에 열거된 화합물들이 뉴런 또는 축삭 변성의 억제제로서 확인되었다. 이러한 화합물들, 뿐만 아니라 표 2에 열거된 표적 및 프로세스를 억제 (또는 아데닐릴 시클라제의 경우에는 활성화)하는 또 다른 작용제 (예를 들어, 표 3 참조)가 본 발명에 따라 뉴런 또는 축삭 변성을 억제하는 방법에서 사용될 수 있다.
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
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D. 뉴런 또는 축삭 변성의 항체 억제제의 제조
본 발명의 결합 및 활성 분석법에 의해 확인된 항체를 재조합 DNA 기술의 기술이 포함되는, 당업계에 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다.
(i) 항원 제조
가용성 항원 또는 이의 단편 (임의적으로 또 다른 분자에 접합됨)이 항체를 생성시키기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 막횡단 분자, 예컨대 수용체에 대해서는, 이의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로 사용될 수 있다. 별법적으로, 막횡단 분자를 발현하는 세포가 면역원으로 사용될 수 있다. 이같은 세포는 천연 공급원 (예를 들어, 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 막횡단 분자를 발현하도록 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 본 발명의 표적들의 예시적인 서열이 표 1에서 언급되고, 본 발명에서 사용하기 위한 항체를 제조하기 위한 항원 제조에서 사용될 수 있다. 항체의 제조에 유용한 기타 항원 및 이의 형태가 당업자에게 명백할 것이다.
(ii) 폴리클로날 항체
관련 항원 및 애주번트(adjuvant)의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 폴리클로날 항체가 동물에서 전형적으로 생성된다. 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (식중, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여, 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.
예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3배 용량의 프로인트(Freund) 완전 애주번트와 합하고, 이 용액을 다중 부위에 진피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 동물들을 면역화시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 애주번트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅(boosting)시킨다. 7일 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 역가가 정체기(plateau)에 도달할 때까지 동물을 부스팅시킨다. 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교 시약을 통해 접합된 동일한 항원의 접합체로 동물이 부스팅될 수 있다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 단백질 융합체로서 제조될 수 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적절하게 사용하여 면역 응답을 강화시킨다.
(iii) 모노클로날 항체
모노클로날 항체를 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495, 1975]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터 또는 짧은꼬리 원숭이를 상기 기술된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발시킨다. 별법적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 그 후, 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986]).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 어버이 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유할 수 있는 적절한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 어버이 골수종 세포에 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(transferase) (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
예시적인 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 높은 수준의 안정적인 항체 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것이다. 이들 중에서, 사용이 고려될 수 있는 특정 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 <Salk Institute Cell Distribution Center> (미국 캘리포니아 샌디에고)>로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 <American Type Culture Collection> (미국 버지니아 마나사스)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기술되어 있다 (문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001, 1984]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987]).
하이브리도마 세포가 성장되는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성이 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석법, 예컨대 방사선면역분석법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화력 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론을 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986]). 이러한 목적에 적절한 배양 배지에는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포가 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
통상적인 절차 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함)을 이용하여 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA가 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포가 이같은 DNA의 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내에 놓을 수 있고, 그 후 이러한 벡터를 형질감염되지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 생산을 수득한다. 항체의 재조합 생산은 하기에 더욱 상세하게 기술될 것이다.
추가적인 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편을 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554, 1990]에 예를 들어 기술된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991]에는 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체의 단리가 각각 기술되어 있다. 후속 간행물들에는 사슬 셔플링에 의한 고친화력 (nM 범위) 인간 항체의 생산 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783, 1992]), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합형 감염 및 생체내 재조합 (문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res. 21:2265-2266, 1993])이 기술되어 있다. 따라서, 이러한 기술들은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 상동성 뮤린 서열 대신 치환함으로써 (미국 특허 번호 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1984]), 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부에 공유결합으로 연결시킴으로써, DNA를 또한 변형시킬 수 있다.
전형적으로, 이같은 비-면역글로불린 폴리펩티드가 항체의 불변 도메인을 치환하거나, 또는 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여 항원에 대한 특이성을 갖는 한 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체가 생성된다.
(iv) 인간화 및 인간 항체
인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 항체 내에 도입되어 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로는 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, 윈터(Winter) 및 공동 연구원의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525, 1986]; [Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988]; [Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988])에 따라 인간화를 본질적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 전형적으로 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용되는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)을 선택하는 것은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 받아들여진다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296, 1993]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901, 1987]). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Set U.S.A. 89:4285, 1992]; [Presta et al., J. Immnol. 151:2623, 1993]).
항원에 대한 높은 친화력 및 기타 유리한 생물학적 성질을 유지시키면서 항체를 인간화시키는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 예시적인 방법에 따라, 어버이 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 어버이 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 프로세스에 의해 인간화 항체가 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이들의 정밀검사로 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 자신의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화력이 달성되도록 수용자 및 수입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 수반된다.
별법적으로, 면역화 시, 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기술되었다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이같은 생식계열 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2551, 1993]; [Jakobovits et al., Nature 362:255-258, 1993]; [Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33, 1993]; 및 [Duchosal et al., Nature 355:258, 1992] 참조. 파지-디스플레이 라이브러리로부터 인간 항체가 또한 유래될 수 있다 (문헌 [Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381, 1991]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991]; [Vaughan et al., Nature Biotech. 14:309, 1996]). 항체 파지 디스플레이로부터의 인간 항체의 생성이 하기에 추가로 기술된다.
(v) 항체 단편
항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해성 분해를 통해 유래되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., J Biochem. Biophys. Meth. 24:107-117, 1992] 및 [Brennan et al., Science 229:81, 1985] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편이 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편이 형성될 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167, 1992]). 하기 실시예에 기술된 바와 같은 또 다른 실시양태에서, F(ab')2 분자의 어셈블리를 촉진하도록 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 F(ab')2가 형성된다. 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편이 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술들이 당업자에게 명백할 것이다. 또 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185 참조).
(vi) 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성이 있고, 이때 에피토프들은 일반적으로 상이한 항원들로부터의 것이다. 이같은 분자들은 일반적으로는 2개의 상이한 에피토프에만 결합할 것이지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가적인 특이성이 있는 항체 예컨대 삼중특이적 항체가 본원에서 사용되는 경우의 이러한 표현에 포함된다.
이중특이적 항체의 제조 방법이 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 하고, 이때 두 사슬은 특이성이 상이하다 (문헌 [Millstein et al., Nature 305:537-539, 1983]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열(assortment)로 인해, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991]에 개시되어 있다. 다른 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)이 있는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합일 수 있다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합물 중 적어도 하나에 존재할 수 있다. 면역글로불린 중쇄 융합물, 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA들을 별도의 발현 벡터들에 삽입하고, 적절한 숙주 세포 내로 공동-형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 동등하지 않은 비율이 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2개 이상의 폴리펩티드 사슬의 발현으로 높은 수율이 초래되는 경우 또는 비율이 특별한 의미가 없는 경우, 2개 또는 모든 3개의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 한 예에서, 이중특이적 항체는 한쪽 팔 내의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른쪽 팔 내의 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다는 것이 발견되었다. 이러한 접근법이 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성을 위한 추가적인 상세사항은, 예를 들어, 문헌 [Suresh et al., Methods Enzymol. 121:210, 1986] 참조.
WO 96/27011에 기술된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 경계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 교체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 교체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 제2 항체 분자의 경계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 바람직하지 않은 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교된 항체 또는 "이종접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이같은 항체들은, 예를 들어, 원치 않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360 및 WO 92/20373)를 위해서 제안되었다. 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 이종접합체 항체를 제조할 수 있다. 다수의 가교 기술과 함께, 적절한 가교제가 당업계에 주지되어 있고, 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술이 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81, 1985]에는 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성시키는 방법이 기술되어 있다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원시켜, 인접한 디티올들을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그후 Fab'-TNB 유도체들 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정을 위한 작용제로서 사용될 수 있다.
Fab'-SH 단편을 대장균으로부터 또한 직접 회수할 수 있고, 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225, 1992]에는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산이 기술되어 있다. 각각의 Fab' 단편이 대장균으로부터 별도로 분비되었고, 시험관내에서 지향성으로 화학적 커플링되어, 이중특이적 항체가 형성되었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다 (문헌 [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553, 1992]). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결시켰다. 항체 동종이량체가 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성된 후, 다시 산화되어 항체 이종이량체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 1993]에 기술된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 별법적인 제조 메커니즘을 제공하였다. 이 단편은 동일한 사슬 상의 두 도메인이 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루도록 강요됨으로써, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고되었다 (문헌 [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368, 1994] 참조).
2가를 초과하는 항체가 구현된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (문헌 [Tuft et al., J. Immunol. 147:60, 1991].
(vii) 이펙터 기능 조작
항체의 유효성을 강화하도록, 이펙터 기능과 관련하여 본 발명에서 사용되는 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입함으로써, 이러한 영역 내에 사슬간 디술피드 결합이 형성되도록 할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 내재화 능력이 개선되고/되거나 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존적 세포형 세포독성 (ADCC; 문헌 [Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195, 1992] 및 [Shopes, J. Immunol. 148:2918-2922, 1992] 참조)이 증가될 수 있다. 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565, 1993]에 기술된 바와 같은 이종이관능성 가교제를 사용하여 항종양 활성이 강화된 동종이량체 항체를 또한 제조할 수 있다. 별법적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작할 수 있고, 이에 의해 항체의 보체 용해 및 ADCC 능력이 강화될 수 있다 (문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230, 1989] 참조).
(viii) 항체- 샐비지 ( salvage ) 수용체 결합 에피토프 융합물
본 발명의 특정 실시양태에서, 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 투과를 증가시키기 위해, 무손상 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우에, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체 단편을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어, 샐비지 수용체 결합 에피토프를 항체 단편 내로 혼입시킴으로써 달성될 수 있다 (예를 들어, 항체 단편 내의 적합한 영역의 돌연변이에 의해, 또는 에피토프를 펩티드 태그 내로 혼입시킨 후, 태그를 항체 단편의 어느 한쪽 말단 또는 중간에 융합시킴 (예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의해)으로써).
샐비지 수용체 결합 에피토프는 Fc 도메인의 1개 또는 2개의 루프로부터의 임의의 하나 이상의 아미노산 잔기가 항체 단편의 유사한 위치로 옮겨진 영역을 구성할 수 있다. 또 다른 예에서, Fc 도메인의 1개 또는 2개의 루프로부터의 3개 이상의 잔기가 옮겨지는 한편, 추가적인 예에서, 에피토프가 Fc 영역 (예를 들어, IgG의 것)의 CH2 도메인으로부터 취해지고, 항체의 CH1, CH3, 또는 VH 영역, 또는 하나를 초과하는 이같은 영역에 옮겨진다. 별법적으로, 에피토프가 Fc 영역의 CH2 도메인으로부터 취해지고, 항체 단편의 CL 영역 또는 VL 영역, 또는 양쪽 모두로 옮겨진다.
(ix) 항체의 기타 공유결합 변형
항체의 공유 결합 변형이 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이는 화학적 합성에 의해 또는 적용가능하다면 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 항체의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 항체의 또 다른 유형의 공유결합 변형이 분자 내로 도입된다. 공유결합 변형의 예가 미국 특허 번호 5,534,615 (참고로 본원에 명확하게 포함됨)에 기술되어 있다. 항체의 공유결합 변형 유형의 한 예는 항체를 미국 특허 번호 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 기재된 방식으로 다양한 비-단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 연결시키는 것을 포함한다.
(x) 합성 항체 파지 라이브러리로부터의 항체의 생성
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 파지 디스플레이 접근법을 사용하여 신규 항체를 생성시키고 선별하는 방법을 사용할 수 있다. 이러한 접근법은 단일 프레임워크 주형을 기초로 하는 합성 항체 파지 라이브러리의 생성, 가변 도메인 내의 충분한 다양성의 디자인, 다양화된 가변 도메인이 있는 폴리펩티드의 디스플레이, 항원을 표적화하는 높은 친화력이 있는 후보 항체의 선별, 및 선별된 항체의 단리를 수반한다.
파지 디스플레이 방법의 상세사항을, 예를 들어, WO 03/102157에서 확인할 수 있고, 이의 전체 내용은 참고로 본원에 명확하게 포함된다.
한 예에서, 본 발명에서 사용된 항체 라이브러리는 항체 가변 도메인의 하나 이상의 CDR 내의 용매가 접근가능하고/하거나 고도로 다양한 위치를 돌연변이시킴으로써 생성될 수 있다. 본원에서 제공된 방법을 사용하여 일부 또는 모든 CDR을 돌연변이시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이시켜 단일 라이브러리를 형성시킴으로써 또는 CDRL3 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이시켜 단일 라이브러리를 형성시킴으로써 또는 CDRL3 및 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이시켜 단일 라이브러리를 형성시킴으로써 다양한 항체 라이브러리가 생성될 수 있다.
예를 들어, CDRH1, CDRH2 및/또는 CDRH3의 용매가 접근가능하고/하거나 고도로 다양한 위치에 돌연변이가 있는 항체 가변 도메인의 라이브러리가 생성될 수 있다. CDRL1, CDRL2 및/또는 CDRL3 내에 돌연변이가 있는 또 다른 라이브러리가 생성될 수 있다. 또한 이러한 라이브러리들은 원하는 친화력의 결합제를 생성시키기 위해 서로 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원에의 결합에 대한 중쇄 라이브러리의 1회 이상의 라운드의 선별 후에, 결합제의 친화력을 증가시키기 위한 추가적인 라운드의 선별을 위해 경쇄 라이브러리가 중쇄 결합제의 집단 내로 교체될 수 있다.
중쇄 서열의 가변 영역의 CDRH3 영역에서 원래의 아미노산을 변이체 아미노산으로 치환함으로써 라이브러리가 생성될 수 있다. 생성된 라이브러리는 서열 다양성이 주로 중쇄 서열의 CDRH3 영역 내에 있는 다수의 항체 서열을 함유할 수 있다.
한 예에서, 인간화 항체 4D5 서열, 또는 인간화 항체 4D5 서열의 프레임워크 아미노산의 서열의 정황에서 라이브러리가 생성된다. 중쇄의 적어도 잔기 95-100a를 DVK 코돈 셋트에 의해 코딩되는 아미노산으로 치환함으로써 라이브러리가 생성될 수 있고, 이때 DVK 코돈 셋트는 이러한 위치의 모든 개개에 대한 변이체 아미노산의 셋트를 코딩하도록 사용된다. 이러한 치환을 생성시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 셋트의 예는 서열 (DVK)7을 포함한다. 일부 실시양태에서,잔기 95-100a를 DVK 및 NNK 코돈 셋트 양쪽 모두에 의해 코딩되는 아미노산으로 치환함으로써 라이브러리가 생성된다. 이러한 치환을 생성시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 셋트의 예는 서열 (DVK)6(NNK)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 잔기 95-100a를 DVK 및 NNK 코돈 셋트 양쪽 모두에 의해 코딩되는 아미노산으로 치환함으로써 라이브러리가 생성된다. 이러한 치환을 생성시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 셋트의 예는 서열 ( DVK ) 5 ( NNK )을 포함한다. 이러한 치환을 생성시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 셋트의 또 다른 예는 서열 ( NNK ) 6 을 포함한다. 본원에 기술된 기준에 따라 당업자가 적절한 올리고뉴클레오티드 서열의 또 다른 예를 결정할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상이한 CDRH3 디자인들이 고친화력 결합제의 단리 및 다양한 에피토프에 대한 결합제의 단리를 위해 이용된다. 이러한 라이브러리 내에 생성된 CDRH3의 길이의 범위는 아미노산 11개 내지 13개이지만, 이와 상이한 길이가 또한 생성될 수 있다. NNK, DVK 및 NVK 코돈 셋트, 뿐만 아니라 N 및/또는 C-말단에서의 더욱 제한된 다양성을 사용함으로써 H3 다양성이 확장될 수 있다.
CDRH1 및 CDRH2에서 다양성이 또한 생성될 수 있다. CDR-H1 및 H2 다양성의 디자인은 이전의 디자인보다 천연 다양성에 더욱 밀접하게 매칭되는 다양성에 초점을 맞추는 변형과 함께 기술된 바와 같은 천연 항체 레퍼토리를 모방하기 위한 표적화 전략을 따른다
CDRH3에서의 다양성을 위해, H3의 길이가 상이한 다수의 라이브러리들을 따로따로 구축한 후 조합하여 표적 항원에 대한 결합제를 선별할 수 있다. 기존에 기술되어 있고 본원에서 하기에 기술된 바와 같은 고체 지지체 선별 및 용액 분류 방법을 사용하여 다수의 라이브러리들을 풀링(pooling) 및 분류할 수 있다. 다중 분류 전략을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 변형은 고체에 결합된 표적 상에서 분류한 후, 융합 폴리펩티드 상에 존재할 수 있는 태그 (예를 들어, 항-gD 태그)에 대해 분류하고, 고체에 결합된 표적 상에서 또다르게 분류하는 것을 수반한다. 별법적으로, 먼저 라이브러리를 고체 표면에 결합된 표적 상에서 분류할 수 있고, 이어서 용출된 결합제를 표적 항원의 농도를 감소시키면서 용액 상 결합을 사용하여 분류한다. 상이한 분류 방법들의 조합을 이용하는 것은 고도로 발현된 서열만 선별되는 것의 최소화를 제공하고, 다수의 상이한 고친화력 클론의 선별을 제공한다.
표적 항원에 대한 고친화력 결합제를 라이브러리로부터 단리할 수 있다. H1/H2 영역에서의 다양성을 제한하는 것은 다의성을 약 104배 내지 105배 감소시키고, H3 다양성을 더욱 허용하는 것은 더욱 높은 친화력의 결합제를 제공한다. CDRH3에서의 다양성의 유형이 상이한 라이브러리들의 이용 (예를 들어, DVK 또는 NVT의 이용)은 표적 항원의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 결합제의 단리를 제공한다.
상기 기술된 바와 같이 풀링된 라이브러리로부터 단리된 결합제들 중에서, 경쇄에서의 제한된 다양성을 제공함으로써 친화력이 추가로 개선될 수 있다는 것이 발견되었다. 이러한 실시양태에서 경쇄 다양성이 하기와 같이 생성된다: CDRL1에서는, 아미노산 위치 28이 RDT에 의해 코딩되고, 아미노산 위치 29가 RKT에 의해 코딩되며, 아미노산 위치 30이 RVW에 의해 코딩되고, 아미노산 위치 31이 ANW에 의해 코딩되고, 아미노산 위치 32가 THT에 의해 코딩되고, 임의적으로, 아미노산 위치 33이 CTG에 의해 코딩되고; CDRL2에서는, 아미노산 위치 50이 KBG에 의해 코딩되고, 아미노산 위치 53이 AVC에 의해 코딩되고, 임의적으로, 아미노산 위치 55가 GMA에 의해 코딩되고; CDRL3에서는, 아미노산 위치 91이 TMT 또는 SRT 또는 양쪽 모두에 의해 코딩되고, 아미노산 위치 92가 DMC에 의해 코딩되며, 아미노산 위치 93이 RVT에 의해 코딩되고, 아미노산 위치 94가 NHT에 의해 코딩되고, 아미노산 위치 96이 TWT 또는 YKG 또는 양쪽 모두에 의해 코딩된다.
또 다른 실시양태에서, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 영역에서의 다양성이 있는 라이브러리 또는 라이브러리가 생성된다. 이러한 실시양태에서, 다양한 길이의 H3 영역을 사용하여, 그리고 주로 코돈 셋트 XYZ 및 NNK 또는 NNS를 사용하여 CDRH3에서의 다양성이 생성된다. 개별적인 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 라이브러리들이 형성되어 풀링될 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오티드들이 풀링되어 라이브러리의 서브셋트가 형성될 수 있다. 이러한 실시양태의 라이브러리를 고체에 결합된 표적에 대해 분류할 수 있다. 다중 분류로부터 단리된 클론을 특이성 및 친화력에 대해 ELISA 분석법을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 특이성에 대해, 원하는 표적 항원, 뿐만 아니라 다른 비-표적 항원에 대해 클론을 스크리닝할 수 있다. 그후, 표적 항원에 대한 결합제를 용액 결합 경쟁 ELISA 분석법 또는 스팟(spot) 경쟁 분석법에서 친화력에 대해 스크리닝할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 제조된 XYZ 코돈 셋트를 이용하여 라이브러리로부터 고친화력 결합제를 단리할 수 있다. 이러한 결합제는 세포 배양에서 높은 수율로 항체 또는 항원 결합 단편으로 쉽게 생산될 수 있다.
일부 실시양태에서, CDRH3 영역의 길이에서의 다양성이 더 큰 라이브러리들을 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 약 7개 내지 19개 범위의 CDRH3 영역이 있는 라이브러리들을 생성시키는 것이 바람직할 수 있다.
이러한 실시양태의 라이브러리로부터 단리된 고친화력 결합제는 박테리아 및 진핵생물 세포 배양에서 높은 수율로 쉽게 생산된다. gD 태그, 바이러스 코트 단백질 성분 서열과 같은 서열을 쉽게 제거하고/하거나, 높은 수율의 전장 항체 또는 항원 결합 단편의 생산을 제공하기 위해 불변 영역 서열을 포함하도록 벡터를 디자인할 수 있다.
CDRH3 내에 돌연변이가 있는 라이브러리가 다른 CDR, 예를 들어 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 및/또는 CDRH2의 변이체 버젼을 함유하는 라이브러리와 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 한 실시양태에서, CDRH3 라이브러리가 미리 정해진 코돈 셋트를 사용하여 위치 28, 29, 30, 31, 및/또는 32에 변이체 아미노산이 있는 인간화 4D5 항체 서열의 정황에서 생성된 CDRL3 라이브러리와 조합된다. 또 다른 실시양태에서, CDRH3에 대한 돌연변이가 있는 라이브러리가 변이체 CDRH1 및/또는 CDRH2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 라이브러리와 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, 위치 28, 30, 31, 32 및 33에 변이체 아미노산이 있는 인간화 항체 4D5 서열로 CDRH1 라이브러리가 생성된다. 미리 정해진 코돈 셋트를 사용하여 위치 50, 52, 53, 54, 56 및 58에 변이체 아미노산이 있는 인간화 항체 4D5의 서열로 CDRH2 라이브러리가 생성될 수 있다.
(xi) 항체 돌연변이체
파지 라이브러리로부터 생성된 항체를 추가로 변형시켜, 어버이 항체에 비해 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 성질이 개선된 항체 돌연변이체를 생성시킬 수 있다. 사용된 분석법이 생물학적 활성 분석법인 경우, 선택된 분석법에서의 항체 돌연변이체의 생물학적 활성이 이러한 분석법에서의 어버이 항체의 생물학적 활성보다 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 50배 이상, 종종 약 100배 또는 200배 이상 더 양호할 수 있다. 예를 들어, 항-표적 항체 돌연변이체는 표적에 대한 결합 친화력이 어버이 항체의 결합 친화력보다 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 50배 이상, 종종 약 100배 또는 200배 이상 더 강할 수 있다.
항체 돌연변이체를 생성시키기 위해, 하나 이상의 아미노산 변경 (예를 들어, 치환)이 어버이 항체의 초가변 영역 중 하나 이상에 도입된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 프레임워크 영역 잔기의 하나 이상의 변경 (예를 들어, 치환)이 어버이 항체에 도입될 수 있고, 이는 제2 포유류 종으로부터의 항원에 대한 항체 돌연변이체의 결합 친화력에서의 개선을 초래한다. 변형될 프레임워크 영역 잔기의 예로는 비-공유결합적으로 항원에 직접적으로 결합하고/하거나 (문헌 [Amit et al., Science 233:747-753, 1986]); CDR의 입체형상과 상호작용하거나 이에 영향을 미치고/미치거나 (문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987]); VL - VH 계면에 참여 (EP 239 400B1)하는 것들이 포함된다. 특정 실시양태에서, 이같은 프레임워크 영역 잔기들 중 하나 이상의 변형은 제2 포유류 종으로부터의 항원에 대한 항체의 결합 친화력의 강화를 초래한다. 예를 들어, 약 1개 내지 약 5개의 프레임워크 잔기가 본 발명의 이러한 실시양태에서 변경될 수 있다. 때때로, 이는, 초가변 영역 잔기가 변경되지 않은 경우에도, 임상전 실험에서 사용하기에 적절한 항체 돌연변이체를 산출시키는데 충분할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 항체 돌연변이체는 추가적인 초가변 영역 변경(들)을 포함할 것이다.
변경되는 초가변 영역 잔기는, 특히 어버이 항체의 출발 결합 친화력이 무작위로 생산된 항체 돌연변이체가 쉽게 스크리닝될 수 있도록 하는 경우에, 무작위로 변화될 수 있다.
이같은 항체 돌연변이체를 생성시키기 위한 한 유용한 절차가 "알라닌-스캐닝 돌연변이유발"로 칭해진다 (문헌 [Cunningham et al., Science 244:1081-1085, 1989]). 여기서, 초가변 영역 잔기(들) 중 하나 이상이 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기(들)로 치환되어, 제2 포유류 종으로부터의 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다. 그 후, 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 초가변 영역 잔기(들)를 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가적인 또는 다른 돌연변이를 도입함으로써 정련한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 그 자체의 성질이 미리 결정될 필요는 없다. 이러한 방식으로 생산된 ala-돌연변이체를 본원에 기술된 바와 같이 이의 생물학적 활성에 대해 스크리닝한다.
일반적으로, 보존적 치환 예컨대 "바람직한 치환"의 표제 하에 하기에 제시된 것들로 치환이 시작될 것이다. 이같은 치환으로 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화력)에서의 변화가 초래되면, 표 4에서 "예시적 치환"으로 명명된 또는 아미노산 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기술되는 바와 같은 더욱 실질적인 변화가 도입되고, 생성물이 스크리닝된다.
Figure pct00043
항체의 생물학적 성질에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형상과 같은, 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피(bulk)를 유지하는 것에 대한 효과가 현저하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질을 기초로 하기 군으로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr, asn, gln;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 클래스 중의 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다.
또 다른 실시양태에서, 변형을 위해 선택된 부위가 파지 디스플레이 (상기 참조)를 사용하여 친화력 성숙된다.
당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 아미노산 서열 돌연변이체를 코딩하는 핵산 분자가 제조된다. 이러한 방법에는 어버이 항체의 앞서 제조된 돌연변이체 또는 비-돌연변이체 버젼의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발 (예를 들어, 문헌 [Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)] 참조), PCR 돌연변이유발, 및 카셋트 돌연변이유발이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 항체 돌연변이체에서 단일 초가변 영역 잔기만이 치환될 것이다. 또 다른 실시양태에서, 어버이 항체의 초가변 영역 잔기들 중 2개 이상, 예를 들어 약 2개 내지 약 10개의 초가변 영역이 치환될 것이다.
통상적으로, 생물학적 성질이 개선된 항체 돌연변이체는 어버이 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성이 75％ 이상인, 예를 들어, 서열 동일성 또는 유사성이 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 또는 95％ 이상인 아미노산 서열을 가질 것이다. 이러한 서열에 관한 동일성 또는 유사성은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 어버이 항체 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 (즉, 동일한 잔기) 또는 유사한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 (즉, 공통적인 측쇄 성질을 기초로 동일한 군으로부터의 아미노산 잔기 (상기 참조))의 백분율로 본원에서 정의된다. N-말단, C-말단 또는 내부 확장, 결실, 또는 가변 도메인 바깥쪽에서의 항체 서열 내로의 삽입 중 어떤 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않아야 한다.
항체 돌연변이체의 생산 후, 어버이 항체와 비교하여 이러한 분자의 생물학적 활성을 결정한다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 항체의 결합 친화력 및/또는 기타 생물학적 활성을 결정하는 것을 수반할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체 돌연변이체들의 패널을 제조하여, 항원 또는 이의 단편에 대한 결합 친화력에 대해 스크리닝한다. 이러한 초기 스크리닝으로부터 선별된 항체 돌연변이체들 중 하나 이상에 하나 이상의 추가적인 생물학적 활성 분석법을 임의적으로 적용하여, 결합 친화력이 강화된 항체 돌연변이체(들)이, 예를 들어 임상전 연구에, 실제로 유용한지를 확인한다.
이렇게 선별된 항체 돌연변이체(들)에, 종종 항체의 의도된 용도에 따라, 추가적인 변형을 적용할 수 있다. 이같은 변형은 추가적인 아미노산 서열 변경, 이종 폴리펩티드(들)에의 융합 및/또는 공유결합 변형 예컨대 하기에 상세히 설명되는 것들을 수반할 수 있다. 아미노산 서열 변경과 관련하여, 예시적인 변형이 상기에 상세하게 설명되어 있다. 예를 들어, 항체 돌연변이체의 적합한 입체형상을 유지하는데 수반되지 않는 임의의 시스테인 잔기가 또한 치환되어 (일반적으로는 세린으로 치환됨), 분자의 산화 안정성을 개선시키고, 비정상적인 가교를 방지할 수 있다. 역으로, 시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어 이의 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우). 아미노산 돌연변이체의 또 다른 유형에서는 글리코실화 패턴이 변경된다. 이는 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키고/시키거나 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가함으로써 달성될 수 있다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (식중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신 또한 사용될 수 있다. 항체에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결 글리코실화 부위의 경우). 변경은 원래의 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 또한 달성될 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우).
(xii) 항체의 재조합 생산
항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 코딩하는 핵산을 단리하여, 추가적인 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 삽입할 수 있다. 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써), 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA가 쉽게 단리되고 서열분석된다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 일반적으로 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다 (예를 들어, 참고로 본원에 명확하게 포함된 미국 특허 번호 5,534,615에 기술되어 있음).
본원에서의 벡터 내의 DNA의 클로닝 또는 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 상기 기술된 원핵생물, 효모, 또는 고급 진핵생물 세포이다. 이러한 목적을 위한 적절한 원핵생물에는 유박테리아(eubacteria), 예컨대 그람(Gram)-음성 또는 그람-양성 생물, 예를 들어, 장내세균 예컨대 에쉐리키아(Escherichia), 예를 들어, 대장균, 엔테로박테르(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실러스(Bacillus) 예컨대 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, DD 266,710에 개시된 바실러스 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas) 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 한 예시적인 대장균 클로닝 숙주는 대장균 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주 예컨대 대장균 B, 대장균 X1776 (ATCC 31,537), 및 대장균 W3110 (ATCC 27,325)도 적절하다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적이다.
원핵생물에 더하여, 진핵생물 미생물 예컨대 필라멘트형 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 베이커(baker) 효모가 저급 진핵생물 숙주 미생물들 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드라소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 클루이베로마이세스 테르모톨레란스(K. Thermotolerans), 및 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 예컨대 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 필라멘트형 진균, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주 예컨대 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans) 및 아스페르길루스 니게르(A. niger)와 같은 다수의 또 다른 속, 종, 및 계통이 통상적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다.
글리코실화 항체의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster) (과일파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 수많은 배큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 상응하는 증식허용성 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어, 오토그래파 칼리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하고, 이같은 바이러스들은, 특히 스포롭테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로 사용될 수 있다. 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포가 가장 흥미롭고, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되어 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, 예를 들어, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:4216, 1980]); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-25, 1980]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트(buffalo rat) 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 항체 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적합하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지 예컨대 햄(Ham) F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하는데 적절하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44, 1979], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255, 1980], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 번호 Re.30,985에 기술된 배지들 중 임의의 것을 숙주 세포에 대한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이러한 배지에 필요하다면 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 젠타마이신(GENTAMYCIN)™), 미량원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 임의의 또 다른 필요한 보충물이 당업자에게 공지된 적합한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현에 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포 내에서 생산되거나, 원형질막 주위공간 내에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 첫번째 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 입상물질 잔해물을, 예를 들어, 원심분리 또는 초여과에 의해 제거한다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 일반적으로 이같은 발현 시스템으로부터의 상등액을 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 초여과 유닛을 사용하여 먼저 농축한다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제 예컨대 PMSF가 임의의 상기 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물을, 예를 들어, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제할 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13, 1983]). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575, 1986]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 거의 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스 예컨대 제어형 다공성 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 유속이 더 빠르게 하고 처리 시간이 더 짧게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (제이.티. 베이커(J. T. Baker) (뉴저지 필립스버그))가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라 기타 단백질 정제 기술 예컨대 이온-교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 이용가능하다.
E. 뉴런 또는 축삭 변성의 억제제의 용도
본원에 기술된 표적의 억제제, 예컨대 본원에 기술된 스크리닝 분석법에서 확인 또는 특성화된 억제제 (예를 들어, 상기 기술된 특정 억제제)를 뉴런 또는 축삭 변성을 억제하는 방법에서 사용할 수 있다. 따라서, 억제제는, 예를 들어, (i) 신경계의 장애 (예를 들어, 신경변성 질환), (ii) 신경계 외부에 1차 효과가 있는 질환, 상태 또는 치료법에 대해 2차적인 신경계의 상태, (iii) 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상, (iv) 통증, (v) 눈-관련 신경변성, (vi) 기억 상실, 및 (vii) 정신과 장애의 치료법에서 유용하다. 일부 이러한 질환, 상태, 및 손상의 비-제한적인 예가 하기에서 제공된다.
본 발명에 따라 예방 또는 치료될 수 있는 신경변성 질환 및 상태의 예로는 근육위축성 측삭 경화증 (ALS), 삼차 신경통, 혀인두 신경통, 벨 마비, 중증 근육무력증, 근육 퇴행위축, 진행성 근육 위축, 원발성 측삭 경화증 (PLS), 거짓 연수 마비, 진행성 연수 마비, 척수 근육 위축, 진행성 연수 마비, 유전성 근육 위축, 추간판 증후군 (예를 들어, 추간판 탈출, 파열 및 탈수 증후군), 경추증, 얼기 장애, 흉곽 출구 파괴 증후군, 말초 신경병증, 포르피린증, 경도 인지 손상, 알츠하이머 질환, 헌팅톤 질환, 파킨슨 질환, 파킨슨-플러스 질환 (예를 들어, 다계통 위축, 진행성 핵상 마비 및 피질기저 변성), 루이체 치매, 전두측두엽 치매, 탈수초성 질환 (예를 들어, 길랑-바레 증후군 및 다발성 경화증), 샤르코-마리-투스 질환 (CMT; 유전성 운동 및 감각 신경병증 (HMSN), 유전성 감각운동 신경병증 (HSMN), 및 비골근 위축증으로 또한 알려져 있음), 프리온 질환 (예를 들어, 크로이츠펠트-야콥 질환, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 증후군 (GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 및 소 해면상 뇌병증 (BSE; 통상적으로 광우병으로 알려져 있음)), 픽 질환, 간질, 및 AIDS 치매 복합증 (HIV 치매, HIV 뇌병증, 및 HIV-관련 치매로 또한 알려져 있음)이 포함된다.
본 발명의 방법은 눈-관련 신경변성 및 관련 질환 및 상태, 예컨대 녹내장, 격자 이영양증, 색소성 망막염, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 건식 또는 습식 AMD와 관련된 광수용체 변성, 기타 망막 변성, 시신경 드루젠, 시각 신경병증, 및 시신경염의 예방 및 치료에서 또한 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 예방 또는 치료될 수 있는 여러 유형의 녹내장의 비-제한적인 예로는 원발성 녹내장 (원발성 개방각 녹내장, 만성 개방각 녹내장, 만성 단순 녹내장, 및 단순 녹내장으로 또한 알려져 있음), 저안압 녹내장, 원발성 폐쇄각 녹내장 (원발성 각-폐쇄 녹내장, 녹내장, 협각 녹내장, 동공-차단 녹내장, 및 급성 울혈성 녹내장), 급성 폐쇄각 녹내장, 만성 폐쇄각 녹내장, 간헐성 폐쇄각 녹내장, 만성 개방각 폐쇄 녹내장, 색소성 녹내장, 비늘 녹내장 (거짓비늘 녹내장 또는 수정체낭성 녹내장으로 또한 알려져 있음), 발육이상 녹내장 (예를 들어, 원발성 선천적 녹내장 및 소아 녹내장), 속발성 녹내장 (예를 들어, 염증성 녹내장 (예를 들어, 포도막염 및 푹스(Fuchs) 이색성 홍채섬모체염)), 수정체성 녹내장 (예를 들어, 성숙 백내장이 동반된 폐쇄각 녹내장, 수정체낭의 파열에 대해 속발성인 수정체과민성 녹내장, 수정체독성 섬유주 차단으로 인한 수정체용해 녹내장, 및 수정체 부분이탈), 안내 출혈에 대해 속발성인 녹내장 (예를 들어, 적혈구파괴성 녹내장으로 또한 알려져 있는, 전방출혈 및 용혈 녹내장), 외상성 녹내장 (예를 들어, 전방각 후퇴 녹내장, 전방각에 대한 외상성 후퇴, 수술후 녹내장, 무수정체 동공 차단, 및 섬모체 차단 녹내장), 신생혈관 녹내장, 약물-유도 녹내장 (예를 들어, 코르티코스테로이드-유도 녹내장 및 알파-키모트립신 녹내장), 독성 녹내장, 및 안내 종양, 망막 박리, 눈의 중증 화학적 화상 및 홍채 위축과 관련된 녹내장이 포함된다.
본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 통증 유형의 예로는 하기의 상태와 관련된 통증이 포함된다: 만성 통증, 섬유근육통, 척추 통증, 수근관 증후군, 암으로 인한 통증, 관절염, 좌골신경통, 두통, 수술로 인한 통증, 근육 연축, 요통, 내장 통증, 손상으로 인한 통증, 치통, 신경성 또는 신경병성 통증과 같은 신경통, 신경 염증 또는 손상, 대상포진, 추간판 탈출, 인대 파열, 및 당뇨병.
신경계 외부에 1차 효과가 있는 특정 질환 및 상태가 신경계에 대한 손상에 이를 수 있고, 이는 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있다. 이같은 상태의 예로는 당뇨병, 암, AIDS, 간염, 신장 기능이상, 콜로라도 진드기 열, 디프테리아, HIV 감염, 나병, 라임 질환, 결절성 다발동맥염, 류머티스성 관절염, 사르코이드증, 쇼그렌 증후군, 매독, 전신성 홍반 루푸스, 및 아밀로이드증에 의해 예를 들어 야기되는 말초 신경병증 또는 신경통이 포함된다.
또한, 본 발명의 방법은 중금속 (예를 들어, 납, 비소 및 수은) 및 공업용 용매가 포함되는 독성 화합물, 뿐만 아니라 화학치료제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 시스플라틴), 댑손, HIV 약제 (예를 들어, 지도부딘(Zidovudine), 디다노신(Didanosine), 스타부틴(Stavudine), 잘시타빈(Zalcitabine), 리토나비어(Ritonavir), 및 암프레나비어(Amprenavir)), 콜레스테롤 저하 약물 (예를 들어, 로바스타틴(Lovastatin), 인다파미드(Indapamid), 및 젬피브로질(Gemfibrozil)), 및 심장 또는 혈액 압력 약제 (예를 들어, 아미다론(Amiodarone), 히드랄라진(Hydralazine), 퍼헥실린(Perhexiline)), 및 메트로니다졸이 포함되는 약물에의 노출에 의해 야기되는 신경 손상, 예컨대 말초 신경병증의 치료에서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상을 치료하는데 또한 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 물리적 손상 (예를 들어, 화상, 상처, 수술 및 사고와 관련됨), 허혈, 저온에의 장기 노출 (예를 들어, 동상)에 의해 야기되는 말초 신경 손상, 뿐만 아니라 예를 들어, 졸중 또는 두개내 출혈 (예컨대 뇌 출혈)로 인한, 중추 신경계에 대한 손상의 치료에서 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명의 방법은 기억 상실, 예를 들어, 연령-관련 기억 상실의 예방 또는 치료에서 사용될 수 있다. 상실에 의해 영향을 받을 수 있고, 따라서 본 발명에 따라 치료될 수 있는 기억 유형에는 일화 기억, 의미 기억, 단기 기억 및 장기 기억이 포함된다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는, 기억 상실과 관련되는 질환 및 상태의 예로는 경도 인지 손상, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 화학요법, 스트레스, 졸중, 및 외상성 뇌 손 손상 (예를 들어, 진탕)이 포함된다.
본 발명의 방법은 정신분열증, 망상 장애, 정신분열정동 장애, 정신분열형 장애, 공유 정신병적 장애, 정신병, 편집성 인격 장애, 분열성 인격 장애, 경계성 인격 장애, 반사회성 인격 장애, 자기애성 인격 장애, 강박 장애, 섬망, 치매, 기분 장애, 양극성 장애, 우울증, 스트레스 장애, 공황 장애, 광장공포증, 사회 공포증, 외상후 스트레스 장애, 불안 장애, 및 충동 조절 장애 (예를 들어, 도벽, 병적 도박, 방화벽, 및 발모벽)가 예를 들어 포함되는 정신과 장애의 치료에서 또한 사용될 수 있다.
상기 기술된 생체내 방법에 더하여, 본 발명의 방법은 생체 외에서 신경을 치료하는데 사용될 수 있고, 이는 신경 이식편 또는 신경 이식물의 정황에서 유익할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 억제제는 시험관 내에서 신경 세포를 배양하는데 사용하기 위한 배양 배지의 성분으로서 유용할 수 있다.
원하는 정도의 순도를 지니는 억제제 (예컨대 소분자 또는 항체)를 임의적인 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA] 참조)와 혼합함으로써 본원에 기술된 억제제의 치료 제형이 동결건조 케이크 또는 수용액의 형태로 보관용으로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산, BHA, 및 BHT가 포함되는 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 당 알콜 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온 예컨대 나트륨; 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(Tween), 플루로닉스(Pluronics) 또는 PEG를 포함한다.
생체내 투여에 사용될 억제제는 반드시 무균성이어야 하고, 이는 동결건조 및 재구성 전 또는 후의 무균성 여과막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 치료 조성물은 무균성 접근 포트(port)가 있는 용기, 예를 들어, 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 놓일 수 있다.
임의적으로 억제제는 서로, 또는 관련된 질환 또는 상태의 치료에서 유용한 것으로 공지된 다른 작용제와 조합될 수 있거나 함께 투여될 수 있다. 따라서, ALS의 치료에서, 예를 들어, 억제제는 릴루졸(Riluzole) (릴루텍(Rilutek)), 미노시클린, 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1), 및/또는 메틸코발라민과 조합되어 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 파킨슨 질환의 치료에서, 억제제는 L-도파, 도파민 효능제 (예를 들어, 브로모크립틴, 페르골리드, 프라미펙솔, 로피니롤, 카베르골린, 아포모르핀, 및 리수리드), 도파 데카르복실라제(decarboxylase) 억제제 (예를 들어, 레보도파, 벤세라지드 및 카르비도파), 및/또는 MAO-B 억제제 (예를 들어, 셀레길린 및 라사길린)와 함께 투여될 수 있다. 추가적인 예에서, 알츠하이머 질환의 치료에서, 억제제는 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase) 억제제 (예를 들어, 도네페질, 갈란타민, 및 리바스티그민) 및/또는 NMDA 수용체 길항제 (예를 들어, 메만틴)와 함께 투여될 수 있다. 조합 요법은, 당업자에 의해 적합한 것을 결정되는 바와 같이, 동시 투여 또는 순차 투여 (동일한 경로 또는 상이한 경로에 의한 투여)를 수반할 수 있다. 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 조합물을 포함하는 제약 조성물 및 키트를 또한 포함한다.
상기 언급된 조합물에 더하여, 본 발명에 포함되는 다른 조합물은 상이한 뉴런 영역들의 변성의 억제제들의 조합물이다. 따라서, 본 발명은 (i) 뉴런 세포체의 변성을 억제하고, (ii) 축삭 변성을 억제하는 작용제들의 조합물을 포함한다. 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, GSK 및 전사의 억제제가 뉴런 세포체의 변성을 방지하는 것으로 발견된 한편, EGFR 및 p38 MAPK의 억제제는 축삭의 변성을 방지한다. 따라서, 본 발명은 GSK 및 EGFR (및/또는 p38 MAPK)의 억제제들의 조합물, 전사 억제제 및 EGFR (및/또는 p38 MAPK)의 조합물, 및 이중 류신 지퍼-보유 키나제 (DLK), 글리코겐 신타제 키나제 3β (GSK3β), p38 MAPK, EGFF, 포스포이노시티드 3-키나제 (P13K), 시클린-의존적 키나제 5 (cdk5), 아데닐릴 시클라제, c-Jun N-말단 키나제 (JNK), BCL2-회합 X 단백질 (Bax), Ih 채널, 칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 키나제 (CaMKK), G-단백질, G-단백질-커플링 수용체, 전사 인자 4 (TCF4), 및 β-카테닌의 억제제들의 추가적인 조합물을 포함한다. 이러한 조합물에서 사용되는 억제제들은 본원에 기술된 것들 중 임의의 것이거나 또는 이러한 표적의 다른 억제제일 수 있다.
억제제의 투여 경로는 공지된 방법에 따라 선택되고, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 또는 하기에 기술되는 바와 같은 서방성 방출 시스템에 의한 것이다.
뇌내 사용을 위해, CNS의 뇌척수액 저장소 내로의 주입에 의해 연속적으로 화합물이 투여될 수 있지만, 볼루스(bolus) 주입이 허용될 수 있다. 억제제는 뇌실 내로 투여되거나, 또는 다른 방식으로 CNS 또는 척수액 내로 도입될 수 있다. 유치 카테터(indwelling catheter) 및 연속 투여 수단 예컨대 펌프의 사용에 의해 투여가 수행될 수 있거나, 또는 서방성 비히클의 이식, 예를 들어, 뇌내 이식에 의해 투여될 수 있다. 더욱 구체적으로, 억제제가 만성적으로 이식된 삽입관을 통해 주사될 수 있거나, 또는 삼투압 미니펌프의 보조로 만성적으로 주입될 수 있다. 소형 튜빙(tubing)을 통해 뇌실에 단백질을 전달하는 피하 펌프가 이용가능하다. 고도로 정교한 펌프가 피부를 통해 재충전될 수 있고, 이의 전달 속도는 수술을 시술하지 않으면서 설정될 수 있다. 피하 펌프 기구 또는 완전 이식형 약물 전달 시스템을 통한 연속적인 뇌실내 주입을 수반하는 적절한 투여 프로토콜 및 전달 시스템의 예는 문헌 [Harbaugh, J. Neural Transm. Suppl., 24:271, 1987]; 및 [DeYebenes, et al., Mov. Disord. 2:143, 1987]에 기술된 바와 같이, 알츠하이머 질환 환자 및 파킨슨 질환에 대한 동물 모델에게 도파민, 도파민 효능제, 및 콜린작용성 효능제를 투여하기 위해 사용되는 것들이다.
서방성 제제의 적절한 예에는 성형품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 중합체 매트릭스가 포함된다. 서방성 매트릭스에는 폴리에스테르, 히드로젤, 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919, EP 58,481), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (문헌 [Sidman et al., Biopolymers 22:547, 1983]), 폴리 (2-히드록시에틸-메타크릴레이트) (문헌 [Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167, 1981]; [Langer, Chem. Tech. 12:98, 1982]), 에틸렌 비닐 아세테이트 ([Langer, et al., 동일문헌]) 또는 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988A)이 포함된다. 서방성 조성물은 리포솜으로 포획된 화합물을 또한 포함하고, 이는 공지된 방법으로 제조될 수 있다 (문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688, 1985]; [Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:4030, 1980]; 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545; 및 EP 102,324A). 통상적으로, 리포솜은 지질 함량이 약 30 몰％ 콜레스테롤을 초과하는 소형 (약 200-800 옹스트롬)의 단층 유형이고, 선택된 비율은 최적의 치료법을 위해 조절된다.
치료적으로 사용될 활성 화합물의 유효량은, 예를 들어, 치료 목적, 투여 경로, 및 환자의 상태에 좌우될 것이다. 따라서, 최적의 치료 효과를 수득하기 위해 필요한 대로 치료사가 투여량을 적정하고 투여 경로를 변형시키는 것이 필요할 것이다. 예를 들어, 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상까지 (예를 들어, 약 1 ㎍/㎏ 내지 1 ㎎/㎏, 약 1 ㎍/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏, 약 1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 200 ㎎/㎏, 약 50 ㎎/㎏ 내지 약 150 mg/mg, 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 500 ㎎/㎏, 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 400 ㎎/㎏, 및 약 200 ㎎/㎏ 내지 약 400 ㎎/㎏)의 범위일 것이다. 전형적으로, 임상의는 치료되는 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상의 개선, 또는 최적으로는 이의 제거를 초래하는 투여량에 도달할 때까지 활성 억제제를 투여할 것이다. 통상적인 분석법에 의해 이러한 치료법의 진행이 쉽게 모니터링된다. 본원에서 제공되는 하나 이상의 작용제는 함께 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다 (예를 들어, 하나의 작용제가 제2 작용제의 투여 전에 투여된다). 하나 이상의 작용제가 상이한 기술을 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다 (예를 들어, 한 작용제는 경구 투여될 수 있는 한편, 제2 작용제는 근육내 주사에 의해 또는 비강 내로 투여된다). 하나 이상의 작용제가 동일한 시간에 대상체에서 약리학적 효과를 지니도록 하나 이상의 작용제가 투여될 수 있다. 별법적으로, 1차로 투여된 작용제의 약리학적 활성이 하나 이상의 2차로 투여되는 작용제 (예를 들어, 1가지, 2가지, 3가지, 또는 4가지의 2차로 투여되는 작용제)의 투여 전에 만료되도록 하나 이상의 작용제가 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 보조 치료제)는 비경구 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 폐내 투여, 비강내 투여, 및 국소 치료를 위해 원하는 경우의 병변내 투여가 포함되는 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 및 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 펄스(pulse) 주입에 의해, 특히 항체의 용량을 감쇠시키면서, 투여될 수 있다. 투여가 단기간인지 또는 장기간인지 여부에 부분적으로 의존적으로, 임의의 적절한 경로, 예를 들어, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투약이 이루어질 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체의 결합 표적의 위치가 항체의 제조 및 투여에서 고려될 수 있다. 결합 표적이 세포내 분자인 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 결합 표적이 위치하는 세포 내로 도입되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인트라바디(intrabody)로서 세포내에서 발현될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "인트라바디"는, 문헌 [Marasco, Gene Therapy 4:11-15, 1997]; [Kontermann, Methods 34:163- 170, 2004]; 미국 특허 번호 6,004,940 및 6,329,173; 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0104402, 및 PCT 공개 번호 WO2003/077945에 기술된 바와 같이, 세포 내에서 발현되고 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 지칭한다. 인트라바디의 세포내 발현은 원하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산 (이러한 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 유전자와 일반적으로 회합된 야생형 리더 서열 및 분비 신호가 없음)을 표적 세포 내로 도입함으로써 실행된다. 미세주입, 탄도 주입, 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포솜, 및 관심 핵산을 보유하는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 우두 벡터로의 형질감염이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 핵산을 세포 내로 도입하는 임의의 표준 기술을 사용할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 내재화 항체가 제공된다. 항체는 세포 내로의 항체의 전달을 강화하는 특정 특성을 가질 수 있거나, 또는 이같은 특성을 갖도록 변형될 수 있다. 이를 달성하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체의 양이온화는 세포 내로의 이의 흡수를 용이하게 하는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,703,019 참조). 리포펙션(lipofection) 또는 리포솜을 또한 사용하여 항체를 세포 내로 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에는, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제 단편이 일반적으로 유리하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열을 기초로, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력이 유지되는 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이같은 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있고/있거나 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7889-7893, 1993] 참조.
표적 세포 내로의 조절자 폴리펩티드의 진입이 당업계에 공지된 방법에 의해 강화될 수 있다. 예를 들어, 특정 서열, 예컨대 HIV Tat 또는 안테나페디아(Antennapedia) 호메오도메인 단백질이 세포막을 가로지르는 이종성 단백질의 효율적인 흡수를 지시할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:4325-4329, 1999] 참조.
결합 표적이 뇌 내에 존재하는 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 신경변성 질환은 혈액-뇌 장벽의 투과성 증가와 관련되어, 항체 또는 항원-결합 단편이 뇌에 용이하게 도입될 수 있다. 혈액-뇌 장벽이 무손상으로 유지되는 경우, 물리적 방법, 지질-기반 방법, 및 수용체 및 채널-기반 방법이 포함되지만, 이에 한정되지 않는, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 분자를 수송하기 위한 여러 접근법이 당업계에 공지되어 있다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 물리적 방법에는 완전히 혈액-뇌 장벽을 우회하는 것, 또는 혈액-뇌 장벽에 구멍을 생성시키는 것이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 우회 방법에는 뇌 내로의 직접적인 주사 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9:398-406, 2002] 참조), 간질 주입/대류-증강 전달 (예를 들어, 문헌 [Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:2076-2080, 1994] 참조), 및 뇌 내에 전달 장치를 이식하는 것 (예를 들어, [Gill et al., Nature Med. 9:589-595, 2003]; 및 글리아델 웨이퍼스(Gliadel Wafers)™, 길드포드 파마슈티컬(Guildford Pharmaceutical) 참조)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 장벽 내에 구멍을 생성시키는 방법에는 초음파 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2002/0038086 참조), 삼투압 (예를 들어, 고장성(hypertonic) 만니톨의 투여에 의해 (문헌 [Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y., 1989])), 예를 들어 브래디키닌 또는 투과제 A-7에 의한 투과 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 및 5,686,416 참조), 및 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터로의 혈액-뇌 장벽에 걸쳐진 뉴런의 형질감염 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2003/0083299 참조)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 지질-기반 방법에는 항체 또는 항원-결합 단편을 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링된 리포솜에 캡슐화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0025313 참조), 및 항체 또는 항원-결합 단편을 저밀도 지질단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0204354 참조) 또는 아포지질단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0131692 참조)에 코팅하는 것이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 항원-결합 단편을 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법에는 글루코코르티코이드 차단제를 사용하여 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0065259, 2003/0162695, 및 2005/0124533 참조); 칼륨 채널을 활성화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0089473 참조), ABC 약물 수송인자를 억제하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0073713 참조); 항체를 트랜스페린으로 코팅하고 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성을 조절하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0129186 참조), 및 항체를 양이온화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,004,697 참조)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에서 사용되는 항체 조성물은 양질의 의료 업무와 일치하는 방식으로 제형, 조제 및 투여될 것이다. 이러한 상황에서 고려되는 인자에는 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유동물, 개별적인 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료인에게 공지된 기타 인자가 포함된다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의적으로는 현재 당해 장애를 예방하거나 치료하는데 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형된다. 이같은 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 본 발명의 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 기타 상기 논의된 인자에 좌우된다. 이들은 본원에서 기술된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99 ％로, 또는 적절한 것으로 실험적으로/임상적으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 일반적으로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 항체의 적합한 투여량 (단독으로 또는 또 다른 작용제와 조합되어 사용되는 경우)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 기존의 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 응답, 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어, 1회 이상의 분리된 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어 0.1 ㎎/㎏-10 ㎎/㎏)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 상태에 따라, 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 일반적으로 치료가 지속될 것이다. 한 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ (또는 이의 임의의 조합) 중 1가지 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이같은 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록). 초기의 높은 로딩 용량에 이어서 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 용량 처방계획은 약 4 ㎎/㎏의 초기 로딩 용량에 이어서 약 2 ㎎/㎏의 항체를 매주 유지 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 또 다른 투여량 처방계획이 유용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 쉽게 모니터링된다.
F. 뉴런 또는 축삭 변성의 활성화
본 발명은 뉴런 또는 축삭 변성을 활성화 또는 증가시키는 방법을 또한 포함한다. 이는 상기 표 2에 열거된 표적들 중 하나 이상 (뉴런 또는 축삭 변성을 활성화시키기 위해 이의 억제제가 사용될 수 있는 아데닐릴 시클라제 제외)의 활성화제 또는 효능제를 사용함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 이중 류신 지퍼-보유 키나제 (DLK), 글리코겐 신타제 키나제 3β (GSK3β), p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (p38 MAPK), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K), 시클린-의존적 키나제 5 (Cdk5), c-Jun N-말단 키나제 (JNK), BCL2-회합 X 단백질 (Bax), Ih 채널, 및 칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 키나제 (CaMKK)의 효능제가 축삭 변성을 활성화 또는 증가시키는 방법에서 사용될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 축삭 변성의 분석법에서 이같은 효능제를 확인 및 특성화할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 후보 효능제가 신경 성장 인자의 존재 하에, 뉴런이 배양되는 배지 내에 존재할 수 있고, 변성에 대한 이의 효과에 대해 평가될 수 있다. 뉴런 또는 축삭 변성의 효능제는 간질 및 자폐증이 포함되는 질환 또는 상태, 뿐만 아니라 축삭 가지치기 및 변성의 천연 프로세스의 실패를 특징으로 할 수 있는 임의의 질환 또는 상태의 예방 및 치료에서 사용될 수 있다. 상기 섹션 E에서 기술된 방법들과 같은 방법을 사용하여, 효능제를 제형하여 이같은 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여할 수 있다.
G. 제조품
본 발명의 또 다른 양상에서, 상기 기술된 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 유용한 물질을 함유하는 제조품 (예를 들어, 제약 조성물 또는 키트)이 제공된다. 제조품은 용기, 및 용기 상에 있는 또는 용기와 조합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적절한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알(vial), 주사기 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로 또는 또 다른 조성물과 조합되었을 때 상태를 치료 또는 예방하는데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트(port)가 있을 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 하나 이상의 활성 작용제는 본 발명의 억제제이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 가리킨다. 또한, 제조품은 (a) 본 발명의 억제제를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가적인 치료제를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서의 제조품은 조성물이 특정 상태를 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 가리키는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업용 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명이 하기의 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 상세하게 설명된다.
H. 실시예
상기 논의된 바와 같이, 뉴런 또는 축삭 변성은 신경변성 질환의 통상적인 특색이고, 신경계에 대한 손상 또는 외상의 결과로서 또한 발생한다. 그러나, 이러한 활성 프로세스를 조절하는 메커니즘은 이제 막 이해되기 시작하고 있다. 상이한뉴런 또는 축삭 변성 모델들을 사용하는 연구를 기초로, 장애 또는 손상의 성질에 따라 상이한 메커니즘이 이러한 프로세스에서 수반될 수 있는 것으로 보인다. 뉴런 또는 축삭 변성을 조절하는 이벤트를 추가로 특성화하기 위해, 뉴런 또는 축삭 변성 모델에서의 공지된 신호전달 경로를 표적으로 하는 소분자 화합물들의 라이브러리를 스크리닝하였다. 다중 신호전달 경로가 뉴런 또는 축삭 변성에 필요한 것으로 확인되었다. 현저하게, 다수의 키나제가 뉴런 또는 축삭 변성의 중개물로서 확인되었고, 추가적인 메커니즘 연구는 별개의 키나제들의 기능을 축삭 구획 또는 세포체 구획으로 국소화하였다. 이러한 경로들을 다른 변성 패러다임에서 또한 연구하였고, 이때 결과들이 유사하였으며, 이는 뉴런 또는 축삭 자가-파괴에 이르는 통상적인 분자 메커니즘을 시사한다. 이러한 실험들이 하기 실시예에서 기술된다.
실시예 1
뉴런 또는 축삭 변성의 모델
항-NGF 항체, 혈청 결핍/KCl 감소, 및 로테논 처리 분석법이 포함되는, 본원에 기술된 바와 같은 뉴런 또는 축삭 변성의 억제제를 확인 및 특성화하는데 사용될 수 있는 분석법들의 설명과 관련하여 상기 소개된 뉴런 또는 축삭 변성의 3가지 모델이 하기의 실험에서 사용되었다.
상기 기술된 바와 같이, 배양된 신경을 NGF로 처리하면 축삭의 증식이 초래되는 한편, 이같은 신경을 항-NGF 항체로 처리하면 축삭 변성이 초래된다 (도 1). 뉴런을 항-NGF 항체로 처리하면 여러 상이한 현미경경사에 의해 검출가능한 여러 상이한 형태학적 변화가 초래된다. 예를 들어, 축삭 단편화 전에 항-NGF 항체와 함께 배양된 신경에서 염주가 형성되었고, 일부 경우에는, 파열되는 것으로 나타났다 (도 2). 또 다른 예에서, 항-NGF 항체와 함께 배양된 축삭은 신장된 미토콘드리아가 없었고, 염주에서의 미토콘드리아의 축적을 나타냈으며, 이는 축삭 이동이 차단되는 것을 시사한다. 상당한 개수의 미토콘드리아가 축삭 단편화 수시간 이내에 여전히 활성이었다 (도 3). 추가적인 예가 세포골격 분해와 관련된다. 축삭절단 후, 미세관 네트워크가 액틴 및 신경미세섬유 네트워크 전에 분해된다. 반면에, NGF 중단 모델에서, 미세관 네트워크가 액틴 또는 신경미세섬유 네트워크 전에 분해되지 않았다 (도 4).
축삭 변성의 또 다른 모델은 축삭을 세포체로부터 분리시키는 축삭 내 병변의 발생에 의해 유도되는 왈러 변성이다 (도 5) (예를 들어, 문헌 [Raff et al., Science 296(5569):868-871, 2002] 참조). 저속 왈러 변성 (Wld S ) 돌연변이체에서, 야생형 대조군과 비교하여, 축삭 변성이 유의하게 지연되었다 (도 5; 문헌 [Araki et al., Science 305(5686):1010-1013, 2004]). Wld S 돌연변이체의 효과는 축삭 자가-파괴 메커니즘이 존재하는 것의 증거이고, 이러한 메커니즘은 Wld S 돌연변이체에서 약화된다. Wld S 는 NGF 중단 후 축삭을 보호하였지만, 아폽토시스를 방지하지는 않았다.
항-NGF 항체, 혈청 결핍/KCL 감소, 및 로테논 처리 분석법에 관한 추가적인 정보들이 실시예 2-4 (항-NGF 항체), 7 (혈청 결핍/KCl 감소), 및 8 및 9 (로테논 처리)에서 제공된다.
실시예 2
뉴런 또는 축삭 변성의 억제제에 대한 스크린
실시예 1에 기술된 항-NGF 항체 모델이 뉴런 또는 축삭 변성의 억제제에 대한 스크린에서 사용되었다. 400개를 초과하는 소분자의 라이브러리 (토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience))를 테스트하여, 어떤 것 (존재하는 경우)이 항-NGF 항체의 존재 하에 관찰되는 변성을 조절하는지를 확인하였다.
방법 및 물질
마우스 E13.5 배아를 해부하고, L15 배지 (인비트로젠(Invitrogen)) 내에 놓았다. 이러한 배아로부터 DRG가 부착되어 있는 척수를 절제해 냈다. DRG가 부착되어 있는 척수를 얼음 상의 L15 배지 + 5％ 염소 혈청 (깁코(Gibco)) 내에 놓았다. 텅스텐 바늘을 사용하여 DRG를 제거하고, 나머지 척수를 폐기하였다. 8웰 슬라이드에 25 ng/㎖ NGF (로쉐(Roche))가 첨가된 N3-F12 용액 (23 ㎖ 햄(Ham) F12, 1 ㎖ N3 보충물, 및 1 ㎖ 1 M 글루코스)을 채웠다. (N3 보충물은 하기의 성분들을 하기의 순서로 10.02 ㎖의 총 부피로 혼합함으로서 제조된 N3 100× 농축물의 희석에 의해 제조되었다 (-20℃에서 보관될 수 있음): 5.0 ㎖ 행크(Hank) 완충 염수 용액 (HBSS; Ca, Mg 프리(free); 인비트로젠), 1.0 ㎖ 소 혈청 알부민 (HBSS 내의 10 mg/㎖ = 150 μM), 2.0 ㎖ 트랜스페린(Transferrin) (T1147-1G, 인간, HBSS 내의 100 mg/㎖ = 1.1 mM), 1.0 ㎖ 아셀렌산나트륨 (S9133-1MG, HBSS 내의 0.01 mg/㎖ = 58 μM), 0.4 ㎖ 푸트레신 디히드로클로라이드 (P5780-5G, HBSS 내의 80 mg/㎖ = 500 mM), 0.2 ㎖ 프로게스테론 (P8783-5G, 무수 에탄올 내의 0.125 mg/㎖ = 400 μM), 0.02 ㎖ 코르티코스테론 (C2505-500MG, 무수 에탄올 내의 2 mg/㎖ = 5.8 mM), 0.1 ㎖ 트리요오도티오닌, 나트륨 염 (T6397-100MG, 0.01 N NaOH 내의 0.2 mg/㎖ = 300 μM), 0.4 ㎖ 인슐린 (I6634-250MG, 소 췌장, 241 U/mg, 20 mM HCl 내의 25 mg/㎖ = 4.4 mM). 40 ㎖의 총 부피로 하기의 물질들을 조합함으로써 N3 보충물 스톡이 제조되었다: 10 ㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (100×, 깁코), 10 ㎖ 글루타민 (200 mM, 깁코), 10 ㎖ MEM 비타민 (100×, 깁코), 10 ㎖ N3 농축물 (100×, 상기 참조). 혼합물을 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 필터 멸균하고, 1-2 ㎖ 분취량을 -20℃에서 보관하였다).
DRG를 반으로 절개하고, 8-챔버 슬라이드 (BD 바이오코트(Biocoat) PDL/라미닌 코팅 유리, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))의 각각의 웰의 중앙에 놓았다. 실온에서 5-10분 동안 DRG가 슬라이드에 부착되도록 한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 선택된 억제제를 항-NGF 항체를 첨가하기 1시간 전에 100 μM (윗줄) 또는 10 μM (아랫줄)의 농도로 첨가하였다. 항-NGF 항체를 슬라이드의 오른쪽 절반 (4개의 웰)에 25 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 20시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 슬라이드를 250 ㎕의 고정 용액을 250 ㎕의 배양 배지에 직접 첨가함으로써 30％ 수크로스/8％ 파라포름알데하이드 (PFA)로 고정하였다. (30％ 수크로스/8％ PFA 용액을 제조하기 위해, 하기의 성분들을 교반 막대가 있는 600 ㎖ 비이커에 첨가하였다: 250 ㎖ 16％ PFA (카탈로그# 15710-S, 일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈(Electron Microscopy Sciences)), 50 ㎖ 10× PBS pH 7.4, 및 15O g 수크로스. 용해될 때까지 약한 가열 하에 용액을 혼합한 후, pH가 7.4가 되도록 6-8방울의 1 M NaOH를 첨가하였다. 그 후, 눈금 실린더에서 물로 부피가 500 ㎖가 되게 하였다. 용액을 잘 혼합하고, 분취량으로 놓고, 동결시켰다.) 슬라이드를 30분 동안 고정시킨 후, PBS로 1회 세정하였다. 모든 세포를 실온에서 2시간 동안 0.1％ 트리톤 및 1％ 염소 혈청 내에서 액틴 염색 (알렉사(Alexa)-568 접합 팔로이딘; 1:40; 인비트로젠), 막 염료 (DiO; 1:200; 인비트로젠), 및 DNA 염색 (훼스트(Hoechst) 33258; 1:10,000; 인비트로젠)으로 표지시켰다. 염색 용액을 제거하고, 슬라이드를 PBS로 1× 세정하고, 130 ㎕의 마운팅 배지 (플루오로마운트(Fluoromount) G; 일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈) 및 24×60 ㎜, #1 커버슬립 (VWR)으로 커버슬립을 덮었다.
결과
이러한 실험에서, 대조군 뉴런 (액틴 염색에 의해 가시화됨)에서 NGF 중단 시 상당한 변성이 나타났다. 반면에, 특정 소분자의 존재 하에서는, NGF 중단 시 축삭 완전성이 유지되었다. 도 6-10은 프로테아솜 억제제 및 GSK 억제제 (도 6), p38 MAPK 억제제 및 아데닐릴 시클라제 활성화제 (도 7), 전사 억제제 및 EGFR 키나제 억제제 (도 8), JNK 억제제 및 백스 채널 차단제 (도 9), 및 Ih 채널 차단제 및 CaMKK 억제제 (도 10)에 대한 이러한 연구의 결과를 나타낸다. 신경 변성에 대해 보호하는 것으로 확인된 특정 화합물, 및 상응하는 표적의 예가 표 5에서 제공되고, 이는 화합물들 중 일부와 관련하여 이루어진 관찰에 대한 해설이 있는 난을 추가로 포함하는 것을 제외하고는 상기 표 2와 유사하다.
Figure pct00044
실시예 3
성장 인자 중단 후 첨가 시간에 관련된 억제제의 특성화
NGF 중단 후 다양한 시점에 첨가되는 경우의 억제제의 활성을 평가하기 위해 연구를 수행하였다. 특히, 축삭 변성을 억제하도록 후보 키나제가 억제될 수 있는, NGF-결핍 시작 후 가장 늦은 시점을 결정하도록 실험을 수행하였다.
방법 및 물질
이러한 연구에서 사용된 1차 세포는 찰스 리버(Charles River) CD-1 E13 후근 신경절 (DRG)이었다. 세포를 N3/F12 (+ 25 ng/㎖ NGF) 배지 (햄 F12 (23 ㎖), N3 보충물 (1 ㎖), 글루코스 (1 M 글루코스 스톡 1 ㎖), 햄 F12 내의 25 ng/㎖ 신경 성장 인자 2.5 S, 마우스 (로쉐 11362348001) (스톡: 50 ㎍/㎖ -80℃); 사용하기 전에 필터-멸균됨)에서 유지시켰다. BD 바이오코트 PDL/라미닌 코팅 유리 8웰 챔버 슬라이드 (BD 354688), 및 24 × 60 ㎜ #1 커버슬립 (VWR 48393 106)이 실험에서 또한 사용되었다.
배아를 L15 배지에서 해부하였다 (70％ 이소프로판올에 해부 도구가 침지되었고, 접시를 얼음 상에 놓았다: 10 ㎝ 접시 (접시 당 배아 4마리) 및 척수용의 1개의 6 ㎝ 접시). E13.5 척수를 DMEM + 10％ FBS 내로 추출하였다. 128개 초과의 DRG를 텅스텐 바늘로 척수로부터 분리하고 반으로 절개하였다. 8웰 슬라이드에 250 ㎕ N3/F12 (25 ng/㎖ NGF)를 채웠다. 절개된 DRG (웰 당 약 4개)를 5 ㎕ 부피로 놓았다. 약 10분 동안 실온에서 부착되도록 한 후, DRG를 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 하기의 조건을 사용하여 억제제들을 테스트하였다. 25 ㎍/㎖ 항-NGF 항체를 22시에 첨가하였다. 억제제들을 T = 항-NGF 첨가 0시간 후, 1시간 후, 3시간 후, 6시간 후, 9시간 후, 및 12시간 후에 첨가하였다 (1.25 ㎕ 억제제를 첨가; 매스 혼합물로부터의 5 ㎕ 분취량을 -20℃로; 12 ㎕ DMSO 내의 18 ㎕; 24 ㎕ DMSO 내의 6 ㎕; 12 ㎕ DMSO 내의 18 ㎕; 21 ㎕ DMSO 내의 9 ㎕; 24 ㎕ DMSO 내의 6 ㎕). 억제제의 첨가 및 가벼운 진탕에 의해 혼합을 수행하였다. 대조군은 +/- 항-NGF (+ 1.25 ㎕ DMSO)였고, 실험을 2중으로 수행하였다.
25시간 후, 250 ㎕ 30％ 수크로스/8％ PFA를 250 ㎕의 배양 배지에 30분 동안 첨가하였다. 슬라이드를 1× PBS로 세정하였다 (정지: 4℃). 면역형광을 하기와 같이 수행하였다. 먼저, 5％ BSA/0.2％ 트리톤(Triton)에서 30분 동안 실온에서 차단을 수행하였다. 1차 항체 (Tuj1 (1:1,000))를 4℃에서 2％ BSA 내에서 슬라이드와 함께 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 1× PBS로 세정하고, 2차 항체 (염소 항-마우스 488; 1:200)를 첨가하였다. 슬라이드를 2차 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 암실에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 10분 동안 1:10,000의 PBS 내 훼스트에서 세정하고, 5분 동안 유리 코플랜드(Copland) 내의 PBS에서 세정하고, 타월에 쳐서 가볍게 건조시키고, 200 ㎕의 플루오로마운트 G로 커버슬립을 덮고, 4℃에서 보관하였다. 동일한 환경에서 모두 사진을 찍었다 (즉, 노출 시간). 또한 세포체로부터의 축삭의 분리를 기초로 변성 속도를 평가하였다.
결과
이러한 연구들은 억제제가 NGF를 중단하고 나서 수시간 (3시간, 6시간, 9시간, 및 12시간) 후에 첨가되는 경우에도 보호적이라는 것을 나타낸다 (도 11). 축삭 점수는 1 내지 10 척도의 축삭의 점수이다 (0 = 항-NGF 대조군처럼 보임; 10 = NGF 대조군처럼 보임; 5 = 0시간에 첨가된 경우의 키나제 억제제처럼 보임). 이러한 연구에서 사용된 억제제들이 표 6에서 열거된다.
Figure pct00045
실시예 4
국소화된 변성에 관련된 화합물의 특성화
캠페놋 챔버를 사용하여, 실시예 2에서 축삭 변성을 억제하는 것으로 확인된 화합물들을 추가로 분석하였다. 캠페놋 챔버는 몸통 환경 및 축삭 환경이 분리되도록 하고, 국소화된 변성의 도입을 허용한다 (도 12 및, 예를 들어, 문헌 [Zweifel et al., Nat. Rev. Neurosci. 6(8):615-625, 2005] 참조). 이같은 챔버에서, 축삭 변성이 국소화되고, 아폽토시스 없이 진행된다 (도 13 및 14).
물질 및 방법
테플론 분할기 (타일러 리서치(Tyler Research))를 물에서 세정하고 이를 어떠한 그리스(grease)도 없게 닦음으로써 깨끗이 하였다. 그후, 분할기를 노크로믹스(Nochromix) (고닥스 래버러토리즈(Godax Laboratories))/황산에 하룻밤 동안 침지시키고, 오토클래이빙된(autoclaved) 증류수 (SQ 물)로 5회 헹구고, 30분 동안 끓이고 나서, 공기-건조시킨 후 사용하였다.
마우스 라미닌 (멸균 여과수 내의 5 ㎍/㎖; 인비트로젠)을 PDL-코팅 35 ㎜ 접시 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, SQ 물에서 2회 세정하였다. 접시를 진공-건조시킨 후, 층류 후드에서 15분 동안 공기-건조시켰다. 그 후, 제조된 접시에 핀 레이크(rake) (타일러 리서치)로 선을 그었다. 생성된 선 트랙(track)을 가로질러 NGF를 함유하는 50 ㎕의 NBM + MC 용액을 적용하였다 (이러한 용액은 하기와 같이 제조되었다: 1750 ㎎의 메틸셀룰로스를 480 ㎖의 뉴로베이슬(Neurobasal) (인비트로젠)에 첨가하고, 여기에 4.5 ㎖ 페니실린/스트렙토마이신, 7.5 ㎖ L-글루타민, 10 ㎖ B-27 무혈청 보충물 (인비트로젠)을 첨가하였다; 용액을 1시간 동안 실온에서, 4℃에서 하룻밤 동안, 그리고 실온에서 추가로 1시간 동안 혼합하였다; 그 후, 용액을 필터 멸균하고, 50 ng/㎖ NGF (로쉐)를 첨가하고 나서 사용하였다). 고-진공 그리스 (VWR)를 절개 범위 하에 각각의 테플론 분할기에 첨가하였다. 라미닌-코팅 PDL 접시를 뒤집고, 테플론 분할기 상에 투하하였고, 이때 트랙을 함유하지 않는 영역 내에 이쑤시개를 사용하여 추가적인 압력이 부가되었다. 접시를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 500 ㎕의 NBM + MC (50 ng/㎖ NGF) 용액을 각각의 측면 구획에 첨가하였고, 중앙 세포 슬롯 전방에 그리스 장벽이 부가되었다.
유리 E13.5 척수를 마우스 배아로부터 절개하고, NBM + MC (25 ng/㎖ NGF) 용액 내에 놓았다. DRG를 텅스텐 바늘로 척수로부터 분리하였다. NBM + MC-윤활 P200 피펫을 사용하여, DRG를 1.5 ㎖ 튜브 내로 이동시켰다. DRG를 탁상용 원심분리로 30초 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 폐기하고, 0.05％ 트립신/EDTA (저온)를 첨가하였다. 피펫으로 펠렛을 재용해시키고, 일정하게 진탕 (650 RPM)시키면서 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 다시 원심분리하고, 상등액을 폐기하였다. 펠렛을 따뜻한 NBM + MC (50 ng/㎖ NGF) 용액에 재용해시키고, 플레임드(flamed) 유리 피펫으로 20회 저작한 후, 파이어-보어드(fire-bored) 유리 피펫으로 또다시 20회 저작하였다. 샘플을 다시 원심분리하고, 생성된 펠렛을 0.5 ㎖ NBM + MC (50 ng/㎖ NGF) 용액에 재현탁시켰다. 세포를 2.5 × 106개의 세포/㎖의 최종 농도로 희석하였다. 세포 현탁액을 22 게이지(gauge) 바늘이 있는 1 ㎖ 주사기 내로 로딩하였다. 주사기를 사용하여 캄페놋 분할기의 중앙 슬롯을 채웠다 (50 ㎕ 이상의 부피로). 캠페놋 챔버를 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 2.5 ㎖ NGF + MC (50 ng/㎖ NGF) 용액을 중앙 구획에 첨가하고, 그리스 게이트를 제거하였다. 3일 후, 외부 배지 (세포체 구획)를 2.5 ㎖ NBM + MC 배지 (25 ng/㎖ NGF 있음)로 교체하였다. 배양물에서의 5일 후, 1개의 원위부 구획을 가온된 NBM + MC (NGF 없음) 용액으로 3회 세정하였다. 세번째 세정 후, 500 ㎕ NBM + MC (NGF 없음) 용액을 0.5％ DMSO 또는 억제제와 조합하여 축삭 구획에 첨가하였다. 세포체 구획을 0.5％ DMSO 또는 억제제를 함유하는 2.5 ㎖ NBM + MC 배지 (25 ng/㎖ NGF 있음)로 교체하였다.
28시간의 항-NGF 항체 처리 후, 8％ PFA/30％ 수크로스 용액 (상기 참조)을 1:1 희석으로 배양 배지에 직접 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션하였다. 첨가로부터 초반의 15분 후 테플론 분할기를 제거하였다. 시스템을 2.5 ㎖ PBS로 1회 세정한 후, 면역염색하였다. PBS 내의 5％ BSA/0.2％ 트리톤으로 30분 동안 뉴런을 차단하였다. 1차 항체 Tuj1 (코밴스(Covance))을 2％ BSA를 함유하는 PBS 내의 1:1000의 최종 희석도로 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 접시를 PBS로 1회 세정하였다. 2차 항체 (알렉사 488 염소 항-마우스 항체 (인비트로젠))를 PBS 내의 2％ BSA 내의 1:200의 최종 희석도로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 접시를 PBS로 2회 세정하고, 350 ㎕의 플루오로마운트 G (일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈)와 함께 22 × 22 ㎜ 커버슬립 (VWR)을 첨가하였다. 형광 현미경을 사용하여 뉴런이 가시화되었다.
결과
상기 기술된 바와 같이, E13.5 DRG를 단리하고, 5일 동안 캠페놋 챔버에서 성장시켰다. 50 ㎍/㎖ 항-NGF를 실험 축삭 구획에 첨가하였고, 이때 억제제를 축삭 구획 (NGF 항체와 함께), 또는 세포체 구획에 첨가하였으며, 28시간 동안 축삭이 변성되도록 하였다. 대조군으로서 NGF 내에 또 다른 축삭 구획이 유지되었다. 도 15 및 16에 나타난 바와 같이, 세포체가 SB415 (GSKi) 또는 Act D (전사 억제제)에 노출되었을 때, 또는 축삭이 AG555 (EGFRi) 또는 SB239 (p38i)에 노출되었을 때, NGF가 결핍된 축삭이 변성되지 않았다. 반면에, NGF-결핍 축삭 구획 내의 SB415 (GSKi) 또는 Act D (전사 억제제), 또는 세포체 구획에서의 AG555 (EGFRi) 또는 SB239 (p38i) 처리는 변성을 방지하지 못했고, 이는 국소적인 축삭 변성에서의 신호전달이 상실되는 축삭 절편에 한정되지 않음을 시시한다; 일부 억제제는 세포체에 적용되는 경우 가장 효과적이었고, 나머지는 축삭에 적용되는 경우에 가장 효과적이었다. 이러한 결과들의 정량이 도 17에 제시된다. 표 7은 캠페놋 챔버로부터의 축삭 변성 데이터의 요약을 제공한다.
Figure pct00046
(주: 표 7의 IC50 정보는 공개된 출처로부터의 것이고, 일부 값은 비-뉴런 세포 유형을 사용하여 생성되었다)
a - 문헌 [Cross et al., J. Neurochem. 77(1):94-102, 2001; total GSK-3 activity by in vitro peptide assay in cerebellar granule neurons].
b - 문헌 [Fry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(20):12022-12027, 1998; heregulin induced tyrosine phosphorylation in MDA-MB-453 cells].
c - 문헌 [Bose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103(26):9773-9778, 2006; protein tyrosine phosphorylatio in 3T3-Her2 cells].
d - 문헌 [Barone et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 296(2):312-321, 2001; LPS-induced TNF-alpha production in human monocytes].
e - 문헌 [Tokumitsu et al., J Biol. Chem. 277(18):15813-15818, 2002; CaMKK activity after ionomycin stimulation in transfected HeLa cells].
상기 기술된 스크린으로부터의 데이터를 기초로 하는 모델이 도 18에 제시된다. 예비 연구는 축삭 구획으로부터 NGF가 제거되는 경우 세포체가 더 작게 보였다는 것 (도 19), 및 국소적으로 NGF가 결핍된 다수의 뉴런이 카스파제-3-양성으로 절단되었고 핵 응축을 나타냈다는 것 (도 20)을 나타냈다. 추가적인 연구들은 GSK3 (도 21) 및 JNK (도 22) 활성이 NGF 중단 6시간 후 피크를 이룬다는 것을 나타낸다.
실시예 5
뉴런 변성의 특정 표현형과 관련된 화합물의 특성화
세포체 억제제로서 상기에서 확인된 화합물 (SB415 (GSKi) 및 Act D (전사 억제제))을 세포체에 적용하고, 축삭 억제제로서 확인된 화합물 (AG555 (EGFRi) 및 SB239 (p38i))을 축삭에 적용하여, 국소적으로 결핍된 축삭을 상기 기술된 캠페놋 챔버 분석법을 사용하여 염주의 형성과 관련하여 관찰하였다. 세포체 억제제로, 다수의, 염주가 있는 축삭, 뿐만 아니라 단편화된 축삭이 관찰되었다 (도 23). 축삭 억제제는 더 적은 염주를 나타냈고, 이러한 억제제로의 처리 시 축삭이 단편화로 직행하는 것으로 보였다 (도 23). 이러한 관찰은 EGFR 및 p38이 염주 형성의 상류에 있을 수 있음을 가리킨다. 미토콘드리아 기능이상, 및 축삭 이동의 차단을 GSK, EGFR, 및 p38 억제제로 연구하였다. 도 24에 나타난 바와 같이, 기능성 미토콘드리아가 관찰되었지만, 신장된 것은 없었다.
세포체를 통한 신호전달이 발생하지 않는 축삭 변성 패러다임에서의 GSK 억제를 또한 연구하였다. 50 μM SB415가 병변 후 변성을 약간 지연시켜서, GSK3 억제는, 주로 축삭성 미세관 네트워크의 안정화를 통해, 축삭에 대한 직접적인 효과를 지닌다. 아마도 이러한 효과는 전반적인 NGF 중단 후 관찰되는 축삭 변성에서의 지연에 기여할 것이지만, 세포체에서의 GSK3b의 역할이 더욱 상당할 것으로 보인다 (도 25). 추가적으로, 전반적인 NGF 중단 후의 축삭 보호가 뉴런 사망에서의 GSK의 역할과 독립적인 것으로 보이는데, 이는 GSK 억제제가 축삭 변성을 차단하였지만 세포 사망은 차단하지 않았기 때문이다 (도 26).
실시예 6
환자에서의 말초 신경병증에 대한 보호
타르세바® (에를로티닙)은 EGFR 키나제 억제제이다. 파클리탁셀 및 기타 화학요법제로의 환자 치료가 말초 신경병증에 이르는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Wilkes, Semin. Oncol. Nurs. 23(3):162- 173, 2007]에 리뷰되어 있음). 타르세바®와 파클리탁셀의 조합물로 치료된 환자가 위약 + 파클리탁셀 군에 비해 말초 신경병증을 유의하게 덜 나타냈다 (p=0.012; 피셔(Fisher) 정확도) (환자의 16.3％ 대 26.4％; 최초에 환자 400명이 등록됨; 통상적인 유해 사례의 분석).
실시예 7
근육위축성 측삭 경화증 ( ALS ) 모델에서의 EGFR 키나제 수준의 분석
근육위축성 측삭 경화증 ("ALS")은 극도로 소모성이고 치명적인 신경변성 질환이고, 이의 병리학은 운동 뉴런의 손실을 특징으로 한다. 유사한 병리학이 과산화물 디스뮤타제("SOD") 유전자에서의 돌연변이를 함유하는 마우스 ALS 모델 (SOD(G93A))에서 일어난다. EGF 수용체의 인산화가 축삭 변성과 관련된다. EGFR 수준이 SOD(G93A) 마우스에서 변경되고, 실험을 수행하여 인산화된 EGFR 수준이 SOD(G93A) 마우스에서 또한 변경되는지 여부를 결정하였다.
말단 SOD(G93A) 및 비-트랜스제닉 한배새끼들로부터의 척수를 슬라이드 상에 냉동절편화 (20 ㎛ 두께)하고, -80℃에서 보관하였다. 슬라이드들을 실온으로 해동하고, 헹굼 당 5분 동안 PBS에서 2회 수화시켰다. 슬라이드를 과산화수소 (PBS 내 0.3％)에서 5분 동안 차단시킨 후, 헹굼 당 5분 동안 PBS에서 2회 헹궜다. 슬라이드를 세정 당 10분 동안 PBS-T (0.1％ 트리톤 X100을 함유하는 PBS)에서 2회 세정하였다. 슬라이드를 약 1시간 동안 실온에서 5％ BSA 및 0.3％ 트리톤 X100을 함유하는 PBS에서 차단시켰다. 토끼의 모노클로날 항-인산화 EGFR 1차 항체 (노부스 바이올로지칼즈(Novus Biologicals))를 PBS 내의 1％ BSA 및 0.3％ 트리톤 X100에 1:500 희석하고, 슬라이드와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 세정 당 10분 동안 PBS-T에서 4회 세정하였다. 비오틴화 염소 항-토끼 2차 항체 (벡터 랩스(Vector Labs))를 PBS 내의 1％ BSA 및 0.3％ 트리톤 X100에 1:300 희석하고, 슬라이드와 함께 30분 내지 1시간 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 세정 당 5분 동안 PBS-T에서 4회 세정하였다. 세정된 슬라이드를 아비딘-비오틴 복합체 용액 (벡터 래버러토리즈(Vector Laboratories))에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 세정 당 5분 동안 PBS-T에서 4회 세정하였다. 그후, 원하는 강도가 발색될 때까지 슬라이드를 과산화효소 기질 (디아미노벤지딘 (DAB); 시그마)과 함께 인큐베이션하였다. 슬라이드를 물에서 헹구고, 커버슬립을 덮고, 관찰하였다.
EGFR 항체로 염색된 척수의 절편을 나타내는 도 27 및 28에 나타난 바와 같이, 인산화된 EGFR 수준이 대조군 마우스와 비교하여 SOD 마우스에서 증가되었다. 이러한 관찰은 EGFR 키나제 억제가 생체 내에서 ALS의 치료에 이로울 수 있음을 나타낸다.
SOD1 샘플의 면역조직화학 연구를 또한 수행하였다. 슬라이드를 실온으로 가온하고, 임엣지(ImmEdge) 펜으로 윤곽을 그리고, 실온에서 PBS에서의 2×10분 세정에 의해 수화시키고, 실온에서 2×10분 동안 PBSTx에서 세정하였다. 항체 차단을 1-2시간 동안 실온에서 수행하였다 (PBS 내의 5％ BSA, 0.3％ Tx; (500 ㎖ PBS + 1.5 ㎖ 10％ Tx 내의 25 ㎎ BSA)). 샘플을 1차 항체와 함께 하룻밤 동안 PBS 내의 1％ BSA, 0.3％ Tx에서 4℃에서 인큐베이션하였다 (NF (마우스, 밀리포어(Millipore)) 1:200; SMI32 (마우스, 코밴스) 1:300)). 1차 항체 인큐베이션 후 샘플을 실온에서 4×10분 동안 PBSTx (0.1％)에서 세정하였다. 2차 항체를 적용하고 (모레큘라 프로브즈(Molecular Probes), 알렉사 접합; 당나귀 항-마우스 알렉사-488; PBS 내의 1％ BSA, 0.3％ Tx에 1:500 희석됨), 샘플을 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 2차 항체 인큐베이션 후, 샘플을 PBSTx에서 2×10분, PBS에서 2×10분 세정하였다. 임의적으로, PBS 내의 1:10,000의 DAPI의 적용에 의해 2차 세정 동안 핵 대비염색을 수행하였다. 벡타쉴드(Vectashield) 마운팅 배지 (벡터 랩스)로 마운팅을 수행하였다.
도 29는 SOD ALS 모델에서 축삭 내에 pEGFR이 남아 있는 것을 나타낸다. 도면에 나타난 바와 같이, 축삭 개수가 SOD1-tg 척수에서 감소되었고, SOD1-tg 동물에서 pEGFR이 부분적으로 축삭과 공동-국소화되었다. 따라서, 비-트랜스제닉 대조군과 비교하여 축삭이 SOD1 트랜스제닉 마우스에서 손실되었고, 남아 있는 축삭 중 다수는 pEGFR에 대해 면역반응성이었다.
실시예 8
혈청 결핍/ KCl 감소-유도 변성으로부터의 소뇌 과립 뉴런의 보호
키나제 억제제 (GSK3, JNK, EGFR, p38, 및 CaMKK의 억제제)를 혈청 결핍/KCl 감소 후 배양된 소뇌 과립 뉴런 (CGN)을 보호하는 능력에 대해 테스트하였다. 간략하게, P7 마우스 뇌로부터 단리된 CGN을 37℃에서 혈청 및 칼륨을 함유하는 배지 (29 mM KCl 및 10％ FBS를 포함하는 이글 기본 배지)에서 PDL- 및 라미닌-코팅 96웰 조직 배양 접시 상에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포를 단독으로 또는 표 8에 제시된 바와 같은 소분자 억제제와 함께 "결핍" 배지 (5 mM KCl을 포함하는 이글 기본 배지)로 옮겼다. 추가로 24시간 배양한 후, 뉴런을 4％ 파라포름알데하이드로 고정하고, 뉴런 마커 (항-클래스 III β-튜블린, 코밴스)로 염색하였다. 이미지익스프레스(ImageXpress) 자동 영상화 시스템 (모레큘라 디바이시즈(Molecular Devices)를 사용하여 영상을 취득하였다. 사용된 플레이트 설정이 표 8에 요약된다.
Figure pct00047
도 30에 나타난 바와 같이, DRG에 대한 실시예 2 및 3에서의 발견과 유사하게, 키나제 억제제가 CGN을 변성으로부터 보호하는 것에서 효과적인 것으로 발견되었다.
실시예 9
로테논 -유도 변성으로부터의 해마 뉴런의 보호
키나제 억제제 (GSK3, JNK, EGFR, p38, 및 CaMKK의 억제제)를 로테논-의존적 변성으로부터 해마 뉴런을 보호하는 능력에 대해 테스트하였다. 하기와 같이 분석법이 수행되었다. 먼저, 해마 뉴런을 절개하였다. 간략하게, 임신한 래트를 마취시켜 이로부터 E18-E19 배아를 제거하고, 저온 HBSS (상기 참조)를 함유하는 페트리 접시 내에 놓고, 신선한 저온 HBSS로 세정하였다. 배아를 낭으로부터 제거하고, 신선한 저온 HBSS 내에 놓고, 표준 기술을 사용하여 뇌를 단리하여 신선한 저온 HBSS 내에 놓았다. 해마 및 피질을 각각의 배아로부터 단리하고, 뇌를 세로로 반으로 절개하여, 반구들을 분리하였다. 잔존하는 소뇌/뇌간, 후각망울, 비-피질 배쪽 하부 조직, 및 뇌막을 제거하였다. 잔존 조직으로부터 해마를 제거하고, 얼음 상의 1.5 ㎖ 튜브로 옮겼다. 별도의 얼음 상의 1.5 ㎖ 튜브로 피질 조직을 제거하였다. 가능한 한 많은 HBSS를 제거하고, HBSS 내의 1％ 트립신 (하이클론(Hyclone))/0.1％ DNase (시그마)를 각각의 튜브 내의 잔존 조직에 첨가하였다. 파이어-폴리쉬드(fire-polished) 피펫을 사용하여 조직을 각각 분쇄하였다. 2분마다 튜브를 태핑(tapping)하면서, 조직을 10분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 가능한 한 많은 용액을 조직으로부터 제거하고, 조직을 각각 0.05％ DNase (시그마) 용액으로 세정하였다. 샘플을 0.05％ DNase (시그마)에서 각각 하기의 것으로 약 20× 저작하였다: (1) 2/3 내경의 파이어 폴리쉬드 피펫, 및 (2) 1/3 내경의 파이어 폴리쉬드 피펫. 5분 동안 샘플이 침강되도록 한 후, 상등액을 수집하고 (잔해물은 침강되었고, 피펫으로 상등액을 제거함), 혈구계에서 세포를 계수하였다.
단리된 해마 뉴런 상에서 뉴클레오펙션(nucleofection)을 수행하였다. 간략하게, 원하는 개수의 세포 (뉴클레오펙션 당 0.5-1×106개의 세포)를 원심분리에 의해 단리하였다. 가능한 한 많은 상등액 용액을 제거하고, 각각의 튜브로부터의 펠렛화된 세포를 실온의 20 ㎕의 뉴클레오펙션 용액 (아맥사(Amaxa))에 재현탁시켰다. 각각의 재현탁액을 예비-분취된 β-액틴-GFP "pCAGGS-AFP"DNA (러닝(running) 당 400 ng)에 첨가하고, 부드럽게 태핑하였다. 혼합물을 96웰 셔틀 플레이트의 뉴클레오큐벳 웰로 옮기고, 플레이트를 뉴클레오펙터(nucleofector) 장치 내로 삽입하였다. 미리 설정된 아맥사 프로그램 CU110을 사용하여 뉴런을 뉴클레오펙션시켰다. 뉴클레오펙션 직후, 100 ㎕의 예비-가온된 CNBM (10 ㎖ B27 (무혈청 보충물; 인비트로젠), 5 ㎖ 100× 페니실린-스트렙토마이신, 5 ㎖ 100× 글루타맥스(Glutamax), 480 ㎖ NBM (뉴로베이슬 배지; 인비트로젠))을 첨가하고, 이어서 세포를 70,000개의 세포/웰의 밀도로 8웰 PDL-코팅 챔버 슬라이드 내에 플레이팅하였다. 3-5일 마다 배지를 교환하면서 뉴런을 5-14일 동안 배양한 후 로테논을 첨가하였다.
10 μM 로테논 (DMSO 내에 재현탁됨; VWR)을 비히클 또는 실험 화합물의 존재 하에 뉴런에 첨가하였다. 로테논 첨가 17-18시간 후, 뉴런을 4％ 파라포름알데하이드/15％ 수크로스의 용액에서 40분 동안 실온에서 고정시켰다. 뉴런을 PBS로 1회 세정하고, 마우스 항-Tuj1 항체 (코밴스)를 1:1000의 희석도 (PBS, 0.1％ 트리톤 X-100, 2％ 염소 혈청 내)로 첨가하고, 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 뉴런을 PBS로 4× 세정하고, 알렉사-568 (알렉사)에 접합된 염소 항-마우스 항체를 1:200 (PBS, 2％ 염소 혈청 내)의 희석도로 30분 동안 첨가하였다. 다시 뉴런을 PBS로 4회 세정하고, 벡타쉴드 마운팅 배지 (벡터 랩스)에서 슬라이드 상에 마운팅하였다. 모든 뉴런이 Tuj1로 가시화되었고, 개별적인 뉴런들이 GFP로 가시화되었다.
도 31에 나타난 바와 같이, 키나제 억제제들이 로테논-의존적 변성으로부터 해마 뉴런을 보호하는 것으로 발견되었다. 유사한 연구를 피질 뉴런으로 수행하였고, 키나제 억제제에 의해 피질 뉴런이 로테논-의존적 변성으로부터 또한 보호되는 것으로 나타났다 (도 32).
실시예 10
축삭 상의 ErbB 수용체의 가시화
축삭 상에서의 ErbB 수용체 발현을 가시화하기 위해, 스크린을 위해 상기 기술된 바와 같이 DRG를 배양하였다. 24시간 성장 후, 세포를 8％PFA/30％ 수크로스를 배양 배지에 1:1 비율로 30분 동안 첨가함으로써 고정시키고, PBS로 1× 세정하였다. 고정된 세포를 PBS 내의 5％ BSA 및 0.2％ 트리톤 X100에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 PBS 내의 2％ BSA에서 하기의 항체와 함께 인큐베이션하였다: (1) 50 ㎍/㎖ 항-EGFR (D1-5, 제넨테크(Genentech)), (2) 1:500 항-ErbB2 (압캠(Abcam)), (3) 24 ㎍/㎖ 항-ErbB3 (57.88, 제넨테크), 및 (4) 1:500 ErbB4 (압캠). 세포를 PBS로 1× 세정한 후, 형광-접합 2차 항체 (1:200, 인비트로젠)와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 훼스트 33258 (1 ㎍/㎖, 인비트로젠)을 함유하는 PBS로 1× 세정한 후, 최종적으로 PBS로 세정하고, 250 ㎕의 플루오로마운트 G (일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈)로 커버슬립을 덮었다. 도 33에 나타난 바와 같이, 면역세포화학에 의해 ErbB가 축삭 상에서 검출되었다.
실시예 11
EGFR 리간드의 사용에 의한 축삭 상에서 발현된 EGFR 의 특성화
EGF가 포함되는 리간드에 의한 EGFR의 활성화의 효과를 평가하기 위해 실험들을 수행하였다.
물질 및 방법
후근 신경절 (DRG) 면역블롯을 하기와 같이 제조하였다. 실험에서 사용된 1차 세포는 찰스 리버 CD-1 E13 후근 신경절 (DRG)이었다. 세포를 N3/F12 (+ 25 ng/㎖ NGF) 배지 (햄 F12 (23 ㎖), N3 보충물 (1 ㎖), 글루코스 (1 M 글루코스 스톡 1 ㎖), 햄 F12 내의 25 ng/㎖ 신경 성장 인자 2.5 S, 마우스 (로쉐 11362348001) (스톡: 50 ㎍/㎖ -80℃); 사용하기 전에 필터-멸균됨)에서 유지시켰다. 트리톤 용해 완충제 (20 mM 트리스(Tris) pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1％ 트리톤-X100, 100× 포스파타제(Phosphatase) 억제제 칵테일 I (신선하게 첨가됨), 100× 포스파타제 억제제 칵테일 II (신선하게 첨가됨), 정제 1개/10 ㎖의 프로테아제(Protease) 억제제 정제 (신선하게 첨가됨))가 실험에서 또한 사용되었다.
DRG 체외이식편을 제0일에 제조하였다. L15 배지에서 배아를 해부하였다 (70％ 이소프로판올에 해부 도구가 침지되었고, 접시를 얼음 상에 놓았다: 10 ㎝ 접시 (접시 당 배아 4마리) 및 척수용의 1개의 6 ㎝ 접시). E13.5 척수를 DMEM + 10％ FBS 내로 추출하였다. 5×20개의 DRG를 척수로부터 분리하였다. 8웰 슬라이드에 250 ㎕ N3/F12 (25 ng/㎖ NGF) + 7 μM 사이토신 아라비노시드를 채웠다. 약 20개의 DRG를 각각의 웰 (총 5개) 내에 놓고, 약 10분 동안 실온에서 부착되도록 하였다. 제2일에, 배지를 N3/F12 + 25 ng/㎖ NGF로 교환하였다. 제3일에, ErbB 리간드를 30분 내지 1시간 동안 첨가하고 (1000×; 100 ㎍/㎖; SQ 물에 1:10으로 희석) (SQ 물 (대조군); EGF (ErbB1); 뉴레귤린(Neuregulin)-1 (ErbB3); 베타-셀룰린(Beta-cellulin) (ErbB1/4); 에피레귤린(Epiregulin) (ErbB1/4); 항-NGF (25 ㎍/㎖)), 슬라이드를 가볍게 진탕시켰다.
배지를 피펫 팁으로 흡인하고, 빙냉 무균 PBS로 2회 세정하고, 모든 PBS를 피펫 팁 또는 킴와이프스가 있는 흡인기를 사용하여 제거함으로써 면역블롯팅을 수행하였다. 세포를 얼음 상에서 40 ㎕ 트리톤 용해 완충제로 용해시켰다. 용해물을 수집하고, 30분 동안 4℃에서 회전시키고, 5분 동안 최고 속도로 스피닝(spinning)시키고, 상등액을 유지시켰다 (정지: -80℃). 약 20 ㎕의 샘플을 로딩하였다. 1× SDS 샘플 완충제 및 NuPAGE 환원제 (10×)를 첨가함으로써 샘플을 제조하였고, 용해물을 비등시켰다. 표준물 (1 ㎕ MWM; 1 ㎕ 및 2 ㎕ 척수 용해물)과 함께 10％ SDS-PAGE (120 볼트) (2개의 막에 대해 러닝됨)에 의해 용해물이 분획화되었다. 젤을 아이블롯(iBlot) 프로그램 3 (니트로셀룰로스(Nitrocellulose))을 사용하여 블롯팅하고, 98 kDa에서 블롯을 절단하였다. 위쪽 막을 TBST 내의 5％ BSA에서 1시간 동안 차단시켰다. 1차 항체를 1시간 동안 2 ㎖의 TBST 40C 내의 5％ BSA 내로 놓았다 (칼바이오켐 항-P-티로신 HRP 접합체 (PY20) 1:10,000). 블롯을 TBST로 3×5분 동안 세정하고, ECL로 발색시켰다. 아래쪽 막을 1시간 동안 PBS 내의 5％ 밀크 내에서 차단시켰다. 1차 항체를 진공 백 내에서 2일 동안 2 ㎖의 TBST 내의 5％ BSA 내에 놓았다. 사용된 항체는 CS 항-P-Erk 토끼 (42/44 kDa) 1:1000; C 항-TUJ1 토끼 (55 kDa) 1:5000 (별도의 막), 및 SC 항-Erk1 토끼 (42/44 kDa) 1:1000 (별도의 막)였다. 블롯을 TBST에서 3×5분 동안 세정하였다. 2차 항체를 10 ㎖의 TBST 내의 5％ 밀크 내에 1:5000으로 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다 (적색 (680) 항-토끼). 블롯을 TBST로 3×5분 동안 세정하였고, 오디세이(Odyssey)로 PBS에서 스캐닝하였다. 음성/반-직관적 값을 최소화하는 배경 방법 및 표준 밴드를 선택함으로써 정량을 수행하였다: 즉, 위쪽/아래쪽, 오른쪽/왼쪽, 사용자-정의 (사용자-정의). 농도 표준의 강도가 낮을수록, 음성 값이 더 적다.
결과
이러한 실험들의 목표는 EGF에 의한 EGFR의 활성화가 변성을 구동시키는데 충분할지를 확인하는 것이었다. 도 34에 나타난 바와 같이, EGFR가 축삭 상에서 발현되었다. 도 35는 NGF에서 유지된 뉴런에 첨가된 EGF가 변성을 야기하지 않는다는 것을 나타낸다. EGF가 이러한 분석법에서 사용된 뉴런 배양물에서 EGFR/ErbB를 활성화시킬 수 있다는 것을 확실히 하기 위해, ERK 활성화를 평가하였다 (ERK는 EGFR의 하류 표적이다). 도 35의 그래프에 나타난 바와 같이, 웨스턴 블롯에 의해 결정 시, EGF 첨가는 ERK 활성을 증가시켰다. 이러한 데이터는 EGFR 활성화가 변성을 구동시키는데 충분하지 않음을 나타낸다.
실시예 12
EGFR 엑토도메인의 사용에 의한 축삭 상에서 발현된 EGFR 의 특성화
EGFR의 활성화에 대한 EGFR 엑토도메인의 효과를 평가하기 위해 실험들을 수행하였다.
물질 및 방법
이러한 연구에서 사용된 물질에는 BD 바이오코트 PDL/라미닌 코팅 유리 8웰 챔버 슬라이드 (BD 354688); L15 배지 (인비트로젠 11415114); 소 혈청으로부터의 알부민 (BSA) (시그마 A7906 - 500 g); 소 태아 혈청 (시그마 F2442 - 100 ㎖); N3 보충물 (상기 참조); 플루오로마운트 G (일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈 17984-25); 24×60 ㎜ #1 커버슬립 (VWR 48393 106); 모노클로날 항-뉴런 클래스 III 베타-튜불린 (코밴스 MMS-435P); 햄 F12 내의 신경 성장 인자 2.5 S, 마우스 (로쉐 11362348001); 및 트리톤 X-100 (시그마 T8787 - 100 ㎖)이 포함된다. 이러한 실험에서 사용된 용액은 25 ㎖ N3/F12 배지 (23 ㎖의 햄 F12; 1 ㎖의 N3 보충물; 1 ㎖의 1M 글루코스; 25 ng/㎖의 NGF) 및 30％ 수크로스/8％ PFA (상기 참조)를 포함한다.
엑토도메인 (R&D 시스템즈(R&D Systems))를 PBS 내의 무균 여과 0.1％ BSA에 1 mg/㎖으로 재현탁시켰다. 마우스 E13.5 배아를 해부하여, L15 배지 내로 놓았다. 핀셋을 사용하여, 배아의 배쪽 영역을 열고, 장기들을 제거하고, 늑골을 절단하고, DRG가 부착되어 있는 척수를 절제해 냈다. DRG가 부착되어 있는 척수를 얼음 상의 L15 배지 + 5％ 염소 혈청 내에 놓았다. 텅스텐 바늘로 DRG를 제거하고, 나머지 척수를 폐기하였다. 8웰 슬라이드에 N3-F12 + 25 ng/㎖ NGF를 채웠다. DRG를 반으로 절개하였다. 절편화된 DRG를 8-챔버 슬라이드의 각각의 웰의 중앙에 놓고, 실온에서 5-10분 동안 DRG가 부착되도록 하였다. 엑토도메인을 윗줄에 50 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 슬라이드를 37℃ 인큐베이터 내에 하룻밤 동안 놓았다. 엑토도메인을 아랫줄에 50 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 항-NGF 항체를 25 ㎍/㎖의 농도로 웰에 첨가하였다. EGFR 억제제 AG555를 양성 대조군으로서 10 μM의 농도로 첨가하였다.
24시간의 항-NGF 항체 처리 후, 8％ PFA/30％ 수크로스를 30분 동안 1:1 희석도로 배양 배지에 직접 첨가하였다. 초반 15분 후에 테플론 분할기를 제거하고, 슬라이드를 PBS로 1회 세정하였다.
슬라이드를 5％ BSA/0.2％ 트리톤에서 30분 동안 차단시키고, 1차 항체 (Tuj1 (1:1 ,000))와 함께 하룻밤 동안 2％ BSA에서 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS로 1회 세정하고, 2차 항체 (염소 항-마우스 488; 1:200)를 첨가하였다. 슬라이드를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하고, PBS로 2× 세정하고, 250 ㎕의 플루오로마운트 G로 커버슬립을 덮고, 4℃에서 보관하였다.
결과
EGF에 더하여, EGFR를 활성화시킬 수 있는 다수의 리간드가 있다. 변성 동안의 EGFR 활성화가 리간드 의존적인지를 테스트하기 위해, R&D 시스템즈로부터의 EGFR 엑토도메인을 50 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였고, 이는 EGFR을 활성화시킬 수 있는 임의의 유리 리간드에 결합하는데 충분하여야 한다. 항-NGF를 첨가하기 24시간 전에 또는 항-NGF 첨가와 동시에 첨가된 EGFR 엑토도메인은 변성을 차단하지 않았다. 이는 변성 동안의 EGFR 활성화가 리간드-독립적일 것임을 시사한다.
실시예 13
등쪽 척수 (DSC) 체외이식편은 신경변성의 또 다른 모델이다. 수일의 기간에 걸쳐 DSC에서 축삭이 생기지만, 생존 인자의 첨가로 구조되지 않는다면, 결국은 변성될 것이다. 도 37에 나타난 바와 같이, 타르세바® (에를로티닙)가 이러한 변성 프로그램을 지연시킬 수 있었다.
실시예 14
A. 이중 류신 지퍼-보유 키나제 의 억제
물질 및 방법
293 세포주에서의 DLK 형질감염
293 세포를 30％ 조밀도(confluence)로 6웰 플레이트의 3개의 웰 내에 플레이팅하였다. 세포를 대조군 플라스미드 DNA, 야생형 DLK를 발현하는 DNA 구축물, 또는 1개는 야생형 DLK를 발현하고 다른 1개는 활성이 없는 단백질 형태를 생성시키는, 트레오닌 277이 알라닌으로 돌연변이된 DLK (T278A)를 발현하는 2개의 플라스미드로 형질감염시켰다 (퓨진(Fugene) 6, 로쉐). 형질감염 24시간 후, 세포를 PBS로 세정하고, 각각의 플레이트로부터 긁어 내어, 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 그 후, 세포를 스피닝에 의해 가라앉히고, 과량의 배지를 제거하였다. 펠렛화된 세포를 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.1％ 트리톤 X-100에서 용해시키고, 4℃에 30분 동안 놓았다. 그 후, 샘플을 스피닝하여 불용성 입자를 제거하고, 바이신코닌산 (BCA) 분석법 (프로메가(Promega))에서 단백질 농도에 대해 테스트하였다.
샘플을 10％ 폴리아크릴아미드 젤 (인비트로젠) 상에 러닝시키고, 아이블롯 장치 (인비트로젠)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 옮겼다. 블롯을 1시간 동안 5％ 소 혈청 알부민 (BSA)이 잇는 TBST (트리스-완충 염수 + 1％ 트윈 20)에서 차단시켰다. 차단 후, 블롯을 TBST + 1％ BSA 내의 JNK (셀 시그널링 테크놀러지즈(셀 시그널링 테크놀러지즈)) 또는 인산화된 형태의 JNK (셀 시그널링 테크놀러지즈)에 대해 지시된 1차 항체에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 블롯을 TBST에서 3회 세정하고 나서, HRP-접합 항-토끼 2차 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 블롯을 다시 한번 3회 세정하고 나서, ECL (프로메가)과 함께 1분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 블롯을 필름 상에 노출시키고, 분석하였다.
DLK siRNA 후의 DRG 에서의 변성
마우스 E13.5 배아를 해부하고, L15 배지 (인비트로젠) 내에 놓았다. 이러한 배아로부터 DRG가 부착되어 있는 척수를 절제해 냈다. DRG가 부착되어 있는 척수를 얼음 상의 L15 배지 + 5％ 염소 혈청 (깁코) 내에 놓았다. 텅스텐 바늘을 사용하여 DRG를 제거하고, 나머지 척수를 폐기하였다. 8웰 슬라이드에 25 ng/㎖ NGF (로쉐)가 첨가된 N3-F12 용액 (23 ㎖의 햄 F12, 1 ㎖의 N3 보충물, 및 1 ㎖의 1 M 글루코스)을 채웠다. (N3 보충물은 하기의 성분들을 하기의 순서로 10.02 ㎖의 총 부피로 혼합함으로서 제조된 N3 100× 농축물의 희석에 의해 제조되었다 (-20℃에서 보관될 수 있음): 5.0 ㎖ 행크 완충 염수 용액 (HBSS; Ca, Mg 프리; 인비트로젠), 1.0 ㎖ 소 혈청 알부민 (HBSS 내의 10 mg/㎖ = 150 μM), 2.0 ㎖ 트랜스페린 (T1147-1G, 인간, HBSS 내의 100 mg/㎖ = 1.1 mM), 1.0 ㎖ 아셀렌산나트륨 (S9133-1MG, HBSS 내의 0.01 mg/㎖ = 58 μM), 0.4 ㎖ 푸트레신 디히드로클로라이드 (P5780-5G, HBSS 내의 80 mg/㎖ = 500 mM), 0.2 ㎖ 프로게스테론 (P8783-5G, 무수 에탄올 내의 0.125 mg/㎖ = 400 μM), 0.02 ㎖ 코르티코스테론 (C2505-500MG, 무수 에탄올 내의 2 mg/㎖ = 5.8 mM), 0.1 ㎖ 트리요오도티오닌, 나트륨 염 (T6397-100MG, 0.01 N NaOH 내의 0.2 mg/㎖ = 300 μM), 0.4 ㎖ 인슐린 (I6634-250MG, 소 췌장, 241 U/mg, 20 mM HCl 내의 25 mg/㎖ = 4.4 mM)). 40 ㎖의 총 부피로 하기의 물질들을 조합함으로써 N3 보충물 스톡이 제조되었다: 10 ㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (100×, 깁코), 10 ㎖ 글루타민 (200 mM, 깁코), 10 ㎖ MEM 비타민 (100×, 깁코), 10 ㎖ N3 농축물 (100×, 상기 참조). 혼합물을 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 필터 멸균하고, 1-2 ㎖ 분취량을 -20℃에서 보관하였다.
뉴런을 37℃에서 30분 동안 0.05％ 트립신-EDTA (깁코)를 사용하여 트립신처리하고, 스피닝에 의해 가라앉히고, 계수하였다. 200,000개의 세포에 아맥사 96-웰 뉴클레오펙터를 사용하여 400 ng 대조군 또는 DLK siRNA를 전기천공시킨 후, 8-챔버 슬라이드 (BD 바이오코트 PDL/라미닌 코팅 유리, 벡톤 디킨슨)의 2개의 웰 상에 균등하게 분할하였다. 실온에서 5-10분 동안 뉴런이 슬라이드에 부착되도록 한 후, 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 항-NGF 항체를 슬라이드의 오른쪽 절반 (4개의 웰)에 25 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 20시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 슬라이드를 250 ㎕의 고정 용액을 250 ㎕의 배양 배지에 직접 첨가함으로써 30％ 수크로스/8％ 파라포름알데하이드 (PFA)로 고정하였다. (30％ 수크로스/8％ PFA 용액을 제조하기 위해, 하기의 성분들을 교반 막대가 있는 600 ㎖ 비이커에 첨가하였다: 250 ㎖ 16％ PFA (카탈로그# 15710-S, 일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈), 50 ㎖ 10× PBS pH 7.4, 및 150 g 수크로스. 용해될 때까지 약한 가열 하에 용액을 혼합하였다. 그 후, pH가 7.4가 되도록 6-8방울의 1 M NaOH를 첨가하였다. 그 후, 눈금 실린더에서 물로 부피가 500 ㎖가 되게 하였다. 용액을 잘 혼합하고, 분취량으로 놓고, 동결시켰다.)
슬라이드를 30분 동안 고정시킨 후, PBS로 3회 세정하였다. 모든 세포를 뉴런 특이적 β-튜불린 항체 (2％ BSA, 0.1％ 트리톤 내의 Tuj1 (1:1000))로 4℃에서 하룻밤 동안 표지시켰다. 1차 항체를 제거하고, 슬라이드를 PBS로 3회 세정하였다. 슬라이드를 염소 알렉사 488 항-토끼 2차 항체 (1:500)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBS에서 3회 세정하고 나서, 130 ㎕의 마운팅 배지 (플루오로마운트 G; 일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈) 및 24×60 ㎜, #1 커버슬립 (VWR)으로 커버슬립을 덮었다.
DLK 에 대한 정량적 PCR ( qPCR )
E13.5 DRG를 해부하고, 대조군 siRNA 또는 DLK에 대해 지시된 siRNA를 전기천공시키고, 5일의 기간 동안 상기 기술된 바와 같이 배양하였다. 그 후, 뉴런으로부터의 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 퀴아젠 알엔이지 미니(Qiagen RNeasy Mini) 키트에 의해 퓨리파이 토탈 RNA(Purify Total RNA)를 사용하여 단리하였다. 대조군 및 DLK siRNA로 처리된 세포로부터의 전체 RNA 10 ng을 DLK 및 GAPDH (대조군)에 대해 특이적인 DNA 프라이머 (
Figure pct00048
(전방향 프라이머) 및
Figure pct00049
(역방향 프라이머); 서열 16 및 17)를 사용하여 정량적 PCR 실험 (퀴아젠 퀀티펙트 SYBR 그린(Qiagen Quantifect SYBR Green) RT-PCR))에서 삼중으로 러닝시켰다. 증폭 곡선을 분석하였고, 각각의 샘플의 상대적인 RNA 농도를 대조군과 비교하여 계산하였다.
결과
이러한 실험의 결과가 도 38에서 제시된다. 야생형 DLK를 코딩하는 플라스미드로의 293 세포의 일시적인 형질감염은 JNK의 인산화 및 활성화를 초래하였고, DLK가 신호전달 케스케이드에서 JNK의 상류에 있는 키나제임을 나타낸다. 키나제-데드 DLK를 코딩하는 플라스미드의 공동-형질감염은 JNK 인산화의 수준을 감소시켰다. siRNA를 통한 DLK 발현의 녹다운은 하류 키나제 JNK의 억제가 그러하듯이 변성에 대한 뉴런의 보호를 초래하였다. DLK에 대해 지시된 siRNA (다미콘(Dharmicon))로 형질감염된 배양된 뉴런을 사용하는 실험에서, 대조군 siRNA로 형질감염된 뉴런 (액틴 염색에 의해 가시화됨)에서 TuJ1 염색에 의해 가시화되는 바와 같이 NGF 중단 시 상당한 변성이 나타났다 (도 38 및 39). 반면에, DLK에 대해 지시된 siRNA로 형질감염된 뉴런에서는, NGF 중단 시 축삭 완전성이 유지되었다. 이러한 실험들에서의 DLK 발현의 녹다운은 DLK에 대해 특이적인 프라이머로의 정량적 PCR을 사용하여 확인되었다.
B. DLK 녹다운이 독소-유도 뉴런 세포 사망으로부터 보호한다
상기 관찰된 DLK 억제의 보호 효과가 다른 상해, 예컨대 독소 노출에 의해 야기되는 축삭 변성/뉴런 아폽토시스에 대해서 더욱 일반적으로 보호적인지 여부를 평가하기 위해 실험들을 수행하였다. 단리된 뉴런을 DLK에 대해 특이적인 siRNA의 존재 또는 부재 하에 유사분열 억제제인 빈크리스틴에 노출시켰다.
피질 뉴런을 하기의 절차를 사용하여 단리하였다. 뇌막이 없는 래트 E18 피질을 빙냉 뉴로베이슬 배지 (인비트로젠) 내로 해부하였다. 피질을 최종 농도 0.1％의 트립신/PBS (워딩톤(Worthington))에서 30분 동안 37℃에서 해리시켰다. 최종 농도 0.1％의 DNase (로쉐)를 튜브에 첨가하고, 조직을 실온에서 1분 동안 인큐베이션하였다. 조직을 따뜻한 뉴로베이슬 배지로 1회 세정하고, 조직이 튜브 내에서 침강되도록 한 후, 2％ B27 보충물 (인비트로젠)을 함유하는 뉴로베이슬 배지 1 ㎖를 첨가하였다. P1000 피펫 (레이닌(Rainin))으로의 저작에 의해 조직을 해리시켰다. 세포를 계수하고, 일부 실험에서는, 바이오시스템(Biosystem) 96-웰 뉴클레오펙터 (아맥사)를 사용하여 siRNA로 형질감염시켰다.
siRNA 실험을 위해, 세포를 6- 또는 8-웰 챔버 또는 96-웰 폴리-D-라이신 코팅 접시 (BD Biosciences)에 각각 2×106개의 세포/웰, 1.25-2×105개의 세포/웰, 또는 1×104개의 세포/웰의 세포 플레이팅 밀도 (전기천공 프로세스와 일반적으로 관련되는 약간의 세포 사망을 허용하는 밀도)로 플레이팅하였다. 뉴런을 20 ㎕의 뉴클레오펙션 용액 (아맥사) 및 600 ng의 siRNA (퀴아젠(Qiagen) 또는 다마콘)과 혼합하였다. 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 플레이팅 3-4일 후 유전자 침묵화를 분석하였다. 간략하게, 형질감염된 뉴런으로부터 알엔이지(RNeasy) 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 RNA를 단리하였다. 10 ng의 RNA를 함유하는 각각의 반응물을 DLK-, JNK1-, JNK2-, 또는 JNK3-특이적 프라이머와 함께 퀀티펙트 SYBR 그린 RT-PCR 키트 (퀴아젠)를 사용하여 삼중으로 러닝시켰다. 살림 유전자인 GAPDH에 대한 프라이머가 대조군으로서 사용되었다. (모든 프라이머를 퀴아젠에서 구입하였다.) ΔCT를 사용하여 각각의 샘플 내의 상대적인 RNA 농도에 대해 증폭 곡선을 분석하였다.
3-4일 동안 플레이팅된 피질 뉴런을 미세관 불안정화제인 300 nM 빈크리스틴으로 6-72시간 동안 처리하였다. NGF 중단-유도 아폽토시스 및 변성을 최종 처리 4-36시간 후 사이에 분석하였다. 아폽토시스 및 변성을 MTT 분석법 및 락테이트 탈수소효소 분석법 양쪽 모두를 사용하여 분석하였다. MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석법은 미토콘드리아 기능을 기초로 세포 생육력을 측정한다. MTT를 배양물 부피의 1/10 총량으로 각각의 웰에 첨가하고, 5％ CO2와 함께 37℃에서 90-120분 동안 인큐베이션하였다. MTT-함유 배양 배지를 흡인하고, 세포를 동일한 부피의 용해 용액 (10％ 트리톤 X-100, 1 방울의 HCl, 50 ㎖ 이소프로판올)에 재현탁시켰다. 분광광도계를 사용하여 흡광도 (570 및 690 nm)를 판독하였다. 락테이트 탈수소효소 (LDH) 수준을 사이토톡스(CytoTox) 비-방사성 LDH 분석법 키트 (프로메가)를 사용하여 분석하여, 분석법에서의 세포 사망량을 평가하였다. 제조사의 지시에 따라, 상이한 처리 조건들로부터의 배지 50 ㎕를 사용하였다. MTT 및 LDH 분석법 양쪽 모두에 대해, 세포 생존/세포 사망을 양성 대조군에 대해 표준화하였다.
결과가 표 9에 제시된다. 상기 기술된 DLK 녹다운, NGF 중단 실험에서 앞서 관찰된 바와 같이, DLK 발현의 녹다운이 2가지 상이한 분석법 시스템에서 빈크리스틴-유도 피질 뉴런 사망에 대해 또한 보호적이었다. 이러한 발견은 DLK 녹다운이 다수의 상이한 뉴런 유형에서의 스트레스-유도 뉴런 세포 사망에 대해 일반적으로 보호적일 수 있음을 가리킨다.
Figure pct00050
C. 교감신경 뉴런에서의 DLK 조절의 효과
상기 분석들은 DLK 억제가 피질 뉴런 및 후근 신경절 뉴런에서의 독소-유도 또는 성장 인자 고갈-유도 축삭 변성/아폽토시스에 대해 보호적이라는 것을 실연한다. 이러한 챌린지에 의해 일반적으로 유도되는 아폽토시스로부터 교감신경 뉴런을 보호하는 DLK 억제의 능력을 평가하기 위해 추가적인 실험들을 수행하였다.
경부 교감신경절을 생후 1일의 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트 (찰스 리버 랩스(Charles River Labs))로부터 해부하고, 5％ 소 태아 혈청 (인비트로젠)이 있는 울트라컬쳐(Ultraculture) 배지 (론자(Lonza))를 함유하는 접시에 수집하였다. 신경절을 무혈청 울트라컬쳐 배지로 2회 세정하고, 최종 농도 0.1％의 트립신 (워딩톤)을 첨가하고, 조직과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS 내의 1％ DNase (로쉐) 용액을 신경절에 첨가하고, 실온에서 1-2분 동안 인큐베이션하였다. 신경절을 울트라컬쳐로 세정하고, 튜브 바닥으로 침강되도록 하였다. 모든 세정 배지를 제거하고, 울트라컬쳐, 5％ 래트 혈청, 1％ 페니실린-스트렙토마이신, 1％ 글루타맥스, 7 μM 사이토신 아라비노시드 (시그마), 및 50 ng/㎖ 신경 성장 인자 (2.5S, 씨더레인 래버러토리(Cedarlane Laboratory))를 함유하는 플레이팅 배지 1 ㎖를 튜브에 첨가하였다. 신경절을 피펫 (레이닌)을 사용하는 저작에 의해 해리시켰다. 세포 슬러리를 0.45 ㎛ 세포 여과기 (팔콘(Falcon)) 상에서 여과하고, 세포수를 계수하였다. 교감신경 뉴런을 5000-7500개의 세포/웰 (96-웰 접시), 200,000개의 세포/웰 (6-웰 플레이트), 또는 100,000개의 세포/웰 (8-웰 챔버 슬라이드)의 밀도로 플레이팅하고, 4-5일 동안 5％ CO2에서 37℃에서 성장시켰다. 이틀마다 뉴런에 5-10 ng/㎖ NGF를 함유하는 신선한 플레이팅 배지를 공급하였다.
NGF 중단 분석법을 실시예 14A에 기술된 바와 같이 수행하였다. 빈크리스틴 처리, MTT 분석법, 및 LDH 분석법을 실시예 14B에 기술된 바와 같이 수행하였다.
렌티바이러스 실험을 2가지 렌티바이러스 벡터를 사용하여 수행하였다: GCMV-MCS-IRES-eGFP 및 GCMV-MC S-IRES-dsRed. 양쪽 벡터 모두 구조적 바이러스 유전자 gag, pol, env, rev, tat, vpr, vif, vpu, 및 nef가 없는 HIV1 균주이다. 또한, 통합 후 5' LTR/프로모터를 자가-불활성화이게 하는 3' LTR 내의 프로모터/인핸서 서열의 부분적인 결실이 있다. 양쪽 벡터 모두에 대해 트랜스로 제공되는 유전자는 바이러스 구조 단백질 Gag, Pol, Rev, 및 Tat (플라스미드 델타8.9를 통해) 및 외피 단백질 VSV-G이다. 이러한 플라스미드들이 공동-형질감염에 의해 HEK293-T 세포 내로 도입되었고, 바이러스 입자를 생성시키는데 필요한 상이한 바이러스 단백질들을 발현하였다. 야생형 또는 병원성 렌티바이러스가 생성될 가능성이 매우 낮은데, 이는 3개의 플라스미드 사이의 다중 재조합 이벤트를 필요로 할 것이기 때문이다. 또한, 양쪽 벡터로부터 발병력 인자 (vpr, vif, vpu, 및 nef)가 완전히 결실되었다.
바이러스를 5 ㎍/㎖ 폴리브렌을 함유하는 세포 배양 배지 내로 첨가함으로서 플레이팅 시점에 즉각적으로 또는 플레이팅 3-5일 후에 뉴런을 감염시켰다. 다음날, 바이러스-함유 배지를 제거하고, 신선한 배지로 교체하였다. 실험 전에 48시간 동안 세포가 바이러스를 발현하도록 하였다.
피질 뉴런 및 DRG에 대한 DLK 녹다운의 보호 효과와 유사하게, DLK의 녹다운이 NGF 중단-유도 아폽토시스 (도 40A-40B 및 표 10) 및 독소-유도 아폽토시스 (도 41 및 표 11)로부터 교감신경 뉴런을 보호하였다.
Figure pct00051
Figure pct00052
뚜렷하게, 과량의 키나제-데드 DLK의 도입이 교감신경 뉴런에서 NGF 중단-유도 아폽토시스에 대해 유사하게 보호적이었다 (도 42 및 표 12).
Figure pct00053
이러한 발견은 293 세포 내로 도입된 키나제-데드 DLK가 이러한 세포에서 JNK 인산화를 억제하였다는 실시예 15의 발견과 일관되었다. 한 비-제한적인 가능성은 키나제-데드 DLK가 정상적인 DLK 이량체화 및 자가-인산화를 방지할 수 있다는 것이다. 이러한 발견은 DLK 발현의 감소를 통한 또는 키나제 활성이 없는 DLK 변이체의 도입을 통한 DLK의 JNK-인산화 능력의 억제가 다수의 유형의 뉴런을 독소 노출 또는 성장 인자 중단에 응답하는 축삭 변성 및 아폽토시스에 대해 보호한다는 것을 시사한다.
실시예 15
DLK의 RNA 침묵화 및 키나제-데드 DLK의 도입이 배양된 뉴런의 NGF 중단-촉발 또는 독소-유도 변성에 대해 각각 보호적이라는 것이 결정되고 나서, 뉴런 변성 경로에서의 DLK의 역할을 확인하기 위해 추가적인 실험들을 수행하였다. DLK는 다중 계통 키나제 (MLK) 패밀리 내의 MAP 키나제 키나제 키나제이다. MLK 패밀리의 다른 구성원과 달리, DLK의 발현은 신경계에 제한된다 (문헌 [Gallo et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3(9):663-672, 2002]; [Bisson et al., Cell Cycle 7(7):909-916, 2008]; [Holzman et al., J. Bio. Chem. 269(49):30808-30817, 1994]). DLK는 특정 조건 하에 아폽토시스/염증을 초래하는, JNK 1-3 및 cJun을 활성화시키는 신호 전달 경로의 구성원이다. 증가된 JNK/cJun 활성이 환자 샘플의 검사 또는 질환의 동물 모델에서의 실험을 통해 파킨슨 질환, 녹내장, 알츠하이머 질환, ALS, 졸중, 및 헌팅톤병이 포함되는 다양한 신경 장애에 연결되었다 (문헌 [Oo et al., J. Neurochem. 72(2):557-564, 1999]; [Ries et al., J. Neurochem. 107(6):1578-1588, 2008]; [Vlug et al., Eur. J. Neurosci. 22(8):1881-1894, 2005]; [Morfini et al., Nat. Newosci. 12(7):864- 781, 2009]; [Perrin et al., Exp. Neurol. 215(1):191-200, 2009]; [Levkovitch-Verbin et al., Eye Res. 80(5):663-670, 2005]; [Tezel et al., Brain Res. 996(2):202-212, 2004]; [Kuan et al., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 100(25):15184-15189, 2003]; [Yang et al., Nature 389(6653):865-870, 1997]; [Hunot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(2):665-670, 2004]; [Thakur et al., J. Neurosci. Res. 85(8): 1668- 1673, 2007]). 신경 장애에 대한 DLK의 가능한 상관관계 및 하나 이상의 JNK/cJun 활성화 경로의 수반을 연구하였다.
A. 인산화된 DLK 에 대해 특이적인 항체
DLK는 MAP 키나제이고, 다른 MAP 키나제들과 유사하게, 이의 활성화 상태에서 활성화 루프 내에서 인산화된다. 활성화된 DLK와 휴지 (비-활성화) DLK를 쉽게 구별할 수 있기 위하여, 인산화된 형태의 DLK ("p-DLK")에 대해 특이적인 항체를 생성시켰다. 이를 위해, 활성 부위 내의 특정 잔기를 인산화될 수 없는 알라닌으로 돌연변이시켰다. 그후, 이러한 구축물을 실시예 14, 파트 A (상기)에 기술된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 293 세포 내로 형질감염시켰고, 하류 키나제 JNK를 인산화시키는 능력에 대해 테스트하였다 (도 43C). 이러한 분석에서, 트레오닌 278 (T278) 및 세린 281 (S281)이 활성에 필요하였음이 확인되었다. 토끼에서의 표준 생체내 면역화 기술을 사용하여 이러한 잔기를 함유한 DLK 단백질의 활성화 루프 내의 펩티드에 대해 항체들을 생성시켰다. 면역화에 사용된 펩티드 서열은 항체 317 및 318에 대한
Figure pct00054
, 및 항체 319 및 320에 대한
Figure pct00055
, 및 항체 321 및 322에 대한
Figure pct00056
이었다. 선택도가 생성되도록 인산화된 펩티드 및 인산화되지 않은 펩티드의 칼럼 상에서의 정제를 포함하는 "p-부위" 프로토콜을 사용하여 옌짐(Yenzym)에서 절차를 수행하였다. 6마리의 면역화된 토끼로부터의 폴리클로날 항체를 단리하고, DLK 및 p-DLK에의 결합에 대해 스크리닝하였다.
수득된 폴리클로날 항체 중 6개를 웨스턴 블롯 및 면역조직화학 분석에 적용하여, p-DLK를 검출하고 이를 인산화되지 않은 DLK 또는 다른 인산화된 키나제 및 인산화된 MLK3와 구별하는 항체의 능력을 결정하였다. 배양된 세포에 대해, 배지를 제거하고, 세포를 빙냉 PBS로 1회 세정하였다. 세포를 저온 PBS 내에 긁어 내고, 얼음 상의 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 세포를 신속하게 펠렛화시키고, 과량의 완충제를 제거하였다. 펠렛을 드라이 아이스 상에서 급속-동결시키고 -80℃에서 보관하거나, 또는 포스파타제 억제제 (시그마 P5726 및 P2850) 및 프로테아제 억제제 (로쉐 11836153001)를 함유하는 신선한 용해 완충제 (20 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.1％ 트리톤 X-100)에서 즉각적으로 용해시켰다. 세포를 4℃에서 30분 동안 회전기 상에서 용해시킨 후, 4℃에서 펠렛화시켰다. BCA 분석법 (피어스(Pierce))을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
단백질 용해물을 샘플 완충제 (인비트로젠)와 혼합하고, 5분 동안 비등시킨 후, 변성 4-12％ 구배 젤 (인비트로젠) 상에 로딩하였다. 샘플을 니트로셀룰로스 (인비트로젠) 상으로 옮기고, 5％ 밀크/TBST 차단 용액 (트리스-완충 염수 + 0.05％ 트리톤 X-100)에서 1시간 동안 차단시켰다. 블롯을 진탕 플랫폼 상에서 하룻밤 동안 4 ℃에서 1:1000의 희석도의 5％ BSA가 있는 TBST 내의 포스포-DLK 항체와 함께 인큐베이션하였다. 블롯을 TBST로 5분 동안 3회 세정하고, 토끼 2차 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-접합 항체 (잭슨 랩스(Jackson Labs), 1:5000)와 함께 1-2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 막을 TBST에서 3회 세정하고, 웨스트듀라(Westdura) 화학발광 기질 (피어스)로 발색시켰다.
293T 세포를 면역염색을 위해 12-웰 배양 접시 내에 함유된 커버슬립 상에 플레이팅하였다. 그 후, 세포를 앞서 기술된 바와 같이 mDLK 또는 mMLK3로 형질감염시키고, 형질감염 24시간 후 4％ PFA, 30％ 수크로스로 고정시켰다. 5％ BSA, 0.3％ 트리톤 X-100으로 1시간 동안 세포를 차단하고 투과성이게 한 후, 1％ BSA 내의 1:500 농도의 1차 항체와 함께 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS로 부드럽게 3회 헹구고, 알렉사488 항-토끼 2차 항체를 1시간 동안 접합시켰다. 이러한 단계에 이어서 PBS로 3회 세정하고, 이때 최종 세정은 핵을 염색하기 위한 DAPI (1:5000)를 함유하였다. 그 후, 커버슬립을 배양물에서 조심스럽게 들어 올리고, 세포가 있는 표면을 슬라이드 상에서 아래로 향하게 하면서 슬라이드 상에 마운팅하고, 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 가시화하였다.
항체 318, 319, 320, 321, 및 322 각각이 p-DLK 및 p-DLK/DN-DLK를 검출하였고, 이때 인산화된 MLK3에는 결합하지 않거나 (항체 318 및 319) 또는 매우 제한적으로 결합하였다 (항체 320, 321, 및 322) (도 43A). 반면에, 항체 317은 3가지 단백질 모두를 인식하였다. 항체 318 및 319가 p-DLK에 대해 가장 강한 결합 + 최소의 p-MLK3 결합을 나타냈고, 따라서 추가적인 분석에 사용되었다.
면역조직화학에 의해 측정된 바와 같이, 항체들이 세포 환경에서 p-DLK에 또한 특이적으로 결합할 수 있었다. 항체 318 및 319 양쪽 모두에서 DLK-형질감염 293T 세포가 염색되었고, MLK3-형질감염 293T 세포에서는 유의하게 감소된 결합이 관찰되었다 (도 43B). 이러한 결합은 키나제 활성의 거의 완전한 결여를 초래하는 돌연변이가 있는 DLK 돌연변이체로 형질감염된 293 세포에서 유의하게 감소되었다 (도 43C). 다른 혼합 계통 키나제와 유사하게, 이종성 시스템에 형질감염되는 경우 DLK가 이량체화하고 자가인산화하는 것으로 생각되기 때문에, 이러한 데이터는 이러한 항체가 인산화된 형태의 DLK를 실제로 인식함을 추가로 확증한다.
B. 피질 뉴런의 빈크리스틴 -유도 변성 동안의 DLK 의 활성화
이어서, 상기 기술된 바와 같이 생성된 항체를 빈크리스틴 스트레스를 받은 피질 뉴런에서 DLK 인산화 및 활성이 증가되는지 여부를 평가하기 위해 테스트하였다. 이는 DLK 활성의 녹다운이 생존을 촉진하였기 때문에 예상될 수 있었다. 상기 기술된 바와 같이 성장되고 빈크리스틴으로 1시간 동안 처리되었을 때, 인산화된-DLK의 수준이 항체 318, 319, 및 320을 사용하여 웨스턴 블롯 (상기 기술된 것과 동일한 프로토콜)에 의해 분석 시 대조군 배양물과 비교하여 상승되었다 (도 43D). 이는 인산화된 DLK의 수준이 활성과 상호관련되고 뉴런 스트레스의 조건 하에 증가된다는 추가적인 증명을 제공한다.
C. 뉴런 질환 모델에서의 DLK 의 발현 및 활성
면역조직화학 분석법을 하기와 같이 수행하였다. SOD1 트랜스제닉 동물에 4％ 파라포름알데하이드를 관류시키고, 척수를 조심스럽게 척주로부터 제거하고, 4℃에서 하룻밤 동안 후-고정시켰다. 그 후, 척수를 30％ 수크로스/PBS에서 평형화시키고 나서, 냉동절편화를 위해 OCT에 매립하였다. 피질 절편 (20 ㎛ 두께)을 절단하고, 저온 슬라이드 상에 마운팅하고, -80℃에서 유지시켰다. 절편을 PBS에서 수화시키고, 내인성 과산화효소 활성에 대해 H2O2 (PBS 내 0.3％)로 10분 동안 차단시킨 후, PBST (0.1％ 트리톤 X-100)로 2회 헹궜다. 절편을 PBS 내의 5％ BSA, 0.3％ 트리톤 X-100에서 1시간 동안 차단시킨 후, PBS 내의 1％ BSA, 0.3％ 트리톤 X-100 내의 p-DLK에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBST에서 3회 세정하고 나서, 1％ BSA, 0.3％ 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 내의 비오틴화 2차 항체 (1:300)로 1시간 동안 표지시켰다. 슬라이드를 PBST로 헹군 후, 30분 동안 아비딘 DH 함유 ABS 시약 (벡터 랩스)와 함께 인큐베이션하고, 마지막으로 암실에서 10-15분 동안 과산화효소 기질 (사용 직전에 30％ H2O2가 첨가된, 10 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.6 내의 0.05％ 디-아미노 벤지딘)에서 인큐베이션하였다. 물로 헹궈서 반응을 정지시키고, 절편들을 유리 슬라이드 상에 마운팅하고, 커버슬립을 덮었다. 알츠하이머 환자 조직을 US 바이올로지컬(US Biological)에서 구입하였다. 알츠하이머 환자 및 연령이 매칭되는 대조군의 해마로부터의 조직 용해물이 이러한 연구에 사용되었다. 상기 기술된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석을 수행하였다.
도 44A의 결과는 질환 과정 말기에 야생형 마우스에 비해 ALS의 SOD1 마우스에서 인산화된-DLK (p-DLK)의 수준이 고도로 상승되었음을 실연한다. p-DLK의 증거가 이러한 동물에서의 ALS-유사 증상의 개시 전인 14일 만큼의 초기에 조직에서 명백하였다 (도 44B).
유사한 결과가 인간 알츠하이머 환자 샘플에서 관찰되었다. 알츠하이머 질환 환자에서의 피질 샘플 내의 p-DLK의 수준이 대조군 샘플에 비교하여 증가되었다 (도 44C). 인산화된 JNK의 수준 및 인산화된 cJun63 수준이 대조군 샘플에 비해 알츠하이머 질환 환자에서 또한 증가되었다 (도 44C). 따라서, DLK가 증상의 개시 전 및 질환의 말기 단계 양쪽 모두의 경우에, ALS의 승인된 마우스 모델에서 활성화되었고, 또한 인간 알츠하이머 환자로부터의 피질 샘플에서 활성화되었다.
D. 관찰된 DLK 억제 효과에 기여하는 신호전달
1. DLK 침묵화의 분자 효과
상기 실시예 14에서 증명된 바와 같이, DLK 침묵화는 독소 노출 또는 성장 인자 중단에 응답한 변성으로부터 뉴런을 보호하고, DLK 키나제 활성이 JNK 인산화에 직접적으로 또는 간접적으로 수반된다. NGF 중단 스트레스 및 독소-의존적 스트레스 조건 하의 JNK 및 cJun 발현 및 활성을 평가하기 위해 실험들을 수행하였다. DLK의 발현을 감소시키기 위해 (siRNA), 그리고 면역블롯팅을 위해 사용된 실험 프로토콜은 상기 기술된 것들과 동일하였다.
DLK의 침묵화는 DRG 또는 피질 뉴런에서 기본적인 JNK 단백질 수준 또는 JNK 활성을 변화시키지 않았다 (도 45). 그러나, DLK 녹다운은 피질 뉴런, DRG, 및 교감신경절 뉴런에서 NGF 중단 또는 빈크리스틴-의존적 스트레스 후 p-cJun 수준을 감소시켰다 (도 45). DLK 녹다운은 피질 뉴런 및 DRG에서 NGF 중단 또는 빈크리스틴-의존적 스트레스 후 p-JNK 수준을 또한 감소시켰다 (도 45). p-JNK 항체가 JNK1, JNK2, 및 JNK3 각각의 인산화된 형태를 인지함을 주지하여야 한다. JNK1 인산화는 스트레스 유도 또는 cJun의 인산화와 상관되지 않았다. DLK 녹다운은 JNK2 및 JNK3의 스트레스-유도 인산화를 침묵화시켰다. 이러한 데이터에서 대조군 샘플에서 관찰된 배경 신호는 아마도 기본적인 인산화된 JNK1로 인한 것일 것이다. 결과는 DLK 침묵화 또는 기타 억제가 JNK 또는 cJun의 분해를 야기하지 않지만, 이러한 분자들의 더 적은 정도의 스트레스-유도 인산화 (및 따라서 활성화의 결여)를 초래함을 나타낸다.
DLK 억제가 JNK2 및 JNK3의 인산화를 제한하는 것을 통해 변성으로부터 뉴런을 보호한다면, JNK2 또는 JNK3의 억제제가 세포 사망 및 축삭 변성으로부터 뉴런을 또한 보호하여야 한다. 직접적인 JNK 억제가 NGF 중단-의존적 변성에 대해 뉴런을 보호하는 능력을 또한 평가하였다. 상기 기술된 NGF 중단 분석법에서의 평가 전에, DRG 체외이식편을 항-NGF 및 pan-JNK 억제제 JNKV 또는 JNKVIII으로 처리하였다. 양쪽 억제제 모두 DRG 체외이식편을 NGF-의존적 변성으로부터 보호할 수 있었다 (도 46): JNKV (칼바이오켐)는 5 μM의 농도에서, JNKVIII (칼바이오켐)은 4 μM의 농도에서 가장 보호적이었다.
관찰된 보호 효과에서 어떠한 JNK(들)이 수반되는지를 확인하기 위해, 추가적인 녹다운 실험들을 상기 기술된 것과 동일한 방법을 사용하여 수행하였다. JNK1 단독에 대해 특이적인 침묵화 RNA는 pan-JNK 억제제로 관찰된 효과를 반복할 수 없었다 (도 47). JNK2 또는 JNK3 단독에 대한 억제 RNA (siRNA)는 NGF 중단 시의 축삭 변성에 대해 DRG를 보호할 수 없었다 (도 47). JNK2 및 JNK3 양쪽의 침묵화의 존재 하에 가장 효과적인 보호가 관찰되었지만, 이러한 보호는 siDLK 단독과 동일한 정도가 아니였다 (도 47).
JNK1은 축삭 유지 및 시냅스 성숙을 담당하는 것으로 공지된, 구성적으로 활성인 분자인 반면, JNK2 및 JNK3은 스트레스에 의해 유도되고 cJun 활성화 및 아폽토시스/축삭 변성에서 수반되는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Coffey et al., J. Neurosci. 22(11):4335-4345, 2002]; [Coffey et al., J. Neurosci. 20(20):7602-7613, 2000]). DLK 억제가 JNK 1/2/3 억제보다 더 큰 신경보호 효과를 초래한다는 사실은 DLK가 JNK/cJUN 경로에서의 이의 역할에 더하여 뉴런 성장 및/또는 생존의 하나 이상의 메커니즘에 대해 억제성이라는 것을 강하게 시사한다.
E. DLK 의 영양 효과
기존의 연구는 우성 음성 키나제-데드 돌연변이체 형태의 DLK (K152A)가 흑색질 치밀부의 도파민작용성 뉴런에서 영양 효과를 야기하는 한편, 류신 지퍼 도메인만을 함유하는 우성 음성 형태의 DLK는 이같은 효과를 야기하지 않음을 시사하였다 (문헌 [Chen et al., J. Neurosci. 28(3):672-680, 2008]). 그러나, 뚜렷하게, 이러한 연구에서의 영양성은 감염된 뉴런과 감염되지 않은 뉴런 사이의 임의의 기능적 또는 형태학적 차이보다는 특정 마커를 발현하는 DLK (K152A)-감염 뉴런의 증가된 개수에 의해 정의되었다. 따라서 DLK 침묵화의 영향을 피질 뉴런 및 DRG에서 연구하였다. 이러한 연구에 사용된 프로토콜은 상기 기술된 것과 동일하였다.
DLK 녹다운은 피질 뉴런 및 교감신경 뉴런 양쪽 모두에서 명백한 영양 효과를 나타냈다 (세포수의 증가가 관찰됨) (도 48A 및 48B). 구체적으로, DRG, 피질 뉴런 및 교감신경 뉴런이 DLK에 대해 지시된 siRNA로 처리되었을 때 배양에서 증가된 성장/생존을 나타냈다 (성장 증가가 관찰됨) (표 13).
Figure pct00057
뉴런 성장에서의 DLK의 역할을 추가로 시험하기 위해, 가지돌기에 특히 국소화되는 미세관 관련 단백질인 MAP2의 수준을 측정하였다. 배양된 뉴런에서의 MAP2 발현은 뉴런 성숙 및 발현을 반영하고, 성장 친화형(pro-growth) 조건 하에 종종 증가된다. 뉴런에서의 류신 지퍼 형태의 DLK 또는 우성 음성 키나제-데드 형태의 DLK를 사용하는 DLK 활성의 억제는 MAP2 단백질 생산의 유도를 초래하였다. MAP2 발현의 유도는 뉴런 성장 및 성숙이 일어나고 있음을 가리키고, DLK 녹다운이 뉴런에 대한 기능성 영양 효과를 실제로 지닌다는 것을 추가로 확증한다.
실시예 16
본원에 기술된 분석법에서 뉴런에서의 변성을 감소시키는 G-단백질 및 G-단백질 커플링 수용체 (GPCR)의 여러 억제제가 확인되었다. 변성 경로에서의 G-단백질 및 GPCR의 역할을 확인하기 위해 DRG에서 실험들이 수행되었다. 이러한 실험에서 사용된 실험 프로토콜은 실시예 14에 기술된 것들과 동일하였다. 백일해 독소 및 SCH 202676은 토크리스 바이오사이언스에서 구입하였다.
데이터는 G 단백질-커플링 수용체에 대한 효능제 및 길항제 결합을 억제하는 술피드릴-반응성 화합물인 SCH 202676이 DRG에서 NGF 중단-유도 변성을 감소시킴을 나타냈다 (도 49 및 50). G-단백질 신호전달의 또 다른 억제제인 백일해 독소 또한 NGF 중단 후의 뉴런에서의 변성을 감소시켰다 (도 51). 이러한 데이터는 G-단백질 및 G- 단백질 커플링 수용체가 뉴런 변성에서 역할을 한다는 것을 시사한다.
실시예 17
본원에 기술된 분석법에서 확인되고, 변성 경로에서 역할을 하는 추가적인 세포 표적은 베타-카테닌 신호전달 경로의 구성원 및 이의 하류 표적 (예를 들어, 전사 인자 4, TCF4)이다. 뉴런 변성에서의 베타-카테닌 및 TCF4의 역할을 확인하기 위해 해마 뉴런에서 실험들을 수행하였다. 이러한 실험에서 사용된 실험 프로토콜은 실시예 14에 기술된 것들과 동일하였다.
데이터는 구성적으로 활성인 GSK3의 발현 (베타-카테닌의 상실을 초래할 수 있음)이 뉴런 생육력에서의 감소를 매개함을 나타냈다 (도 52; 상부 오른쪽 패널). 우성 음성 형태의 TCF4의 발현이 뉴런 생육력에서의 감소를 또한 매개하였다 (도 52, 하부 오른쪽 패널). 이러한 데이터는 베타-카테닌 신호전달 경로가 뉴런 생육력의 유지에 중요함을 가리킨다. 베타-카테닌 신호전달 경로를 표적으로 하는 억제제가 뉴런 변성을 촉진하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 베타-카테닌 발현의 억제제 및 TCF4 활성의 억제제). 역으로, 베타-카테닌 및 TCF4 신호전달의 활성화제가 축삭 변성 및 뉴런 세포 사망을 방지할 수 있다.
기타 실시양태
본 명세서에서 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별적인 간행물 또는 특허가 참고로 포함되는 것으로 명확하게, 그리고 개별적으로 지시된 바와 같이 참고로 본원에 포함된다. "단수형 부정관사 (a)" 및 "단수형 정관사 (the)"와 같은 단수형 형태가 본원에서 사용되는 것은, 문맥적으로 달리 지시되지 않는 한, 상응하는 복수 형태의 지시를 배제하지 않는다. 본 발명이 이해를 명확하게 하려는 목적으로 설명 및 예의 방식으로 약간 상세하게 기술되었지만, 첨부된 청구항의 취지 또는 범주를 벗어나지 않으면서 이에 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 본 발명의 교시내용의 견지에서 당업자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech et al. <120> Modulation of Axon Degeneration <130> 50474/020WO2 <150> 61/197,051 <151> 2008-10-22 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitory nucleic acid sequence <400> 1 gcactgaatt ggacaactct t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitory nucleic acid sequence <400> 2 gagttgtcca attcagtgct t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitory nucleic acid sequence <400> 3 ggacatcgcc tccgctgatt t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitory nucleic acid sequence <400> 4 atcagcggag gcgatgtcct t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitory nucleic acid sequence <400> 5 gcaagacccg tcaccgaaat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitory nucleic acid sequence <400> 6 tttcggtgac gggtcttgct t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitory nucleic acid sequence <400> 7 gcggtgtcct ggtctactat t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibitory nucleic acid sequence <400> 8 tagtagacca ggacaccgct t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JNK1 target nucleic acid sequence <400> 9 ttggatgaag ccattagact a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JNK2 target nucleic acid sequence <400> 10 acctttaatg gacaacatta a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JNK2 target nucleic acid sequence <400> 11 aaggattagc tttgtatcat a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JNK3 target nucleic acid sequence <400> 12 cccgcatgtg tctgtattca a 21 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DLK1 peptide sequence <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> phosphorylated threonine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> phosphorylated serine <400> 13 Cys Lys Glu Leu Ser Asp Lys Xaa Thr Lys Met Xaa Phe Ala Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DLK1 peptide sequence <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> phosphorylated serine <400> 14 Lys Met Xaa Phe Ala Gly Thr Val Ala Trp Met Ala Lys Lys Cys 1 5 10 15 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DLK1 peptide sequence <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> phosphorylated threonine <400> 15 Cys Gly Thr Ser Lys Glu Leu Ser Asp Lys Ser Xaa Lys Met 1 5 10 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DLK1 forward primer <400> 16 catcatctgg gtgtgggaag 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DLK1 reverse primer <400> 17 agttgcagca tgagggcatt c 21

Claims (31)

  1. (i) 뉴런 또는 이의 일부분 내의 표적 단백질의 활성 또는 발현, 또는 (ii) 뉴런 또는 이의 일부분에서의 프로세스를 조절하는 작용제를 뉴런 또는 이의 일부분에 투여하는 단계를 포함하는, 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 억제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 억제되는 변성이 뉴런의 축삭 또는 세포체에서의 변성인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 뉴런 또는 이의 일부분이 소뇌 과립 뉴런, 후근 신경절 뉴런, 피질 뉴런, 교감신경 뉴런, 및 해마 뉴런으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴런이거나, 또는 이러한 뉴런 내에 포함되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 투여가 대조군 뉴런 집단에 비교하여 뉴런 집단의 변성에서의 10％ 이상의 감소 또는 뉴런 집단 내의 축삭 또는 세포체의 변성에서의 10％ 이상의 감소를 초래하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 표적 단백질이 이중 류신 지퍼-보유 키나제 (DLK), 글리코겐 신타제 키나제 3β (GSK3β), p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (p38 MAPK), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K), 시클린-의존적 키나제 5 (cdk5), 아데닐릴 시클라제, c-Jun N-말단 키나제 (JNK), BCL2-회합 X 단백질 (Bax), Ih 채널, 칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 키나제 (CaMKK), G-단백질, G-단백질-커플링 수용체, 전사 인자 4 (TCF4), 또는 β-카테닌으로 구성된 군으로부터 선택되거나; 또는
    프로세스가 전사 또는 단백질 합성인 방법.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서, 작용제가 표적 단백질 또는 프로세스의 억제제인 방법.
  7. 제1항 또는 제6항에 있어서, 작용제가 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티바디(peptibody), 핵산 분자, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 폴리뉴클레오티드, 압타머(aptamer), 소분자, 및 폴리사카라이드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 항체가 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편, 및 F(ab')2 단편으로 구성된 군으로부터 선택되거나; 또는
    소분자가 GSK3β 억제제 I, GSK3β 억제제 VII, GSK3β 억제제 VIII, GSK3β 억제제 XII, 염화리튬, 티르포스틴(Tyrphostin) B44, 티르포스틴 B42 (AG 490), 아니소마이신(Anisomycin), 시클로헥시미드(Cycloheximide), 로스코비틴(Roscovitine), 포르스콜린(Forskolin), 악티노마이신(Actinomycin) D, 백스(Bax) 채널 차단제, 보르테조미드, 디술피람, 파마피모드, 제피티닙, 에를로티닙, 라파티닙 디토실레이트, 데메클로시클린 히드로클로라이드, 젠타마이신 술페이트, 네오마이신 술페이트, 파로모마이신 술페이트, 및 이들의 제약상 허용되는 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 억제제가 DLK 신호전달 억제제, GSK3β 억제제, EGFR 경로 억제제, 또는 G-단백질 억제제인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 억제제가
    (i) DLK를 표적으로 하는 siRNA 분자, JNK1을 표적으로 하는 siRNA 분자, JNK2를 표적으로 하는 siRNA 분자, JNK3을 표적으로 하는 siRNA 분자, 소분자, T278A DLK, S281A DLK, K152A DLK, 및 DLK의 류신 지퍼 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 DLK 신호전달 억제제;
    (ii) GSK3β 억제제 I, GSK3β 억제제 VII, GSK3β 억제제 VIII, GSK3β 억제제 XII, 및 염화리튬으로 구성된 군으로부터 선택된 GSK3β 억제제;
    (iii) 에를로티닙, 티르포스틴 B44, 티르포스틴 B42/AG 490, 및 소분자로 구성된 군으로부터 선택된 EGFR 경로 억제제; 또는
    (iv) 백일해 독소 또는 소분자인 G-단백질 억제제
    인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 뉴런 또는 이의 일부분이 인간 대상체 내에 존재하거나, 신경 이식편 또는 신경 이식물 내에 존재하거나, 또는 생체외 또는 시험관 내에 있는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 대상체, 또는 신경 이식편 또는 신경 이식물을 도입하려는 대상체가 (i) 신경계의 장애, (ii) 신경계 외부에 1차 효과가 있는 질환, 상태 또는 치료법에 대해 2차적인 신경계의 상태, (iii) 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상, (iv) 통증, (v) 눈-관련 신경변성, (vi) 기억 상실, 및 (vii) 정신과 장애로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 상태에 걸렸거나 또는 이러한 질환 또는 상태가 발생할 위험이 있는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 투여가 신경계의 장애; 신경계 외부에 1차 효과가 있는 질환, 상태 또는 치료법에 대해 2차적인 신경계의 상태; 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상; 통증; 눈-관련 신경변성; 기억 상실; 또는 정신과 장애의 하나 이상의 증상, 또는 상기 장애 또는 상태가 발생할 가능성에서의 10％ 이상의 감소를 초래하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 증상이 떨림, 느린 동작, 운동실조, 균형 상실, 우울증, 인지 기능 감소, 단기 기억 상실, 장기 기억 상실, 혼란, 성격 변화, 언어 곤란, 감각 인지 상실, 접촉 과민, 팔다리 무감각, 근육 쇠약, 근육 마비, 근육 경련, 근육 연축, 상당한 식습관 변화, 과도한 공포 또는 걱정, 불면증, 망상, 환각, 피로, 요통, 흉통, 소화 문제, 두통, 빠른 심박수, 어지러움, 시야 흐림, 시야의 그림자 또는 누락 영역, 변시증, 색각 장애, 밝은 빛에의 노출 후 시력 기능의 회복 감소, 및 시각적 대비 감도 상실로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 질환 또는 상태가
    (i) 근육위축성 측삭 경화증 (ALS), 삼차 신경통, 혀인두 신경통, 벨(Bell) 마비, 중증 근육무력증, 근육 퇴행위축, 진행성 근육 위축, 원발성 측삭 경화증 (PLS), 거짓 연수 마비, 진행성 연수 마비, 척수 근육 위축, 유전성 근육 위축, 추간판 증후군, 경추증, 얼기 장애, 흉곽 출구 파괴 증후군, 말초 신경병증, 포르피린증, 알츠하이머(Alzheimer) 질환, 헌팅톤(Huntington) 질환, 파킨슨(Parkinson)) 질환, 파킨슨-플러스 질환, 다계통 위축, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 루이체(Lewy body) 치매, 전두측두엽 치매, 탈수초성 질환, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 다발성 경화증, 샤르코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth) 질환, 프리온 질환, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob) 질환, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커(Gerstmann-Straussler-Scheinker) 증후군 (GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 소 해면상 뇌병증, 픽(Pick) 질환, 간질, 및 AIDS 치매 복합증으로 구성된 군으로부터 선택된 신경계의 장애;
    (ii) 만성 통증, 섬유근육통, 척추 통증, 수근관 증후군, 암으로 인한 통증, 관절염, 좌골신경통, 두통, 수술로 인한 통증, 근육 연축, 요통, 내장 통증, 손상으로 인한 통증, 치통, 신경성 또는 신경병성 통증과 같은 신경통, 신경 염증 또는 손상, 대상포진, 추간판 탈출, 인대 파열, 및 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택된 상태와 관련된 통증;
    (ii) 당뇨병, 암, AIDS, 간염, 신장 기능이상, 콜로라도 진드기 열, 디프테리아, HIV 감염, 나병, 라임 질환, 결절성 다발동맥염, 류머티스성 관절염, 사르코이드증, 쇼그렌 증후군, 매독, 전신성 홍반 루푸스, 또는 아밀로이드증에 의해 야기되는 말초 신경병증 또는 신경통;
    (iii) 독성 화합물, 중금속, 공업용 용매, 약물, 화학치료제, 댑손, HIV 약제, 콜레스테롤 저하 약물, 심장 또는 혈액 압력 약제, 또는 메트로니다졸에의 노출에 의해 야기되는 신경 손상;
    (iv) 물리적, 기계적 또는 화학적 외상으로 인해 야기되는 신경계에 대한 손상;
    (v) 정신분열증, 망상 장애, 정신분열정동 장애, 정신분열형 장애, 공유 정신병적 장애, 정신병, 편집성 인격 장애, 분열성 인격 장애, 경계성 인격 장애, 반사회성 인격 장애, 자기애성 인격 장애, 강박 장애, 섬망, 치매, 기분 장애, 양극성 장애, 우울증, 스트레스 장애, 공황 장애, 광장공포증, 사회 공포증, 외상후 스트레스 장애, 불안 장애, 및 충동 조절 장애로 구성된 군으로부터 선택된 정신과 장애; 또는
    (vi) 녹내장, 격자 이영양증, 색소성 망막염, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 건식 또는 습식 AMD와 관련된 광수용체 변성, 기타 망막 변성, 시신경 드루젠, 시각 신경병증, 및 시신경염으로 구성된 군으로부터 선택된 눈-관련 신경변성
    인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 신경계에 대한 손상이 화상, 상처, 수술, 사고, 허혈, 저온에의 장기 노출, 졸중, 두개내 출혈, 및 뇌 출혈로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는
    녹내장이 원발성 녹내장, 저안압 녹내장, 원발성 폐쇄각 녹내장, 급성 폐쇄각 녹내장, 만성 폐쇄각 녹내장, 간헐성 폐쇄각 녹내장, 만성 개방각 폐쇄 녹내장, 색소성 녹내장, 비늘 녹내장, 발육이상 녹내장, 속발성 녹내장, 수정체성 녹내장, 안내 출혈에 대해 속발성인 녹내장, 외상성 녹내장, 신생혈관 녹내장, 약물-유도 녹내장, 독성 녹내장, 및 안내 종양, 망막 박리, 눈의 중증 화학적 화상 및 홍채 위축과 관련된 녹내장으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제12항에 있어서, 뉴런 또는 이의 일부분을 작용제와 접촉시키는 단계가 작용제를 포함하는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 투여가 정맥내 주입; 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사; 또는 국소 또는 안구 적용에 의해 수행되는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 대상체에게 하나 이상의 추가적인 제약 작용제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  20. 뉴런 또는 이의 일부분을 축삭 또는 뉴런 변성 분석법에서 후보 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때 대조군에 비해 후보 작용제의 존재 하에 뉴런 또는 이의 일부분의 변성 감소가 검출되는 것은 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 억제하는데 사용하기 위한 작용제의 확인을 지시하는 것인, 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 억제하는데 사용하기 위한 약제를 확인하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 축삭 또는 뉴런 변성 분석법이 항-신경 성장 인자 (NGF) 항체, 혈청 결핍/KCl 감소, 및 로테논 처리로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 후보 작용제가 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티바디, 핵산 분자, 짧은 간섭 RNA (siRNA), 폴리뉴클레오티드, 압타머, 소분자, 및 폴리사카라이드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 억제하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 작용제를 포함하는 제약 조성물 또는 키트.
  24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 작용제가 DLK 신호전달 억제제, GSK3β 억제제, EGFR 경로 억제제, 또는 G-단백질 억제제인 제약 조성물 또는 키트.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 하나 이상의 작용제가 GSK3β 억제제 I, GSK3β 억제제 VII, GSK3β 억제제 VIII, GSK3β 억제제 XII, 염화리튬, 티르포스틴 B44, 티르포스틴 B42 (AG 490), 아니소마이신, 시클로헥시미드, 로스코비틴, 포르스콜린, 악티노마이신 D, 백스 채널 차단제, 보르테조미드, 디술피람, 파마피모드, 제피티닙, 에를로티닙, 라파티닙 디토실레이트, 데메클로시클린 히드로클로라이드, 젠타마이신 술페이트, 네오마이신 술페이트, 파로모마이신 술페이트, 및 이들의 제약상 허용되는 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물 또는 키트.
  26. 제24항에 있어서, 하나 이상의 작용제가
    (i) DLK를 표적으로 하는 siRNA 분자, JNK1을 표적으로 하는 siRNA 분자, JNK2를 표적으로 하는 siRNA 분자, JNK3을 표적으로 하는 siRNA 분자, 소분자, T278A DLK, S281A DLK, K152A DLK, 및 DLK의 류신 지퍼 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 DLK 신호전달 억제제;
    (ii) GSK3β 억제제 I, GSK3β 억제제 VII, GSK3β 억제제 VIII, GSK3β 억제제 XII, 및 염화리튬으로 구성된 군으로부터 선택된 GSK3β 억제제;
    (iii) 에를로티닙, 티르포스틴 B44, 티르포스틴 B42/AG 490, 및 소분자로 구성된 군으로부터 선택된 EGFR 경로 억제제; 또는
    (iv) 백일해 독소 또는 소분자인 G-단백질 억제제
    인 제약 조성물 또는 키트.
  27. 제23항에 있어서, 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제, 또는 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 억제하기 위한 방법에서의 조성물 또는 키트의 사용을 위한 설명서를 추가로 포함하는 제약 조성물 또는 키트.
  28. (i) 뉴런 또는 이의 일부분 내의 표적 단백질의 활성 또는 발현, 또는 (ii) 뉴런 또는 이의 일부분에서의 프로세스를 조절하는 작용제를 뉴런 또는 이의 일부분에 투여하는 단계를 포함하는, 뉴런 또는 이의 일부분의 변성을 활성화하는 방법.
  29. 제29항에 있어서, 표적 단백질이 이중 류신 지퍼-보유 키나제 (DLK), 글리코겐 신타제 키나제 3β (GSK3β), p38 미토겐-활성화 단백질 키나제 (p38 MAPK), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K), 시클린-의존적 키나제 5 (cdk5), 아데닐릴 시클라제, c-Jun N-말단 키나제 (JNK), BCL2-회합 X 단백질 (Bax), Ih 채널, 칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 키나제 (CaMKK), G-단백질, G-단백질-커플링 수용체, 전사 인자 4 (TCF4), 및 β-카테닌으로 구성된 군으로부터 선택되거나; 또는
    프로세스가 전사 또는 단백질 합성인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 작용제가 표적 단백질 또는 프로세스의 활성화제인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 표적 단백질의 조절이 GSK3β의 활성 또는 발현의 증가, β-카테닌의 활성 또는 발현의 감소, 및/또는 TCF4의 활성 또는 발현의 감소인 방법.
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