KR20100063673A

KR20100063673A - 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물을 포함하는 항산화 기능성 식품 조성물

Info

Publication number: KR20100063673A
Application number: KR1020090119076A
Authority: KR
Inventors: 신한승
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2008-12-03
Filing date: 2009-12-03
Publication date: 2010-06-11
Anticipated expiration: 2029-12-03
Also published as: KR101646516B1

Abstract

본 발명은 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 기능성 식품 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 알코올 및 다른 유기 용매에 의해 추출되고 분획된 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물을 포함하는 항산화력이 우수한 식품 조성물을 제공한다.

Description

올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물을 포함하는 항산화 기능성 식품 조성물{FOOD COMPOSITION COMPRISING EXTRACT OF NELUMBO NUCIFERA LEAF, SEED, AND OLIVE LEAF}

연(Nelumbo nucifera)은 인도와 중국을 중심으로 열대, 온대의 동부아시아를 비롯한 한국, 일본 등에 널리 분포하는 고생대의 식물로 불교에서 신성한 식물로 꽃은 관상용과 차제로 이용하여 왔으며, 잎과 뿌리는 식용하여 왔다. 한방에서 잎은 하엽(河葉)이라하며 설사, 두통과 어지러움, 토혈, 산후 어혈치료, 야뇨증, 해독작용에 쓰이고, 성분으로는 진통작용, 진정작용이 있는 roemerine, nuciferin, armepavine, n-nornuciferine, pronuciferine, d-n-methylcoclaurine, liriodenine, 주석산, 구연산, 호박산, 탄닌 등이 함유되어 있다고 한다 (Yuk CS 1990).

연 종류 중에서도　백련(Nelumbo nucifera Gaertn)의 뿌리와 잎은 민간요법에서 당뇨병, 고지혈증과 고혈압 등 대사상 질환에 사용되어 왔고, 설사, 두통, 어지러움, 출혈 및 해독작용에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Xiao et al 2005, Ling et al 2005). 일반적으로 연의 뿌리와 잎이 약용과 식용으로 많이 사용되고 있으며, 특히 연근에는 수용성 섬유질이 많아 변비 완화작용이 있고 혈압 강하에도 효과적이라고 알려졌다. 또한 당단백질인 뮤신이 함유되어 있어 혈압 강하 콜레스테롤 저하 작용이 있다고 밝혀졌으며 연근에 함유된 탄닌은 강력한 수렴 작용이 있어 지혈 효과가 탁월하고 항산화 작용도 크다고 알려졌다(Ling et al 2005).

또한 올리브란 하나의 식물계와 그에 대한 대표적인 속(屬)에 대해서 뿐만 아니라, 올리브 나무에 열리는 나무에도 공통적으로 사용하는 명칭으로 24개의 속(屬)에 약 900여 종(種)이 존재하며 스페인, 이태리, 그리스 등이 주요 올리브 생산 국가이다. 현재 올리브가 미치는 건강상의 이점에 대한 관심이 높아짐으로 인해 세계의 여러 국가 및 지역 (미국, 캐나다, 일본 등)에서도 재배하고 있으며 열매는 생과 그대로 사용하거나 올리브유의 원료로, 잎은 이태리 요리의 향신료나 약용식품으로 현재까지 이용되고 있다.

약용식품으로써 올리브잎은 말라리아 고열 등을 치료하는 목적으로 민간 의약품으로 사용되었으며, 고혈압, 아테롬성 동백경화증, 결장암, 염증, 식중독 등의 증상에 효능이 있다고 알려져 있다. 특히 올리브잎 추출물은 혈압을 낮추거나 관상동맥의 혈류 속도를 증가, 부정맥을 완화, 소장 근육의 경련을 예방하는 등의 능력이 있는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 AIDS(Acquired Immune Deficiency Syndrome)에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Campeol et al., 2003; Flamini et al., 2003; Garcia-Gomez et al., 2003; Ryan et al., 2003).

올리브잎의 주요 생리활성 물질은 페놀성 화합물들로 하이드록시티로졸(hydroxytyrosol), 타이로졸(tyrosol), 카테킨(catechin), 카페인산(caffeic acid), 바닐린산(vanillic acid), p-쿠마린산(p-coumaric acid), 디오스메틴(diosmetin), 바닐린(vanillin), 루틴(rutin), 올레우로페인(oleuropein), 디메틸올레우로페인(demethyloleuropein), 올레우로시드(oleuroside), 베르바스코시드(verbascoside), 리그스트로시드(ligstroside), 및 루테오린 7-루티노시드(luteolin 7-rutinoside), 루테올린 4-글루코시드(luteolin 4-glucoside), 아피제닌 7-글루코시드(apigenin 7-glucoside), 아피제닌 7-루티노시드(apigenin 7-rutinoside) 등의 플라보노이드 글리코시드(flavonoid glycosides) 등이 있다. 특히 이들 성분 중 올레우로페인(oleuropein)은 올리브잎에 가장 많이 함유되어 있는 페놀성 물질로 최근에는 올레우로페인의 생리활성에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있는데생리활성물질은 매우 적은 양으로도 인체 내에서 현저한 활성을 나타내는 고부가가치 물질로 많은 종류가 유용하게 쓰이고 있다(Bianco et al., 2000; Ryan et al., 2002).

올레우로페인은 올리브 열매와 잎에 함유된 주요 페놀화합물로서 세균, 바이러스, 진균 등과 같이 인체에 해로운 미생물에 대한 저항력을 향상, 고혈압 완화, 산화 방지 효과, 혈당 조절 기능 등 다양한 질병의 치료보조 기능이 있는 물질로 밝혀지고 있어 올리브잎으로부터 추출한 페놀성 성분들로부터 이러한 질병에 대한 연구로 이어지고 있다(Raffaella and Patumi, 2002).

한편 한국특허등록 10-0386640호(등록일자: 2003년05월23일)에는 연잎을 깨끗한 물로 세척하는 세척단계; 세척된 연잎을 통풍이 잘되는 상온(常溫)의 그늘에서 건조하는 1 차 상온 건조단계; 상온 건조된 연잎을 0.5 내지 1.0㎝의 길이로 잘게 써는 절단단계; 잘게 썰린 연잎을 상온에서 수분 함량이 30 % 이하가 되도록 재차 건조하는 2 차 상온 건조단계; 2 차 건조된 연잎을 90 내지 110 ℃ 사이의 온도로 3 ∼ 8 분 동안 가열하여 건조하는 가열 건조단계 및; 가열 건조된 연잎을 냉각하여 연엽차를 완성하는 냉각단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 연엽차 제조방법이 개시되어 있다.

또한 한국등록특허 10-0386640(등록일자: 2003년05월23일)에는 연잎차 음료의 제조방법에 있어서, 절단 및 세척된 연잎을 90 - 100kg f /㎠ 압력의 증기로 40 - 50초 동안 증제하여 냉풍건조로 1분간 식히는 증제공정; 상기 증제된 연잎을 75 - 110℃의 열풍으로 15 - 25분 동안 조유 처리하는 조유공정; 상기 조유된 연잎을 상온에서 5 - 10분 동안 유념 처리하는 유념공정; 상기 유념된 연잎을 30 - 40℃의 열풍으로 20 - 30분 동안 중유 처리하는 중유공정; 상기 중유된 연잎을 40 - 50℃의 열풍에서 이물질과 가루를 날려보내고 15 - 25분간 덖어 재건하는 재건공정; 상기 재건된 연잎을 건조기에서 60 - 70℃ 온도로 30 - 40분간 열풍 건조하는 건조공정; 상기 건조된 연잎을 80 - 90℃의 가향기에서 20 - 40분간 덖어 연잎차를 가향 처리하는 가향공정; 상기 가향이 완성된 연잎차에 올리고당을 5-20% 용해시킨 물을 첨가하여 70-100℃에서 단시간 우려낸 후 냉각하는 우림공정; 상기 우린 액을 여과하고 용기에 담아 밀봉한 후 80-90℃에서 30-60초간 살 균하고 냉각하여 포장하는 밀봉 및 살균공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 연잎차음료 제조방법이 개시되어 있다.

또한 한국등록특허 10-0659483(등록일자: 2006년12월13일)에는 연근과; 연의 열매와; 연잎과; 연밥과; 연 줄기와; 연꽃을 각각 수세후 이들을 물과 함께 진공감압농축기에 넣어, 110℃를 유지한 상태로 2시간 동안 감압농축하여 추출물을 얻고, 상기의 추출물로 올리고당을 첨가하여 희석후 다시 가열용기에 넣어 100℃를 유지한 상태로 30 ~ 40분 동안 끓인 후 여과기를 통해 그 내의 이물질이나 건더기를 여과 시킨 다음 0 ~5℃의 냉장보관함을 특징으로 하는 연을 이용한 엑기스의 제조방법이 기재되어 있다.

그러나 상기 발명들은 단순히 연잎을 말려서 차를 제조하거나, 물에 넣고 가열하는 방식만을 채용하고 있어, 연의 유용한 성분이 충분히 우러나오지 않을 뿐만 아니라 다양한 종류에 식품 원료로 사용하는데 한계가 있었다. 또한 본 발명과 같이 연잎 뿐만 아니라 연꽃씨 및 올리브잎을 함께 사용한 식품에 대해서는 전혀 알려진 바가 없었다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물을 유효 성분으로 포함하는 항산화력이 우수한 기능성 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물을 2.0 내지 50.0 중량 % 포함하는 항산화 식품 조성물로서, 상기 혼합 추출물 중 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 비율은 5:3:2의 중량비인 것을 특징으로 하는 항산화 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 혼합 추출물은 건조된 올리브잎, 연꽃씨, 연잎을 조분쇄한 후 20 내지 70중량%의 알코올을 첨가하는 단계; 상기 용액을 60 내지 80℃ 범위에서 환류 냉각하면서 2회 이상 반복 추출하는 단계; 상기 추출된 혼합 용액을 여과한 다음 감압 농축한 후 동결건조하는 단계; 및 선택적으로 물과 유기 용매를 첨가하여 분획한 다음 0 내지 80℃ 범위에서 감압 농축한 후 동결건조하는 단계를 수행하여 제조될 수 있다.

또한 본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 환류냉각 단계는 60 내지 80℃ 범위에서 수행되는 것이 바람직하며, 감압농축 과정은 30 내지 80℃ 범위가 적합하고, 40℃가 더욱 바람직하다.

또한 본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 상기 알코올은 40 ~ 90% 에탄올인 것이 바람직하며, 유기용매는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 본 발명에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물을 포함하는 식품은 산제, 정제, 캡슐제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제제일 수 있으며, 상기 제제 중 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물의 함량은 2.0 내지 50.0 중량%인 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 본 발명에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물을 포함하는 식품은 빵, 케이크, 쿠키, 크래커, 면류, 유제품, 선식, 음료로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 음료는 탄산 또는 비탄산 음료, 야채 쥬스, 과일 쥬스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 식품 중 올리브잎, 연꽃씨, 연잎 추출물의 함량은 2.0 내지 30.0 중량%인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물은 총 페놀 함량이 높고, SOD 유사 활성 및 아질산염 소거능도 우수한 것으로 확인되었으므로, 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물을 포함하는 다양한 기능성 제제와 식품은 우수한 항산화력을 통해 국민 건강 증진에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

이하에서 실시예 및 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 일실시예에 따른 항산화 식품 조성물은 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물을 2.0 내지 50.0 중량 % 포함하는 항산화 식품 조성물로서, 상기 혼합 추출물 중 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 비율은 5:3:2의 중량비인 것을 특징으로 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

실시예 1: 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 메탄올 혼합추출물 제조

그리스 산 올리브잎(Olea europaea L. var. Kalamata), 국내산 연꽃씨와 연잎을 50:30:20으로 혼합한 후 잘 씻어 이물질을 제거하고 자연건조 시킨 후 조분쇄하여 시료로 사용하였다.

30 메쉬 전후로 조분쇄 된 올리브잎, 연꽃씨, 연잎 각각 25 g에 10배의 60% 메탄올을 첨가하고 soxhlet 장치를 이용하여 환류냉각하며 3시간동안 80℃ 수욕상에서 3회 반복 추출하였다. 이를 여과한 후 24시간 동안 4℃에서 정치시키고 재 여과하였다. 이 용액을 70℃에서 회전식 진공 증발 장치(rotary vacuum evaporator: R-124, BUCHI, Switzerland)를 이용하여 감압농축한 후 동결 건조하여 추출물을 제조하였고, 상기 추출물을 극성의 차를 이용해 서로 다른 용매를 첨가하여 단계적으 로 분획하였다. 구체적으로 추출물을 물에 녹여 분획깔때기에 놓고 헥산을 첨가하여 헥산층과 물층을 분획하였고 이를 다시 감압 농축하여 헥산 분획물을 얻었다. 동일한 과정을 통해 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 가하여 각 분획물을 얻었고 최종 남은 용액은 물분획물이라 칭하였다. 이들 분획물들을 감압, 농축하였고 동결 건조하여 용매를 제거한 후 실험에 사용하였다.

실시예 2: 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 에탄올 혼합추출물 제조

올리브잎, 연꽃씨와 연잎 각각 25 g에 10배의 80% 에탄올을 첨가한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 에탄올 추출물 및 각 유기 용매 분획물을 제조하여 이하의 평가 실험에 사용하였다.

비교예 1: 올리브 잎의 추출물 제조

그리스산 올리브 잎에 대해 실시예 1에 기재된 방법에 따라 추출 및 분획 실험을 수행하였다.

평가예 1: 총 플라보노이드 및 페놀 함량 평가

총 플라보노이드(flavonoid) 함량은 올리브잎, 연꽃씨, 연잎 80%에탄올 추출물 및 용매 분획물을 일정량 취해 50% 메탄올 용액 5 mL로 mass-up한 후 이 시료 용액 1 mL와 디에틸렌글리콜 10 mL, 1N-NaOH용액 1 mL 가하여 혼합시킨 후, 이 용액을　37℃에서 1시간 반응시킨 후 UV/VIS 스펙트로포토미터(Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 표준검량곡선은 naringin (Sigma, Saint Louis, USA,)을 이용하여 작성하였다.

또한 상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 추출물에 대한 페놀성 물질에 대하여 몰리브덴인산(phosphomolybdic acid)와 반응하여 청색을 나타내는 것을 이용한 Folin-Dennis법 (Teresa-Sartue et al., 1995)을 이용하여 측정하였다.

일정량의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹인 시료 1 mL, 증류수 7 mL, Folin-Dennis 시약 0.5 mL를 첨가하고 정확히 3분 후에 무수 탄산나트륨 포화용액 1 mL, 증류수 0.5 mL를 넣은 후 725 nm에서 UV/VIS 스팩트로포토미터를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 이때 표준검량곡선은 탄닌산(tannic acid: Fluka, Buchs, Switzerland)를 이용하여 작성하였다. Folin-Dennis시약은 텅스텐산나트륨 10 g, 몰리브덴인산 2 g, 인산 5 mL에 증류수를 가한 후 (시료가 녹을 만큼 충분히) 80℃ 수욕조상에서 환류냉각하여 사용하였다.

하기 표 1에는 본 발명에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합추출물에 대한 총 페놀 함량이 표시되어 있다.

샘플	총 페놀 함량
메탄올 추출물	32 ± 2
클로로포름 분획물	17 ± 3
헥산 분획물	12 ± 2
에틸아세테이트 분획물	22 ± 4
부탄올 분획물	19 ± 3
물 분획물	10 ± 2

한편 실시예 2의 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 80% 에탄올 추출물과 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물에 대한 총 플라보노이드와 총 페놀 함량을 비교한 결과는 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다.

총 플라보이드 함량은 에틸아세테이트 분획물이 24.9%로 가장 높은 함량을 나타냈고 헥산과 물 분획물에서는 그 함량이 낮았다. 총 페놀 함량의 경우도 에틸아세테이트 분획물이 18.2%로 가장 높았으며 헥산과 물 분획물에서 상대적으로 페놀함량이 낮아 플라보노이드와 비슷한 양상을 나타냈다.

동일 조건에서 올리브잎, 연꽃씨, 연잎 분획물의 플라보이드와 페놀 함량을 분석한 결과에서 플라보노이드의 함량은 1.57.13%, 페놀함량은 3.4-17.5%의 수준으로 나타나 본 실험에서 보다 낮은 함량을 보였다. 하지만 부탄올 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 올리브잎 80%에탄올 추출물의 플라보이드와 페놀 함량이 상대적으로 높은 값을 나타내며 물, 헥산 분획물의 함량이 상대적으로 낮은 값을 나타냈다는 점에서는 유사한 결과를 나타냈다.

평가예 2: SOD 유사활성 측정

SOD는 사람과 동물의 장기와 혈액 내에 존재하는 생리활성 효소로 유해 산소를 제거하는 역할을 하게 되며 SOD 유사활성물질은 피토케미컬(phytochemical)에 속하는 물질이 SOD와 유사한 역할을 하여 수퍼옥사이드 라디컬의 반응성을 억제하여 생체를 보호한다고 보고되어 있다(Murakami et al., 2003).

본 실험에서 SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity)은 Marklund et al. (1975)의 방법으로 측정하였다. 일정농도의 시료 0.2 mL, Tris-HCl buffer (50 mM Tris (히드록시메틸)아미노메탄 + 10 mM EDTA, pH8.5로 보정) 3 mL, 7.2 mM 피로갈롤(pyrogallol) 0.2 mL을 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시키고 1N HCl 1 mL를 가하여 반응을 정지시킨다. 반응액 중 산화된 피로갈롤의 양은 420nm에서 UV/VIS 스팩트로포토미터를 사용하여 흡광도를 측정하였으며 SOD 유사활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율로 나타내었다.

SOD 유사활성능 (%) = (1-시료 첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도) × 100

하기 표에는 본 발명의 실시예에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 메탄올 혼합 추출물(표 2), 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 에탄올 혼합추출물(표 3) 및 비교예에 따른 올리브잎 단독 추출물(표 4)에 대한 SOD 유사활성능이 표시되어 있으며, 상기 결과에 따르면, 올리브잎 단독에 대한 SOP 유사활성에 비해 본 발명에 따른 혼합 추출물의 SOD 유사활성이 현저하게 향상되었음을 확인할 수 있다.

샘플 (1000 ppm)	SOD 유사 활성(%)
클로로포름 분획물	14.7±2.2
부탄올 분획물	91.7±6.6
에틸아세테이트 분획물	90.3±4.9
60% 메탄올 추출물	82.2±5.4
헥산 분획물	14.6±4.4
물 분획물	62.3±6.1

시료	1000ppm
클로로포름 분획물	5.82±0.46
부탄올 분획물	5.29±0.41
에틸 아세테이트 분획물	4.67±0.68
80% 에탄올 추출물	29.54±4.62
헥산 분획물	없음
물 분획물	1.58±0.29

샘플 (1000 ppm)	SOD 유사 활성(%)
클로로포름 분획물	4.99±0.88
부탄올 분획물	4.31±0.61
에틸아세테이트 분획물	3.33±0.17
60% 메탄올 추출물	24.71±0.59
헥산 분획물	None
물 분획물	0.78±0.17

실시예 2에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎 분획물의 SOD 유사활성은 29.54%의 범위이었으며, 80% 에탄올 추출물에서 가장 높은 활성을 나타냈고 농도 의존적으로 증가하였다 본 실험 결과를 오가피(13.5%), 구기자 (21.27%), 천문동 (11.7%), 복분자 (13.2%), 갈근 (17.13%), 생강 (9.03%), 싸리추출물 (2044.08%) 등 한국산 약용식물 82종의 SOD 유사활성을 알아본 연구 결과와 비교해보면 3-4종의 약용식물을 제외하고는 1,000 ppm 농도에서 SOD 유사활성이 더 높거나 비슷한 결과를 나타냈다.

올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 분획물에서 페놀성 화합물에 의한 피토케미컬 성분들의 영향으로 SOD 유사활성이 있음이 확인되었고 이러한 SOD 유사활성을 갖는 물질을 섭취하는 것은 생체내의 수퍼옥사이드를 제거시킴으로써 노화억제와 산화를 예방할 수 있는 방법이라 할 수 있겠다.

평가예 3: 아질산염(Nitrite)분해능 측정

Gray and Dungan (1975) 방법에 따라 일정 농도의 시료 1 mL에 1 mM NaNO₂용액 1 mL를 가한 뒤 0.1 N HCl로 반응 용액의 pH가 1.2가 되게 조절한 후 총량이 10 mL가 되도록 하였다. 1시간동안 37℃에서 반응 시킨 이 용액을 1 mL 취해 2% 아세트산 5 mL, Griess 시약 (30% 아세트산으로 조제한 1% 설파닐산(sulfanilic acid)와 1% 나프틸아민의 1:1 비율 혼합액으로 사용 직전에 조제함.) 0.4 mL를 가하여 잘 혼합하였다. 이 혼합액을 상온에서 15분간 반응시키고 UV/VIS 스팩트로포토미터를 사용해서 520 nm에서 흡광도를 측정하여 남아있는 아질산량을 구하였다. 대조구는 Griess 시약 대신 동량의 증류수를 가하여 위와 동일한 방법으로 측정하였다.

N (%) = (1-A-C/B ) × 100

N: nitrite scavenging ability,A: 시료첨가구 흡광도

B: 1 mM NaNO₂의 흡광도,C: 대조구의 흡광도

실시예 1 및 2에 대한 발암물질인 니트로아민 생성의 원인물질인 아질산염 제거활성을 확인한 결과를 하기 표 5와 표 6에 나타냈다. 헥산과 물 분획물을 제외하고는 올리브와 연잎 분획물의 아질산염 소거능력은 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였으며 1,000 ppm 농도 기준으로 높은 활성을 나타냈다. 한약재로 쓰이는 약용식물 추출물의 아질산염 소거능을 살펴본 연구에 따르면 동일 조건에서 당귀35%, 목통42%, 골담초33%, 찔레 영지버섯 64%의 제거능을 나타냈다. 또한 노화질환을 예방하고 항산화능력이 있다고 알려진 솔잎 추출물과 쑥 추출물등 은 각각 77.85%, 37%의 아질산염 소거능을 나타내 본 실험에서 사용한 올리브잎 분획물의 제거활성은 높은 수준의 활성을 보인 것이라 생각된다.

식품 중에 함유되어 있는 아질산염 자체는 해롭지 않지만 아질산염 환원효소에 의해 환원되면 독성을 가지게 된다. 식물의 뿌리나 잎에서 만들어지는 모든 화학물질을 통틀어 일컫는 개념으로 식물 중에 존재하는 성분들 중 인체에 유익한 생리활성을 가진 성분들을 피토케미컬(phytochemical)이라 한다. 이러한 피토케미컬 중 플라보노이드나 페놀성 화합물은 라디칼 수용체로서 좋은 conjugated double bond 구조로 환원성이 강해 자유라디칼에 전자를 공여하여 아질산염 소거자 역할을 하게 된다.

위와 같은 결과로 올리브잎, 연꽃씨, 연잎 분획물에서 피토케미컬 성분들의 영향으로 자유 라디칼에 전자를 공여하여 발암물질인 니트로아민을 억제하는 능력이 있음이 확인되었다.

시료 (1000 ppm)	아질산염 분해능 (%)
클로로포름 분획물	48.7±5.6
부탄올 분획물	93.5±7.2
에틸 아세테이트 분획물	95.3±5.4
80% 에탄올 추출물	91.6±7.1
헥산 분획물	54.8±7.0
물 분획물	64.7±6.3
비타민 C	94.76±3.28
비타민 E	86.48±2.46
BHT	82.53±4.16

시료	100ppm	500ppm	1000ppm
클로로포름 분획물	없음	11.25±1.24	71.37±8.26
부탄올 분획물	없음	28.26±3.26	77.22±4.28
에틸 아세테이트 분획물	29.95±4.23	69.16±5.26	86.57±3.23
80% 에탄올 추출물	없음	11.56±1.36	75.73±2.37
헥산 분획물	없음	없음	없음
물 분획물	없음	없음	없음
비타민 C	38.62±1.93	66.14±5.57	94.76±3.28
비타민 E	28.58±1.82	58.58±4.36	86.48±2.46
BHT	28.54±2.24	49.53±4.52	82.53±4.16

평가예 4: DPPH 라디칼 소거능 측정

Chu et al. (2000)의 방법에 따라 일정농도의 추출물 0.2 mL에 4 × 10^-4M DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)용액 0.8 mL를 가하고 10초간 혼합한 뒤 상온에서 10분간 방치 후 525 nm에서 UV/VIS 스펙트로포토미터를 사용하여 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 아래와 같이 백분율로 나타내었다.

DPPH radicals scavenging activity (%) =

(1-시료 첨가구의 흡광도/무첨가구 흡광도) × 100

하기 표 7과 8에는 실시예 1 및 비교예의 DPPH 측정 결과가 기재되어 있다.

샘플	DPPH 소거능 (%)
메탄올 추출물	83.2 ± 5,4
클로로포름 분획물	60.4 ± 3.9
헥산 분획물	57.4 ± 4.1
에틸아세테이트 분획물	74.6 ± 6.3
부탄올 분획물	66.3 ± 6.1
물 분획물	53.8 ± 4.2

시료	100ppm	500ppm	1000ppm
클로로포름 분획물	20.24±0.88	29.23±0.42	53.52±2.59
부탄올 분획물	10.49±0.72	18.21±0.14	29.19±0.15
에틸 아세테이트 분획물	7.74±0.65	17.24±0.31	31.47±0.63
80% 에탄올 추출물	15.64±1.59	40.86±1.59	59.35±3.17
헥산 분획물	17.89±1.92	33.62±0.37	43.48±0.67
물 분획물	12.94±0.36	18.45±0.21	23.46±1.12
비타민 C	29.14±0.93	50.43±0.10	74.24±5.23
비타민 E	27.26±0.07	48.37±1.58	71.53±4.12
BHT	29.07±0.77	43.27±0.49	68.83±4.50

올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 80% 에탄올 추출물과 클로로포름 분획물에서 비교적 높은 활성을 나타냈으며, 처리농도가 증가함에 따라 올리브잎 분획물의 DPPH 라디칼 제거활성이 5.9056.86%로 증가함을 확인할 수 있었다(표 8)

올리브잎, 연꽃씨, 연잎 분획물의 DPPH 라디칼 제거활성은 약용식물인 국내산 참당귀 43%, 연명초 60.0%의 radical 제거활성과 유사하게 나타났고, 카테킨(catechin)류에 의해 대표적인 항산화 물질로 알려진 녹차의 DPPH 라디칼 제거활성이 50.56%로 보고되어 올리브잎, 연꽃씨, 연잎 분획물의 항산화 효과가 우리에게 잘 알려진 약용식물에 비하여 뒤지지 않는다는 것을 확인 할 수 있었다.

세포가 성장하고 자라면서 발생되는 자유라디칼에 의해 세포가 산화되어 손상되는데 페놀성 화합물은 환원성이 강해서 자유라디칼에 전자를 공여하여 산화를 억제하는 항산화 능력이 있다고 알려져 있다. DPPH는 자체가 안정한 자유라디칼을 지니고 있는 화합물로 항산화물질에 의해 환원되어 항산화 능력을 확인하는데 널리 사용되는 물질이다. 위와 같은 결과로 올리브잎, 연꽃씨, 연잎 분획물에서도 자유라디칼에 전자를 공여하여 산화를 억제하는 능력이 있음이 확인되었으며 이는 올리브잎의 페놀성 화합물의 작용으로 판단된다.

평가예 5: 리놀렌산 자동산화 억제활성

Kiharu et al. (1990)의 방법을 변형하여 측정하였다. 처리 농도별로 일정량의 시료에 99.5% 에탄올 2 mL, 에탄올로 희석한 2.5% 리놀렌산(linoleic acid) 2.05 mL, 1시간 이상 에어레이션(aeration)시킨 0.05 M 인산염 완충액(pH 7.0) 4 mL를 가한 후 증류수를 첨가하여 총량이 10 mL가 되도록 조정한 후, 이 용액을 70℃ 암소에서 24시간 동안 반응 시키면서 3시간 간격으로 반응액 0.1 mL를 취하여 75% 에탄올 9.7 mL, 30% 티오시안산 암모늄(ammonium thiocyanate) 0.1 mL, 3.5% HCl과 0.02 M 염화철(ferrous chloride)의 혼합용액 0.1 mL를 차례로 첨가하여 상온에서 3분간 반응시킨 후 UV/VIS 스펙트로포토미터를 사용해서 500 nm에서 흡광도를 측정 하였다.

자동산화 과정은 두 개의 라디칼이 안정한 화합물을 생성함으로써 반응이 종결되는 것인데 이 과정에서 자유라디칼에 전자를 공여하여 산화를 억제하게 하는 환원성이 강한 물질을 필요로 하게 된다. 항산화제는 이러한 자유라디칼을 제거하는 역할을 하게 되는데 주로 페놀성 화합물이 이러한 기능을 갖고 있으며 올리브잎의 주요 페놀성 화합물인 올레우로페인(oleuropein)과 하이드록시티로솔(hydroxytyrosol)이 리놀렌산 자동산화를 억제하는 능력이 있다고 보고되었다 (Park, 2005).

리놀렌산과 함께 시료를 처리하여 지질과산화를 억제하는 정도는 도 5에 나타난 바와 같다. 시간 경과에 따라 농도 의존적으로 비교적 일정하게 산화억제활성을 나타냈다. 올리브잎, 연꽃씨, 연잎 80%에탄올 추출물의 경우 시간 경과에 따라 비타민 C, 비타임 E, BHT와 동일한 수준으로 항산화력을 나타냈으며 클로로포름 분획물, 물 분획물의 순으로 산화억제활성을 확인할 수 있었고 이것 역시 추출물 내에 존재하는 페놀류의 작용으로 리놀렌산의 자동산화 억제활성을 보인 것이라 생각된다.

제조예 1: 산제의 제조

상기 실시예에서 제조된 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물 또는 분획물 4 g과 유당 1g을 혼합하고, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제조예 2: 정제의 제조

상기 실시예에서 제조된 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물 또는 분획물 200mg, 옥수수전분 100mg, 유당 100mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 사용하여, 통상의 정제 제조 방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

제조예 3: 캡슐제의 제조

상기 실시예에서 제조된 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물 또는 분획물 200mg, 옥수수전분 100mg, 유당 100mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 사용하여, 통상의 캡슐제 제조 방법에 따라 캡슐제를 제조하였다.

제조예 4: 밀가루 식품의 제조

본 발명에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물 또는 그의 분획물을 2.0 ~ 7.0 중량%를 밀가루에 첨가하고,이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 또는 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제조예 5: 유제품(dairy products)의 제조

본 발명에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물 또는 그의 분획물 5 ~ 10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제조예 6: 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 50메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 50 메쉬의 분말로 제조하였다. 본 발명에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물 또는 그의 분획물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기 실시예에서 제조한 본 발명에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물 또는 그의 분획물의 건조분말 5 중량%와 곡물류(현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%), 종실류(들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 5중량%), 영지 0.5중량%, 지황 0.5중량%를 배합하여 제조하였다.

제조예 7 : 탄산음료의 제조

올리고당 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:5의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.8%를 주입하여 상기 실시예에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 탄산음료를 제조하였다.

제조예 8: 건강 음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 상기 실시예에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물 또는 그의 분획물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

제조예 9: 야채 쥬스의 제조

상기 실시예에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물 또는 그의 분획물 5g을 토마토, 당근, 또는 샐러리쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채 쥬스를 제조하였다.

제조예 10: 과일 쥬스의 제조

상기 실시예에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물 또는 그의 분획물 1g을 오렌지, 귤 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일 쥬스를 제조하였다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 에탄올 추출물을 제조하는 과정을 나타낸 흐름도이다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 에탄올 추출물을 유기 용매를 이용하여 분획하는 과정을 나타낸 흐름도이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 에탄올 추출물 및 유기 용매 분획물의 총 플라보노이드 함량을 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 에탄올 추출물 및 유기 용매 분획물의 총 페놀 함량을 나타낸 그래프이다.

도 5은 본 발명의 일실시예에 따른 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 에탄올 추출물 및 유기 용매 분획물의 자동산화억제 활성을 나타낸 그래프이다.

Claims

올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 추출물을 2.0 내지 50.0 중량 % 포함하는 항산화 식품 조성물로서, 상기 혼합 추출물 중 올리브잎, 연꽃씨, 연잎의 혼합 비율은 5:3:2의 중량비인 것을 특징으로 하는 항산화 식품 조성물.
제1항에 있어서,

상기 혼합 추출물은 건조된 올리브잎, 연꽃씨, 연잎을 조분쇄한 후 20 내지 70중량%의 알코올을 첨가하는 단계; 상기 용액을 60 내지 80℃ 범위에서 환류 냉각하면서 2회 이상 반복 추출하는 단계; 상기 추출된 혼합 용액을 여과한 다음 감압 농축한 후 동결건조하는 단계; 및 선택적으로 물과 유기 용매를 첨가하여 분획한 다음 0 내지 80℃ 범위에서 감압 농축한 후 동결건조하는 단계를 수행하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항산화 식품 조성물.
제2항에 있어서,

상기 알코올은 40 ~ 90% 에탄올인 것을 특징으로 하는 항산화 식품 조성물.
제2항에 있어서,

상기 유기용매는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 항산화 식품 조성물.
제2항에 있어서, 상기 환류냉각 단계는 60 내지 80℃ 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 항산화 식품 조성물.
제2항에 있어서, 상기 감압농축 과정은 30 내지 80℃ 범위가 수행되는 것을 특징으로 하는 항산화 식품 조성물.
제1항에 있어서,

상기 식품 조성물은 산제, 정제, 캡슐제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제제인 것을 특징으로 하는 항산화 식품 조성물.
제1항에 있어서,

상기 식품 조성물은 빵, 케이크, 쿠키, 크래커, 면류, 유제품, 선식, 탄산 또는 비탄산 음료, 야채 쥬스, 과일 쥬스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항산화 식품 조성물.