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KR20090112268A - 베타-아밀로이드로 유발된 뇌세포 손상의 치료 및 예방용약제학적 조성물 - Google Patents

베타-아밀로이드로 유발된 뇌세포 손상의 치료 및 예방용약제학적 조성물 Download PDF

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KR20090112268A
KR20090112268A KR1020080038054A KR20080038054A KR20090112268A KR 20090112268 A KR20090112268 A KR 20090112268A KR 1020080038054 A KR1020080038054 A KR 1020080038054A KR 20080038054 A KR20080038054 A KR 20080038054A KR 20090112268 A KR20090112268 A KR 20090112268A
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구병수
이인
전송희
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동국대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 한약재 향기를 이용하여 베타-아밀로이드로 유발된 뇌세포 손상의 치료 또는 예방에 효능을 나타내는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 한약재의 향기액은 향기액의 흡입으로 베타-아밀로이드로 유발된 뇌세포의 손상에 우수한 치료효과를 가지므로 알츠하이머형 치매 예방이나 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
한약재 향기액, 베타-아밀로이드, 뇌세포 손상

Description

베타-아밀로이드로 유발된 뇌세포 손상의 치료 및 예방용 약제학적 조성물 {Pharmaceutical composition for treatment and prevention of brain cell damage caused by beta-amyloid containing herb essential oil}
본 발명은 한약재의 향기성분을 유효성분으로 함유하는 베타-아밀로이드로 유발된 뇌세포 손상의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 베타-아밀로이드로 유발된 뇌세포 손상을 치료하는 효과가 우수하다는 것을 확인한 9종의 한약재로부터 추출한 향기액을 함유하는 알츠하이머형 치매 예방이나 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
치매란 뇌의 만성적 진행성 변성질환에 의해 흔히 기억장애 및 기타 지적기능의 상실이 일어나는 임상 증후군을 말하며 좀 더 넓은 의미로는 지적 황폐화뿐 만 아니라 행동 이상 및 인격 변화를 초래하며, 정서적 기능 상실과 진행성인 지적 황폐화가 사회적 혹은 직업적 기능의 장애를 초래하게 되는 상태를 말한다.2,3) 그 원인에 따라 알츠하이머형 치매(Alzheimer's dementia, AD), 혈관성 치매, 파킨슨병, 헌팅턴 병 등으로 나눌 수 있으며, 주로 뇌의 감염, 비타민 부족, 종양 등에 의해 발병되는 것들이 알려져 있다. 이 중 알츠하이머형 치매(AD)는 점진적으로 뇌의 다양한 지역에 있는 신경세포가 죽거나 기능을 잃음으로써 야기되는 퇴행성 뇌 질환으로, 전체 치매의 60~70%를 차지할 만큼 치매의 유발 원인 중 가장 높은 비율을 차지하고 있다.1)
AD의 병리학적 특징으로, 대뇌피질이나 해마에 생기는 뇌 위축 및 뇌내에 노인반 (senile plaque) 이나 신경원섬유농축제 (neurofibrillary tangle)가 침착되는 것으로 밝혀졌다64 ). AD의 발병과정을 관찰하면 베타 아밀로이드라고 하는 단백질이 축적되고, 이어서 치매가 나타남과 동시에 신경원섬유농축제가 축적되는 것이 밝혀졌다.
신경원섬유농축제는 신경전달물질의 세포 간 이동통로인 신경세포 돌기를 구성하고 있는 미소섬유관이 엉켜 생긴 것으로, 최근의 연구결과를 보면 tau라는 단백질의 비정상적인 축적과 관계가 있는 것으로 보고되었다65 ). 신경세포 안에 존재하는 tau는 정상적인 상태에서는 미소섬유관이 엉키지 않도록 배열해주는 역할을 한다. 그러나 AD 환자의 경우 tau 단백질에 비정상적인 인산화가 과도하게 일어남으로 인해 미소섬유관이 불규칙적으로 엉켜 신경세포 돌기가 제대로 뻗어나가지 못해 신경전달물질이 원활히 이동하지 못하여 궁극적으로 신경세포사멸을 유도하게 된다.65)
과량의 β-amyloid가 생성되어 독성을 유발하는 작용 기전은 다양하지만 크게 두 가지의 이론으로 질병의 진행을 설명할 수 있다. 첫째로, β-amyloid가 소교세포 (microglia cell)를 활성화 시켜 신경 세포를 손상시키는 사이토카인을 생성하여 일련의 염증 반응을 유발하는 것이다66 ,67). 두 번째 이론은, 활성산소종의 작용에 관한 것이다. 뇌의 95% 이상은 지방으로 구성되어 있으며, 자유라디칼 (free radical)의 공격을 받아 산화된다. 즉, 이러한 손상으로 유발된 순차적인 신호전달에 의하여 세포는 결국 사멸하게 된다68 ).
또한, AD 환자에서 p42/44 MAPK의 인산화가 저해 되었으며 p42/44 MAPK의 인산화 증가는 신경세포 성장이나, 시냅스 가소성 (synaptic plasticity), long-term potentiation (LPT) 을 유도하는 것으로 알려져 있다72 ). 특히 도파민과 카테콜아민 분비에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다73 ,74). 그러나 신경 세포 실험에서는 베타 아밀로이드를 처리 시 p42/44 MAPK의 인산화가 증가하며 이러한 인산화 증가로 인해 세포가 사멸되거나 소교세포의 활성에 중요한 활성산소의 생성 및 사이토 카인의 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다75 ,76).
이상의 결과로부터 AD가 생성되는 초기 단계에는 p42/44 MAPK의 활성이 요구되지만 장기적으로는 이 단백질의 활성화 저하로 인해 AD의 병적 진행이 더 가속화 될 수 있음을 시사하는 것이다.
한편, 지금까지 AD의 인지적 증상을 치료하는 서양의학에서는 Cognex (tacrine, ParkeDavis), Aricept (donepezil, Pfizer), Exelon (rivastigmine, Novartis), Reminyl (galantamine, Evans) 등의 4가지 약물이 대표적으로 사용되어져 왔다. 이들 약물의 주작용은 아세틸콜린의 가수분해를 가역적으로 저해하여 아세틸콜린을 증가시키는 것이며, 그러므로, 이는 콜린성 신경이 기능적으로 손상되지 않았을 때 가장 효과적이다.
Cognex의 경우 질병의 초기 및 중간 단계의 환자들에게 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 떨림증, 현기증, 구토증, 간독성 등의 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 효능과 부작용에서 개선된 새로운 제품으로 1996년에 Aricept 제품이 시판되면서 이 제품은 Cognex보다 훨씬 선택성이 우수하여 사용되었으나, 이 제품 역시 현기증, 구토, 설사, 근육경련 등의 부작용이 있다고 보고되었다. 한편, 이들 약물은 AD 자체를 멈추거나 되돌릴 수는 없으며, 더욱이 얼마나 오랫동안 환자들이 이러한 약들을 복용해야 하는지 또 얼마나 오랫동안 효과가 있는지에 대해서는 아직 명확하지 않다.
그러므로 최근에는 일상 식생활에서 쉽게 접할 수 있는 천연에 존재하는 항산화, 항염증 물질들에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 그 대표적인 물질로는 EGb 761은 은행잎(Ginko biloba)의 표준화된 추출물로 주로 항산화 물질들을 포함하여 치매예방과 증세경감에 탁월한 효과가 있다는 연구결과가 발표되었다. 실험동물 혹은 임상실험에서 기억력을 향상시키는데 도움이 되는 것으로 보고되었으 며7 7 -,81), 세포주 모델에서는 nitric oxide (NO) 또는 베타아밀로이드로 유도된 신경독성을 현저히 억제하였다.82-84) 이는 활성산소의 생성과 지질과산화를 감소시키고, 혈소판 활성화 인자에 길항작용이 있어 항산화, 항염증 작용을 나타내는 것으로 추정된다.
이 물질 이외에도 녹차85 ,86),인삼87 ,88), 멜리사엽88 ,90) 등에서 추출한 성분이 항산화 효과를 보이는 것으로 베타 아밀로이드로 유도된 활성산소종의 생성과 염증반응을 억제함으로써 신경세포 사멸에 대한 보호작용 및 기억력 증진의 효과를 나타내었다.
또한 Docosahexaenoic acid (DHA) 라는 물질도 아밀로이드 베타 투여에 기억 상실에 억제 효과가 있는 것으로 보고되었다91 ).
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이에, 본 발명자들은 선별한 9종의 전통 한약재를 적절히 배합하여 향기액만을 추출하고 그 효능을 시험한 결과, 베타-아밀로이드에 의해 유발되는 뇌세포 손상 치료 또는 예방 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 향기흡입만으로도 베타-아밀로이드에 의해 유발되는 뇌세포 손상을 개선하여 알츠하이머형 치매의 예방 혹은 치료 효과를 갖는 약제학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 9종의 한약재, 즉 용뇌, 소합향, 안식향, 목향, 유향, 침향, 정향, 단향 및 향부자로 이루어진 혼합 약재에서 추출한 향기액을 유효성분으로 함유하여 베타-아밀로이드에 의해 유발되는 뇌세포 손상을 개선하여 알츠하이머형 치매를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 9종의 한약재는 ≪東醫寶鑑≫14)에 준하여 향성분이 많이 추출될 수 있는 약재 위주로 가감한 것으로, 그 함량비는 이에 한정하는 것은 아니나, 한약재 혼합물의 전체 기준으로 용뇌:소합향:안식향:목향:유향:정향:단향:향부자:침향의 중량비를 1:1:1:1:1:1:1:1:0.75로 혼합하여 사용하면 충분하다. 즉, 상기 한약재의 배합 비율은 불면증상이나 경련발작 질환을 치료 또는 예방하기에 유효한 비율이라면 다른 배합 비율로도 사용될 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다.
구체적인 일 양태로, 본 발명은 용뇌 22.86g, 소합향 22.86g, 안식향 22.86g, 목향 22.86g, 유향 22.86g, 침향 17.14g, 정향 22.86g, 단향 22.86g 및 향부자 22.86g의 비율로 포함하는 9종의 한약재 혼합물에서 추출한 향기액을 유효성분으로 함유하여 베타-아밀로이드에 의해 유발되는 뇌세포 손상을 개선하여 알츠하이머형 치매를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 사용된 각 한약재는 이미 한의서나 한약관련서적에 각각의 특성이 잘 알려져 있다. 구체적으로, 각 한약재의 특성 및 공지된 약리작용에 대하여 설명해보면 다음과 같다.
용뇌는 디테로카파시에(Diterocarpaceae)에 속하는 용뇌향의 수지를 수증기로 증류냉각하여 얻은 결정체로 수지를 가공한 것이다. 용뇌는 청량감을 주는 제제로 더위 먹음, 중독, 복통에 널리 사용되고 있는 약재로, 황색 포도상 구균, 대장균, 돼지 콜레라균에 대해서는 항균 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 국내에서는 우황청심원 성분으로 주로 사용이 되고(특허공고 제 87-6998호), 독특한 향내 가 있기 때문에 실내용 방향제로도 사용되고 있다(특허공개 제 96-46125호).
안식향은 스티락스 벤조인 드루안데르(Styrax benzoin Druander) 또는 그 밖의 동속식물(때죽나무과 Styracaceae)에 상처를 내어 삼출되는 수지를 채집한 것으 로, 회갈색 또는 어두운 적갈색의 고르지 않은 덩어리이며 깨어진 면에서
흰색 또는 엷은 황적색의 알맹이가 박혀있고 상온에서는 단단하면서 무르고 가열하면 연화된다. 미(味)는 신고(辛苦)하고 성(性)은 평(平)하며, 귀경(歸經)은 심비폐위(心碑肺胃)경이다. 주 약리작용은 방향개규, 행기, 행혈, 거담작용이 있다. 임상에서는 뇌졸중등에서의 의식장해 개선에 응용되고 있으며, 기혈을 통하게 하는 작용이 있어 흉복의 동통을 멎게하는 데에도 이용된다.
소합향은 소합향나무에 상처를 내어 삼출되는 수지를 채집한 것으로, 반유동성의 점조한 액체로서 황백색 또는 회갈색이며 반투명이다. 미(味)는 감신(甘辛)하고 성(性)은 온(溫)하며, 귀경(歸經)은 심비(心碑)경이다. 주 약리작용은 방향개규, 해울, 거담작용이 있다. 임상에서는 의식장해등 한폐증상이 있는 뇌졸중, 갑작스런 흉복통, 돌연한 의식장해에 주로 사용된다.
목향은 국화과에 속하는 당목향의 뿌리이며 특이한 냄새가 있고 맛은 쓰다. 주 약리작용으로서 신경과민 치료, 위.십이지장 궤양 치료에 사용되고, 보약에서 기순환에 도움을 주며, 소화촉진약재로서 사용된다.
유향은 감람나무과에 속하는 활혈약으로 미(味)는 신고(辛苦)하고 성(性)은 온(溫)하며 귀경(歸經)은 심(心), 간(肝), 폐(肺)경이다. 유향의 효능은 활혈지통 (活血止痛)으로 임상에서는 어혈로 인한 동통 등에 응용되고 있다.
침향은 단향과에 속하는 이기약으로 미(味)는 신고(辛苦)하고 성(性)은 미온(微溫)하며 귀경(歸經)은 폐(肺), 위(胃), 신(腎)경이다. 침향의 효능은 강기화중(降氣和中), 온신보양(溫腎補陽)으로 주 약리작용은 진통, 진정작용으로 알려져 있다.
정향은 정향과에 속하는 정향나무의 꽃봉오리이다. 특이한 냄새가 강하고 맛은 강렬하며 나중에 혀를 마비시킨다. 주된 성분은 유게놀(eugenol), 아세틸 유게놀(acetyl eugenol), 베타-카리오필렌(β-caryophyllene)이며, 비위를 따뜻하게 하고 곽란을 멎게 하며 냉기의 복통을 낫게 하고 허리와 무릎을 따뜻이 하고 반위를 고치고 주독을 풀어주고 풍독과 제종을 없애주고 향을 잘나게 한다. 또한, 정향은 구토, 설사, 소화불량치료, 구취해소, 신경안정 작용, 통증 해소, 살균제, 방부제, 협심증통증 치료, 딸국질 치료 효과가 있다.
단향은 중국원산으로 室町시대에 일본에 건너와 사찰에서 재배해 온 중국채소로서, 백단향은 본래 낙엽성 고목인데 식용으로 하는 것은 잎을 잘라 버리므로 키가 낮다. 새싹은 붉고 아름다우며 마늘과 비슷한 향기가 있어 향신료로 이용된다. 성분이 따뜻하고 맛이 매우며 독이 없고 열종을 없애며 신기의 복통을 낫게 하고 또 심복통과 곽란중악 및 귀기와 벌레를 죽인다.
향부자는 정유 1% (주성분은 사이페론(cyperone), 사이페롤(cyperol), 사이페렌(cyperene), 패츄레논(patchoulenone), 사이페로툰돈(cyperotundone))을 함유하고, 그 밖에 코부손(kobusone), 유게놀(eugenol) 등을 함유한다. 또한 향부자는 경폐통경, 진경약으로 월경불순, 신경통, 소화불량, 두통 등에 쓰이고 부인병의 요약이다.
이와 같은 복수의 유효성분으로 구성된 향기액은 현재 시판되는 진정제가 복용 또는 주사로 투여되고 단일 성분으로 사용되는데 따른 부작용이 있는 반면, 간 단히 흡입으로 투여되고 복수의 성분으로 구성되어 부작용 없이 베타-아밀로이드에 의해 유발되는 뇌세포 손상을 치료 또는 예방할 수 있는 것으로 나타났다.
즉, 본 발명의 한약재 향기액을 이용하여 β-amyloid 1-42를 주입하여 치매를 유발한 mouse의 행동실험을 통해 기억력 저하 정도를 확인하였고, hippocampus내의 세포 활성도 변화를 살펴 본 결과 치매 발병 억제에 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명에서 사용된 한약재 향기액은 도 1에 도시한 바와 같이, 용뇌 22.86g, 소합향 22.86g, 안식향 22.86g, 목향 22.86g, 유향 22.86g, 침향 17.14g, 정향 22.86g, 단향 22.86g 및 향부자 22.86g로 이루어진 加減蘇合香元 (modified Storax Pill) 200g을 분말화하는 단계; 상기 한약재 혼합 분말에 n-hexane을 첨가하고 실온 방치하면서 교반하여 추출하는 단계; 및 상기 추출액을 여과한 다음, 여액중 n-hexane을 증류하여 제거하고 암록색의 맑은 정유향기액을 수득하는 단계; 에 의해 제조할 수 있다.
이와 같이 제조된 향기액의 성분은 가스크로마토그래피-질량분석법 (GC-MS)으로 분석할 수 있으며, 함유된 성분으로는 펜콜, 캄퍼, 보르네올, 엔도 보르네올, 유게놀, 베타 카리오필렌, 유게닐 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 벤질 신나메이트 등이 있다. 보르네올(borneol,[(1S)-엔도]-1,7,7-트리메틸비시클로[2.2.1]헵탄-2- 올)과 캄퍼(camphor, [(1S)-엔도]-1,7,7-트리메틸비시클로[2.2.1]헵탄-2-온)는 두 개의 환을 가진 테르펜계 화합물(bicyclic terpenes)로서, 항염증제 (US5,889,049), 산화질소(nitric oxide)와 관련된 질병 치료제 (US 5,990,177), 청량감을 위해 항비듬 제품 첨가물(국제특허 제9939638호)로 이용되고 있으며, 항가려움증과 마취, 청량감 등의 목적으로 이용되는 것이 알려져 있다 (국제특허 9956548호). 상기 보르네올과 캄퍼는 휴물렌 (humulene, 2,6,6,9-테트라메틸- 1,4,8-시클로운데카트리엔)과 더불어 한약재인 용뇌의 주요 성분이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 통상적인 제형으로 투여될 수 있으나, 흡입에 의해 투여되는 것이 효과가 빠르고 부작용을 피할 수 있어 바람직하다. 이와 같은 흡입 투여 형태는 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체, 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 향기액의 유효량은 투여경로, 제형, 사용하는 목적, 환자의 질환의 정도 등에 따라 광범위한 범위 내에서 결정될 수 있다. 그러나, 일반적으로 향기액은 1-2㎎/kg/일(day)의 흡입량 농도로 투여될 수 있다.
하기 실시예에서도 규명한 바와 같이, 알츠하이머병을 유발시키는 아밀로이드 베타를 쥐의 뇌에 주입하여 가감소합향원 향기액이 알츠하이머병의
치료 및 발생 억제에 미치는 영향을 조사한 결과 다음과 같은 작용을 규명할 수 있었다:
첫째, 아밀로이드 베타 주입에 의한 기억 결손이 가감소합향원 흡입에 의해 대조군 수준으로 회복되었으며, 이러한 효과는 DHA만을 미리 투여한 군에 비해서
더 좋은 효과를 나타내었다.
둘째, 아밀로이드 베타 주입에 의한 JNK의 인산화가 가감소합향원 정유액의 향기 흡입에 의해 저해되었다.
셋째, 아밀로이드 베타 주입에 의한 p38의 인산화가 가감소합향원 정유액의 향기 흡입에 의해 저해되었다.
넷째, 아밀로이드 베타 주입에 의한 MAPK의 인산화가 가감소합향원 정유액의 향기 흡입에 의해 저해되었다.
다섯째, 아밀로이드 베타 주입에 의한 tau의 인산화가 가감소합향원 정유액의 향기 흡입에 의해 저해되었다.
여섯째, 아밀로이드 베타 주입에 의한 GFAP의 증가가 가감소합향원 정유액의 향기 흡입에 의해 저해되었다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 한약재 향기액은 향기 흡입에 의해 베타-아밀로이드에 의해 유발되는 뇌세포 손상 치료효과를 제공하므로 치매 예방 및 치료제로 유효하게 사용될 수 있다.
약재의 구성
본 실험에 사용한 약재는 동국대학교 일산한방병원에서 구입하여 정선한 것 을 사용하였고, 가감소합향원의 처방구성은 ≪東醫寶鑑≫14)에 준하여 향 성분이 많이 추출될 수 있는 약재 위주로 가감하였다(하기 표 1 참조).
한약명 행약명 중량
용뇌 ( Borneol ) 22.86 g
소합향 ( Styrax Liquidus ) 22.86 g
안식향 ( Benzoinum ) 22.86 g
목향 ( Helenii Radix ) 22.86 g
유향 ( Olibanum ) 22.86 g
침향 ( Aquillariae Lignum ) 17.14 g
정향 ( Caryophylli Flos ) 22.86 g
단향 ( Santali Ligum album ) 22.86 g
향부자 ( Cyperi Rhizoma ) 22.86 g
총 중량 200.02 g
가감소합향원 향기액의 제조
상기 가감소합향원 200g을 분말로 만든 다음, n-hexane 2 ℓ를 넣고 실온에서 48시간 방치하여 추출하였다 (도 1 참조).
방치하는 동안 12시간마다 1번씩 저어주면서 가능한 많은 정유 향기액이 추출되도록 하였다. 추출액을 여과한 다음, 여액인 n-hexane을 evaporator을 이용하여 증류하여 제거하고 암록색의 맑은 정유 향기액 29.7 g을 얻었다.
향기액을 흡입시킨 그룹에는 1cage당 4g의 향기액이 유지되도록 1일 1회 확인하였다.
실험 시약
뇌 손상을 유발시키기 위해 사용한 β-amyloid 1-42 peptide fragments (sigma), Positive control에는 치매예방효과를 보기 위해 docosahexaenoic acid (DHA) (D2534-25mg, sigma)을 사용하였다.
50ul Hamilton syringe와 26-gauge needle, Purfusion시 Formalin 조성의 KH2PO4와 NaHPO4, 0.9% Saline 조성의 NaCl, Purfusion 후 Brain 저장시 PBS 조성의 Na2HPO47H2O, NaCl, TRITON X-100, Brain section 후 장기보존액 조성은 NaH2PO4, Na2HPO4, Sucrose, Polyvinyl pyrrolidone(PVP-40), Ethylene glycol는 Sigma(St. Louis, MO, USA)사 제품을 사용하였다. 그리고, 마취제는 Ketamine과 Xylazine을 사용하였다.
실험 동물
실험동물은 오리엔트바이오(주)에서 구입한 외관상 건강한 ICR계 mouse로 웅성 6주령(20~26g)을 사용하였으며, 온도 22±1℃, 습도 55±1%, 12시간 light-dark cycle의 통제된 사육실(동국대 일산병원 동물실)에서 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 반입 후 7일 동안 적응 사육시킨 후 실험에 사용하였다.
실험군 구성
실험군은 1주일간 적응 사육시킨 후 무게별로 균등하게 6마리씩 4 group으로 나누고, 각 group별로 다음과 같이 처치하였다.
Control group : 아무 처치하지 않음.
Positive group : 14일간 10mg/kg의 DHA를 경구 투여한 후, β-amyloid 1-42를 투여하여 치매를 유발하였다.
Negative group : 치매 유발 전 DHA 투여 및 향기액 흡입을 하지 않았다.
SH aroma group : 가감소합향원 정유액 향기를 14일 간 오전, 오후 각 3시간씩 흡입시킨 후 치매를 유발하였다.
각 group별로 해당 처치 14일 후 control을 제외한 세 group은 β-amyloid 1-42를 Laursen & Belknap의 방법22 )에 따라 50㎕ Hamilton microsyringe를 이용하여 26 gauge needle로 bregma에 2.4nm 깊이로 5㎕를 intracerebroventricular injection하였다. 이로써 치매를 유발하였고, 치매 유발 뒤 48시간 후 Y-maze task를 실시하고, 이어 passive avoidance task의 training trial을 실시하였다. 다시 24시간 후 passive avoidance task의 retention trial을 실시한 후 brain의 hippocampus 부위를 적출하여 immunocytochemistry, western blot을 실시하였다.
행동 연구
1) Y-maze task
단기 행동 기억 정도는 Y-maze에서의 자발적인 교차 행동량(spontaneous alternation behavior)을 기록함으로써 평가하였다.23) Y자형 미로 측정 장치는 3개의 통로(arm)를 뻗어 알파벳 Y자 모양을 하고 있으며 각 가지는 길이 25cm, 높이 14cm, 폭 5cm이고 동일한 각도로 위치한다. Y자형 미로의 한 통로의 끝에 실험동물의 머리 부분이 향하도록 하고 7분 동안 자유롭게 통로를 돌아다니도록 한다.
동물의 움직임을 기록하고 동물의 뒷발까지 통로로 들어간 경우를 통과한 것(arm entry)으로 본다. 동물의 움직임을 교차횟수(alternation)로 나타내는데, 교차횟수란 동물이 연속적으로 3개의 통로를 통과하였을 때 한 번 교차한 것으로 정의된다. 자발적인 교차 행동량은 실제 교차횟수와 최대 가능한 교차횟수(즉, 총 교차횟수에서 2를 뺀 값)의 백분비이다.
2) Passive avoidance task
(1)Passive avoidance test 장치
측정기기는 내부가 두 개의 방으로 구성된 상자(shuttle box, 53cmW × 44cmH × 33cmD)의 가운데에 guillotine door가 있으며 한쪽 방에는 바닥(grid floor)전체에 전기쇼크(scrambled foot-shock)를 가할 수 있는 장치가 되어 있다.
(2) Training trial
실험군 또는 대조군 각 1마리씩 한쪽 방에 넣고 15초간의 탐색시간을 준 뒤, 위에서 조명을 가하면서 가운데의 guillotine door를 열어주면 통과하여 어두운 다른 방에 도달한다. mouse가 dark room에 들어가면 guillotine door를 닫고 home cage에 꺼내준다. 이것을 2회 반복한 후, 세 번째에는 dark room에 들어가면 door가 닫히면서 전기쇼크가 가해진다. 쇼크는 0.3mA의 전류를 3초간 통하게 하였으며 쥐가 foot-shock를 받은 후에 꺼내어 home cage에 다시 넣어둔다. 이러한 방법으로 각각 group별로 전기쇼크를 가하였다. 300초 동안에 쇼크실로 들어가지 않는 쥐는 실험대상에서 제외시켰다.
(3) Retention trial
traing trial을 실시한 뒤 24시간 후, 1마리씩 light room에 넣어주고, guillotine door를 열어주어 dark room으로 넘어가는 시간을 측정한다. 전일 전기쇼크에 대한 기억이 있으면 mouse는 쇼크실로 잘 들어가지 않게 된다. 따라서, retention time이 길수록 수동회피의 학습과 기억효과가 좋음을 나타낸다. 이 때, 쇼크실 도달시간(step-through latency time)은 300초(cut-off time)까지 측정하였다.
Immunocytochemistry
Immunocytochemistry방법은 β-Amyloide 1-42를 주입하고 5일 후에 4% PFA로 Transcardially Perfusion한 후 30% sucrose에 넣어 cryoprotected시킨다. -20℃로 유지되는 cryosection microtome을 사용하여 35um 로 coronally section한다. Section 된 조직들은 cryoprotectant에 담근 후 -20℃ 에서 보관한다.
Antibody는 Glial fibrillary acidic protein (rabbit anti-GFAP,1:200, Chemicon)를 사용하였다. PBS에서 Coating slide에 절편된 조직을 올려놓은 후 3번 PBS로 washing 한 후 Blocking solution (1% Bovine serum, albumin 과 0.2% Triton X-100)을 도포하여 실온에서 30분간 반응시킨다. 3번 PBS로 washing 해준 후 Ab를 PBS에 희석하여 도포해준 후 실온에서 16시간 방치한다. 다음날 3번 PBS로 washing 해준 후 HRP가 붙어 있는 이차 항체를 도포하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 DAB 발색반응을 유도한다. 마지막으로 mount 용액을 도포하여 coverslip을 덮고, 사진촬영은 olympus(BX-UCB)microscopy를 이용하였다.
Western blotting analysis
뇌를 적출한 후 해마를 분리하여 완충액 (50 mM Tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 30 mM sodium pyrophosphate, 10 mM NaF, 2 mM Na3VO4, protease inhibitor cocktail)을 넣고 균질기를 이용하여 균질화하였다. 균질액을 12000 rpm에서 15 분간 4도에서 원심분리 후 상층액만을 얻었다. 단백질 정량은 bicinchoninic acid (BCA, Pierce)법을 사용하였다. 상층액은 4X Lammlie의 완충액 (62.5 mmol/1 Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol)을 넣고 95 도에서 boiling 하였다.
정량된 단백질 시료 50 ug을 4-12% sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gradient gel (Invitrogen) 전기 영동법 (SDS-PAGE)으로 분리되었고, nitrocellulose paper (Amersham)로 옮졌다. 단백질이 옮겨진 막을 Ponceau-S로 염색하여 단백질이 완전하게 옮겨졌음을 확인하고 0.1% Tween 20을 포함하는 Tris-buffered saline (TBS-T)으로 씻은 후 5% 탈지 분유액으로 30분 이상 blocking하였다. 항 인산화 p38 (p-p38), p38, 항 인산화 MAPK (p-MAPK), MAPK, 항 인산화 JNK (p-JNK), JNK, 항 인산화 tau (p-tau, Ser262) 및 tau 항체 (Cell signaling tech. USA)와 함께 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 막을 TBS-T에서 10분씩 3회 세척한 후 blot을 2차 항체와 함께 1시간동안 반응시켰다. 2차 항체 반응 후 막을 씻고 enhanced chemiluminiscence system (ECL, Pierce)으로 원하는 단백질을 가시화 하였다.
단백질의 가시화 및 정량 분석은 image 장비 (LAS-3000, Fuji)를 이용하였다.
Data 분석 및 통계처리
모든 측정값은 평균값 표준편차(mean±S.D.)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 window용 SPSS Program의 one-way ANOVA로 검정하여 p값이 0.05이하인 경우에 유의한 것으로 인정하였다.
실시예 1: 행동 연구 결과
1) Y-maze task
행동실험은 모든 group에서 아밀로이드 베타를 주입 후 5일에 수행하였다.
자발적 행동변화는 공간적 기억을 측정하는 Y-maze 법을 이용하여 측정하였으며 얻어진 결과를 도 2에 정리하였다. 도 2에서 보듯이, 아밀로이드 베타 주입한 group은 대조군에 비해 공간지각 능력이 현저히 저하됨을 관찰할 수 있었다(대조군에 비해 15 % 저하). 그러나, 가감소합향원을 미리 흡입시킨 group에서는 아밀로이드 베타 투여에 의한 행동 변화가 거의 관찰되지 않았다(대조군에 비해 5% 감소). 거의 대조군 수준의 공간지각 능력을 보였다.
또한 치매 유발 전에 DHA를 투여한 group에서도 아밀로이드 베타만을 투여한 group 보다는 효과가 좋은 것으로 관찰되었으나 향기를 미리 흡입한 group에 비해서는 낮은 효과를 나타냈다. 그리고 각각의 팔로 들어가는 횟수는 각 group 당 차이를 보이지 않았다. 따라서 이러한 결과는 일반적인 운동능력에는 각 group 당 차이가 없음을 시사한다.
2) Passive avoidance task
또 다른 학습과 기억 수행 능력을 검사하는데 널리 사용되는 검사로, 이전에 혐오 자극이 제시되었던 상자 안에 들어가기까지 걸리는 시간을 측정하는 방법으로 passive avoidance test를 수행하고 얻어진 결과를 도 3에 정리하였다.
도 3에서 보듯이, 가감소합향원을 미리 흡입한 group은 아밀로이드 베타만을 주입한 group에 비해 유의하게 기억능력이 향상되었다. 그러나 DHA만을 미리 투여한 group에서는 향기를 미리 흡입한 group에 비해서는 기억능력이 저하되어 있었다. 이상의 결과는 아밀로이드 베타 주입에 의한 기억 수행 능력 장애가 가감소합향원 흡입에 의해 예방될 수 있음을 시사한다.
실시예 2: Immunocytochemistry 결과
행동실험에 이어 다음으로는 조직학적으로 아밀로이드 베타 주입에 의해 뇌의 기억 부분을 담당하는 해마에 일어나는 변화를 면역 염색을 이용하여 astrocyte의 marker 인 glial fibrillary acidic protein (GFAP)을 관찰하였다. 이 단백질은 뇌에서 염증반응이나 손상, 알츠하이머 등의 뇌질환 시에 증가하는 단백질로 알려져 있으므로 이 단백질의 면역염색을 통하여 뇌의 어느 부위에 이 단백질이 증가되었는지를 관찰하고 얻어진 결과를 도 4에 정리하였다.
도 4에서 보듯이, GFAP staining 결과 아밀로이드 베타를 주입한 group에서는 GFAP의 염색이 진하게 되었으며 향을 미리 흡입한 group에서는 대조군과 비슷한 상태로 GFAP의 양이 증가하지 않았다. 그리고 DHA를 미리 투여한 group에서도 GFAP의 발현이 증가하지 않았다. 따라서 이상의 결과는 향기 흡입에 의해 해마에서 병리학적인 치매유발이 발생하지 않았음을 시사한다.
실시예 3: Western blot 분석
1) 가감소합향원 정유액의 향기 흡입 후 p38 단백질의 인산화 억제 효과
해마 조직에서 아밀로이드 베타 투여에 의해 활성화가 증가된다고 알려져 있는 스트레스 관련 단백질의 인산화를 immunoblot을 이용하여 관찰하였다. 가감소합향원 정유액의 향기를 미리 흡입시켰을 때 세포가 스트레스를 받거나 사멸시에 활성화된다고 알려진 단백질 중 p38의 활성과 인산화 억제 효과를 살펴보았으며, 얻어진 결과를 도 5에 정리하였다.
도 5에서 보듯이, 실험군에서 beta-amyloid(1-42)를 주입함으로써 치매를 유발하였는데, 선행처치로 가감소합향원 향기를 미리 14일간 흡입시킨 group은 beta-amyloid (42-1)을 주입하여 치매가 유발되지 않은 group과 비교하였을 때 p38의 인산화 억제 효과가 뛰어남을 확인하였다. 선행처치로 향기 흡입과 DHA 경구투여를 함께 병행한 group 또한 뛰어난 p38의 인산화 억제 효과를 보였다.
2) 가감소합향원 정유액의 향기 흡입 후 ERK 단백질의 인산화 억제 효과
가감소합향원 정유액의 향기를 미리 흡입시켰을 때 세포가 스트레스를 받거나 사멸시에 활성화된다고 알려진 단백질 중 ERK의 활성과 인산화 억제 효과를 살펴보았다.
도 6에서 보듯이, 치매 유발 전선행처치로 가감소합향원 향기를 미리 14일간 흡입시킨 group은 beta-amyloid(42-1)을 주입하여 치매가 유발되지 않은 group보다 ERK의 인산화 억제 정도가 높거나 비슷하게 나타났다. 선행처치로 향기 흡입과 DHA 경구투여를 함께 병행한 group은 치매 유발 group보다는 ERK의 인산화 정도가 낮았으나, 향기만 흡입시킨 group에 비해서는 인산화 억제 효과가 떨어지는 것으로 확인되었다.
3) 가감소합향원 정유액의 향기 흡입 후 JNK 단백질의 인산화 억제 효과
가감소합향원 정유액의 향기를 미리 흡입시켰을 때 세포가 스트레스를 받거나 사멸시에 활성화된다고 알려진 단백질 중 JNK의 활성과 인산화 억제 효과를 살펴보았다.
도 7에서 보듯이, 치매 유발 전 선행처치로 가감소합향원 향기를 미리 흡입시킨 group은 beta-amyloid(42-1)을 주입하여 치매가 유발되지 않은 group보다는 JNK의 인산화 정도가 약간 높았으나, 선행 처치없이 치매를 유발한 group에 비해 매우 뛰어난 JNK의 인산화 억제 효과를 보였으며, 선행처치로 향기 흡입과 DHA 경구투여를 함께 병행한 group이 가장 뛰어난 JNK의 인산화 억제 효과를 보였다.
4) 가감소합향원 정유액의 향기 흡입 후 tau의 인산화 억제 효과
가감소합향원 정유액을 미리 흡입시켰을 때 AD 환자의 뇌 조직에서 인산화가 증가된다고 보고된 단백질 중 tau의 인산화를 관찰하였다.
도 8에서 보듯이, 가감소합향원 정유액을 미리 2주일간 흡입시킨 뒤 beta-amyloid(1-42)를 주입하여 치매를 유발한 group은 선행 향기 흡입 없이 치매를 유발한 group에 비해 tau의 인산화가 크게 억제되었는데, 이는 beta-amyloid(42-1)를 주입하여 치매가 유발되지 않은 control group과 유사한 정도의 효과를 보였다. 또한 DHA와 향기를 같이 처치한 group에서도 tau의 인산화 억제가 확인되었다.
결론
앞서 실시결과를 정리해보면, 가감소합향원 정유액의 향기액 흡입이 베타아밀로이드를 주입하였을 때 발생하는 기억력 장애 정도와 억제 효과를 행동실험과 세포 손상 정도를 실험적으로 평가함으로써 알츠하이머형 치매 예방 효과를 확인하였다.
즉, 행동 실험으로는 Y-maze task 와 passive avoidance task 를 수행하였다. 동물실험에서 아밀로이드 베타의 intracerebraventricular (i.c.v) 주입은 기억 상실을 유발하는 것으로 잘 알려져 있다.63) Y-maze task 결과로는 일반적인 운동능력에는 각 group 당 차이가 없었으나, 공간지각 능력에 있어서는 가감소합향원을 미리 흡입시킨 group에서는 아밀로이드 베타 투여에 의한 행동 변화가 거의 관찰되지 않았으며, 거의 대조군 수준의 공간지각 능력을 보였다(Fig. 2).
또다른 행동실험으로 passive avoidance test를 수행하였는데, 가감소합향원을 미리 흡입한 group은 아밀로이드 베타만을 주입한 group에 비해 유의하게 기억능력이 향상되었으며 거의 대조군 수준으로 나왔다(Fig. 3). 이상의 결과는 아밀로이드 베타 주입에 의한 기억 수행 능력 장애가 가감소합향원 흡입에 의해 예방될 수 있음을 시사한다.
본 발명에서 베타 아밀로이드에 의한 세포 독성 및 세포 사멸의 지표로 JNK 와 p38 MAPK의 활성화 정도를 인산화 특이 항체를 이용하여 관찰하였다. 이 두 단백질 외에 본 발명에서는 p42/44 MAPK (ERK)의 인산화도 베타아밀로이드에 의해 증가함을 관찰하였다(Fig. 6). 그러나, 이 단백질의 활성화가 세포 독성이나 세포 사멸에 중요한지는 아직도 의견이 상반된다. 왜냐하면 AD 환자에서 p42/44 MAPK의 인산화가 저해 되었으며 p42/44 MAPK의 인산화 증가는 신경세포 성장이나, 시냅스 가소성 (synaptic plasticity), long-term potentiation (LPT)을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문이다72 ). 특히 도파민과 카테콜아민 분비에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다73 ,74). 그러나 신경 세포 실험에서는 베타 아밀로이드를 처리 시 p42/44 MAPK의 인산화가 증가하며 이러한 인산화 증가로 인해 세포가 사멸되거나 소교세포의 활성에 중요한 활성산소의 생성 및 사이토 카인의 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다75 ,76). 이상의 결과는 AD가 생성되는 초기 단계에는 p42/44 MAPK의 활성이 요구되지만 장기적으로는 이 단백질의 활성화 저하로 인해 AD의 병적 진행이 더 가속화 될 수 있음을 시사한다. 본 연구에서도 베타 아밀로이드 투여에 의한 초기단계의 병적 상태를 관찰하는 것이므로 p42/44 MAPK의 인산화 증가가 유발된 것임을 제시한다.
본 발명에서 가감소합향원 추출향의 흡입만으로 베타 아밀로이드의 투여에 의한 세포 독성의 지표인 JNK 와 p38의 인산화가 억제되었으며(Fig. 5, Fig. 7), AD 환자에서 특징적으로 보이는 tau의 인산화도 억제되었다(Fig. 8). 그리고 뇌 세포의 독성 저해 뿐만 아니라 동물 행동실험에서 기억력 손상의 회복도 관찰하였다.
이상의 실험 결과로부터, 천연이나 한약에서 추출한 항산화, 항염증 물질이
AD의 예방과 치료에 도움을 줄 수 있음을 시사한다. 그리고 이러한 천연물이나
본 발명에서 시도한 향기요법은 비용이 비교적 적게 들며, 쉽게 적용이 가능하고,
일상생활에서 접근하기 쉬운 방법이다. 따라서 비용절감 측면에서 이러한 전략은
대중적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 한약재 향기액은 통상적인 투여 방식,
바람직하게는 향기 흡입에 의해 베타-아밀로이드로 유발된 뇌세포 손상의 예방 및
치료 효과를 제공하므로 알츠하이머형 치매 예방 및 치료제로 유효하게 사용될 수
있다.
도 1은 가감소합향원으로부터 향기액을 제조하는 흐름도이다.
도 2는 마우스내 Y-maze 자발적 행동변화에 있어 가감소합향원 향기액이 미치는 효과를 도시한 그래프로서, p<0.05이다.
도 3은 마우스내 Passive avoidance task 행동변화에 있어 가감소합향원 향기액이 미치는 효과를 도시한 그래프로서, p<0.01, p<0.001이다.
도 4는 아밀로이드 베타 주입에 의한 GFAP의 증가가 가감소합향원 정유액의 향기 흡입에 의해 저해되는 것을 보이는 도면이다.
도 5는 아밀로이드 베타 주입에 의한 p38의 인산화가 가감소합향원 정유액의 향기 흡입에 의해 저해되는 것을 보이는 도면으로서, C: beta-amyloid (42-1), N: beta-amyloid (1-42), S : Fragnance, PH : fragnance + DHA을 나타낸다.
도 6은 아밀로이드 베타 주입에 의한 MAPK의 인산화가 가감소합향원 정유액의 향기 흡입에 의해 저해되는 것을 도시한 도면으로서, C: beta-amyloid (42-1), N: beta-amyloid (1-42), S : Fragnance, PH : fragnance + DHA을 나타낸다.
도 7은 아밀로이드 베타 주입에 의한 JNK의 인산화가 가감소합향원 정유액의 향기 흡입에 의해 저해되는 것을 도시한 도면으로서, C: beta-amyloid (42-1), N: beta-amyloid (1-42), S : Fragnance, PH : fragnance + DHA를 나타낸다.
도 8은 아밀로이드 베타 주입에 의한 tau의 인산화가 가감소합향원 정유액의 향기 흡입에 의해 저해되는 것을 도시한 도면으로서, C: beta-amyloid (42-1), N: beta-amyloid (1-42), S : Fragnance, PH : fragnance + DHA를 나타낸다.

Claims (6)

  1. 용뇌, 소합향, 안식향, 목향, 유향, 침향, 정향, 단향 및 향부자로 이루어진 혼합 약재에서 추출된 향기액을 유효성분으로 함유하여 베타-아밀로이드에 의해 유발되는 뇌세포 손상을 개선하여 알츠하이머형 치매를 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혼합 약재의 중량비는 용뇌: 소합향: 안식향: 목향: 유향: 정향: 단향: 향부자: 침향=1:1:1:1:1:1:1:1:0.75인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 혼합 약재는 용뇌 22.86g, 소합향 22.86g, 안식향 22.86g, 목향 22.86g, 유향 22.86g, 침향 17.14g, 정향 22.86g, 단향 22.86g 및 향부자 22.86g의 배합 비율로 혼합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 향기액은
    a) 용뇌 22.86g, 소합향 22.86g, 안식향 22.86g, 목향 22.86g, 유향 22.86g, 침향 17.14g, 정향 22.86g, 단향 22.86g 및 향부자 22.86g로 이루어진 혼합 약재 200g을 분말화하는 단계;
    b) 상기 한약재 혼합 분말에 n-hexane을 첨가하고 실온 방치하면서 교반하여 추출하는 단계; 및
    c) 상기 추출액을 여과한 다음, 여액중 n-hexane을 증류하여 제거하고 암록색의 맑은 정유 향기액을 수득하는 단계; 에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 향기액은 흡입 방식으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 향기액이 1-2㎎/kg/일(day)의 흡입량 농도로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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