KR20090080654A

KR20090080654A - 5'-크산틸산 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물및 이를 이용한 5'-크산틸산의 생산 방법

Info

Publication number: KR20090080654A
Application number: KR1020080006537A
Authority: KR
Inventors: 김철하; 최종수; 조진만; 김혜원; 이지혜; 홍국기; 이진남; 오윤석; 박장희
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2008-01-22
Filing date: 2008-01-22
Publication date: 2009-07-27
Anticipated expiration: 2028-01-22
Also published as: KR100957690B1

Abstract

본 발명은 퓨린 생합성 경로에 관여하는 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라제(phosphoribosylglycinamide formyltransferase) 및 이노신산 사이클로하이드롤라아제(inosinic acid cyclohydrolase) 효소의 활성이 강화되고, 바람직하게는 추가로 5'-뉴클레오티다제가 불활성화됨으로써 5'-크산틸산의 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용하여 고농도의 5'-크산틸산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라제, 이노신산 사이클로하이드롤라아제, 5'-뉴클레오티다제, 5'-크산틸산, 코리네박테리움

Description

5'-크산틸산 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-크산틸산의 생산 방법{A MICROORGANISM OF CORYNEBACTERIUM GENUS HAVING ENHANCED XANTHOSINE 5'-MONOPHOSPHATE PRODUCTIVITY AND METHOD OF PRODUCING XANTHOSINE 5'-MONOPHOSPHATE USING THE SAME}

본 발명은 퓨린 생합성에 관여하는 5'-포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제(5'-phosphoribosylglycinamide formyltransferase 1) 및 이노신산 사이클로하이드롤라아제(inosinic acid cyclohydrolase; 이하 IMP 사이클로하이드롤라아제라 칭한다) 효소의 활성을 강화시키고, 바람직하게는 핵산을 분해하는 5'-뉴클레오티다아제(5'-nucleotidase)를 추가로 불활성화시킴으로써 5'-크산틸산(xanthosine 5'-monophosphate; 이하 5'-XMP라 칭한다)의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 5'-크산틸산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

5'-XMP는 퓨린 뉴클레오티드(purine nucleotide) 생합성 대사계의 중간 생성물로 5'-구아닐산(guanine 5'-monophosphate: 이하 5'-GMP라 칭한다)의 제조 원료로서 중요한 물질이다. 5'-GMP는 이노신산(inosinic acid; 이하 IMP라 칭한다)과 더불어 식품 조미 첨가제로 널리 이용되고 있는 물질이다. 5'-GMP는 그 자체로서 버섯의 맛을 내는 것으로 알려져 있으나, 주로 L-글루타민산나트륨(monosodium L-glutamate; MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 있다. 이러한 성질은 특히 IMP과 같이 쓰여졌을 때 강하게 나타난다.

지금까지 알려진 5'-GMP의 제조 방법에는 (1) 효모세포로부터 추출한 리보핵산(RNA)을 효소학적으로 분해하는 방법, (2) 미생물 발효법으로 5'-GMP를 직접 발효하는 방법, (3) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적으로 인산화 시키는 방법, (4) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 효소적 방법으로 인산화 시키는 방법, (5) 미생물 발효법으로 생산한 5'-XMP를 코리네형 미생물을 이용하여 5'-GMP으로 전환하는 방법, (6) 미생물 발효법으로 생산한 5'-XMP를 대장균을 이용하여 5'-GMP로 전환시키는 방법을 들 수 있다. 이중 (1)의 방법은 원료 수급 및 경제성에 문제가 있으며, (2)의 방법은 5'-GMP의 세포막 투과성의 문제로 인하여 수율이 낮다는 단점이 있어 그 외의 방법이 공업적으로 주로 이용되고 있다.

위에서 전기한 방법들 중 5'-XMP를 생산하여 5'-GMP로 전환시키는 방법을 이용하여 5'-GMP를 생산 할 경우, 5'-XMP의 생산성을 강화할 수 있는 전략이 필요하다. 때문에 종래에 5'-XMP 생합성 관련 유전자가 강화된 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 5'-XMP 생산방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 국내 특허 10-1991-018061에는 5'-XMP 수율을 높이기 위하여, 아데닌과 구아닌 반영양요구성형의 크산틸산아미나제 불활성균주이며 구아노신 유사체 내성을 가지고 있고 세포벽 분해 효소인 라이소인 라이소자임에 감수성이 매우 높은 균주를 제작하여 개시하였다. 국 내 특허 10-2001-000513에는 5'-XMP을 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)를 친주로 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine; NTG) 등의 변이 유발제를 통상적인 방법에 따라 처리하여 친주의 형질을 변형시킴으로써 5'-XMP의 생합성에 영향을 주는 발린(valine)에 대한 유사체(analoge)인 노르발린(norvaline) 내성주를 선별하였고, 그 결과 5'-XMP을 고수율, 고농도로 배양액 중에 직접 축적시키는 미생물을 이용한 5'-XMP 생산방법을 개시하였다. 또, 국내 특허 10-2003-0091342에서는 미생물에서 핵산을 분해함으로써 핵산 농도를 감소시키는 것으로 보고된 (Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology: 2^nd edition:561~579) ushA 유전자를 코리네박테리움에서 규명하여 이노신산 생산 균주에서 불활성화시킴으로써 고수율의 이노신산을 생산하는 방법을 개시하였다.

그러나 종래에는 고수율의 5'-XMP 생산주를 만들기 위해 5'-XMP의 생합성에 관련된 퓨린 생합성 경로에 관여하는 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제 및 IMP 사이클로하이드롤라아제 효소를 각각 암호화하는 유전자인 purN, purH(이하 purNH라 칭한다)를 강화하여 5'-XMP 수율을 향상시킨 미생물에 관한 예는 개시된 바 없다. 또한, 핵산을 분해하는 5'-뉴클레오티다아제를 암호화하는 ushA 유전자를 불활성시킨 변이주에 관한 내용 또한 언급된 적이 없다. 더불어 purNH 유전자가 강화되고 ushA 유전자가 불활성화된 균주에서 고수율의 5'-XMP를 생산하는 방법에 대해서도 개시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 5'-XMP를 생산하여 5'-GMP로 전환시키는 방법을 이용하여 5'-GMP를 생산 할 경우, 5'-GMP의 수요만큼 5'-XMP가 필요하므로 5'-XMP의 생산성을 강화하기 위하여, 퓨린 생합성 경로에 관여하는 효소의 활성을 강화하고 핵산을 분해하는 효소를 불활성화시킴으로써 5'-XMP의 생산성을 보다 극대화할 필요가 있다고 판단하였다. 본 발명자들은 퓨린 생합성 경로에 관여하는 포스포리보실글리신아미드 포밀트랜스퍼라아제 및 IMP 사이클로하이드롤라아제 효소를 암호화하는 유전자 purNH의 활성을 강화시키고, 핵산을 분해하는 5'-뉴클레오티다아제를 암호화하는 ushA 유전자를 불활성화시킴으로써 5'-XMP의 생산성이 증가한다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라제 및 IMP 사이클로하이드롤라아제 효소를 암호화하는 purNH 유전자를 염색체 내로 도입하여 상기 효소의 활성을 강화시킴으로써 5'-XMP의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 추가적으로 5'-뉴클레오티다제를 암호화하는 ushA 유전자의 활성을 불활성화시킨 5'-XMP의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 5'-XMP의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 5'-XMP를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라제 및 IMP 사이클로하이드롤라아제 효소를 암호화하는 purNH 유전자가 도입에 의해 염색체 내에 2 카피 이상 존재하여 상기 효소의 활성을 강화시킴으로써 5'-XMP의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 코리네박테리움 속 미생물을 추가적으로 5'-뉴클레오티다제를 암호화하는 ushA 유전자 내에 하나의 염기를 삽입시켜 불활성화시킴으로써 5'-XMP의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 5'-XMP의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 5'-XMP를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 코리네박테리움 속 미생물은 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라제와 IMP 사이클로하이드롤라아제의 활성이 코리네박테리움 속 미생물이 가지고 있는 고유의 활성보다 증가되어 있고, 5'-뉴클레오티다제가 불활성화 되도록 조작되어 있어 기존의 5'-XMP 생산에 사용되는 미생물에 비하여 5'-XMP 생산능이 향상되어 있다. 따라서, 당해 미생물을 사용하면 고효율로 5'-XMP를 생산하여 생산성을 증가시킬 수 있다.

본 발명은 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라제 및 IMP 사이클로하이드롤라아제 효소를 암호화하는 purNH 유전자가 도입에 의해 염색체 내에 2 카피 이상 존재하여 상기 효소의 활성을 강화시킴으로써 5'-XMP의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

5'-XMP를 만들기 위한 생합성 경로는 매우 복잡하며, 다양한 아미노산 및 조효소들이 부가적으로 참여하는 반응이 연속되고 있다. 본 발명에서 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라제 및 IMP 사이클로하이드롤라아제 효소는 모두 5'-XMP의 합성에 관련된 퓨린의 합성에 관여하는 효소들이다.

포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제는 퓨린의 생합성에 중요한 역할을 하며, N2-포밀-NL(5-포스포-D-리보실)글리신아마이드 및 테트라하이드로폴산을 생성하기 위하여 10-포밀테르라하이드로폴산(N10-formyltetrahydrofolate)의 포밀기를 N1-(5-포스포-D-리보실)글리신아마이드(N1-(5-phospho-D-ribosyl)glycinamide)로 이동시키는 것을 촉매하는 효소이다. 테트라하이드로폴산은 퓨린, 티미딘, DNA 등의 합성에 중요한 역할을 하므로, 5'-XMP의 합성에 필수적이다. 또한, IMP 사이클로하이드롤라아제는 퓨린 생합성의 마지막 단계를 촉매하며, 5-포밀아미노이미다졸-4-카복사마이드 리보뉴클레오티드(5-formylaminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)를 IMP로 촉매하는 효소이다.

상기 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제 및 IMP 사이클로하이드롤라아제를 암호화하는 유전자의 염기서열은 이미 밝혀져 있으며, 바람직하게는 상기 효소를 암호화하는 유전자는 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 purNH 유전자(진뱅크 허가번호 AB003159; 서열번호 12)이다.

본 발명에서 상기 효소의 활성을 강화시키는 방법은 유전자 카피 수의 증가 및 돌연변이에 의하여 효소활성을 증가시킴을 포함한다. 본 발명에서 유전자 카피 수의 증가는, 외래 유전자의 도입에 의한 카피 수의 증가뿐만 아니라, 내재적 유전자의 증폭에 의한 것도 포함된다. 외래 유전자 도입의 경우에는, 유전자를 코리네박테리움 속 미생물에서 기능할 수 있는 벡터로 도입하여 유전자 카피수를 증가시킨다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것은 아니며, 공지된 발현벡터를 사용할 수 있다. 내재적 유전자 증폭의 경우, 본 발명에서 상기 내재적 유전자는 코리네박테리움 속 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 유전자를 의미한다. 내재적 유전자의 증폭은 당업계에 알려진 방법, 예를 들면 적당한 선택 압력하에서의 배양 등에 의하여 용이하게 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 효소의 활성은 코리네박테리움 속 미생물이 천연상태로 가지고 있는 내재적 purNH 유전자에 더하여 1 카피 이상의 purNH 유전자를 새로 도입함으로써 달성되며, 바람직하게는 2개 카피의 purNH 유전자가 상동 재조합에 의하여 내재적 purNH 유전자 옆에 1 카피의 purNH 유전자가 더 삽입되고, 최종적으로는 2개 카피의 purNH 유전자가 증폭되고 돌연변이를 일으킴으로써 효소의 활성이 강화되는 것이다.

본 발명에서 외래 유전자의 도입시 사용 가능한 벡터는 바람직하게는 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 사용한다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 상기 유전자 도입에 사용되는 벡터는 상기 purNH 유전자를 포함하는 pDZ-purNH 벡터이다.

본 발명은 또한 추가적으로 5'-뉴클레오티다제를 암호화하는 ushA 유전자의 활성을 불활성화시킨 5'-XMP의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공 한다.

본 발명에서 5'-뉴클레오티다아제는 뉴클레오티드의 당과 인산결합을 가수분해하는 효소로서 핵산을 분해하여 핵산의 농도를 감소시킨다. 상기 효소를 암호화하는 유전자 ushA의 염기서열은 국내 특허 10-2003-0091342로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 상기 ushA 유전자는 서열번호 13의 염기서열을 갖는다.

본 발명에 있어서, 상기 불활성화는 ushA 유전자의 활성이 치환, 결손, 삽입 등에 의해서 불활성화된 것을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 ushA 유전자가 염색체 내의 염기 삽입으로 인한 프레임쉬프트에 의해 불활성화 된 것이며, 상기 염기는 임의의 염기일 수 있다. 상기 유전자의 치환, 결실 및/또는 삽입은 통상의 당업계에 알려진 방법에 의하여 용이하게 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 유전자가 도입되는 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 속 미생물이면 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면, 상기 코리네박테리아 속 미생물에는, 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872, 코리네박테리움 써모아미노게네스 (thermoaminogenes) FERM BP-1539, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 (lactofermentum) ATCC 13869 및 이들로부터 제조된 균주를 포함하며, 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530이다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 코리네박테리움 속 미생물은 각각 도 1, 2의 개열지도를 갖는 벡터 pDZ-purNH, pDZ-ushA가 코리네박테리움 속 미생물에 순차적으로 또는 동시에 도입된 것일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 purNH 유전자가 염색체 내에 1카피 이상 삽입되어 포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라아제 및 IMP 사이클로하이드롤라아제 효소의 활성이 강화되어 있고, 더 바람직하게는 추가적으로 ushA 유전자가 염색체 내 염기 삽입으로 인한 프레임쉬프트에 의해 불활성화 된 것이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530에 도 1, 2의 개열지도를 갖는 벡터 pDZ-purNH 및 pDZ-ushA를 도입하고 선택배지에 배양하여, 2개 카피의 purNH 유전자가 염색체 내에 삽입되고 ushA 유전자에 하나의 염기가 삽입되어 불활성화된 균주를 얻었으며, 제작된 균주를 코리네박테리움 암모니아게네스 KCJ-0001(수탁번호 : KCCM10913P), KCCM-0002(수탁번호 :KCCM10914P)로 각각 명명하였다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 미생물을 이용하여 직접 발효법에 의하여 배양액내에 고수율로 5'-XMP를 직접 축적하여 생산하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 상기 본 발명에 따라 제조된 5'-XMP 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 세포 또는 배양물 중에 5'-XMP를 생산하는 단계; 및 상기 세포 또는 배양물로부터 5'-XMP를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고수율로 5'-XMP를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 5'-XMP를 생산하는 방법에서, 상기 비생물의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당 업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 본 발명에서 사용되는 배지는 글리세롤을 탄소원으로서 일부 혹은 전부 포함한다. 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있다. 특히 바람직한 탄소원은 포도당이다. 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소디움-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포생성을 억제 할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소, 또는 이산화탄소 가스를 주입한다. 배양물의 온도는 보 통 20 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: 염색체 삽입용 벡터( pDZ )를 이용한 유전자의 삽입방법

본 실시예에서는 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 이용하여 유전자의 염색체 삽입을 진행하였다. 코리네박테리움의 염색체로 뉴클레오티드를 삽입하기 위하여, 염색체상의 삽입되는 부위와 상동성을 갖는 시퀀스를 삽입하고자 하는 뉴클레오티드를 양 옆에 갖고 있는 pDZ 벡터를 제작한다. 염색체로 여분의 유전자를 삽입하기 위하여, 대상이 되는 유전자를 연속적으로 2 카피 포함하고 있는 pDZ 벡터를 제작하여, 도입할 균주에 전기펄스법으로 형질전환 후 카나마이신 (kanamicin) 25mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 뉴클레오티드와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다.

벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-B-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 푸른색을 나타내는가의 여부를 확인함으로써 가능하였다.

1차 염색체 삽입된 균주를 영양배지에서 진탕 배양 (30℃, 4시간) 한 후, 각 각 10^-4으로부터 10^-10으로 x-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 띄는데 반하여, 낮은 비율로 나타나는 백색 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차 (crossover)에 의해 삽입된 염색체상의 벡터 서열이 제거된 균주를 선별하였다.

이상과 같이 선별된 균주는 최종적으로 항생제 카나마이신에 대한 감수성 여부의 확인 및 PCR을 통하여 유전자 구조 확인 과정을 거쳐 최종 선정되었다.

실시예 1 : 5'- XMP 생산균주 코리네박테리움 암모니아게네스 KTCC -10530 유래 purNH 클로닝 및 염색체 삽입용 재조합 벡터 ( pDZ - purNH ) 제작

본 실시예에서는 NIH GenBank를 근거로 하여 purNH 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 _ AB003159)를 확보하고, 이에 근거하여 두 쌍의 프라이머 (서열 1-3)를 합성하였다.

코리네박테리움 KCCM-10530를 주형으로 하고, 상기 서열번호 7 내지 10의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 25회 반복하였다.

그 결과 2.7 kb의 purNH 유전자 두쌍 (purNH-A, purNH-B)을 얻었다. purNH-A는 서열번호 1과 2를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, purNH-B는 서열번호 2과 3를 프라이머로 하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO 클로닝 키 트(Invitrogen)을 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-purNH-A와 pCR-purNH-B 벡터를 얻었다.

서열 번호 1 cgg gat ccc gag gcg aag acg ata ttg agg aca g

서열 번호 2 acg cgt cga cgt ggg aaa cgc aga cga gaa ca

서열 번호 3 acg cgt cga cga ggc gaa gac gat att gag gac ag

상기 pCR 벡터에 purNH-A, purNH-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (purNH-A:BamHI+salI, purNH-B:SalI+salI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 purNH-A, purNH-B 유전자를 분리하였다. 다음으로 제한효소 BamHI과 SalI이 처리된 pDZ 벡터에 3조각 접합을 통하여, 최종적으로 purNH 2 카피가 연속적으로 클로닝된 pDZ-purNH 재조합 벡터를 얻었다. 도 1은 코리네박테리움 염색체 삽입용 pDZ-purNH를 나타내는 도면이다.

실시예 2 : purNH 삽입 균주 개발

제작된 pDZ-purNH 벡터를 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530 균주에 형질 전환하였다. 참고예 1에서 기술한 것과 같이 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 purNH 유전자의 바로 옆에 1 카피의 purNH 유전자를 추가로 삽입하여, 카피 수를 2개로 증가시킨 5'-XMP 생산균주를 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KCJ-0001으로 명명하고, 그를 2008년 1월 8일자 로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 구제 기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 기탁하였다(KCCM-10913P).

연속적으로 삽입된 purNH 유전자는 2 카피의 purNH 연결부위를 증폭할 수 있는 프라이머 (서열 4, 5)을 이용한 PCR로 최종 확인하였다.

서열 번호 4 tcg atg cct gca tct tgg

서열 번호 5 ggc gat aag gct tcg agt

실시예 3 : 5'- XMP 생산균주 코리네박테리움 암모니아게네스 KTCC -10530 유래 ushA 클로닝 및 염색체 삽입용 재조합벡터 ( pDZ - ushA ) 제작

본 실시예에서는 5'-XMP 생산능이 있는 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 5'-뉴클레오티다제를 암호화하는 유전자인 ushA의 유전자를 확보하였다.

국내 특허 10-2003-0091342을 근거로 하여 ushA 유전자의 염기서열 정보를 확보하고, 이에 근거하여 두 쌍의 프라이머 (서열번호 6 내지 9)를 합성하였다. 프라이머 7과 8의 양끝에 하나의 염기를 삽입하여 프라이머를 제작하여 염색체의 ushA 유전자 내부에 하나의 염기가 삽입되도록 디자인하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530을 주형으로 하고, 상기 서열번호 6 내지 9의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소 는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (stratagene)이고, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 25회 반복하였다.

그 결과 400 bp의 ushA 유전자 두쌍 (ushA-A, ushA-B)을 얻었다. ushA-A는 서열번호 6과 7를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, ushA-B는 서열번호 8과 9를 프라이머로 하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO 클로닝 키트 (Invitrogen)를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-ushA-A와 pCR-ushA-B 벡터를 얻었다.

서열 번호 6 g acg gcc agt gaa ttc gac cgc ggc tat gac gat ttg ctc

서열 번호 7 agt gca gtg tct aga acc atc acg ttc gat gat gcc ctg c

서열 번호 8 cgt gat ggt tct aga cac tgc act ggg cgc agg ggc atg a

서열 번호 9 a tgc ctg cag gtc gac gta cgc cac cag cat tca taa tgc

상기 pCR 벡터에 ushA-A와 ushA-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (ushA-A:EcoRI+xbaI, ushA-B:xbaI+salI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 ushA 유전자를 분리하였다. 다음으로 제한효소 EcoRI과 SalI이 처리된 pDZ 벡터에 3조각 접합을 통하여, 최종적으로 ushA 유전자 내부에 하나의 뉴클레오티드가 삽입되어 클로닝된 pDZ-ushA를 제작하였다. 도 2는 코리네박테리움 염색체 삽입용 pDZ-ushA 벡터를 나타내는 도면이다.

실시예 4 : purNH 삽입 및 ushA 유전자 불활성화 균주의 제작

제작된 pDZ-ushA 벡터를 코리네박테리움 암모니아게네스 KCJ-0001(KCCM-10913P) 균주에 형질 전환하고, 참고예 1의 방법으로 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 ushA 유전자 내부에 하나의 염기가 삽입되어 불활성화된 생산주를 제작한 후 이를 코리네박테리움 암모니아게네스 KCJ-0002로 명명하였으며, 그를 2008년 1월 8일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 구제 기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 기탁하였다(KCCM-10914P).

유전자의 뉴클레오티드 변이는 변이된 부분을 프라이머 서열로 포함하는 서열번호 10과 11의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.

서열 번호 10 tcg aac gtg atg gtc

서열 번호 11 gta cgc cac cag cat tca taa tgc

실시예 5 : purNH 삽입 및 ushA 유전자 불활성화 균주의 5'- XMP 생산

실시예 2와 4에서 최종적으로 제작된 5'-XMP 생산균주인 코리네박테리아 암모니아게네스 KCJ-0001(KCCM-10913P)과 KCJ-0002(KCCM-10914P)를 5'-XMP 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 하기 종 배지 3ml을 함유하는 14ml 튜브에 코리네박테리움 암모니아게네스 모균주 KCCM-10530, KCJ-0001(KCCM-10913P)와 KCJ-0002(KCCM-10914P)을 접종하고 30℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.

하기의 생산배지 32 ml (본배지 24ml + 별살배지 8ml)을 포함하고 있는 250 ml 코너-바플 플라스크에 0.4 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 96 시간 동안 230 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 5'-크산틸산의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530, KCJ-0001(KCCM-10913P)와 KCJ-0002(KCCM-10914P)에 대한 배양액 중의 5'-XMP 결과는 아래 표1 과 같다.

균주명	KCCM-10530	KCJ-0001 (KCCM-10913P)	KCJ-0002 (KCCM-10914P)
5'-XMP (g/l)	28.6	29.7	30.3

종배지: 포도당 30g/l, 펩톤 15g/l, 효모엑기스 15g/l, 염화나트륨 2.5g/l, 우레아 3g/l, 아데닌 150mg/l, 구아닌 150mg/l, pH 7.2

생산배지 (본배지): 포도당 80g/l, 황산마그네슘 10g/l, 황산철 20mg/l, 황산아연 10mg/l, 황산망간 10mg/l, 아데닌 30mg/l, 구아닌 30mg/l, 비오틴 100μg/l, 황산구리 1mg/l, 티아민염산염 5mg/l, 염화칼슘 10mg/l, pH 7.2

생산배지 (별살배지): 인산제1칼륨 10g/l, 인산제2칼륨 10g/l, 우레아 7g/l, 황산암모늄 5g/l

상기 표 1 에서 나타낸 바와 같이, KCJ-0001(KCCM-10913P)과 KCJ-0002(KCCM-10914P)는 모균주 KCCM-10530에 비하여 5'-XMP 생산이 1.7 g/l 증가되었음을 확인 할 수 있었다.

도 1은 pDZ 벡터에 purNH 유전자를 클로닝하여 제작한 pDZ-purNH 벡터의 구조를 나타낸다.

도 2는 pDZ 벡터에 ushA-A와 ushA-B 유전자를 클로닝하여 제작한 pDZ-ushA 벡터의 구조를 나타낸다.

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> A Microorganism of corynebacterium genus having enhanced xanthosine 5'-monophosphate productivity and method of producing xanthosine 5'-monophosphate using the same <130> PA07-0408 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgggatcccg aggcgaagac gatattgagg acag 34 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acgcgtcgac gtgggaaacg cagacgagaa ca 32 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acgcgtcgac gaggcgaaga cgatattgag gacag 35 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcgatgcctg catcttgg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggcgataagg cttcgagt 18 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gacggccagt gaattcgacc gcggctatga cgatttg 37 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 agtgcagtgt ctagaaccat cacgttcgat gatgccctgc 40 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgtgatggtt ctagacactg cactgggcgc aggggcatg 39 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atgcctgcag gtcgacgtac gccaccagca ttcataatgc 40 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tcgaacgtga tggtc 15 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtacgccacc agcattcata atgc 24 <210> 12 <211> 2900 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 12 cagtggacta cattgatggt gaggtcgaag aagagacatc cgttgccaac gagggtggct 60 cccagggtga ggcagtctcc gttggagcaa tgtcggagga gctgatcgat aatttggaag 120 atggttcctt ccccgatgag gtgccaggcg aagacgatat tgaggacagg atcggtactg 180 ctacgcatga gccaagcgat ggagatgcca ataacgagcc cagcgtcgaa gacgttgaca 240 tcgacaatgc agagcaaacc gcggaagggg tattgccaaa ctctgacaac ggagcccaag 300 aagctgcgga aaatgacaca gaagcttctg gggtcgagca cgctgatgat ggccacgatg 360 gccaacagca aagcgatgag gacgataaaa caggcaaaga tacccaataa gaggggataa 420 gttgtcctct tttccgtggt ggaggaaaaa ttggcggcat cgtttcgtcc tcgaaagggc 480 tacagactag tctttaacac gtgactgaat cgccttcgca agttttgaaa gcacaagacc 540 cgcttcaagt agtggtgctg gtatctggca ccggatcttt gctgcaaaat attatcgaca 600 accaagatga ctcctatcgg gttatcaagg tagtcgcgga taagccctgc ccggggatta 660 accgagccca agatgcaggc atcgacaccg aagtcgtgct tttaggctca gaccgcgcgc 720 agtggaacaa agaccttgtc gcagcggttg gtaccgccga tgttgtggtg tccgctggat 780 ttatgaaaat cctggggcct gaattcttgg ccagctttga aggccgcaca ataaatacgc 840 atcccgcact cctgccgtcc tttccgggcg cgcatggagt acgggatgcg ttggcttatg 900 gcgtgaaagt caccggctct actgtccatt ttgtggacgc gggagtcgat actggccgca 960 tcatcgcaca acgcgcagta gagattgagg cagaagatga tgaggcaagc ttgcatgagc 1020 gcatcaaaag cgtcgaacgt gagcttatcg tgcaggtctt acgcgcagcg aatgttcaag 1080 accagcaact tattattgag atttaaacca gatttcccac agtcaggaag gcaaggcttt 1140 catccatgag tgatgaccgc aagcagatca agcgtgcact aattagcgtt tatgacaaga 1200 cagggctcga agagctcgct cgcacgcttg acagcgcagg cgtagagatt gtgtccaccg 1260 gctccaccgc cgccaagatt gctgatcttg gtattaacgt cactccggtt gaatctctca 1320 ccggattccc agagtgcctc gaaggccgcg ttaagacctt gcacccacgc gtgcatgcgg 1380 gcattttggc tgatacccgc aagccggatc accttaatca gctggaagag cttgagattg 1440 agccattcca gttggtcgtg gttaacctgt acccatttaa agagactgta gcttctggcg 1500 cagacttcga tggttgcgtc gagcagattg atatcggcgg tccatccatg gtccgtgctg 1560 ctgccaagaa ccacccatcg gtggcggttg ttgtagaccc agcgcgttac ggcgacatcg 1620 ctgaggctgt cgctcagggc ggattcgatc tggcgcagcg tcgtcagctg gccgcgactg 1680 cgtttaagca cacggcagat tatgatgttg cagtttctgg ctggtttgcc cagcagcttg 1740 ccgatgactc tgttgcctct gctgagcttg aaggcgacgc gctgcgttat ggtgagaacc 1800 ctcaccagca ggcttccatc gttcgtgaag gcacgaccgg tgttgctaat gcgaagcagc 1860 tgcacggtaa ggaaatgagc tacaacaact accaggacgc ggatgccgca tggcgcgcgg 1920 cttgggatca tgaacgtcca tgtgtagcaa ttattaagca cgctaaccct tgcggtatcg 1980 ctgtttctga tgagtccatc gcagcagcac acgcagcggc acacgcctgt gacccaatgt 2040 ccgctttcgg tggcgttatt gcggtcaacc gcgaagtcac caaggaaatg gcaacccagg 2100 ttgctgacat cttcaccgag gtcatcatcg caccgtccta cgaagatgga gccgtcgaga 2160 ttttgcaggg caagaagaat attcgcatcc ttgttgttga gcatgaagta ccagcagtag 2220 aggtcaaaga aatctctggt ggccgtctgc tgcaggaagc agacgtttac caggctgagg 2280 gcgataaggc ttcgagttgg actttggctg ccggcgaagc tgcatccgag gaaaagctcg 2340 cggagctgga attcgcttgg cgcgcagtac gctcggtaaa gtccaacgcc atcttgttgg 2400 cgcatgaagg tgcaaccgtt ggcgtgggta tgggccaggt caaccgcgtt gattcggcga 2460 agttggctgt tgaccgcgcg aatactttgg ctgattccgc agagcgtgct cgcggttccg 2520 tcgcagcatc ggatgcgttc ttcccattcg ccgatggctt gcaggtgctt atcgatgccg 2580 gcgtttccgc cgttgtccag cccggcggct ccatccgcga tgaagaagtt attgctgccg 2640 ctgaagcagc cggtatcacc atgtacttca ctggcacccg ccacttcgcg cactaaagct 2700 ttcctccgct tcgcgtccgg gaagctttag cccggaagag atagcaaaag gggcctgttc 2760 acccgcaatt ttaacggtgt gaacaggccc cttggctttc tagagctcga cttttaaata 2820 tcgagcttta agcgtcgatg ttctcgtctg cgtttcccag ccacggcgcg atgacctggt 2880 ctgacttctt cggacaacaa 2900 <210> 13 <211> 2615 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 13 taccaacgcg gataagctca agagcgaacc agagcgcatg gcgcaggttg agtgggaaca 60 aggaaagtcg tcttccggtg ctttcgctgc aaccttgcag ctagaagcgc tcgataggca 120 aggcctgctc tttgaggtca ccaaggtatt taccgaagcg aagctgaacg tattatccat 180 gcgctcggtt cgaggtgaag accatattgc gaccctgcag tttacttttt cggtctcaga 240 taccaagcag cttggttctt tgatgacaac gttgcgtaat actgaaggcg tattcgacgt 300 ctatcgcgtg actgcttagt tgccccttct gcggggtagc taagccacta gcaggtggcg 360 tgaagttaaa gctgtggtga attattttca tcgacgcggt aaatgcggag gtggtgcaaa 420 accattgcac tgcttagata atttaaaggc gatataaaga ctcctgtaag taatttctca 480 ttattctcac aggagaaccc gtgtctaagt ttcgccgttt tggccgtctg ctggctgcaa 540 ccaccgtatc cgccaccatc gtagttggcg cgcccgtagc ctttggtcaa gaagataatg 600 ttgttgattt ctcagtcacc aatatcactg acttccatgg ccacctttct acgcaggagg 660 ctgacgctcc tgatgccaac tcagagatgg gggcggccaa gctcaaggaa ctgattgagt 720 acgttaatca ggaccaggaa tacatcatga ctacctccgg cgataacgtc ggcggtagcg 780 ctttcgtctc ggcaatcgct gatgatgagc caaccctaga tgtcctcaac atgctcggcg 840 ttgacgtctc tgcggtaggt aaccatgaat tcgaccgcgg ctatgacgat ttgctcggtc 900 gtattgctga aaaatccgcc tacccattgc tgggcgcgaa tgtcacctta aacggtgaac 960 cgatgttgga tgcttcctac gttcaagaaa ttgacggcgt caaggtggga tttgtcggta 1020 ctgtgaccac cttgactaag gacaaggtcg caccatccgc agttgaaggt gtggagtttt 1080 ctgaccccgt cgaggctacg aataaggaat ctgaccgtct gaaggaatct ggcgaagcag 1140 acgttgttgt agcgctcatg cacgaggacg cgcagcagta cgctgctggc ttcaacaaca 1200 atgtggatat ccttttcgga ggcgactctc accagcgctc gcagggcatc atcgaacgtg 1260 atggtgcgca gccactgcac tgggcgcagg ggcatgaata tggcaaggtt ctccaagacg 1320 ccgatatttc ctttaacaag gacaccggcg aaattgagtc cgtcgaaatc acccagtacg 1380 accgctcgat gcctgaggtt gaagcactag cccctgatgc agaaattgcc gctcgcgtgg 1440 cagccgctga ggcagaagct gaagagcttg gagctaaagt tgtcggccag atggaccgcg 1500 ctactttccg tggtcaagat gagggcgcag gagcggggag caaccgcggt gttgaatcta 1560 cgttgaactc gctaattgct gatgccaacc gcgcatcagt tgctaaggcg actggtgcgg 1620 acgtggattt gggcattatg aatgctggtg gcgtacgtgc tgaccttcct gcaggcgatg 1680 tcactttcca ggatgtgctt accgtgcagc ctttcggcaa ttcgattgca tacggcactt 1740 tgaccggcca agatattttg gatgctttgg aagctcagtg gcagccagga tcgtctcgtc 1800 cacgcttggc tttgggtcta tctgctggat ttgagtacgc ctacgaccca actgcagagc 1860 aaggccagcg cgttatctcc gcgaccttgg atggcgaaga aattgaccca tcagcggaat 1920 acactgttgc aacttccacg ttcctcttcg atggtggcga caacttcgca tctctggcca 1980 atgtccaaaa cctcactgac gtgggctaca tggactactc agttctcaat gactacatca 2040 aagatggcgc agaggtacag gaaggccagt ctgatatcgg tatcagcacc gaaggcaccc 2100 tggcagctgg tgaagaagtt accttcaacc tcacctcgct taactacact atggaagaag 2160 atccacaagc caccacagcg accgtcaccg tgggcgacgt gcaagaaacc gccgatatcg 2220 acgctcagtg gaatgctgaa gaagatccgc agaagaatga atttggccgt gctagcgtaa 2280 cgctgactct gccagaggac attgaggaaa ccgacttggt taccgtaacc accgatgccg 2340 gcaccgagat tactgtgccg ctgagggcct tgggcaccaa cgagggcacg gacggcggct 2400 ccaatcctgg cagcagcgca cctggcacag gtaagggctc ttctcggggt gcttcggctg 2460 ctgcaggaat cgctggagtg ttggcagcga ttgcgggcat cgccgcgttt attggtctga 2520 acggtcagtt tgatcagttc atcccagcta acatgcagcg cgctcttggt gacctgcgca 2580 gtcagctcaa cgaggttagc cacatcaaat tctag 2615

Claims

포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라제(phosphoribosylglycinamide formyltransferase) 및 이노신산 사이클로하이드롤라아제(inosinic acid cyclohydrolase) 효소를 암호화하는 purNH 유전자가 염색체 내에 2 카피 이상 존재하여 상기 효소의 활성을 강화시킴으로써 5'-크산틸산의 생산능이 향상된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,

상기 purNH 유전자는 서열번호 12의 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,

상기 효소의 활성이 코리네박테리움 속 미생물이 천연상태로 가지고 있는 내재 purNH 유전자에 더하여 1 카피 이상의 purNH 유전자가 새로 도입됨으로써 강화된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,

추가적으로 5'-뉴클레오티다제 (5'-nucleotidase)를 암호화하는 ushA 유전자의 활성이 불활성화된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제4항에 있어서,

상기 ushA 유전자가 서열번호 13의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제4항에 있어서,

상기 ushA 유전자의 활성이 치환, 결손, 삽입에 의해서 불활성화된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제4항에 있어서,

상기 ushA 유전자의 활성이 염색체의 ushA 유전자 내부에 하나의 염기가 삽입됨으로써 불활성화된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,

상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KCCM-10530인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,

상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네 스(Corynebacterium ammoniagenes) KCJ-0001 (수탁번호 : KCCM-10913P)인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,

상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) KCJ-0002 (수탁번호 : KCCM-10914P)인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물.
포스포리보실글리신아마이드 포밀트랜스퍼라제(phosphoribosylglycinamide formyltransferase) 및 이노신산 사이클로하이드롤라아제(inosinic acid cyclohydrolase) 효소를 암호화하는 purNH 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
내부에 임의의 염기가 삽입된 5'-뉴클레오티다제 (5'-nucleotidase)를 암호화하는 ushA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제1항에 따른 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 세포 또는 배양물 중에 5'-크산틸산을 생산하는 단계; 및

상기 세포 또는 배양물로부터 5'-크산틸산을 회수하는 단계;

를 포함하는, 5'-크산틸산을 생산하는 방법.