KR20090075395A - 프로폴리스 나노입자 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소수성 코어와 친수성 쉘로 이루어진 중합체 나노입자와 그의 소수성 코어에 적재된 프로폴리스로 구성된 프로폴리스 나노입자 조성물에 관한 것으로, 이는 수성 매질에 손쉽게 분산될 수 있어 비경구 투여가 가능하고, 세포 생존 및 콜로니 형성을 억제함으로써 in vitro 췌장암 세포주의 활성을 저해하는 효과가 있다.

나노입자, 프로폴리스, 프로폴리스 나노식품

Description

프로폴리스 나노입자 조성물{A Composition of Propolis Nanoparticles}

본 발명은 프로폴리스 나노입자 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 소수성 코어와 친수성 쉘로 이루어진 중합체 나노입자와 그의 소수성 코어에 적재된 프로폴리스로 구성된 프로폴리스 나노입자 조성물에 관한 것이다.

나노식품(Nanofood)은 전통적인 식품과학이 그동안 간과해 왔던 양자역학분야의 새로운 접근 방식으로 식품소재의 물성을 나노 단위에서 분석하고 이를 응용하여 생체에 안정하게 흡수·전달될 수 있는 기능성을 보유한 식품이라고 정의할 수 있으며, 좀더 자세하게 나노식품은 나노기술 영역에 시스템을 구축하고 고안하여 유용물질을 생산하거나 새로운 성질과 현상을 이용하여 신소재를 생성하는 기술로 만들어진 기능성 식품이라고 말할 수 있다.

따라서 식품분야에 적용한 나노기술은 분자와 원자 차원의 극미세 기술로써 그 동안 마이크로 수준에서 논의되어왔던 식품과학을 전혀 예측하지 못했던 다른 성질로 바꿀 수가 있게 되어 선진국에서는 이 기술을 이용한 연구가 한창이다.

최근 식품가공 분야에서 가장 빠르게 확산되고 있는 나노식품 기술은 나노입자화 기술을 이용한 제품 응용이다. 즉, 현재 개발 중이거나 출시되고 있는 나노식품은 하향식 나노기술을 천연물 소재에 적용시켜 만든 식품이 대부분이다.

많은 생물현상은 나노 단위에서 발생된다고 볼 수 있다. 우리의 인체를 구성하는 핵산과 단백질 그리고 각종 영양소는 식품 섭취를 통하여 소화기관이라는 화학공장에서 분해·합성 과정을 거쳐서 생성되고 이들은 생명기능을 집행하는 중요한 나노 성분으로 이루어져 있는 가장 좋은 천연 나노식품 소재이며 인체 세포는 진정한 의미의 '나노식품 가공공장'이라고 할 수 있다. 또한, 인체 세포는 오랜 태고적부터 나노 단위의 수준에서 생명활동을 수행해 왔다.

효소들은 나노 단위로 영양소를 처리하며 단백질은 대략 30나노, 아미노산은 0.5나노 정도의 크기이다. 모세혈관은 한 층의 세포로 되어있고 세포들의 연결 부분에 미세한 혈관 구멍들이 있다. 이 구멍들의 크기는 조직에 따라 편차가 있지만 대략 200~600나노 정도이고 이 구멍을 통해 영양물질들과 백혈구가 이동한다.

지금까지의 식품가공 기술은 체내의 흡수에 대해서는 소홀한 면이 없지 않다. 실제 소화효소에 의해 충분히 분해되지 않은 영양소는 위와 장에서 흡수되지 않는다. 칼슘과 같은 미네랄처럼 원래 녹기 어려운 성분은 섭취량에 비해 흡수율이 매우 낮다.

특히 철분 결핍증은 개인의 씹는 습관과도 관계가 있는데 음식물을 충분히 씹어 삼키는 것이 중요하다. 그러나 아무리 잘 씹는다고 하더라도 세포의 입장에서는 여전히 커다란 덩어리일 뿐이다. 흡수율을 최상으로 높이고 안전하게 세포의 각 기관에 전달하고자 개발된 것이 바로 나노식품인 것이다.

나노기술을 식품에 적용하면 기존에 섭취가 어려운 식품소재를 일부가 아닌 전체로서 섭취가 가능하고 화학적으로나 열처리에 의해 제조되는 가공식품을 생식 그 자체로 섭취할 수 있으며 특정 영양성분에 특이 성질이 부여되도록 할 수 있을 것으로 보고 있다. 또한, 나노 입자를 캡슐화 함으로써 변질을 방지할 수 있을 뿐만 아니라 인체 내의 주요 작용 부위의 조절이 가능해질 것으로 전망되고 있다.

나노식품의 큰 장점은 소화 흡수율의 증가, 식품의 자연적 고유 성분을 물성 변화 없이 인체에 전달, 소량으로 영양성분의 효율적 이용이 가능하다는 것이다.

이러한 장점을 가질 수 있는 것은 나노 기술이 용해도를 증가시켜 생체이용률을 최상으로 끌어올릴 수 있기 때문이다. 이는 나노 입자가 물과 지방에 모두 친화력(duo-solubility)을 갖고 있기 때문에 가능한 것이다.

또한, 나노화된 영양소는 표면적이 증가하여 소화효소의 작용을 많이 받으며 물과 기름에 이중의 용해성을 가지게 되어 생체 이용률이 몇 배로 높아지므로 더 적은 양으로도 충분한 효과를 거둘 수 있다.

이외에도 나노식품은 식품의 자원을 절약할 수 있고, 폐기물이 없고, 에너지 절감 효과가 있으며 화학용매를 사용하지 않는다는 장점을 지니고 있다.

나노기술이 표면적 증대·음용용이·균일화향상·비가열 살균을 가능하게 하는 등 종래의 식품 제조에선 실현하기 어려웠던 문제를 해결할 수 있기 때문에 건강식품을 비롯한 식품분야에서도 제품개발에 응용되기 시작했지만 몇몇 종류의 건강식품 소재들을 나노화하게 되면 소재의 특성이 바뀌는 단점이 있다. 예를 들면 소재의 흡수율이 크게 향상되면 의약품과의 경계가 애매한 건강식품도 나올 수 있게 된다든지 콩을 나노화할 경우에는 당도가 높아지는 현상 등이다.

또한. 유기물로 이루어진 식품소재의 특성상 구성성분의 분포가 복잡하며 외부환경에 의한 변화 가능성이 크기 때문에 식품소재를 나노화 한다는 것은 큰 어려움이 있다.

요즘 유행하는 나노상품은 거의 수십~수백 나노 입자들을 이용한 것들이 많다, 금이나 은 입자를 잘게 부숴 제품 표면이나 필터 등에 붙이거나 섞는 형태가 일반적이다. 물론 그 기능과 효과가 입증된 사례도 많다. 하지만 모두가 제대로 기능과 효과를 발휘하는 것은 아닌 것 같고 특히 인체에 안전하며 자연에 해가 미치지 않는지 등 아직 검증되고 있지 못한 부분도 많다.

지난 10년 동안, 약물 전달 분야는 나노테크놀러지의 출현에 힘입어 대변혁을 일으킨 바 있으며, 세포 및 조직을 목표로 하는 치료 화합물을 위한 불활성 구조적 담체(systemic carrier)로서 생물학적 적합성의 나노입자들이 개발되었다.

약물 전달에 있어 나노의약에 대한 최근의 예는 파클리탁셀(paclitaxel)의 알부민 나노입자 공액체로서 이러한 신흥 약물 제형 군 중 최초로 FDA에서 승인된 항암제인 아브락산(Abraxane)(상표명)의 성공으로 뒷받침되고 있다.

프로폴리스는 러시안페니실린 또는 천연페니실린이라고도 불리는 매우 복잡한 화학 조성을 갖는 꿀벌 생성물로서, 고대로부터 전통 의약에 사용되어 왔다. 꿀벌은 벌집의 틈이 난 곳에 프로폴리스를 발라 병균이나 바이러스로부터 스스로를 보호하고, 말벌이나 쥐와 같은 적의 침입을 막는다. 이로써 산란과 성장, 꿀의 숙성과 보관 등에 알맞은 서식처를 유지한다. 특히 여왕벌이 산란할 때에는 일벌이 산란장소를 소독할 때 사용해 청결하게 한다.

이러한 프로폴리스는 기원전 약 300년 이집트에서 사용했다는 기록이 있을 정도로 오래전부터 인류가 화농방지제로서 사용해왔다. 최근에는 1965년 프랑스의 의사 레미 쇼방이 꿀벌의 몸에 박테리아가 없음을 연구하던 중 프로폴리스가 천연항생물질임을 알아냈다.

프로폴리스의 성분으로는 유기물과 미네랄(무기염류)이 가장 많으며 이와 함께 104종 정도의 성분이 들어 있다. 많은 성분 중에서 미네랄·비타민·아미노산·지방·유기산·플라보노이드 등은 세포대사에 중요한 역할을 하며, 테르펜류 등은 항암 작용을 한다. 특히 100종류가 넘는 플라보노이드가 들어 있어 건강 증진에 큰 도움을 준다.

주요한 효능으로는 항염·항산화·면역증강 등이 있다. 항염 효과를 내는 것은 사람의 몸에 염증을 일으키는 프로스타그란딘을 만들어내는 효소를 절반까지 줄이기 때문이다. 또 주요 성분인 플라보노이드가 활성산소를 없애기 때문에 항산화 효과가 있다. 항암 효과를 나타내는 케르세틴 등이 있어 암세포의 유전자가 복제되기 전에 차단하는 일을 한다.

한편, 프로폴리스는, 그의 항균 활성과 관련하여, 그람-양성 세균에 대한 효과 및 그람-음성 세균에 대한 제한된 작용으로 세균 성장을 저해한다. 프로폴리스의 항바이러스 활성은 아모로스 등(Amoros et al.)에 의해 연구된 바 있다. 또한, 프로폴리스는 주로 피부진균증(superficial mycosis)에 대하여 살균 작용을 나타낸다. 하지만, 면역 시스템에 대한 프로폴리스의 효과에 대해서는 거의 알려진바 없다. 쉘러 등(Scheller et al.)은 프로폴리스 에탄올 추출물이 마우스 비장 세포에서 항체 생산을 유도한다는 사실을 밝혀낸바 있다.

프로폴리스는 대식세포에 의한 in vitro 및 in vivo C1q 생산뿐만 아니라 이들 세포에 대한 보체 시스템 수용체의 작용을 조절한다. 이바노브스카 등(Ivanovska et al.)은 프로폴리스 성분들 중 하나인 신남산이 숙주 방어(host defense)에 작용하여 림프구 증식을 촉진시키고, IL-1 및 IL-2 생산을 유도한다는 사실을 관찰하였다.

프로폴리스의 암 치료에 대한 잠재적 용도에 부가하여, 다양한 실험적(화학적) 발암 모델에 대한 연구 및 가족성 선종성 폴립(familial adenomatous polyposis) 환자에게 수행된 임상에 대한 연구로부터, 프로폴리스가 다양한 기관 부위에서 암으로 진행되는 것을 완화시킬 수 있어서, 화학예방용 수단으로서 프로폴리스의 잠재력을 반복구현할 수 있음이 확인되었다.

프로폴리스가 효능 있고 안전한 암 치료 및 화학예방용 화합물이라는 유력한 가능성에도 불구하고, 암 커뮤니티에서 ‘만병통치약’으로서 받아들어 지지는 않고 있다. 이러한 제한에 대한 가장 중요한 일례는, 프로폴리스를 경구투여하면 생체이용가능성이 감소하고, 그에 따라 치료적 효과가 본질적으로 관상 하부 위장관 지역(tubular lower GI tract)(즉, 대장암)에 국한된다는 것이었다.

예를 들어, 종래 임상 1상에서 결장암의 간장 전이(hepatic colorectal cancer metastases) 환자에게 프로폴리스가 1일 3,600mg씩 경구투여되고, 문맥 및 말초 혈액 중 프로폴리스 및 그의 대사체 수준이 HPLC로 측정되었다. 극미량 수준의 모화합물 및 그의 글로쿠로나이드 및 황산염 공액체가 말초 또는 문맥 순환에서 발견되었기 때문에 프로폴리스는 경구투여로는 거의 이용할 수 없었다.

다른 임상 1상 연구에서, 8 g 이하로 감지가능한 구조적 수준을 얻기 위하여 환자에게 유리 프로폴리스를 1일 당 8,000 mg 경구 투여하는 것이 필요했고, 부피가 큰 약물은 환자에게 투여할 수 없었다. 커큐민 투여량 확대를 포함한 또 다른 인간 임상 1상에서는 500 ~ 8,000 mg/day 투여량에서 프로폴리스의 흔적은 검출되지 않았고, 일 당 10~12 g의 프로폴리스를 섭취한 소수의 환자들에게서 단지 미량이 검출되었다.

유키히로 등(Yukihiro et al.)은 100회 이상 인용된 바 있는 그들의 문헌에서, 실험실에서의 인간 암세포주의 다혈증(plethora)에 대한 프로폴리스의 잠재력을 반복하여 언급한 바 있다. 마찬가지로 중요하게, 유리 커큐민은 암 세포주에 대해 치료적 효능을 나타내는데 필요한 투여량에서 간세포, 포유류 상피 세포, 신장 상피 세포, 림프구, 및 섬유아세포를 포함한 정상 세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않고, 이러한 in vitro 발견은 고도로 노출된 위장 점막에 대해서 조차도 1일 10g 미만의 투여량이 역효과를 최소로 나타낸 프로폴리스 경구 투여로 수행된 제한된 인간 임상에 의해 뒷받침되었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 작용제를 사용한 임상은 거의 실시된 바 없다. 최근 리포좀성 프로폴리스 제형이 유리 프로폴리스에 필적하는 잠재력을 나타내고, 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다고 보고되 었다. 이러한 리포좀성 프로폴리스 제형에 대한 추가의 연구들에서 예기된 바대로, 대사안정성 지질 응집체인 리포솜이 대부분의 나노입자들 보다 이질적인 경향이 있고 보다 큰 크기(전형적으로 100-200 nm)라는 사실이 강조되고 있다.

이러한 프로폴리스를 이용한 기술로는 수용성이 개선된 프로폴리스 추출물이 대한민국 특허공개 제1998-075409호(1998년 11월 16일 공개; 가부시키가이샤 하야시바라 세부쓰 가가쿠 겐쿠쇼 하야시바라 겐)에 개시되어 있고, 프로폴리스 추출물을 함유한 식품 및 그 제조 방법(대한민국 특허공개 제1997-0061106호), 프로폴리스 추출물이 함유된 건강식품의 제조방법(대한민국 특허공개 제1999-0076154호), 프로폴리스 추출물의 제조방법(대한민국 특허공개 제2000-0056792호), 프로폴리스 추출물이 제조방법(대한민국 특허공개 제2001-0073494호) 등이 개시된 바 있다.

하지만, 상기한 바와 같이 프로폴리스가 수용성이지 않기 때문에 프로폴리스를 경구투여하면 생체이용가능성이 감소하는 문제점을 개선하는데 관련된 시도는 개시된 바 없다.

이와 같이, 본 발명자들은 항염·항산화·면역증강 등에 효과가 있다고 알려진 프로폴리스를 중합체 나노입자에 적용하여 경구투여 이외의 방법으로 효과적으로 이용하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 프로폴리스를 비경구 투여가 가능하도록 한 전달 시스템의 개발하고, 이들의 식품 및 제약으로서의 이용가능성을 밝히는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 소수성 코어와 친수성 쉘로 이루어진 가교 중합체 나노입자를 제조하고, 그의 소수성 코어에 프로폴리스를 적재하여 캡슐화함으로써 100 nm 이하로 입도가 일정한 프로폴리스 나노입자 조성물을 합성하고, 그의 생리화학적 특성 및 그의 항암 용도를 밝힘으로써 달성되었다.

본 발명에서는 소수성 코어와 친수성 쉘로 이루어진 중합체 나노입자와 그의 소수성 코어에 적재된 프로폴리스로 이루어진 프로폴리스 나노입자 조성물을 제공한다.

본 발명에서 프로폴리스 나노입자 조성물에 있어서, 상기 중합체 나노입자는 N-이소프로필아크릴아미드(N-isopropylacrylamide; NIPAAM), N-비닐-2-피르롤리디논(N-vinyl-2-pyrrolidinone; VP) 및 폴리(에틸렌글리콜) 아크릴레이드[poly(ethyleneglycol) acrylate; PEG-A)로 이루어진 것이 바람직하다.

본 발명에서는 상기의 중합체 나노입자의 in vitro 및 in vivo 본태성 무독성 입증하여 소수성 약물을 위한 담체로서 이들 나노입자의 잠재력을 뒷받침하였다.

본 발명에서 프로폴리스 나노입자 조성물에 있어서, 상기 프로폴리스 나노입자의 입도가 1 내지 100 nm인 것이 바람직하다.

‘나노물질(nanomaterial)’에 대한 나노기술개발전략(National Nanotechnology Initiative; NNI)의 정의에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 프로폴리스의 나노입자 조성물은 상기의 입도 범위에서 안정하며, 50 nm 크기 범위에서 가장 안정한 것으로 나타났다.

또한, 본 발명에서는 상기 프로폴리스 나노입자 조성물을 유효성분으로 함유하는 프로폴리스 나노식품을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 프로폴리스 나노입자 조성물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 제제를 제공한다.

본 발명에서는 본 발명의 프로폴리스 제제가 반고체 아가(soft agar)에서 세포 생존 및 콜로니 형성을 억제함으로써 in vitro 췌장암 세포주에 대해서 유리 프로폴리스에 필적하는 효능을 갖는다는 사실을 밝혀냈다.

프로폴리스 나노입자 조성물은 프로폴리스의 유익한 효과가 제출되어 있는 인간 암의 구조적 치료법에 대한 길을 열었다. 따라서 본 발명에 관련된 실험 모델을 이용한 추가의 연구를 통해 이러한 시나리오를 in vivo 환경에 적용가능하게 할 것이며, 이렇게 잘 알려져 있지만 사용되고 있지 않은 치료적 작용제의 궁극적인 임상적 변용을 촉진시킬 것이다.

또한, 본 발명에서는 수용성 단량체인 NIPAAM, VP 및 PEG-A를 물에 용해시키는 단계;

질소(N2) 환경에서 APS, MBA 및 FAS를 이용하여 상기 NIPAAM, VP 및 PEG-A를 중합시켜 공중합체 나노입자를 제조하는 단계;

상기 공중합체 나노입자를 투석하여 미반응 단량체를 제거하는 단계;

상기 공중합체 나노입자를 동결건조하여 공중합체 나노입자 건조분말을 제조하는 단계; 및

상기 공중합체 나노입자 건조분말을 물에 용해시킨 후, 여기에 유기용매에 용해된 프로폴리스를 교반과 함께 고주파처리하면서 가하여 프로폴리스를 나노입자의 소수성 코어에 물리적으로 포획시키는 단계

로 이루어진 프로폴리스 나노입자 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 NIPAAM, VP 및 PEG-A의 비율은 90:5:5인 것이 바람직하다.

본 발명의 프로폴리스 나노입자 조성물은 소수성 코어와 친수성 쉘로 이루어진 중합체 나노입자와 그의 소수성 코어에 적재된 프로폴리스로 구성되어, 이는 수성 매질에 손쉽게 분산될 수 있어 비경구 투여가 가능하고, 세포 생존 및 콜로니 형성을 억제함으로써 in vitro 췌장암 세포주의 활성을 저해하는 효과가 있어, 식품 및 제약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 예로 들어 보다 상세하게 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 중합체 나노입자의 제조

N-이소프로필아크릴아미드(NIPAAM)와 N-비닐-2-피르롤리돈(VP) 폴리(에틸렌글리콜) 및 모노아크릴레이트 (PEG-A)의 공중합체를 도 1에 도시한 바와 같은 자유 라디칼 중합을 통해 합성하였다.

NIPAAM, VP 및 PEG-A는 시그마 케미칼(St. Louis, MO)로 부터 구입하였다. NIPAAM은 헥산을 이용하여 재결정화시켰고, VP는 사용 전에 새로이 증류하여 사용하였으며, PEG-A는 n-헥산으로 3회 세척하여 임의의 저해제를 제거하였다. 밀리포어 워터(Millipore water) 및 다른 화학약품은 있는 그대로 사용하였다.

이어서, 수용성 단량체인 NIPAAM, VP 및 PEG-A를 물에 90:5:5의 몰비로 용해시켰다. 질소(N2) 환경에서 개시제로서 암모늄 퍼설페이트(ammonium persulphate)(APS, Sigma)를 이용하여 중합을 개시하였다. 황산 암모늄 제1철(ferrous ammonium sulphate)(FAS, Sigma)을 가하여 중합 반응을 활성화시키고, 단량체들의 완전한 중합을 확보하였다. 전형적인 실험 프로토콜에 있어서, NIPAAM 90 mg, 새로이 증류한 VP 5 μL, 및 PEG-A (1% w/v) 500 μL를 물 10 mL에 가하였다.

중합체 사슬을 가교시키기 위하여, N,N'-메틸렌 비스 아크릴아미드(N,N'-Methylene bis acrylamide)(MBA, Sigma, 0.049 g/ml) 30 μL를 단량체 수용액에 가하였다. 질소 가스를 30 분 동안 통과시켜 용존 산소를 제거하였다. 이어서, FAS (0.5% w/v) 20 μL, APS 30 μL 및 TEMED (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) 20 μL를 가하여 중합 반응을 개시하였다.

중합은 30℃에서 24 시간 동안 N2 환경에서 수행되었다. 중합이 완료된 후, 스펙트라포어(Spectrapore)(상표명) 막 투석 백(12 kD cut off)을 이용하여 전체 중합체 수용액을 투석하여 임의의 잔류 단량체를 제거하였다.

이어서, 투석된 용액을 즉시 냉동건조하여 후속 공정에서 이용하기 위한 손쉽게 수용성 매질에 재분산가능한 건조 분말을 수득하였다. 상기 프로토콜을 이용하여 얻은 중합체 나노입자의 수율은 전형적으로는 90% 이상이었다.

도 1에 개략적인 NIPAAM/VP/PEG-A 공중합체 나노입자 합성 공정을 도시하였다. 도 1에서 사용된 약어는 다음과 같은 의미를 갖는다(Bisht et al. Journal of Nanobiotechnology 2007 5:3):

NIPAAM = N-이소프로필아크릴아미드;

VP = N-비닐-2-피르롤리돈;

PEG-A = 폴리(에틸렌글리콜)모노아크릴레이트;

MBA = N,N'-메틸렌 비스 아크릴아미드;

APS = 암모늄 퍼설페이트;

FAS = 황화 암모늄 제1철;

TEMED = 테트라메틸에틸렌디아민.

실시예 2 : 공중합체 나노입자에 프로폴리스 적재

원료 프로폴리스로는 대한민국 소재의 타키온 나노테크사(Tachyon Nanotech Co.)의 천연 제품을 이용하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 중합체 나노입자 내로 프로폴리스 적재는 후-중합 방법을 이용하여 수행하였다. 적재 공정에 있어서, 공중합체 형성이 완료된 후 프로폴리스를 용해시켰다. NIPAAM/VP/PEG-A 중합체 나노입자에 프로폴리스를 물리적으로 포획시키는 공정을 다음과 같이 수행하였다:

냉동건조된 공중합체 나노입자 분말 10 mg을 증류수 10 mL에 분산시키고 교질입자가 재구성되도록 교반하였다. 유리 프로폴리스를 클로로포름(CHCl3; 10 mg/mL)에 용해시키고, CHCl3 중의 프로폴리스 용액을 일정하게 와동시키고 가볍게(mild) 고주파처리하면서 중합체 용액에 가하였다. 프로폴리스를 나노입자의 소수성 코어에 물리적으로 포획시켜 직접 적재하였다. 이어서, 프로폴리스-적재 나노입자를 후속 사용을 위한 건조 분말로 냉동건조시켰다.

실험예 1: 포획 효율( Entrapment efficiency ; EE %) 측정

NIPAAM-VP-PEG-A 나노입자중에 적재된 프로폴리스의 포획 효율을 다음과 같이 측정하였다: 나노세프(NANOSEP)(100 kD cut off) 막 필터를 이용하여 나노입자를 비포획 유리 프로폴리스로부터 분리하고, 여과물중의 유리 나노폴리스의 양을 35 nm에서 월락 플레이트 리더(WALLAC plate reader)를 이용하여 분광광도법으로 측정하였다.

E%를 다음식으로 계산하였다.

(%) = ([프로폴리스]전체 - [프로폴리스]유리)/[프로폴리스]전체 × 100

실험예 2: 중합체 나노입자의 FT - IR 분석

NIPAAM, VP 및 PEG-A 단량체 뿐만 아니라 보이드 중합체 나노입자의 중간 IR 스펙트럼을 브루커 텐솔(Bruker Tensor) 27 (FT-IR) 스펙트로미터 (Bruker Optics Inc., Billerica, MA, USA)를 이용하여 얻었다.

도 2는 공중합체 나노입자의 퓨리어 변형 적외선(Fourier transform infra-red; FTIR) 스펙트럼이다. (NIPAAM-VP-PA) 공중합체의 FTIR 스펙트럼은 완전한 중합 및 물리적 혼합물에 단량체가 존재하지 않음을 나타낸다. 세 가지 상업적으로 시판되는 단량체의 스펙트럼은 나타내지 않았다.

상기에서 얻은 NIPAAM, VP, PEG-A, 및 보이드(빈) 중합체 나노입자의 IR 스펙트럼을 이용하여 적절한 중합이 일어났는지 여부 또는 단량체들이 물리적 혼합물내에 존재하는지 여부를 측정하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 비닐 이중 결합의 스트레칭 모드에 상응하는 800~1000 cm-1 범위의 강한 피크들이 중합체의 스펙트럼에서 사라졌으며, 이는 중합이 일어났다는 사실을 지시한다. 중합체의 수화 및 용매와의 양이온 교환 공정에서 부착된 물은 3300 cm-1에서 넓고 강한 피크를 발생시켰다. 중합체 주쇄의 -CH- 스트레칭 진동은 2936 - 2969 cm-1에서의 피크를 통해 명백한 반면, 1642 및 1540 cm-1에서의 피크들은 각각 아미드 카보닐기 및 아미드 N-H기의 벤딩 주파수에 상응하였다. 1443 - 1457 cm-1 구역에서의 흡수 밴드는 CH3기의 밴딩 진동에 기인한 것이고, CH2기의 밴딩 진동은 약간 더 높은 구역에서 확인 할 수 있다.

실험예 3: 1H 핵자기공명( NMR ) 분석

브루커 어벤스(Bruker Avance) 400 MHz 스펙트로미터(Bruker BioSpin Corporation, Billerica, MA, USA)를 이용하여 시료를 D2O 용매에 용해시켜 NIPAAM, VP 및 PA 단량체뿐만 아니라 중합체 나노입자의 NMR 스펙트럼을 얻었다.

도 3은 공중합 나노입자의 핵자기공명(NMR) 스펙트럼을 나타낸 도이다. NMR 스펙트럼은 중합체 주쇄에 존재하는 상이한 양자들의 상응하는 시그널 피크들에 의해 명백한 바와 같이 공중합체의 형성을 추가로 확인시켜준다. 세 가지 상업적으로 입수가능한 단량체의 스펙트럼은 도시하지 않았다.

도 3에서, 본 발명자들은 전형적인 단량체들뿐만 아니라 형성된 공중합체의 1H-NMR 스펙트럼과 화학적 이동 어싸인먼트를 예시하였다. 형성된 공중합체 교질입자의 스펙트럼에서 단량체들의 비닐 말단기 양성자 공명이 부재에 의해 중합이 지시되었다. 오히려 공명은 상부 구역(δ = 1.4~1.9 ppm)에서 관찰할 수 있으며, 이는 중합체 네트워크의 포화된 양성자에 기인한 것일 수 있다. δ = 0.8.1.0 ppm에서의 넓은 공명 피크가 이소프로필기의 메틸 양성자를 형성시켰다. N-이소프로필아크릴아미드기의 메틸렌 양성자(>CH-) 및 폴리에틸렌 옥사이드의 메틸렌 양성자(>CH2-)에 대한 시그널 피크를 각각 3.81 및 3.72 ppm에서 관찰할 수 있었다.

실험예 4: 동적 광 산란( Dynamic light scattering ; DLS ) 측정

중합체 교질입자의 평균 입도 및 입도 분포를 측정하기 위한 DLS 측정을 나노사이저(Nanosizer) 90 ZS (Malvern Instruments, Southborough, MA)를 이용하여 수행하였다. 산란광 강도를 입사광에 대해 90°에서 검출하였다. 냉동-건조 분말을 수성 완충제에 분산시키고, 측정을 수행한 후, 수성 교질입자 용액을 평균 기공 크기 0.2mm(밀리포어)를 갖는 마이크로필터로 여과하였다. 모든 데이터 분석은 자동 모드에서 수행하였다. 측정된 크기를 각 회 당 세 차례 측정한 20 회 평균 값으로 나타내었다.

도 4A에서, 나노입자들의 전형적인 입도 분포를 예시하였고, 평균 입도는 좁은 입도 분포로 25℃에서 50nm 미만에 상당하였다.

실험예 5: 투과 전자 현미경 분석

80 kV 배율로 조작되는 히타치(Hitachi) H7600 TEM 장치를 이용하여 AMT CCD 카메라로 캡쳐된 1 K × 1 K 디지털 이미지로 중합체 나노입자의 TEM 사진을 얻었다. 간략하게, 냉동건조 분말 수성 용액 한 방울(5 mg/mL)을 여과지(Whatman No. 1)를 갖춘 막 코팅 격자 표면에 떨어뜨렸다. 1% 우라닐 아세테이트 한 방울을 탄소 코팅 격자의 표면에 즉시 가하였다. 1분 후, 과량의 유체를 제거하고, 격자 표면을 실온에서 공기 건조한 후 현미경에 장착하였다.

중합체 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 사진을 도 4B에 도시하였고, 이는 입자들이 구형 형태 및 직경 약 45nm로 낮은 다분산도를 가졌으며, 이는 DLS 측정으로 얻은 입도에 필적하는 것이었다.

실험예 6: 프로폴리스 나노입자 조성물의 in vitro 방출 동역학

냉동건조 중합체 나노입자 100 mg으로 캡슐화된 프로폴리스를 pH 7.4 인산염 완충제 10 mL에 분산시키고, 이 용액을 20 마이크로퓨즈 튜브에서 나누었다(각각 500 μL). 상기 튜브를 실온의 열 안정성 수조 세트에 보관하였다. 유리 프로폴리스는 물에 완전히 불용성이기 때문에 소정의 시간 간격으로 용액을 10분 동안 3000 rpm으로 원심분리하여 방출된(펠렛화된) 프로폴리스를 적재된 나노폴리스로부터 분리하였다. 방출된 프로폴리스를 에탄올 1 mL에 용해시키고, 흡수도를 450nm에서 분광광도계로 측정하였다. 이어서 방출된 프로폴리스의 농도를 에탄올 중의 프로폴리시의 표준 곡선을 이용하여 계산하였다. 방출된 프로폴리스 %를 다음 식으로 계산하였다.

방출 (%) = [프로폴리스]방출/ [프로폴리스]전체 × 100

여기서, [프로폴리스]방출은 시간 t에서 수집된 방출 프로폴리의 농도이고, [프로폴리스]전체는 나노입자에 포획된 프로폴리스의 전체 양이다.

나노입자 내로 프로폴리스의 포획 효율은 방법에 기술한 계산식을 기준으로 >90%인 것으로 밝혀졌다. 생리학적 pH에서 나노입자로부터 적재된 프로폴리시의 in vitro 방출 프로파일을 도 5에 나타내었다. 도 5는 프로폴리스 나노입자 조성물의 in vtro 방출 동역학을 나타낸 도로서, 프로폴리스 방출은 억제된 방식으로 일어나, 24 시간 동안 전체 프로폴리스 중 단지 40%만이 나노입자로부터 방출되었다. 오차 막대는 3회 수행된 시험의 평균 및 표준편차를 나타낸다.

실험예 7: 보이드 중합체 나노입자를 이용한 In vitro 및 in vivo 독성 연구

중합체 성분들로부터 새로운 독성의 가능성을 배제하기 위하여, 본 발명자들은 여덟 개의 인간 췌장암 세포포주 패널(MiaPaca2, Su86.86, BxPC3, Capan1, Panc1, E3LZ10.7, PL5 및 PL8)에 대해 보이드 나노입자를 이용하였다. 이들 세포를 보이드 나노입자에 20-배 농도 범위(93 . 1852 μg/mL)로 교차시켜 96 시간 동안 노출시키고, 하기에 기술한 바와 같은 MTS 분석에 의해 세포 생존력을 측정하였다. 또한 제한된 in vivo 독성 연구를 3 주 동안 매 주 현저히 높은 720 mg/kg의 투여량으로 보이드 중합체 나노입자를 아티믹(athymic)(nude) 마우스에 복강내 주사하여 수행하였다. 치료 과정 동안 복강 내로 프로폴리스 나노입자 조성물(N=4)이 투여된 마우스를 매주 계량하고, 평균 중량을 대조군 한배(littermate) 누드 마우tm(N = 4)의 평균 중량과 비교하였다. 3 주 과정의 최고점에서, 마우스를 안락사시키고, 중합체의 임의의 복강내 침착 또는 전체 기관 독성을 배재하기 위하여 부검을 실시하였다.

이상적인 프로폴리스 전달 플랫폼은 생분해성 및 생적합성이어야 하고, 부차적인 역효과와 관련이 없어야 한다. 보이드 공중합체 나노입자의 독성 프로파일을 in vitro 및 in vivo로 연구하였다.

여덟 개의 인간 췌장암 세포주 패널(도 6A)에서, 본 발명자들은 보이드 나노입자의 20-배 투여량 범위에 걸친 세포 생존력 분석에서 어떠한 독성도 발견하지 못하였다. 이어서, 본 발명자들은 전임상 종양 연구에서 통상적으로 사용되는 아티믹(‘누드’) 마우스에서 이들 입자의 효과를 연구하였다. 마우스를 무작위호 4 마리씩 두 개의 군-대조군 및 보이드 나노입자군(3 주 동안 매주 2회 720 mg/kg 투여)으로 나누었다. 도 6B에 도시한 바와 같이, 비교적 많은 투여량에도 불구하고, 보이드 나노입자가 투여된 마우스들은 체중 감소를 보이지 않았고, 부검시에도 전체 기관 변화를 보이지 않았다. 투여 동안 또는 후속 추적연구 동안 마우스에서 어떠한 동태적 변화도 보이지 않았다.

도 6은 보이드 중합체 나노입자의 독성 프로파일을 나타낸 그래프로서, A)는 일군의 8개 췌장암 세포주를 20-배 범위의 보이드 중합체 나노입자(93 - 1,852 μg/mL)에 노출시키고, 72 시간 후 생존력 분석 (MTT)을 수행한 것이다. 부형제로 처리된 세포와 비교하여, 중합체 나노입자에 노출된 세포는 아무런 세포독성도 관찰되지 않았다. B)에서는 중합체 나노입자(3 주 동안 일주일에 두 번 720 mg/kg을 복강 내 주입함)를 대조둔 마우스와 비교하여 일주일 간격으로 계량된(N = 4) 4 마리 아티믹 마우스 군에 투여하여 in vivo 독성 연구를 수행하였다. 체중에 있어 현저한 변화가 관찰되지 않았고, 부검 시 전체 독성도 분명하지 않았다. 오차 막대는 3회 수행된 실험에서의 평균 및 표준 편자를 나타낸다.

도 7에 도시한 바와 같이, 프로폴리스를 나노-캡슐화(nano-encapsulation)함으로써 프로폴리스가 수성 매질에 완전하게 분산성이 되도록 하였다. 도 7의 (a)에서 유리 프로폴리스는 수성 매질에 용해성이 열악하였으며, 육안으로 보이는 플레이크가 병내 떠다님을 볼 수 있었다. 반면에, 중합체 나노입자로 캡슐화된 등량의 프로폴리스 (b)는 수성 매질에 완전히 분산성이었다.

프로폴리스 나노입자 조성물은 췌장암 세포주의 성장을 저해하고, 콜로니 형 성을 억제한다. 유리 프로폴리스는 수성 매질에 용해성이 열악하여, 용액중에 육안으로 보이는 용해되지 않은 화합물의 플래이트가 보인다(도 7A 참조). 반면에, 프로폴리스 나노입자 조성물은 깨끗한 분산된 제형으로, 그의 색조는 프로폴리스의 천연 색상에서 유래한 것이었다(도 7B 참조). 본 발명자들은 프로폴리스 나노입자 조성물의 항암 특성을 보다 잘 특성화시키기 위해 모델 시스템으로서 인간 췌장암 세포을 이용하고, 그들의 효능을 유리 프로폴리스와 직접 비교하여 일련의 in vitro 관능 분석을 수행하였다. 암 유형의 선택은 췌장암 세포주에 대한 유리 프로폴리스의 활성을 확인한 다양한 기존의 보고서를 기준으로 하였다.

실험예 8: 췌장암 세포에 의한 프로폴리스 나노입자 조성물 흡수에 대한 형광 현미경 분석

프로폴리스는 본래 가시광선 녹색 스펙트럼에서 형광이다. 나노입자에 캡슐화된 프로폴리스의 흡수율을 연구하기 위하여, BxPC3 세포를 100nm 접시에 도말하고, 아유착(sub-confluent) 수준으로 성장되도록 하였다. 이어서, 세포를 프로폴리스 나노입자 조성물로 2.4 시간 동안 배양하고, FITC 채널에 시각화하였다.

도 8은 췌장암 세포주에 의한 프로폴리스의 세포내 흡수율을 나타낸 도로서, 형광 현미경 검사에 의해 미처리 대조구 세포 (b)와 비교하여 프로폴리스 나노입자 조성물로 배양된 BxPC3 세포 (a)에서 현저한 형광도의 증가가 관찰되었으며, 이는 (a)에서 프로폴리스의 세포 흡수율과 일치한다.

도 8A 및 8B에 나타낸 바와 같이, 중합체 나노입자로 캡슐화된 프로폴리스는 췌장암 세포에 의해 잘 흡수되고, 이는 축적된 세포질내(intra-cytoplasmic) 프로폴리스로부터 방출된 형광에 의해 지시되었다. 일군의 췌장암 세포주에 대하여 수행된 세포 생존력(MTT) 분석에 있어, 몇몇 세포주들이 본질적으로 시약에 저항성임에도 불구하고 프로폴리스 나노입자 조성물은 유리 프로폴리스(도 9)에 필적하는 효능을 안정되게 나타내었다. 프로폴리스 나노입자 조성물은 반고체 아가 분석에서 MiaPaca 췌장암 세포주의 집락형성을 차단하는 능력에 있어서 효과적이었다(도 10 참조). 미처리 세포 또는 보이드 중합체 나노입자와 비교하여, 유리 프로폴리스 및 프로폴리스 나노입자 조성물은 10 및 15 μM의 투여량에서 집락형성을 저해하였으며, 프로폴리스 나노입자 조성물의 효과는 보다 낮은 투여량에서도 다소 현저하였다.

실험예 9: 프로폴리스 나노입자 조성물에 노출된 췌장암 세포주에서 세포 생존력 분석

생장 저해율을, 생존 세포의 활성에 의해 착색된 포르마잔 생성물로의 테트라줄륨 화합물(MTS)의 전환율에 의존하는 셀티터 96(CellTiter 96)(상표명) 수성 세포 증식 분석기(Promega)를 이용하여 측정하였다. 간략하게, 2000 세포/웰을 96 웰 플레이트에 도말하고, 0, 5, 10, 15 및 20 μM 농도의 유리 프로폴리스 및 동량의 프로폴리스 나노입자 조성물으로 72 시간 동안 처리한 후, 분석을 중단하고, 상대 생장 저해율을 제조자의 프로토콜에 기술된 바와 같은 셀티터 96 시약을 이용하여 측정한 부형제-처리 세포와 비교하였다. 인간 췌장암 세포주 패널(BxPC3, AsPC1, MiaPaca, XPA-1, XPA-2, PL-11, PL-12, PL-18, PK-9 및 Panc 2.03)을 MTT 분석으로 조사하였다(이들 열 개 세포주의 공급원 및 배양 조건은 이미 공지된 바있다). 모든 실험은 세 차례 실시하여 평균 및 표준편차를 측정하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 프로폴리스 나노입자 조성물은 췌장암 세포주의 성장을 저해하였다. 인간 췌장암 세포주 패널에서 유리 프로폴리스 및 프로폴리스 나노입자 조성물을 등량의 투여량으로 이용하여 세포 생존력(MTT) 분석을 수행하였다. 72 시간 후 상기 분석을 중단하고, 세포 생존력의 비색정량(colorimetric determination)을 수행하였다.

여섯 개의 세포주 중 네 개, BxPC3, ASPC-1, PL-11 및 XPA-1가 프로폴리스 나노입자 조성물에 반응한 반면(10.15 μM 범위에서 IC50으로 정의됨), 두 개의 세포주 PL-18 및 PK-9는 프로폴리스-저항성이었다. 모든 분석은 3회 수행하였고, 평균±표준편차로 나타내었다.

실험예 10: 반고체 아가에서 콜로니 분석( Colony assays in soft agar )

유리 프로폴리스와 동량 투여량의 프로폴리스 나노입자 조성물을 이용한 치료법에 대하여 반고체 아가에서 콜로니 형성을 분석하였다. 간략하게, 혈청 보충 매질과 5, 10 또는 15 μM의 유리 프로폴리스 및 동량의 프로폴리스 나노입자 조성물을 함유한 1% 아가의 혼합물 2 mL를 35 mm 배양 접시에 가하고, 각각 고형화되도록 하였다. 이어서, 기부층의 상부에 보이드 중합체, 유리 또는 프로폴리스 나노입자 조성물의 존재하에 혈청 보충 매질과 10,000 MiaPaca2 세포를 함유한 0.7% 아 가의 혼합물을 가하고, 고형화시켰다(상부 아가)( 네 번째 세트의 플레이트는 어떠한 첨가제 없이 MiaPaca2 세포를 함유하였다).

이어서, 접시를 37℃ 및 5% CO2로 유지되는 조직 배양 인큐베이터에 14일 동안 보관하여 콜로니가 성장하도록 하였다. 모든 분석은 3회 수행하였다. 14일 째 콜로니 분석을 중단한 후, 플레이트를 염색하고, 콜로니를 ChemiDoc XRS instrument (Bio-Rad, Hercules, CA)로 계수하였다.

도 10에 도시한 바와 같이, 프로폴리스 나노입자 조성물이 췌장암 세포주의 집락형성(clonogenic) 잠재력을 저해한다. 상기한 바와 같이 반고체 아가에서 콜로니 분석을 수행하여 유리 및 프로폴리스 나노입자 조성물의 췌장암 세포주 MiaPaca에서의 집락형성 저해 효과를 비교하였다. 플레이트를 미처리 세포(UT), 보이드 중합체 나노입자-처리 세포(VP), 유리 프로폴리스-처리 세포(FP) 및 프로폴리스 나노입자 조성물-처리 세포(PN)로 나타내고, FP와 PN에는 등량의 10 μM 프로폴리스를 투여하였다. 모든 분석은 3회 수행하였고, 평균±표준편차로 나타내었다.

도 1은 NIPAAM/VP/PEG-A 공중합체 나노입자 합성 공정을 개략적으로 도시한 도이다.

도 2는 본 발명에 따른 공중합체 나노입자의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 공중합체 나노입자의 NMR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

도 4는 DLS 및 TEM 분석을 이용하여 측정한 본 발명의 중합체 나노입자의 입도 특성을 나타낸 도이다.

도 5는 본 발명의 프로폴리스 나노입자 조성물의 in vitro 방출 동역학을 나타낸 그래프이다.

도 6은 보이드 중합체 나노입자의 독성 프로파일을 나타낸 그래피이다.

도 7은 본 발명의 프로폴리스 나노입자 조성물이 수성 매질에 완전하게 분산성이라는 사실을 보여주는 사진이다.

도 8은 췌장암 세포주에 의한 프로폴리스의 세포내 흡수율을 나타낸 도이다.

도 9는 본 발명의 프로폴리스 나노식품의 췌장암 세포주 성장 저해 효과를 나타낸 도이다.

도 10은 본 발명의 프로폴리스 나노식품의 췌장암 세포주의 집락형성(clonogenic) 잠재력에 대한 저해효과를 나타낸 도이다.

Claims (8)

1. 소수성 코어와 친수성 쉘로 이루어진 중합체 나노입자와 그의 소수성 코어에 적재된 프로폴리스로 이루어진 프로폴리스 나노입자 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 중합체 나노입자가 N-이소프로필아크릴아미드(N-isopropylacrylamide; NIPAAM), N-비닐-2-피르롤리디논(N-vinyl-2-pyrrolidinone; VP) 및 폴리(에틸렌글리콜) 아크릴레이드[poly(ethyleneglycol) acrylate; PEG-A)로 이루어진 것을 특징으로 하는 프로폴리스 나노입자 조성물.
3. 제1항에 있어서 상기 프로폴리스 나노입자의 입도가 1 내지 100 nm인 것을 특징으로 하는 프로폴리스 나노입자 조성물.
4. 제1항에 있어서 상기 프로폴리스 나노입자 조성물이 수성 매질에 완전히 분산상이어서 비경구투여될 수 있음을 특징으로 하는 프로폴리스 나노입자 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프로폴리스 나노입자 조성물을 유효성분으로 함유하는 프로폴리스 나노식품.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프로폴리스 나노입자 조성물을 유효성분 으로 함유하는 항암용 약학적 제제.
7. 수용성 단량체인 NIPAAM, VP 및 PEG-A를 물에 용해시키는 단계;

   질소(N2) 환경에서 APS, MBA 및 FAS를 이용하여 상기 NIPAAM, VP 및 PEG-A를 중합시켜 공중합체 나노입자를 제조하는 단계;

   상기 공중합체 나노입자를 투석하여 미반응 단량체를 제거하는 단계;

   상기 공중합체 나노입자를 동결건조하여 공중합체 나노입자 건조분말을 제조하는 단계; 및

   상기 공중합체 나노입자 건조분말을 물에 용해시킨 후, 여기에 유기용매에 용해된 프로폴리스를 교반과 함께 고주파처리하면서 가하여 프로폴리스를 나노입자의 소수성 코어에 물리적으로 포획시키는 단계

   로 이루어진 프로폴리스 나노입자 조성물의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, NIPAAM, VP 및 PEG-A의 비율이 90:5:5인 것을 특징으로 하는 프로폴리스 나노입자 조성물의 제조방법.

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