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KR20090060183A - Ｆｌｊ２５４１６ 유전자의 신규한 용도 - Google Patents

Ｆｌｊ２５４１６ 유전자의 신규한 용도 Download PDF

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KR20090060183A
KR20090060183A KR1020080122892A KR20080122892A KR20090060183A KR 20090060183 A KR20090060183 A KR 20090060183A KR 1020080122892 A KR1020080122892 A KR 1020080122892A KR 20080122892 A KR20080122892 A KR 20080122892A KR 20090060183 A KR20090060183 A KR 20090060183A
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gene
cancer
flj25416
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flj25416 gene
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김선영
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이희구
송은영
김영호
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윤채옥
김문희
정경은
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한국생명공학연구원
주식회사 삼천리제약
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Abstract

본 발명은 FLJ25416 유전자 또는 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 진단용 또는 항암제 스크리닝용 조성물, 상기 유전자의 억제제 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료용 조성물, FLJ25416 유전자 또는 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 FLJ25416 유전자는 특정 암 세포에 다량 발현되고 정상세포의 증식 속도를 증가시키므로, 이들 유전자의 발현을 저해시키면 암세포의 성장을 억제시키는 작용 효과를 가져온다. 따라서 FLJ25416 유전자는 각종 암의 진단 또는 치료제의 표적 유전자로 활용될 수 있다.
FLJ25416, 암, siRNA

Description

ＦＬＪ２５４１６ 유전자의 신규한 용도 {Novel use of FLJ25416 gene}
본 발명은 FLJ25416 유전자 또는 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 진단용 또는 항암제 스크리닝용 조성물, 상기 유전자의 억제제 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료용 조성물, FLJ25416 유전자 또는 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트, 암 진단방법, 항암제 스크리닝방법에 관한 것이다.
인간 유전체 프로젝트 연구 결과, 인체의 질환을 분자 수준에서 이해하고 새로운 질환 관련 표적을 발굴하고 이를 이용한 신약을 개발하고자 하는 신개념의 바이오 생명공학 기술의 시대가 열리고 있다. 이에 따라, 유전적 환경이 다른 환자 개개인에 맞추어 각종 다양한 질병을 진단, 치료, 예측하는 맞춤의학 시대가 현실로 다가오고 있다. 맞춤의학에는 유전체 진단용 바이오마커의 발굴, 표적화 치료기술, 질병 특이적 약물작용점의 발굴, 표적 치료용 신약, 정확한 임상 정보, 환자의 유전체 정보, 유전체적 역학결과, 그리고 이들을 분석 통합할 수 있는 바이오인포매틱스 등이 상호보완적으로 구성된 약물 유전체기술 개발이 수반되어야 한다. 특 히, 맞춤의학에서 경쟁력을 갖추기 위해서는 질환과 개인에 대한 약물 예측 시스템, 진단 바이오마커 발굴, 새로운 표적유전자 및 단백질을 발굴하는 기초연구 및 이를 이용한 치료제의 개발이 중요하다.
최근, 전 세계적으로 난치병인 암의 생성 및 치료와 관련된 유전자의 기능 연구를 통해 치료용 표적을 발굴하고 이들을 진단 및 치료제 개발에 이용하기 위한 치열한 경쟁이 불붙고 있다. 게놈 연구의 활성화와 함께 인간 유전자 DNA 칩 또는 프로테옴 분석 연구가 활발하게 이루어지고 암과 관련된 유전자가 대량 발굴됨에 따라 많은 유전자들의 목록과 관련 데이터베이스는 구축되어 있으나 대부분 이들 유전자들에 대한 세포 내에서의 구체적 생물학적 기능 및 암 관련성은 아직 연구되지 않았거나 불확실하여 실제 암 관련성 또는 진단 및 표적 유전자로 활용하기에 상당한 어려움이 있다.
한편, 수많은 인간 유전자들의 기능에 대한 연구의 필요성이 부각됨에 따라 단순한 기능 및 형태 연구가 가능한 모델 생물체에 대한 활용도 및 관심은 더욱 높아지고 있다. 이에, 세포 내에서 일어나는 기본적이고 진화적으로 잘 보존되어 있는 기작을 이해하기 위하여 오랫동안 여러 분야에서 사용되어 왔던 모델 생물체 (model organism)를 암 진단 또는 치료용 타겟 발굴에 이용하는 연구가 진행되고 있다.
한편, 암세포에서 대량 발현된 유전자에 대해 RNAi (RNA interference) 실험 기법을 이용하면 치료용 암 타겟으로의 사용 가능성을 확실히 확인할 수 있다. RNAi는 다양한 형태의 올리고 이중 리보핵산 (miRNA, expressed dsRNA, synthetic siRNA)을 이용하여 세포 내에서 특이적으로 해당 염기서열의 mRNA의 분해를 유도하여 유전자의 기능이 나타나지 못하도록 하는 기법이다. 이렇게 유전자의 발현이 저해된 세포의 표현 현상을 관찰함으로써 해당 유전자의 기능 연구 및 신호전달 경로 (pathway) 분석이 가능하여 암 표적으로서의 검증 (target validation) 등을 통한 신약 개발 연구가 수행되고 있다.
RNAi 기법에 사용 가능한 올리고 이중 리보핵산 중 최근 각광을 받고 있는 siRNA (small interfering RNA)를 이용한 기법은 2002년 Science Journal에서 "breakthrough of the year"라고 선정할 정도로 획기적인 방법이다. siRNA는 짧은 19-23개의 이중 리보핵산쇄로 세포내 도입하면 비특이적 저해(non-specific inhibition) 없이 특정 유전자의 발현만을 억제하는 효과를 나타내므로 암의 생성을 촉진, 세포사멸을 억제하는 유전자에 대한 siRNA는 세포 내에서 해당 유전자 작용을 억제시켜 암세포를 죽이는 효과를 나타내며 이를 이용하여 치료용 표적유전자를 검증할 수 있다. 따라서 최근 질병에 대한 표적 유전자 발굴, 표적 유전자 검증, 치료제 개발을 위한 siRNA 연구가 매우 활발하다.
한편, FLJ25416 유전자(GenBank 등록번호: FLJ25416, FLJ13936, UniProtKB/TrEMBL entry Q8IXT1) 는 가상적인 단백질(hypothetical protein)에 대한 유전자로서, 현재까지 그 기능이 알려진 바 없다.
본 발명은 FLJ25416 유전자의 신규한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 FLJ25416 유전자 또는 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 진단용 또는 항암제 스크리닝용 조성물, 상기 유전자의 억제제 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료용 조성물, FLJ25416 유전자 또는 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하고자 한다.
또한, 암진단방법 및 항암제스크리닝방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 FLJ25416 유전자를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 'FLJ25416 유전자'는 이 유전자의 DNA 또는 mRNA를 말하며, DNA 또는 mRNA의 전부 또는 일부를 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 조성물은 상기 유전자 외에도 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.
하기 실시예 1 내지 4로부터 확인할 수 있는 바와 같이, FLJ25416 유전자는 암세포주 및 암세포에서 특이적으로 발현이 증가한다. 따라서 FLJ25416 유전자의 과발현 여부를 조사하면 암을 진단할 수 있다.
그러므로 본 발명은 또한 상기 유전자의 암 진단제 제조 용도 및 상기 유전 자와 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하는 단계를 포함하는 암을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 진단 방법에서 상기 유전자와 시료 간의 반응의 확인은 인비보 또는 인비트로에서, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응 (PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay), 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 2-D 겔 분석 및 시험관 내 결합 에세이 (in vitro binding assay) 등을 이용할 수 있다. 예컨대 상기 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerases chain reaction), 써던블로팅(southern blotting), 노던 블롯팅(Northern blooting) 등으로 이를 검출함으로써 대상자에서 상기 유전자가 고발현된 상태인지 조사하면 암의 발생 여부를 판단할 수 있다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상기 단백질 외에도 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이 FLJ25416 유전자는 암세포에서 특이적으로 발현이 증가하므로 상기 유전자들로부터 발현된 단백질을 이용하여 FLJ25416 유전자 또는 단 백질의 과발현 여부를 조사하면 암을 진단할 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 상기 단백질들의 암 진단제 제조 용도 및 상기 단백질과 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하는 단계를 포함하는 암을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 진단 방법에서 상기 단백질과 시료 간의 반응의 확인은 인비보 또는 인비트로에서, DNA-단백질, RNA-단백질, 단백질-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응 (PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay), 특이적 면역염색(histoimmunostaining), 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 2-D 겔 분석 및 시험관 내 결합 에세이 (in vitro binding assay) 등을 이용할 수 있다. 예컨대 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산 또는 단백질과 하이브리드화한 후 당분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerases chain reaction), 웨스턴 블로팅(western blotting) 등으로 이를 검출함으로써 대상자에서 상기 유전자가 고발현된 상태인지 조사하면 암의 발생 여부를 판단할 수 있다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다.
다르게는 본 발명의 조성물은 상기 단백질 대신 상기 단백질에 대한 특이적 항체를 포함할 수 있다. 암 세포에서는 FLJ25416 유전자가 과발현되어 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양 또한 증가하게 된다. 따라서 상기 유전자로부터 발 현된 단백질에 대한 항체를 이용하는 경우, 항원-항체 반응을 통해 상기 단백질을 검출해 내어 암을 진단할 수 있다.
상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 일반적으로 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호올스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 컨쥬게이션된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량 분석할 수도 있고, 아니면 직접 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 컨쥬게이션된 것을 사용하여 정량분석할 수도 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.
따라서 본 발명은 또한 상기 단백질에 대한 항체의 암 진단제 제조 용도 및 상기 항체와 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하는 단계를 포함하는 암을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 FLJ25416 유전자를 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 FLJ25416 유전자의 항암제 스크리닝용 제제의 제조 용도 및 상기 유전자를 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 유전자와 시험대상물질 간의 반응 확인은, 인비보 또는 인비트로에서, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 외부에서(in vitro) 상기 유전자와 시험대상물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 유전자 외에도, 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 단백질의 항암제 스크리닝용 제제 제조 용도 및 상기 단백질을 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 단백질의 기능을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 것을 포함하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 항암제는 저분자 또는 천연물일 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 단백질과 시험대상물질 간의 반응 확인은, 인비보 또는 인비트로에서, 단백질-단백질, 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질 과 시험대상물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 상기 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS (drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체 내 (in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질을 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 항암제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 저분자 화합물 등이 될 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 유전자 발현을 증진시키거나 단백질의 기능을 증진시키는 활성을 나타내는 시험대상물질 및 반대로 유전자 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 시험대상물질은, 전자의 경우, 항암제 후보물질이 될 수 있고, 후자의 경우는 시험대상물질에 대한 억제제를 개발함으로써 항암제 후보물질이 될 수 있다. 이와 같은 항암제 후보물질은 이후의 항암제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 상기 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 억제효과를 나타낼 수 있 도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 항암제를 개발할 수 있다.
본 발명은 또한 FLJ25416 유전자에 대한 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유전자는 암 세포에서 다량 발현되므로, 상기 유전자의 억제제를 투여하여 상기 유전자의 발현을 저해시키면 암을 억제할 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 상기 유전자의 억제제의 암 치료제 제조 용도 및 유효량의 상기 유전자의 억제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 본 발명에 있어서 암 치료는 암의 예방 및 억제를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자에 대한 억제제는 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 생체 내 뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 안티센스 뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다(Hogrefe, 1999). 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항 적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있고 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
또한, 상기 유전자에 대한 억제제는 상기 유전자의 siRNA(Small Interfering RNA)일 수 있다.
siRNA는 상대적으로 낮은 농도로도 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 얻을 수 있는 효과와 동등하거나 높은 효과를 얻을 수 있기 때문에 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 대안으로 제시되고 있다(Thompson, 2002). siRNAs의 이용은 질병의 동물 모델에 있어서 유전자 발현을 저해하는 데 대중성을 나타내고 있다.
siRNA는 세포 배양 및 생체 내에서 오래 지속되는 효과, 생체 내에서 세포를 트랜스펙션시키는 능력 및 혈청 내 분해에 대한 저항력의 측면에서 생체 내에서 특정한 유전자의 발현의 저해에 대해 매우 강한 약물이 되는 잠재력을 지닌다(Bertrand et al., 2002). siRNA의 전달 및 siRNA를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터의 제조는 당분야에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 제20040106567호 및 제20040086884호에는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡 터, 리포솜 전달 운반체, 플라스미드 주입 시스템, 인공 바이러스 엔벨로프 및 폴리라이신 컨쥬게이트를 포함한 전달 메커니즘뿐만 아니라 많은 발현 컨스트럭트/벡터를 제공하고 있다.
당업자는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA를 합성하고 변형시킬 수 있다. (Andreas Henschel, Frank Buchholz1 and Bianca Habermann (2004) DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32(Web Server Issue):W113-W120.)
또한, 상기 유전자에 대한 억제제는 상기 유전자의 shRNA(short hairpin RNA)일 수 있다. shRNA는 45 내지 70 뉴클레오티드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서 타겟유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10개의 염기 linker를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 프라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노바이러스 (adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다. 상기 shRNA는 siRNA에 비해 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타낸다.
shRNA (small hairpin RNA)를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터는 당분야에서 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 제20040106567호 및 제20040086884호에는 shRNA를 포함하는 바이러스성 벡터 등 발현 컨스트럭트/벡터 관련 정보를 제공하고 있다.
또한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 shRNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예컨대, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 그의 결합) 역시 당분야에서 공지된 내용으로부터 적절히 선택할 수 있다.
암 치료를 위해 사용되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 shRNA는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 적당한 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.
상기 유전자의 저해제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 shRNA 외에도 상기 유전자의 발현을 억제하는 물질이면 어떤 것이든 가능하다. 따라서 종래 당해 기술 분야에서 상기 유전자의 저해제로 알려진 화합물 또한 이용가능하다.
본 발명은 또한 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 유전자를 억제하면 그에 따른 단백질의 발현이 억제되어 암이 억제되는 것이므로, 상기 유전자의 단백질을 저해하면 암을 억제할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 단백질에 대한 억제제의 암 치료제 제조 용도 및 유효량의 상기 단백질의 억제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 본 발명에 있어서 암 치료는 암의 예방 및 억제를 포함한다.
상기 단백질에 대한 억제제는 핵산, 화합물, 천연물, 저분자 화합물, 또는 단백질 등일 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질에 대한 억제제는 본 발명의 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체일 수 있다. 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 단백질에 대한 억제제가 항체일 경우 약제학적으로 허용되는 담체는 결합 단백질의 저장 수명 또는 유효성을 증가시키는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은 최소량의 보조 물질로 구성될 수 있다.
또한 본 발명의 암 치료용 조성물은 하나 또는 그 이상의 항암제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 암 치료용 조성물은 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 화학요법약제(chemotherapeutic agent), 예컨대, 사이클로포스파마이드, 아지리딘, 알킬알콘설포네이트, 나이트로소우레아, 다카르바진, 카르보플라틴, 시스플라틴 등과 같은 알킬화제(alkylating agent), 마이토마이신 C, 안트라사이클린, 독소루비신(아드리아마이신) 등과 같은 항생제, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라신, 시타라빈 등과 같은 항대사제(antimetabolitic agent), 빈카 알칼로이드와 같은 식물유래 약제 및 호르몬 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 암 치료용 조성물은 상기 유효 성분 외에도 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 가용화제 등이 있다.
또한 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.
본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 치료 방법에 있어서, "유효량"은 암을 억제하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 본 발명의 유효 성분의 "유효량"은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자 또는 단백질의 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, shRNA일 경우 0.01ng/kg~30㎎/kg, siRNA일 경우 0.01ng/kg~10㎎/kg, 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 경우 0.01ng/kg~10㎎/kg, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
추가로, 본 발명은 FLJ25416 유전자 또는 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 암 진단용 키트는 본 발명의 진단용 조성물 외에도 상기 조성물과 시료 간의 반응을 파악하는데 사용되는 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩 등의 적용을 위한 재료를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FLJ25416 유전자는 서열번호 1의 염기서열 또는 상기 염기서열 중 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FLJ25416 유전자의 siRNA는 서열번호 2, 서열번호 3, 또는/및 서열번호 4의 센스 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 FLJ25416 유전자의 shRNA는 서열번호 9의 DNA 염기서열로 코드된 것일 수 있다.
상기한 FLJ25416 유전자에 대한 siRNA 또는 shRNA의 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하기위해 사용된다. 이러한 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할만한 정도가 된다.
본 발명에서 “암”은 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추 신경계 (CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등을 포함한다.
본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in Molecular Biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 암 진단, 항암제 스크리닝, 암치료 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명은 암 표적 유전자에 특이적인 치료제와 같이 부작용이 적은 바이오 신약 및 맞춤형 항암제의 개발에 크게 활용될 것이다. 또한 새로운 암 관련 기전 경로 연구의 기반을 닦는 원천 기술 개발에 기여할 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예 1> FLJ25416 유전자의 암 세포주에서의 발현양 증가 효과 확인
유전자의 암 관련성을 추정하는 간단한 방법은 암조직 또는 암세포주에서의 해당 유전자의 발현양의 변화를 비교하는 것이다. 정상 세포에 비해 암세포주에서 다량 발현되어 있는지 또는 감소되어 있는지 비교하여 암 생성 및 진행에 따른 발현량과의 관계를 조사하여야 한다. 이를 위해서는 암세포주에서 실제 해당 유전자의 발현이 어떻게 나타나고 있는지 암 세포주에서 총 RNA를 추출한 후 해당 유전자의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 각 유전자의 양을 정상 세포주와 비교하여 유전자의 세포 내 발현양을 확인하게 된다.
이에 본 발명에서는 FLJ25416 유전자의 발현 정도를 인간 위암 세포주, 간암 세포주 및 정상 세포에서 RT-PCR을 실시하여 분석하였다. 위암 세포주로서 SNU620, SNU216, SNU484, SNU601 및 SNU638(서울대학교 세포주 은행), 간암세포주로서 Huh7, SH-J1, Ck-1a(전남대학교 김대곤 박사에게서 분양), Chang(ATCC #CCL13), SNU709, 및 SNU354(서울대학교 세포주 은행)를 이용하였다. 정상 세포주로는 IMR90 (human fetal lung fibroblasts, ATCC #CCL-186)을 이용하였다. 본 실험의 RT-PCR은 one-step RT-PCR PreMix kit (iNtRON Biotechnology, INC)을 이용해 실시하였다. 이 키트는 cDNA의 합성 및 증폭이 한번에 이루어질 수 있도록 제작된 것으로, PreMix (OptiScriptTM RT, i-StarTaqTMDNA polymerase) 8㎕에 각 암세포의 RNA 주형 1㎍/reaction, 특이적 프라이머(specific primer), 3차 증류수를 넣어 총 20㎕로 부피를 맞춰 RT-PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR에서 사용한 특이적 프라이머는 다음과 같다.
N-말단 프라이머 C-말단 프라이머
FLJ25416 서열번호 6 5'-CAGAAGCCCTATTGTATCTGG-3' 서열번호 7 5 '-GTGACCAAGCACTTCGAGTTT-3'
RT-PCR을 수행한 결과, FLJ25416은 정상 세포주와 비교하여 많은 암세포 주에서 그 mRNA 발현 정도가 확실히 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 1). 도 1의 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)는 비교 컨트롤이다.
이러한 결과는 FLJ25416 유전자의 발현량 증가가 암진단 지표가 될 수 있음을 의미한다.
<실시예 2> 마이크로 어레이 실험에 의한 대장암환자의 암조직에서 FLJ25416의 발현양 증가 효과 확인
삼성의료원(서울, 대한민국)으로부터 66명의 대장암 환자의 대장암 조직과 정상 조직을 각각 입수하였다. 각각의 조직은 환자로부터 외과적으로 제거된 후, 분석때 까지 이를 액체질소에 보관하였다.
총 RNA는 QIAGEN 킷트 (RNeasy Maxi kit: cat #75162)를 사용하여 분리하였고 Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 우선 대장암 임상조직과 정상조직을 적절한 크기로 자른 후 150ul 의 베타 멀캅토 에탄올을 첨가한 15ml의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 15ml의 70% 에탄울을 넣어 잘 섞은 후, 3000g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척을 한 후 1.2ml의 RNase가 없는 물을 첨가하여 총 RNA를 분리하였다. 부착된 세 포주의 경우는 트립신, EDTA를 이용하여 회수한 후 키트 내 분해 완충액 1ml에 용해시켰다.
상기 추출된 총 RNA를 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion사)을 이용하여 하이브리드화 하였다. T7 Oligo(dT) primer를 이용하여 cDNA를 합성하고, biotin-UTP를 이용하여 in vitro transcription을 실시하여 biotin-labeled cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 NanoDrop을 이용하여 정량하였다. 정상 대장 상피세포 및 대장암 세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2 (Illumina사) 칩에 하이브리드화 하였다. 하이브리드화 후 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 Illumina Gene Expression System 세척액 (Illumina사)을 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 streptavidin-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너 (Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina사)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 'quantile' 기능을 이용하여 보정하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 대장암 환자의 암조직과 정상조직에서 측정된 FLJ25416 유전자 발현 프로파일로, 고발현 되는 경우 붉은색으로, 저발현되는 경우 녹색으로 나타내었다. 도 2의 ACTB(Homo sapiens actin, beta)는 유전자 발현의 차이를 판단하기 위한 정상 표준유전자를 의미한다. FLJ25416 유전자는 암조직에서 발현양이 평균 5배 증가되었다.
이러한 결과는 FLJ25416 유전자의 발현량 증가가 암진단 지표가 될 수 있음을 의미한다.
<실시예 3> RT-PCR에 의한 FLJ25416 유전자의 대장암 조직에서의 발현양 증가 효과 확인
유전자의 암 관련성을 추정하는 간단한 방법은 암조직 또는 암세포주에서의 해당 유전자의 발현양의 변화를 비교하는 것이다. 정상 세포에 비해 암세포에서 다량 발현되어 있는지 또는 감소되어 있는지 비교하여 암 생성 및 진행에 따른 발현량과의 관계를 조사하여야 한다. 이를 위해서는 암세포에서 실제 해당 유전자의 발현이 어떻게 나타나고 있는지 암 세포에서 총 RNA를 추출한 후 해당 유전자의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 각 유전자의 양을 정상 세포와 비교하여 유전자의 세포 내 발현양을 확인하게 된다.
이에 본 발명에서는 대장암 조직에서의 FLJ25416 유전자의 발현 정도를 RT-PCR을 실시하여 분석하였다. 본 실험의 RT-PCR은 one-step RT-PCR PreMix kit (iNtRON Biotechnology, INC)을 이용해 실시하였다. 이 키트는 cDNA의 합성 및 증폭이 한번에 이루어질 수 있도록 제작된 것으로, PreMix (OptiScriptTM RT, i-StarTaqTMDNA polymerase) 8㎕에 각 암세포의 RNA 주형 1㎍/reaction, 특이적 프라이머(specific primer), 3차 증류수를 넣어 총 20㎕로 부피를 맞춰 RT-PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR에서 사용한 특이적 프라이머는 실시예 1에서 사용한 것과 같다.
도 3은 암환자에서 FLJ25416 유전자의 발현의 범위를 나타내고 있다. 도 3의 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)는 유전자 발현의 차이를 판단하기 위한 표준유전자를 의미하며, N은 Normal, T는 Tumor를 나타낸다. 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 20 환자의 정상조직과 암조직을 비교했을 때 정상 조직에 비해 15 환자의 암조직에서 그 FLJ25416의 mRNA가 증가됨을 확인하였다 (도 3).
이러한 결과는 FLJ25416 유전자의 발현량 증가가 암진단 지표가 될 수 있음을 의미한다.
<실시예 4> FLJ25416 유전자의 클로닝
유전체사업단의 KUGI (Korean Unigene Information, (http://kugi.kribb.re.kr/)에서 벡터 클론된 유전자 pBluescript-FLJ25416를 구매한 후 Forward primer(SalⅠ 효소 절단 부위 포함) 5-ATTGTCGACAATGAACAGAAGACGAAAATTT-3' 및 Reverse primer (EcoRⅤ 효소 절단 부위 포함) 5-CCAGATATCTATGAAAACAATTCAGGTGA-3 primer를 이용해 55℃에서 37 cycles로 pfu premix(iNtRON, Inc.)를 사용하여 PCR 로 유전자를 증폭하였다. FLJ25416 유전자의 DNA band를 정제한 후, pGEM-T easy vector에 클로닝(cloning)하였다. DNA 시퀀싱(sequencing)으로 FLJ25416 유전자의 염기서열(2997 bp)을 확인하고, GATE Way 시스템(Invitrogen Corp. www.invitrogen.com)을 이용한 제조회사의 매뉴얼에 따라 클로닝을 하였다. pDEST vector에 옮기기 위해 pGEM-T easy-FLJ25416 pDNA를 Sal1/EcoR5로 제한효소 처리하여 pENTR3C vector (Invitrogen Corp. www.invitrogen.com)에 클로닝(cloning)하였다. EGFP가 tag된 FLJ25416 (EGFP-FLJ25416)을 클론하기 위해 pENTR3C-FLJ25416을 pDEST-EGFP(Invitrogen Corp. www.invitrogen.com)와 LR reaction시켰고, Flag가 tag된 FLJ25416 (Flag-FLJ25416)을 클론하기 위해 pDEST-EGFP (Invitrogen Corp. www.invitrogen.com)에 각각 클로닝(cloning) 하였다. 플라즈미드 pENTR3C-FLJ25416을 벡터 pDEST-EGFP 또는 pDEST-Flag DNA와 함께 섞은 후 LR clonase Ⅱ enzyme mixture를 각각 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 proteinase K를 첨가하고 37℃에서 10분간 배양하여 LR 반응을 끝낸 후, E. coli DH5α competent cell에 형질 전환하여 pDEST-EGFP-FLJ25416 또는 pDEST-Flag-FLJ254156 클론을 얻었다.
<실시예 5> FLJ25416의 과발현에 의한 세포 성장 속도 증가 효과 확인
HEK293T cell(한국생명공학연구원 Cell Line Bank)을 10% 송아지 혈청(bovine calf serum)과 penicillin (10,000 units/㎖)-streptomycin (10 ㎎/㎖)의 혼합액 (GIBCO, 15140)을 100배 희석한 Low glucose DMEM 배지 (GIBCO, 11885)에 1.4 x 105 cells/ml의 농도로 60mm dish에 5ml seeding한 후 5% CO2 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양하였다. EGFP-FLJ25416 plasmid DNA를 배양된 상기 세포에 트랜스펙션(transfection)하였다. 3시간 30분이 경과하면 media를 모두 제거하고 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 3회 빠르게 씻어준 후, 10% serum이 든 배지로 갈아주었다. 트랜스펙션 후 24시간이 경과하면 0.5% EDTA-Trypsin을 처리하여 세포 를 모아 혈구계수기(heamacytometer)로 세포수를 측정한 다음, 24 well plate에 1 x 105 cells/ml의 농도로 씨딩(seeding)하여 5% CO2 배양기에서 37℃로 SRB(Sulforhodamine B) assay를 할 때까지 배양하였다. 배양 후 12시간 마다 plate를 하나씩 꺼내어 SRB assay 방법으로 세포성장율(cell growth rate)을 측정하였다. 비교를 위해 EGFP 벡터 DNA로 트랜스펙션하고 상기 HEK293T cell과 동일하게 처리하여 대조군으로 사용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 가로축은 시간을 세로축은 세포성장율(cell growth rate)을 나타내며, EV는 FLJ25416 유전자가 없는 벡터를 트랜스펙션한 세포를 의미하고, O/E는 FLJ25416 유전자가 클론된 벡터를 트랜스펙션하여 FLJ25416 단백질이 과발현된 세포를 의미한다.
그 결과, FLJ25416 유전자가 과량 발현된 세포에서는 성장 속도가 약 2배 정도 증가하였는데, 이것은 FLJ25416 유전자는 종양세포의 특징인 세포의 성장 속도를 증가시키는 것과 관련되어 있음을 나타낸다(도 4). 이러한 결과는 FLJ25416 유전자의 발현량 증가가 종양세포진단 지표가 될 수 있음을 의미한다.
<실시예 6> 암세포주에 siFLJ25416의 도입에 따른 암세포주의 성장 억제 효과 확인
암세포 조직 또는 암세포주에서 다량 발현되는 유전자의 경우 siRNA 기법을 통해 유전자 발현을 억제하여 세포의 증식 속도에 변화가 있는지를 관찰할 수 있다. 이에 본 발명에서는 FLJ25416에 대한 각각의 siRNA를 디자인하여 위암 세포주 SNU638에 도입한 후 해당유전자 mRNA 발현 저하에 따른 암세포주의 성장 속도의 변화를 관찰하였다.
먼저 FLJ25416 및 GFP의 siRNA를 디자인하여 합성하였다(삼천리 제약, 대한민국). 합성된 siRNA는 유전자 염기서열을 바탕으로 디자인된 19개 올리고뉴클레오타이드의 이중 리보핵산쇄에 단쇄의 2 염기가 매달린 구조로 이루어져 있다. GFP(Green Flourescence Protein)는 세포의 증식에 아무 영향을 미치지 않는 siRNA 실험의 음성 대조군으로 사용되었다.
대장암 세포주 Colo205 (서울대 세포주은행)를 70% 컨플루언시로 배양 후 하이퍼펙트 방법(Qiagen Co.)으로 siFLJ25416(센스서열: 서열번호 2), siGFP(센스서열: 서열번호 5)를 세포 내에 도입하여 72시간 동안 배양하며 형질 전환하였다. 각 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하여 해당 유전자 mRNA가 감소되었음을 확인하고 siRNA에 의한 유전자 발현 억제가 이루어졌음을 확인하였다 (도 5 상단). NT는 siRNA를 처리하지 않은 세포에서의 유전자 발현양을 나타내고, - 는 음성대조군인 siGFP을 나타낸다. siGFP는 인간의 유전자와 homology가 없는 시퀀스에 대한 siRNA로 타겟하는 부분이 없는 것을 보여준다. 각 세포를 SRB (Sulfur rhodamine, Sigma Co.)로 염색하고 현미경을 통해 세포 성장에 큰 변화가 없는 콘트롤인 GFP siRNA를 처리한 SRB 염색한 세포의 사진을 관찰함으로써 siFLJ25416을 처리한 세포에서 성장 억제가 일어났음을 보여주고 있다 (도 5 하단).
좀 더 구체적으로 siRNA에 의한 세포 성장 저하 정도를 조사하기 위해 A549 cell(생명공학연구원 Cell Line Bank 분양)을 1.0 x 105 cells/ml의 농도로 24 well plate 에 0.5 ml 씨딩(seeding)한 후 5% CO2 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 스크램블 siRNA(scrambled siRNA)(센스서열: 서열번호 8)와 siFLJ25416 (센스서열: 서열번호 2)를 위의 방법대로 세포 내로 트랜스펙션한 후 24 시간마다 플레이트(plate)를 꺼내 웰(well) 당 세포수를 혈구계수기(heamacytometer)로 측정하여 세포의 성장 속도를 비교하였다. 실험 결과를 도 6에 나타내었으며, 도 6의 가로축은 배양한 날짜(일)를 세로축은 세포수(cell number)를 나타낸다. 또한, siFLJ#1은 siFLJ25416으로 처리한 세포주이며, Scrambled는 스크램블 siRNA로 처리한 세포주이다. 스크램블 siRNA는 음성대조군 목적으로 사용한 것이다. 그 결과, siFLJ25416으로 처리한 세포주의 경우 스크램블 siRNA(scrambled siRNA)를 처리한 세포주의 경우보다 현저하게 세포 성장 속도가 감소되었음을 확인하였다 (도 6).
그 외 암세포주에 대한 세포 성장억제 효과를 조사하기 위하여 대장암 세포주 KM12C (서울대 세포주은행), KM12SM (서울대 세포주은행), Colo205 (서울대 세포주은행), SW620 (서울대 세포주은행), HCT116 (서울대 세포주은행), 폐암 세포주 A549, 간암세포주 Huh7(전남대학교 김대곤 박사에게서 분양), Snu387(서울대 세포주은행), 전립선암 세포주 PC-3 (서울대 세포주은행)를 70% 컨플루언시로 배양 후 하이퍼펙트 방법(Qiagen Co.)으로 siFLJ25416(센스서열: 서열번호 2)를 세포 내에 도입 후72시간 동안 배양하며 siRNA에 의한 세포의 성장 억제 정도도 조사하였다. 각 세포를 SRB (Sulfur rhodamine, Sigma Co.)로 염색하고 현미경을 통해 세포 성 장에 큰 변화가 없는 콘트롤(control)인 GFP siRNA를 처리한 세포주를 기준으로, SRB 분석하여 해당 유전자 siRNA를 도입한 세포의 성장 억제 정도를 비교하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7의 x축은 각 세포주를 나타내며, y축은 상대세포성장비(Relative cell growth)를 나타낸다. 그 결과 대부분의 대장암 세포주에서 FLJ25416의 유전자 발현 억제가 세포 성장 억제를 나타내었다. 위 실험 결과에 의하면, FLJ25416 유전자의 siRNA는 대장암 세포주 및 폐암, 간암 세포주의 성장 억제를 유발할 수 있으므로 FLJ25416 유전자가 암 치료 타겟으로 활용 가능함을 의미한다.
<실시예 7> sh-FLJ25416 아데노바이러스(adenovirus) 제조 및 항암효과 확인
1) sh-FLJ25416 adenovirus 제조
siFLJ25416(센스서열: 서열번호 2)의 상보적인 염기서열 사이에 loop 염기서열을 갖는 shRNA 서열을 디자인 한 후, 상기 shRNA 서열을 코딩하는 DNA 올리고 뉴클레오티드(서열번호 9)를 합성하여 shFLJ25416단편을 제조하였다. E1 shuttle vector인 pE1sp1A(Ψ)(연세대 윤채옥 교수)에 BamHI과 HindIII 제한효소를 처리하여 어닐링(annealing) 시킨 shFLJ25416 단편을 삽입시켜 pE1sp1A(Ψ)/ shFLJ25416를 제조한 뒤, U6 promoter를 넣기 위하여 제작된 pE1sp1A(Ψ)/ shFLJ25416에 BamHI 제한효소처리를 하고, U6 promoter가 삽입되어 있는 pE1sp1A(Ψ)/U6 shNFE1(연세대 윤채옥 교수)에서 U6 promoter만을 얻기 위하여 BamHI 제한효소를 처리하고 전기영동 하여 약 300bp의 DNA절편을 분리한 뒤 이를 라이게이 션(ligation)시켜 pE1sp1A(Ψ)/U6/shFLJ25416 셔틀벡터를 제조하였다. 방향성을 확인하기 위하여 EcoRI과 HindII 제한효소 처리하여 약 400bp의 산물을 전기영동으로 확인 한 후, 제작된 pE1sp1A(Ψ)/U6/shFLJ25416 셔틀벡터를 아데노바이러스 아형 5의 화이버(fiber)가 변형된 Vdmldl324 토탈벡터(연세대 윤채옥 교수)와 함께 BJ5183 대장균 (연세대 윤채옥 교수)에 형질전환시켜 상동 재조합(homologous recombination)을 유도하여 dlRGD/shFLJ25416의 복제불능바이러스를 제작하였다. 대조군으로는 LacZ유전자가 들어있는 동일한 바이러스인 dlRGD/LacZ(연세대 윤채옥 교수)를 이용하였다. 제작된 모든 바이러스들은 293A세포(인비트로젠)에서 증식 배양 한 후 염화세슘 밀도 퓨리피케이션(CsCl density purification)을 시행하고 투석(dialyze)시킨 후, 4% 수크로오스를 함유한 저장버퍼(storage buffer)에 용해한 뒤 -80 ℃ 냉동고에 저장하였다. 각 바이러스 스톡(stock)의 역가(titer)는 스펙트로미터(spectrophotometer)를 이용하여 바이러스 게놈의 흡광도에 의한 광학밀도(optical density;O.D)로 산출하였다.
2) shFLJ25416에 의한 항종양 효과 확인
본 실험에 사용된 인체 폐암 세포 주 A549는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 폐암 세포주는 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에서 단층(monolayer)으로 배양하여 0.5% trypsin-EDTA(Invitrogen)를 처리한 후 7 X 108 생존세포를 100 ㎕ Hanks' Balanced salt solution(HBSS)로 부유하여 생후 7 8주된 누드마우스의 복벽에 피하 주사하 였다. 종양세포 이식 후 약 10-14일 경, 종양의 크기가 약 70-80 ㎣정도 성장하면, dlRGD/LacZ 아데노바이러스, 또는 dlRGD/shFLJ25416 아데노바이러스 5 X 108 plaque-forming unit (PFU)/50ul을 이틀 간격으로 세 번 종양 내에 직접투여 한 후, 이틀 간격으로 종양의 크기를 측정하였다. 음성 대조군으로는 PBS (Phosphate Buffered Saline)를 이용하였고, 바이러스 투여와 같은 방법으로 투여하였다. 종양의 용적은 캘리퍼(caliper)를 이용하여 최장경(a)과 최장경에 수직한 최단경(b)을 각각 측정하여 a X b X b X 0.523의 공식으로 산출하였다. (종양의 용적(mm3)= (최단경 mm)2 × 최장경 mm × 0.523). 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8의 가로축은 시간(일), 세로축은 종양 용적(tumor volume; mm3)을 나타낸다. 또한 PBS는 PBS처리한 음성대조군, dlRGD/LacZ는 dlRGD/LacZ 아데노바이러스를 주입한 마우스, dlRGD/shFLJ25416은 dlRGD/shFLJ25416 아데노바이러스를 주입한 마우스를 나타낸다.
도 8에 나타난 바와 같이 dlRGD/shFLJ25416 아데노바이러스를 주입하여 shRNA를 발현시킨 마우스에서 항종양 효과가 우수함을 알 수 있다. 또한 투여 후 30일 째의 종양크기를 비교한 결과, PBS를 투여한 대조군에서는 투여 후 25일째 종양의 크기가 현저하게 증가하는 것을 관찰하였고, dlRGD/LacZ 아데노바이러스를 투여한 마우스의 경우에도 음성대조군인 PBS를 투여한 경우와 비슷하게 종양이 크게 자라는 경향을 보였다. 이에 반하여, dlRGD/shFLJ25416 아데노바이러스를 투여한 마우스의 경우는 바이러스 투여 후 25일경에 종양의 크기가 PBS를 투여한 대조군에 비해 약 38%정도 종양성장이 억제되었으며, 또한 일부 종양이 괴사되는 것이 관찰되었다. 위 결과에 따라, 본 발명의 shFLJ25416에 의해 항종양 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
도 1은 인간 위암 세포주, 간암 세포주 및 정상 세포에서 FLJ25416유전자의 발현양의 변화를 RT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. GAPDH는 대조 유전자이다.
도 2는 Illumina 48K chip을 이용한 마이크로어레이 실험을 통해 대장암 환자의 조직에서 FLJ25416 유전자의 발현이 증가되었음을 나타내는 그림이다.
도 3은 대장암 환자 20명의 암조직에서 FLJ25416 유전자의 발현양의 변화를 RT-PCR을 통해 분석한 결과를 나타낸다. GAPDH는 대조 유전자이다.
도 4는 FLJ25416 유전자 과다발현에 의한 세포 성장 속도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 대장암 세포에서 FLJ25416 유전자에 각 유전자의 siRNA를 처리시 mRNA의 양이 감소되었으며, 세포 성장이 억제되었음을 나타내는 사진이다.
도 6은 A549 폐암세포주에서 siRNA의 처리에 의한 세포 성장 속도 저해 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 대장암, 폐암, 간암, 전립선암 세포주에서 각 유전자의 siRNA를 처리시 세포의 성장 저해 정도를 SRB 염색으로 조사한 그래프이다.
도 8은 shRNA 를 도입한 아데노바이러스(adenovirus)의 A549 세포에 대한 항암효과를 나타낸 그래프이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel use of FLJ25416 gene <130> P08-089-KRI <150> KR10-2007-0126222 <151> 2007-12-06 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3545 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gggagattcg attggaaggc tgccggcgtg ctactgagtt cggccggtcc gagtcactgt 60 gcgtcgcctg ggcgcgttcc tggtcttctc ccccagggtc ttgctctgtc acccaggctg 120 gagtgccatg gcatcatcat agctcactat ggccttgatc ctcctgcctt agcctcccaa 180 gcagctggta ttacagacca cggtgtgaac acatgaacag aagacgaaaa tttcttctag 240 cctcagtact tgctctccag aattcaagtt ttatatatcc atcatgtcag aagtgcttct 300 ctaggataat cctggtctcc aaaaggtcta attgtccaaa atgtggctct actggtgaat 360 ctggaaatgc caattacaga tacaaacttt ccttaaaagt tgcagaatca aacaaattgt 420 ttgttattac tgtatttgga agttgcttag atacattttt tggtcttact gccactggtt 480 tgcacaggta cattcaggat cctaataaaa ttccagaaac actggacaat gatacaactc 540 agaatctatt aactaaagca gttgaaactt gctttgttgg acaaagcttt atttttggag 600 tgacgaattt tgaaaaccaa cctggacaag gttcagatgc cagtaacttc 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gtgcttggtc acctgaattg ttttcataaa aagtcacctg aacccaattc ctgaactttt 3240 aaatctgttt ggaaatgttt gccttcaggg gtacggaaag cattctttac attttgaaca 3300 cttggagaga agcaaattga aaacaggact ctgctgggag ctactgtgcc ttttaaaata 3360 taaagccatt gttttcccca gggttttatc tagaatacta tgattaggta gttgagcact 3420 ttatcttata ctgtttattg tactttaata atattgttaa gattgttttt gaaagtatta 3480 atgtttgtta aaatcacata tacatccaga aataaagact ttgcaaacca aaaaaaaaaa 3540 aaaaa 3545 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for FLJ25416, sense <220> <223> siRNA for FLJ25416, sense <400> 2 cagaacagaa agtccatct 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for FLJ25416, sense <220> <223> siRNA for FLJ25416, sense <400> 3 gatacaactc agaatctat 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for FLJ25416, sense <220> <223> siRNA for FLJ25416, sense <400> 4 gattcatgga gccttgttt 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for GFP, sense <220> <223> siRNA for GFP, sense <400> 5 cucgccggac acgcugaact t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal primer for PCR of FLJ25416 <400> 6 cagaagccct attgtatctg g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal primer for PCR of FLJ25416 <400> 7 gtgaccaagc acttcgagtt t 21 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled siRNA, sense <400> 8 ccuacgccac caauuucgu 19 <210> 9 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for shRNA <400> 9 gatccccaga acagaaagtc catctttcaa gagaagatgg actttctgtt ctgttttttg 60 gaaa 64

Claims (19)

  1. FLJ25416 유전자를 포함하는 암 진단용 조성물.
  2. FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 진단용 조성물.
  3. FLJ25416 유전자를 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물.
  4. FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물.
  5. FLJ25416 유전자에 대한 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 FLJ25416 유전자에 대한 억제제가 FLJ25416 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 암 치료용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 FLJ25416 유전자에 대한 억제제가 FLJ25416 유전자의 siRNA인 암 치료용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 siRNA가 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 센스서열 중에서 선택된 하나 이상의 센스서열을 갖는 siRNA인 암 치료용 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 FLJ25416 유전자에 대한 억제제가 FLJ25416 유전자의 shRNA인 암 치료용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 9의 DNA 염기서열로 코드된 것인 암 치료용 조성물.
  11. FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 억제제가 상기 단백질에 대한 항체인 암 치료용 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 억제제가 저분자 화합물인 암 치료용 조성물.
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FLJ25416 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것인 암 치료용 조성물.
  15. FLJ25416 유전자 또는 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단용 키트.
  16. FLJ25416 유전자와 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하는 단계를 포함하는 암 진단 방법.
  17. FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체와 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하는 단계를 포함하는 암 진단 방법.
  18. FLJ25416 유전자를 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 FLJ25416 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
  19. FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질을 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 FLJ25416 유전자의 발현을 억제 및 FLJ25416 유전자로부터 발현된 단백질의 기능을 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 저분자 또는 천연물 항암제 스크리닝 방법.
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