KR20090060143A - 자성 나노 입자와 주파수 혼합 자기 판독기를 이용한 생체물질의 정량적 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자성나노입자와 주파수 혼합 자기 판독기(frequency mixing magnetic reader)를 이용한 생체물질의 정량적 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 검출방법에 의하면, 자성나노입자의 수에 대한 신호의 검출로서 간단하게 생체물질의 존재를 정량적으로 측정할 수 있고, ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 보다 안정하면서 그와 유사한 고민감도의 신뢰성있는 데이터를 확보할 수 있다. 또한 본 발명의 검출방법에 따르면, 1회용의 스트립 유형의 기판부가 센서로 이용되므로 공정 및 비용 측면에서 매우 경제적이다.

자성나노입자, 주파수 혼합 자기 판독기, 스트립

Description

자성 나노 입자와 주파수 혼합 자기 판독기를 이용한 생체물질의 정량적 검출방법{QUANTATIVE DETECTION METHOD OF BIOMOLECULES USING MAGNETIC NANO PARTICLE AND FREQUENCY MIXING MAGNETIC READER}

본 발명은 자성 나노 입자와 주파수 혼합 자기 판독기를 이용한 생체물질의 정량적 검출방법에 관한 것이다. 본 발명은 정보통신부 및 정보통신연구진흥원의 IT원천기술개발사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다[과제관리번호: 2006-S-074-02, 과제명: 나노 입자를 이용한 고성능 바이오 센서 시스템].

생명공학, 의학, 화학 분야에서 미량의 생체물질 분석은 매우 중요한 과제 중의 하나이다. 이러한 측면에서, 좀 더 쉬운 분석 방법(tool)을 개발하기 위해 많은 연구가 진행되어 왔으며, 혁신적인 분석 방법의 개발은 생명공학이나 이에 연관된 분야의 학문적 경향을 바꿀 정도로 영향력이 매우 크다고 할 수 있다(예: 거대분자(macoromolecule)에 대한 MALDI-TOF, HPLC-MS, PCR 등). 이러한 실험실 수준의 장비 개발 이외에 현장에서 간편하게 측정/분석할 수 있는 장비의 개발에서도 많은 연구가 있어 왔는데, 흔히 랩온어칩(Lab on a Chip, LoC), 시스템온칩(System on Chip, SoC) 등으로 불리는 어레이(array) 분석이 가능한 칩(chip)의 개발이 그 일례이다.

이 중에서 1970년대에 개발된 거대자기저항(Giant MagnetoResistance, GMR)은 하드디스크 뿐만 아니라 센서(sensor)의 개발에도 많은 영향을 미쳤다. 이러한 이유로, 자성 나노 입자는, 1) 기존에 사용되는 바이오 센서의 표지(label) 물질보다 물리/화학적인 측면에서 훨씬 더 안정적이고, 2) 신호의 생성과 표적(target) 물질의 포획(capturing)을 동시에 할 수 있다는 장점으로 인하여 매우 각광을 받았다.

종래 나노 입자 또는 비드를 이용한 기술로는, 마이크로 또는 나노 입자의 한쪽에 고상의 지지물(support)이 붙을 수 있도록 하고, 나머지 한쪽에 DNA가 붙을 수 있도록 한, 입자를 이용한 DNA의 고정화 방법이 있다. 상기의 고정화 방법은, 일반적인 표면에 고정화 시키는 것보다 많은 양의 DNA를 입자의 표면에 부착하여, 좁은 면적에 많은 DNA를 농축시킬 수 있는 고정화 방법이다. 그러나, 상기 방법에서 입자는 단지 DNA의 포획만을 담당할 뿐이었다.

또한, 비드(bead)를 이용하여 어레이를 제작한 후 여기에 DNA 증폭을 위한 각종 효소를 이용하여 다양한 종류의 DNA를 효율적으로 분석하게끔 하는 방법이 개시된 바 있다. 그러나, 상기 방법에서는 DNA 증폭 반응 자체가 각각의 비드 표면에서 일어나게끔 하는 것에 그칠 뿐이었다.

한편 자성나노입자를 이용한 종래의 기술로는, 1) GMR 센서를 이용하는 방법, 2) 스핀 밸브(spin valve)를 이용하는 방법, 3) 홀 프로브(Hall probe)를 이용하는 방법, 4) 인덕션 코일(induction coil)을 사용하는 방법과 5) 민감도가 가장 높다는 초전도 양자 간섭 소자(Super conducting quantum interface device, SQUID)를 이용하는 방법 등이 있다.

그 중 현재 상용화에 가장 가까운 기술은 GMR을 이용하는 방법인데, 이 방법의 경우 센서 하나의 개당 가격이 매우 비쌀 뿐만 아니라 분석 장비도 비드의 농도에 따라 따로 만들어야 할 만큼 매우 고가이다. 다른 방법의 경우도 검출 한계(detection limit) 자체는 매우 낮으나, 현실적으로 장비의 가격 및 크기/유지 등의 문제로 실제로 상용화 하기는 매우 어려운 실정이다.

이러한 자성나노입자를 이용한 종래 분석방법으로는, 바이오센서 시스템에서 MRAM을 사용하는, 자기 바이오센서를 위한 여기 및 측정 방법이 개시된 바 있다. 이 방법에서는 적어도 하나의 디지털 자기 센서 요소를 사용하며, 자기 비드(bead)의 자화 정도를 측정함으로써 생체 물질의 분석이 가능하다.

또한 SQUID와 40 ㎛의 비드를 이용하여, 항체-항원의 결합 여부를 측정하며, 약 2만~5만개 정도의 비드를 재현성 있게 분석할 수 있도록 하는 방법이 개시된 바 있다. 그러나, SQUID의 경우는 이론적으로도 휴대 장비를 만들 수 없고 반드시 장비 내로 시료를 집어 넣어주어야 하는 점에서 간단하지 않은 단점이 있다.

또한, 여시니아 페스티스(Yersinia pestis)라는 세균에 대해 자기 비드와 자기 판독기(magnetic reader)를 이용힌 분석 방법이 개시된 바 있다. 그러나, 상기 방법은 센서의 개발과는 차이가 있는 것으로, 시료의 분석을 위하여 ABICAP(Antibody Immuno Column for Analytical Processes)이라는 PE 재질의 항체 면역 컬럼을 이용한다.

이와 같이 자성 나노 입자를 신호 물질로 사용하는 데에는, 1) 나노 입자의 분석을 위해 매우 큰 분석 장비가 필요하고, 2) GMR, 터널자기저항(Tunneling MagnetoResistance, TMR), 스핀 밸브(Spin Valve) 등에 사용되는 센서 또는 칩의 제작이 매우 까다롭고 고가라는 점에서, 결정적인 단점이 존재한다.

이에 본 발명자들은 스트립 유형의 기판부와 자성나노입자 및 주파수 혼합 방식의 자기 판독기를 사용하는 경우, 공정 및 비용 면에서 경제적이고, 또한 자성나노입자의 수에 대한 신호의 검출로서 매우 간단하고 안정적으로 생체물질의 존재를 정량 측정할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 기존의 고가의 센서 또는 분석장비가 필요 없으면서, 실내나 야외 모두에서 간단하고 안정적으로 신뢰성 있는 데이터를 확보할 수 있는, 새로운 생체물질의 정량적 검출방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

스트립 유형의 기판부 상에 고정화된 생체물질을 자성나노입자로 표지하는 단계; 및

상기 생체물질을 표지한 자성나노입자를 주파수 혼합 방식의 자기 판독기를 이용하여 측정하는 단계;

를 포함하는 생체물질의 정량적 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기판부는 자성을 띠지 않는 재질로 되어 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 기판부는 반도체 웨이퍼, 유리, 또는 석영이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 자성나노입자는 1nm 내지 200nm의 입경을 갖는다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 기판부 상에 고정화된 생체물질을 자성나노입자로 표지하는 단계는, 상기 생체물질에 대한 제1 포획자 및 제2 포획자 를 이용하여 샌드위치 면역반응에 의해 수행한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 기판부는 생체물질에 대한 제1 포획자가 고정 가능하도록 표면처리되어 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 제1 포획자 및 제2 포획자는 각각 항원, 항체, DNA, RNA, PNA, LNA, 합텐(hapten), 앱타머(aptamer), 아비딘, 비오틴, 스트렙트아비딘, 뉴트라비딘(neturavidin), 렉틴, 셀렉틴(selectin), 효소, 호르몬, 단백질, 수용체, 리간드, 아미노산, 올리고뉴클레오티드, 펩티드 및 올리고펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, 서로 동일하거나 상이하다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 생체물질은 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 항원, 항체, 바이러스, 호르몬, 병원성 세균, 바이러스, 세포, 당 및 휘발성 유기물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 검출방법은 표지 단계 뒤에 여분의 자성나노입자를 제거하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 검출방법은, 표지물질로서 ELISA의 샌드위치 면역반응에서와 같은 HRP(Horse Radish Peroxidase) 효소 대신 안정한 자성나노입자를 이용하고, 검출기로 휴대 가능한 주파수 혼합 방식의 자기 판독기를 이용함으로써, 기타 다른 분석 방법과 비교하여, 자성 입자의 수에 대한 신호의 검출로서 매우 간단하게 바이오 물질의 존재를 정량적으로 측정할 수 있고, 보다 안정적인 데이터를 확보할 수 있으며, 실험실이 아닌 야외에서도 생체물질을 측정할 수 있다. 또한 ELISA에서와 같은 고민감도의 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 ELISA와는 달리 반응시간이 틀려도 동일한 결과 확보가 가능하며, 추후에 동일한 시료를 다시 측정할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명의 검출방법은, 스트립 유형의 1회용 기판부를 이용하므로 GMR 방법과 같이 기판부 상에 복잡한 패턴을 형성할 필요가 없으며, 사용되는 기판부의 재료가 자성 물질을 제외하고는 매우 다양하여 공정 및 비용 면에서도 경제적인 우수한 효과를 제공한다.

이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 단계별로 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 생체물질의 정량적 검출방법을 개략적으로 나타낸 개요도이다. 도 1에 표시된 바와 같이, 본 발명의 검출방법은,

스트립 유형의 기판부(10) 상에 고정화된 생체물질(30)을 자성나노입자(50)로 표지하는 단계; 및

상기 생체물질(30)을 표지한 자성나노입자(50)를 주파수 혼합 방식의 자기 판독기를 이용하여 측정하는 단계;를 포함한다.

본 발명에서, 상기 기판부(10) 상에 고정화된 생체물질(30)을 자성나노입자(50)로 표지하는 단계는, 반드시 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 생체물질(30)에 대한 제1 포획자(20) 및 제2 포획자(40)를 이용한 샌드위치 면역반응에 의해 수행될 수 있다.

도 2는 이러한 본 발명의 일 실시예에 따른 기판부(10) 상에 고정화된 생체물질(30)을 자성나노입자(50)로 표지하는 단계를 보여주는 개략도로서, 도 2에 의하면, 상기 단계는 기판부(10) 표면에 제1 포획자(20)를 고정화하는 단계; 고정화된 상기 제1 포획자(20)와 시료 내 생체물질(30)을 결합시키는 단계; 상기 결합된 생체물질(30)과 제2 포획자(40)를 결합시키는 단계; 및 상기 결합된 제2 포획자(40)에 자성나노입자(50)를 표지하는 단계로 수행될 수 있다.

본 발명에서, 상기 기판부(10)로는 1회용의 스트립 유형을 사용한다. 이와 같이 스트립 유형을 사용하는 경우에는, GMR 방법 등과 같이 기판부 상에 복잡한 패턴을 형성할 필요가 없어 제작이 간편하고, 취급이 용이하며, 가격 면에서 저렴한 장점이 있다. 이 때, 상기 기판부(10)의 길이 및 폭은 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 길이 3cm 내지 20cm, 폭 1mm 내지 15mm일 수 있다.

또한 상기 기판부(10)는 자성나노입자에 대한 신호에 영향을 주지 않도록 자성을 띠지 않는 재질로 되어 있는 것을 사용한다. 예를 들면, 실리콘 웨이퍼(silicone wafer) 등의 반도체 웨이퍼; 커버 글래스(cover glass), 슬라이드 글래스(slide glass) 등의 유리; 또는 석영(quartz) 재질의 플레이트 등을 사용할 수 있으며, 그 외에도 폴리메틸 메타아크릴레이트(PMMA), 폴리프로필렌(PP), 폴리스티렌(PS), 감압접착제(PSA) 등의 폴리머를 사용할 수 있다.

또한 상기 기판부(10)는 생체물질(30)에 대한 제1 포획자(20)가 고정가능하도록, 바이오센서 제작에 사용되는 일반적인 화학물질을 이용하여 표면처리가 가능한 것을 사용하는데, 상기의 표면처리는 측정하고자 하는 시료의 종류, 생체물질의 종류 및 제1 포획자의 종류 등에 따라 당업자가 공지된 방법을 적절히 이용하여 수행할 수 있다.

이와 관련하여 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 표면처리된 기판부(10)의 모식도를 보여준다. 도 3에 나타나 있듯이, 본 발명에서는 기판부(10) 상에 실라놀(silanol) 형태로 변형된 실리콘 옥사이드층(Si-OH_x)(11)을 형성하고, 상기 실리콘 옥사이드층(11) 상에 폴리에틸렌이민을 이용하여 아민기를 갖는 폴리머층(12)을 형성한 후, 그 위에 일단에 아민-반응성기를 갖고 타단에 비오틴을 갖는 링커를 통해 비오틴(13)을 고정화하고, 다시 상기 비오틴(13)에 스트렙트아비딘(14)을 고정화함으로써 기판부(10)를 표면처리할 수 있다. 그러나 반드시 이에 제한되는 것은 아니고, 경우에 따라 상기의 비오틴-스트렙트아비딘 컨쥬게이션(conjugation)을 항원-항체, DNA 상보 등 공지의 다른 바이오컨쥬게이션(bioconjugation) 시스템으로 대체할 수 있다.

이렇게 표면처리된 본 발명의 기판부(10)는, 그 표면 위에 서로 동일하거나 상이한 종류의 제1 포획자(20)를 1개 이상 고정할 수 있도록 어레이(array) 함으로써, 시료 내 1개 이상의 생체물질(30)을 동시에 측정할 수도 있다.

이와 같은 기판부(10) 표면에 고정화되는 제1 포획자(20) 및 상기 제1 포획자(10)에 의해 포획된 생체물질(30)에 결합하는 제2 포획자(40)는, 생체물질(30)에 대하여 항원-항체반응, DNA 상보결합, 유기화합물질의 특이반응성 등으로 결합가능한 생체분자라면 모두 가능하다. 예를 들면, 상기 제1 포획자(20) 및 제2 포획 자(40)로서, 각각 항원, 항체, DNA, RNA, PNA, LNA, 합텐(hapten), 앱타머(aptamer), 아비딘, 비오틴, 스트렙트아비딘, 뉴트라비딘(neturavidin), 렉틴, 셀렉틴(selectin), 효소, 호르몬, 단백질, 수용체, 리간드, 아미노산, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 올리고펩티드 등에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 제1 포획자 및 제2 포획자는 서로 동일하거나 상이한 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서 표적이 되는 생체물질(30)은 제한이 없으나, 예를 들어 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 항원, 항체, 바이러스, 호르몬, 병원성 세균, 세포, 당, 휘발성 유기물질 등으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한 상기 생체물질(30)을 포함하는 시료는 반드시 이에 제한되는 것은 아니나, 배양된 바이러스, 박테리아, 세포 또는 조직 유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서는, 이와 같은 생체물질(30)에 결합한 제2 포획자(4)에 대해 표지물질로서 자성나노입자(50)를 결합시키는데, 상기 자성나노입자(50)는, 기존의 표지물질인 효소, 형광물질 등에 비해 저렴하고 안정하여, 보다 신뢰성 있는 분석을 가능케 하고, 야외에서도 측정을 가능하게 하는 장점이 있다.

이러한 자성나노입자(50)로는 자성을 띠며 나노 크기를 갖는 입자이면 어느 것이든 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면, 금속, 자성물질, 자성합금 또는 내부에 산화철을 포함하여 외부자기장에 대해 자화되는 폴리머 등을 사용할 수 있 다. 또한 상기 자성나노입자의 입경은 1nm 내지 200nm의 범위일 수 있으며, 바람직하게는 20nm 내지 100nm 범위의 것을 사용한다. 이는 입자의 크기가 작으면 작을수록 비교적 좁은 기판 표면에 결합할 수 있는 개수가 늘어나고 분석가능한 범위 또한 확장되기 때문이다.

한편 본 발명에서, 상기한 제1 포획자(20)의 기판부(10)에의 고정화 및 제2 포획자(40)와 자성나노입자(50) 간의 결합은, 각각 결합물질 고정화 수단과 이에 결합하는 결합물질 간의 화학결합에 의해 이루어질 수 있다.

이에 따라, 제1 포획자(20) 및 제2 포획자(40)는 사전에 결합물질(예: 비오틴)과 컨쥬게이션된 것을 사용하고, 자성나노입자(50)는 결합물질 고정화 수단(예: 스트렙트아비딘)으로 표면이 피복된 것을 사용한다. 기판부(10)는 전술하였듯이, 결합물질 고정화 수단인 스트렙트아비딘이 표면에 고정화되도록 표면처리할 수 있다.

본 발명에서, 상기 결합물질 고정화 수단으로는 상술한 스트렙트아비딘을 사용할 수 있고, 그 외에 비오틴, 아비딘, 앱타머(aptamer), 렉틴(lectin), DNA, RNA, 리간드, 조효소(coenzyme), 무기이온, 효소보조인자(cofactor), 당, 지질, 기질 중 어느 하나를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 결합물질은 결합물질 고정화 수단에 화학결합할 수 있으면서, 제1 포획자 및 제2 포획자가 갖는 기능기, 예를 들어 일차아민기, 설프하이드릴(sulfhydryl)기, 카르보닐기, 카르복시기 등에 결합될 수 있는 물질이면 한정되지 않는다.

이 때, 상기 기능기와 반응하여 결합물질을 결합시킬 수 있는 물질의 일부 예는 다음과 같다. 즉, 아민기와 반응하는 물질로는 이미도에스테르(imidoester) 화합물, N-하이드록시숙신이미드 등을 들 수 있고, 설프하이드릴기와 반응하는 물질로는 말레이미드(malemide), 할로아세틸류(haloacetyls), 피리딜 디설파이드(pyridyl disulfide) 등을 들 수 있으며, 카르보닐기와 반응하는 물질로는 카르보디이미드(carbodiimides)류 등을 들 수 있고, 카르복시기와 반응하는 물질로는 일차아민류 또는 히드라지드(hydrazides) 등을 들 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 결합물질 고정화 수단으로 스트렙트아비딘을 사용하고, 결합물질로 비오틴을 사용함에 따라, 상기 비오틴을 포획자에 결합시키는 물질로 N-하이드록시숙신이미드를 사용하였으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

한편 본 발명에서, 상기 기판부(10) 상에 고정화된 생체물질(30)을 자성나노입자(50)로 표지하는 단계는, 시료 내 생체물질(30)을 제2 포획자(40)로 먼저 포획한 후, 기판부(10)에 고정화된 제1 포획자(20)에, 상기 제2 포획자(40)가 결합된 생체물질(30)을 결합시키고, 그에 자성나노입자(50)를 표지하는 단계로 수행될 수도 있다. 이 때의 기판부(10)의 표면처리는 제1 포획자(20)를 기판부(10)에 고정화하는 단계까지 포함한다.

이어서 상기와 같이 고정화된 생체물질(30)을 표지한 자성나노입자(50)를, 주파수 혼합 방식의 자기 판독기를 이용하여 정량적으로 측정한다.

상기 주파수 혼합 방식의 자기 판독기는 2 종류의 상이한 파장, 즉 저주파 수(고에너지)와 고주파수(저에너지)를 반복적으로 금속 물체 또는 자성 입자에 적용할 경우 발생되는 소형의 필드(fringe field)를 감지하여 금속 또는 자성입자 등의 유무를 측정하는 원리의 검출기이다.

상기 주파수 혼합 방식의 자기 판독기에 대해서는 미국공개특허 제2007/0155024A1에 그에 대한 내용이 개시되어 있는데, 이 기기는 저주파수 부위, 고주파수 부위 및 감지 부위(검출 부위)를 각각 코일로 구성함으로써, 종래의 자기 판독기(예: GMR, TMR, SQUID 등)와 달리 냉각장치나 증폭을 위한 앰프 등의 장치가 필요하지 않아, 소형화가 가능하고 휴대 가능한 장점이 있다.

본 발명에서는 이러한 주파수 혼합 자기 판독기를 검출기로 사용하고, 스트립 유형의 기판부를 센서로 사용함으로써, 실내나 야외 모두에서 생체물질의 존재를 간단하게 정량 측정할 수 있는 효과를 제공한다.

상기의 주파수 혼합 자기 판독기로는 위와 같은 측정원리를 갖는 자기 판독기이면 어느 것이든 사용할 수 있으며, 특별히 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 저주파수로 50 내지 100 Hz 범위의 주파수를, 그리고 고주파수로 10 내지 100 KHz 범위의 주파수를 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기의 자기 판독기로서 독일 세노바(Senova)사의 자기 판독기를 사용할 수 있는데, 도 4는 이러한 본 발명의 일 실시예에서 사용된 주파수 혼합 자기 판독기의 사진을 보여준다.

한편, 본 발명의 검출방법에서는, 상기 기판부(10) 상에 고정화된 생체물질(30)을 자성나노입자(50)로 표지하는 단계 뒤에, 반응하지 않은 여분의 자성나노 입자를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같이 여분의 자성나노입자를 제거하는 경우에는, 보다 정확한 측정결과를 얻을 수 있다. 상기 여분의 자성나노입자의 제거는 당업계에서 일반적으로 공지된 방법을 이용할 수 있고, 예를 들면 PBS 버퍼를 사용하여 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.

[실시예 1]

본 발명의 검출방법에 의해 연속된 농도의 자성 나노 입자를 측정할 수 있는지에 대한 정보를 획득하기 위해, 표면 처리 없이 기판부 위에 자성 나노 입자를 적용하여, 이를 농도별로 측정할 수 있는지를 확인하였다.

사용된 자성 나노 입자는 독일의 Chemicell사로부터 구입한 50nm의 비드(bead)를 사용하였으며, 100 ㎕의 시료를 여러 농도로 (117, 234, 351, 468, 585, 936, 1053 개/㎖) 적용하여 측정하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5로부터, 본 발명의 검출방법에 의하는 경우, 자성나노입자를 농도별로 정량 측정 가능함을 알 수 있다.

[실시예 2]

(1) 기판부의 준비 - 표면처리

약 10 nm 두께의 실리콘 옥사이드(silicone oxide)층을 형성한 실리콘 웨이퍼(Nano fab center, 대전)를 폭 6mm, 길이 8 cm로 잘랐다. 상기 웨이퍼를, RCA 세정 방법 또는 플라즈마 세정법을 이용하여 유기물을 제거하였다. MeOH: HCl(1:1) 용액을 이용하여 상기 웨이퍼 표면을 실라놀(silanol) 형태로 변형시켰다. 상기와 같이 처리된 표면에 PEI 10% 용액(in 50 mM, calcium carbonate ,pH 8.0)을 처리하여 표면에 자유 아민(free amine)이 나타나게 하였다. Pierce 사에서 구입한 NHS-sulfo-비오틴을 이용하여, 기판 쪽은 N-하이드록시숙신이미드(NHS)가 자유 아민과 결합하도록 하였고, 나머지는 비오틴이 나올 수 있도록 하였다. 상기와 같이 준비된 기판에 스트렙트아비딘이 녹아 있는 PBS(pH 7.1) 용액을 적용한 후 실온에서 약 30분 내지 1시간 정도 정치하여 스트렙트아비딘을 고정화시켰다.

(2) 생체물질의 표지 및 측정

1) 제1 포획자로서의 DCR-3 항체는 Santa Cruz사에서 구입하였고, 생체물질(항원)로 사용된 DCR-3 표준단백질, 및 제2 포획자로 사용된 비오틴이 컨쥬게이션된 이차 항체는 오스트리아 비에나(Vienna)의 Bender Medsystems사에서 구입하였다. 또한 자성 나노 입자는 독일 Chemicell사로부터 구입한 Fluidmag-BC-비오틴 (크기: 100nm, 농도: 10.0mg/㎖)을 PBS 용액에 100배 희석하여 사용하였다.

2) Santa Cruz사에서 구입한 DCR-3 항체를, Pierce 사에서 구입한 NHS-sulfo-비오틴을 이용하여 비오틴을 상기 DCR-3 항체에 컨쥬게이션 시켰다. 상기 비오틴이 컨쥬게이션된 DCR-3 항체를 PBS 용액에 녹여 상기 (1)에서 준비한 표면처리된 기판에 적용한 후 실온에서 약 30분간 정치하였다. 정치 후 반응하지 않은 물질들은 PBS(1% Tween 20을 포함한 PBS 용액) 용액을 이용하여 제거하였다.

3) 이어서, DCR-3 항원을 초순수를 이용하여 1000 pg/50㎕가 되게 녹인 후, 준비된 용액을 상기 2)에서 준비된 기판에 적용한 후 실온에서 약 2시간 정도 배양(incubation)하였다.

4) 이어서, 다시 비오틴이 컨쥬게이션된 이차 항체(in PBS)를 상기 3)에서 준비된 기판에 적용하여 ELISA의 샌드위치 구조를 완성하였다.

5) 상기 4)에서 준비된 기판에 스트렙트아비딘이 코팅된 비드(자성 나노 입자)를 얼려 상기 비드가 선택적으로 붙는지를 확인하였다. 이 때, 상기 비드는 ELISA에서 사용된 HRP 효소와 동일한 역할을 하는 것이다.

6) 이어서, PBS 버퍼를 이용하여 반응에 참가하지 않은 여액들을 제거하였다.

7) 표지된 비드(자성 나노 입자)에 대한 신호를 주파수 혼합 자기 판독기(SENOVA, Germany)를 이용하여 저주파수를 61Hz, 고주파수를 49KHz로 하여 측정하였다.

[비교예 1 및 비교예 2]

비교를 위해, 실시예 2에서 실리콘 웨이퍼만 삽입한 경우를 무처리군(비교예 1)으로 하여 실험하였고, (2)-2)까지는 동일하나 DCR-3 항원 대신 일반 증류수만 사용한 경우를 무항원군(negative reference, 비교예 2)으로 하여 실험하였다.

상기 실시예 2 및 비교예 1, 2로부터 얻은 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6의 결과로부터, 본 발명의 검출방법에 의한 경우, 실제 생체물질의 존재를 매우 안정적으로 정량 측정 가능함을 확인할 수 있다.

[실시예 3]

또한 자성나노입자를 연속된 농도로 처리한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.

[비교예 3]

실시예 3과 동일한 생체물질(DCR-3 항원) 및 동일한 제1, 제2 포획자(DCR-3 항체,이차 항체)를 사용하고, 자성나노입자 대신 HRP 효소를 표지물질로 사용하여 ELISA(Human DcR-3 BMS2031, Bender Med system) 분석을 수행한 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 실시예 3 및 비교예 3에서 얻은 결과(정량분석 그래프)를 각각 도 7a 및 도 7b에 나타내었다. 상기 도 7a 및 도 7b의 결과로부터, 본 발명의 검출방법에 의한 경우 ELISA와 유사한 고민감도로 그보다 안정하게 생체물질을 측정 가능함을 확인할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 생체물질의 정량적 검출방법을 개략적으로 나타낸 개요도이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 기판부 상에 고정화된 생체물질을 자성나노입자로 표지하는 단계를 보여주는 개략도이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 표면처리된 기판부를 보여주는 모식도이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에서 사용된 주파수 혼합 자기 판독기의 사진이다.

도 5는 실시예 1에서 얻어진 상이한 농도의 50nm 자성나노입자를 이용한 정량 곡선의 작성 및 기본 통계 자료이다.

도 6은 실시예 2, 비교예 1 및 비교예 2에서 얻어진 측정결과를 나타낸 그래프이다.

도 7a는 실시예 3에서 얻어진 정량분석 그래프이고, 도 7b는 비교예 3에서 얻어진 정량분석 그래프이다.

도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

10: 기판부 11: 실라놀 형태로 변형된 실리콘 옥사이드층

12: 아민기를 갖는 폴리머층 13: 비오틴

14: 스트렙트아비딘 20: 제1 포획자

30: 생체물질 40: 제2 포획자

50: 자성나노입자

Claims (9)

1. 스트립 유형(strip type)의 기판부 상에 고정화된 생체물질을 자성나노입자로 표지하는 단계; 및

   상기 생체물질을 표지한 자성나노입자를 주파수 혼합 방식의 자기 판독기(frequency mixing magnetic reader)를 이용하여 측정하는 단계;

   를 포함하는 생체물질의 정량적 검출방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 기판부는 자성을 띠지 않는 재질로 되어 있는 것을 특징으로 하는, 생체물질의 정량적 검출방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 기판부는 반도체 웨이퍼, 유리, 또는 석영(quartz)인 것을 특징으로 하는, 생체물질의 정량적 검출방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 자성나노입자는 1nm 내지 200nm의 입경을 갖는 것을 특징으로 하는, 생체물질의 정량적 검출방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 기판부 상에 고정화된 생체물질을 자성나노입자로 표지하는 단계는, 상기 생체물질에 대한 제1 포획자 및 제2 포획자를 이용하여 샌드위치 면역반응에 의해 수행하는 것을 특징으로 하는, 생체물질의 정량적 검출방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 기판부는 생체물질에 대한 제1 포획자가 고정 가능하도록 표면처리되어 있는 것을 특징으로 하는, 생체물질의 정량적 검출방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 제1 포획자 및 제2 포획자는 각각 항원, 항체, DNA, RNA, PNA, LNA, 합텐(hapten), 앱타머(aptamer), 아비딘, 비오틴, 스트렙트아비딘, 뉴트라비딘(neturavidin), 렉틴, 셀렉틴(selectin), 효소, 호르몬, 단백질, 수용체, 리간드, 아미노산, 올리고뉴클레오티드, 펩티드 및 올리고펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, 서로 동일하거나 상이한 것을 특징으로 하는, 생체물질의 정량적 검출방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 생체물질은 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 항원, 항체, 바이러스, 호르몬, 병원성 세균, 바이러스, 세포, 당 및 휘발 성 유기물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 생체물질의 정량적 검출방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 기판부 상에 고정화된 생체물질을 자성나노입자로 표지하는 단계 뒤에, 여분의 자성나노입자를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체물질의 정량적 검출방법.

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