KR20090033307A - Ｂ형 간염 유래 간질환 진단용 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 B형 간염에서 유래된 간질환 환자에 특이적인 HBV로부터 유래된 변형된 preS2 항원 유전자를 검출할 수 있는 간질환 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트는 서열번호 1, 2, 5 및 6의 염기서열을 갖는 프라이머 및 제한효소 Mbo II을 포함한다. 본 발명의 간질환 진단키트를 사용할 경우, B형 간염, 간경변, 간암 등의 각종 간질환에 특이적인 변이된 preS2 항원 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 용이하게 검출할 수 있으므로, 변이된 preS2 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 B형 간염 또는 상기 B형 간염에서 유래된 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있을 것이다.
간질환, HBV preS2 항원
Description
본 발명의 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 B형 간염에서 유래된 간질환 환자에 특이적인 HBV로부터 유래된 변형된 preS2 항원 유전자를 검출할 수 있는 간질환 진단용 키트에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 각종 간 질환을 유발시키는 주된 원인으로서, HBV와 간질환의 상관관계, 숙주의 면역시스템에 대한 HBV의 반응기작, HBV의 약독화방법 등 HBV와 관련된 다양한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 최근에는 국내 환자에서 분리되는 HBV 대부분이 유전형 C라고 보고됨에 따라, 간질환의 발병에 미치는 HBV 유전자형(genotype)의 영향이 주목받고 있다(참조: Kim BJ and Song BC., Korean J. Gastroenterol., 42(6):496-501, 2003). 즉, HBV는 유전형 B와 유전형 C를 동등한 수준으로 포함하는데, 유전형 C는 유전형 B 보다도 상대적으로 병원성이 높을 뿐만 아니라, HBV의 preS 항원을 암호화하는 유전자의 유전형이 유전형 B 의 것과 명백히 구별되는 것으로 알려져 있는 상황에서, 국내 환자에서 분리되는 HBV 대부분이 유전형 C라는 결과는 HBV가 지역특이적인 변이주를 발생시킬 수 있고, 이는 preS 항원과 관련될 가능성이 높다는 것을 시사하므로, 이에 대한 관심이 증폭되고 있는 실정이다.
한편, HBV 중에서 preS 항원을 암호화하는 유전자가 변이되거나 또는 preS2 항원의 N-말단 근처부위의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자가 변이된 변이주는 간암과 같은 간질환을 발병시키거나 또는 발명된 간질환을 악화시킬 수 있다고 보고되었다(참조: Hsieh Y.H., et. al., Carcinogenesis, 25:2023-2032, 2004; Raimondo G. et. al., J. Hepatol., 40:515-519, 2004). 상기 preS 항원은 전체적으로 하나의 개방해독틀(ORF)을 가지는 preS1 항원부위와 preS2 항원부위로 구성되는데, preS1 항원부위는 HBV가 간세포에 결합하는 역할 및 S 항원의 전사수준을 조절하는 역할을 수행하고, preS2 항원부위는 HBV에 숙주의 면역반응을 방어하는 역할을 수행한다.
특히, preS2 항원을 암호화하는 유전자가 변이된 변이주는 숙주에서 급발성 간염 및 간암을 유발시킬 수도 있다고 알려져 있는데, 상기 유전자 변이가 S 항원그룹(Large S 항원, Middle S 항원 및 S 항원)의 각 단백질의 발현비율을 변화시키고, 이로 인하여 S 항원그룹의 각 단백질이 세포밖으로의 분비가 저해되어 세포내에 축적되며, 세포내에 축적된 각 단백질이 세포독성을 유발시켜서, 최종적으로는 급발성 간염 및 간암을 유발시키는 것으로 예상되고 있다(참조: Chisari F.V. and Ferrari C., Annu. Rev. Immunol., 13:29-60, 1995).
이에 따라, B형 간염 및 이로부터 유래된 다양한 질병에 있어서, HBV의 변이된 preS 항원 단백질 또는 그를 암호화하는 유전자가 중요한 역할을 수행할 것으로 예상되기 때문에, HBV의 변이된 preS 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 조기에 검출하여, B형 간염 및 이로부터 유래된 다양한 질병의 발병 또는 악화를 예방하려는 노력이 계속되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 B형 간염으로부터 유래된 다양한 임상적 증상에 영향을 미치는 HBV의 변이된 preS2 항원 유전자를 발굴하고, 전기 유전자를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 특정부위가 변이된 preS2 항원 단백질이 간질환의 악화와 연관되어 있다는 사실을 발견하고, 상기 변이된 preS2 항원 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 검출할 수 있는 키트를 이용할 경우, 변이된 preS2 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 변이된 preS2 항원 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 검출하여, B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환을 용이하게 진단할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 B형 간염에서 유래된 간질환 환자에 특이적인 HBV로부터 유래된 변형된 preS2 항원 유전자를 검출할 수 있는 간질환 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 간질환 진단키트를 사용할 경우, B형 간염, 간경변, 간암 등의 각종 간질환에 특이적인 변이된 preS2 항원 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 용이하게 검출할 수 있으므로, 변이된 preS2 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 B형 간염 또는 상기 B형 간염에서 유래된 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있을 것이다.
본 발명자들은 HBV에 감염된 간질환 환자의 혈액으로부터 DNA를 수득하고, 이에 포함된 HBV preS 항원의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 일부 환자로부터 수득한 preS2 영역의 22번 위치(preS1 영역의 141번 위치)의 아미노산을 암호화하는 코돈이 페닐알라닌을 암호화하는 코돈인 ttt가 아닌, 류신을 암호화하는 코돈인 ctt로 변이된 형태("F141L")로 존재하며, 임상증상의 악화정도가 악화될수록(만성간염->간경변->간암), 특히 간암환자에서 상기 유전자 변이의 변이율이 증가함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명자들은 F141L 변이된 preS2 항원 단백질 유전자를 포함하는 HBV는 간염의 증상을 악화시킬 수 있는 병원성이 높은 균주이고, 이를 조기에 진단할 경우, B형 간염으로부터 유래된 간질환의 발병을 예방할 수 있을 것으로 판단하였는 바, F141L 변이된 preS2 항원 단백질을 유전자 또는 단백질 수준에서 검출하여, B형 간염, 간경변, 간암 등의 각종 간 질환을 진단할 수 있는 키트를 개발하게 되었다.
본 발명의 일 실시태양에 의하면, B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트는 서열번호 1, 2, 5 및 6의 염기서열을 갖는 프라이머 및 제한효소 Mbo II을 포함하는 Mbo-II PRA(PCR-Restriction analysis) 키트이다. 이때, B형 간염에서 유래된 간질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 간암 또는 간경변이다. 상기 Mbo-II PRA 키트를 이용할 경우에는, 환자에서 수득한 DNA를 이용하여, 환자에 감염된 HBV의 preS2 항원의 F141L 변이를 검출함으로써, 전기 변이된 preS2 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 간질환을 용이하게 진단할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에 의하면, B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트는 F141L 변이를 검출할 수 있는 DNA 칩을 포함한다.
즉, 본 발명의 B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트는 (ⅰ) B형 간염 바이러스(HBV)의 preS2 항원 단백질의 preS1 영역의 시작부위로부터 141번 위치의 아미노산 또는 preS2 영역의 시작부위로부터 22번 위치의 아미노산이 페닐알라닌에서 류신으로 치환된 preS2 항원 단백질(F141L preS2)을 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합하는 염기서열을 갖는 유전자 탐침; (ⅱ) (dT)15, -(CH2)6- 및 아민기를 순차적으로 포함하고, 상기 유전자 탐침의 5′말단이 상기 dT의 티민부위에 연결된 링커; 및, (ⅲ) 표면에 알데히드가 부착되고, 상기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base) 반응을 통해 연결된 고체기판을 포함한다. 이때, 상기 preS2 항원 단백질(F141L preS2)을 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합하는 염기서열은 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 7 내지 14 중 어느 하나의 염기서열을 사용함이 바람직하고, B형 간염에서 유래된 간질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 간암 또는 간경변이다. 상기 DNA 칩을 포함하는 간질환 진단키트를 이용할 경우, 대량의 시료로부터 HBV의 preS2 항원 단백질의 F141L 변이를 검출함으로써, 전기 변이된 preS2 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 간질환을 용이하게 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 의하면, B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트는 F141L 변이된 preS2 항원 단백질을 검출할 수 있는 ELISA키트이다.
즉, 본 발명의 B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 ELISA키트는 (ⅰ) B형 간염 바이러스(HBV)의 preS2 항원 단백질의 preS1 영역의 시작부위로부터 141번 위치의 아미노산 또는 preS2 영역의 시작부위로부터 22번 위치의 아미노산이 페닐알라닌에서 류신으로 치환된 preS2 항원 단백질(F141L preS2)에 대한 토끼의 항체가 고정된 고정기판; (ⅱ) 페록시다제로 표지된, 상기 preS2 항원 단백질(F141L preS2)에 대한 염소의 항체용액; 및, (ⅲ) 페록사이드를 포함한다. 이때, B형 간염에서 유래된 간질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 간암 또는 간경변이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: preS2 항원의 유전자 변이주의 검색
실시예 1-1: HBV 환자의 DNA 수득
120 명의 HBV에 감염된 간질환 환자(간암 환자 40명, 간경변 21명, 만성간염 21명, 보균자 38명)로부터 채혈한 혈액으로부터 DNA를 수득하였다: 각 환자로부터 수득한 혈액의 혈청 100㎕에 DNAzol(Molecular Research Center, Inc., USA) 500㎕를 가하여 1분간 혼합하고, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(50:49:1, v/v/v) 혼합용매 500㎕를 가한 다음, 실온에서 10분간 12,000rpm으로 원심분리하여 상층액 400㎕를 수득하였다. 전기 상층액에 이소프로판올 260㎕를 가하고 4℃에서 10분간 15,000rpm으로 원심분리하여 침전물을 수득한 다음, 전기 침전물을 70% 에탄올로 세척하고, 다시 Tris 완충용액(pH 7.8) 30㎕에 용해시켜 각 환자의 DNA를 수득하였 다.
실시예 1-2: HBV preS2 항원의 염기서열 분석
전기 수득한 HBV 환자의 DNA에 존재하는 HBV DNA의 preS2 항원 유전자 변이양상을 분석하기 위하여, 환자의 DNA에 존재하는 S 항원영역의 유전자를 포함하는 HBV DNA를 수득하고, 이 중에서 preS1 항원 및 preS2 항원을 암호화하는 유전자를 선별한 다음, 선별된 유전자에 포함된 preS2 항원을 암호화하는 유전자의 유전형 변이양상을 분석하였다.
먼저, 전기 실시예 1-1에서 수득한 환자의 DNA를 주형으로 하고, 하기의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 DelF2 및 역방향 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여(first denaturation: 85℃ 10분; 30 cycle: denaturation(95℃ 45초), annealing(58℃ 60초) 및 extension(72℃ 90초); final extension: 72℃ 5분), 총 1491bp의 PCR 절편(S 항원영역의 유전자를 포함하는 HBV DNA)을 수득하였다.
정방향 프라이머(DelF2): 5'-gggtcaccatattcttggg-3'(서열번호 1)
역방향 프라이머(HB2R): 5'-catactttccaatcaatagg-3'(서별번호 2)
그런 다음, 전기 수득한 PCR 절편을 주형으로 하고, 하기의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동 일한 방법을 수행하여, 총 663bp의 PCR 절편(preS1 항원 및 preS2 항원을 암호화하는 유전자)을 수득하였다.
정방향 프라이머(Del-PRA-F1): 5'-cttgggaacaagagctacagc-3'(서열번호 3)
역방향 프라이머(PreS-R1): 5'-ttgagagaagtccaccacga-3'(서열번호 4)
상기 수득한 절편을 자동염기서열 분석장치(Applied Biosystems Model 377 DNA Automatic Sequencer, Perkin-Elmer Applied Biosystems, UK)에 적용하여, 모든 preS1 및 preS2의 지역을 포함하는 총 522bp의 염기서열과 상기 염기서열에 의하여 발현될 수 있는 단백질의 아미노산 서열을 결정하였다.
그런 다음, 결정된 염기서열 및 아미노산 서열을 염기서열 분석프로그램(DNASTAR Megalign, Window Version 3.12e, Madison, USA)에 적용하여 GenBank에 등록된 HBV의 표준균주의 preS2의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 유전자의 염기서열과 비교분석함으로써, 각 환자로부터 유래된 preS2 항원 유전자의 유전형 변이양상을 분석하였다(참조: 도 1a 및 도 1b).
도 1a는 간암 환자, 간경변 환자 및 HBV 보균자로부터 유래된 preS2 항원의 아미노산 서열을 표준균주의 것과 비교한 그림으로서, 1번 열은 표준균주의 preS2 항원의 아미노산 서열이고, 2 내지 4번 열은 간암 환자에서 유래된 preS2 항원의 아미노산 서열이며, 5 내지 8번 열은 간경변 환자에서 유래된 preS2 항원의 아미노 산 서열이고, 9 내지 12번 열은 보균자에서 유래된 preS2 항원의 아미노산 서열이다.
한편, 도 1b는 간암 환자, 간경변 환자 및 보균자로부터 유래된 preS2 항원을 암호화하는 유전자의 염기서열을 표준균주의 것과 비교한 그림으로서, 1 내지 12번 열은 도 1a의 것과 동일하다.
도 1a에서 보듯이, 간암 및 간경변 환자로부터 유래된 preS2 항원은 preS2의 시작 부위에서 22번째(preS1의 시작부위에서 141번째)의 아미노산이 류신이거나 결실되었음에 반하여, 표준균주의 preS2 항원 및 보균자로부터 유래된 preS2 항원은 preS2의 시작 부위에서 22번째(preS1의 시작부위에서 141번째)의 아미노산이 페닐알라닌임을 알 수 있었다.
또한, 도 1b에서 보듯이, 표준균주의 preS2 항원 또는 보균자로부터 유래된 preS2 항원의 preS2의 시작 부위에서 22번째 아미노산을 암호화하는 유전자는 ttt임에 반하여, 간암 및 간경변 환자로부터 유래된 preS2 항원의 preS2의 시작 부위에서 22번째 아미노산을 암호화하는 유전자는 ctt 이거나 또는 결실되었음을 알 수 있었다.
이로부터, 간암 및 간경변 환자로부터 유래된 preS2 항원 유전자는 preS1의 시작부위에서 141번째 아미노산을 암호화하는 유전자가 류신을 코딩하는 코돈을 포함하는 변이형태("F141L")로 존재함을 확인할 수 있었다.
상술한 preS2 항원 단백질의 변이를 나타내는 시료를 HBV 환자의 유형에 따라 분류하였다(참조: 표 1). 이때, 변이율은 전체 환자수에 대한 변이 유전자를 갖는 환자수의 비율로 산출하였다.
| 환자유형 | 환자수(변이율%) | ||
| 전체 | 정상 | F141L* | |
| 간암 | 40 | 31(77.5) | 9(22.5) |
| 간경변 | 21 | 19(90.5) | 2(9.5) |
| 만성간염 | 21 | 20(95.2) | 1(4.8) |
| HBV 보균자 | 38 | 38(100) | 0(0) |
*: F141L 변이를 나타내는 환자수를 의미한다.
상기 표 1에서 보듯이, 상기 preS2 항원의 변이(F141L)는 보균자에서는 발견되지 않았으나, 간질환 환자에게서는 모두 발견되었고, 간질환의 정도가 악화될 수록 변이 항원 단백질의 변이율이 증가함을 알 수 있었으므로, preS2 항원의 변이가 간암의 발병과 관련성이 있음을 알 수 있었다.
한편, 유전형 C를 갖는 다양한 HBV(PRE-SE25-HCC, Jeju-HCC-42)의 감염에 의한 간암 환자 및 유전형 C를 갖는 다양한 HBV(PRE-AHEPA-55-2, PRE-HE61-LC)의 감염에 의한 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS2 항원 유전자를 대상으로 하여 상술한 바와 동일한 방법으로 염기서열을 분석한 결과, PRE-SE25-HCC의 감염에 의한 간암 환자에서 유래된 HBV의 preS2 항원 유전자(서열번호 15), Jeju-HCC-42의 감염에 의한 간암 환자에서 유래된 HBV의 preS2 항원 유전자(서열번호 16), PRE-AHEPA-55-2의 감염에 의한 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS2 항원 유전자(서열번호 17) 및 PRE-HE61-LC의 감염에 의한 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS2 항원 유전자(서열번호 18)는 모두 preS2의 시작 부위에서 22번째 아미노산을 암호화하는 유전자가 CTT임을 확인하였다.
또한, 상기 간암 환자 및 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS2 항원을 대상으로 하여 상술한 바와 동일한 방법으로 아미노산 서열을 분석한 결과, PRE-SE25-HCC의 감염에 의한 간암 환자에서 유래된 HBV의 preS2 항원(서열번호 19), Jeju-HCC-42의 감염에 의한 간암 환자에서 유래된 HBV의 preS2 항원(서열번호 20), PRE-AHEPA-55-2의 감염에 의한 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS2 항원(서열번호 21) 및 PRE-HE61-LC의 감염에 의한 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS2 항원(서열번호 22)는 모두 preS2의 시작 부위에서 22번째 아미노산이 류신임을 확인하였다.
따라서, preS2 항원의 변이(F141L)가 간암 및 간경변의 발병과 관련성이 있음을 다시 한번 확인할 수 있었다.
실시예 2: Mbo-II PRA(PCR-Restriction analysis) 키트에 의한 변이된 preS2 항원의 검출
직접염기서열 분석없이 제한효소 처리만으로 변이된 preS2 항원을 검출할 수 있는 방법으로서, 다음과 같이 Mbo-II PRA(PCR-Restriction analysis) 키트를 작제하였다.
실시예 2-1: Mbo-II PRA 키트의 작제
화학적으로 합성한 프라이머인 DelF2(서열번호 1), 역방향 프라이머인 HB2R(서열번호 2), 하기의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머(MboF), 하기의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머(MboR) 및 제한효소 Mbo-II((주)다카라, 일본)를 포함하는 Mbo-II PRA 키트를 작제하였다.
정방향 프라이머(MboF): 5'-acctctaagagacagccatcc-3'(서열번호 5)
역방향 프라이머(MboR): 5'-attgacgatatgggtgaggc-3'(서열번호 6)
실시예 2-2: Mbo-II PRA 키트를 이용한 F141L 변이주의 검출
전기 Mbo-II PRA 키트에 포함된 4종의 프라이머를 이용하여, 네스티드 PCR(nested PCR)을 실시하였다.
먼저, 실시예 1-1에서 수득한 각 환자(만성 간염환자, 간경변환자 및 간암환자)의 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 DelF2(서열번호 1)과 HB2R(서열번호 2)를 이용하여 첫 번째 PCR을 수행하였다.
그런 다음, 첫 번째 PCR 산물을 주형으로 하고, 프라이머 MboF(서열번호 3)와 MboR(서열번호 4)을 이용하여 두 번째 PCR을 수행함으로써, 162bp의 증폭산물을 수득하였다
그런 다음, 전기 162bp의 증폭산물 10㎕에 gaaga(n)8 부위를 인지하는 Mbo II 0.5㎕(5U), 10배 제한효소 완충용액 2㎕ 및 멸균 증류수를 넣어 최종부피를 20㎕로 적정하고, 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 이를 전기영동하여 증폭산물의 패턴을 확인하였다(참조: 도 2).
도 2는 Mbo II PRA 키트를 이용하여 변이된 preS2 항원의 유전자를 판별한 결과를 나타내는 전기영동사진으로서, 상단은 Mbo II PRA 키트에 적용하지 않은 유전자의 전기영동사진이고, 하단은 Mbo II PRA 키트에 적용하여 절단된 유전자의 전기영동사진이며, 전기영동사진의 각 레인은 각 환자로부터 유래된 PCR 산물을 나타낸다.
도 2에서 보듯이, 레인 1, 3, 4, 5, 6, 7은 결손변이 없이 정상적인 162-bp의 증폭산물을 보여주고, 레인 2는 결손 유전자가 존재하여 정상보다 약간 작은 크기의 증톡산물을 생산함을 보여준다. 특히, 하부의 전기영동사진에서 보듯이, 레인 4, 6 및 7은 preS2에 F141L 유전자 변이를 가지고 있어 완전하게 79bp 및 83bp크기의 절편으로 절단되었으나, 두 절편의 크기가 유사하여 전기영동상에서는 한 개의 밴드로 나타났다. 또한, 레인 1, 3 및 5는 유전자 변이가 존재하지 않고 야생형만이 존재하므로, 결과적으로 야생형에 해당하는 162bp 크기의 밴드가 나타났다.
한편, 레인 2는 유전자 변이를 포함하는 절편임에도 불구하고, 야생형과 동등한 수준의 162bp 보다 약간 작은 크기의 밴드가 나타났는 바, 이는 preS2 F141L 유전자 변이가 아닌 다른 변이에 의한 것이기 때문인 것으로 예측되었다.
상기 도 2에서 보듯이, Mbo II PRA 키트를 이용할 경우에는, 야생형 preS2 항원 유전자 및 변이된 preS2 항원 유전자를 구별할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 결손 유전자 변이가 존재하는 시료까지도 확인할 수 있으므로, 변이된 preS2 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있을 것이다.
실시예 3: DNA 칩을 이용한 변이된 preS2 항원 유전자의 검출
HBV의 preS2 항원 유전자에서 F141L 변이를 검출할 수 있는 DNA 칩을 작제하고 이를 이용하여, 환자에게서 변이된 preS2 항원 유전자를 검출하고자 하였다.
실시예 3-1: DNA 칩의 작제
먼저, F141L 변이 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 다음과 같은 염기서열을 갖는 각각의 탐침을 제조하였다:
대조용 탐침:
5'-taccgacgagcccacacgacggttgac-3'(서열번호 7),
5'-gggttccagaatgtattctcctgagaa-3'(서열번호 8)
검출용 탐침:
5'-cgacgagcctacacgacggtt-3'(서열번호 9),
5'-taccgacgagcctacacgacggttgacctaggacgc-3'(서열번호 10),
5'-taccgacgagcctacacgacggttgacctaggacgcgccctg-3'(서열번호 11),
5'-ttccagaatatattctcctga-3'(서열번호 12),
5'-gccctggggttccagaatatattctcctgagaacctgag-3'(서열번호 13),
5'-ctaggacgcgccctggggttccagaatatattctcctgagaacctgagagtcgttac-3'(서열번호 14)
다음으로, 올리고 (dT)15, -(CH2)6- 및 아민기가 순차적으로 연결된 링커를 제조한 다음, 전기 제조한 각 탐침의 5' 말단을 링커의 티민부위에 연결시켰다. 이어, 전기 링커와 연결된 탐침을 완충용액(350mM sodium bicarbonate, pH 9.0)에 각각 50μM로 용해시키고, 알데히드가 부착된 슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, USA) 표면에 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 크기 150㎛, 간격 400㎛로 점적한 후, 시프염기 반응을 수행하였다. 이어, 0.2%(w/v) SDS용액과 3차 증류수를 이용하여 순차적으로 세척하고, NaBH4 용액(0.1g NaBH4, 30㎖ PBS, 10㎖ ethanol)에 15분 동안 침지하여, 아민이 결합되지 않은 알데히드 잔기를 환원시킨 후, 3차 증류수로 세척하고 건조시켜서 DNA 칩을 작제하였다.
실시예 3-2: DNA 칩을 이용한 F141L 변이주의 검출
전기 실시예 3-1에서 작제한 DNA 칩을 이용하여, HBV 환자로부터 F141L 변이를 검출하였다.
먼저, 전기 실시예 1에서 준비된 197명의 HBV에 감염된 간질환 환자(간암 환자 55명, 간경변 52 명, 만성간염 45명, 보균자 45 명)로부터 채취한 혈액을 RNA 추출키트(Micro-to-Midi Total RNA purification system, Life Technologies, USA)에 적용하여, 각각의 mRNA를 분리하고, 역전사 키트(Platinum Biochip Reagent Kit, Genocheck, 한국) 및 시아닌 5 dGTP(Cyanine 5 dGTP, Amersham, GB)를 이용하여 전기 분리된 mRNA로부터 형광표지된 각각의 cDNA를 합성하였다.
이어, 전기 실시예 3-1에서 작제된 DNA 칩에 전기 합성된 각 cDNA를 가하고, 혼성화반응을 12시간동안 수행한 후, 혼성화반응이 종결된 DNA 칩을 평판 스캐너(GenePix Scanner 4000A, Axon Inc, USA)으로 스캔하여, 전기 DNA 칩에 구비된 대조용 탐침과 검출용 탐침에서 형광발색반응을 나타내는 시료를 확인한 결과, 전기 실시예 1-2의 표 1에서 정상적인 preS2 항원 유전자를 갖는 것으로 판별된 환자의 시료는 대조용 탐침에서 형광발색반응을 나타내었고, 변이된 preS2 항원 유전자를 갖는 것으로 판별된 환자의 시료는 검출용 탐침에서 형광발색반응을 나타내었다.
따라서, 상기 DNA 칩을 포함하는 간질환 진단키트를 이용하면, HBV에 감염된 환자로부터 변이된 preS2 항원 유전자를 용이하게 검출할 수 있으므로, 변이된 preS2 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있을 것이다.
실시예 4: F141L 변이주 특이적인 ELISA 키트를 이용한 간암 특이적인 F141L preS2 항원의 검출
실시예 4-1: 간암 특이적인 F141L preS2 항원의 수득
우선, 실시예 1-2에서 수득한 F141L 변이를 갖는 preS2 항원 유전자(서열번호 14)와 6개의 히스티틴을 암호화하는 유전자를 pPIC9K(Invitrogen, USA) 플라스미드 벡터의 다클론부위에 순서대로 삽입하여 F141L 변이를 갖는 preS2 항원의 C-말단에 6개의 히스티딘 잔기가 포함된 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는 재조합 벡터를 수득하고, 이를 제한효소 Bgl II로 처리하여 직쇄형태로 형성한 다음, 공지된 방법에 따라 피치아 균주(Pichia pastoris, GS115 strain)에 도입하여(참조: Protocol of Multi-Copy expression kit, Version F 01/03/02, Invitrogen, USA), 형질전환체를 수득하였다.
상기 수득한 형질전환체를 공지된 방법에 따라 BMGY/BMMY 배지를 사용하여 6일 동안 배양하고(참조: Protocol of Multi-Copy expression kit, Version F 01/03/02, Invitrogen, USA), 배양물을 5000rpm으로 원심분리하여 배양된 세포를 수득하였다.
상기 수득한 세포에 1X Trypsin-EDTA(GIBCO, Invitrogen, USA)를 처리하고, 멸균한 PBS로 세척한 후, 세포용해 완충용액(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 1mM EDTA, 0.1 % SDS, 1X Protease Inhibitor, Calbiochem, USA) 50㎕를 가한 다음, 초음파 처리장치(sonicator, Minonix, USA)로 처리하여, 세포 파쇄물을 수득하였다.
상기 수득한 세포 파쇄물을 50um 기공 크기를 갖는 미세필터(Millipore, USA)에 가하여 여과하고, 이를 Ni-NTA 레진(Qiagen, Japan)이 충진된 컬럼에 적용한 다음, 이에 용출용 완충용액(10mM KH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole, 8% glycerol, 0.2% Triton X-100, pH 7.8)을 가하여, 목적하는 F141L 변이를 갖는 preS2 항원을 수득하였다.
실시예 4-2: F141L 변이주 특이적인 ELISA 키트의 작제
상기 실시예 4-1에서 수득한 F141L preS2 항원(서열번호 18) 2㎖(10㎎/㎖)과 애주번트 2㎖을 혼합하고, 전기 혼합물을 7주령 웅성 토끼에 1주 간격으로 3회 주사한 다음, 2주간격으로 2회 주사하였다. 이어, 토끼의 혈액을 일부 채취하여, F141L preS2 항원에 대한 역가를 측정한 다음, 심장천공법(cardiac puncture)을 이용하여 토끼의 혈액을 모두 채취하였다. 전기 채취한 혈액은 상온에서 24시간 동안 방치하여, 상층액인 혈장부분만을 수득하였다. 이어, 전기 혈장을 12% 아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동법에 적용하여, 전기영동하고, F141L preS2 항원을 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여, 항체부분의 분자량을 확인하였다. 전기 확인된 분자량을 분리할 수 있는 젤여과 크로마토그래피에 전기 혈장을 적용하여, F141L preS2 항원에 대한 토끼의 항체를 활성분획으로 수득하였다.
또한, 상기 토끼 대신에 염소를 이용한 것을 제외하고는, 상술한 방법과 동일한 방법을 이용하여 F141L preS2 항원에 대한 염소의 항체를 수득하고, 전기 수득한 F141L preS2 항원에 대한 염소의 항체에 페록시다제를 표지하였다.
그런 다음, 상기 수득한 F141L preS2 항원에 대한 토끼의 항체를 유리판 재질의 고정기판위에 고정시키고, 전기 페록시다제가 표지된 F141L preS2 항원에 대한 염소의 항체용액 100㎕와 50%(v/v) 글리세롤이 함유된 트리스 완충용액(50mM 트리스/HCl, pH 8.0) 900㎕를 혼합하여 제 2항체를 제조하였으며, 발색제인 페록사이드(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, PIERCE, USA)를 별도로 준비하여, F141L 변이주 특이적인 ElISA 키트를 제작하였다.
실시예 4-3: F141L 변이주 특이적인 ELISA 키트를 이용한 간암 특이적인 F141L preS2 항원의 검출
전기 실시예 1에서 수득한 F141L 변이를 나타내는 9명의 간암환자 및 9명의 정상인으로부터 각각의 간세포를 수득하고, 각각의 세포를 파쇄한 다음, 상기 파쇄물을 상기 실시예 4-2에서 작제한 ELISA 키트에 적용하였다. 그 결과, F141L 변이를 나타내는 9명의 간암환자로부터 수득한 간세포에 존재하는 F141L preS2 항원이 검출되었으나, 정상인으로부터 수득한 간세포에 존재하는 야생형 preS2 항원은 상기 ELISA 키트에 의하여 검출되지 않음을 알 수 있었다.
도 1a는 간암 환자(2 내지 4번 열), 간경변 환자(5 내지 8번 열) 및 보균자(9 내지 12번 열)로부터 유래된 preS2 항원의 아미노산 서열을 표준균주(1번 열)의 것과 비교한 그림이다.
도 1b는 간암 환자(2 내지 4번 열), 간경변 환자(5 내지 8번 열) 및 보균자(9 내지 12번 열)로부터 유래된 preS2 항원을 암호화하는 유전자의 염기서열을 표준균주(1번 열)의 것과 비교한 그림이다.
도 2는 Mbo II PRA 키트를 이용하여 변이된 preS2 항원의 유전자를 판별한 결과를 나타내는 전기영동사진으로서, 상단은 Mbo II PRA 키트에 적용하지 않은 유전자의 전기영동사진이고, 하단은 Mbo II PRA 키트에 적용하여 절단된 유전자의 전기영동사진이다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION
<120> A Diagnostic Kit for Hepatitis B-Associated Hepatic Disorder
Comprising HBV preS2 Antigen
<160> 22
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
gggtcaccat attcttggg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
catactttcc aatcaatagg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
cttgggaaca agagctacag c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
ttgagagaag tccaccacga 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
acctctaaga gacagccatc c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
attgacgata tgggtgaggc 20
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 7
taccgacgag cccacacgac ggttgac 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 8
gggttccaga atgtattctc ctgagaa 27
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 9
cgacgagcct acacgacggt t 21
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 10
taccgacgag cctacacgac ggttgaccta ggacgc 36
<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 11
taccgacgag cctacacgac ggttgaccta ggacgcgccc tg 42
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 12
ttccagaata tattctcctg a 21
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 13
gccctggggt tccagaatat attctcctga gaacctgag 39
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 14
ctaggacgcg ccctggggtt ccagaatata ttctcctgag aacctgagag tcgttac 57
<210> 15
<211> 165
<212> DNA
<213> PRE-SE25-HCC
<400> 15
atgcagtgga actccaccac atttcaccaa gctctgctag atcccagagt gaggggccta 60
tatcttcctg ctggtggctc cagttccgga acagtaaacc ctgttccgac tactgcctca 120
cccatatcgt caatcttctc gaggactggg gaccctgcac cgaac 165
<210> 16
<211> 165
<212> DNA
<213> Jeju-HCC-42
<400> 16
atacagtgga actccacaac attccaccaa gctctgctag atcccagagt gaggggccta 60
tatcttcctg ctggtggctc cagttccgga acagtaaacc ctgttccgac tactgcctct 120
cccatatcgt caatcttctc gaggactggg gaccctgcac cgaac 165
<210> 17
<211> 165
<212> DNA
<213> PRE-AHEPA55-2
<400> 17
gcgcagtgga actccacaac attccatcaa gctctgctag atcccagagt gaggggccta 60
tatcttcctg ctggtggctc cagttccgga acagtaaacc ctgttccgac tactgcctct 120
cccatatcgt caatcttctc gaggactggg gaccctgcac cgaac 165
<210> 18
<211> 165
<212> DNA
<213> PRE-HE61-LC
<400> 18
acgcagtgga actccacaac attccaccaa gctctgctag atcccagagt gaggggccta 60
tatcttcctg ctggtggctc cagttccgga acagtaaacc ctgttccgac tactgcctca 120
cccatatcgt caatcttctc gaggactggg gaccctgcac cgaac 165
<210> 19
<211> 55
<212> PRT
<213> PRE-SE25-HCC
<400> 19
Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg
1 5 10 15
Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val
20 25 30
Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg
35 40 45
Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn
50 55
<210> 20
<211> 55
<212> PRT
<213> Jeju-HCC-42
<400> 20
Ile Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg
1 5 10 15
Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val
20 25 30
Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg
35 40 45
Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn
50 55
<210> 21
<211> 55
<212> PRT
<213> PRE-AHEPA55-2
<400> 21
Ala Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg
1 5 10 15
Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val
20 25 30
Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg
35 40 45
Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn
50 55
<210> 22
<211> 55
<212> PRT
<213> PRE-HE61-LC
<400> 22
Thr Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg
1 5 10 15
Val Arg Gly Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val
20 25 30
Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg
35 40 45
Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn
50 55
Claims (9)
- 서열번호 1, 2, 5 및 6의 염기서열을 갖는 프라이머 및 제한효소 Mbo II을 포함하며, B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트.
- 제 1항에 있어서,B형 간염에서 유래된 간질환은 간암 또는 간경변인 것을 특징으로 하는B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트.
- (ⅰ) B형 간염 바이러스(HBV)의 preS2 항원 단백질의 preS1 영역의 시작부위로부터 141번 위치의 아미노산 또는 preS2 영역의 시작부위로부터 22번 위치의 아미노산이 페닐알라닌에서 류신으로 치환된 preS2 항원 단백질(F141L preS2)을 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합하는 염기서열을 갖는 유전자 탐침;(ⅱ) (dT)15, -(CH2)6- 및 아민기를 순차적으로 포함하고, 상기 유전자 탐침의 5′말단이 상기 dT의 티민부위에 연결된 링커; 및,(ⅲ) 표면에 알데히드가 부착되고, 상기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base) 반응을 통해 연결된 고체기판을 포함하는, B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트.
- 제 3항에 있어서,상기 preS2 항원 단백질(F141L preS2)을 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합하는 염기서열은 서열번호 7 내지 14 중 어느 하나의 염기서열인 것을 특징으로 하는B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트.
- 제 3항에 있어서,B형 간염에서 유래된 간질환은 간암 또는 간경변인 것을 특징으로 하는B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트.
- B형 간염, 간경변 또는 간암에 특이적이고, 서열번호 15 내지 18로부터 선택되는 1개의 염기서열을 가지는, HBV의 preS2 항원을 암호화하는 유전자.
- B형 간염, 간경변 또는 간암에 특이적이고, 서열번호 19 내지 22로부터 선택 되는 1개의 아미노산 서열을 가지는, HBV의 preS2 항원 단백질.
- (ⅰ) B형 간염 바이러스(HBV)의 preS2 항원 단백질의 preS1 영역의 시작부위로부터 141번 위치의 아미노산 또는 preS2 영역의 시작부위로부터 22번 위치의 아미노산이 페닐알라닌에서 류신으로 치환된 preS2 항원 단백질(F141L preS2)에 대한 토끼의 항체가 고정된 고정기판;(ⅱ) 페록시다제로 표지된, 상기 preS2 항원 단백질(F141L preS2)에 대한 염소의 항체용액; 및,(ⅲ) 페록사이드를 포함하는, B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 ELISA키트.
- 제 8항에 있어서,B형 간염에서 유래된 간질환은 간암 또는 간경변인 것을 특징으로 하는B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 ELISA키트.
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| KR1020070098527A KR20090033307A (ko) | 2007-09-29 | 2007-09-29 | Ｂ형 간염 유래 간질환 진단용 키트 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2012068919A1 (zh) * | 2010-11-23 | 2012-05-31 | 深圳华大基因科技有限公司 | DNA文库及其制备方法、以及检测SNPs的方法和装置 |
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2007
- 2007-09-29 KR KR1020070098527A patent/KR20090033307A/ko not_active Ceased
Cited By (2)
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| WO2012068919A1 (zh) * | 2010-11-23 | 2012-05-31 | 深圳华大基因科技有限公司 | DNA文库及其制备方法、以及检测SNPs的方法和装置 |
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