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KR20090031696A - 토마토 토르라도 바이러스­저항성 식물 - Google Patents

토마토 토르라도 바이러스­저항성 식물 Download PDF

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KR20090031696A
KR20090031696A KR1020087032098A KR20087032098A KR20090031696A KR 20090031696 A KR20090031696 A KR 20090031696A KR 1020087032098 A KR1020087032098 A KR 1020087032098A KR 20087032098 A KR20087032098 A KR 20087032098A KR 20090031696 A KR20090031696 A KR 20090031696A
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KR
South Korea
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plant
totv
tomato
markers
resistant
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KR1020087032098A
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Inventor
파울루스 코르넬리스 마리스
하안 아니타 아프케 데
요하네스 헨드리쿠스 마리아 바르텐
덴 호이벨 요하네스 프란시스쿠스 요한나 마리아 반
Original Assignee
드 루이터 씨즈 알 앤 디 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 드 루이터 씨즈 알 앤 디 비.브이. filed Critical 드 루이터 씨즈 알 앤 디 비.브이.
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Abstract

본 발명은 게놈 중에 토마토 토르라도 바이러스 (ToTV)에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 하나 이상의 대립인자를 갖는 토마토 식물로서, 상기 바이러스는 2004년 11월 24일에 기탁자 참조 번호 ToTV-EOl (DSM 16999) 하에 독일 미생물 자원 센터에 기탁된 것인 토마토 식물에 관한 것이다.
ToTV

Description

토마토 토르라도 바이러스­저항성 식물{ToTV-resistant plants}
본 발명은 바이러스 저항성 식물 및 그 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 토마토 토르라도 바이러스(Tomato torrado virus, ToTV)에 대한 저항성이 있는 식물, 그 식물을 생산하는 방법 및 그 방법에 의해 얻어진 식물 및 식물 부분에 관한 것이다.
토마토 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum) (종래 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum))은 많은 바이러스 종에 감염되기 쉽다. 가장 현저한 토마토 바이러스의 일부는 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus, TSWV; 토스포바이러스(Tospovirus) 속); 펩피노 모자이크 바이러스 (Pepino mosaic virus, PepMV; 포텍스바이러스(Potexvirus) 속), 및 토마토 황화 잎 말림 바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV; 베고모바이러스(Begomovirus) 속)를 포함한다. 이들 질병이 상기 식물에 끼친 손해는 잎의 탈색 및 괴사 손상부터, 심각한 농작물 손실 및 상기 식물의 죽음에까지 이른다.
저항성 식물을 제공하는 능력은 상업적인 재배자에게 매우 중요해서, 경제적으로 가장 큰 손해를 주는 일부 바이러스에 대한, 저항성 식물은 생산되고 있다. 그러나, 때때로 농작물에 상당한 손해를 미칠 수 있는 새로운 바이러스가 출현한 다.
1996년에 새로운 토마토 바이러스가 1993년 이래로 미국 및 이탈리아에서 토마토 식물을 감염시켰고, 토마토 감염성 황백화 바이러스(Tomato infectious chlorosis virus, TICV; 크리니바이러스(Crinivirus) 속; Duffus 등, 1996)로 명명되었던 것으로 보고되었다. 동일한 속의 또 다른 새로운 토마토 바이러스가 1998에 보고되었다. 이 바이러스는 1989년 이래로 미국에서 토마토 식물을 감염시켰던 것으로 보이고 토마토 황백화 바이러스(Tomato chlorosis virus, ToCV; Wisler 등, 1998)로 명명되었다. 이들 새로운 바이러스 모두는 매우 효과적인 질병-전달 벡터인 곤충, 가루이(whitefly)에 의해 퍼지는 것으로 밝혀졌다.
알려진 바이러스의 지리적 분포는 증가할 것이고 새로운 균주(strain) 또는 새로운 바이러스를 생성하도록 하는 부분적으로 다른 바이러스들의 재조합의 결과로서, 새로운 바이러스가 지속적으로 출현하는 것으로, 일반적으로 여겨지고 있다. 저항성 품종의 개발은 이들 질병의 성공적인 관리에 있어서 중요한 역할을 수행할 수 있다.
최근, 임의의 알려진 바이러스에 의해 기인될 수 없는 ("토르라도(torrado)" 질병으로 지역적으로 알려진) 증상을 일으키는, 토마토 식물에 관한 새로운 바이러스가 스페인에서 발견되었다. 상기 식물은 잎 상에서 괴사 손상 및 열매 상에서 갈색 고리(brown ring)를 나타냈고, 감소된 성장을 보였다. 혈청 시험(ELISA)은 페피노 모자이크 바이러스 (PepMV)의 존재를 가리켰다. 전자 현미경 조사는 실제로 포텍스바이러스에 관한 전형적인 막대(rod)-유사 입자를 밝혀냈다. 그러나, 또한 구 형 형상의 바이러스 입자가 감염된 잎 조직에서 발견되었다. 본 발명자들은 페피노 모자이크 바이러스(PepMV)와의 상기 복합체로부터 상기 새로운 바이러스를 분리할 수 있었다. 상기 새로운 바이러스는 2004년 11월 24일에 기탁자 참조 번호(depositors reference number) ToTV-EOl(DSM 16999) 하에 독일 미생물 자원 센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁된, 토마토 토르라도 바이러스 (Tomato torrado virus, ToTV)라고 임시로 명명되었고, 이는 "토르라도(torrado)"(스페인), "마르키테츠(marchitez)" 또는 "초코렛(chocolate)"(멕시코 및 과테말라)으로 알려진 토마토에 영향을 미치는 질병의 병원체이다. 또한 상기 바이러스는 솔라눔(Solanum)의 다른 속에서 특히, 캅시쿰 종(Capsicum spp.)(후추) 및 솔라눔 멜론제나(Solanum melongena)(가지)에서, 토마토에서 발생하는 질병과 유사한 질병 증상을 일으킬 수 있는 것으로 여겨진다.
현재로서는 이 새로운 바이러스에 대한 특이적 저항성을 갖는 알려진 식물은 없지만, 그러한 저항성 식물을 개발해야 할 필요성은 존재한다.
이제 본 발명자들은 ToTV에 대한 저항성이 있는 토마토 식물을 발견했다. 그들은 상기 식물을 상기 바이러스에 노출시키는 경우, 질병 증상이 없는 상태로 유지되고, 바이러스 입자, 또는 바이러스 RNA가 이들 식물에서 검출될 수 없다는 것을 발견했다. 하기 기재된 것과 같이, 이러한 반응은 저항성으로 정의된다. 상기 식물은 상기 새로운 바이러스에 대한 저항성이 있는 경작된 토마토의 상업적으로 가치가 있는 변종을 개발함에 있어서, 특히 상기 저항성 특성에 관여하거나 또는 연관되어 있고, 교배 동안 식물들 사이에서 교환되는 유전 물질이 육종 과정 동안 추적되고 모니터될 수 있는 경우 매우 중요하다. 그러한 모니터링은 육종의 효율을 증가시키는데 도움을 주고 새롭게 개발된 저항성 변종의 출시 시간(time-to-market)을 훨씬 개선시킬 수 있다. 교배 실험을 통해, ToTV에 대한 저항성에 관여하는 유전자는 상기 저항성 식물에서 동형접합으로 존재하나, 이형접합성 식물은 ToTV에 감염되기 쉽다는 것이 발견되었다. 따라서, ToTV 저항성은 열성 유전자에 의해 전달되는 것으로 발견되었다. 그럼에도 불구하고, 상기 두 형태의 대립인자를 포함하는 식물, 즉 이형접합성 식물은 그것들이 교배 및 자가 교배시 부모로 사용되어 동형접합성 자손 식물을 생성할 수 있기 때문에 식물 육종자에게 동등하게 유용하다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 게놈 중에 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 하나 이상의 대립인자를 갖는 토마토 식물로서, 상기 바이러스는 2004년 11월 24일에 기탁자 참조 번호 ToTV-EOl(DSM 16999) 하에 독일 미생물 자원 센터에 기탁된 것인 토마토 식물에 관한 것이다. ToTV 저항성 토마토 식물은 현재까지 알려지지 않았다.
뒤이은 실험에서, 본 발명자들은 이들 ToTV 저항성 토마토 식물의 저항성은 많은 AFLP 마커에 밀접하게 연관되어 있다는 것을 발견했다. 게놈에서의 이들 대부분의 마커의 위치는 아직 확실하지 않다는 사실에도 불구하고, 상기 특성에 관여하는 유전자(들)는 4번 염색체 상에 위치되는 것으로 여겨지나, 이론에 의해 한정되고자 하는 것은 아니다. 따라서, 상기 제1 측면의 바람직한 구체예에서, ToTV에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함하는 대립인자는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, 및/또는 P13/M38-F-311/313, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313에 연관된 게놈 영역에 위치된다.
상기 제1 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 대립인자는 4번 염색체, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282와 P11/M35-F-216 사이에 위치된 게놈 영역에 위치된다.
상기 제1 측면의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 대립인자는 상기 저항성 표현형을 발현하는 식물을 발생시키는, 동형접합 형태로 존재한다.
상기 제1 측면의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 토마토 식물은 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum) 종의 식물, 바람직하게는 경작된 토마토 식물이다.
상기 제1 측면의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 저항성은 상기 식물에 ToTV의 최저 감염 용량 이상이 노출되는 경우 상기 바이러스 감염의 확립(establishment)에 대한 저항성으로 표현된다. 당업자는 상기 최저 감염 용량이 감응성 식물에 대한 일반적인 실험에 의해 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
상기 제1 측면의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 식물은 ToTV 감염을 포함하는 저항성 바이오에세이로 확인되고, 또는 상기 식물은 상기 ToTV 저항성 유전자의 상기 대립인자에 연관된 하나 이상의 분자 마커의 존재에 대한 스크리닝에 의해 확인된다.
상기 제1 측면의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 식물은 상기 ToTV 저항성 유전자의 상기 대립인자에 연관된 하나 이상의 분자 마커의 존재에 대한 스크리닝을 포함하는 방법에 의해 생산된다.
추가적인 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 식물로부터 유래되는 식물 부분에 관한 것이다. 식물 부분의 예는 꽃가루, 난세포, 잎, 배아, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기(stem), 싹, 어린 가지(scion), 근경(rootstock), 씨, 프로토플라스트(protoplast), 칼리(calli) 등 뿐만 아니라 꽃가루, 난세포, 잎, 배아, 뿌리, 뿌리 끝(root tip), 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기, 싹(stem shoot), 및 씨로부터 유래된 단세포 및 조직을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 부분은 열매 또는 씨이다. 식물 부분의 다른 바람직한 구체예는 미세포자(microspore), 꽃가루, 난세포, 잎, 배아, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥, 꽃, 열매, 줄기 싹, 줄기, 싹, 어린 가지, 근경, 프로토플라스트, 칼리, 및 분열 조직(meristemic tissue) 등으로서 상기 바람직한 부분을 포함하는 영양 생식(vegetative propagation)을 위한 부분을 포함한다.
추가적인 일 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 것과 같은 ToTV에 대한 저항성이 있는 토마토 식물을 선택하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 a) 상기 바이러스의 접종물(inoculum)을 제공하는 단계; b) 식물을 상기 접종물에 노출하는 단계; c) 충분한 배양 시간동안 배양하는 단계; 및 d) 상기 배양 시간의 경과 중에 상기 식물에 어떠한 감염도 확립하지 않는 경우에 상기 식물을 선택하는 단계를 포함한다.
추가적인 일 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 것과 같은 게놈 중에 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 하나 이상의 대립인자를 갖는 토마토 식물을 선택하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, 및/또는 P13/M38-F-311/313, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313에 연관된 게놈 영역의 존재에 대한 토마토 식물의 게놈 DNA를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
또한 추가적인 일 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 토마토 식물을 선택하는 방법을 수행함으로써 본 명세서에 정의된 것과 같은 게놈 중에 상기 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 (유전자의) 하나 이상의 대립인자를 갖는 식물을 선택하는 단계, 상기 선택된 식물 그 자체 또는 다른 토마토 식물과 교배시켜 씨를 생성하는 단계, 및 상기 씨를 토마토 식물로 성장시키는 단계를 포함하는 토마토 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한 추가적 일 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 것과 같은 상기 ToTV에 대한 저항성이 있는 토마토 식물을 생산하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 a) 본 발명에 따른 토마토 식물을 선택하는 방법을 수행하여 게놈 중에 상기 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 하나 이상의 대립인자를 갖는 식물을 선택하는 단계; b) 상기 선택된 식물을 다른 토마토 식물 또는 그 자체와 교배시켜 씨를 생성하는 단계; c) 상기 씨를 토마토 식물로 성장시켜 자손 식물을 생성하는 단계; d) 선택적으로 상기 b) 및 c) 단계의 교배 단계 및 성장 단계를 반복하는 단계; 및 e) 상기 자손 식물들 중에서 상기 대립인자가 동형접합 형태로 존재하는 식물을 선택하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 바람직한 구체예에서, 단계 e)의 선택은 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, 및/또는 P13/M38-F-311/313, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313에 연관된 상기 게놈 영역의 동형접합성의 존재에 대한 상기 자손 식물의 DNA를 스크리닝하는 것에 의해 수행된다. 대안적으로, 단계 e)의 상기 선택은 상기 ToTV 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 임의의 다른 적절한 방법을 사용하는 저항성 바이오에세이에 의해 수행된다.
상기 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 토마토 식물은 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum) 종의 식물, 더 바람직하게는 경작된 토마토 식물이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의하여 얻을 수 있는 토마토 식물 및 상기 신규하고 특허성있는 발명의 토마토 식물로부터 유래된, 식물 부분, 바람직하게는 열매 또는 씨에 관한 것이다. 대안적인 바람직한 구체예의 상기 식물 부분은 영양 생식(vegetative propagation)에 적절한 식물 부분을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 상기 대립인자의 용도로서, 상기 대립인자는 토마토의 4번 염색체에 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900에 연관된 게놈 영역 중에 위치된 것으로서,
- ToTV 저항성 토마토 식물을 선택하기 위한, 또는
- ToTV 감응성 토마토 변종에 상기 저항성을 갖는 대립인자의 존재 빈도를 증가시켜 상기 변종에 ToTV에 대한 저항성을 부여하기 위한 것인 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 ToTV 식물의 수율을 개선하거나 및/또는 ToTV로부터 야기되는 상기 식물의 수율 감소를 방지하는 ToTV 저항성 식물의 용도로서, 상기 ToTV 저항성 식물은 토마토의 4번 염색체에 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900에 연관된 게놈 영역에 위치된 대립인자의 동형접합성 존재에 의해 특징지어지는 것인 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 ToTV 저항성 식물의 씨의 용도로서, 상기 식물은 식물 또는 식물 집단에서 ToTV 저항성 식물을 생산하기 위한 또는 토르라도 질병(또는 마르키테츠(marchitez) 또는 초코렛 반점 질병과 같은 관련 질병)의 발생을 방지하기 위한 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 ToTV에 대한 저항성을 부여하거나, 또는 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 대립인자에 대해 동형접합성인 하나 이상의 대립인자를 포함하는 식물의 용도로서, ToTV 저항성 토마토 식물로서 또는 상기 대립인자의 동형접합성의 존재로부터 발생되는 ToTV 저항성 표현형을 갖는 다른 식물을 제공할 목적인 육종 프로그램에 있어서 부모 식물로서, 상기 대립인자는 토마토의 4번 염색체에 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900에 연관된 게놈 영역에 위치된 것인 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 식물에 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 대립인자의 존재를 검출하기 위한 마커 P11/M35-F-216, P13/M38-F-311/313 및/또는 C2_At5g25900의 용도에 관한 것이다. 상기 용도는 상기 저항성 대립인자와 연관된 뉴클레오티드 다형성의 존재를 규명하기 위하여, 일반적으로 DNA를 분리하는 단계, 상기 마커-특이적 프라이머로 상기 분리된 DNA를 증폭하는 단계, 및 선택적으로 상기 증폭된 DNA 단편을 절단한 후에, 예측된 염기 쌍 길이의 증폭된 DNA 단편을 확인하는 단계를 포함하는 핵산 검출 방법을 포함한다.
본 발명의 상기 기재된 용도 측면의 바람직한 구체예에서, 상기 식물은 바람직하게는 토마토 식물, 가장 바람직하게는 본 명세서에서 구체적으로 기재된 것과 같은 상업적으로 원하는 특징을 포함하는 토마토 식물과 같은, 상업적으로 가치가 있는 토마토 식물이다.
본 명세서에서, "대립인자(allele)"라는 용어는 임의의 유전자의 하나 이상의 다른 형태(alternative form)를 의미하고, 상기 모든 대립인자는 하나 이상의 형질 또는 특징에 관련된다. 이배체 세포 또는 개체에 있어서, 주어진 유전자의 두 개의 대립인자는 한 쌍의 상동 염색체 상에서 대응되는 유전자좌(loci)를 차지한다. 본 발명은 하나 이상의 유전자, 그러나 또한 조절 서열을 포함할 수 있는 게놈 영역을 확인하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이기 때문에, "대립인자(allele)" 대신에 "하플로타입(haplotype)"(즉, 염색체 단편(segment)의 대립인자)를 의미하는 것이 더 정확한 일부의 예가 있지만, 이들 예에서, 상기 "대립인자(allele)"라는 용어는 "하플로타입(haplotype)"이라는 용어를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"유전자(gene)"는 본 명세서에서 염색체 상에 특정 위치를 차지하고 개체에서 특정 특성 또는 형질에 대한 유전적 지시를 포함하는 DNA의 서열로 구성된 유전적 단위로 정의된다.
"유전자좌(locus)"는 본 명세서에서 주어진 유전자가 주어진 종의 염색체 상에서 차지하는 위치로 정의된다.
본 명세서에서, "이형접합(heterozygous)"이라는 용어는 상이한 대립인자가 상동 염색체 상에서 대응되는 유전자좌에 위치하는 경우에 존재하는 유전적 상태를 의미한다.
본 명세서에서, "동형접합(homozygous)"이라는 용어는 동일한 대립인자가 상동 염색체 상의 대응되는 유전자좌에 위치하는 경우에 존재하는 유전적 상태를 의미한다.
본 명세서에서, "분자 마커(molecular marker)"라는 용어는 핵산 서열의 특성의 차이점을 가시화하기 위한 방법에 사용되는 지시자를 말한다. 상기 지시자의 예는 특이적 유전적 및 염색체상 위치를 정의하는 제한효소단편길이다형성(RFLP) 마커, 증폭단편길이다형성(AFLP) 마커, 단일뉴클레오티드다형성(SNPs), 마이크로새틀라이트 마커(예를 들어, SSRs), 서열-특정증폭영역(sequence-characterized amplified region, SCAR) 마커, 단편증폭다형성서열(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS) 마커 또는 이소자임 마커 또는 본 명세서에 기재된 마커의 조합이다.
본 명세서에서, "토마토(tomato)"라는 용어는 리코페르시콘 세라시포르메(Lycopersicon cerasiforme), 리코페르시콘 체에스만니(Lycopersicon cheesmanii), 리코페르시콘 칠렌세(Lycopersicon chilense), 리코페르시콘 츠미엘레우스키(Lycopersicon chmielewskii), 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)(또는 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)), 리코페르시콘 히르수툼(Lycopersicon hirsutum), 리코페르시콘 파르비플로룸(Lycopersicon parviflorum), 리코페르시콘 펜넬리(Lycopersicon pennellii), 리코페르시콘 페루비아눔(Lycopersicon peruvianum), 리코페르시콘 핌피넬리포르움(Lycopersicon pimpinellifolium), 또는 솔라눔 리코페르시코이데스(Solanum Iycopersicoides)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는 임의의 리코페르시콘(Lycopersicon)의 식물, 라인(line) 또는 집단을 의미한다. 현대 토마토의 야생 친척(wild relative)은 리코페르시콘 펜넬리(L. pennellii), 리코페르시콘 히르수툼(L. hirsutum), 리코페르시콘 페루비아눔(L. peruvianum), 리코페르시콘 칠렌세(L. chilense), 리코페르시콘 파르비플로룸(L. parviflorum), 리코페르시콘 츠미에레우스키(L. chmielewskii), 리코페르시콘 치에스마니(L. cheesmanii), 리코페르시콘 세라시포르메(L.cerasiforme), 및 리코페르시콘 핌피넬리포리움(L. pimpinellifolium)과 같은 리코페르시콘(Lycopersicon) 속에 분류되어 왔다. 지난 몇 년에 걸쳐서, 이들 종의 명칭을 재분류할 지 여부에 대해 토마토 연구자 및 식물학자 간에 논쟁이 있었다. 현대 토마토에 대하여 새롭게 제안된 과학적 명칭은 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)이다. 유사하게, 상기 야생 종의 명칭은 변경될 수 있다. 리코페르시콘 펜넬리(L. pennellii)는 솔라눔 펜넬리(Solanum pennellii)가 될 수 있고, 리코페르시콘 히르수툼(L. hirsutum)은 솔라눔 하브로차이테스(Solanum habrochaites)가 될 수 있고, 리코페르시콘 페루비아눔(L. peruvianum)은 솔라눔 'N 페루비아눔(N peruvianum)'과 솔라눔 '칼레존 데 후야레스(Callejon de Huayles)', 솔라눔 페루비아눔(S. peruvianum), 및 솔라눔 코르넬리오무엘레리(S. corneliomuelleri)로 나뉠 수 있고, 리코페르시콘 파르비플로룸(L. parviflorum)은 솔라눔 네오릭키(S. neorickii)가 될 수 있고, 리코페르시콘 츠미에레우스키(L. chmielewskii)는 솔라눔 츠미에레우스키(S. chmielewskii)가 될 수 있고, 리코페르시콘 칠렌세(L. chilense)는 솔라눔 칠렌세(S. chilense)가 될 수 있고, 리코페르시콘 치에스마니에(L. cheesmaniae)는 솔라눔 치에스마니에(S. cheesmaniae) 또는 솔라눔 갈라파겐세(S. galapagense)가 될 수 있고, 리코페르시콘 핌피넬리포리움(L. pimpinellifolium)은 솔라눔 핌피넬리포리움(S. pimpinellifolium)가 될 수 있다(Solanacea Genome Network(2005) Spooner and Knapp; http://www.sgn.cornell.edu/help/about/solanum_nomenclature.html).
본 발명에 따른 식물은 자연에서 존재한다. 다만, 그것은 기술적 방법(techinical process)의 결과로서 확인되었다. 본 발명은 상기 식물을 확인하는 두가지 원칙적인 방법을 개시한다. 제1 방법에서 상기 식물은 본 명세서에 정의된 것과 같이 후보 식물을 유효량의 ToTV에 (기계적인 접종 또는 자연(field)에서 노출에 의해) 노출시키는 것을 포함하는 저항성 바이오에세이를 사용하므로써 확인된다. 상기 후보 식물이 질병, 즉 불타는 것과 유사하게 종료하는 괴사 손상, 식물 물질 특히 잎의 전부 괴사 및 상기 식물의 죽음 및/또는 열매 상의 괴사성 반점의 동심원 고리를 포함하는 상기 질병의 증상이 없이 유지되는 경우, 상기 식물은 저항성이 있는 것으로 간주된다. 이 방법을 사용하는 것에 의해 확인되는 식물은 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함하는 두 개의 대립인자를 포함하고, 결과적으로 상기 형질에 대한 동질접합이다.
"토마토 토르라도 바이러스에 대한 저항성(resistant to ToTV)"이라는 용어는 상기 기탁된 균주 ToTV-EOl (DSM 16999)를 포함하는, ToTV 및 관련된 바이러스에 대한 저항성을 포함하는 것으로 의미된다. 본 발명의 문맥에 있어서 관련된 바이러스는 ToTV와 동일한 분류학상의 속에 속하는 바이러스 뿐만 아니라, 저항성이 본 명세서에 기재된 저항성 대립인자에 의해 주어진 바이러스로도 정의될 수 있다.
본 발명의 식물은 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 하나 이상의 유전자를 포함한다. 상기 유전자의 유전자좌는 본 명세서에서 확인된 많은 AFLP 마커에 연관된다. 그러나, 토마토의 게놈 지도 상의 이들 많은 AFLP 마커의 위치는 아직 알려지지 않았다. 따라서, 상기 게놈 중에 상기 유전자의 위치는 완전히 확실하진 않다. 마커 P14/M49-F-282는 임시적으로 4번 염색체 상에 위치지정되어 있기 때문에, 상기 유전자좌는 4번 염색체 상에 위치하는 것으로 강하게 제안되고 있다. 공연하게 알려진 마커의 위치를 P14/M49-F-282의 위치와 비교하는 경우, 상기 유전자는 그 경계가 CT264 (토마토 EXPEN 2000 위치 86cM) 및 마커 TG 163(토마토 EXPEN 2000 위치 135 cM)에 의해 정하여지는 영역에 위치되는 것처럼 보인다. 따라서 본 발명의 식물은 4번 염색체 상의 마커 CT264와 TG163 사이의 위치 상에 위치되는 ToTV 저항성 유전자를 갖는 것으로 특징지어질 수 있다.
저항성 식물 및 감응성 식물을 포함하는 실험 상의 토마토 집단에 존재하는 마커에 관한 더 상세한 분석에 있어서, 2개의 마커는 상기 집단 중에서 다형적이고 상기 저항성 대립인자의 존재 또는 부존재와 높은 상호관련성이 있는 것으로 밝혀졌다: COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900 (실시예 참조) 및 P13/M38-F-311/313로 언급되는 이중-대립인자 마커(bi-allelic marker). 이들 마커들은 토마토의 4번 염색체 상에 위치하고 그것은 이들 마커들이 약 3cM의 거리에 의하여 분리되어 있는 것으로 관찰된 재조합 빈도로부터 계산될 수 있다. C2_At5g25900의 위치는 도 1에 제공된다. C2_At5g25900에 대한 P13/M38-F-311/313의 위치는 알려진 지도 위치를 갖는 다른 다형성 마커의 시험된 집단 중에 없기 때문에 확립될 수 없다. 따라서, 토마토의 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 상기 유전자는 지금까지는 다형성 마커 C2_At5g25900 (특히 Msel로 절단되는 경우 420 bp 및 260 bp 단편을 생성하는 마커로서, 상기 마커는 상기 저항성 대립인자에 연관되어 있는 마커) 및 P13/M38-F-311/313 (특히 상기 저항성 대립인자에 연관되어 있는, P13/M38-F-313)에 의해 특징지어지는 영역과 연관되고, 상기 영역은 4번 염색체 상에 약 3 cM의 유전적 거리, 더 바람직하게는 0 내지 10 cM, 더욱 바람직하게는 0 내지 3.6 cM, 가장 바람직하게는 3 cM 미만을 나타내는 DNA의 스트레치를 커버하는 영역인 것으로 결론지을 수 있다.
당업자는 (예를 들어, 도 2에 도시된 것과 유사하게, 제3 마커에 대한 각각의 거리가 결정될 수 있는 경우) 토마토의 유전자 지도 상에 서로에 대한 상기 두 마커의 방향을 구분할 것이다. 상기 실험은 당업자의 접근 범위 내에 있다.
본 발명의 식물은 "마르키테츠(marchitez)"라는 명칭으로 멕시코에서 알려진 토마토 질병을 야기하는 바이러스 작용제에 대한 저항성이 있는 것으로 밝혀졌다. 이 바이러스 작용제는 접수 번호 DSM 16999 하에 기탁되고 ToTV라는 명칭으로 할당된 것과 동일한 것으로 여겨진다. ToTV는 스페인에서 "토르라도(torrado)"라고 하는 토마토에 유사 질병의 병원체이다. 접수 번호 DSM 16999 하에 기탁된 ToTV에 대한 저항성과 관련된 본 명세서에 기재된 것과 같은 상기 마커는 또한 "마르키테츠(marchitez)"에 대한 저항성과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 명세서에 정의된 상기 식물은 "마르키테츠(marchitez)" 뿐만 아니라 "토르라도(torrado)"에 대한 저항성이 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 상기 식물은
- 상기 기탁된 바이러스 ToTV DSM 1699에 의해 야기되는 것과 동일 또는 유사한 증상을 갖는 토마토 식물에 질병을 야기하는 질병의 병원체인 모든 바이러스;
- (여전히 분류학상 지위가 결정될 필요가 있는 것 중에서) ToTV와 동일한 분류(taxon), 바람직하게는 동일한 과의 식물 바이러스, 더 바람직하게는 동일한 속, 더욱 바람직하게는 동일한 종에 속하는 모든 식물 바이러스;
- ToTV DSM 16999에 대한 저항성을 부여한다.
자연에서 본 발명의 식물을 확인하는 대안적인 방법에 있어서, 상기 식물은 상기 ToTV 저항성 유전자의 상기 하나 이상의 대립인자와 연관된 하나 이상의 분자 마커의 존재를 스크리닝하는 것에 의해 확인된다. 본 발명은 마커들이 토마토 식물 중에 상기 저항성 유전자의 존재에 대하여 다양한 정도로 연관된 것이 발견되었기 때문에, 현재 상기 스크리닝 에세이에서 사용하기에 적절한 다양한 AFLP 마커를 개시한다. 적절한 분자 마커는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, 및 P13/M38-F-311/313로 구성된 군, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및 P13/M38-F-311/313으로 구성된 군, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및 P13/M38-F-311/313으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 실시예에서는 이들 마커와 상기 저항성 형질의 연결성을 더 자세하게 설명한다.
또한 본 발명은 ToTV 저항성 식물, 또는 그의 부분을 확인하는 방법에 관한 것이다. ToTV 저항성 식물을 확인하는 것은 다양한 가능성이 있다. 상기 방법의 구체예의 일 세트에서, 활성/감염성 바이러스 또는 전체-길이 감염성 클론이 사용될 수 있지만, 반면에 대안적인 구체예에서는 바이러스-검출 수단만이 사용된다.
활성/감염성 바이러스를 사용하는 토르라도-저항성 식물을 확인하는 방법의 제1 단계는 감염시킬 목적으로, 잎 또는 줄기 단편과 같은, 식물 또는 식물 부분을 ToTV의 감염성 투여량에 노출시키는 것을 포함한다. 상기 노출은 많은 경우에 물리적 접촉의 실행을 포함한다. 감염성 투여량은 식물들 사이에서 및 시험된 ToTV-분리물 사이에서 변할 수 있다. 이론적으로, 약 500-5000 바이러스 입자 또는 그 핵산의 양에 대하여 약 1-10의 양이 충분할 것이다(Theoretically, an amount of about 1 to 10 to an amount of about 500-5000 viral paticles of said virus or the nucleic acids thereof will be sufficient). 이러한 방식의 감염은 정제된 바이러스 입자 또는 바이러스 핵산을 건강한 식물에 기계적으로 접종하거나 또는 예를 들어 감염된 식물에 노출시키는 수동적인 접종에 의해 이루어질 수 있다.
대안적으로, 감염은, 예를 들어:
- 건강한 어린 가지를 ToTV에 감염된 근경 상에서 성장시키는 단계, 또는 그 역의 경우도 포함;
- 건강한 식물을 (감염된 식물, 예를 들어, 쿠스쿠타 종과 같은 기생성 식물을 포함하는) 상기 바이러스를 포함하는 전달 벡터에 노출시키는 단계;
- 건강한 식물에 상기 ToTV 바이러스 게놈의 코딩 영역을 갖는 발현 벡터를 도입하는 단계;
- 상기 ToTV 게놈의 코딩 영역을 갖는 발현 벡터를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주와 같은, 아그로-감염성 클론을 사용하는 단계에 의해 이루어 질 수 있다.
본 발명의 문맥에 있어서, 식물 또는 식물 부분을 ToTV의 감염성 투여량에 노출시키는 방법은 임의의 특정 방법으로 한정되지 않는다. 언급한 바와 같이, 감염은 건강한 식물에 상기 바이러스를 기계적으로 접종하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 병에 걸린 잎의 일 부분을 감염되어야 하는 식물의 잎에 직접 문지를 수 있다. 대안적인 방법에서, 접종물은 예를 들어 바이러스를 포함하는 식물 조직, 바람직하게는 증상을 보이는 어린 잎을 예를 들어, 접종을 위한 적절한 버퍼(예를 들어, 0.03 M의 포스페이트 버퍼, pH 7.7) 중에서, 막자사발 및 막자, 또는 임의의 다른 적절한 유형의 균질화기(homogeniser)로 분쇄하여 제조될 수 있다. 분쇄한 후, 상기 얻어진 균질화물(즙)은 바람직하게는 예를 들어, 치즈 클로스(cheese cloth)를 통해, 여과된다. 그 후 상기 즙은 예를 들어, 상당한 양의 즙을 잎에 천천히 접촉시켜 접종될 수 있다. 상기 잎은 바람직하게는 하부 표피에 상처를 내고 상기 바이러스의 유입을 촉진하기 위하여 미리 처리된다. 이는 예를 들어 상기 잎에 카보런덤(carborundum) 분말을 미리 뿌리는 것에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는 과도하게 상처를 주는 것은 회피된다. 바람직하게는 카보런덤 분말은 미세하게(microscopically) 작은 각의 실리콘 카바이드 입자(400 내지 500 메시)를 갖는 상태로 사용된다. 또한 카보런덤 분말은 상기 미리 처리되어지는 것이 생략되는 경우에는, 상기 즙에 직접 첨가될 수 있다. 상기 즙은 예를 들어, 집게손가락, 즙이 스며든 거품 또는 직물의 패드(pad), 또는 또한 분쇄에 사용되는 절구와 함께, 유리 약수저, 빡빡한 브러쉬, 또는 스프레이 총에 의해 적용될 수 있다. 접종 후, 상기 잎은 바람직하게는 즉시 물로 세척된다.
ToTV 저항성 식물을 확인하는 방법의 제2 단계는 상기 노출 후에, i) 상기 식물 또는 식물 부분의 질병 증상이 없는 상태로 유지되거나 감응성 및/또는 민감성 대조군 식물에 비해 발현 지연되거나 또는 적어도 심각성이 감소하거나 또는 국재되는(localized) 경우 및/또는 ii) ToTV 또는 ToTV 게놈 서열이 상기 식물 또는 식물 부분에 존재하지 않거나 또는 ToTV 바이러스의 존재가 감응성 대조군 식물에 비해 상기 식물에 적어도 정량적으로 감소되는 경우 ToTV 저항성 식물로서 상기 식물을 확인하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 "국재되는(localized)"이라는 용어는 상기 접종된 잎에 제한되는 것을 의미한다.
감염된 식물에 ToTV에 의해 유도된 질병 증상의 발달을 결정하는 단계는 예를 들어 상기 인식가능한(예를 들어, 눈에 보이는) 질병 증상의 발달에 요구되는 기간을 기록하는 것인, 정량적인 방법, 또는 특정 기간이 종료된 후, 상기 식물의 증상 발현을 관찰하고 상기 증상의 존재 또는 심각성을 나타내는 것인, 정성적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 ToTV에 의해 유도된 질병 증상의 발달을 결정하는 단계에 추가하거나 또는 그의 대안으로서, 검출되는 ToTV 저항성 유형에 의존하여, 상기 바이러스의 존재는 상기 식물 또는 식물 부분에서 검출된다. 상기 시험 식물 중에 바이러스의 부재를 검출하기 위해서, 원칙적으로 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일 방법은 본 발명에 따른 ToTV 특이적 항체, 프라이머-세트 또는 프로브가 사용되는 것이 채택될 수 있다. 대안적으로, 상기 시험 식물의 부분은 바이러스가 상기 시험 식물 중에 존재하거나 또는 부존재하는지 여부를 확립하기 위해 감응성 지시자 식물(예를 들어, N. hesperis '67A')과 접촉될 수 있다. 당업자는 상기 방법에 있어서 상기 식물 세포 내에서 바이러스의 존재만이 확립될 필요가 있기 때문에, 전달 벡터, 내성 시험-식물 및 저항성 시험 식물을 구별하기 위하여, 상기 시험 식물의 표면을 비오염시키는 것이 중요하다는 것을 이해할 것이다.
ToTV 저항성 식물을 확인하는 방법의 상기 제2 단계를 수행한 후, 하기 결과를 얻을 수 있다. 만약, 성공적인 접종 후(예를 들어, 감응성 및 민감성 대조군 식물에 감염을 일으키는 조건 하에 식물-바이러스 접촉을 실행한 후):
i) 질병 증상이 없는 상태로 유지되거나, 또는 바이러스 입자, 또는 바이러스 RNA가 검출될 수 없으면, 상기 식물은 저항성이 있는 것이다;
ii) 질병 증상이 지연되거나 또는 심각성이 감소되거나, 또는 바이러스 입자 또는 바이러스 RNA의 낮은 전신성(systemic) 역가가 검출될 수 있으면, 상기 식물은 부분적으로 저항성이 있는 것이다;
iii) 질병 증상이 심각하나, 상기 접종된 잎에 제한된, 국부적인 상태를 유지하고 접종된 조직을 넘어 전신으로 퍼지지 않거나, 또는 바이러스 입자, 또는 바이러스 RNA가 국부적으로만 검출될 수 있으면, 상기 식물은 과민성이 있는 것이다;
iv) 만약 질병 증상이 없는 상태로 유지되고, 바이러스 입자, 또는 바이러스 RNA가 검출될 수 있다면, 상기 식물은 내성이 있는 것이다;
v) 만약 상기 식물이 질병 증상을 발달시키고 높은 전신성 바이러스 역가를 갖는다면, 상기 식물은 감응성 및 민감성인 것이다. 그러한 식물의 예는 본 발명의 바이러스가 그로부터 분리되는 식물이다. 이들 식물은 본 발명의 방법에 있어서 적절한 대조군 식물로서의 역할을 할 수도 있다.
저항성 식물을 생산하는 목적과 관련하여, 그리고 피토니테이션(phytosanitation)의 관점으로는, i), ii) 및 iii) 단계의 결과만이 흥미로운 것으로 간주될 수 있다. 증상이 없는 수확물 및 생산물을 생산하기에 적절한 식물을 얻고자 하는 목적과 관련해서는, iv) 단계의 결과도 또한 특별한 상업적인 흥미가 될 수 있다.
ToTV 저항성 식물을 확인하는 방법의 대안적인 구체예에서는, 바이러스 검출 수단만이 사용된다. 예를 들어, ToTV 저항성 식물은 포장(field)에서 증상을 갖는 식물들 중에 증상이 없는 식물을 관찰하거나 또는 확인하고 바이러스 검출 방법을 수행하여 상기 식물 중에 바이러스의 부재를 결정하여 확인될 수 있다. 상기 방법이 수행되는 경우 ToTV-선택적 폴리뉴클레오티드 또는 항체가 사용되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, ToTV 저항성 식물을 확인하는 방법은 상기 바이러스 또는 바이러스-선택적 폴리뉴클레오티드 또는 항체의 사용을 요구한다.
본 발명은 이제 추정되는 ToTV 저항성 유전자에 연관된, 몇몇 실시예가 제공된, 마커의 동형접합성 존재를 결정하여, ToTV 저항성 식물을 확인하는 추가적인 방법을 또한 개시한다.
또한 본 발명은 ToTV 저항성 식물, 또는 그의 부분을 생산하는 방법에 관한 것이다. 일단 ToTV 저항성 식물이 확인되면, 이 식물은 제공자 식물로부터 상기 수령작 식물로 전달되는 유전 물질의 제공자 식물로서 역할을 수행하여 상기 유전 물질을 갖는 상기 수령자 식물을 제공할 수 있다. 제공자 식물로부터 수령자 식물로 유전 물질을 전달하는 것은 당업계에 알려진 임의의 적절한 방법에 의해 일어날 수 있다. 상기 유전 물질은 대부분의 경우 게놈 물질일 것이다. 그러나, 적어도 상기 제공자 식물의 게놈의 저항성 부여 부분이 전달된다는 것은 중요하다. 상기 제공자 식물의 게놈의 어느 부분이 상기 ToTV 저항성을 부여하는지를 결정하는 방법이 부재시에는, 상기 전달은 완전한 게놈을 전달하여 적절하게 일어날 수 있다. 바람직하게는, 상기 ToTV 저항성 식물은 저항성 자손 식물을 생성하기 위하여 교배시 웅성(male) 또는 자성(female)의 부모 식물로서의 역할을 수행하고, 이에 의해 상기 자손 식물은 상기 저항성 제공자로부터 유전 물질을 제공받고 상기 수령자 식물로서 활동하게 된다. 비록 교배시 감응성 부모는 반드시 협의의(sensu stricto) 수령자 식물이 아니더라도, 상기 감응성 부모는 또한 본 명세서에서 수령자 식물(recipient plant)이라는 용어 안에 포함될 것이다.
ToTV 저항성 식물을 생산하는 방법에 있어서, 또한 프로토플라스트 융합(protoplast fusion)은 저항성 부여 게놈 물질을 제공자 식물로부터 수령자 식물로, 즉 상기 식물의 교배 방식으로서, 전달하는데 사용될 수 있다. 프로토플라스트 융합은 (세포벽은 효소 처리에 의해 제거되는) 하나의 이중- 또는 다중- 핵 세포를 생성하기 위해 2 이상의 프로토플라스트 간의, 체세포 혼성화(somatic hybridization)와 같은, 유도성 또는 자발적인 결합이다. 자연에서 서로 교배될 수 없는 식물 종에 대하여도 얻어질 수 있는 상기 융합된 세포는 조직배양되어 형질의 원하는 조합을 나타내는 잡종 식물로 된다. 더 구체적으로는, 제1 프로토플라스트는 ToTV에 의한 감염에 저항성을 나타내는 토마토 식물 또는 다른 식물 라인으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, ToTV 저항성 토마토 라인으로부터의 프로토플라스트가 사용될 수 있다. 제2 프로토플라스트는 질병 저항성, 곤충 저항성, 가치있는 열매 특성 등과 같지만, 이에 제한되지 않는 상업적으로 원하는 특성을 포함하는, 감응성 제2 식물 라인, 선택적으로 다른 식물 종 또는 변종, 바람직하게는 동일한 식물 종 또는 변종으로부터 얻을 수 있다. 그 후 상기 프로토플라스트는 상기 교배물(the cross)을 생산하기 위해 당업계에서 알려진, 일반적인 프로토플라스트 융합 과정을 사용하여 융합된다.
대안적으로, 배아 구조(embryo rescue)는 저항성 부여 게놈 물질을 제공자 식물로부터 수령자 식물로 전달하는데 즉, 상기 식물의 교배 방식으로서, 채택될 수 있다. 배아 구조는 식물이 생존가능한 씨를 생성하지 못하는 교배에서 배아의 그것을 분리하기 위한 과정으로서 사용될 수 있다. 이러한 과정에서, 상기 식물의 수정된 난소 또는 미성숙 씨는 조직 배양되어 새로운 식물을 생성한다(이 방법은 Pierik, 1999에서 상세하게 설명되어 있음).
따라서 ToTV 저항성 식물을 생산하는 방법은 일 구체예에서 ToTV 저항성 제공자 식물 또는 본 명세서에 기재된 것과 같은 저항성 유전자의 하나 이상의 대립인자를 포함하는 식물(담체 식물)을 확인하는 단계 및 상기 ToTV 저항성 제공자 식물 또는 상기 담체 식물을 수령자 식물과 교배하는 단계를 포함한다. 그 후, 추가적인 교배 및 자가 교배에 의해, 상기 바이러스에 저항성이 있는 동형접합 식물이 얻어질 수 있다.
ToTV 저항성 식물을 생산하는 방법은 또한 이미 기재된 것과 같은 ToTV 저항성 식물을 확인하는 방법을 수행하여 저항성 식물을 자손 식물으로부터 선택하는 단계를 더 포함한다.
바람직하게는, 상기 수령자 식물은 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum), 더 바람직하게는 상업적으로 원하는 특성을 갖는 솔라눔 리코페르시쿰(S. lycopersicum) 식물 종의 토마토 식물이다. 상기 수령자 식물은 ToTV 감응성 식물(susceptible plant), ToTV 민감성 식물(sensitive plant) 또는 ToTV 저항성 식물일 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 상기 식물의 선택은 상기 저항성 형질이 열성이라는 사실에 의해 결정될 수 있다. 당업자는 상기 문제점을 해결하기 위해 이용할 수 있는 다양한 방법론(methodology)를 알고 있다.
또한 본 발명의 일 측면은 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는, ToTV 저항성 식물, 또는 그의 부분이다.
ToTV 저항성 식물을 생산하기 위한 일 방법은 ToTV 저항성 제공자 식물 또는 이형접합 형태의 저항성 유전자를 갖는 식물로부터 상기 식물과의 교배에 의하여 수령자 식물로 저항성 부여 핵산 서열의 유전질 침투(introgression)에 의한 전달을 포함할 수 있다.
혈통 육종(pedigree breeding)이라고 불리는, 일 방법에서, ToTV (동형접합)에 대한 저항성을 나타내는 제공자 식물은 바람직하게는 질병 저항성, 곤충 저항성, 가치있는 열매 특성 등과 같지만, 이에 제한되지 않는, 상업적으로 원하는 특성을 나타내는 수령자 식물과 교배될 수 있다. 그 후 상기 결과인 (F1 잡종을 나타내는) 식물 집단은 자가-수분되고 씨를 형성하게 한다(F2 씨). 그 후 상기 F2 씨로부터 자라난 상기 F2 식물은 ToTV에 대한 저항성에 관한 또는 상기 저항성 유전자에 연관된 마커의 동형접합성의 존재에 대해 스크리닝된다. 따라서, 상기 자손 집단은 많은 방법으로 스크리닝될 수 있다.
형질도입 방법(transgenic method)에 의해 ToTV 저항성 토마토 식물의 생산
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 명세서에서 확인된 것과 같은 상기 ToTV 저항성 유전자에 연관된 상기 하나 이상의 마커를 포함하는 핵산 (바람직하게는 DNA) 서열은, ToTV 저항성 토마토 식물의 생산에 사용될 수 있다. 일단 적절한 제공자 토마토 식물에서 확인되면, ToTV 저항성에 관한 유전자를 포함하는 핵산 서열은, 임의의 사용가능한 방법에 의해 적절한 수령자 식물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산 서열은 ToTV 저항성 제공자 토마토 식물을 감응성 수령자 토마토 식물과 교배하여(즉, 유전질 침투에 의해), 형질 전환, 프로토플라스트 융합, 2배화된 하플로이드 기술(doubled haploid technique) 또는 배아 구조 또는 임의의 다른 핵산 전달 시스템에 의하여 전달될 수 있고, 선택적으로 뒤이어 유전자 이형접합성 또는 동형접합성을 포함하는 및/또는 ToTV 저항성을 나타내는 자손 식물이 선택될 수 있다. 전달의 형질전환 방법과 관련하여, ToTV 저항성에 관한 유전자를 포함하는 핵산 서열은 당업계에서 알려진 방법을 사용하여 상기 제공자 식물로부터 분리될 수 있고, 그렇게 분리된 핵산 서열은 형질전환 방법, 예를 들어, 일 배우자(gamete), 또는 상기 핵산 서열로 코팅된 비행(ballistic) 입자와 같은 임의의 다른 적절한 전달 물질 중에 있는 벡터에 의하여 상기 수령자 식물에 전달될 수 있다.
식물 형질전환은 일반적으로 식물 세포에서 기능할 발현 벡터의 구성을 포함한다. 본 발명에 있어서, 그러한 벡터는 ToTV 저항성에 관한 유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 벡터는 프로모터와 같은, 조절 인자의 조절 하에 또는 작동가능하게 연관된 ToTV 저항성 부여 유전자를 포함할 수 있다. 상기 발현 벡터는 하나 이상의 그러한 작동가능하게 연관된 유전자/조절 인자 조합물을 포함할 수 있고, 상기 조합물에 포함된 하나 이상의 유전자는 ToTV 저항성을 코딩한다. 상기 벡터(들)는 플라스미드의 형태일 수 있고, 단독으로 또는 다른 플라스미드와 조합하여 사용되어 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환 시스템과 같은, 당업계에서 알려진 형질전환 방법을 사용하여, ToTV에 대한 저항성이 있는 형질전환 식물을 제공할 수 있다.
발현 벡터는 마커를 포함하는 형질전환된 세포를 (상기 선택가능한 마커 유전자를 포함하지 않는 세포의 성장을 저해하는 것에 의한) 음성 선택, 또는 (상기 마커 유전자에 의해 코팅되는 생성물에 관한 스크리닝에 의한) 양성 선택에 의해 회복되도록 하는 (프로모터와 같은) 조절 인자에 작동가능하게 연관된 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 일반적으로 사용되는 식물 형질전환을 위한 많은 선택가능한 마커 유전자들은 업계에 알려져 있고, 예를 들어, 항생제 또는 살충제일 수 있는 선택적 화학제를 대사적으로 비독성화시키는 효소를 코딩하는 유전자, 또는 상기 저해제에 대해 반응을 보이지 않는 변형된 표적을 코딩하는 유전자를 포함한다. 몇몇의 양성 선택 방법은 만노오즈 선택과 같이, 업계에 알려져 있다. 대안적으로, 무마커(marker-less) 형질전환은 상기 기재된 마커 유전자 없이도 식물을 얻기 위해 사용될 수 있고, 상기 기술은 당업계에 알려져 있다.
발현 벡터를 식물 중에 도입하는 일 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium)의 자연 형질전환 시스템을 기초로 한다(Horsch 등, 1985을 참조). 아그로 박테리아 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 아그로 박테리아 리조겐(A. rhizogenes)은 유전적으로 식물 세포를 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. 아그로 박테리아 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 아그로 박테리아 리조겐(A. rhizogenes)의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각, 상기 식물의 유전적 형질전환에 관여하는 유전자를 가지고 있다(예를 들어, Kado, 1991를 참조). 식물 조직에 발현 벡터를 도입하는 방법은 직접 감염시키는 것 또는 아그로 박테리아 투메파시엔스(A. tumefaciens)와 식물 세포를 공동-배양하는 것을 포함한다(Horsch 등, 1985). 아그로박테리움(Agrobacterium) 벡터 시스템 및 아그로박테리움(Agrobacterium)이 매개된 유전자 전달 방법에 관한 설명은 Gruber 및 Crosby, 1993 및 Moloney 등, 1989에 의해 제공된다. 또한, 미국 특허 제5,591,616호 참조. 식물 발현 벡터 및 레포터 유전자 및 형질전환 프로토콜의 일반적인 설명 및 아그로박테리움(Agrobacterium) 벡터 시스템 및 아그로박테리움(Agrobacterium)이 매개된 유전자를 전달하는 방법에 관한 일반적인 설명은 Gruber 및 Crosby, 1993에서 확인할 수 있다. 식물 조직을 배양하는 일반적인 방법은 Miki 등, 1993 및 Phillips 등, 1988에서 제공된다. 분자 클로닝 기술 및 적절한 발현 벡터에 관한 적절한 참조 안내서(handbook)는 Sambrook 및 Russell (2001)이다.
발현 벡터를 식물 중에 도입하는 다른 방법은 DNA가 미세발사체(microprojectile)의 표면 상에서 운반되는 미세발사체가 매개된 형질전환을 기초로 한다. 상기 발현 벡터는 상기 미세발사체를 식물 세포 벽 및 세포막을 관통하기에 충분한 300 내지 600 m/s의 속도로 가속화시키는 바이오리스틱(biolistic) 장치에 의해 식물 조직 중에 도입된다 (Sanford 등, 1987, 1993; Sanford, 1988, 1990; Klein 등,1988, 1992을 참조). 식물에 DNA를 도입하는 다른 방법은 표적 세포의 초음파 조사(sonication)를 통해 이루어 진다(Zhang 등, 1991을 참조). 대안적으로, 리포솜 또는 스페로플라스트 융합은 발현 벡터를 식물 중에 도입하는데 사용되어 왔다(Deshayes 등, 1985 및 Christou 등, 1987을 참조). 또한, CaCl2 침전, 폴리비닐 알코올 또는 폴리-L-오르니틴을 사용하여 프로토플라스트에 DNA를 직접 흡수(uptake)시키는 것이 보고되고 있다(예를 들어, Hain 등, 1985 및 Draper 등, 1982을 참조). 또한, 프로토플라스트 및 전체 세포 및 조직의 전기천공(electroporation)이 기재되어 있다(D'Halluin 등, 1992 및 Laursen 등, 1994).
토마토 표적 조직의 형질전환 후, 상기 기재된 선택가능한 마커 유전자의 발현은 현재 당업계에 잘 알려진 재생(regeneration) 및 선택 방법을 사용하여, 형질전환된 세포, 조직 및/또는 식물을 우선적으로 선택할 수 있도록 한다. 또한, 본 명세서에 정의된 상기 마커는 그러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
비-형질전환 방법에 의한 ToTV 저항성 토마토 식물의 생산
ToTV 저항성 토마토 식물을 생산하는 대안적인 구체예에서, 프로토플라스트 융합은 제공자 식물로부터 수령자 식물로 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 프로토플라스트 융합은 하나의 이중- 또는 다중- 핵 세포를 생성하기 위해 (세포벽은 효소 처리에 의해 제거되는) 2 이상의 프로토플라스트 간의, 체세포 혼성화와 같은, 유도성 또는 자발적인 결합(union)이다. 자연에서 교배될 수 없는 식물 종에 대하여도 얻어질 수 있는 상기 융합된 세포는 조직 배양되어, 원하는 형질의 조합을 나타내는 잡종 식물로 된다. 더 구체적으로는, 제1 프로토플라스트는 ToTV에 의한 감염에 저항성을 나타내는 토마토 식물 또는 다른 식물 라인으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 실시예에 기재된 것과 같은 임의의 상기 저항성 라인으로부터의 프로토플라스트가 사용될 수 있다. 제2 프로토플라스트는 질병 저항성, 곤충 저항성, 가치있는 열매 특성 등과 같지만, 이에 제한되지 않는 상업적으로 바람직한 특성을 포함하는, 제2 토마토 또는 다른 식물 변종, 바람직하게는 토마토 라인으로부터 얻을 수 있다. 그 후 상기 프로토플라스트는 당업계에서 알려진, 전통적인 프로토플라스트 융합 과정을 사용하여 융합된다.
대안적으로, 배아 구조(embryo rescue)는 제공자 식물로부터 수령자 식물로 저항성 유전자를 전달함에 있어서 채택될 수 있다. 배아 구조는 식물이 생존가능한 씨를 생성하지 못하는 교배에서 배아의 그것을 분리하기 위한 과정으로 사용될 수 있다. 이러한 과정에서, 식물의 수정된 난소 또는 미성숙 씨는 조직 배양되어 새로운 식물을 생성한다(Pierik, 1999).
또한, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 제공자 토마토 식물에 있어서 ToTV에 대한 저항성과 연관된 대립인자의 존재를 검출하는 방법을 수행하는 단계, 및 상기 제공자 식물로부터 ToTV 감응성 수령자 토마토 식물로 상기 검출된 대립인자를 포함하는 핵산 서열을 전달하는 단계를 포함하는 ToTV 저항성 토마토 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 핵산 서열의 전달은 본 명세서에 앞서 기재된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 방법의 바람직한 구체예는 상기 핵산 서열을 ToTV 저항성 제공자 토마토 식물로부터 ToTV 감응성 수령자 토마토 식물 중으로 상기 식물들의 교배에 의해 유전질 침투시켜 전달하는 것을 포함한다. 따라서 이러한 전달은 전통적인 육종 기술에 의해 적절하게 이루어질 수 있다. 상기 ToTV 저항성 유전자는 바람직하게는 마커-의존적 육종(marker-assisted breeding, MAS)을 사용하여 상업적인 토마토 변종으로 유전질 침투된다. 마커-의존적 육종 또는 마커-의존적 선택은 상기 원하는 형질을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 그들 자손 식물을 확인하고 선택하기 위한 하나 이상의 상기 분자 마커의 사용을 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 확인 및 선택은 바람직하게는 본 명세서에서 확인된 것과 같은 저항성 유전자와 연관된 마커를 선택하는 것으로 기초로 한다.
ToTV-저항성 토마토 식물 및 씨
또한 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는, ToTV 저항성 토마토 식물, 또는 그의 부분은 본 발명의 일 측면이다.
본 발명의 ToTV 저항성 토마토 식물은 근교계(inbred), 잡종(hybrid), 단배체(haploid), 이배체(dihaploid), 단위결실(parthenocarp) 또는 형질도입(transgenic)과 같은 임의의 유전적 유형일 수 있다. 또한, 본 발명의 식물은 상기 저항성 형질에 대한, 이형접합 또는 동형접합, 바람직하게는 동형접합일 수 있다. 비록, 본 발명에서 확인되는 대립인자는, ToTV 저항성 식물을 제공하기 위해 임의의 식물에 전달될 수 있다 하더라도, 본 발명의 방법 및 식물은 바람직하게는 상기 가지(Solanaceae) 과의 식물, 더 바람직하게는 토마토에 관한 것이다.
근교계(inbred) ToTV 저항성 토마토 식물 라인은 반복 선발(recurrent selection) 및 역교배 기술, 자가 및/또는 이배체(dihaploid) 또는 부모 라인을 형성하기 위해 사용되는 임의의 다른 기술을 사용하여 개발될 수 있다. 선발 및 역교배 방법에 있어서, ToTV 저항성은 (상기 반복친(recurrent parent)과 상이하고 본 명세서에서 "1회친(nonrecurrent parent)"으로 언급되는) 제1 제공자 식물과 상기 반복친을 교배시켜 (상기 반복친으로 불리는) 표적 수령자 식물에 유전질 침투될 수 있다. 상기 반복친은 비-저항성이거나 또는 ToTV에 대한 낮은 수준의 저항성을 갖고 질병 저항성, 곤충 저항성, 가치있는 열매 특성 등과 같으나, 이에 제한되지 않는, 상업적으로 원하는 특성을 갖는 식물이다. 상기 1회친은 ToTV 저항성을 나타내고 ToTV 저항성을 발현하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 1회친은 상기 반복친과 교차-수정(cross-fertile)되는 임의의 식물 변종 또는 근교계(inbred) 라인일 수 있다. 상기 반복친과 1회친 사이의 교배에 의해 발생하는 자손은 상기 반복친과 역교배된다. 그 후 상기 얻어진 식물 집단은 스크리닝된다. 상기 집단은 많은 상이한 방식으로 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 상기 집단은 앞서 본 명세서에 기재된 것과 같은 저항성 바이오에세이 또는 야생(field) 스크리닝을 사용하여 스크리닝될 수 있다. ToTV 저항성 표현형을 나타내는 F1 잡종 식물은 ToTV 저항성을 발현하는 필수적인 핵산 서열을 포함하고, 상업적으로 원하는 특성을 갖고, 그 후 상기 상기 토마토 식물을 더욱 증가적으로 근교계(inbred)가 되도록 하기 위해서 많은 세대 (5, 6, 7 또는 8세대 이하까지) 동안 선택되고 자가 교배되고 선택된다. 상기 계속된 자가 교배 및 선발 방법은 2 내지 5 이상 또는 그 이상 세대 동안 수행될 수 있다. 상기 육종 및 선택의 결과는 상업적인 흥미를 갖는 형질과 연관된 다른 유전자 뿐만 아니라 ToTV 저항성과 연관된 유전자에 대한 유전적으로 균질한 라인의 생산이다. 바이오에세이의 표현형 병리학적 스크리닝을 사용하는 대신에, 마커-의존적 육종은 ToTV 저항성을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 그들 자손을 확인하기 위해 본 명세서에서 앞서 언급된 1 이상의 분자 마커, 혼성화 프로브 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 마커-의존적 육종은 정량적인 바이오에세이로부터 얻어지는 결과를 확인하는데 사용될 수 있다. 일단 적절한 선택이 이루어 지면, 상기 방법은 반복된다. 상기 반복친과의 역교배 및 ToTV 저항성을 선택하는 방법은 약 5 내지 그 이상 세대 동안에 반복된다. 이 과정에서 발생하는 자손은 ToTV 저항성을 코딩하는 1 이상의 유전자에 대해 이형접합이다. 그 후 최종 역교배 세대는 자가 교배되어 ToTV 저항성에 대한 동형접합성 순수 육종 자손을 제공한다.
본 명세서에 기재된 ToTV 저항성 근교계(inbred) 토마토 라인은 ToTV 저항성 잡종 식물을 생성하기 위해 추가적인 교배에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제1 ToTV 저항성 근교계(inbred) 토마토 식물은 질병 저항성, 곤충 저항성, 원하는 열매 특성 등과 같으나, 이에 제한되지 않는 제2 잡종과 교배될 수 있다. 이러한 제2 근교계(inbred) 토마토 라인은 ToTV 저항성일 수도 있고 아닐 수도 있으나, 바람직하게는 상기 자손 식물의 50% 이상이 상기 ToTV 저항성 표현형을 발현하도록 본 명세서에 정의된 상기 마커와 연관된 것과 같은 ToTV 저항성의 하나 이상의 대립인자를 갖는다. 또한 더 바람직하게는, 상기 제2 근교계(inbred) 토마토 라인은 ToTV 저항성이 있기 때문에, 상기 저항성 표현형은 상기 교배에도 불구하고 보존된다. 이러한 방식으로, 본 발명의 상기 제1 ToTV 저항성 근교계(inbred) 토마토 식물은 추가적인 유전가능한 형질을 상기 제2 근교계(inbred) 토마토 식물 라인으로 유전질 침투시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 ToTV 저항성 토마토 식물로 성장할 수 있는 씨를 생성하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 본 발명의 ToTV 저항성 토마토 식물을 제공하는 단계, 다른 ToTV 저항성 토마토 식물과 상기 ToTV 저항성 식물을 교배하는 단계, 및 식재되는 경우, ToTV 저항성 잡종 토마토 식물을 생성하는 상기 교배로부터 발생하는 씨를 수집하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 본 발명의 ToTV 저항성 토마토 식물을 제공하는 단계, 상기 ToTV 저항성 식물을 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum) 식물과 교배시키는 단계, 상기 교배로부터 발생하는 씨를 수집하는 단계, 상기 씨를 식물로 재생산하는 단계, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 ToTV 저항성 식물을 선택하는 단계, 상기 식물에 ToTV 저항성을 부여하는 대립인자에 대하여 고정된 식물을 얻기 위해 충분히 많은 세대 동안 상기 선택된 식물을 자가교배하는 단계, ToTV 저항성이고 원하는 표현형 형질을 갖는 솔라눔 리코페르시쿰(S. lycopersicum) 식물을 얻기 위해 충분히 많은 세대 동안 원하는 표현형 형질을 갖는 솔라눔 리코페르시쿰(S. lycopersicum) 식물과 상기 식물을 역교배하는 단계, 및 식재되는 경우, ToTV 저항성인 토마토 식물을 생성하는 최종 역교배로부터 발생하는 식물로부터 생산된 씨를 수집하는 단계를 포함한다.
예시적이고, 한정적이지 않는, 본 발명의 실시예들이 이하 주어질 것이다.
도 1은 4번 염색체를 표현하고, 많은 잘 알려진 마커의 가장 최근 위치를 나타내는 토마토 게놈의 도식적 지도를 나타내는 것이다.
도 2는 실시예 2에 기재된 것과 같은 ToTV 저항성에 대한 상기 저항성 대립인자의 존재 또는 부존재를 나타내기 위하여 특이적인 제한 효소로 절단된 PCR 단편의 아가로즈 겔을 도시한 것이다.
실시예 1
토마토에서 상기 ToTV 저항성 유전자에 연관된 마커의 확인
이 실험의 목적은 벌크 분리 분석 (Bulk Segregant Analysis, BSA; Michelmore, R. W., I. Paran 및 R. V. Kesseli, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9828-9832)을 사용하여, 토마토에서 ToTV 저항성에 연관된 AFLP 마커를 확인하는 것이었다.
ToTV 저항성은 단성 열성(monogenic recessive)으로 유전되는 형질인 것으로 밝혀졌다. 상기 분석은 F3 식물이 표현형 분석된 150 개의 F2 토마토 품종 교배 식물에 대해 수행했다. 신뢰할 수 있는 표현형을 결정하기 위해, F3 식물에 관한 표현형 분석을 F2 식물의 서브세트(subset)에 대하여 여러 번 반복했다. 반복된 표현형 분석에 의해 얻어진 결과를 기초로, 18개의 개체는 신뢰할 수 있는 저항성을 갖는 것으로 나타났고 9개의 개체는 신뢰할 수 있는 감응성을 나타냈다. 이들 식물들을 상기 BSA에 사용했다. 이들 개체들로부터의 표현형 정보는 표 1에 기재했다.
마커 확인 및 증명
마커의 명명
상기 AFLP 프라이머 조합이 공통적으로 표시되고 있는 코드, 예를 들어, P14/M49-F-282에서, 상기 P 및 M은 공통적인 PstI 및 MseI 프라이머 서열 또는 보편적인 프라이머 (Vos 등, 1995; Bai 등, 2003)이고, 뒤이어 2개의 숫자 확장 코드에 의해 표시되는 것과 같은 2 또는 3개의 여분의 선택적인 염기가 표시된다. 2개의 숫자 확장 코드는 하기와 같다. 11: AA; 13: AG; 14: AT; 15: CA; 21: GG; 25: TG; 35: ACA; 38: ACT; 49: CAG; 51: CCA; 61: CTG. 282는 얻어지는 다형 단편의 염기쌍의 대략적인 크기이다(주어진 크기±2 염기쌍). 상기 크기는 정상적으로는 반올림되지만 또한 십진수로 주어질 수 있다. 이 단편은 조사되는 식물에서 증폭된다. 프라이머 및 어뎁터 서열은 Bai 등 2003에 의해 상세하게 기재된다.
마커 TG 163(Expen 2000; SOL Genomics Network; http://www.sgn.cornell.edu/index.pl)은 하기 서열의 정방향 및 역방향 프라이머로 구성된다.
정방향 서열:
Figure 112008090695607-PCT00001
역방향 서열:
Figure 112008090695607-PCT00002
생물학적인 물질
총 300개의 F2 식물의 잎 물질이 평가에 이용가능했다. 이들 중, 총 150개의 식물은 이들 F2 개체로부터 유래된 F3 식물의 표현형을 기초로 표현형을 분석했다. 게놈 DNA를 이들 150개의 표현형이 분석된 식물(표 1)의 잎 물질로부터 분리했고 AFLP 핑거프린팅을 위한 PstI/MseI 주형을 이들 DNA 시료로부터 생성시켰다. 뒤이어, 시험 핑커프린트는 모든 식물에 관한 프라이머 조합인 P14/M50을 사용하여 생 성되었다.
개체에 대한 BSA 및 입증
상기 BSA는 ToTV에 대한 저항성이 있는 10개(10)의 개체를 포함하는 하나의 벌크 및 ToTV에 대한 9개(9)의 감응성 개체를 포함하는 하나의 벌크에 대하여 96개의 프라이머 조합을 스크리닝하므로써 시작되었다(표 2). 이러한 스크리닝은 총 18개(18)의 이용가능한 ToTV 저항상 개체, 9개(9)의 ToTV 감응성 개체 및 상기 표현형이 명백하게 평가될 수 없는 5개(5)의 개체로 구성된, 32개의 개체에 대하여 뒤이어 입증된 3개(3)의 후보 마커((이중-대립인자성인) P11/M54-P-233/235, P14/M49-F-282 및 P15/M49-F-330)를 결과적으로 확인했다(표 3). 이러한 스크리닝을 기초로, 마커 P14/M49-F-282는 상기 ToTV 저항성 유전자에 가장 근접하게 연관된 마커처럼 보였다.
제2 BSA는 96개의 프라이머 조합이 (현재 각각, 9개 및 8개의 개체로 구성된) R-벌크 및 S-벌크에 대하여 스크리닝되는 것으로 수행되었다. 이러한 스크리닝은 상기 이전 BSA 스크리닝으로부터의 하나의 마커 (P15/M49-F-330)와 함께 32개의 상기 언급된 개체 상에서 입증된 2개의 후보자 마커 (P21/M61-F-583 및 P25/M51-F-131)를 결과적으로 확인했다. 상기 추가적으로 스크리닝된 마커 중 어떠한 것도 상기 제1회 BSA에서 확인된, 가장 잘 연관된 마커 P14/M49-F-282보다 더 근접하게 연관된 것으로 보이지 않았다.
마커 P14/M49-F-282가 가장 근접하게 연관된 마커로 밝혀졌기 때문에, 150개의 표현형이 분석된 모든 개체에서 이 마커를 스크리닝할 것을 결정했다. 그 결과 를 표 5에 나타냈다. 총 17개의 재조합체를 확인했다(표 4). 상기 표현형을 3개의 분류(class)로 나누었다.
- 저항성 (A) = 전체 감염 비율은 25%보다 작았다.
- 분리 (H) = 전체 감염 비율은 25% 내지 75%였다.
- 감응성 (B) = 전체 감염 비율은 75% 보다 높았다.
마커 P14/M49-F-282의 유전자형과 조합된 이러한 분류를 기초로, 총 28개의 재조합체를 확인했고, 이는 상기 마커와 상기 ToTV 저항성 유전자 사이의 거리, 약 9.5 cM에 해당한다. 이것은 상기 ToTV 저항성 유전자가 마커 P14/M49-F-282와 Pl1/M35-F-216 사이에 위치된, 상기 창의 계산된 크기 (9 cM)와 일치한다(표 3). 이러한 계산은 BSA에서 사용되고 가장 신뢰할 수 있는 것으로 표현형 분석 결과 여겨지는 상기 라인을 기초로 하고 있다.
시험된 모든 마커 중에 가장 근접하게 연관된 것으로 보이는, 마커 P14/M49-F-282는 그럼에도 불구하고 상기 유전자좌로부터 아주 먼 거리에 있기 때문에, 더욱 근접하게 연관된 마커가 요구된다. 따라서, 72개의 프라이머 조합을 스크리닝하여, 스크리닝된 프라이머 조합의 총 수가 263개에 달하는, 제3 BSA 스크리닝을 실행했다. 이러한 제3 스크리닝에서, (6개의 프라이머 조합 중에) 9개의 후보 마커가 확인되었고, 이는 8개의 저항성 및 8개의 감응성 개체에서 입증되었다(표 3). 2개의 마커 (P11/M35-F-216 및 상기 이중-대립인자 마커 P13/M38-F-311/313)는 가장 근접하게 연관된 것으로 나타났다. 마커 P11/M35-216의 위치는 그 위치가 단일 조합체를 기초로 하기 때문에, 현재로서는 임시적이라는 것이 강조된다. 상기 2개의 마커 P11/M35-F-216 및 P13/M38-F-311/313는 뒤이어 17개의 제조합체 및 28개의 저항성 및 감응성 개체를 포함하는, 어떠한 표현형 정보도 이용불가능한 더 큰 개체의 세트에서 스크리닝되었다(표 5).
마커 P13/M38-F-311는 상기 민감성 대립인자에 연관된다. 상기 프라이머들 사이에서 증폭된 상기 311-염기쌍 단편은 하기 서열을 갖는다(311개의 염기 중 278개는 신뢰할 수 있게 결정됨):
Figure 112008090695607-PCT00003
마커 P13/M38-F-313는 상기 저항상 대립인자에 연관된다. 상기 프라이머들 사이에서 증폭된 313-염기쌍 단편은 하기 서열을 갖는다(313개의 염기 중 284개는 신뢰할 수 있게 결정됨):
Figure 112008090695607-PCT00004
마커 P11/M35-F-216는 상기 저항성 표현형에 연관된다. 상기 프라이머들 사이에서 증폭된 216-염기쌍 단편은 하기 서열을 갖는다(216개의 염기 중 185개는 신뢰할 수 있게 결정됨):
Figure 112008090695607-PCT00005
생식질(germplasm) 라인 상에서 마커에 연관된 2개의 후보의 스크리닝
상기 2개의 마커 P11/M35-F-216 및 P13/M38-F-311/313은 상기 ToTV 저항성에 근접하게 연관되어 있는 것으로 확인되었다. 상기 표현형의 해석은 상기 계산된 거리에 많은 영향을 미치기 때문에, 유전자와 마커 사이의 거리를 결정하기 어렵다는 것에 유의해야 한다. 이들 마커는 83개 개체의 생식질 세트에서 스크리닝되었다. 이러한 스크리닝을 기초로, 마커 P11/M35-F-216은 90.4%의 예상 수치를 갖는 것으로 나타났고, 마커 P13/M38-F-311/313은 96.4%의 예상 수치를 갖는 것으로 나타났다(표 6).
토마토 게놈 상의 ToTV 저항성의 위치 확인
토마토 마커의 독점적인 게놈 지도(proprietary genome map)와 조합된 실험적 증거는 마커 P14/M49-F-282가 4번 염색체에 위치되어 있는 것을 제안했다. 따라서, ToTV 저항성의 유전적 기초는 4번 염색체에 위치되는 것으로 기대된다. 4번 염색체에서 2개의 인접된(flanking) 마커가 발견되었다: 상기 이중-대립인자 마커 P13/M38-F-311/313 및 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900(실시예 2 참조). 이 COSⅡ/CAPS 마커가 MseI으로 분해되는 경우, 상기 민감성 (동형접합성 감응성) 표현형은 각각 360 bp 및 260 bp의 2개의 단편을 제공하는 반면, 상기 (동형접합성) 저항성 표현형은 각각 420 bp 및 260 bp의 2개의 단편을 제공하고, 총 3가지의 단편을 나 타내는 식물은 2개 대립인자를 갖고 이형접합성(즉, 감응성)이다 (총 3가지 유형의 식물로 구성된 시험 집단의 분해된 PCR 산물을 나타내는 대표적인 겔에 관한 도 2를 참조. 이동은 아래에서 위로 이루어지고, 사이즈 마커는 100, 200, 300 bp 등의 단편을 나타냄).
리코페르시콘(Lycopersicon)의 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900에 대한 유니젠(unigene) 서열(ID: 2004년 6월 30일자 데이터에 근거한 SGN-U228314; 2007년 4월 5일자 유니젠 SGN-U332034)은:
Figure 112008090695607-PCT00006
결론
저항성 및 감응성 개체의 2개의 저항성 벌크에 총 263개의 263 PstI/MseI PC의 스크리닝 및 뒤이은 입증 단계에 의하여, (하나의 이중-대립인자인) 총 4개의 마커는 ToTV 저항성에 연관된 것으로 나타났다. 상기 마커와 상기 ToTV 저항성 유전자 사이의 거리는 결정하기 어렵지만, 번역된 표현형과 마커 P14/M49-F-282의 유전자형을 기초로 상기 거리는 9.5 cM로 추정되었다. 이는 상기 ToTV 저항성 유전자가 위치된 9 cM인, 상기 창의 계산된 크기에 일치한다. 이러한 계산은 가장 신뢰할 수 있게 표현형 분석된 것으로 여겨지는 상기 라인을 기초로 한다.
마커 P11/M35-F-216 및 P13/M38-F-311/313 (이중-대립인자인)는 83개의 생식질 개체에서 증명되었다. 이러한 스크리닝을 기초로, 상기 마커는 각각 90.4% 및 96.4%의 예상 수치를 갖는다. 빗나간 라인이 발생하는 것은 상기 ToTV 유전자좌 또는 재조합에서 대립인자 변이에 의해 설명될 수 있다.
상기 ToTV 저항성 유전자는 4번 염색체 상에 마커 P14/M49-F-282의 존재에 의해 표시된 것과 같이 상기 염색체에 가장 위치할 것 같다.
263개의 PC를 사용하여 확인된 마커에 연관된 상대적으로 많은 수의 후보물질을 기초로, 상기 ToTV 저항성 유전자는 야생 토마토 접근(accession)으로부터의 유전질 침투인 것으로 보인다.
Figure 112008090695607-PCT00007
표 1: ToTV 저항성에 관한 F2 개체 및 표현형의 개요. 표현형은 이들 F2 개체로부터 유래된 F3 식물을 기초로 함을 참조.
Figure 112008090695607-PCT00008
표 1 - 계속
표 2: BSA에 사용된 벌크에서의 사용된 F2 개체
저항성 풀(pool) 감응성 풀(pool)
004 008
019 032
040 045
046 053
049 078
070 083
082 135
095 172
136 178*
149*
* 제1 BSA에만 사용된 개체
Figure 112008090695607-PCT00009
표 3: BSA를 사용하여 확인되고 뒤이어 32개의 F2 식물에서 스크리닝된 마커의 개요. 마커는 가장 예상되는 순서로 배열되었다. 마커 Pl1/M35-F-216가 정확하게 위치된 것인지 여부는 의문시된다.
Figure 112008090695607-PCT00010
표 4: 마커 P14/M49-F-282<N>를 기초로 데 루이테르 씨(De Ruiter Seeds)에 의해 선택된 제조합체.
Figure 112008090695607-PCT00011
표 5: 3개의 가장 연관된 마커를 사용하여 생성된 데이터. 마커 P14/M49-F-282는 150개의 표현형 라인 및 상기 마커 Pl1/M35-F-216에 대하여 스크리닝되었고 상기 이중-대립인자 P13/M38-F-311/313은 서브세트에 대하여 스크리닝되었다.
Figure 112008090695607-PCT00012
표 6: 80개의 생식질 라인에 대하여 ToTV 저항성에 연관된 마커의 후보물질의 스크리닝에 의해 생성된 데이터.
실시예 2
ToTV에 대한 열성 저항성을 검출하기 위한 마커 C2_At5g25900 및 제한 효소 MseI의 용도
시료:
시험 집단의 각 식물로부터 토마토 조직의 DNA 시료를 표준 제조 기술(예를 들어, Fulton TM, Chunwongse J, and Tanksley SD. (1995) Microprep Protocol for Extraction of DNA from Tomato and other Herbaceous Plants. Plant Molecular Biology Reporter 13 (3): 207-209에서 말하는 것과 같은, 마이크로프렙)을 사용하여 제조했다.
PCR 화학물질은 하기와 같다:
- dNTP's (2mM Stock) (Amersham Bioscience)
- SuperTherm polymerase (Integro)
- 정향방향 프라이머 (lOng/㎕) 5' TGC TAA TTG GGC TGA AAC TTA TGG
- 역방향 프라이머 (lOng/㎕) 5' TGT TAG CTT TCT AGT TGA GAT GGA TG
- 1Ox PCR 버퍼 25mM MgCl2
- 로딩 버퍼
- 에티디움브로마이드 (10mg/㎖)
- Ix TE
- 0,5X TBE (Duchefa)
- 제한 효소 MseI (New England Biolabs)
(시료 당) 구성된 PCR 혼합물
2.0 ㎕ 1Ox PCR 버퍼 (25mM MgCl2)
2.0 ㎕ dNTP's 혼합물 (각 dNTP's 2mM)
3.0 ㎕ 정방향 프라이머 (10 ng/㎕)
3.0 ㎕ 역방향 프라이머 (10 ng/㎕)
0.05 ㎕ SuperTherm 폴리머라아제
8.95 ㎕ H2O
1.1 ㎕ 주형 DNA
PCR 열순환기 프로파일은 다음과 같다:
32 주기 동안 94℃에서 3분;(94℃에서 30초, 65℃에서 1분, 및 72℃에서 1분); 4℃에서 유지(hold)
상기 PCR 산물은 제조자의 지시에 따라 MseI으로 분해했다. 전기영동은 1.5% 아가로즈 겔에서 수행했다.
마커점수(Markerscores):
점수 1 = 360 bp + 260 bp = 동형접합성 감응성
점수 2 = 420 bp + 360 bp + 260 bp = 이형접합성
점수 3 = 420 bp + 260 bp = 동형접합성 저항성
상기 표현형은 잡종으로부터 독립적으로 점수가 매겨졌다.
결과 및 검토:
상기 겔의 사진은 총 3가지 유형의 식물로 구성된 상기 시험 집단의 분해된 PCR 산물을 나타내는 것으로, 도 2에 나타냈다. 이동은 아래에서 위로 이루어지고, 사이즈 마커는 100, 200, 300 bp 등의 단편이다.
표 I:
ToTV 마커점수 ToTV 표현형
2-이형접합성
식물 1002 2 2
식물 1003 2 2
식물 1004 2 2
식물 1006 2 2
식물 1007 2 2
식물 1010 2 2
식물 1011 2 2
식물 1012 2 2
식물 1014 2 2
식물 1015 2 2
표 Ⅱ:
ToTV 마커점수 ToTV 표현형
3 -저항성
식물 1016 3 3
식물 1017 3 3
식물 1018 3 3
식물 1019 3 3
식물 1037 3 3
식물 1038 3 3
식물 1040 3 3
식물 1041 3 3
식물 1042 3 3
식물 1043 3 3
식물 1044 3 3
식물 1045 3 3
식물 1046 3 3
식물 1047 3 3
식물 1048 3 3
식물 1049 3 3
식물 1051 3 3
식물 1052 3 3
식물 1054 3 3
식물 1055 3 3
식물 1061 3 3
식물 1062 3 3
식물 1064 3 3
식물 1065 3 3
식물 1066 3 3
식물 1067 3 3
식물 1068 3 3
식물 1069 3 3
식물 1070 3 3
식물 1071 3 3
식물 1072 3 3
식물 1073 3 3
식물 1074 3 3
식물 1075 3 3
식물 1076 3 3
식물 1077 3 3
식물 1078 3 3
식물 1079 3 3
식물 1080 3 3
식물 1081 3 3
식물 1082 3 3
식물 1083 3 3
식물 1084 3 3
식물 1089 3 3
식물 1090 3 3
표 Ⅲ:
ToTV 마커점수 ToTV 표현형
1-감응성
식물 1020 1 1
식물 1021 1 1
식물 1022 1 1
식물 1024 1 1
식물 1025 1 1
식물 1026 1 1
식물 1027 1 1
식물 1028 1 1
식물 1029 1 1
식물 1030 1 1
식물 1031 1 1
식물 1032 1 1
식물 1033 1 1
식물 1034 1 1
식물 1035 1 1
식물 1036 1 1
식물 1056 1 1
식물 1057 1 1
식물 1058 1 1
식물 1059 1 1
식물 1085 1 1
식물 1086 1 1
식물 1087 1 1
식물 1088 1 1
1-저항성
식물 1039 1 3
식물 1050 1 3
식물 1053 1 3
3-감응성
식물 1023 3 1
모름
식물 1005 3 2?
식물 1008 3 2?
식물 1013 - 2
상기 마커 C2_At5g25900는 86개의 라인에서 원래 시험되었다. 이들 라인들 중 3개는 불명확한 표현형 또는 존재하지 않는 마커 결과로 인해 분석할 수 없었다(표 Ⅲ에 "모름(unknown)"을 참조).
- 10개의 라인은 상기 표현형이 이형접합성 감응성인 경우 점수 "2"를 나타 냈다.
- 24개의 라인은 상기 표현형이 동형접합성 감응성인 경우 점수 "1"을 나타냈다.
- 45개의 라인은 상기 표현형이 동형접합성 저항성인 경우 점수 "3"을 나타냈다.
- 상기 마커점수는 상기 시험된 물질의 95%에서 관찰된 표현형과 일치한다.
결론:
상기 마커는 상기 표현형의 예상 및 상기 저항성 대립인자의 검출을 위해 신뢰할 수 있게 (95%의 정확도) 사용될 수 있다고 결론지어진다.
상기 마커 C2_At5g25900와 상기 저항성 대립인자 사이의 유전적 거리는 부분적으로 지도화되었다. 이러한 마커를 기초로, 상기 데이터는 결론에 이르지 못했고 상기 유전자에 대한 거리는 0 내지 10 cM에서 신뢰할 수 있게 결정될 수 있을 뿐이다.
상기 동일한 시료를 마커 P13/M38-F-311/313에 대해 시험했을 경우, 55개의 시료로부터 총 2개의 재조합체가 O cM 내지 3.6 cM의 이러한 마커와 상기 저항성 유전자 사이의 연관을 나타내는 것으로, 설명될 수 있다.

Claims (29)

  1. 게놈 중에 토마토 토르라도 바이러스(ToTV)에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 하나 이상의 대립인자를 갖는 식물로서, 상기 바이러스는 2004년 11월 24일에 기탁자 참조 번호 ToTV-EOl(DSM 16999) 하에 독일 미생물 자원 센터에 기탁된 것인 식물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물은 가지(Solanaceae) 속의 식물, 더 바람직하게는 토마토 식물인 것인 식물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 식물은 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum) 종의 식물인 것인 식물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 대립인자는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900에 연관된 게놈 영역에 위치된 것인 식물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 대립인자는 4번 염색체, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282와 P11/M35-F-216 사이에, 더 바람직하게는 AFLP 마커 P13/M38-F-311/313와 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900 사이에 위치된 게놈 영역에 위치된 것인 식물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대립인자는 동형접합 형태로 존재하는 것인 식물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저항성은 감염의 확립(establishment)에 대한 저항성으로 발현되는 것인 식물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 제1항의 토마토 토르라도 바이러스 (ToTV)에 의한 감염 및 선택적으로 뒤이어 상기 ToTV 저항성 유전자의 상기 대립인자에 연관된 하나 이상의 분자 마커의 존재에 대하여는 스크리닝하는 것을 포함하는 방법을 포함하는 저항성 바이오에세이에서 확인되는 것인 식물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 상기 ToTV 저항성 유전자의 상기 대립인자에 연관된 하나 이상의 분자 마커의 존재에 대하여 스크리닝하는 것을 포함하는 방법 및 선택적으로 뒤이어 제1항의 토마토 토르라도 바이러 스 (ToTV)에 의한 감염을 포함하는 저항성 바이오에세이에 의해 생산되는 것인 식물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 분자 마커는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, 및 P13/M38-F-311/313 및 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900으로 구성된 군으로부터, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및 P13/M38-F-311/313 및 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900으로 구성된 군으로부터, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 식물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 식물로부터 유래된 식물 부분.
  12. 제11항에 있어서, 상기 부분은 열매 또는 씨인 것인 식물 부분.
  13. 제1항의 토마토 토르라도 바이러스 (ToTV)에 대한 저항성이 있는 식물을 선택하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 상기 바이러스의 접종물(inoculum)을 제공하는 단계;
    b) 식물을 상기 접종물에 노출하는 단계;
    c) 충분한 배양 시간 동안 배양하는 단계; 및
    d) 상기 배양 시간의 경과 중에 상기 식물에 어떠한 감염도 확립하지 않는 경우에 있어서 상기 식물을 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 게놈 중에 제1항의 토마토 토르라도 바이러스(ToTV)에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 하나 이상의 대립인자를 갖는 식물을 선택하는 방법으로서, 상기 방법은 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900에 연관된 게놈 영역의 존재에 대한 식물의 게놈 DNA를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 제13항 또는 제14항의 방법을 수행함으로써 게놈 중에 제1항의 토마토 토르라도 바이러스(ToTV)에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 하나 이상의 대립인자를 갖는 식물을 선택하는 단계, 상기 선택된 식물을 그 자체 또는 다른 식물과 교배시켜 씨를 생성하는 단계, 및 상기 씨를 식물로 성장시키는 단계를 포함하는 식물의 제조 방법.
  16. 제1항의 토마토 토르라도 바이러스 (ToTV)에 대한 저항성이 있는 식물을 제 조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 제13항 또는 제14항의 방법을 수행하여 상기 토마토 토르라도 바이러스 (ToTV)에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 하나 이상의 대립인자를 게놈 중에 갖는 식물을 선택하는 단계;
    b) 상기 선택된 식물을 다른 식물 또는 그 자체와 교배시켜 씨를 생성하는 단계;
    c) 상기 씨를 식물로 성장시켜 자손 식물을 생성하는 단계;
    d) 선택적으로 단계 b) 및 단계 c)의 교배 단계 및 성장 단계를 반복하는 단계; 및
    e) 상기 대립인자가 동형접합 형태로 존재하는 식물을 상기 자손 식물들 중에서 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단계 e)의 선택은 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900에 연관된 상기 게놈 영역의 동형접합 존재에 대한 상기 자손 식물의 DNA를 스크리닝하는 단계에 의해 수행되는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 단계 e)의 선택은 상기 바이러스를 사용하는 저항성 바이오에세이에 의해 수행되는 것인 방법.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 가지(Solanaceae) 속의 식물, 더 바람직하게는 토마토 식물, 더 바람직하게는 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum) 종의 식물인 것인 방법.
  20. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 식물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 식물은 가지(Solanaceae) 속의 식물, 더 바람직하게는 토마토 식물, 더욱 더 바람직하게는 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum) 종의 식물인 것인 식물.
  22. 제21항에 따른 식물로부터 유래된 식물 부분.
  23. 제22항에 있어서, 상기 부분은 열매 또는 씨인 것인 식물 부분.
  24. ToTV에 대한 저항성을 부여하는 대립인자의 용도로서, 상기 대립인자는 토마토의 4번 염색체에 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900에 연관된 게놈 영역 중에 위치된 것으로서,
    - ToTV 저항성 토마토 식물을 선택하기 위한, 또는
    - ToTV 감응성 토마토 변종에 상기 저항성을 갖는 대립인자의 존재 빈도를 증가시켜 상기 변종에 ToTV에 대한 저항성을 부여하기 위한 것인 용도.
  25. ToTV 감염으로부터 야기되는 식물의 수율을 개선하거나 및/또는 상기 식물의 수율 감소를 방지하기 위한 ToTV 저항성 식물의 용도로서, 상기 ToTV 저항성 식물은 토마토의 4번 염색체에 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900에 연관된 게놈 영역에 위치된 대립인자의 동형접합 존재에 의해 특징지어지는 것인 용도.
  26. ToTV 저항성 식물의 씨의 용도로서, 상기 식물은 식물 또는 식물 집단에서 ToTV 저항성 식물을 생산하기 위한 또는 토르라도 질병(또는 마르키테 츠(marchitez) 또는 초코렛 반점 질병과 같은 관련 질병)의 발생을 방지하기 위한, 제1항 내지 제11항, 제20항 또는 제21항 중 어느 한 항의 식물인 것인 용도.
  27. ToTV에 대한 저항성을 부여하거나, 또는 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 대립인자에 대해 동형접합성인 하나 이상의 대립인자를 포함하는 식물의 용도로서, ToTV 저항성 토마토 식물로서 또는 상기 대립인자의 동형접합성 존재로부터 야기되는 ToTV 저항성 표현형을 갖는 다른 식물을 제공하는 목적인 육종 프로그램에서 부모 식물로서, 상기 대립인자는 토마토의 4번 염색체에 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216, P21/M61-F-583, P25/M51-F-131, P15/M49-F-330, P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900, 바람직하게는 AFLP 마커 P14/M49-F-282, P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313, 가장 바람직하게는 AFLP 마커 P11/M35-F-216 및/또는 P13/M38-F-311/313 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900에 연관된 게놈 영역에 위치된 것인 용도.
  28. 식물에 ToTV에 대한 저항성을 부여하는 대립인자의 존재를 검출하기 위한 AFLP 마커 P13/M38-F-311/313, P11/M35-F-216 및/또는 COSⅡ/CAPS 마커 C2_At5g25900의 용도.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 토마토 식물인 것인 용도.
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