KR20090023619A

KR20090023619A - 인슐린친화성 펩타이드 합성법

Info

Publication number: KR20090023619A
Application number: KR1020087031096A
Authority: KR
Inventors: 린 첸; 연-퀘이 한; 크리스토퍼 알 로버츠
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2006-06-23
Filing date: 2007-06-19
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2027-06-19
Also published as: CY1110186T1; US20080004429A1; IL195421A0; JP2009541257A; PL2035451T3; TW200811195A; ZA200810072B; UA96602C2; NZ573093A; RS51281B; HRP20100302T1; RU2448978C2; CN101563364B; KR101087859B1; CA2654610A1; NO20084863L; SI2035451T1; CR10463A; WO2007147816A1; CA2654610C

Abstract

본 발명은 고체-상 및 용액-상("혼성") 접근법을 이용하여 합성되는 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 이 접근법은 고체-상 화학을 이용하여 3가지 상이한 펩타이드 중간체 단편을 합성함을 포함한다. 이어, 용액-상 화학을 이용하여 추가적인 아미노산 물질을 단편중 하나에 부가한다. 이어, 단편을 고체-상 및 용액-상에서 함께 커플링시킨다. 단편중 하나에 슈도프롤린을 사용하면 그 단편의 고체-상 합성이 용이해지고, 또한 이 단편과 다른 단편의 후속 용액-상 커플링도 용이해진다. 본 발명은 GLP-1(7-36) 및 그의 천연 및 비-천연 유사체 같은 인슐린친화성 펩타이드를 생성시키는데 매우 유용하다.

인슐린친화성 펩타이드, 고체-상 및 용액-상 합성.

Description

인슐린친화성 펩타이드 합성법{INSULINOTROPIC PEPTIDE SYNTHESIS}

본 발명은 고체-상(solid-phase) 및 용액-상(solution-phase) 방법을 이용하여 인슐린친화성(insulinotropic) 펩타이드, 구체적으로는 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 그의 유사체(counterpart)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 방법에 사용될 수 있는 중간체 펩타이드 단편에 관한 것이다.

많은 펩타이드 합성 방법이 문헌에 기재되어 있다[예를 들어, 미국 특허 제 6,015,881 호; 머글러(Mergler) 등 (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008; 머글러 등 (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012; 캠버(Kamber) 등(편집), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526; 리니커(Riniker) 등 (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320; 로이드-윌리암스(Lloyd-Williams) 등 (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133; 및 앤더슨(Andersson) 등 (2000) Biopolymers 55:227-250 참조]. 다양한 합성 방법은 합성이 이루어지는 상의 물리적 상태, 즉 액체-상 또는 고체-상에 의해 구분된다.

고체-상 펩타이드 합성법(SPPS)에서는, 아미노산 또는 펩타이드기를 고체 지 지체 수지에 결합시킨다. 이어, 연속적인 아미노산 또는 펩타이드기를 관심 있는 펩타이드 물질이 형성될 때까지 지지체-결합된 펩타이드에 부착한다. 지지체-결합된 펩타이드를 전형적으로 지지체로부터 절단하고 추가 가공 및/또는 정제시킨다. 일부 경우에서는 고체-상 합성법이 성숙 펩타이드 생성물을 생성시키고; 다른 경우에서는 지지체로부터 절단된 펩타이드(즉, "펩타이드 중간체 단편")를 더 큰 성숙 펩타이드 생성물을 제조하는데 사용한다.

고체-상 방법으로부터 생성된 펩타이드 중간체 단편을 고체-상 또는 액체-상 합성 방법(본원에서는 "용액-상 합성법"이라고 함)에서 함께 커플링할 수 있다. 용액-상 합성법은 고체-상에 의한 유용한 성숙 펩타이드의 합성이 불가능하거나 실용적이지 못한 경우에 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 고체-상 합성법에서는, 보다 긴 펩타이드가 고체 지지체에 여전히 부착되어 있는 동안 결국 불규칙한 형상을 갖게 되어 성장하는 쇄에 추가적인 아미노산 또는 펩타이드 물질을 부가하기 어렵게 될 수 있다. 펩타이드 쇄가 지지체 수지 상에서 더 길어짐에 따라, 커플링 및 탈보호 같은 공정 단계의 효율이 희생될 수 있다. 이로 인해 다시, 활성화가능한 아미노산, 보조 시약 및 용매 같은 출발 물질의 손실이 증가됨에 덧붙여, 이들 문제점을 보충하기 위해 가공 시간이 길어질 수 있다. 펩타이드의 길이가 증가함에 따라 이들 문제점이 더 많아질 수 있다.

따라서, 고체-상 절차만을 이용하여 단일 단편에서 합성된, 길이가 아미노산 30개보다 더 큰 성숙 펩타이드를 찾기는 비교적 드문 일이다. 대신, 고체-상에서 개별 단편을 별도로 합성한 다음 고체-상 및/또는 용액 상에서 커플링하여 목적하 는 펩타이드 생성물을 구축할 수 있다. 이 접근법에서는 후보 단편을 조심스럽게 선택해야 한다. 몇몇 일반적인 원리에 따라 단편을 선택할 수 있지만, 후보 단편을 상당히 자주 실험에 의해 시험해야 한다. 한 상황에서 작용하는 단편 전략이 다른 상황에서는 작용하지 않을 수도 있다. 적당한 후보 단편이 밝혀진 경우에라도, 상업적으로 적당한 조건하에 작용하는 합성 전략을 위해 공정 개혁이 여전히 요구될 수 있다. 그러므로, 혼성 체계를 이용하는 펩타이드 합성법이 흔히 요구되며, 많은 경우 실제 합성을 수행할 때까지는 어떤 문제점이 합성 반응에 내재하는지를 예측하기가 어렵다.

용액-상 커플링에서는, 통상 커플링 반응의 효율 및 품질을 증진시키는 추가적인 시약의 존재하에서, 2개의 펩타이드 중간체 단편, 또는 펩타이드 중간체 단편과 반응성 아미노산을 적절한 용매 중에서 커플링시킨다. 한 단편의 N-말단이 다른 단편의 C-말단에 커플링되도록, 또는 그 반대가 되도록 펩타이드 중간체 단편을 반응성 있게 배열한다. 또한, 고체-상 합성 동안 존재하는 측쇄 보호기는 통상 용액-상 커플링 동안 단편 상에 보유되어, 단편의 말단의 특이적인 반응성을 보장한다. 이들 측쇄 보호기는 전형적으로 성숙 펩타이드가 생성된 후에야 제거된다.

전체적인 합성 반응의 하나 이상의 단계에서의 최근 개선은 성숙 펩타이드의 제조에서 상당한 진보에 상당할 수 있다. 이러한 개선에 의해 시간 및 시약을 전체적으로 크게 절약할 수 있고, 또한 최종 생성물의 순도 및 수율을 크게 개선할 수 있다.

혼성 합성법에서의 개선의 중요성에 대한 논의를 이들 절차를 이용하여 생성 되는 임의의 종류의 펩타이드에 적용할 수 있으나, 치료 면에서 유용하고 상업적 의료 용도의 규모로 제조되는 펩타이드와 관련하여서는 특히 중요하다. 치료용 펩타이드 같은 보다 큰 생물 분자 약제의 합성법은 비용이 매우 비쌀 수 있다. 기타 인자에 덧붙여 시약의 비용, 합성 시간, 다수의 합성 단계 때문에, 이러한 보다 큰 생물 분자 약제의 합성 방법에서의 매우 작은 개선은 이러한 약제를 생성시키는 것이 경제적인 면에서 실행가능한지의 여부에 대해 상당한 영향력을 가질 수 있다. 다수의 경우 이러한 유형의 보다 큰 생물 분자 약제에 대한 적합한 치료 대안이 존재하는 경우에도 매우 소수라는 사실에 의해 뒷받침되는 바와 같이, 보다 큰 생물 분자 약제의 이러한 높은 생산 비용 때문에, 이러한 개선이 필요하다.

이는 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 그의 유사체의 경우에 명백히 보여진다. 이들 펩타이드는 유형 2 비-인슐린-의존성 진성 당뇨병 및 관련 대사 장애(예컨대, 비만)의 치료에 가능한 치료제로서 관련되어 왔다. 구트니악(Gutniak, M.K.) 등의 문헌[Diabetes Care 1994:17:1039-44].

로페즈(Lopez) 등은 천연 GLP-1의 길이가 37개 아미노산 잔기임을 밝혀내었다. 로페즈(Lopez, L.C.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80:5485-5489 (1983)]. 이러한 발견은 우텐탈(Uttenthal, L. O.) 등의 문헌[J. Clin. Endocrinal. Metabol., 61:472-479 (1985)]의 연구에 의해 확인되었다. 천연 GLP-1은 GLP-1(1-37)이라는 표기로 표시될 수 있다. 이 표기는 펩타이드가 1(N-말단) 내지 37(C-말단)의 아미노산을 모두 가짐을 나타낸다. 천연 GLP-1은 하기 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는다:

HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

천연 GLP-1(1-37)은 통상 인슐린 생합성을 매개할 수 없으나 이 펩타이드의 생물학적으로 중요한 단편은 인슐린친화성 특성을 갖는 것으로 보고되어 있다. 예를 들어, 하기 서열번호 2에 따른 길이가 31개 아미노산인 천연 펩타이드 GLP-1(7-37)은 인슐린친화성이고 천연 GLP-1의 7(N 말단) 내지 37(C 말단) 위치의 아미노산을 갖는다:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

GLP-1(7-37)은 말단 글리신을 갖는다. 이 글리신이 존재하지 않는 경우, 이 펩타이드는 여전히 인슐린친화성을 나타내고, 하기 서열번호 3에 따른 GLP-1(7-36)으로 불린다:

HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR

GLP-1(7-36)은 흔히 아마이드화된(amidated) 형태에서 C-말단 아르기닌을 갖는 상태로 존재하고, 이 형태는 GLP-1(7-36)-NH₂라는 표기로 표시될 수 있다.

GLP-1(1-37)은 통상 생체 내에서 그의 인슐린친화성 유사체로 전환된다. 예를 들어, GLP-1(1-37)은 생체 내에서 자연적으로 GLP-1(7-37)로 전환된다. 이 펩타이드는 다시 C-말단 글리신의 단백질 분해성 제거에 의해 추가적으로 처리되어 GLP-1(7-36)을 생성시킬 수 있으며, 이는 흔히 아마이드화된 형태인 GLP-1(7-36)-NH₂로 존재한다. 따라서, 치료를 위한 처치는 생체 내에서 그의 인슐린친화성 유도체를 생성시킬 것으로 예상하면서 GLP-1(1-37) 또는 그의 유사체를 투여함을 포함 할 수 있다. 그러나, 더욱 통상적으로, 연구되고 있는 치료를 위한 처치는 인슐린친화성을 나타내는 GLP-1 단편 자체를 투여함을 포함한다.

미국 특허 제 6,887,849 호에 따라, GLP-1(7-37), GLP-1(7-36) 및 GLP-1(7-36)-NH₂의 인슐린친화성은 췌장 베타 세포에 특이적인 것으로 보이며, 여기에서 이들 펩타이드는 인슐린의 생합성을 유도하는 것으로 보인다. 이로 인해, 이들 펩타이드 및 그의 약학적으로 허용가능한 유사체는 성인기 발증형 진성 당뇨병, 즉 인슐린 분비의 역학이 비정상적인 고혈당증을 그 특징으로 하는 질병의 병인 연구에 유용하다. 뿐만 아니라, 이들 글루카곤-유사 펩타이드는 이 질환의 치료 및 처치에, 또한 고혈당증의 치료 및 처치에 유용하다. 유럽 특허 제 1137667 B1 호에 따라, 이들 펩타이드 및 이들의 약학적으로 허용가능한 유사체는 또한 다른 유형의 당뇨병, 비만, 글루카곤종, 기도의 분비 장애, 대사 장애, 관절염, 골다공증, 중추신경계 질환, 재협착증, 신경 변성 질환, 신부전, 울혈성 심부전, 신증후군, 간경변, 폐부종, 고혈압 및/또는 음식 섭취 감소가 요구되는 장애를 치료하는 데에도 유용할 수 있다.

서열번호 1 내지 3에 따른 천연 GLP-1(1-37) 및 그의 인슐린친화성 천연 유사체는 대사 면에서 불안정하여 생체 내에서 겨우 1 내지 2분의 혈중 반감기를 갖는다. 외부에서 투여된 GLP-1도 급속하게 열화된다. 이 대사 불안정성이 천연 GLP-1 및 그의 천연 단편의 치료능을 한정하였다.

개선된 안정성을 갖는 GLP-1 펩타이드의 합성 유사체가 개발되었다. 예를 들어, 하기 서열번호 4에 따른 펩타이드가 유럽 특허 제 1137667 B1 호에 기재되어 있다:

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR

이 펩타이드는 알파-아미노아이소뷰티르산(약어 Aib로 개략적으로 표시됨)의 비키랄(achiral) 잔기가 8 및 35 위치의 상응하는 천연 아미노산 대신 이들 위치에 나타난다는 것을 제외하고는 천연 GLP-1(7-36)과 유사하다. 비키랄 알파-아미노아이소뷰티르산은 또한 메틸알라닌으로도 알려져 있다. 이 펩타이드는 식 (Aib^8,35)GLP-1(7-36)-NH₂로 지칭될 수 있다.

유럽 특허 제 1137667 호는 고체-상 기법을 이용하여 서열번호 4에 따른 펩타이드 및 그의 유사체를 단일 단편으로서 구축할 수 있다고 기재하고 있다. 유럽 특허 제 1137667 호에서 제안된 이 단일 단편 합성 접근법은 문제가 많다. 한 논쟁점으로서, 이 접근법은 최종 아미노산 커플링, 예를 들어 (Aib⁸ ^,35)GLP-1(7-36)의 경우 히스티딘 커플링에서 높은 수준의 에피머화를 야기할 수 있다. 또한, 크로마토그래피에 의한 정제 동안 불순물을 제거하기 어려울 수 있고, 수율이 너무 낮은 경향이 있을 수 있다. 결과적으로, 이 펩타이드 및 그의 유사체를 상업적으로 허용가능한 수율, 순도 및 양으로 제조할 수 있기 위하여 서열번호 4에 따른 펩타이드를 합성하기 위한 개선된 전략이 필요하다.

이들 우려에 덧붙여, 펩타이드의 대규모 생산을 위한 생성물 회수 및 생성물 순도뿐만 아니라 시약 취급, 저장 및 폐기와 관련된 논쟁점은 펩타이드 합성 반응 의 실행가능성에 크게 영향을 끼칠 수 있다. 그러므로, 개선된 수율로 큰 배치량의 상업적으로 관심을 끄는 펩타이드 물질을 효율적으로 생성시킬 수 있는 펩타이드 합성 방법이 지속적으로 요구되고 있다.

도 1은 본 발명에 따른 합성 반응의 개략적인 도면이다.

단편(12)은 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰(서열번호 6)을 포함하는 펩타이드 단편이다. 단편(14)은 아미노산 서열 T¹¹FTSD¹⁵VX¹⁷ ^-18YL²⁰EG(서열번호 8)를 포함하는 펩타이드 단편이다. 단편(16)은 아미노산 서열 Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵(서열번호 9)를 포함하는 펩타이드 단편이다. 중간체 단편(18)은 아미노산 서열 H⁷X⁸EX¹⁰TFTSD¹⁵VX¹⁷ ^-18YL²⁰EG(서열번호 11)를 포함하는 펩타이드 단편이다. 중간체 펩타이드 단편(20)은 아미노산 서열 Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵R(서열번호 12)을 포함하는 펩타이드이다. 생성물(11)은 목적하는 보호된 펩타이드 H⁷X⁸EX¹⁰TFTSD¹⁵VX¹⁷ ^-18YL²⁰EGQAA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵R(서열번호 13)이며, 여기에서 17 및 18 위치의 Ser-Ser은 여전히 보호된 슈도프롤린 형태이다. 아래에서는 도표를 더욱 상세하게 기재한다.

본 발명은 고체-상 및 용액-상("혼성") 접근법을 이용하여 합성되는 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 이 접근법은 고체-상 화학을 이용하여 3가지 상이한 펩타이드 중간체 단편을 합성함을 포함한다. 이어, 용액-상 화학을 이용하여 추가적인 아미노산 물질을 단편중 하나에 부가한다. 이어, 단편을 고체-상 및 용액-상에서 함께 커플링시킨다. 단편중 하나에 슈도프롤린을 사용하면 그 단편의 고체-상 합성이 용이해지고, 또한 이 단편과 다른 단편의 후속 용액-상 커플링도 용이해진다. 본 발명은 GLP-1, GLP-1(7-36) 및 이들의 천연 및 비-천연 유사체, 특히 GLP-1(7-36) 및 그의 천연 및 비-천연 유사체 같은 인슐린친화성 펩타이드를 생성시키는데 매우 유용하다.

한 양태에서, 본 발명은 a) 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰(서열번호 6)을 포함하는 펩타이드 단편(또는 이 단편은 X⁸ 및 X¹⁰ 잔기를 포함하는 그의 유사체임)을 제조하는 단계; 및 b) 상기 펩타이드 단편을 인슐린친화성 펩타이드 내로 도입시키는 단계를 포함하되, 상기 X⁸ 및 X¹⁰이 각각 비키랄 아미노산의 잔기이고, H, E, X⁸ 및 X¹⁰이 측쇄 보호기를 각각 포함하거나 포함하지 않는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, X⁸은 메틸 알라닌(Aib)에 상응하는 아미노산 잔기이다. X¹⁰은 바람직하게는 글리신에 상응하는 아미노산 잔기이다.

다른 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰(서열번호 6)을 갖는 펩타이드 단편으로서, 상기 X⁸ 및 X¹⁰이 각각 비키랄 아미노산의 잔기이고, H, E, X⁸ 및 X¹⁰이 측쇄 보호기를 각각 포함하거나 포함하지 않는 펩타이드 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, X⁸은 Aib에 상응하는 아미노산 잔기이고, X¹⁰은 글리신에 상응하는 아미노산 잔기이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 아미노산 서열 TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 8)를 포함하는 펩타이드 단편 또는 그의 유사체를 제조하는 단계; 및 b) 상기 펩타이드 단편을 인슐린친화성 펩타이드 내로 도입시키는 단계로서, 여기서 X¹⁷ ^-18이 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기인, 단계를 포함하는 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 8)를 포함하는 펩타이드 또는 그의 유사체로서, 상기 부호 X¹⁷ ^-18로 표시되는 잔기가 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고, 상기 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는 펩타이드 또는 그의 유사체에 관한 것이다.

추가의 양태에서, 본 발명은 a) 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰(서열번호 6)을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을, 아미노산 서열 TFTSDVX^17-18YLEG(서열번호 8)를 포함하는 제 2 펩타이드 단편에 커플링시켜, 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 11)를 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 제공하는 단계; 및 b) 상기 펩타이드 단편을 인슐린친화성 펩타이드 내로 도입시키는 단계를 포함하되, 상기 X⁸ 및 X¹⁰이 각각 비키랄 아미노산의 잔기이고, H 및 E가 측쇄 보호기를 각각 포함하거나 포함하지 않고, X¹⁷ ^-18로 표시되는 잔기가 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 제 1 항에 따른 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵(서열번호 9)를 포함하는 펩타이드 단편 또는 그의 유사체를 제조하는 단계; 및 b) 상기 펩타이드 단편을 인슐린친화성 펩타이드 내로 도입시키는 단계를 포함하되, 상기 X³⁵가 비키랄 아미노산의 잔기이고, 상기 서열의 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계중 하나 이상을 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다:

a) 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰(서열번호 6)을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 여기서 X⁸ 및 X¹⁰이 각각 비키랄 아미노산의 잔기이고, H 및 E가 측쇄 보호기를 각각 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

b) 아미노산 서열 TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 8)를 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 여기서 X¹⁷ ^-18로 표시되는 잔기가 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

c) 제 1 단편을 제 2 단편에 커플링시켜, 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 11)를 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

d) 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵(서열번호 9)를 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 상기 X³⁵가 비키랄 아미노산의 잔기이고, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

e) 제 4 펩타이드 단편을 아르기닌에 커플링시켜 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 12)을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 상기 서열의 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계; 및

f) 상기 제 5 단편을 제 3 단편에 커플링시켜 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 13)을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계로서, 상기 서열의 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계.

바람직하게는, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다:

c) 제 1 단편을 제 2 단편에 커플링시켜 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 11)를 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

d) 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵(서열번호 9)를 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 여기서 X³⁵가 비키랄 아미노산의 잔기이고, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

e) 상기 제 4 펩타이드 단편을 아르기닌에 커플링시켜 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 12)을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 상기 서열의 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계; 및

f) 상기 제 5 단편을 상기 제 3 단편에 커플링시켜 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 13)을 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계로서, 상기 서열의 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 g) 측쇄 보호기를 제거하여 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 5) 및 그의 유사체를 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵가 입체적으로 장애된(sterically hindered) 또는 장애되지 않은 비키랄 아미노산 잔기를 각각 독립적으로 나타내는, 단계를 추가로 포함하는 상기 방법에 관한 것이다.

하나 이상의 산분해 시약(acidolytic reagent) 및 하나 이상의 양이온 소거제를 포함하는 탈보호 용액을 사용함으로써, 측쇄 보호기를 바람직하게 제거한다. 전체적인 탈보호를 위한 산분해 시약은 트라이플루오로아세트산(TFA), HCl, BF₃Et₂O 또는 Me₃SiBr 같은 루이스산, 액체 플루오르화수소산(HF), 브롬화수소(HBr), 트라이플루오로메테인설폰산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 바람직하게 선택된다. 적합한 양이온 소거제는 다이티오트레이톨(DTT), 아니솔, p-크레솔, 에테인다이티올 및 다이메틸 설파이드로부터 바람직하게 선택된다. 탈호보 용액은 물도 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다:

a) 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰(서열번호 6)을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 여기서 X⁸ 및 X¹⁰이 각각 비키랄 아미노산 잔기이고, H, E, X⁸ 및 X¹⁰이 측쇄 보호기를 각각 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

f) 상기 제 5 단편을 상기 제 3 단편에 커플링시켜 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 5)의 인슐린친화성 펩타이드 및 그의 유사체를 제공하는 단계로서, 여기서 X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵가 입체적으로 장애된 또는 장애되지 않은 비키랄 아미노산 잔기를 각각 독립적으로 나타내고, 상기 서열의 아미노산 잔기중 하나 이상이 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계.

아래에 기재되는 본 발명의 실시양태는 총망라하고자 하는 의도가 아니거나, 또는 본 발명을 하기 상세한 설명에 개시되는 정밀한 형태로 한정하고자 하지는 않는다. 그보다는, 실시양태는 당해 분야의 숙련자가 본 발명의 원리 및 실시를 인지하고 이해할 수 있도록 선택 및 기재된다.

본 발명은 고체-상 및/또는 용액-상 기법을 이용하여, 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1), 및 그의 천연 및 비-천연 인슐린친화성 유사체 같은 펩타이드를 제조하는 합성 방법에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드 분자는 보호되거나, 보호되지 않거나 또는 부분적으로 보호될 수 있다. 보호는 N-말단 보호, 측쇄 보호 및/또는 C-말단 보호를 포함할 수 있다. 본 발명은 일반적으로 이들 글루카곤-유사 펩타이드, 이들의 유사체, 단편 및 이들의 유사체, 및 융합 생성물 및 이들의 유사체의 합성에 관한 것이지만, 본원의 발명의 교시내용은 또한 다른 펩타이드, 특히 고체-상 및 용액-상 접근법의 조합을 이용하여 합성되는 다른 펩타이드의 합성에도 적용될 수 있다. 본 발명은 또한 불순물, 특히 피로글루타메이트 불순물이 포함된 펩타이드 중간체 단편의 합성에도 적용될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 바람직한 GLP-1 분자는 천연 및 비-천연 GLP-1(7-36) 및 그의 유사체를 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "아미노산 서열을 포함하는"은 "아미노산 서열을 갖는"을 바람직하게 의미한다.

본원에 사용되는 "유사체"는 펩타이드의 천연 및 비-천연 유사체, 유도체, 융합 화합물, 염 등을 가리킨다. 본원에 사용되는 펩타이드 유사체는 통상 다른 펩타이드 또는 펩타이드 유사체와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 역전 및/또는 부가에 의해서와 같이 변형된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 나타낸다. 치환은 하나 이상의 천연 또는 비-천연 아미노산에 관련될 수 있다. 치환은 바람직하게는 보존성일 수 있거나 또는 매우 보존성일 수 있다. 보존성 치환은 아미노산을 보통 동일한 순전하 및 통상 동일한 크기 및 형상을 갖는 다른 아미노산으로 치환함을 말한다. 예를 들어, 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산은 측쇄의 탄소 및 헤테로원자의 총수가 약 4개 이하로 상이한 경우 대략 동일한 크기를 갖는다. 이들은 측쇄의 분지의 수가 약 1 또는 2개 이하로 상이한 경우 대략 동일한 형상을 갖는다. 측쇄에 페닐 또는 치환된 페닐기를 갖는 아미노산은 대략 동일한 크기 및 형상을 갖는 것으로 생각된다. 아래에 나열된 것은 5가지 아미노산 군이다. 화합물의 아미노산을 동일한 군으로부터의 다른 아미노산으로 대체하면 통상 보존성 치환이 야기된다.

군 I: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌 및 C₁-C₄ 지방족 또는 C₁-C₄ 하이드록실 치환된 지방족 측쇄(직쇄 또는 하나의 분지를 가짐)를 갖는 비-천연 발생 아미노산.

군 II: 글루탐산, 아스파르트산 및 카복실산 치환된 C₁-C₄ 지방족 측쇄(분지되지 않거나 또는 하나의 분지점을 가짐)를 갖는 비-천연 발생 아미노산.

군 III: 리신, 오르니틴, 아르기닌 및 아민 또는 구아니디노 치환된 C₁-C₄ 지방족 측쇄(분지되지 않거나 또는 하나의 분지점을 가짐)를 갖는 비-천연 발생 아미노산.

군 IV: 글루타민, 아스파라긴 및 아마이드 치환된 C₁-C₄ 지방족 측쇄(분지되지 않거나 또는 하나의 분지점을 가짐)를 갖는 비-천연 발생 아미노산.

군 V: 페닐알라닌, 페닐글리신, 티로신 및 트립토판.

본원에 사용되는 용어 "유사체"는 펩타이드의 염, 또는 C-말단에서 아마이드화된 그의 유도체를 더욱 바람직하게 나타낸다.

"매우 보존성인 치환"은 아미노산을 측쇄에 동일한 작용기를 갖고 거의 동일한 크기 및 형상을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이다. 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산은 이들의 측쇄의 탄소 및 헤테로원자의 총수가 2개 이하로 상이한 경우 거의 동일한 크기를 갖는다. 이들은 측쇄에 동일한 수의 분지를 갖는 경우에 거의 동일한 형상을 갖는다. 매우 보존성인 치환의 예는 류신에 대해 발린, 세린에 대해 트레오닌, 글루탐산에 대해 아스파르트산, 페닐알라닌에 대해 페닐글리신을 포함한다.

"펩타이드 유도체"는 일반적으로 펩타이드, 펩타이드 유사체, 또는 그의 측기, 알파 탄소 원자, 말단 아미노기, 및/또는 말단 카복실산기중 하나 이상이 화학적으로 개질된 다른 펩타이드 유사체를 말한다. 예를 들어, 화학적 개질은 화학적 잔기의 부가, 새로운 결합 형성 및/또는 화학적 잔기 제거를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 아미노산 측기에서의 개질은 리신 e-아미노기의 아실화, 아르기닌, 히스티딘 또는 리신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산 카복실산기의 알킬화 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아마이드화를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다. 말단 아미노기의 개질은 데스-아미노, N-저급 알킬, N-다이-저급 알킬 및 N-아실(예컨대, -CO-저급 알킬) 개질을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 말단 카복실기의 개질은 아마이드, 저급 알킬 아마이드, 다이알킬 아마이드 및 저급 알킬 에스터 개질을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다. 바람직한 유도체는 말단 카복시기에서 아마이드화된 유도체, 예를 들어 펩타이드의 아마이드, 저급 알킬 아마이드 또는 다이알킬 아마이드이다. 그러므로, 부분적으로 또는 완전히 보호된 펩타이드는 펩타이드 유도체를 구성한다.

본 발명을 실시함에 있어서, 화합물이 호르몬 인슐린의 합성 또는 발현을 촉진시키거나 또는 촉진을 야기하거나 또는 촉진을 야기하는데 도움이 될 수 있다면, 이 화합물은 "인슐린친화성" 활성을 갖는다. 바람직한 실시 방식에 있어서, 인슐린친화성은 미국 특허 제 6,887,849 호 및 제 6,703,365 호에 기재되어 있는 검정에 따라 입증될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 갖는 합성 (X⁸, X¹⁰, X³⁵)GLP-1(7-36) 펩타이드 및 그의 유사체를 합성하는 방법을 제공한다:

HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 5)

여기서, X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵는 입체적으로 장애된 또는 장애되지 않은 비키랄 아미노산 잔기를 각각 독립적으로 나타낸다.

X⁸, X¹⁰ 및/또는 X³⁵ 잔기중 임의의 것은 측쇄 보호기(들)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 상기 서열에 따른 펩타이드는 적어도 입체적으로 장애된 또는 장애되지 않은 비키랄 X⁸ 및 X³⁵ 잔기가 천연 아미노산 잔기의 8 및 35 위치에 치환된다는 점에서 천연 GLP-1(7-36)과는 상이하다. X¹⁰ 잔기는 천연 비키랄 글리신 또는 다른 비키랄 아미노산으로부터 유래될 수 있다. 비키랄 X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵ 아미노산의 사용은 생성되는 펩타이드를 안정화시키는데 도움이 될 뿐만 아니라, 최근 구성 블록으로서 이들 아미노산의 사용이 또한 도 1에 도시되고 아래에서 추가로 기재되는 본 발명의 용이한 합성 경로를 촉진시키는 것으로도 밝혀졌다.

본 발명의 원리에 따라 합성될 수 있는 (X⁸, X¹⁰, X³⁵)GLP-11(7-36) 펩타이드의 특히 바람직한 실시양태는 하기 아미노산 서열의 펩타이드식(서열번호 4) 및 바람직하게는 C-말단에서 아마이드화된 그의 유사체를 포함한다:

HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR

이 펩타이드는 X⁸ 및 X³⁵로서 알파-아미노아이소뷰티르산(또는 메틸알라닌, 약어 Aib로 개략적으로 도시됨)의 비키랄 잔기를 사용하고, 바람직하게는 C-말단에 아마이드를 가지며, 10 위치에 천연 G의 잔기를 사용하고, 식 (Aib⁸ ^,35)GLP-1(7-36)-NH₂로 표시될 수 있다. 이 표기는 천연 알라닌 대신 8 및 35 위치에 아미노산 "Aib"에 상응하는 아미노산 잔기가 존재함을 나타낸다. 비키랄 알파-아미노아이소뷰티르산은 또한 메틸알라닌으로도 알려져 있다. 서열번호 4에 따른 펩타이드는 유럽 특허 제 1137667 B1 호에 기재되어 있다. 8 및 35 위치에 Aib 잔기가 존재하면 체내에서의 대사 열화가 느려져서, 이 펩타이드가 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드보다 체내에서 훨씬 더 안정해진다.

본 발명은 (Aib⁸ ^,35)GLP-1(7-36)-NH₂ 같은 GLP-1(7-36) 펩타이드를 제조하는 개선된 방법을 제공한다. 예로서, 도 1은 GLP-1(7-36) 펩타이드 및 이들의 유사체를 합성하는 하나의 예시적인 반응(10)을 개략적으로 도시한다. 도 1의 반응(10)은 GLP-1(7-36) 펩타이드의 규모가 커진 합성에 특히 적합한 것으로 생각된다. 전형적으로는 상업적인 분배에 유용한 양의 펩타이드를 제공하기 위하여 규모가 커진 절차를 수행한다. 예를 들어, 규모가 커진 절차에서 펩타이드의 양은 배치당 500g 또는 1kg, 더욱 전형적으로는 배치당 수십kg 내지 수백kg 이상일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 가공(합성) 시간의 감소, 생성물 수율의 개선, 생성물 순도의 개선 및/또는 요구되는 시약 및 출발물질의 양 감소 같은 개선을 제공할 수 있다.

도 1에 도시된 합성 반응(10)은 고체-상 및 용액-상 기법의 조합을 이용하여 펩타이드 생성물(11)을 제조한다.

도 1에 도시된 바와 같이, 반응(10)은 고체-상에서 펩타이드 중간체 단편(12, 14, 16)을 합성함을 포함한다. 단편(12)은 하기 서열번호 6에 따른 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편이거나, 또는 X⁸ 및 X¹⁰ 잔기를 포함하는 그의 유사체이다:

HX⁸EX¹⁰

여기서, X⁸ 및 X¹⁰은 상기 정의된 바와 같다.

아미노산 잔기중 하나 이상은 통상적인 관행에 따라 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 단편(12)은 C-말단을 통해 수지 결합될 수 있다. 이 단편은 N-말단 및/또는 C-말단 보호기를 갖거나 갖지 않을 수 있다. Fmoc는 펩타이드 단편의 고체-상 합성과 관련하여 특히 유용한 N-말단 보호기인 것으로 밝혀졌다.

단편(12)은 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 7 내지 10 위치의 아미노산에 상응하는 4개의 아미노산 잔기를 포함하고, 따라서 (X⁸, X¹⁰)GLP-1(7-10)이라는 표기로 표시될 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 하기 서열번호 7에 따라 X⁸은 Aib이고, X¹⁰은 글리신이거나, 또는 그의 유사체는 10 위치에 Aib 잔기를 포함한다:

H⁷AibEG¹⁰

서열번호 7에 따른 펩타이드 단편은 (Aib⁸)GLP-1(7-10)이라는 표기에 의해 표시되어, 천연 GLP-1(7-10)의 8 위치에서 천연 알라닌이 Aib로 치환됨을 나타낼 수 있다.

고체-상 합성은 통상 단편(12)의 C-말단으로부터 N-말단으로의 방향으로 수행된다. 그러므로, 단편의 C-말단부에 존재하는 X¹⁰ 아미노산은 고체-상 수지 지지체에 연결되는 첫번째 아미노산 잔기이다. 이어, 목적하는 서열에 상응하는 방식으로 아미노산 잔기를 연속적으로 부가함으로써 고체-상 합성을 진행시킨다. N-말단 잔기(예컨대, N-말단 히스티딘 잔기(H))가 발생되는 펩타이드 쇄에 부가된 후 펩타이드 중간체 단편의 합성이 종결된다.

서열번호 6 및 7에 따른 펩타이드 단편의 선택 및 사용은 반응(10)에서 상당한 이점을 제공한다. 첫번째로, H는 적어도 부분적으로 에피머화 문제로 인해 아미노산 잔기를 성장하는 펩타이드 쇄에 부가하기가 어려운 경향이 있다. 그러나, 단편(12)은 이러한 우려를 크게 경감시키기에 충분히 작다. 또한, 단편(12)은 2개의 키랄 중심을 가지기에 충분히 길다. 따라서, 간단히 결정화시킴으로써 단편을 정제시킬 수 있다. 단편(12)이 Aib에서 종결되면, 단편은 하나의 키랄 중심만을 갖게 되고, 그 결과 라세미체를 정제시키기가 더욱 어렵다. 비키랄 G를 C-말단에 위치시키면, 단편(12)이 C-말단에서 키랄 E로 종결되는 경우 우려가 될 수 있는 라세미화 우려를 피하게 된다. 간단히, 단편(12)을 펩타이드 구성 블록으로서 선택하면 단편을 구축하고 정제하며 이를 다른 펩타이드 물질에 커플링시키기가 더욱 용이해진다. 단편 선택은 또한 H의 낮은 라세미화를 야기한다. 놀랍게도, H는 매우 낮은 에피머화 수준으로, 예를 들어 일부 실시 방식에서 약 3중량%로 이 단편에 부가된다.

단편(14)은 하기 서열번호 8에 따른 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편이거나, 또는 17 및 18 위치에 X¹⁷ ^-18을 포함하는 그의 유사체이다:

T¹¹FTSD¹⁵VX¹⁷ ^-18YL²⁰EG

여기서, X¹⁷ ^-18로 표시되는 잔기는 아래에서 추가로 정의되는 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이다. 단편(14)은 통상 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 상응하는 17 및 18 위치를 점유하는 SS(Ser-Ser) 잔기 대신 슈도프롤린 다이펩타이드 잔기 X¹⁷ ^-18을 사용함을 제외하고는 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 11 내지 22 위치에 있는 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다.

단편(14)의 아미노산 잔기중 하나 이상은 통상적인 관행에 따라 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 단편(14)은 C-말단을 통해 수지 결합될 수 있다. 이 단편은 N-말단 및/또는 C-말단 보호기를 갖거나 갖지 않을 수 있다. Fmoc는 펩타이드 단편의 고체-상 합성과 관련하여 특히 유용한 N-말단 보호기인 것으로 밝혀졌다. 서열번호 8에 따른 펩타이드 단편은 표기 (X^17-18)GLP-1(11-22)로 표시되어, 17 및 18 위치의 Ser-Ser 잔기가 X^17-18 슈도프롤린 잔기로 치환됨을 나타낼 수 있다.

본 발명의 실시에 사용되는 용어 슈도프롤린은 하이드록실 작용성 측쇄가 알파-아미노와 측쇄 하이드록실 사이에서 프롤린-유사, TFA 불안정성 옥사졸리딘 고리로서 보호되는 Ser 또는 Thr 같은 하이드록실 작용성 아미노산의 잔기를 포함하는 다이펩타이드를 일컫는다. 옥사졸리딘 고리의 결과, 다이펩타이드는 가역적인 프롤린 모방체(mimetic)로서 기능한다.

일반적으로, 펩타이드 내로 도입되는 전형적인 슈도프롤린 잔기는 하기 화학식 I로 표시될 수 있다:

상기 식에서,

φ는 임의의 아미노산의 잔기를 나타내고,

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 적합한 2가 연결 부분(moiety)이다.

흔히, R¹은 하기 화학식 II로 표시되는 2가 부분이다:

상기 식에서, R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 H 또는 저급 알킬(예: 메틸) 같은 1가 잔기이다.

R³ 및 R⁴는 또한 고리 구조체의 공동-일원일 수도 있다. 바람직하게는, R³ 및 R⁴는 각각 메틸이다. 옥사졸리디닌 고리-보호된 Ser의 경우에는 R²가 2가 잔기인 CH₂인 반면, Thr의 경우에는 R²가 2가 잔기인 (CH₃)CH이다.

용어 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 1가 알킬 라디칼을 가리킨다. 이 용어는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, s-뷰틸, 아이소뷰틸, 3급-뷰틸, n-펜틸, 3-메틸뷰틸, n-헥실, 2-에틸뷰틸 등과 같은 라디칼로 추가로 예시된다. 바람직한 저급 알킬 잔기는 메틸 및 에틸이고, 메틸이 특히 바람직하다.

탈보호 동안, R¹ 잔기가 절단되어 하기 화학식 III에 따른 다이펩타이드 잔기를 제공한다:

상기 식에서,

φ 및 R²는 상기 정의된 바와 같다.

단편(14)에 적용될 때, 슈도프롤린 잔기는 바람직하게는 C-말단에 더욱 근접한 Ser이 옥사졸리딘 고리로 보호되는 Ser-Ser 잔기에 상응하고, 하기 화학식 IV의 구조를 갖는다:

N-말단에 더 가까운 Ser의 하이드록실-함유 측쇄는 3급-뷰틸 보호기에 의해서와 같이 보호된다. 보호하는 옥사졸리딘 고리 구조체 및 3급-뷰틸이 절단될 때, Ser-Ser 잔기가 생성된다.

단편(14)의 합성시 구성 블록으로서 이러한 프롤린 모방체를 사용하면 본 발명과 관련하여 상당한 이점을 제공한다. 첫째, 단편(14)의 고체-상 합성이 엄청나게 용이해진다. 단편(14)의 고체-상 합성 과정에 슈도프롤린이 사용되지 않는 경우에는, 잔기(11)를 통해 잔기(13)로부터 Fmoc를 제거하는데 상당한 문제가 있을 수 있다. 이러한 어려움은 베타 시트 형성에 기인할 수 있는 것으로 생각된다. 슈도프롤린의 사용은 베타 시트 형성 정도의 감소에 의해(생각되는 바에 따르면) 이러한 Fmoc 제거를 훨씬 더 용이하게 만든다. 둘째, 단편(14)을 단편(12)에 후속 고체-상 커플링시켜 아래 기재되는 단편(18)을 생성시키기가 훨씬 용이해진다. 슈도프롤린 잔기의 부재시에는, 전형적인 용액-상 커플링 용매중에서의 단편(18)의 용해도가 매우 불량하다. 슈도프롤린은 단편(18)의 용해도 특성을 향상시켜, 이 단편이 관련된 단편(20)으로의 용액-상 커플링을 용이하게 한다(아래 도 1에 대한 논의 참조).

고체-상 합성은 통상 단편(14)의 C-말단으로부터 N-말단으로의 방향으로 수행된다. 따라서, 단편의 C-말단부에 존재하는 G 아미노산이 고체-상 수지 지지체에 커플링되는 첫번째 아미노산 잔기이다. 이어, 목적하는 서열에 상응하는 방식으로 아미노산 잔기를 연속적으로 부가함으로써 고체-상 합성을 진행시킨다. 그러나, 17 및 18 위치에 한 쌍의 천연 Ser 잔기를 연속적으로 부가하는 대신에, GLP-1(7-36)의 17 및 18 위치에 상응하는 위치에서 X^17-18 슈도프롤린 다이펩타이드를 성장하는 쇄에 부가한다. N-말단 잔기(예컨대, N-말단 트레오닌 잔기(T))가 발생되는 펩타이드 쇄에 부가된 후 펩타이드 중간체 단편의 합성이 종결된다.

단편(16)은 하기 서열번호 9에 따른 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편 또는 그의 유사체이거나, 또는 X³⁵를 포함하는 그의 유사체이다:

Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵

여기서, X³⁵는 상기 정의된 바와 같다.

아미노산 잔기중 하나 이상은 통상적인 실시에 따른 측쇄 보호기를 포함할 수 있다. 단편(16)은 X³⁵가 위치 35의 천연 아미노산 대신 그 위치에 존재함을 제외하고는 천연 GLP-1(7-36) 펩타이드의 23 내지 35 위치에 있는 아미노산에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다. 단편(16)은 표기 (X³⁵)GLP-1(23-35)로 표시될 수 있다.

일부 실시양태에서, 펩타이드 단편(16)은 C-말단을 통해 수지 결합될 수 있다. 이 단편은 측쇄, N-말단 및/또는 C-말단 보호기를 갖거나 갖지 않을 수 있다. Fmoc는 펩타이드 단편의 고체-상 합성과 관련하여 특히 유용한 N-말단 보호기인 것으로 밝혀졌다.

바람직한 실시양태에서, X³⁵는 하기 서열번호 10 또는 35 위치에 Aib를 포함하는 그의 유사체에 따라 Aib이다:

Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKAib³⁵

서열번호 10에 따른 펩타이드 단편은 표기 (Aib³⁵)GLP-1(23-35)로 표시되어, 천연 GLP-1(7-36)의 35 위치에 있는 천연 아미노산이 Aib로 치환됨을 나타낼 수 있다.

서열번호 9 및 10에 따른 단편(16)이 C 말단의 36 위치에 R(arg) 잔기를 아직 포함하지 않음에 주목한다. 바람직하게는 측쇄 보호 없이 Arg를 사용하여 용액-상에서 단편(16)의 C 말단에 Arg를 후속 커플링시킨다. 이 전략은 도 1의 반 응(10)에서 상당한 이점을 제공하는데, 왜냐하면 이로 인해 보호된 Arg를 사용한 결과 생기는 경향이 있는 바람직하지 못한 부반응이 피해지기 때문이다. 예를 들어, 보호된 Arg의 탈보호시에는, 탈보호의 부산물이 펩타이드의 다른 성분, 예컨대 트립토판과 반응하는 경향이 있을 수 있다. 이로 인해, 조질 물질중 정제에 이용될 수 있는 목적하는 펩타이드의 양이 감소된다.

고체-상 합성은 통상 단편(16)의 C-말단으로부터 N-말단으로의 방향으로 수행된다. 따라서, 단편의 C-말단부에 존재하는 X³⁵ 아미노산이 고체-상 수지 지지체에 커플링되는 첫번째 아미노산 잔기이다. 이어, 목적하는 서열에 상응하는 방식으로 아미노산 잔기를 연속적으로 부가함으로써 고체-상 합성을 진행시킨다. N-말단 잔기(예컨대, N-말단 글루타민 잔기(Q))가 발생되는 펩타이드 쇄에 부가된 후 펩타이드 중간체 단편의 합성이 종결된다. 단편(16)의 합성에 사용되는 임의의 아미노산은 통상적인 관행에 따라 측쇄 보호기를 포함할 수 있다.

X³⁵-로딩된(loaded) 지지체 수지에 근접한 입체 장애로 인해, 리신(34) 및 발린(33)의 성장하는 펩타이드 쇄로의 커플링이 문제가 될 수 있다. 과량의 아미노산을 사용하는 경우에라도, 이들 커플링 반응은 완결되기가 어렵다. 용매 선택 및/또는 말단-캡핑이 이 문제를 경감시키는데 도움이 될 수 있다. 커플링 용매의 특성이 커플링이 완결되는 정도에 영향을 줄 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 한 세트의 실험에서 3:1 NMP/DCM, 1:1 NMP/DCM, 1:1 DMF/DCM 및 3:1 DMF/DCM 중에서 커플링 반응을 수행하였다. 이들 용매 조합의 비는 부피 기준이다. NMP는 N-메틸피롤리돈을 나타내고, DCM은 다이클로로메테인을 나타내며, DMF는 다이메틸폼아마이드를 나타낸다. 1:1 DMF/DCM을 사용하는 경우에 커플링 반응이 완결을 위해 더 진행된 것으로 밝혀졌다.

각각의 리신 및 발린 커플링 후의 말단-캡핑을 이용하여서도 추가적인 커프링 반응에서 미반응 수지-지지된 물질이 생기는 것을 방지할 수 있다. 말단-캡핑된 물질은 필요한 경우 정제동안 더욱 용이하게 제거된다. 통상적인 말단-캡핑 기법을 이용할 수 있다.

계속 도 1을 보면, Arg와 함께 단편(12, 14, 16)을 조합하여 목적하는 펩타이드(11)를 완성시킨다. 이를 달성하기 위하여, 고체-상에서 단편(12)을 단편(14)에 부가하여, 하기 서열번호 11에 따른 아미노산 잔기를 도입시키는 더 큰 중간체 단편(18)을 생성시킨다:

H⁷X⁸EX¹⁰TFTSD¹⁵VX¹⁷ ^-18YL²⁰EG

여기서, X⁸, X¹⁰ 및 X^17-18은 상기 정의된 바와 같다.

바람직한 실시양태에서, X⁸은 Aib이고, X¹⁰은 천연 G이며, X¹⁷ ^-18은 상기 정의된 바와 같은 슈도프롤린 다이펩타이드 잔기이다. 이 중간체 펩타이드 단편은 표기(X⁸, X¹⁰, X¹⁷ ^-18)GLP-1(7-22)로 표시될 수 있다.

도 1은 용액-상에서 Arg가 단편(16)의 C-말단에 부가되어 하기 서열번호 12에 따른 아미노산 잔기를 도입시키는 더 큰 중간체 펩타이드 단편(20)을 생성시킴 을 추가로 보여준다:

Q²³AA²⁵KEFIA³⁰WLVKX³⁵R

여기서, X³⁵는 상기 정의된 바와 같고, 바람직하게는 Aib이다.

바람직하게는, 이러한 방식으로 펩타이드 단편에 부가되는 Arg는 측쇄 보호기를 포함하지 않는다. 이 중간체 펩타이드 단편(20)은 표기 (X³⁵)GLP-1(23-36)으로 표시될 수 있다. 이어, 펩타이드 단편(18, 20)을 용액-상에서 커플링시켜, 17 및 18 위치의 Ser-Ser이 여전히 보호된 슈도프롤린 형태로 존재하는 하기 서열번호 13에 따른 목적하는 보호된 펩타이드(11)를 생성시킨다:

H⁷X⁸EX¹⁰TFTSD¹⁵VX^17-18YL²⁰EGQAA²⁵KEFIA²⁰WLVKX³⁵R

펩타이드(11)는 표기 (X⁸, X¹⁰, X¹⁷ ^-18, X³⁵)GLP-1(7-36)에 의해 표시될 수 있다. 다른 아미노산이 측쇄 보호기를 갖는 한도까지는 이 보호기가 이 단계를 통해 바람직하게 유지된다.

도 1의 반응을 수행함에 있어서는, 당해 분야에 공지되어 있는 표준 방법에 의해 고체-상 및 용액-상 합성을 수행할 수 있다. 대표적인 실시 방식에서는, 아미노산이 C-말단으로부터 N-말단으로 부가되는 화학적 수단을 이용하여 고체-상에서 펩타이드를 합성한다. 따라서, 특정 단편의 C-말단에 근접한 아미노산 또는 펩타이드기가 먼저 수지에 부가되어야 한다. 아미노산 또는 펩타이드기의 C-말단 작용기를 수지 지지체상의 상보적인 작용기와 반응시킴으로써 이를 수행한다. 아미 노산 또는 펩타이드기의 N-말단부를 마스킹하여 바람직하지 못한 부반응을 방지한다. 아미노산 또는 펩타이드기는 바람직하게는 또한 측쇄 보호기도 포함한다. 이어, 관심 있는 펩타이드가 생성될 때까지 연속적인 아미노산 또는 펩타이드기를 지지체-결합된 펩타이드 물질에 부착시킨다. 이들중 대부분은 또한 통상적인 관행에 따라 측쇄 보호기를 포함한다. 각각의 연속적인 커플링시, 수지 결합된 펩타이드 물질의 N-말단에 있는 마스킹기를 제거한다. 이어, 이를 N-말단이 마스킹된 다음 아미노산의 C-말단과 반응시킨다. 따라서, 고체-상 합성의 생성물은 수지 지지체에 결합된 펩타이드이다.

고체-상 펩타이드 합성을 실시하는데 적합한 임의의 유형의 지지체를 사용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 지지체는 폴리아마이드, 폴리설파마이드, 치환된 폴리에틸렌, 폴리에틸렌글라이콜, 페놀 수지, 폴리사카라이드, 또는 폴리스타이렌 같은 하나 이상의 중합체, 중합체의 공중합체 또는 조합으로부터 제조될 수 있는 수지를 포함한다. 중합체 지지체는 또한 펩타이드 합성에 사용되는 용매에 충분히 불용성이고 불활성인 임의의 고체일 수 있다. 고체 지지체는 전형적으로 성장하는 펩타이드가 합성동안 이에 커플링되고 목적하는 조건하에서 절단되어 지지체로부터 펩타이드를 방출할 수 있는 연결 잔기를 포함한다. 적합한 고체 지지체는 광-절단성, TFA-절단성, HF-절단성, 플루오라이드 이온-절단성, 환원-절단성; Pd(O)-절단성; 친핵성-절단성; 또는 라디칼-절단성인 연결기를 가질 수 있다. 바람직한 연결 잔기는 절단된 펩타이드의 측쇄 기가 여전히 실질적으로 전체적으로 보호되도록 하는 조건하에서 절단될 수 있다.

하나의 바람직한 합성 방법에서는, 트리틸기를 포함하는 산 감수성 고체 지지체 상에서, 더욱 바람직하게는 펜던트 염소 기를 갖는 트리틸기를 포함하는 수지, 예를 들어 2-클로로트리틸 클로라이드(2-CTC) 수지[발로스(Barlos) 등 (1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946] 상에서 펩타이드 중간체 단편을 합성한다. 예는 또한 트리틸 클로라이드 수지, 2-메틸트리틸 클로라이드 수지, 4-메톡시트리틸 클로라이드 수지, 4-아미노뷰탄-1-올 2-클로로트리틸 수지, 4-아미노메틸벤조일 2-클로로트리틸 수지, 3-아미노프로판-1-올 2-클로로트리틸 수지, 브로모아세트산 2-클로로트리틸 수지, 사이아노아세트산 2-클로로트리틸 수지, 4-사이아노벤조산 2-클로로트리틸 수지, 글리시놀 2-클로로트리틸 수지, 프로피오닉 2-클로로트리틸 수지, 에틸렌글라이콜 2-클로로트리틸 수지, N-Fmoc 하이드록실아민 2-클로로트리틸 수지, 하이드라진 2-클로로트리틸 수지를 포함한다. 몇몇 바람직한 고체 지지체는 다이비닐벤젠과 공중합되어 반응성 기가 고정되는 지지체 물질을 생성시킬 수 있는 폴리스타이렌을 포함한다.

고체-상 합성에 사용되는 다른 수지는 4-하이드록시메틸페닐-옥시메틸 고정기를 갖는 스타이렌과 다이비닐벤젠의 공중합체를 포함하는 "왕(Wang)" 수지[왕(Wang, S.S.), 1973, J. Am. Chem. Soc]; 및 4-하이드록시-메틸-3-메톡시페녹시뷰티르산 수지[리히터(Richter) 등 (1994), Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706]를 포함한다. 왕 수지, 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 및 4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시뷰티르산 수지는 예를 들어 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 칼바이오켐-노바바이오켐 코포레이션(Calbiochem-Novabiochem Corp.)에서 구입할 수 있다.

고체-상 합성용 수지를 제조하기 위하여, 수지를 적합한 용매(들) 중에서 선-세척할 수 있다. 예를 들어, 2-CTC 수지 같은 고체-상 수지를 펩타이드 챔버에 첨가하고 적합한 용매로 선-세척한다. 커플링 반응에 사용되는 용매(또는 용매의 혼합물)의 유형에 기초하여 선-세척 용매를 선택할 수 있거나, 또는 그 역으로 한다. 세척, 및 후속 커플링 반응에 적합한 용매는 다이클로로메테인(DCM), 다이클로로에테인(DCE), 다이메틸폼아마이드(DMF) 등, 및 이들 시약의 혼합물을 포함한다. 다른 유용한 용매는 DMSO, 피리딘, 클로로폼, 다이옥세인, 테트라하이드로퓨란, 에틸 아세테이트, N-메틸피롤리돈 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 경우에는, 부피비 9:1 내지 1:9, 더욱 통상적으로는 4:1 내지 1:4의 DMF와 DCM의 혼합물 같은 2원 용매 시스템에서 커플링을 수행할 수 있다.

달리 표시되지 않는 한 적절한 보호기의 존재하에서 본 발명의 합성을 바람직하게 수행한다. 보호기의 특성 및 용도는 당해 분야에 널리 알려져 있다. 일반적으로, 적합한 보호기는 그가 부착되는 원자 또는 잔기, 예를 들어 산소 또는 질소가 가공 및 합성 동안 바람직하지 못한 반응에 참여하지 못하도록 방지하는데 도움을 줄 수 있는 임의의 종류의 기이다. 보호기는 측쇄 보호기 및 아미노- 또는 N-말단 보호기를 포함한다. 보호기는 또한 카복실산, 티올 등의 반응 또는 결합도 방지할 수 있다.

측쇄 보호기는 측쇄의 일부가 펩타이드 합성, 가공 등의 단계에 사용되는 화학약품과 반응하지 못하도록 방지하는데 도움을 주는, 아미노산의 측쇄(즉, 일반적 인 아미노산의 화학식 H₂N-C(R)(H)-COOH에서 R 기)에 연결된 화학적 잔기를 일컫는다. 측쇄-보호기의 선택은 다양한 인자, 예를 들어 수행되는 합성의 유형, 펩타이드에 가해지는 가공, 목적하는 중간체 생성물 또는 최종 생성물에 따라 달라질 수 있다. 측쇄 보호기의 특성은 또한 아미노산 자체의 특성에 따라 달라진다. 일반적으로는, 고체-상 합성시 α-아미노기의 탈보호 동안 제거되지 않는 측쇄 보호기가 선택된다. 따라서, α-아미노 보호기와 측쇄 보호기는 전형적으로 동일하지 않다.

일부 경우, 또한 고체-상 합성 및 다른 펩타이드 가공에 사용되는 시약의 유형에 따라, 아미노산은 측쇄 보호기의 존재를 필요로 하지 않을 수 있다. 일부 아미노산은 전형적으로 측쇄에 반응성 산소, 질소 또는 다른 반응성 잔기를 포함하지 않는다.

측쇄 보호기의 예는 아세틸(Ac), 벤조일(Bz), 3급-뷰틸, 트라이페닐메틸(트리틸), 테트라하이드로피란일, 벤질 에터(Bzl) 및 2,6-다이클로로벤질(DCB), 3급-뷰톡시카본일(Boc), 나이트로, p-톨루엔설폰일(Tos), 아다만틸옥시카본일, 잔틸(Xan), 벤질, 2,6-다이클로로벤질, 메틸, 에틸 및 3급-뷰틸 에스터, 벤질옥시카본일(Z), 2-클로로벤질옥시카본일(2-Cl-Z), 3급-아밀옥시카본일(Aoc), 및 방향족 또는 지방족 우레탄-형 보호기, 나이트로 베라트릴 옥시카본일(NVOC) 같은 광분해성 기; 및 트라이메틸실릴 옥시카본일(TEOC) 같은 플루오라이드 분해성 기를 포함한다.

본 발명을 실시함에 있어서 GLP-1 펩타이드를 합성하는데 통상적으로 사용되는 아미노산에 바람직한 측쇄 보호기가 하기 표 A에 기재된다.

아미노산	측쇄 보호기(들)
Aib	없음
Ala	없음
Arg	없음
Asp	3급-뷰틸 에스터(OtBu)
Gln	트리틸(trt)
Glu	OtBu
Gly	없음
His	트리틸(trt)
Ile	없음
Leu	없음
Lys	3급-뷰틸옥시카본일(Boc)
Phe	없음
Ser	3급-뷰틸(tBu)
X¹⁷ ^-18(Ser-Ser에 상응함)	C-말단에 더 가까운 Ser의 알파 질소와 OH 사이의 옥사졸리딘 고리; 다른 Ser 상의 tBu
Thr	tBu
Trp	Boc
Tyr	tBu
Val	없음

아미노-말단 보호기는 아미노산의 알파 아미노기에 연결되는 화학적 잔기를 포함한다. 전형적으로, 아미노-말단 보호기는 성장하는 펩타이드 쇄에 부가되어야 하는 다음 아미노산의 부가 전에 탈보호 반응에서 제거되지만, 펩타이드가 지지체로부터 절단될 때에는 유지될 수 있다. 아미노 말단 보호기의 선택은 다양한 인자, 예컨대 수행되는 합성의 유형 및 목적하는 중간체 생성물 또는 최종 생성물에 따라 달라질 수 있다.

아미노-말단 보호기의 예는 (1) 폼일, 아크릴릴(Acr), 벤조일(Bz) 및 아세틸(Ac) 같은 아실-형 보호기; (2) 벤질옥시카본일(Z) 및 치환된 Z(예컨대, p-클로로벤질옥시카본일, p-나이트로벤질옥시카본일, p-브로모벤질옥시카본일, p-메톡시벤질옥시카본일) 같은 방향족 우레탄-형 보호기; (3) 3급-뷰틸옥시카본일(Boc), 다이아이소프로필메톡시카본일, 아이소프로필옥시카본일, 에톡시카본일, 알릴옥시카본일 같은 지방족 우레탄 보호기; (4) 9-플루오렌일-메틸옥시카본일(Fmoc), 사이클로펜틸옥시카본일, 아다만틸옥시카본일 및 사이클로헥실옥시카본일 같은 사이클로알킬 우레탄-형 보호기; 및 (5) 페닐티오카본일 같은 티오우레탄-형 보호기를 포함한다. 바람직한 보호기는 9-플루오렌일-메틸옥시카본일(Fmoc), 2-(4-바이페닐릴)-프로필(2)옥시카본일(Bpoc), 2-페닐프로필(2)-옥시카본일(Poc) 및 3급-뷰틸옥시카본일(Boc)을 포함한다.

Fmoc 또는 Fmoc-유사 화학적 수단이 고체-상 펩타이드 합성에 매우 바람직한데, 보호된 상태의 생성된 펩타이드의 절단이 약산성 절단제를 사용하여 수행하기에 비교적 간단하기 때문이다. 이러한 종류의 절단 반응은 생성되는 부산물, 불순물 등의 면에서 비교적 깨끗하여, 팽윤 및 수축 세척으로부터 펩타이드를 대규모로 회수하기가 기술적으로나 경제적으로 용이해지는 바, 수율이 향상된다. 본원에 사용되는, 펩타이드 합성과 관련된 "대규모"는 통상 배치당 500g 이상, 더욱 바람직하게는 배치당 2kg 이상의 펩타이드 합성을 포함한다. 대규모 합성은 전형적으로 수지, 용매, 아미노산, 커플링 및 탈보호 반응용 화학약품 같은 시약을, kg 내지 톤 범위의 펩타이드를 생성시킬 수 있도록 하는 크기의 양으로 수용할 수 있는 강 반응 용기 같은 큰 반응 용기에서 수행된다.

또한, Fmoc 보호기는 측쇄 보호기에 대해 펩타이드로부터 선택적으로 절단되어, Fmoc가 절단될 때 측쇄 보호기가 제 자리에 유지되도록 할 수 있다. 이러한 종류의 선택성은 측쇄 반응을 최소화하기 위하여 아미노산 커플링 동안 중요하다. 또한, 측쇄 보호기는 Fmoc에 대해 선택적으로 절단되어 제거될 수 있어서, Fmoc를 제 자리에 남길 수 있다. 아래에 더 기재되는 정제 반응 동안 이 후자의 선택성에 매우 유리하게 의존한다.

커플링 반응을 향상 또는 개선시키는 하나 이상의 화합물의 존재하에서 고체-상 커플링 반응을 수행할 수 있다. 반응 속도를 증가시킬 수 있고 부반응 속도를 감소시킬 수 있는 화합물은 3급 염기, 예컨대 다이아이소프로필에틸아민(DIEA) 및 트라이에틸아민(TEA)의 존재하에서 보호된 아미노산을 활성화된 부류로 전환시킬 수 있는(예를 들어, BOP, PyBOPO, HBTU 및 TBTU는 모두 HOBt 에스터를 생성시킴) 포스포늄 및 우로늄 염을 포함한다. 다른 시약은 보호 시약을 제공함으로써 라세미화를 방지하는데 도움을 준다. 이들 시약은 보조 친핵체(예를 들어, 1-하이드록시-벤조트라이아졸(HOBt), 1-하이드록시-아자벤조트라이아졸(HOAt) 또는 HOSu)가 첨가된 카보다이이미드(예컨대, DCC 또는 WSCDI)를 포함한다. 아자이드 방법과 마찬가지로, 그에 연관되는 낮은 라세미화 덕분에, 보조 친핵체가 첨가되거나 첨가되지 않은 아이소뷰틸 클로로폼에이트를 사용하는 혼합된 무수물 방법을 또한 이용할 수 있다. 이들 유형의 화합물은 또한 카보다이이미드-매개되는 커플링의 속도를 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 Asn 및 Gln 잔기의 탈수를 방지할 수도 있다.

커플링이 완결된 것으로 결정된 후에는, 커플링 반응 혼합물을 용매로 세척하고, 펩타이드 물질의 후속 아미노산 잔기 각각에 대해 커플링 사이클을 반복한다. 다음 아미노산을 커플링시키기 위하여, 전형적으로는 N-메틸피롤리돈(NMP) 또는 다이메틸폼아마이드(DMF) 같은 용매 중에서 피페리딘 20 내지 50%(중량 기준)를 포함하는 시약으로 처리함으로써, 수지-결합된 물질로부터 N-말단 보호기(예컨대, Fmoc 기)를 제거한다. Fmoc 보호기를 제거한 후, 전형적으로 수회 세척하여 잔류 피페리딘 및 Fmoc 부산물(예컨대, 다이벤조풀벤 및 그의 피페리딘 부가물)을 제거한다.

수지 지지체상의 펩타이드 물질의 로딩 계수에 비해 아미노산이 화학량론적 과량이 되도록 후속 아미노산을 사용할 수 있다. 일반적으로, 커플링 단계에 사용되는 아미노산의 양은 수지 상의 첫번째 아미노산의 로딩 계수에 적어도 상응한다(1당량 이상). 바람직하게는, 커플링 단계에 사용되는 아미노산의 양은 1.3당량(0.3 과량) 이상, 가장 바람직하게는 약 1.5당량(0.5 과량) 이상이다. 일부 경우에는, 예컨대 커플링 단계에서 1 내지 3당량의 아미노산을 사용한다.

최종 커플링 사이클을 수행한 후, 수지를 NMP 같은 용매로 세척한 다음, DCM 같은 불활성 제 2 용매로 세척한다. 수지로부터 합성된 펩타이드 물질을 제거하기 위하여, 절단된 펩타이드 물질이 여전히 충분한 측쇄 및 말단 보호기를 갖도록 하는 방식으로 절단 처리를 수행한다. 보호기를 제 자리에 유지시키는 것은 수지 절단 동안 또는 후에 펩타이드 단편의 바람직하지 못한 커플링 또는 다른 바람직하지 못한 반응을 방지하는데 도움을 준다. Fmoc 또는 유사한 화학적 수단을 사용하여 펩타이드를 합성하는 경우에는, DCM 같은 용매 중에서 아세트산 또는 묽은 TFA 같은 비교적 약산 시약을 사용하는 것과 같은 임의의 목적하는 방식으로 보호된 절단을 달성할 수 있다. DCM중 0.5 내지 10중량%, 바람직하게는 1 내지 3중량%의 TFA를 사용하는 것이 전형적이다. 예컨대 미국 특허 제 6,281,335 호 참조.

고체-상 수지로부터 펩타이드 중간체 단편을 절단하는 단계는 다음과 같은 예시적인 공정 라인을 따라 진행될 수 있다. 그러나, 펩타이드 중간체 단편을 수지로부터 효과적으로 절단하는 임의의 적합한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 산성 절단 시약을 함유하는 용매 약 5 내지 20, 바람직하게는 약 10부피를 수지-결합된 펩타이드 물질을 함유하는 용기에 첨가한다. 그 결과, 전형적으로 비드 형태의 수지가 시약에 침지된다. 액체 내용물을 적합한 온도에서 적합한 시간동안 진탕시킬 때 절단 반응이 이루어진다. 진탕은 비드가 뭉치지 않도록 하는데 도움을 준다. 적합한 시간 및 온도 조건은 사용되는 산 시약, 펩타이드의 특성, 수지의 특성 등과 같은 인자에 따라 달라진다. 일반적인 지침으로서, 약 -15 내지 약 5℃, 바람직하게는 약 -10 내지 약 0℃에서 약 5분 내지 2시간, 바람직하게는 약 25분 내지 약 45분동안 교반하는 것이 적합하다. 절단 시간은 약 10분 내지 약 2시간 또는 하루 정도로 더 길 수 있다. 반응 동안 전형적으로 발생되는 반응시의 발열을 조절하기 위해 이렇게 냉각된 온도 범위에서 바람직하게 절단을 수행한다. 또한, 절단 반응의 온도가 더 낮으면 트리틸기 같은 산 감수성 측쇄 보호기가 이 단계에서 제거되지 않도록 방지하게 된다.

절단 처리 후, 반응을 급랭시킨다. 예를 들어 절단제를 피리딘 등과 같은 적합한 염기와 합치고, 추가로 5분 내지 2시간, 바람직하게는 약 20분 내지 약 40분 같은 추가적인 시간동안 계속 진탕 및 교반함으로써 이를 달성할 수 있다. 염기 첨가 및 계속되는 진탕은 용기 내용물의 온도를 높인다. 진탕 후, 용기 내용물은 약 0 내지 약 15℃, 바람직하게는 약 5 내지 약 10℃로 될 수 있다.

펩타이드 회수 양상을 개선하기 위하여 수지의 팽윤 및 수축 같은 요소를 전체적인 합성 공정에 도입시키거나 도입시키지 않을 수 있다. 이들 기법은 예를 들어 미국 특허 공개 제 2005/0164912 A1 호에 기재되어 있다.

일부 양태에서는, 다른 펩타이드 단편 및/또는 아미노산으로의 용액-상 커플링을 위해 절단된 펩타이드 단편을 제조할 수 있다. 용액-상에서의 펩타이드 커플링 반응은 예를 들어 문헌[New Trends in Peptide Coupling Reagents; 알베리치오(Albericio, Fernando); 친칠라(Chinchilla, Rafeal); 도즈워쓰(Dodsworth, David J.); 및 나제라(Najera, Armen); Organic Preparations and Procedures International (2003), 33(3), 203-303]에서 개괄된 바 있다.

동일 반응계내 커플링 시약, 예컨대 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)트리스(다이메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP), o-(벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), o-(7-아조벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HATU), 다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 수용성 카보다이이미드(WSCDI) 또는 o-(벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU)를 사용하여, 펩타이드 중간체 단편을 용액-상에서 다른 단편 또는 아미노산(들)에 커플링시킬 수 있다. 다른 커플링 기법에서는 하이드록시석신이미드(HOSu) 및 p-나이트로페놀(HONp) 에스터 같은 미리 제조된 활성 에스터; 미리 제조된 대칭 무수물; N-카복시무수물(NCA) 같은 비-대칭 무수물; 또는 아실 플루오라이드 및 아실 클로라이드 같은 산 할라이드를 사용한다.

적합한 커플링 용매를 용액-상 커플링 반응에 사용할 수 있다. 사용되는 커플링 용매(들)는 생성되는 펩타이드 결합의 라세미화 정도; 펩타이드 및/또는 펩타이드 단편의 용해도; 및 커플링 반응 속도에 영향을 끼칠 수 있다. 일부 실시양태에서, 커플링 용매는 하나 이상의 수혼화성 시약을 포함한다. 수혼화성 용매의 예는 예컨대 DMSO, 피리딘, 클로로폼, 다이옥세인, 테트라하이드로퓨란, 에틸 아세테이트, N-메틸피롤리돈, 다이메틸폼아마이드, 다이옥세인 또는 이들의 혼합물을 포함한다.

다른 실시양태에서, 커플링 반응은 하나 이상의 비-수혼화성 시약을 포함할 수 있다. 예시적인 비-수혼화성 용매는 메틸렌 클로라이드이다. 이들 실시양태에서, 비-수혼화성 용매는 바람직하게는 탈보호 반응에 적합하며; 예를 들어 비-수혼화성 용매가 사용되는 경우 바람직하게는 이는 탈호보 반응에 불리한 영향을 끼치지 않는다.

펩타이드(11)가 생성된 후에는, 필요에 따라 생성물을 탈보호, 정제, 동결건조, 추가적인 가공(예컨대 다른 펩타이드와 반응시켜 융합 단백질을 형성함); 이들의 조합 등을 거치게 할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따라, 측쇄 보호기는 전형적으로 고체-상 합성 및 용액-상 커플링 반응 전체에서 펩타이드 중간체 단편 상에 보유된다. 일반적으로, 용액-상 커플링 단계가 완결된 후에는, 하나 이상의 탈보호 단계를 수행하여 펩타이드로부터 하나 이상의 보호기를 제거할 수 있다.

전체적인 탈보호에 의해 측쇄 보호기를 제거하는 데에는, 전형적으로 측쇄 보호기를 절단하기 위하여 산분해제를 포함하는 탈보호 용액을 사용한다. 전체적인 탈보호에 통상적으로 사용되는 산분해 시약은 순수한 트라이플루오로아세트산(TFA), HCl, BF₃Et₂O 또는 Me₃SiBr 같은 루이스산, 액체 플루오르화수소산(HF), 브롬화수소(HBr), 트라이플루오로메테인설폰산 및 이들의 조합을 포함한다. 탈보호 용액은 또한 하나 이상의 적합한 양이온 소거제, 예컨대 다이티올트레이톨(DTT), 아니솔, p-크레솔, 에테인다이티올 또는 다이메틸 설파이드를 포함한다. 탈보호 용액은 또한 물을 포함할 수 있다. 본원에 사용되는, 탈보호 조성물에 존재하는 시약의 양은 전형적으로 비로 표현되는데, 여기에서 개별적인 성분의 양은 "중량부" 또는 "부피부" 같은 부로 표시되는 분자로서 표현되고, 분모는 조성물의 총 부이다. 예를 들어, 비 90:5:5(중량/중량/중량)의 TFA:H₂O:DTT를 함유하는 탈보호 용액은 90/100중량부의 TFA, 5/100중량부의 H₂O 및 5/100중량부의 DTT를 갖는다.

일부 실시양태에서는, 탈보호 조성물중 산분해제, 바람직하게는 TFA의 양이 90/100중량부보다 큰 탈보호 반응을 수행할 수 있다. 다른 바람직한 탈보호 조성물은 93/100중량부 이상, 또는 93/100중량부 내지 95/100중량부의 양의 산분해제를 포함한다.

에터, 예를 들어 다이에틸 에터 또는 MTBE(메틸 3급 뷰틸 에터)를 사용하여 전형적으로 침전을 수행한다. 침전 후, 펩타이드를 바람직하게 다른 성분과 합치기 전에 단리 및 건조시키고, 동결건조, 포장, 저장, 추가 가공 및/또는 달리 처리한다. 임의의 적합한 방식으로 이를 달성할 수 있다. 하나의 적합한 접근법에 따라, 여과에 의해 펩타이드를 수거하고 다량의 MTBE 세척액으로 세척하여 최종 염 함량을 적합한 수준으로 감소시킨 다음 건조시킨다.

본 발명은 또한 GLP-1 펩타이드 및 이들의 유사체를 비롯한 광범위한 펩타이드를 정제시키는 유용한 기법을 제공한다.

특히 바람직한 정제 방법은 적어도 첫번째 실행은 제 1 pH에서 이루어지고 적어도 두번째 실행은 제 2 pH에서 이루어지는, 크로마토그래피 매질을 통한 2회 이상의 정제 실행을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 첫번째 실행은 산성 pH에서 이루어지는 반면, 두번째 실행은 염기성 pH에서 이루어진다. 바람직한 실시양태에서는, 염기성 조건하에서 실행하기 전에 적어도 한 번의 실행이 산성 조건하에서 이루어진다. 이 정제 접근법을 실시하는 예시적인 방식은 도 1에 도시된 반응(10)으로부터 생성되는 완전 보호된 펩타이드(11)를 정제함에 관련되어 기재될 수 있다. 먼저, 펩타이드를 전체적으로 탈보호시킨다. N-말단 및 측쇄 보호기 둘 다를 절단한다. 약 1 내지 5, 바람직하게는 약 2의 pH를 제공하기에 충분한 TFA를 사용하여 물/ACN(아세토나이트릴) 구배로 첫번째 크로마토그래피를 실행한다. 이어, 약 8 내지 9, 바람직하게는 8.5 내지 8.9의 pH를 제공하기 위해 소량의 암모니아 및/또는 아세트산암모늄 등을 사용하여 물/ACN 구배로 두번째 크로마토그래피를 실행한다.

산인지 염기인지에 관계없이 pH 값은 각각의 경우에 균일한 이온 종류가 존재한다는 점에서 균일성을 조장한다. 따라서, 산성 pH는 바람직하게는 펩타이드 물질중의 아미노산 잔기가 실질적으로 모두 양성자화되도록 하기에 충분히 낮다. 염기성 pH는 바람직하게는 펩타이드 물질중의 아미노산 잔기가 실질적으로 모두 탈양성자화되도록 하기에 충분히 높다. 산 및 염기 크로마토그래피를 임의의 순서대로 수행할 수 있다. 펩타이드 아세테이트가 목적하는 생성물인 경우에는 아세테이트가 크로마토그래피의 생성물일 수 있기 때문에 염기성 크로마토그래피를 마지막에 수행하는 것이 편리하다.

이제, 하기 예시적인 실시예와 관련하여 본 발명의 원리를 추가로 설명한다. 하기에서, 백분율 및 비는 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 모두 부피 기준이다.

실시예 1 - N-말단에 Fmoc 보호기를 갖고 His 및 Glu 상에 측쇄 보호기를 갖는 단편(12)의 고체-상 합성

A. Fmoc - Gly - 로딩된 2 CTC 수지의 제조

먼저, Fmoc-Gly-로딩된 2CTC 수지를 제조하였다. 사용된 수지의 양은 하기 표에 기재된다:

Fmoc-Gly-2-클로로트리틸 수지의 제조
물질	MW	Eq	밀리몰	g	㎖
2-클로로트리틸클로라이드 수지	-	-	52.24	35.06	-
Fmoc-Gly-OH	297.3	1.0	13.06	3.88	-
다이아이소프로필에틸아민(DIEA)	129.25	2.35	30.72	3.97
다이메틸 폼아마이드(DMF)					1270
다이클로로메테인(DCM)					1785
9:1(부피)의 메탄올:DIEA					350
아이소프로판올(IPA)					1050

2-CTC 수지를 500㎖들이 펩타이드 반응기에 넣고 25℃에서 30분간 DCM 400㎖ 로 팽윤시켰다. 상을 배수시키고, 8부피의 DMF:DCM(87.5:12.5)중 Fmoc-Gly-OH 및 DIEA의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 25℃에서 2시간동안 교반하였다.

상을 배수시키고, DMF 350㎖로 1회, 또한 DMF 175㎖로 1회 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지상의 잔류 활성 부위를 1시간동안 MeOH:DIEA(9:1) 용액 350㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시키고, DMF 250㎖로 2회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 3×350㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤(de-swell)시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 로딩된 수지 38.20g을 수득하였다. 분석 결과 0.18밀리몰/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

본 실시예 1의 A부에서 제조된 0.18밀리몰/g으로 로딩된 Fmoc-Gly-2-CTC 수지 20.0g으로 출발하여 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(200㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP(각각의 세척시 5부피)로 3회 세척하였다.

이어, 수지를 NMP중 20부피%의 피페리딘(각 처리시 5부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후, 음성 클로라닐 시험을 위해 수지를 NMP(각 세척시 5부피)로 5회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산(2.85당량) 및 6-클로로-1-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT, 2.85당량)을 칭량하고, NMP 2.55배 부피에 용해시킨 다음 5 내지 10℃의 DIEA(3.25당량)와 합쳤다. TBTU(2.85당량)를 5 내지 10℃의 NMP 1.3배 부피에 용해시켰다. 두 용액을 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 플라스크를 DCM 1.3배 부피로 반응기 내로 세정하였으며, 이어 이를 25 내지 27℃에서 2 내지 3시간동안 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험(Kaiser Test)을 수행하여 반응 완결을 점검하였다. 3시간 후에 커플링 반응이 완결되지 않으면(양성 카이저 시험), 반응 용기를 비우고 활성화된 아미노산의 새로운 용액으로 재커플링을 수행하였다. 커플링 반응이 완결된 후, 커플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 5부피) 세척하였다. 이어, 단편중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 보호기 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Glu(OtBu)→Aib→His(trt)의 순서대로).

활성화된 Fmoc-His(trt)-OH와 H-Aib-Glu(OtBu)-Gly-2-CTC 사이의 커플링 반응의 어려움 및 활성화된 Fmoc-His(trt)-OH의 불안정성 때문에, 1시간 후에 반응 용액을 배수시키고 두번째의 새로운 활성화된 Fmoc-His(trt)-OH 용액으로 재커플링 반응을 즉시 수행함으로써, 커플링 반응을 완결시켰다.

본 실시예의 B부에 사용된 모든 시약이 아래 표에 기재된다:

수지-결합된 펩타이드 단편을 NMP(5부피)로 4회, DCM(6부피)으로 5회, IPA(5 부피)로 3회 세척하였다. 이어, 탈-팽윤된 수지를 35℃에서 진공하에 건조시켜, 수지 및 수지-결합된 펩타이드 22.58g을 수득하였다.

C. 수지로부터의 Fmoc 및 측쇄 보호된 단편의 절단

상기 B부로부터 구축된 수지를 25℃에서 30분간 DCM(사용되는 수지의 중량에 대해 12.5부피; 수지 1g당 DCM 12.5㎖ 또는 1kg당 12.5리터)으로 팽윤시킨 다음, DCM으로 2회(각 세척시 6.25부피) 세척하여 임의의 NMP 잔류물을 제거하였다. 수지를 마지막 DCM 세척으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시키고 1% TFA/DCM의 차가운 용액(-5 내지 -10℃, 10부피)을 첨가하고 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘(TFA의 1.3당량)을 반응기에 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 절단 용액을 여과해내고 플라스크에 수거하였다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM으로 7회(7.5부피) 세척하였다. 세척액을 절단 용액과 합쳤다. DCM 절단 용액을 물(7.5부피)과 합쳤다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 펩타이드 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. Fmoc-(Aib⁸)GLP-1(7-10)-OH 총 4.73g을 수득하였다.

실시예 2

A. Fmoc - Gly - 로딩된 2 CTC 수지의 제조

Fmoc-Gly-로딩된 2CTC 수지를 제조하였다. 사용된 시약의 양은 아래 표에 기재된다:

Fmoc-Gly-2-클로로트리틸 수지의 제조
물질	MW	Eq	밀리몰	g	㎖
2-클로로트리틸클로라이드 수지	-	-	59.66	40.04	-
Fmoc-Gly-OH	297.3	1.0	29.84	8.87	-
다이아이소프로필에틸아민(DIEA)	129.25	1.67	49.90	6.45
다이메틸 폼아마이드(DMF)					1580
다이클로로메테인(DCM)					1840
9:1 메탄올:DIEA					390
아이소프로판올(IPA)					1050

2-CTC 수지를 500㎖들이 펩타이드 반응기에 넣고 30분간 DCM 400㎖로 팽윤시켰다. 수지를 배수시키고, 8부피의 DMF:DCM(부피 기준 87.5:12.5)중 Fmoc-Gly-OH 및 DIEA의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 25℃에서 2시간동안 교반하였다.

수지 상을 배수시키고, DMF 400㎖로 1회, 또한 DMF 200㎖로 1회 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지상의 잔류 활성 부위를 1시간동안 MeOH:DIEA(부피 기준 9:1) 용액 390㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시키고, DMF 350㎖로 2회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 3×350㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 진공하에 35℃에서 건조시켜, 로딩된 수지 48.51g을 수득하였다. 분석 결과 0.54밀리몰/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

0.54밀리몰/g으로 로딩된 Fmoc-Gly-2-CTC 수지 27.59g으로 출발하여 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(300㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP(각각의 세척시 5부피)로 3회 세척하였다.

이어, 수지를 NMP중 20부피%의 피페리딘(각 처리시 5부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후, 음성 클로라닐 시 험을 위해 수지를 NMP(각 세척시 5부피)로 6회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산(1.7당량) 및 6-클로로-1-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT, 1.7당량)을 칭량하고, NMP 4.6배 부피에 용해시킨 다음 5 내지 10℃의 DIEA(1.9당량)와 합쳤다. TBTU(1.7당량)를 5 내지 10℃의 NMP 2.28배 부피에 용해시켰다. 두 용액을 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 플라스크를 DCM 2.28배 부피로 반응기 내로 세정하였으며, 이어 이를 25 내지 27℃에서 2 내지 3시간동안 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험을 수행하여 반응 완결을 점검하였다. 커플링 반응이 완결되면, 커플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 5부피) 세척하였다. 이어, 단편중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 기 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Glu(OtBu)→Aib→His(trt)의 순서대로).

본 실시예에 사용된 모든 시약이 아래 표에 기재된다:

C. 수지로부터의 단편의 절단

구축된 수지를 NMP(5부피)로 6회, 이어 DCM(6부피)으로 8회 세척하여 NMP 잔류물을 제거하였다. 수지를 마지막 DCM 세척으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배 수시킨 후, 1% TFA/DCM의 차가운(-5 내지 -10℃) 용액(10부피)을 첨가하고 생성된 폿(pot) 혼합물을 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘(TFA의 1.3당량)을 반응기에 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 절단 용액을 플라스크에 수거하였다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM(7.5부피)으로 11회 세척하고 절단 용액 중으로 배수시켰다. DCM 용액을 물(10부피)과 합쳤다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. Fmoc-(Aib⁸)GLP-1(7-10)-OH 총 11.12g(78.8% 수율)을 수득하였다.

실시예 3

A. Fmoc - Gly - 로딩된 2 CTC 수지의 제조

Fmoc-Gly-2-클로로트리틸 수지의 제조
물질	MW	Eq	밀리몰	g	㎖
2-클로로트리틸클로라이드 수지	-	-	60.88	40.86	-
Fmoc-Gly-OH	297.3	1.0	42.58	12.66	-
다이아이소프로필에틸아민(DIEA)	129.25	1.48	63.21	8.17
다이메틸 폼아마이드(DMF)					1380
다이클로로메테인(DCM)					1840
9:1 메탄올:DIEA					390
아이소프로판올(IPA)					1000

2-CTC 수지를 500㎖들이 펩타이드 반응기에 넣고 30분간 DCM 400㎖로 팽윤시켰다. 상을 배수시키고, 8부피의 DMF:DCM(87.5:12.5)중 Fmoc-Gly-OH 및 DIEA의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 25℃에서 2시간동안 교반하였다.

상을 배수시키고, DMF 400㎖로 1회 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지상의 잔류 활성 부위를 1시간동안 MeOH:DIEA(9:1) 용액 390㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시키고, DMF 350㎖로 2회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 4×250㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 진공하에 35℃에서 건조시켜, 로딩된 수지 52.02g을 수득하였다. 분석 결과 0.72밀리몰/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

0.72밀리몰/g으로 로딩된 Fmoc-Gly-2-CTC 수지 24.43g으로 출발하여 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(250㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP(각각의 세척시 5부피)로 3회 세척하였다.

이어, 수지를 NMP중 20%의 피페리딘(각 처리시 5부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후, 음성 클로라닐 시험을 위해 수지를 NMP(각 세척시 5부피)로 6회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산 및 6-클로로-1-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT)을 칭량하고, NMP에 용해시킨 다음 5 내지 10℃의 DIEA와 합쳤다. TBTU를 5 내지 10℃의 NMP에 용해시켰다. 두 용액을 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 플라스크를 DCM(양에 대해서는 하기 표 참조)으로 반응기 내로 세정하였으며, 이어 이를 25 내지 27℃에서 2 내지 6시간동안 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험을 수행하여 반응 완결을 점검하였다. 3시간 후에 커플링 반응이 완결되지 않으면(양성 카이저 시험), 반응 용기를 배수시키고 활성화된 아미노산의 새로운 용액으로 재커플링을 수행하였다. 커플링 반응이 완결된 후, 커 플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 5부피) 세척하였다. 이어, 단편중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 기 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Glu(OtBu)→Aib→His(trt)의 순서대로).

본 실시예에 사용된 모든 시약이 아래 표에 기재된다:

C. 수지로부터의 단편 Fmoc - AA (7-10)- OH 의 절단

구축된 수지를 NMP(5부피)로 6회, 이어 DCM(6부피)으로 7회 세척하여 NMP를 제거하였다. 수지를 마지막 DCM 세척으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 수지 상을 1% TFA/DCM의 차가운(-5 내지 -10℃) 용액(11.26부피)으로 0℃에서 5분간 세척하였다. 절단 용액을 플라스크에 수거하고, 여기에 피리딘(총 TFA의 1.3당량)을 첨가하여 TFA를 중화시켰다. 이어, 차가운 1% TFA/DCM의 두번째 분량(6.14부피)을 반응기에 첨가하고 2분간 교반하였다. 두번째 절단 용액을 다시 수거 플라스크 내로 배수시켰다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM(8.2부피)으로 9회 세척하고 절단 용액 중으로 배수시켰다. DCM 용액을 물(8.2부피)과 합쳤다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. 서열번호 7에 따른 Fmoc-(Aib⁸)GLP-1(7-10)-OH 총 14.02g(86.6% 수율)을 수득하였다. 분석 결과, 94.3% AN의 순도를 나타내었다.

실시예 4 - 측쇄 보호된 Fmoc -( Aib ³⁵ ) GLP -1(23-35)- OH 의 고체-상 합성

A. Fmoc - Aib - 로딩된 2 CTC 수지의 제조

Fmoc-Aib-로딩된 2CTC 수지를 제조하였다. 사용된 시약의 양은 아래 표에 기재된다:

Fmoc-Aib-2-클로로트리틸 수지의 제조
물질	MW	Eq	밀리몰	g	㎖
2-클로로트리틸클로라이드 수지	-	-	59.66	40.04	-
Fmoc-Aib-OH	325.5	1.0	14.91	4.85	-
다이아이소프로필에틸아민(DIEA)	129.25	2.39	35.20	4.61
다이메틸 폼아마이드(DMF)					1480
다이클로로메테인(DCM)					1840
9:1 메탄올:DIEA					450
아이소프로판올(IPA)					1050

2-CTC 수지를 500㎖들이 펩타이드 반응기에 넣고 30분간 DCM 400㎖로 팽윤시켰다. 상을 배수시키고, 8부피의 DMF:DCM(87.5:12.5)중 Fmoc-Aib-OH 및 DIEA의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 25℃에서 2시간동안 교반하였다.

상을 배수시키고, DMF 400㎖로 1회, 또한 200㎖로 한번 더 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지상의 임의의 잔류 활성 부위를 1시간동안 MeOH:DIEA(9:1) 용액 400㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시켰다. 수지를 DMF/MeOH/DIEA(4:0.9:0.1) 450 ㎖로 1회, DMF 200㎖로 1회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 3×350㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 로딩된 수지 45.15g을 수득하였다. 분석 결과 0.24밀리몰/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

0.24밀리몰/g의 로딩 계수를 갖는 Fmoc-Aib-2-CTC 수지 10.01g을 반응 용기에 넣고, DCM(120㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 NMP(각각의 세척시 6부피)로 3회 세척하였다.

이어, 수지를 NMP중 5부피%의 피페리딘(각 처리시 6부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 5% 피페리딘/NMP 처리 후, 수지를 NMP(각 세척시 6부피)로 4회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산(1.875당량) 및 1-하이드록시벤조트라이아졸 일수화물(HOBT 수화물, 2.07당량)을 5 내지 10℃의 NMP 3.5배 부피에 용해시킨 다음 NMP(1.5배 부피)중 HBTU(2.0당량)의 16.1㎖ 용액과 합쳤다. 이어, DIEA(2.63당량) 2.2㎖를 5 내지 10℃에서 활성화 용기에 첨가하였다. 생성된 용액을 반응 용기에 옮겨넣었다. 활성화 용기를 DCM 1.5배 부피로 반응기 내로 세정하고, 이어 이를 25℃에서 2시간동안 교반하였다. 반응 용기를 배수시켰다. 활성화된 아미노산(1.875당량)의 새로운 용액으로 커플링 반응을 한번 더 반복하였다. 두번째 커플링 반응이 종결된 후, 커플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 6부피) 세척하였다. 이어, 단편중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 기 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)의 순서대로).

본 실시예에 사용된 모든 시약이 아래 표에 기재된다:

구축된 수지를 NMP(6부피)로 4회, DCM(6부피)으로 4회, 또한 아이소프로판올(IPA, 6부피)로 3회 세척함으로써 단리하였다. 구축된 수지를 진공하에 35℃에서 건조시켰다. 구축된 수지 14.3g을 수득하였다.

C. 구축된 수지로부터의 중간체 단편의 절단

상기로부터의 구축된 수지 6.6g을 10배 부피의 DCM으로 30분간 팽윤시키고 -10℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 1% TFA/DCM(-5 내지 -10℃에서 12부피)의 차가운 용액을 첨가하고 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘(TFA의 2 내지 3당량)을 함유하는 플라스크에 절단 용액을 수거하였다. 25℃까지 가온하면서, 수지를 1% TFA/DCM(10배 부피)과 함께 5분간 교반하고 피리딘(2 내지 3당량)을 첨가하였다. 추가로 5분 후, 용액을 수거하였다. 수지를 DCM으로 4회(10부피) 세척하였다. 모든 DCM 세척액을 물과 합쳤다(물/DCM=1/4). 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. 절단 절차를 한 번 더 반복하였다. Fmoc-(Aib³⁵)GLP-1(23-35)-OH 총 2.36g(92% 수율)을 수득하였다.

실시예 5

A. Fmoc - Aib - 로딩된 2 CTC 수지의 제조

Fmoc-Aib-로딩된 2CTC 수지를 제조하였다. 본 실시예에서 사용된 시약의 양은 아래 표에 기재된다:

Fmoc-Aib-2-클로로트리틸 수지의 제조
물질	MW	Eq	밀리몰	g	㎖
2-클로로트리틸클로라이드 수지	-	-	59.67	40.05	-
Fmoc-Aib-OH	325.5	1.0	14.92	4.85	-
다이아이소프로필에틸아민(DIEA)	129.25	2.35	35.20	4.55
다이메틸 폼아마이드(DMF)					1280
다이클로로메테인(DCM)					1840
9:1 메탄올:DIEA					400
아이소프로판올(IPA)					1050

2-CTC 수지를 500㎖들이 펩타이드 반응기에 넣고 30분간 DCM 400㎖로 팽윤시켰다. 상을 배수시키고, 8부피의 DMF:DCM(87.5:12.5)중 Fmoc-Aib-OH 및 DIEA의 용 액을 첨가하였다. 혼합물을 질소하에 25℃에서 2시간동안 교반하였다.

상을 배수시키고, DMF 400㎖로 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지상의 임의의 잔류 활성 부위를 1시간동안 MeOH:DIEA(9:1) 용액 400㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시키고, DMF 400㎖로 1회, DMF 200㎖로 1회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 3×350㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 로딩된 수지 45.32g을 수득하였다. 분석 결과 0.30밀리몰/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

0.30밀리몰/g으로 로딩된 Fmoc-Aib-2-CTC 수지 15.0g으로 출발하여 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(150㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 DCM으로 2회(각 세척시 6부피) 및 NMP로 3회(각각의 세척시 6부피) 세척하였다.

이어, 수지를 NMP중 20%의 피페리딘(각 처리시 6부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후, 음성 클로라닐 시험을 위해 수지를 NMP(각 세척시 6부피)로 6회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산(1.7당량) 및 6-클로로-1-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT, 1.7당량)을 칭량하고, 5 내지 10℃의 NMP 2.6배 부피에 용해시킨 다음 DIEA(1.9 내지 3.0당량)와 합쳤다. TBTU 또는 HBTU(1.7당량)를 5 내지 10℃의 NMP 1.33배 부피에 용해시켰다. 두 용액을 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합 플라스크를 DCM 1.33배 부피로 반응기 내로 세정하 고, 이어 이를 25 내지 27℃에서 2 내지 3시간동안 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험을 수행하여 반응 완결을 점검하였다. 커플링 반응이 3시간 후에 완결되지 않으면(양성 카이저 시험), 반응 용기를 배수시키고, 활성화된 아미노산의 새로운 용액으로 재커플링을 수행하였다. 커플링 반응이 완결된 후, 커플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 6부피) 세척하였다. 이어, 단편중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 기 제거 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)의 순서대로).

2-메틸알라닌(Aib)과 2-CTC 수지 사이의 가능한 지지 효과로 인해, 처음 두 아미노산 커플링 반응(Lys(Boc)-34 및 Val-33)을 완결시키는 데에는 상당한 어려움이 있다. 따라서, (Lys(Boc)-34, Val-33)에 대한 두 커플링 반응을 모두 3회 수행하였다(즉, 커플링 후에 재커플링을 2회 수행하였음). 또한, Lys(Boc)-34와 Val-33의 커플링 반응 후 미반응 수지-결합된 물질을 말단-캡핑시키는데 아세트산 무수물을 사용하였다. 이는 크로마토그래피에 의한 정제 동안 목적하는 생성물로부터 불순물을 멀리 이동시킴으로써 후속 정제의 효율을 개선시켰다.

본 실시예에 사용된 모든 시약이 아래 표에 기재된다:

C. 구축된 수지로부터의 단편의 절단

상기로부터의 구축된 수지를 DCM으로 7회(각 세척시 6부피) 세척하여 NMP 잔류물을 제거하고, 수지를 마지막 DMC 세척으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 1% TFA/DCM의 차가운 용액(-5 내지 -10℃에서 12부피)을 첨가하고 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘(TFA의 1.3당량)을 함유하는 플라스크에 절단 용액을 수거하였다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM으로 9회(10부피) 세척하고 절단 용액 중으로 배수시켰다. DCM 용액을 물(6부피)과 합쳤다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃ 에서 건조시켰다. 본 실시예의 경우, 절단 절차를 한 번 더 반복하였다. Fmoc-(Aib³⁵)GLP-1(23-35)-OH 총 6.78g(68.1% 수율)을 87.3% AN의 순도로 수득하였다.

실시예 6

A. Fmoc - Aib - 로딩된 2 CTC 수지의 제조

Fmoc-Aib-2-클로로트리틸 수지의 제조
물질	MW	Eq	밀리몰	g	㎖
2-클로로트리틸클로라이드 수지	-	-	59.85	40.44	-
Fmoc-Aib-OH	325.5	1.0	20.95	6.82	-
다이아이소프로필에틸아민(DIEA)	129.25	0.95	19.88	2.57
다이메틸 폼아마이드(DMF)					1280
다이클로로메테인(DCM)					1840
9:1 메탄올:DIEA					400
아이소프로판올(IPA)					1050

상을 배수시키고, DMF 400㎖로 세척하였다. 이어, 2-CTC 수지상의 임의의 잔류 활성 부위를 1시간동안 MeOH:DIEA(9:1) 용액 400㎖로 말단-캡핑시켰다. 상을 배수시키고, DMF 400㎖로 1회, DMF 200㎖로 1회, 이어 DCM 350㎖로 4회 세척하였다. 3×350㎖ IPA로 세척함으로써 수지를 탈-팽윤시켰다. 수지를 일정한 중량이 될 때까지 건조시켜, 로딩된 수지 47.56g을 수득하였다. 분석 결과 0.37밀리몰/g의 로딩 계수를 나타내었다.

B. 고체-상 합성

0.37밀리몰/g으로 로딩된 Fmoc-Aib-2-CTC 수지 25.0g으로 출발하여 고체-상 합성을 수행하였다. 수지를 DCM(250㎖) 중에서 25℃에서 30분간 팽윤시켰다. DCM 용매를 배수시키고 수지를 DCM으로 2회(각 세척시 6부피) 및 NMP로 3회(각각의 세척시 6부피) 세척하였다.

이어, 수지를 NMP중 20부피%의 피페리딘(각 처리시 6부피)으로 2회 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 두번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후, 음성 클로라닐 시험을 위해 수지를 NMP(각 세척시 6부피)로 6회 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, 아미노산 및 6-클로로-1-하이드록시벤조트라이아졸(6-Cl-HOBT)을 칭량하고, NMP(또는 Lys-34, Val-33 및 Gln-23의 경우 DMF) 3.2배 부피에 용해시킨 다음 5 내지 10℃의 DIEA와 합쳤다. TBTU를 5 내지 10℃의 NMP(또는 Lys-34, Val-33 및 Gln-23의 경우 DMF) 1.6배 부피에 용해시켰다. 두 용액을 합쳤다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하고 플라스크를 DCM 1.6배 부피로 반응기 내로 세정하고, 이어 이를 25 내지 27℃에서 2 내지 3시간동안 수지와 함께 교반하였다. 샘플에 대해 카이저 시험을 수행하여 반응 완결을 점검하였다. 커플링 반응이 3시간 후에 완결되지 않으면(양성 카이저 시험), 반응 용기를 배수시키고, 활성화된 아미노산의 새로운 용액으로 재커플링을 수행하였다. 커플링 반응이 완결된 후, 커플링 용액을 배수시키고 수지를 NMP로 4회(각 세척시 6부피) 세척하였다. 이어, 단편중의 나머지 아미노산에 대해 Fmoc 기 탈보호 및 커플링 반응 사이클을 반복하였다(즉, Lys(Boc)→Val→Leu→Trp(Boc)→Ala→Ile→Phe→Glu(OtBu)→Lys(Boc)→Ala→Ala→Gln(trt)의 순서대로).

2-메틸알라닌(Aib)과 2-CTC 수지 사이의 가능한 지지 효과로 인해, 처음 두 아미노산 커플링 반응(Lys(Boc)-34 및 Val-33)을 완결시키는 데에는 상당한 어려움이 있다. 아미노산 및 6-Cl-HOBT 둘 다의 사용량을 1.7당량에서 2.5당량으로 증가시키고 DIEA의 사용량을 1.9당량에서 3.0당량으로 증가시킴으로써, Lys(Boc)-34, Val-33 및 Gln(trt)-23에 대한 커플링 조건을 변경시켰다. 커플링 반응용 용매도 커플링 반응을 완결시키기 위하여 NMP에서 DMF로 변화시켰다. 또한, 본 실시예에서는, Lys(Boc)-34와 Val-33의 커플링 반응 후 미반응 수지-결합된 물질을 말단-캡핑시키는데 아세트산 무수물을 사용하였다. 이는 크로마토그래피에 의한 정제 동안 목적하는 생성물로부터 불순물을 멀리 이동시킴으로써 후속 정제의 효율을 개선시켰다.

본 실시예에 사용된 모든 시약이 아래 표에 기재된다:

C. 구축된 수지로부터의 단편의 절단

상기로부터의 구축된 수지를 DCM으로 6회(각 세척시 6부피) 세척하여 NMP를 제거하고, 수지를 마지막 DCM 세척으로 -5℃까지 냉각시켰다. DCM을 배수시킨 후, 1% TFA/DCM의 차가운 용액(-5 내지 -10℃에서 10부피)을 첨가하고 0℃에서 30분간 교반하였다. 피리딘(TFA의 1.3당량)을 함유하는 플라스크에 절단 용액을 수거하였다. 용기를 25℃까지 가온하면서, 수지를 DCM으로 7회(6부피) 세척하고 절단 용액 중으로 배수시켰다. DCM 용액을 물(10부피)과 합쳤다. 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거하였다(28℃에서 350토르). DCM이 제거될 때 물로부터 단편이 침전되어 나왔다. 단편을 물로 세척하고 진공하에 30 내지 35℃에서 건조시켰다. 본 실시예의 경우, 완전한 절단을 달성하기 위하여 절단 절차를 한 번 더 반복하였다. Fmoc-(Aib³⁵)GLP-1(23-35)-OH 총 12.36g(59.35% 수율)을 84.3% AN의 순도로 수득하였다.

실시예 7

1. 수지 세척

미리 로딩된 Fmoc-Gly-O-2-CTC 수지(0.18 내지 0.65밀리몰/g의 로딩), 또는 Fmoc-Aib-O-2-CTC(0.25 내지 0.65밀리몰/g의 로딩)로 출발하여, 표준 Fmoc 화학을 적용하였다. 수지를 먼저 DCM 10배 부피로 30 내지 60분간 팽윤시켰다. 이어, DCM을 배수시키고 수지를 NMP 10배 부피로 3 내지 5분간(각각 5분) 세척하였다.

2. 일반적인 합성 사이클:

본 실시예 7의 A부에 따라 세척된 수지를 사용하여, NMP중 20% 피페리딘(v/v)의 10배 용액으로 2회 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. 처리에는 각각 15 내지 30분이 걸렸다. 각각의 처리 후 피페리딘/NMP 용액을 배수시켰다. 이어, 수지를 NMP로 4 내지 5회(10배 부피, 각각 5분) 세척하였다.

커플링 용액을 제조하기 위하여, Fmoc 보호된 아미노산(AA) 및 HOBt를 칭량하고(1.5 내지 2.0당량), 10℃의 NMP 4배 부피에 용해시킨 다음 DIEA(1.5 내지 2.0당량)와 합쳤다. HBTU(1.5 내지 2.0당량)를 10℃의 NMP 3배 부피에 용해시켰다. 이어, 두 용액을 합치고 DCM 3배 부피와 1 내지 2분간 혼합하였다. 생성된 용액을 반응 용기에 첨가하고 진탕하에 1.5 내지 5시간동안 수지와 혼합하였다. 샘플에 대해 카이저 시험을 수행하여 반응의 완결을 점검하였다. 완결되지 않은 커플링을 재커플링시켰다. 커플링 반응을 완결시킨 후, 커플링 용액을 배수시키고, 수지를 NMP로 5회(10배 부피, 각각 5분) 세척하였다.

A. 일반적인 합성 절차에 따라, 동일한 일반적인 합성 절차를 이용하여 천연 서열을 갖는 단편 Fmoc-GLP-1(11-22)-2-CTC를 단계적으로 구축하고, 일반적인 합성 절차를 이용하여 이 A부에서 제조된 단편 Fmoc-GLP-1(11-22)-2-CTC에 서열번호 7에 따른 단편을 커플링시켰다.

B. 일반적인 합성 절차에 따라, 단편 Fmoc-GLP-1(11-22)-2-CTC를 단계적으로 구축하였다. 그러나, Fmoc 제거 조건을 NMP중 20% 피페리딘(v/v) 대신 NMP중 10% 피페리딘 및 2% DBU(v/v)의 용액으로 변화시켰다. 또한, AA14[Fmoc-Ser(tBu)-] 위치 및 AA13[Fmoc-Thr(tBu)-] 위치에서의 처리 시간을 1.5시간으로 연장시켜 반응을 완결시켰다. 동일한 일반적인 합성 절차를 이용하여, 일반적인 합성 절차를 이용하여 제조된 Fmoc-GLP-1(11-22)-2-CTC에 서열번호 7에 따른 단편을 커플링시켰다.

C. 일반적인 합성 절차에 따라, MMP중 10% 피페리딘 및 2% DBU(v/v)로서의 Fmoc 제거 용액으로 단편 Fmoc-(X¹⁷ ^-18)GLP-1(11-22)-2-CTC를 단계적으로 구축하였다. 이어, 일반적인 합성 절차를 이용하여 생성된 Fmoc-(X¹⁷ ^-18)GLP-1(11-22)-2-CTC에 서열번호 7에 따른 단편을 커플링하였다.

D. 일반적인 합성 절차에 따라, 단편 Fmoc-(X¹⁷ ^-18)GLP-1(11-22)-2-CTC를 단계적으로 구축하였다. 이어, 일반적인 합성 절차를 이용하여 생성된 Fmoc-(X¹⁷ ^-18)GLP-1(11-22)-2-CTC에 서열번호 7에 따른 단편을 커플링시켰다.

E. 하기 표에 표시된 차이점을 제외한 바로 앞의 D부의 일반적인 합성 절차에 따라, 단편 Fmoc-(X^17-18)GLP-1(11-22)-2-CTC를 단계적으로 구축하였다. 이어, 일반적인 합성 절차를 이용하여 생성된 Fmoc-(X¹⁷ ^-18)GLP-1(11-22)-2-CTC에 서열번호 7에 따른 단편을 커플링시켰다.

하기 표는 본 실시예의 절차 A 내지 E의 세부사항을 요약한다:

실시예	규모	로딩 밀리몰/g	Fmoc 제거 조건	위치 17-18의 슈도프롤린	AA의 당량	순도 HPLC	수율
A	5g	0.24	20% 피페리딘/NMP	없음	2.0	30%	42%^*
B	20g	0.30	10% 피페리딘/2% DBU/NMP	없음	1.7	58%	62%
C	5g	0.30	10% 피페리딘/2% DBU/NMP	있음	2.0	84%	74%
D	5g	0.30	20% 피페리딘/NMP	있음	2.0	75%	80%
E	20g	0.42	20% 피페리딘/NMP	있음	2.0	89%	86%

F. 단편 절단:

본 실시예에서 합성된 임의의 펩타이드 단편과 관련하여 단편 절단을 달성하기 위하여, 구축된 펩타이드-수지를 DCM 10배 부피로 30분간 팽윤시키고 -10℃로 냉각시킨다. DCM을 배수시키고 1% TFA/DCM의 용액(10배 부피)을 첨가하고 30분간 교반한다. 피리딘(TFA에 대해 2 내지 3당량)을 함유하는 플라스크에 절단 용액을 수거한다. 25℃로 가온하면서, 수지를 1% TFA/DCM(10배 부피)으로 5분간 처리한 다음, 피리딘(TFA에 대해 2 내지 3당량)을 첨가한다. 추가로 5분간 진탕시킨 후, 용액을 수거한다. 이어, 수지를 10배 부피의 DCM으로 4회 세척한다(각각 5분). 모든 세척액과 절단 용액을 합치고 물과 혼합한다(물/DCM 비= 약 1/4, 부피 기준). 생성된 혼합물을 감압하에 증류시켜 DCM을 제거한다(350토르/28℃). DCM이 제거될 때 펩타이드 단편이 물로부터 빠져나오고, 이를 여과한다. 펩타이드 단편을 물로 세척하고 진공하에 30℃에서 건조시킨다.

실시예 8 - 용액 합성: Arg 부가

(Aib³⁵)GLP-1(23-35) 단편(표 A에 따른 측쇄 보호기를 갖고, N-말단에 Fmoc 보호기를 가짐)(9.11g, 3.94밀리몰)을 DMSO(90㎖)에 용해시켰다. 이 용액에, HOBt(2.42g, 4당량), HBTU(5.98g, 4당량), DIEA(3.44㎖, 5당량) 및 H-Arg(2HCl)-NH₂(3.88g, 4당량)를 DMSO 10㎖와 함께 넣었다. 반응을 진탕시키고 HPLC에 의해 모니터링하였다. 4시간 후, 반응이 완결되지 않았기 때문에, DIEA 2㎖를 첨가하였다. 반응을 하룻밤동안 수행하였다. 이어, 피페리딘(5㎖)을 반응 혼합물에 첨가 하였다. Fmoc 제거를 2시간 내에 수행하였다. 반응 혼합물을 빙수(800㎖)로 급랭시키고 40분간 교반하였다. 생성된 백색 고체를 여과하고 물(400㎖)로 세척한 다음 하룻밤동안 건조시켜, 단편(9.65g, 중량 수율 109%) (Aib³⁵)GLP-1(23-36)을 수득하였다.

실시예 9

표 A에 따른 측쇄 보호기 및 N-말단에 Fmoc 보호기를 갖는 단편 (Aib⁸, X¹⁷ ^-18)GLP-1(7-22)(7.73g, 2.88밀리몰)를 DMSO(65㎖)에 용해시켰다.

이 용액에, HOBt(0.73g, 4.77밀리몰), HBTU(1.46g, 3.85밀리몰), DIEA(0.71㎖, 7.40밀리몰), 및 단편 (Aib³⁵)GLP-1(23-36)(8.5g, 3.45밀리몰)을 DMSO 20㎖와 함께 넣었다. 반응을 진탕시키고 HPLC에 의해 모니터링하였다. 3시간 후, 커플링이 완결되었다. 이어, 피페리딘(5㎖)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 2시간 내에 Fmoc 제거를 수행하였다. 반응 혼합물을 빙수(800㎖)로 급랭시키고 30분간 교반하였다. 생성된 백색 고체를 여과하고 물(400㎖)로 세척한 후 하룻밤동안 건조시켜, 보호된 펩타이드 (Aib⁸, X¹⁷ ^-18, Aib³⁵)GLP-1(7-36)을 수득하였다.

실시예 10 - 전체적인 탈보호

실시예 9에 따라 제조된 펩타이드(16.24g)를 TFA/DTT/물(100㎖/5g/2.0㎖)의 용액으로 2시간동안 처리하고, 생성된 용액을 빙욕중의 MTBE(800㎖)에 부어넣었다. 30분간 진탕시킨 후, 생성된 백색 고체를 여과하고 MTBE(400㎖)로 세척한 다음 건 조시켜, 조질 펩타이드 생성물(16.0g, 중량 수율 138%)을 제공하였다. 생성된 탈보호된 펩타이드를 이후 "조질" 펩타이드라고 한다.

실시예 11 - 정제

98+% 순도 및 약 60% 함유량/함유량 수율로 정제된 펩타이드를 생성시키는 크로마실(Kromasil; 등록상표) C4, 10마이크론, 2.0×25cm 칼럼 상에서 조질 펩타이드의 정제를 수행한다. 정제는 pH 2에서의 첫번째 크로마토그래피 정제 후 pH 9에서의 두번째 정제를 포함한다. 이 정제 후에는, 정제된 펩타이드를 다양한 방식으로 추가로 처리 또는 가공할 수 있다. 예로서, 두번째 정제로부터 생성되는 정제된 풀(pool)을 동결건조시키거나 또는 농축 칼럼을 통해 통과시키고 침전에 의해 단리할 수 있다. 두 단리 모두 목적하는 펩타이드(아세테이트)를 생성시킨다.

2회 실행 공정의 개관으로서, 조질 펩타이드를 10% 아세토나이트릴/물의 혼합물(0.2M 아세트산)에 5mg/㎖(함유량 기준)로 용해시킨다. 아세토나이트릴/THF/물/TFA 구배를 이용하여 1000mg 주입(함유량 기준)을 2회 실행하고, 약 95% 순도의 분획을 모은다. 또한 약 70% 순도에서 "재순환 분획"을 모아서 약 34% 회수율을 제공한다. 동일한 아세토나이트릴/THF/물/TFA 구배를 이용하여 재순환 분획을 재주입하고, 약 85% 순도에서의 풀을 주 풀과 합친다. 첫번째 실행된 크로마토그래피 정제의 함유량 대 함유량 수율은 70%이다.

이어, 합쳐진 첫번째 실행 풀(pH 2)을 동일하지만 아세토나이트릴/THF/물/아세트산암모늄(pH 8.8) 구배를 사용하는 크로마실(등록상표) C4 칼럼 상에서 두번째 실행으로 추가로 정제시켰다. 분획을 합쳐서 약 85% 두번째 실행 회수율에서 98+% 순도를 수득한다. 두 정제 단계의 전체 수율은 60%이다(함유량/함유량).

동일하지만 메탄올/물/아세트산암모늄 단계 구배를 사용하는 크로마실(등록상표) C4 칼럼을 사용하여, 합쳐진 두번째 실행 풀(pH 8.8)을 농축시켰다. 분획을 합치고, 이는 단리에 즉시 사용가능하다.

A. 조질 펩타이드 용액 제조:

90% 0.2N 아세트산/10% 아세토나이트릴의 용액 500㎖에 조질 펩타이드 8g을 용해시켰다. 0.45마이크론 듀라포어(Durapore) 필터(47mm 직경)[밀리포어(Millipore)]를 통해 1회, 이어 슈퍼(Supor) EKV 디스크 스택 마이트론 필터(0.65/0.2mm 직경)[폴 필터즈(Pall Filters)]를 통해 용액을 여과하였다. 조질 주입 용액을 HPLC에 의해 분석한 결과, 1㎖당 함유된 펩타이드 5.02mg(중량%)을 함유하는 것으로 밝혀졌다. (500㎖×5.02mg/㎖=2512mg 함유된 펩타이드).

B. 크로마토그래피 - 약 pH 2에서의 첫번째 실행

하기 조건하에서 조질 용액으로 4회 동일하게 주입하였다:

칼럼: 크로마실에 의해 제조됨, C4의 팩킹을 가짐, 10마이크론 및 2.0×25cm의 치수.

검출기: 280nm로 설정된 자외선 검출기(8nm 밴드폭, 350/20nm 기준).

컬럼 온도: 주위 온도

유속: 13.0㎖/분(약 50바 배압)

이동상: A=0.1% 트라이플루오로아세트산/15% 아세토나이트릴/85% 물의 혼합물, B=0.1% 트라이플루오로아세트산/15% 테트라하이드로퓨란/70% 아세토나이트릴 /15% 물의 혼합물.

구배: 구배는 100% A 이동상으로 시작해서 0.1분간 유지된다. 이어, 샘플을 펌프 C(아래 펌프 C에 대한 내용 참조)에 의해 수동으로 칼럼 상에 로딩한다. 샘플 로딩 후, 100% A로부터 83% A까지의 선형 구배가 1분간에 걸쳐 진행된다. 이어, 이동상을 이후 11분동안 83% A에서 유지시킨다. 이어, 두번째 선형 구배가 10분간에 걸쳐 73% A까지 진행된다. 이어, 이동상을 다음 15분동안 73% A에서 유지시킨다. 이어, 진행을 종결시키고, 10분간 100% B로 플러시시킨 후 20분간 100% A로 칼럼을 재-평형화시킨다.

9.0㎖/분으로 별도의 등용리 HP 1100 펌프(펌프-C)를 이용하여 샘플을 로딩하였다. 먼저 용리되는 불순물을 83% A로 유지되는 처음 11분간의 등용리 유지 후 다음 10분간에 걸친 73% A까지의 선형 구배에 의해 주 피크로부터 분리한다. 이어, 73% A로 유지되는 15분동안 주 펩타이드 피크를 용리시킨다. 73% A로 유지되는 이 15분동안 분획을 수거한다.

C. 약 pH 2에서의 첫번째 실행 재순환:

합쳐진 풀에 첨가될 수 있는 순도 미만의 순도를 갖는 것으로 결정된 분획으로부터 재순환 풀을 수득한다. 이들 분획을 별도로 합치고 동일 부피의 물로 희석시켰다. 이 별도로 합쳐진 풀로부터 칼럼 상으로 다시 재순환 주입을 수행하였다. 동일한 크로마토그래피 조건을 이용하고, 허용가능한 순도의 분획을 합치고 동일 부피의 물로 희석시킨 다음 첫번째 실행의 합쳐진 풀에 첨가한다.

펩타이드 피크 부근에서 용리되는 불순물이 증가되었기 때문에 재순환 주입 을 위한 로딩량은 조질 주입량보다 상당히 더 적다. 평균적으로, 매 2회 조질 주입에 대해 1회 재순환 주입이 이루어진다.

D. pH 8.8에서의 두번째 실행 분취 크로마토그래피:

최종적으로 합쳐진 첫번째 실행 풀을 pH 8.8에서 재 크로마토그래피시킴으로써 추가로 정제시켰다. 두번째 실행시 pH 8.8을 이용하면 불순물의 용리도를 상당히 변화시켜 더 높은 회수율로 더욱 우수하게 깨끗이 만들 수 있었다. 두번째 크로마토그래피 단계에 이용되는 조건은 다음과 같았다:

컬럼 온도: 주위 온도

유속: 13.0㎖/분(약 50바 배압)

이동상: A=1리터당 2g의 아세트산암모늄 및 1리터당 1㎖의 진한 수산화암모늄을 함유하는 15% 아세토나이트릴/85% 물의 혼합물, B=1리터당 2g의 아세트산암모늄 및 1리터당 1㎖의 진한 수산화암모늄을 함유하는 15% 테트라하이드로퓨란/60% 아세토나이트릴/25% 물의 혼합물.

구배: 구배는 100% A 이동상으로 시작해서 0.1분간 유지된다. 이어, 샘플을 펌프 C에 의해 수동으로 칼럼 상에 로딩한다. 샘플 로딩 후, 100% A로부터 67% A까지의 선형 구배가 2분간에 걸쳐 진행된다. 이어, 이동상을 이후 33분동안 67% A에서 유지시킨다. 이어, 진행을 종결시키고, 5분간 100% B로 플러시시킨 후 15분 간 100% A로 칼럼을 재-평형화시킨다.

9.0㎖/분으로 별도의 등용리 HP 1100 펌프(펌프-C)를 이용하여 샘플을 로딩하였다. 30분간의 로딩 단계 후, 100% A로부터 67% A까지의 짧은 구배가 30.2분에서 32분까지 진행되었다. 67% A에서 유지되는 33분 동안 주 펩타이드 피크를 용리시켰다. 칼럼을 로딩한지 20분 후부터 시작하여 주 피크가 용리를 종결한 후까지 분획을 수거한다. 분획을 약 15분간 수거한다. 허용가능한 분획을 모으고 동일 부피의 물로 희석시킨다. 정제의 이 단계에서 재순환이 가능하지만, 폐기되는 분획은 통상 재순환 주입을 정당화하기에 충분한 펩타이드를 함유하지 않는다. 다수의 주입이 이루어지고 재순환을 위해 폐기 분획을 모은다면, 이것이 가능해질 수 있다.

E. 농축 실행:

마지막으로 합쳐진 두번째 실행의 합쳐진 풀을 동일한 칼럼에 로딩하고, 상이한 이동상을 사용하여 신속하게 용리시켜 펩타이드를 단리하기 위해 농축시킨다. 이 단계에 사용된 조건은 다음과 같았다:

컬럼 온도: 주위 온도

유속: 13.0㎖/분(약 50바 배압)

이동상: A=10% 메탄올/90% 20mM 아세트산암모늄의 혼합물, B=90% 메탄올/10% 20mM 아세트산암모늄의 혼합물.

구배: 구배는 100% A 이동상으로 시작해서 0.1분간 유지된다. 이어, 샘플을 펌프 C에 의해 수동으로 칼럼 상에 로딩한다. 샘플 로딩 후, 이동상을 100% A에서 5분간 유지시킨다. 이어, 이동상을 다음 20분동안 즉시 100% B로 만든다. 이어, 진행을 종결시키고, 15분간 100% A로 칼럼을 재-평형화시킨다.

9.0㎖/분으로 별도의 등용리 HP 1100 펌프(펌프-C)를 이용하여 샘플을 로딩하였다. 45분간의 로딩 단계 후, 100% A를 사용하여 5분간 짧게 유지시킨 다음, 100% B까지의 단계 구배를 20분간 실행시켜 펩타이드를 용리시켰다. 주 피크는 100% B로의 단계 구배가 시작된지 2분 후에 용리되기 시작하였다. 다음 12분간의 분획은 펩타이드를 함유하였고, 이들을 단리를 위해 모았다.

실시예 12 - 동결건조

입구가 넓은 1리터들이 FLPE 병의 무게를 측정하였다. 이 병에 아세토나이트릴 수용액/아세트산암모늄중 (Aib⁸, X^17-18, Aib³⁵)GLP-1(7-36) 아세테이트의 정제된 풀(210㎖)을 첨가하였다. 용기를 탈이온수 3×5㎖로 세정하고 세정액을 풀에 첨가하였다. 이 용액을 휘저어 균질화시킨 다음 뚜껑을 닫고 액체 질소 중에서 외피를 동결시켰다. 동결된 병의 뚜껑을 열고 입구를 고무 밴드로 제 자리에 위치되는 이중 킴와이프(Kimwipe)로 덮었다. 병을 동결건조기 상의 배큐테이너(vacutainer)에 넣고 동결건조시켰다. 응축기 온도 -89℃, 압력 19마이크론.

24시간 후, 배큐테이너를 통기시켜 진행을 점검하였는데; 여전히 가청 얼음 덩어리가 존재하였다. 동결건조를 다시 시작하였다.

추가로 18시간 후, 병을 동결건조기에서 제거하고 중량을 점검하였다. 중량은 불안정하였고 생성물의 흡습성 때문에 급속하게 상승되었다. 점착성 생성물을 용기의 무게를 잰 섬광 바이알로 신속하게 옮겨넣고 칭량하였으며, 펩타이드 0.822g을 수득하였다.

실시예 13: 정제된 펩타이드의 침전

플라스크에서, MeOH/물(9:1, 부피 기준)중 20mM 아세트산암모늄 2㎖중 순수한 (Aib⁸, X¹⁷ ^-18, Aib³⁵)GLP-1(7-36) 아세테이트 100.5mg의 용액을 MeOH/물(9:1, 부피 기준)중 20mM 아세트산암모늄 1㎖로 희석시켰다. 진탕하면서, 아이소프로판올(IPA) 20㎖를 20 내지 25℃에서 플라스크 중으로 서서히 공급하였다. IPA 15㎖를 첨가한 후 폿 혼합물이 흐려지기 시작했다. 20 내지 25℃에서 하룻밤동안 계속 교반하였다. 침전 생성물을 여과하고 IPA 5㎖로 세척한 다음 25℃에서 진공하에 중량이 일정해질 때까지 건조시켰다. 펩타이드 90.9mg을 수득하였다(90.42% 회수율).

실시예 14: 정제된 펩타이드의 단리

플라스크에서, MeOH/물(9:1)중 20mM 아세트산암모늄 10㎖중 순수한 (Aib⁸, X^17-18, Aib³⁵)GLP-1(7-36) 아세테이트 497.7mg의 용액을 MeOH/물(9:1)중 20mM 아세트산암모늄 6㎖로 희석시켰다. 진탕시키면서, 아이소프로판올(IPA) 40㎖를 20 내지 25℃에서 35분간에 걸쳐 플라스크 내로 서서히 공급하였다. IPA 2㎖를 첨가한 후 폿 혼합물이 흐려지기 시작했다. 20 내지 25℃에서 1시간동안 계속 교반하였다. 침전 생성물을 여과하고 IPA 5㎖로 세척한 다음 25℃에서 진공하에 중량이 일정해질 때까지 건조시켰다. 펩타이드 458.4mg을 수득하였다(92% 회수율).

실시예 15: 정제된 펩타이드의 단리

플라스크에서, 20 내지 25℃에서 농축 칼럼을 통해 MeOH/물(9:1)중 20mM 아세트산암모늄 150㎖중 순수한 (Aib⁸, X¹⁷ ^-18, Aib³⁵)GLP-1(7-36) 아세테이트 약 1000mg의 교반되는 용액에 IPA 900㎖를 서서히 첨가하였다. 이 첨가는 45분간에 걸쳐 종결되었다. IPA 260㎖를 첨가한 후 폿 혼합물이 흐려지기 시작했다. 20 내지 25℃에서 40분동안 계속 교반하였다. 침전 생성물을 여과하고 IPA 5㎖로 세척한 다음 20 내지 25℃에서 진공하에 중량이 일정해질 때까지 건조시켰다. 펩타이드 746mg을 수득하였다(74.6% 회수율).

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG Roberts, Christopher R. <120> INSULINOTROPIC PEPTIDE SYNTHESIS <130> Case 23831 <150> US 60/815,919 <151> 2006-06-23 <160> 13 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val 1 5 10 15 Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu 20 25 30 Val Lys Gly Arg Gly 35 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is Aib <400> 4 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is an achiral amino acid <400> 5 His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <400> 6 His Xaa Glu Xaa 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is Aib <400> 7 His Xaa Glu Gly 1 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 7-8) <400> 8 Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is an achiral amino acid <400> 9 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is Aib <400> 10 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa 1 5 10 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <400> 11 His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is an achiral amino acid <400> 12 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is an achiral amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is an amino acid of a pseudoproline dipeptide (residues 11-12) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa is an achiral amino acid <400> 13 His Xaa Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Xaa Xaa Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30

Claims

h) 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰(서열번호 6)을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 여기서 X⁸ 및 X¹⁰이 각각 비키랄(achiral) 아미노산 잔기이고, H 및 E가 측쇄 보호기를 각각 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

i) 아미노산 서열 TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 8)를 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 여기서 X¹⁷ ^-18로 표시되는 잔기가 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

j) 상기 제 1 단편을 상기 제 2 단편에 커플링시켜 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEG(서열번호 11)를 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

k) 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵(서열번호 9)를 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 여기서 X³⁵가 비키랄 아미노산 잔기이고, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

l) 상기 제 4 펩타이드 단편을 아르기닌에 커플링시켜 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 12)을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계; 및

m) 상기 제 5 단편을 상기 제 3 단편에 커플링시켜 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 13)을 포함하는 인슐린친화성(insulinotropic) 펩타이드를 제공하는 단계로서, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계

중 하나 이상의 단계를 포함하는, 인슐린친화성 펩타이드의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

단계 a) 내지 f)를 포함하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

n) 측쇄 보호기를 제거하여 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 5) 및 그의 유사체(counterparts)를 포함하는 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계로서, 여기서 X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵가 입체적으로 장애된(sterically hindered) 또는 장애되지 않은 비키랄 아미노산 잔기를 각각 독립적으로 나타내는, 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

a) 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰(서열번호 6)을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 여기서 X⁸이 Aib에 상응하는 아미노산 잔기이고, X¹⁰이 글리신에 상응하는 아미노산 잔기이고, H 및 E가 측쇄 보호기를 각각 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

b) 아미노산 서열 TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 8)를 포함하는 제 2 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 여기서 X¹⁷ ^-18로 표시되는 잔기가 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

c) 상기 제 1 단편을 제 2 단편에 커플링시켜 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEG(서열번호 11)를 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

d) 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵(서열번호 9)를 포함하는 제 4 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 여기서 X³⁵가 Aib에 상응하는 아미노산 잔기이고, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계;

e) 상기 제 4 펩타이드 단편을 아르기닌에 커플링시켜 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 12)을 포함하는 제 5 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계; 및

f) 상기 제 5 단편을 제 3 단편에 커플링시킨 후 측쇄 보호기를 제거하여 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 5)의 인슐린친화성 펩타이드를 제공하는 단계로서, 여기서 X⁸ 및 X³⁵가 Aib에 상응하는 아미노산 잔기이고, X¹⁰이 글리신에 상응하는 아미노산 잔기인, 단계

를 포함하는, 방법.
제 1 항에 있어서,

a) 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰(서열번호 6)을 포함하는 펩타이드 단편을 제조하고, 상기 펩타이드 단편을 인슐린친화성 펩타이드 내로 도입시키는 단계로서, 여기서 X⁸ 및 X¹⁰이 각각 비키랄 아미노산 잔기이거나, 또는 상기 단편이 X⁸ 및 X¹⁰ 잔기를 포함하는 그의 유사체이며, H, E, X⁸ 및 X¹⁰이 측쇄 보호기를 각각 포함하거나 포함하지 않는, 단계를 포함하는 방법.
제 1 항 또는 제 5 항에 있어서,

X⁸이 메틸 알라닌에 상응하는 아미노산 잔기인, 방법.
제 1 항 또는 제 5 항에 있어서,

X¹⁰이 글리신에 상응하는 아미노산 잔기인, 방법.
아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰(서열번호 6)을 갖는 펩타이드 단편으로서, 여기서 X⁸ 및 X¹⁰이 각각 비키랄 아미노산 잔기이고, H, E, X⁸ 및 X¹⁰이 측쇄 보호기를 각각 포함하거나 포함하지 않는, 펩타이드 단편.
제 8 항에 있어서,

X⁸이 Aib에 상응하는 아미노산 잔기이고, X¹⁰이 글리신에 상응하는 아미노산 잔기인, 펩타이드 단편.
제 5 항에 있어서,

인슐린친화성 펩타이드가 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 5) 및 그의 유사체를 포함하고, 여기 서 X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵가 입체적으로 장애된 또는 장애되지 않은 비키랄 아미노산 잔기를 각각 독립적으로 나타내고, 상기 서열의 아미노산 잔기중 하나 이상이 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 방법.
제 10 항에 있어서,

X⁸ 및 X³⁵중 하나 이상이 Aib 잔기인, 방법.
제 10 항에 있어서,

X¹⁰이 글리신 잔기인, 방법.
제 1 항에 있어서,

b) 아미노산 서열 TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 8)를 포함하는 펩타이드 단편을 제조하고, 상기 펩타이드 단편을 인슐린친화성 펩타이드 내로 도입시키는 단계로서, 여기서 X¹⁷ ^-18로 표시되는 잔기가 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기인, 단계를 포함하는 방법.
제 13 항에 있어서,

인슐린친화성 펩타이드가 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVX^17-18YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 13) 및 그의 유사체를 포함하고, 여기서 X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵가 비키랄 아미노산 잔기를 각각 독립적으로 나타내고, X¹⁷ ^-18이 슈도프롤린 잔기이며, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 방법.
제 1 항 또는 제 13 항에 있어서,

X¹⁷ ^-18이 하기 화학식 I으로 표시되는, 방법:

화학식 I

상기 식에서,

φ는 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는 임의의 아미노산의 잔기를 나타내고,

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 적합한 2가 연결 부분(moiety)이다.
제 15 항에 있어서,

φ가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는 Ser 잔기를 나타내는, 방법.
제 15 항에 있어서,

R²가 -CH₂-인, 방법.
제 15 항에 있어서,

R¹이 하기 화학식 II로 표시되는, 방법:

화학식 II

상기 식에서,

R³ 및 R⁴는 H 및 저급 알킬로부터 각각 독립적으로 선택된 1가 부분이거나; 또는

R³ 및 R⁴는 고리 구조체의 공동 구성원일 수도 있다.
제 18 항에 있어서,

R³ 및 R⁴가 각각 메틸인, 방법.
아미노산 서열 TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 8)를 포함하는 펩타이드 또는 그의 유사체로서, 여기서 X¹⁷ ^-18로 표시되는 잔기가 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이고, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 펩타이드 또는 그의 유사체.
제 1 항에 있어서,

c) 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰(서열번호 6)을 포함하는 제 1 펩타이드 단편을, 아미노산 서열 TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 8)를 포함하는 제 2 펩타이드 단편에 커플링시켜, 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVX¹⁷ ^-18YLEG(서열번호 11)를 포함하는 제 3 펩타이드 단편을 제공하고, 상기 펩타이드 단편을 인슐린친화성 펩타이드 내로 도입시키는 단계로서, 여기서 X⁸ 및 X¹⁰이 각각 비키랄 아미노산 잔기이고, H 및 E가 측쇄 보호기를 각각 포함하거나 포함하지 않고, X¹⁷ ^-18로 표시되는 잔기가 슈도프롤린의 다이펩타이드 잔기이며, 서열번호 8 및 11의 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

d) 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵(서열번호 9)를 포함하는 펩타이드 단편 또는 그의 유사체를 제조하고, 상기 펩타이드 단편을 인슐린친화성 펩타이드 내로 도입시키는 단계로서, 여기서 X³⁵가 비키랄 아미노산 잔기이고, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계를 포함하는 방법.
제 22 항에 있어서,

X³⁵가 메틸알라닌 잔기인, 방법.
제 22 항에 있어서,

e) 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵(서열번호 9)를 포함하는 펩타이드 단편 또는 그의 유사체를 아르기닌에 커플링시켜 아미노산 서열 QAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 12)을 포함하는 펩타이드 단편을 제공하는 단계로서, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 24 항에 있어서,

R이 측쇄 보호기를 포함하지 않는, 방법.
제 22 항에 있어서,

인슐린친화성 펩타이드가 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVX¹⁷ ^{- 18}YLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 13) 및 그의 유사체를 포함하고, 여기서 X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵가 비키랄 아미노산 잔기를 각각 독립적으로 나타내며, 상기 서열의 아미노산 잔기가 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않고, X¹⁷ ^-18이 슈도프롤린 잔기인, 방법.
제 22 항에 있어서,

인슐린친화성 펩타이드가 아미노산 서열 HX⁸EX¹⁰TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKX³⁵R(서열번호 5) 및 그의 유사체를 포함하고, 여기서 X⁸, X¹⁰ 및 X³⁵가 입체적으로 장애된 또는 장애되지 않은 비키랄 아미노산 잔기를 각각 독립적으로 나타내고, 상기 서열의 아미노산 잔기중 하나 이상이 측쇄 보호기를 포함하거나 포함하지 않는, 방법.
제 1 항 내지 제 7 항, 제 13 항 및 제 21 항 내지 제 25 항중 어느 한 항에 있어서,

인슐린친화성 펩타이드가 아미노산 서열 HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR(서열번호 4) 및 그의 유사체를 갖는, 방법.
제 28 항에 있어서,

인슐린친화성 펩타이드가 C-말단에서 아마이드화된(amidated) 아미노산 서열 HAibEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibR(서열번호 4) 및 그의 유사체를 갖는, 방법.
본원에 기재된 신규 방법 및 펩타이드.