KR20090013543A

KR20090013543A - Isolation of spermatogonial stem cells

Info

Publication number: KR20090013543A
Application number: KR1020070077777A
Authority: KR
Inventors: 이훈택; 엄상준; 정윤희; 양지훈
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2007-08-02
Filing date: 2007-08-02
Publication date: 2009-02-05

Abstract

본 발명은 정조 줄기 세포의 분리방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 물리적 방법만을 사용하여 정소로부터 정조 줄기 세포를 분리하는 것이다.The present invention relates to a method for isolating spermatogonial stem cells. More specifically, it is to separate spermatogonial stem cells from the testis using only physical methods.

Description

Method for isolating Spermatogonial stem cell

본 발명은 정조 줄기 세포의 분리방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for isolating spermatogonial stem cells.

실험용 쥐는 가장 광범위하게 연구된 포유류 중 하나로 광범위한 의학 관련 분야에서 백만 이상의 논문들에 사용되어 왔다. 크기, 생산력, 행동, 수술의 용이성, 조직 샘플링 등과 같은 성질들이 그것의 인기에 기여하여 왔다.(Gill, T. J., 3rd, Smith, G. J., Wissler, R. W. & Kunz, H. W. (1989) Science 245, 269-76.;Hedrich, H. (2000) History Strains and Models of The Laboratory Rat (Academic Press, San Diego.). Laboratory mice are among the most widely studied mammals and have been used in more than one million papers in a wide range of medical fields. Properties such as size, productivity, behavior, ease of surgery, and tissue sampling have contributed to its popularity (Gill, TJ, 3rd, Smith, GJ, Wissler, RW & Kunz, HW (1989) Science 245, 269-). Hedrich, H. (2000) History Strains and Models of The Laboratory Rat (Academic Press, San Diego.).

포유류 고환(testis)의 정조 줄기 세포들은 감수분열을 통하여 정자형성(spermatogenesis)의 공급원으로 작용하기 위하여 성체에서 제한없이 성장을 유지하는 세포들이다. 정조 줄기 세포들은 다음 세대로 유전자들을 유전하게 한다. 정조 줄기 세포들은 성체에서 발견되는 유일한 형태의 줄기세포들이기 때문에 그들은 인 비보 실험들, 의학 연구 및 생명공학 분야에 유용하다. The spermatogonial stem cells of mammalian testis are cells that maintain unlimited growth in the adult to act as a source of spermatogenesis through meiosis. The spermatogonial stem cells inherit the genes for the next generation. Because spermatogonial stem cells are the only form of stem cells found in adults, they are useful in in vivo experiments, medical research, and biotechnology.

특히 정조 줄기 세포들은 형질 전환 동물의 생산, 남성 불임의 치료 및 의약 개발, 인간 생식 세포 수준에서 유전자 치료를 위한 의약 개발 및 연구 및 이와 유사한 분야에 적용될 수 있다.In particular, spermatogonial stem cells can be applied to the production of transgenic animals, the treatment of male infertility and the development of medicine, the development and research of medicine for gene therapy at the level of human germ cells and similar fields.

기존의 연구에서 정조줄기세포를 분리하기 위한 방법으로는 collagenase와 DNase, typsin-EDTA를 사용하는 two-step enzymatic digestion 방법을 가장 일반적으로 사용하였다(Ogawa et al., Int J Dev Biol 41:111-122,1997).In the previous study, the two-step enzymatic digestion method using collagenase, DNase, and typsin-EDTA was most commonly used to isolate spermatogonial stem cells (Ogawa et al., Int J Dev Biol 41: 111-). 122,1997).

그러나 이러한 이 단계 효소 소화법에서 사용되는 효소들이 세포가 배양되는 과정에서 좋지 않은 영향을 끼칠 수 있다고 생각하여 효소을 전혀 사용하지 않고 물리적인 방법으로 분리하는 방법을 사용할 필요성이 존재한다.However, there is a need to use a method of physical separation without using any enzymes because the enzymes used in this two-step enzyme digestion may have a negative effect on the culture of cells.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 물리적 방법을 사용하여 정소로부터 정조 줄기 세포를 분리하는 것이다.The present invention solves the above problems, and has been made by the above necessity, the object of the present invention is to separate spermatogonial stem cells from the testis using physical methods.

본 발명의 다른 목적은 정조 줄기 세포의 배양 시스템을 최적화하는 것이다. Another object of the present invention is to optimize the culture system of spermatogonial stem cells.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 The present invention to achieve the above object

a) 포유류로부터 정소를 분리하는 단계;a) separating the testes from the mammal;

b)상기 정소의 백막(tunica albuginea)을 제거하는 단계;b) removing the tunica albuginea of the testes;

c) 상기 백막을 제거 후 세정관들을 분리하는 단계;c) separating the cleaning tubes after removing the white film;

d) 상기 세정관을 가위를 이용하여 잘게 잘라준 후, 주사기를 이용하여 잘려진 세정관 조각들로부터 세포를 단일 세포로 분리하는 단계; 및 d) slicing the scrub tube with scissors and then separating the cells into single cells from the scrub tube pieces that have been cut using a syringe; And

e) 상기 분리된 세정관 조각들을 배양액과 함께 필터링 하는 단계를 포함하는 정조 줄기 세포의 분리 방법을 제공한다.e) providing a method for separating spermatogonial stem cells comprising the step of filtering the separated pieces of the cleansing tube together with the culture medium.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 분리된 정소 세포를 배지에서 배양하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.In the present invention, the method further comprises culturing the isolated testis cells in the medium.

또한 본 발명에 있어서, 상기 배양된 세포를 계대 배양하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, further comprising the step of subcultured the cultured cells.

또한 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 방법에서 사용된 주사기의 니들 게이지의 크기는 세정관을 잘게 자르기에 적당한 크기이면 어느 것이나 바람직하고, 20∼25 게이지인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In addition, in one embodiment of the present invention, the size of the needle gauge of the syringe used in the method is preferably any size suitable for cutting the cleaning tube, most preferably 20 to 25 gauge, but is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 필터링 단계에서 사용된 여과 사이즈는 20㎛∼ 80㎛인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the filtration size used in the filtering step is preferably 20㎛ to 80㎛, but is not limited thereto.

또한 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 포유류는 인간, 생쥐, 쥐, 소, 돼지, 고양이, 말 등을 포함하고, 생쥐인 경우에는 4∼6 주령인 것이 바람직하다.In addition, in one embodiment of the present invention, the mammal includes a human, a mouse, a rat, a cow, a pig, a cat, a horse, and the like, and in the case of a mouse, it is preferably 4 to 6 weeks old.

또 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 배양 배지는 소 태아 혈청 및/또는 신경교-유래 향신경 성장인자(GDNF)와 백혈병 저해 인자를 포함하는 것이 바람직하다.In addition, in one embodiment of the present invention, the culture medium preferably contains fetal bovine serum and / or glial-derived neuronal growth factor (GDNF) and leukemia inhibitory factor.

본 발명에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명은 효소 등을 전혀 사용하지 아니하고 물리적인 방법만을 사용하여 정소로부터 정조줄기세포를 분리하여 효소 등에 의한 세포에 불리한 효과를 제거한 방법이므로 본 발명의 방법을 통하여 분리되고 배양된 정조줄기세포는 형질 전환 동물의 생산 등에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다. As can be seen in the present invention, the present invention is a method of separating the spermatogonial stem cells from the testes by using only a physical method without using an enzyme or the like and thus removing the adverse effects on the cells by enzymes and the like. The cultured stem cells are effective to be useful for the production of transgenic animals.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to non-limiting examples.

실시예 1: 정조 줄기 세포의 분리 방법:Example 1: Isolation of spermatogonial stem cells

이미 성성숙이 끝난(4~6주) 생쥐로부터 정소를 분리한 다음, 정소의 백막을 forcep을 이용하여 벗겨내었다. 백막 (tunica albuginea)을 제거하고 나면, 세정관 과 혈관이 서로 엉켜있으며, 이를 두 forceps을 사용하여 분리하고, 혈관을 제거하였다. 이 과정에서 세정관 주위를 감싸고 있는 정소의 다른 체세포들을 제거해야 한다. 깨끗이 세정관들을 분리를 한 후 수술용 가위를 이용하여 가능한 한 잘게 잘라주었다. 잘려진 세정관 조각들로부터 세포를 single 세포로 분리하기 위해 주사기를 이용한다. 이 과정에서 세정관을 주사기의 needle(22 또는 23 gauge)에 통과시킴으로써 좀 더 많은 single 세포들을 얻을 수 있었다.The testes were isolated from mice that were already mature (4-6 weeks), and the white film of the testes was peeled off using forcep. After removal of the tunica albuginea, the lavage tube and blood vessels were entangled with each other, separated using two forceps, and the blood vessels removed. This process requires the removal of other somatic cells from the testes that surround the lavage tube. After cleansing the tubes, they were chopped as much as possible using surgical scissors. A syringe is used to separate the cells into single cells from the cut lavage tube pieces. In the process, more single cells were obtained by passing the tubing through the syringe needle (22 or 23 gauge).

마지막 단계로 위에서 분리한 세정관 조각들을 배양액과 함께 60um와 40um여과기(strainer)을 차례차례 통과시켰다. 이 과정을 통해 정소의 다른 불순물이나 조각들을 분리할 수 있으며, 세포크기가 상대적으로 작은 정조줄기세포를 순수하게 분리할 수 있었다.As a final step, the scrub tube slices isolated above were passed through a 60um and 40um strainer with culture. This process allowed the separation of other impurities and fragments of the testis, and pure separation of spermatogonial stem cells with relatively small cell sizes.

실시예 2: 정조 줄기 세포의 배양조건: Example 2: Culture conditions of spermatogonial stem cells

실시예 1에서 분리한 정소의 세포를 0.1% 젤라틴이 코팅된 디쉬에서, 15% FBS( Hyclone Cat. No. 30070.03)가 첨가된 DMEM(Gibco Cat. No. 11995)을 넣고서 배양하였다. 초기 4일 동안, 세포가 서로 모여지는 것을 확인할 수 있으며, 이 모여지는 세포만을 분리하여 mitomycin C가 처리된 STO가 깔려있는 dish에 옮겨서 계대 배양하였다. 이렇게 세포가 모여서 자람으로써, 다른 정소의 세포들과 현미경하에서 구별할 수 있으며, 이 모이는 세포만을 계대 배양함으로써 안정적으로 유지되는, 배아줄기세포와 유사한 모양의 정조 줄기 세포를 순수하게 분리할 수 있다.The embodiment of the testicular cells isolated from example 1 in 0.1% gelatin-coated dish and cultured freshmen a 15% FBS (Hyclone Cat. No. 30070.03) is added to the DMEM (Gibco Cat. No. 11995) . During the first four days, the cells gathered together, and only the cells were collected and transferred to a dish coated with mitomycin C-treated STO and subcultured. Thus, the cells gather and grow, and can be distinguished from other testicular cells under a microscope, and this gathering can purely separate spermatogonial stem cells similar in shape to embryonic stem cells, which are stably maintained by passaging only cells.

상기 분리되어진 정조줄기세포를 유지하기 위해서 사용되어진 배양액과 성장인자는 다음과 같다. 배지: 15% FBS DMEM, 성장인자: 10ng/ml Glial Cell Line- Derived Neurotrophic Factor( GDNF, R&D Cat. No. 212-GD), 1000unit/ml Leukemia inhibitory factor( LIF,Chemicon Cat. No. ESG 1107)이었다.The culture medium and growth factors used to maintain the separated spermatogonial stem cells are as follows. Medium: 15% FBS DMEM, Growth Factor: 10ng / ml Glial Cell Line- Derived Neurotrophic Factor (GDNF, R & D Cat.No. 212-GD), 1000unit / ml Leukemia inhibitory factor (LIF, Chemicon Cat.No. ESG 1107) It was.

상기 실시예에 대한 사진들을 도 1에 도시하였다.Photos for this example are shown in FIG. 1.

실험예Experimental Example 1: 마우스 정조 줄기 세포 1: mouse spermatogonial stem cell 콜로니의Colony APAP 염색 dyeing

배양된 정조줄기세포의 다능성을 확인하기 위해 ALP활성을 확인하였다.ALP activity was confirmed to confirm pluripotency of cultured spermatogonia.

Alkaline Phosphatase staining kit (Sigma Cat. No. 85L2)을 사용하였으며, 고정용액으로 Citrate solurion과 acetone, 37% formaldehyde을 섞어서 제조하고, alkaline-dye 용액으로는 FBB-alkaline과 sodium nitrite, 3차 증류수, Naphthol AS-BI alkaline solution을 섞어서 제조하였다. 염색방법으로는 정조줄기세포를 PBS로 세정해준 뒤, 고정액으로 실온에서 30초간 처리하고, 3차 증류수로 45초간 가볍게 세정해 주었다. 그 다음, alkaline dye 용액으로 실온에서 약 15분간 incubation 시킨다. 해부 현미경하에서 염색결과를 확인할 수 있었다.Alkaline Phosphatase staining kit (Sigma Cat.No. 85L2) was used and prepared by mixing Citrate Solurion with acetone and 37% formaldehyde as a fixed solution. It was prepared by mixing AS-BI alkaline solution. As a staining method, the spermatogonial stem cells were washed with PBS, treated with fixed solution at room temperature for 30 seconds, and gently washed with tertiary distilled water for 45 seconds. Then, incubate with alkaline dye solution at room temperature for about 15 minutes. Staining results could be confirmed under a dissecting microscope.

실험예Experimental Example 2:정조 줄기 세포주에서 2: in spermatogonial stem cell line RTRT -- PCRPCR 에 의하여 줄기 세포 Stem cells by 마커로With marker OctOct -4와 -4 and nanognanog 를 마우스 정조줄기세포의 Mouse spermatogonia 마커로With marker Stra8Stra8 의 발현Expression of

본 발명에서 사용된 프라이머(5'→3')는 다음과 같다:Primers (5 '→ 3') used in the present invention are as follows:

1) Oct4 (Product size 312bp/ temp. 58℃/ 35 cycle )1) Oct4 (Product size 312bp / temp. 58 ℃ / 35 cycle)

Forward(서열번호 1): GGC GTT CTC TTT GGA AAG GTForward (SEQ ID NO: 1): GGC GTT CTC TTT GGA AAG GT

Reverse(서열번호 2): CTC GAA CCA CAT CCT TCT CTReverse (SEQ ID NO: 2): CTC GAA CCA CAT CCT TCT CT

2) Nanog (Product size 363bp / temp. 58℃ /35 cycle)2) Nanog (Product size 363bp / temp. 58 ℃ / 35 cycle)

Forward(서열번호 3): TGA TTC TTC CAC CAG TCC CForward (SEQ ID NO: 3): TGA TTC TTC CAC CAG TCC C

Reverse(서열번호 4): TGC ATT CTT CGG CCA GTT GReverse (SEQ ID NO: 4): TGC ATT CTT CGG CCA GTT G

3) Stra8 (Product size: 420bp/ temp. 58℃/35 cycle)3) Stra8 (Product size: 420bp / temp. 58 ℃ / 35 cycle)

Forward(서열번호 5): TCA CAG CCT CAA AGT GGC AGGForward (SEQ ID NO: 5): TCA CAG CCT CAA AGT GGC AGG

Reverse(서열번호 6): GCAACA GAG TGG AGG AGG AGT Reverse (SEQ ID NO: 6): GCAACA GAG TGG AGG AGG AGT

4) Gapdh (Product size: 320bp/ temp. 58℃/35 cycle)4) Gapdh (Product size: 320bp / temp. 58 ℃ / 35 cycle)

Forward(서열번호 7): CTCACTCAAGATTGTCAGCAForward (SEQ ID NO: 7): CTCACTCAAGATTGTCAGCA

Reverse(서열번호 8): GTCATCATACTTGGCAGGTTReverse (SEQ ID NO: 8): GTCATCATACTTGGCAGGTT

정조줄기세포로부터 전체 RNA를 Trizol Reagent( Invitrogen Cat.No. 15596-018)을 이용하여 분리하였다. cDNA를 위 primer로 합성시키기 위한 조건으로 94℃ 5분/ 94℃ 30초/ 58℃ 30초/ 72℃ 45초/ 72℃ 7분/ 4℃ 과정을 총 35 cycle을 반복하였다.Total RNA was isolated from spermatogonial stem cells using Trizol Reagent (Invitrogen Cat. No. 15596-018). As a condition for synthesizing the cDNA with the above primer, a total of 35 cycles were repeated for 94 ° C 5 minutes / 94 ° C 30 seconds / 58 ° C 30 seconds / 72 ° C 45 seconds / 72 ° C 7 minutes / 4 ° C.

실험예Experimental Example 3: 3: 다능성Versatility (( pluripotencypluripotency ) ) 마커로With marker OctOct 4에 대한 면역염색 분석 Immunostaining Assay for 4

배양한 정조줄기세포의 Oct4에 대한 면역염색 분석을 위해서 ES 세포 marker sample kit (Chemicon catalog No. SCR002)를 사용하였다. 사용된 첫 번째 antibody는 Oct4 ( monoclonal antibody / MS x Oct-4, Ig G, clone 9E3)이며, 실험방법은 다음과 같다. ES cell marker sample kit (Chemicon catalog No. SCR002) was used for immunostaining analysis of Oct4 in cultured stem cells. The first antibody used was Oct4 (monoclonal antibody / MS x Oct-4, Ig G, clone 9E3).

염색을 하기 전에 세포를 dish안에 cover glass을 넣고, 그 위에서 배양하였다. 고정은 4% PFA(4% paraformaldehyde (Sigma P6146 ) /PBS)를 이용하여 세포를 실온에서 15분간 고정시켰다. DPBS(Gibco Cat. No. 14287)를 이용하여 두 차례 washing해 주었다. 0.1% Triton X-100을 약 10분간 처리해 주었다. 10분 후, Triton X-100을 제거하고, DPBS로 한 두 차례 washing해 주었다.Before staining, the cells were placed in a cover glass in a dish and incubated thereon. For fixation, cells were fixed at room temperature for 15 minutes using 4% PFA (4% paraformaldehyde (Sigma P6146) / PBS). Washing was performed twice using DPBS (Gibco Cat.No. 14287). 0.1% Triton X-100 was treated for about 10 minutes. After 10 minutes, Triton X-100 was removed and washed once or twice with DPBS.

Blocking 용액으로는 5% BSA 가 첨가된 DPBS을 이용하며 약 30 분간 실온에서 blocking 과정을 거친다. 1차 antibody인 Oct-4를 Blocking solution에 1:50 비율로 희석시킨 뒤, 실온에서 약 1시간 동안 붙여 주었다. DPBS로 세 차례 washing을 해 준 후, 2차 antibody(Anti-mouse IgM FITC conjugate)를 붙여 주었다. 마지막으로 slide glass 위에 핵 염색을 해주는 DAPI solution이 첨가된 mounting solution (vector shield)을 한 방울 떨어뜨리고, 그 위에 염색한 세포이 있는 cover glass을 올려 주었다.As a blocking solution, DPBS with 5% BSA was used and the blocking was performed at room temperature for about 30 minutes. The primary antibody Oct-4 was diluted 1:50 in a blocking solution and then attached at room temperature for about 1 hour. After washing three times with DPBS, a second antibody (Anti-mouse IgM FITC conjugate) was attached. Finally, one drop of the mounting solution (vector shield) with DAPI solution for nuclear staining was placed on the slide glass, and the cover glass containing the stained cells was placed on it.

실험예Experimental Example 4: 4: 배상체Embryonic body (( embryroidembryroid bodybody ) 형성) formation

Feeder 세포 위에서 배양하던 정조줄기세포를 feeder 세포로부터 분리하기 위해 0.05% Trypsin-EDTA를 처리하였다. 정조줄기세포와 STO 세포이 single 세포로 다 떼어지면, 약 30분간 culture dish에 넣고, 37℃에서 배양시켰다. 이 과정을 통해 STO 세포들은 dish 바닥에 가라앉게 되며, 정조줄기세포는 배지에 서스펜젼되었다.In order to separate the spermatogonial stem cells cultured on the feeder cells from the feeder cells, 0.05% Trypsin-EDTA was treated. When spermatogonia and STO cells were separated into single cells, they were placed in a culture dish for about 30 minutes and incubated at 37 ° C. Through this process, STO cells settle to the bottom of the dish, and spermatogonia stem cells are suspended in the medium.

이 상태에서 배양액만 살짝 걷어내어서 정조줄기세포만을 분리하였다. Centrifuge를 돌린 세포를 15% FBS DMEM으로 부양시키고, 이 세포를 100mm dish 뚜껑에 20ul씩 drop을 찍어 주었다. dish에는 미리 워밍된 DPBS를 넣어준 뒤, drop을 찍은 뚜껑을 뒤집어서 덮어 주었다. 약 3일 후에 EB가 형성됨을 현미경 하에서 확인할 수 있었다.In this state, only the culture medium was gently rolled out to separate only spermatogonia. The centrifuge cells were supported with 15% FBS DMEM, and the cells were immersed in 20ul drop on a 100mm dish lid. The dish was pre-warmed with DPBS, then covered with a drop cap. After about 3 days it was confirmed under the microscope that EB was formed.

도 1은 생쥐 성숙한(adult) 정소로부터 정조 줄기 세포를 분리 및 배양한 사진이다. (A)는 성숙된 마우스 정소(strain-DBA2), (B)는 백막을 제거한 후의 정소, (C)는 정소의 세정관들, (D)는 가위로 잘게 자른 후의 세정관 조각, (E)는 주사기를 사용한 상기 세정관들의 여과, (F)는 60㎛ 나이론 메쉬를 통한 여과 후의 단일 세포, (G)는 일차 배양 3일 후 배양된 세포들이 뭉쳐서 덩어리를 형성하는 것을 나타내는 사진, (H)는 일차 배양 5일 후 AP 염색된 세포를 보여주는 사진.1 is a photograph of isolated and cultured spermatogonial stem cells from mouse adult testis. (A) mature mouse testis (Strain-DBA2), (B) testis after removal of the white membrane, (C) testicular cleansing tubes, (D) cleansing tube slices with scissors, (E) Filtration of the cleaning tubes using a syringe, (F) is a single cell after filtration through a 60㎛ nylon mesh, (G) is a photograph showing that the cultured cells aggregate after three days of primary culture to form agglomerates, (H) Photograph showing AP stained cells 5 days after primary culture.

도 2는 마우스 정조 줄기 세포 콜로니의 AP 염색을 보여주는 사진.Figure 2 is a photograph showing AP staining of mouse spermatogonial stem cell colonies.

A와 D는 마우스 ESCs의 콜로니, B와 E는 마우스 SSCs(36 계대)의 콜로니, C와 F는 마우스 SSCs(23 계대)의 콜로니를 나타내는 사진이다.A and D are colonies of mouse ESCs, B and E are colonies of mouse SSCs (36 passages), and C and F are colonies of mouse SSCs (23 passages).

도 3은 정조 줄기 세포주에서 RT-PCR에 의하여 줄기 세포 마커로 Oct-4와 nanog를 마우스 정조줄기세포의 마커로 Stra8의 발현을 확인한 사진.Figure 3 is a photograph confirming the expression of Stra8 as a marker of mouse spermatogonia stem cells Oct-4 and nanog as a stem cell marker by RT-PCR in spermatogonial stem cell line.

도 4는 다능성(pluripotency) 마커로 Oct 4에 대한 면역염색 분석을 나타내는 사진.Figure 4 is a photograph showing the immunostaining analysis for Oct 4 as a pluripotency marker.

도 5는 배상체(embryroid body)들을 형성하는 것을 나타내는 사진. A와 B는 현탁 배양 4일 후에 배상체 형성을 나타내며, C는 현적 배양(hanging drop culture) 7일 후에 배상체 형성을 나타낸다.5 is a photograph showing the formation of embryonic bodies. A and B show goblet formation after 4 days of suspension culture, and C shows goblet formation after 7 days of hanging drop culture.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Method for isolating Spermatogonial stem cell <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Oct4 <400> 1 ggcgttctct ttggaaaggt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Oct4 <400> 2 ctcgaaccac atccttctct 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nanog <400> 3 tgattcttcc accagtccc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nanog <400> 4 tgcattcttc ggccagttg 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Stra8 <400> 5 tcacagcctc aaagtggcag g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Stra8 <400> 6 gcaacagagt ggaggaggag t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Gapdh <400> 7 ctcactcaag attgtcagca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Gapdh <400> 8 gtcatcatac ttggcaggtt 20 <110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Method for isolating Spermatogonial stem cell <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Oct 4 <400> 1 ggcgttctct ttggaaaggt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Oct 4 <400> 2 ctcgaaccac atccttctct 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Nanog <400> 3 tgattcttcc accagtccc 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Nanog <400> 4 tgcattcttc ggccagttg 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Stra8 <400> 5 tcacagcctc aaagtggcag g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Stra8 <400> 6 gcaacagagt ggaggaggag t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Gapdh <400> 7 ctcactcaag attgtcagca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Gapdh <400> 8 gtcatcatac ttggcaggtt 20

Claims

a) separating the testes from the mammal;

b) removing the tunica albuginea of the testes;

c) separating the cleaning tubes after removing the white film;

d) slicing the scrub tube with scissors and then separating the cells into single cells from the scrub tube pieces that have been cut using a syringe; And

e) separating the spermatogonial stem cells, comprising filtering the separated lavage tube pieces with the culture medium.

The method of claim 1, wherein the method further comprises the step of culturing the isolated testis cells in medium.

The method of claim 1, wherein the size of the needle gauge of the syringe used in the method is 20 to 25 gauge.

The method of claim 1, wherein the filtration size used in the filtering step is 20 μm to 80 μm.

The method of claim 1, wherein the mammal is human, mouse, rat, cow, pig, horse, sheep or cat.

The method for separating spermatogonial stem cells according to claim 2, further comprising the step of subcultured the cultured cells.

The method for separating spermatogonial stem cells according to claim 2 or 6, wherein the culture medium comprises serum.

The method of claim 2 or 6, wherein the culture medium further comprises glial-derived neuronal growth factor (GDNF) and / or leukemia inhibitory factor (LIF).

The method of claim 5, wherein the mouse is 4 to 6 weeks old.