KR20090007962A - 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 검출하기 위한면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법 - Google Patents

Abstract

생시료를 NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form))와 접촉시키는 단계를 포함하는, 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 항체로 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법 및 이를 이용한 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 모노모형으로부터 고속으로 용이하게 분별 검출할 수 있도록 한다. 본 발명은 다양한 질환에 관여하는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 고속으로 검출할 수 있고, 특히 프라이온의 이질형 검출에 매우 유용하다.

모노머, 멀티머, 검출, 항체, NADPH, 금속, 캐리어, 비드, 프라이온

Description

멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법{Methods for Decreasing False Signals in Immunoassay to Detect a Multimeric Form from a Monomeric Form of Multimer-Forming Polypeptides}

본 발명은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 항체로 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법 및 이를 이용한 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법에 관한 것이다.

단백질을 구성하는 폴리펩타이드는 멀티머를 형성하여 기능적인 단백질을 이루는 경우도 있지만, 정상적인 상태에서는 모노머로 존재하다가 비정상적인 상태(예컨대, 미스폴딩형으로 전환)가 되면 멀티머를 형성하여 응집되어 질병을 유발하는 경우가 많다. 예를 들어, 알츠하이머 질환에 관여하는 Aβ 펩타이드과 tau 단백질, 스폰지폼 뇌질환에 관여하는 프라이온, 파킨슨 질환에 관여하는 α-시누클레 인, 일차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 Ig 경사슬, 이차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 혈청 아밀로이드 A, 프론토-일시적 치매에 관여하는 tau 단백질, 노인 전신성 아밀로이드증에 관여하는 트랜스티레틴, 가족성 아밀로이드 다발신경병에 관여하는 트랜스티레틴, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병에 관여하는 시스타틴 C 또는 혈투석-관련 아밀로이드증에 관여하는 β₂-마이크로글로블린이 미스폴딩형으로 전환되면 응집되어 질병을 유발하게 된다.

이와 같이, 멀티머-형성 폴리펩타이드는 질병과 관련하여 특히 중요한 위치를 차지하는 데, 이러한 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머 형태를 모노머로부터 분별적으로 검출할 수 있는 방법은 개발되지 않았다.

본 발명자들은 특정 병적 상태에 있으면 모노머형에서 멀티머형으로 전환되는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 특이적으로 검출하는 시스템을 개발하였다. 종래 본 발명자들이 개발한 멀티머 검출용 면역분석 프로토콜은 멀티머형에 대한 시그널은 대체적으로 높게 나왔지만, 오류 시그널(즉, 정상 시료에서 나오는 시그널)은 효율적으로 차단하지 못하였다. 이에, 본 발명자들은 이러한 오류 시그널을 최대한 감소시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 생시료를 NADPH와 전처리 한 후에 면역 분석을 하면 이러한 오류 시그널이 크게 감소됨을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 항체로 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 생시료를 NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form))와 접촉시키는 단계를 포함하는, 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 항체로 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 고상의 캐리어(solid phase carrier)의 표면에 포획항체를 3차원적으로 결합시켜 캐리어-포획항체 복합체를 준비하는 단계로서, 상기 포획항체는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드의 하나의 특정 에피토프에 결합하고;

(b) 검출항체를 준비하는 단계로서, 상기 검출항체가 인식하는 에피토프는 검출항체가 에피토프에 결합한 경우 상기 포획항체의 에피토프에 결합된 포획항체에 의해 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 있는 것을 특징으로 하며;

(c) 생시료를 NADPH로 전처리하는 단계;

(d) 상기 생시료에 상기 캐리어-포획항체 복합체 및 검출항체를 반응시키는 단계; 및

(e) 상기 단계 (d)에서 형성된 캐리어-포획항체-멀티머형 폴리펩타이드-검출항체 복합체를 검출하는 단계.

일반적으로 특정 항원에 대한 항체를 이용하는 면역분석에서 이론적으로는 특정 항원에 대한 시그널만이 나와야 한다. 그러나 실제적으로 면역분석을 실시하여 보면, 특정 항원이 없는 시료에서도 항원의 존재에 대한 시그널이 나온다. 이러한 오류 시그널은 면역분석의 정확성 및 재현성(reproducibility)에 크게 악형향을 미치게 된다.

본 발명자들은 특정 병적 상태에 있으면 모노머형에서 멀티머형으로 전환되는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 특이적으로 검출하는 시스템을 개발하였다. 종래 본 발명자들이 개발한 멀티머 검출용 면역분석 프로토콜은 멀티머형에 대한 시그널은 대체적으로 높게 나왔지만, 오류 시그널(즉, 정상 시료에서 나오는 시그널)은 효율적으로 차단하지 못하였다. 이에, 본 발명자들은 이러한 오류 시그널을 최대한 감소시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 생시료를 NADPH와 전처리 한 후에 면역 분석을 하면 이러한 오류 시그널이 크게 감소됨을 확인하였다.

또한, 본 발명은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 모노머형으로부터 분별적으로 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 기본적으로 항원-항체 반응을 이용하며, 에피토프에 결합된 포획항체 및 검출항체가 서로 입체적 방해를 일으켜 경쟁적 관계에 있게 되는 2종의 항체, 즉 포획항체 및 검출항체를 이용하고, 포획항체와 검출항체가 3차원적으로 분석대상의 시료와 접촉하게 되는 환경에서 실시하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 이미 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 모노머형으로부 터 분별적으로 검출하는 방법을 이미 개발하였고, 이를 멀티머 검출 시스템(Multimer Detection System: MDS)로 명명하고, PCT 출원하였다(PCT/KR2005/004001, 대한민국 특허출원 2005-0013877(2005년 2월 19일 출원)와 PCT/KR2005/000733(2005년 3월 11일 출원)에 대하여 우선권 주장). 본 발명은 본 발명자들의 MDS를 더욱 발전시킨 것으로서, MDS의 검출도 및 분별력을 더욱 향상시켰다. 본 발명의 가장 큰 특징은 포획항체와 검출항체가 3차원적으로 분석대상의 시료와 접촉하는 것이므로, 본 발명에서 제시되는 방법을 “MDS-3D(three dimensional) 시스템”으로 명명한다.

본 명세서에서 용어 “멀티머-형성 폴리펩타이드”는 응집형(aggregation form), 특히 컨포메이션의 변화에 의해 응집형을 형성할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 응집형 폴리펩타이드는 다양한 질환, 예컨대, 알츠하이머 질환, 스폰지폼 뇌질환, 파킨슨 질환, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매, 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병, 혈투석-관련 아밀로이드증, 크로이츠펠드-야곱 증후군, 헌팅톤 질환 및 타입 II 당뇨병을 유발한다. 따라서 용어 “멀티머-형성 폴리펩타이드”는 응집형-형성 폴리펩타이드와 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명은 2종의 항체, 즉 포획항체 및 검출항체를 이용한다. 용어 “포획항체”는 생시료 내의 타깃으로 하는 멀티머-형성 폴리펩타이드에 결합능을 가지는 항체를 의미한다. 용어 “검출항체”는 포획항체에 의해 포획된 멀티머-형성 폴 리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “항체”는 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 항체는 전 항체(entire antibody)뿐만 아니라, 에피토프, 항원 또는 항원성 단편에 결합능을 가지는 항체 단편(예컨대, F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv)도 포함한다.

본 발명에 따르면, 검출항체와 포획항체의 에피토프들은 여기에 결합된 항체들이 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 놓여 있는 것이다. 바람직하게는, 포획항체의 에피토프와 검출항체의 에피토프의 아미노산 서열은 동일하거나, 중첩되거나 또는 인접한 아미노산 서열을 가진다. 포획항체의 에피토프와 검출항체의 에피토프의 아미노산 서열이 동일하거나 중첩된 경우에는 여기에 결합된 포획항체와 검출항체가 서로 입체적 방해, 즉 경쟁적 결합을 하게 되는 것은 쉽게 이해할 수 있다. 또한, 상기 2종의 에피토프가 서로 인접한 아미노산 서열이라는 것은, 상술한 입체적 방해, 즉 경쟁적 결합을 유발할 수 있을 정도의 거리에 있는 아미노산 서열이라는 의미를 가진다.

본 발명의 특징 중 하나는, 고상의 캐리어(solid phase carrier)의 표면에 포획항체를 3차원적으로 결합시켜 캐리어-포획항체 복합체를 준비하는 것이다. 예컨대, 입체적 비드에 포획항체를 결합시키는 것이 이에 해당한다. 그러나 플레이트 표면 상에 포획항체를 결합시키는 것은 2차원적인 결합이므로 본 발명에서 제외된다. 이렇게 입체적으로 캐리어에 결합된 포획항체는 3차원 방식으로 생시료와 접촉하게 되며, 이는 생시료와 접촉할 수 있는 기회를 더 많이 갖도록 한다.

포획항체가 결합되는 고상의 캐리어는 입체적 구조를 가지는 어떠한 물질도 가능하며, 바람직하게는, 무게(gravity), 전하 또는 자기에 의해 쉽게 분리 또는 회수도리 수 있는 물질이다. 가장 바람직하게는, 고상의 캐리어는 자성 비드이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 검출항체에는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있거나 친화성 물질이 결합되어 있다. 상기 레이블은 효소(예컨대, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, β-글루코시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent), OLED(organic light emitting diode) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 검출을 용이하게 하기 위하여, 검출항체에 결합될 수 있는 친화성 물질은 바이오틴을 포함한다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

검출항체에 결합하는 레이블로서 방사능동위원소가 이용되는 경우에는, 본 발명의 최종 과정에서 형성된 항원-항체 복합체를 방사능을 측정함으로써 검출할 수 있다. 검출항체에 결합하는 레이블로서 발색반응을 촉매하는 효소가 이용되는 경우에는, 효소반응에 이용되는 기질을 본 발명의 측정 시스템에 첨가하여 반응 생성물을 측정하여, 항원-항체 복합체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 레이블로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용될 수 있고, 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민(OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

검출항체에 친화성 물질이 결합되는 경우에는, 이 친화성 물질에 결합하는 파트너에 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블(예컨대, 발색 반응-촉매 효소)이 결합된 물질을 이용하여 항원-항체 복합체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 바이오틴이 결합된 검출항체를 이용하는 경우에는, 스트렙타비딘이 결합된 발색 반응-촉매 효소(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)를 항원-항체 복합체에 처리한 다음, 발색 반응 기질을 반응시켜 나오는 시그널을 검출함으로써, 항원-항체 복합체를 검출하게 된다.

이러한 표지는 상기 단계 (e)에서 멀티머형 항원-항체 복합체의 검출을 용이하게 할 뿐만 아니라 정량적 분석도 가능하게 한다. 검출항체에 표지가 결합된 경우, 단계 (e)는 폴리펩타이드의 멀티머형에 결합된 검출항체의 표지로부터 나오는 신호를 측정하여 실시된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 캐리어-포획항체와 검출항체를 시료에 동시에 처리하는 것이다. 만일, 두 항체를 동시에 처리하지 않고, 포획항체를 먼저 처리한 다음 검출항체를 처리하게 되면, 유리 상태(free form)의 캐리어-포획항체는 플레이트의 표면에 고정되어 있는 항체와는 달리 멀티머형에 존재하는 다수의 에피토프에 결합함으로써, 나중에 검출항체가 에피토프(상기 포획항체에 대한 에피토프와 동일, 중첩 또는 인접한 에피토프)에 결합하는 것을 입체적으로 방해하는 문제점이 있다. 따라서 별도 처리를 하게 되면, 검출항체에 의한 시그널이 매우 미약하게 나온다. 그러나 두 항체를 동시에 처리하면, 포획항체와 검출항체가 에피토프에 서로 경쟁적인 상태에 놓이게 되며, 농도-의존적으로 두 항체가 에피토프에 결합하게 된다.

본 명세서에서 캐리어-포획항체와 검출항체를 언급하면서 사용되는 용어 “동시 처리”는 (i) 캐리어-포획항체와 검출항체 각각을 시료에 동시에 처리하는 것 또는 (ii) 캐리어-포획항체와 검출항체의 혼합 칵테일을 시료에 처리하는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 포획항체와 검출항체는 몰비 5:1-1:5로 동시에 첨가된다.

본 발명은 어떠한 멀티머-형성 폴리펩타이드도 멀티머형을 모노머형으로부터 분별적으로 검출할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 검출할 수 있는 멀티머-형성 폴리펩타이드는 알츠하이머 질환에 관여하는 Aβ 펩타이드과 tau 단백질, 스폰지폼 뇌질환에 관여하는 프라이온, 파킨슨 질환에 관여하는 α-시누클 레인, 일차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 Ig 경사슬, 이차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 혈청 아밀로이드 A, 프론토-일시적 치매에 관여하는 tau 단백질, 노인 전신성 아밀로이드증에 관여하는 트랜스티레틴, 가족성 아밀로이드 다발신경병에 관여하는 트랜스티레틴, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병에 관여하는 시스타틴 C 또는 혈투석-관련 아밀로이드증에 관여하는 β₂-마이크로글로블린이다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 검출 대상의 멀티머-형성 폴리펩타이드는 프라이온 단백질이다.

사람에 있어서 산재성 및 가족성 크로이츠펠드-야곱 증후군, 쿠루 및 게르스트만-샤잉커 증후군, 염소와 양에서의 이질, 그리고 소의 스폼지폼 뇌증은 치명적인 퇴행성 신경질환으로서, 이들은 전염성 스폰지폼 뇌질환(transmissible spongiform encephalopathies: TSE)에 기인한다(Prusiner S.B. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:13363-13383(1998); and Hope J. Curr . Opin . Genet. Dev . 10, 568-57(2000)). 프라이온 단백질의 비정상적 동형체 및 이질형(scrapie form)(PrP^sc) 및 이의 축적은 TSE의 주 요인으로 강력하게 제안되고 있다(Caughey B. Trends Biochem . Sci . 26:235-42(2001)).

프라이온 단백질의 정상형(PrP^c)은 α-사슬 및 유연하게 비정돈된 부위를 포함하며(Zahn, R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:145-150(2000)), 이질형(PrP^sc)은 많은 β-쉬트 구조를 갖고 있다(Caughey, B., et al., J. Biol . Chem. 273:32230-35(1998)). 질병 진행 과정에서 α-사슬 구조는 β-쉬트 구조로 변화되며, 이와 같은 구조의 변화는 그의 신경질환 병리에 관련이 있는 것으로 추측되며, PrP^sc는 고분자 응집체(즉, 멀티머)를 형성하는 경향이 있다(Bolton D. C. Lancet, 358:164-5 (2001)).

본 발명의 방법은 이러한 프라이온 단백질의 구조적 변화(conformation change)에 따른 멀티머형 프라이온, 즉 PrP^sc으로 형성된 멀티머의 검출에 매우 유용하다.

본 발명의 방법이 PrP^sc에 의해 형성되는 멀티머의 검출에 이용되는 경우에는, 상기 폴리펩타이드의 모노머형은 PrP^c(cellular form of prion)이고, 멀티머형은 PrP^sc으로 형성된 멀티머이다.

본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 반복되지 않는 서열(non-repeated sequence)을 에피토프로 가지는 항체를 이용하는 것이다. 만일, 항체가 인식하는 에피토프가 반복서열인 경우에는 본 발명의 방법은 모노머형으로부터 멀티머형을 효과적으로 분별하여 검출할 수 없다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 포획항체 및/또는 검출항체가 인식하는 폴리펩타이드의 에피토프는 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열이다.

본 발명에 이용되는 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511- 519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991); 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 효소 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 명세서에서 용어 “생시료(biosample)"는 검사 대상의 유기체-유래 시료를 의미한다. 생시료는 세포, 조직 또는 생체액을 포함한다. 바람직하게는, 생시료는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 밀크, 오줌, 분변, 침, 뇌추출액(예컨대, 뇌 균질액), 척수액을 포함하는 생체액이다. 보다 바람직하게는, 생시료는 뇌균질액, 혈액, 혈장이며, 가장 바람직하게는 혈장이다.

생시료가 뇌 균질액인 경우 본 발명의 방법은 생시료를 프로테아제 K 또는 트립신으로 전처리하는 과정을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다. 한편, 생 시료가 혈액 또는 혈장인 경우, 사코실(sarkosyl) 또는 Triton 계열(예컨대, Triton X-100) 디터젼트로 생시료를 전처리하는 과정을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 자성 비드의 표면에 포획항체를 3차원적으로 결합시켜 자성 비드-포획항체 복합체를 준비하는 단계로서, 상기 포획항체는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드의 하나의 특정 에피토프에 결합하고;

(b) 검출항체를 준비하는 단계로서, 상기 검출항체가 인식하는 에피토프는 검출항체가 에피토프에 결합한 경우 상기 포획항체의 에피토프에 결합된 포획항체에 의해 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 있는 것을 특징으로 하며;

(c) 생시료를 NADPH로 전처리하는 단계;

(d) 생시료에 상기 자성비드-포획항체 복합체 및 검출항체를 동시에 반응시키는 단계;

(e) 상기 단계 (d)의 결과물에 자기장을 적용하는 단계; 및

(e) 상기 단계 (d)에서 형성된 자성비드-포획항체-멀티머형 폴리펩타이드-검출항체 복합체를 검출하는 단계.

본 발명의 방법을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다: 만일, 검체에 PrP 의 다양한 형태, 즉 PrP^c 및 PrP^sc가 있는 경우, 이 검체를 포획항체가 코팅된 자성 비드와 검출항체에 동시에 적용시키면, HRP-검출항체는 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^c에는 결합할 수 없고, 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^sc에만 결합하게 된다. 이용된 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 반복되지 않는 서열을 에피토프 로 인식하는 것이다. 또한, 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 동일한, 중첩된 또는 인접한 에피토프를 인식한다. 검출항체에 의해 인식되는 에피토프는 포획항체와 이미 결합되어 있기 때문에, 이러한 에피토프를 하나만 가지고 있는 PrP^c에는 검출항체가 결합하지 않는다. 그러나, PrP^sc에 의해 형성된 멀티머형에는 동일 에피토프가 다수 존재하기 때문에 검출항체가 결합하게 된다. 항원-항체 반응 후, 자기장을 부여하여, 자성비드를 수집하고 이어 세척을 한 다음, HRP의 기질로 발색, 형광 또는 발광반응을 유도한다. 최종적으로, 상기 발색, 형광 또는 발광반응을 측정하여, PrP^sc로 구성된 멀티머-항체 복합체의 존재 또는 양을 분석한다.

본 발명의 키트의 바람직한 구현예에 따르면, 캐리어-포획항체 및 검출항체는 몰비 5:1-1:5로 칵테일 형태로 포함된다. 본 발명의 키트는, 자기장 플레이트, 완충용액, 발색효소, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 MDS-3D 시스템은 MDS-3D Single Bead 시스템 및 MDS-3D Dual Bead 시스템을 포함한다.

MDS-3D Single Bead 시스템은 상술한 바와 같이, 비드에 결합된 포획항체를 이용하는 것이며, MDS-3D Dual Bead 시스템은 포획항체 및 검출항체 모두 비드에 결합된 것을 이용하는 것이다. 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 데 있어서, MDS-3D Single Bead 시스템 보다 MDS-3D Dual Bead 시스템이 시그널의 세기의 측면에서 유리하다.

MDS-3D Dual Bead 시스템에 따르면, 상기 검출항체는 고상의 캐리어의 표면에 3차원적(즉, 입체적)으로 결합되어 있다. 이렇게 입체적으로 캐리어에 결합된 검출항체는 3차원 방식으로 그리고 보다 집중된 방식(concentrated manner)으로 멀티머형 폴리펩타이드와 접촉하게 되며, 이는 멀티머형과 접촉할 수 있는 기회를 더 많이 갖도록 한다. MDS-3D Dual Bead 시스템은 MDS-3D Single Bead 시스템 보다 요구하는 시료의 양과 항체의 양이 작은 이점이 있다.

검출항체가 결합되는 고상의 캐리어는 입체적 구조를 가지는 어떠한 물질도 가능하며, 바람직하게는, 무게, 전하 또는 자기에 의해 쉽게 분리 또는 회수될 수 있는 물질이다. 가장 바람직하게는, 고상의 캐리어는 라텍스 비드이다. 검출항체가 결합되는 캐리어에는 표지물질이 결합될 수 있다. 이와 같이 캐리어에 표지물질이 결합된 경우, 예컨대 형광물질이 있는 라텍스 비드를 이용하는 경우, 검출항체에 표지(예컨대, HRP)를 결합시키지 않아도 캐리어로부터 나오는 안정된 최종 검출 시그널(멀티머형 존재를 가리키는 시그널)을 얻을 수 있다.

MDS-3D Dual Bead 시스템은, MDS-3D Dual Bead 시스템 with Single Label 및 MDS-3D Dual Bead 시스템 with Double Label을 포함한다.

MDS-3D Dual Bead 시스템 with Single Label에 따르면, 검출항체 또는 캐리어에 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있다. MDS-3D Dual Bead 시스템 with Double Label에 따르면, 캐리어와 검출항체 둘 모두에 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있다. 이러한 이중적인 레이블링은, 캐리어로부터 나오는 시그널 및 검출항체로부터 나오는 시그널을 상호 체크가 가능하다는 이점이 있다.

MDS-3D Dual Bead 시스템 with Single Label을 설명하면 다음과 같다. 만일, 검체에 PrP의 다양한 형태, 즉 PrP^c 및 PrP^sc가 있는 경우, 이 검체를 포획항체가 코팅된 자성 비드와 검출항체에 동시에 적용시키면, Fluor-검출항체(형광물질이 결합되어 있는 라텍스 비드에 결합된 검출항체)는 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^c에는 결합할 수 없고, 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^sc에만 결합하게 된다. 이용된 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 반복되지 않는 서열을 에피토프로 인식하는 것이다. 또한, 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 동일한, 중첩된 또는 인접한 에피토프를 인식한다. 검출항체에 의해 인식되는 에피토프는 포획항체와 이미 결합되어 있기 때문에, 이러한 에피토프를 하나만 가지고 있는 PrP^c에는 검출항체가 결합하지 않는다. 그러나, PrP^sc에 의해 형성된 멀티머형 에는 에피토프가 다수 존재하기 때문에 검출항체가 결합하게 된다. 항원-항체 반응 후, 자기장을 부여하여, 자성비드를 수집하고 이어 세척을 한 다음, 형광을 측정하여, PrP^sc로 구성된 멀티머-항체 복합체의 존재 또는 양을 분석한다.

MDS-3D Dual Bead 시스템 with Double Label을 설명하면 다음과 같다. 만일, 검체에 PrP의 다양한 형태, 즉 PrP^c 및 PrP^sc가 있는 경우, 이 검체를 포획항체가 코팅된 자성 비드와 검출항체에 동시에 적용시키면, Fluor-HRP-검출항체(형광물질이 결합되어 있는 라텍스 비드에 결합된 검출항체로서 검출항체에는 HRP가 결합되어 있다)는 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^c에는 결합할 수 없고, 자성비드-포획항체에 결합된 PrP^sc에만 결합하게 된다. 이용된 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 반복되지 않는 서열을 에피토프로 인식하는 것이다. 또한, 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 동일한, 중첩된 또는 인접한 에피토프를 인식한다. 검출항체에 의해 인식되는 에피토프는 포획항체와 이미 결합되어 있기 때문에, 이러한 에피토프를 하나만 가지고 있는 PrP^c에는 검출항체가 결합하지 않는다. 그러나, PrP^sc에 의해 형성된 멀티머형에는 에피토프가 다수 존재하기 때문에 검출항체가 결합하게 된다. 항원-항체 반응 후, 자기장을 부여하여, 자성비드를 수집하고 이어 세척을 한 다음, HRP에 의한 반응 산물 및/또는 형광을 측정하여, PrP^sc로 구성된 멀티머-항체 복합체의 존재 또는 양을 분석한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)에서 생시료는 (ⅰ) NADPH 및 (ⅱ) 구리 이온, 아연 이온, 니켈 이온 및 망간 이온으로부터 선택되는 금속 이온과 접촉시킨다. 보다 바람직하게는, 상기 금속 이온은 구리 이온이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 NADPH의 처리 양은 0.4-2 mM, 보다 바람직하게는 0.8-1.2 mM이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구리 이온의 처리 양은 30-100 μM, 보다 바람직하게는 70-90 μM이다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 항체로 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법 및 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 모노모형으로부터 고속으로 용이하게 분별 검출할 수 있도록 한다. 본 발명은 다양한 질환에 관여하는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 고속으로 검출할 수 있고, 특히 프라이온의 이질형 검출에 매우 유용하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 : MDS-3D-Single Bead 시스템에 따른 혈장 내 멀티머형 PrP 검출

CuCl₂(Sigma)를 TBST 완충액에 용해하여 8 mM CuCl₂ 용액을 제조하였다. NADPH(Sigma)를 TBST 완충액에 용해하여 100 mM NADPH 용액을 제조하였다. 멀티머형 PrP가 함유되어 있는 혈장 시료, 8 mM CuCl₂ (in TBST) 및 100 mM NADPH (in TBST)를 혼합하여 프라이온 시료를 준비하였다. 이어, 시료를 간단히 볼텍싱하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 7000 x g로 1분 동안 원심분리하고 TX-100(Triton X-100) 160 ㎕를 첨가하였다. 이어, 반응용액을 간단히 볼텍싱하고, 7000 x g에서 1분 동안 원심분리하였다.

한편, 자성 비드에 포획항체를 결합시키되, 자성 비드 2.5 ㎕에 포획항체가 1 ㎍이 결합되도록 결합시켰다. 자성 비드에 결합시킨 포획항체는 3E7 단일클론항체이다. 3E7 단일클론 항체는 PrP^c의 아미노산 140-160(소 프라이온 기준)을 에피토프로 인식하는 것으로서, 상기 에피토프 서열은 PrP^c에서 반복되지 않는다.

이어, 상기 시료에 자성비드-포획항체 복합체 및 검출항체를 동시에 반응시켜 멀티머형 양 PrP를 검출할 수 있는 지 여부를 조사하였다. 검출항체로 이용한 것은, T2-HRP 이다. T2 단일클론 항체는 Hiroko Hayashi, et al., J. Vet. Med . Sci ., 66(6):515(2004)에 개시되어 있으며, PrP_{135 -140} 에피토프에 특이적으로 반응하 는 항체이다.

상기 시료에 자성비드-포획항체 복합체 및 검출항체를 동시에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 자기장을 반응 혼합물에 부여하여 자성비드를 분리하고 자성비드를 TBST로 3회 세척한 다음, ECL(enhanced chemiluminescence) 검출을 실시하였다. 실험 결과는 도 2 및 도 3에 나타나 있다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 혈장 시료를 항체와 반응시키기 전에, CuCl₂ 및 NADPH와 전반응시킨 경우, PrP^Sc에 대한 시그널은 증가하면서도 정상적인 혈장에 대한 시그널은 감소하였다. 따라서, CuCl₂ 및 NADPH의 전처리는 본 발명의 MDS-3D-Single bead system의 멀티머형 프라이온에 대한 분별력을 매우 크게 향상시킨다는 것을 알 수 있다. 또한, 혈장 시료를 전처리하기 위한 CuCl₂ 및 NADPH의 적합한 농도는 각각 80 μM 및 1 mM임을 알 수 있다.

도 3은 혈장 전처리에 있어서 NADPH의 영향을 보여주는 그래프이다. 도 3에서 볼 수 있듯이, NADPH는 혈장 내의 PrP^Sc에 대한 시그널의 세기에는 영향이 거의 없지만, 정상 혈청에서 나오는 시그널을 감소시키는 데 크게 기여를 한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이 며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1a는 본 발명자들에 의해 개발된 MDS-3D-Single Bead(Multimer Detection System-3 Dimensional-Single Bead) 시스템의 작동원리를 보여주는 개념도이다.

도 1b는 본 발명자들에 의해 개발된 MDS-3D-Dual Bead 시스템의 작동원리를 보여주는 개념도이다.

도 1c는 본 발명자들에 의해 개발된 MDS-3D-Dual Bead 시스템의 작동원리를 보여주는 개념도이다.

도 2는 혈장 시료를 CuCl₂ 및 NADPH로 전처리한 후 MDS-3D-Single Bead 시스템에 따라 PrP^Sc를 검출한 결과를 보여 준다.

도 3은 혈장 시료의 전처리에 있어서, NADPH의 영향을 보여주는 그래프이다.

Claims (40)

1. 생시료를 NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form))와 접촉시키는 단계를 포함하는, 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 항체로 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 생시료는 (ⅰ) NADPH 및 (ⅱ) 구리 이온, 아연 이온, 니켈 이온 및 망간 이온으로부터 선택되는 금속 이온과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 금속 이온은 구리 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에서 있어서, 상기 항체는 고상의 캐리어의 표면에 3차원적으로 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드는 알츠하이머 질환에 관여하는 Aβ 펩타이드과 tau 단백질, 프라이온, 파킨슨 질환에 관여하는 α-시누클레인, 일차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 Ig 경사슬, 이차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 혈청 아밀로이드 A, 프론토-일시적 치매에 관여하는 tau 단백질, 노인 전신성 아밀로이드증에 관여하는 트랜스티레틴, 가족성 아밀로이드 다발신경병에 관여하는 트랜스티레틴, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병에 관여하는 시스타틴 C 또는 혈투석-관련 아밀로이드증에 관여하는 β₂-마이크로글로블린인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 검출 대상의 멀티머-형성 폴리펩타이드는 프라이온 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 멀티머형은 PrP^Sc인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 면역분석은 검출항체 및 포획항체를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 생시료는 뇌 균질액 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 생시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 혈액 시료는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1 항에 있어서, 상기 NADPH의 처리 양은 0.4-2 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 NADPH의 처리 양은 0.8-1.2 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 3 항에 있어서, 상기 구리 이온의 처리 양은 30-100 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 다음의 단계를 포함하는 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법:

    (a) 고상의 캐리어(solid phase carrier)의 표면에 포획항체를 3차원적으로 결합시켜 캐리어-포획항체 복합체를 준비하는 단계로서, 상기 포획항체는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드의 하나의 특정 에피토프에 결합하고;

    (b) 검출항체를 준비하는 단계로서, 상기 검출항체가 인식하는 에피토프는 검출항체가 에피토프에 결합한 경우 상기 포획항체의 에피토프에 결합된 포획항체에 의해 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 있는 것을 특징으로 하며;

    (c) 생시료를 NADPH로 전처리하는 단계;

    (d) 상기 생시료에 상기 캐리어-포획항체 복합체 및 검출항체를 반응시키는 단계; 및

    (e) 상기 단계 (d)에서 형성된 캐리어-포획항체-멀티머형 폴리펩타이드-검출항체 복합체를 검출하는 단계.
16. 제 15 항에서 있어서, 상기 검출항체는 고상의 캐리어의 표면에 3차원적으로 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 15 항에 있어서, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드는 알츠하이머 질환에 관여하는 Aβ 펩타이드과 tau 단백질, 프라이온, 파킨슨 질환에 관여하는 α-시누클레인, 일차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 Ig 경사슬, 이차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 혈청 아밀로이드 A, 프론토-일시적 치매에 관여하는 tau 단백질, 노인 전신성 아밀로이드증에 관여하는 트랜스티레틴, 가족성 아밀로이드 다발신경병에 관여하는 트랜스티레틴, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병에 관여하는 시스타틴 C 또는 혈투석-관련 아밀로이드증에 관여하는 β₂-마이크로글로블린인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 검출 대상의 멀티머-형성 폴리펩타이드는 프라이온 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 상기 모노머형은 PrP^c이고, 멀티머형은 PrP^Sc인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 15 항에 있어서, 상기 포획항체의 에피토프와 검출항체의 에피토프의 아미노산 서열은 동일하거나, 중첩되거나 또는 인접한 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 15 항에 있어서, 상기 포획항체가 인식하는 폴리펩타이드의 에피토프는 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 15 항에 있어서, 상기 검출항체가 인식하는 폴리펩타이드의 에피토프는 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 15 항에 있어서, 상기 포획항체가 결합된 고상의 캐리어는 자성 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 16 항에 있어서, 상기 검출항체가 결합된 고상의 캐리어는 라텍스 비드인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 15 항에 있어서, 상기 검출항체에는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 16 항에 있어서, 상기 검출항체 및/또는 검출항체가 결합된 고상의 캐리어에는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 상기 단계 (e)는 상기 폴리펩타이드의 멀티머형에 결합된 검출항체의 표지로부터 나오는 신호를 측정하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 26 항에 있어서, 상기 단계 (e)는 상기 폴리펩타이드의 멀티머형에 결합된 검출항체-캐리어의 표지로부터 나오는 신호를 측정하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 25 항 또는 제 27 항에 있어서, 상기 검출항체에 결합된 표지는 화학물질, 효소, 방사능물질, 형광물질, 발광물질, 화학발광물질 또는 FRET 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 15 항에 있어서, 상기 생시료는 뇌 균질액 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 15 항에 있어서, 상기 생시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 혈액 시료는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 30 항에 있어서, 상기 생시료가 뇌 균질액인 경우 상기 방법은 생시료를 프로테아제 K 또는 트립신으로 전처리하는 과정을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 15 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 포획항체와 검출항체는 몰비 5:1-1:5로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 생시료는 (ⅰ) NADPH 및 (ⅱ) 구리 이온, 아연 이온, 니켈 이온 및 망간 이온으로부터 선택되는 금속 이온과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 35 항에 있어서, 상기 금속 이온은 구리 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 15 항에 있어서, 상기 NADPH의 처리 양은 0.4-2 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제 37 항에 있어서, 상기 NADPH의 처리 양은 0.8-1.2 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제 36 항에 있어서, 상기 구리 이온의 처리 양은 30-100 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제 15 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 캐리어-포획항체 복합체 및 검출항체는 생시료에 동시에 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.

Images