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KR20080107464A - 혼합된 태아-모체 소스로부터 태아 ｄｎａ 서열의 특이적 증폭 - Google Patents

혼합된 태아-모체 소스로부터 태아 ｄｎａ 서열의 특이적 증폭 Download PDF

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KR20080107464A
KR20080107464A KR1020087024444A KR20087024444A KR20080107464A KR 20080107464 A KR20080107464 A KR 20080107464A KR 1020087024444 A KR1020087024444 A KR 1020087024444A KR 20087024444 A KR20087024444 A KR 20087024444A KR 20080107464 A KR20080107464 A KR 20080107464A
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KR
South Korea
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dna
fetal
trophoblast
amplified
methylation
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Withdrawn
Application number
KR1020087024444A
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English (en)
Inventor
스테펜 브라운
Original Assignee
더 트러스티이스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 트러스티이스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 filed Critical 더 트러스티이스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
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Abstract

본 발명은 혼합된, 태아-모체 소스로부터 태아 DNA 서열을 선택적으로 증폭하는 방법을 제공한다. 이 방법은 비-영양막/태아 DNA를 고농도로 포함하는 DNA 혼합물로부터 영양막/태아 DNA 특정 서열을 선택적으로 증폭시키도록 하는 특이적인 메틸화를 이용한다. 본 발명은 또한 이수배수체 검출을 위해 증폭된 태아 DNA 서열을 이용하는 방법을 제공한다.
태아 DNA, 증폭, 영양막, 이수배수체

Description

혼합된 태아-모체 소스로부터 태아 ＤＮＡ 서열의 특이적 증폭{SPECIFIC AMPLIFICATION OF FETAL DNA SEQUENCES FROM A MIXED, FETAL-MATERNAL SOURCE}
본 발명은 혼합된, 태아-모체 소스로부터 태아 DNA 서열을 선택적으로 증폭하는 방법을 제공한다. 이 방법은 비-영양막(non-trophoblast)/태아 DNA를 고농도로 포함하는 DNA 혼합물로부터 영양막(trophoblast)/태아(fetal)의 특정 서열을 선택적으로 증폭하기 위해 특이적 메틸화(methylation)를 이용한다. 본 발명은 또한 이수배수체(aneuploidy) 검출을 위해 증폭된 태아 DNA 서열을 이용하는 방법을 제공한다.
많은 연구들은 신생아에서 전체-염색체 이수배수체의 발생은 1 내지 2% 사이라고 보고 있다(Hsu, In: A. M. (ed) Genetic Disorders and the Fetus, pp 179-248) (1998)). 이런 염색체 이상은 장기간 생존자들에게 있어 심각한 발달 지연의 주요 원인일뿐만 아니라, 산전 이환율(morbidity) 및 사망률(mortality)의 중대한 원인으로 나타난다. 일반적인 삼염색체의 산모 나이 의존성 및 평균 산모 나이의 증가를 가정하면, 이수배수체 스크리닝의 중요성이 지속적으로 증가할 것이 분명하다. 임신기간 동안 이수배수체 검출을 위한 신뢰성 있고, 경제적이며 비-침투적인 방법이 강하게 요구된다.
이수배수체 검사를 위한 최근의 옵션들은 불충분하다. 현재, 융모막 융모 검사(chorionic villus sampling, "CVS") 또는 양수천자(amniocentesis)에 의한 침투적인 검사방법(invasive testing)은 35세 이상의 모든 여성들 및 이수배수체의 고위험군으로 알려진 여성들에게 선택방법으로 제공되고 있다. 이와 같이 대다수의 여성들은, 이들 카테고리에 해당하지 않기 때문에, 침투적인 검사방법을 제의 받지 않고 있다. 대부분의 아이가 35세미만의 여성에 의해 출산되며, 35세 여성 250명 중 약 1명에서만 양수천자에 의해 삼염색체성(trisomy)이 발견될 수 있기 때문에 산모 나이는 스크리닝 검사방법으로는 기능이 부족하다. 지난 20년에 걸쳐, 21번 삼염색체("T21")를 위한 모체 혈청 스크리닝(maternal serum screening)의 효율은 크게 향상되어왔다. 현재 초음파뿐만 아니라 두 임신시점의 모체 혈청을 이용한 최첨단 스크리닝은 5%의 위양성비율(false positive rate)을 갖는 T21의 검출을 위한 ~95%의 "민감도(sensitivity)"를 갖는다. 예를 들어, Wald N. J., et al. 111:521-31.(2004)을 참고한다. 그러나, 이 유형의 검사에는 세가지 주요 결점이 있다. 첫째, 이 검사는 진단이 아니라, 다운증후군(Down syndrome)의 가능성을 제공한다는 점이다. "양성(positive)" 결과는 35세이상의 여성에서 다운증후군의 위험성으로 정의된다. 그러므로 "양성" 결과를 갖는 대부분의 여성들은 실제로 발견되는 다운 증후군의 가능성은 여전히 1% 이하임을 고려하여야 한다. 둘째, 이 검사는 21번 및 18번 삼염색체에 국한된다. 세번째 문제는 단지 95%의 민감도라는 점이다. 이 같은 검사방법에서의 95% 민감도는 공중 보건(public health) 측면에서는 큰 수치이나, 많은 환자들에게 있어서 T21을 놓칠 5%의 가능성은 용납될 수 없는 일이다. 훨씬 더 높은 양성의 예상 수치와 더 높은 민감도를 갖는 비-침투적인 검사(non-invasive test)가 분명하게 환자들에게 더욱 유용할 것이며, 기존의 스크리닝 방법을 즉시 대체하여 이용가능하게 될 것이다.
약 12년 전 시작된, 모체 혈액 내 다양한 혈통의 태아 세포의 입증은 큰 흥미를 야기했다. 모체순환(maternal circulation)으로부터 이런 세포들을 정제하기 위한 기술은 발전하였고, 산전 진단(prenatal diagnosis)의 다수의 조건의 적합성이 입증되었다. 그럼에도 불구하고, 이런 방법들은 실용적이지 못하였다. 이는 거의 태아 세포의 부족 및 이것을 정제하는 문제 때문이다. Bianchi, D.W., et al, Br. J. Haematol. 105:574-83 (1999).
최근의 많은 논문들은 유리 태아 DNA(free fetal DNA)가 첫 3개월의 초기에 시작하여 출산까지 계속되는 사실상 모든 임신기간에서 모체 혈장(maternal plasma)에 존재한다고 보고하고 있다. Bischoff, F.Z., et al., Hum. Reprod. Update 11:59-67 (2005). 다양한 연구들은 태아의 성별(sex)이 모체 혈장 유래 DNA에서 Y 염색체 특이적 서열의 증폭을 통해 결정될 수 있다고 보고 있으며, 다른 보고서들은 태아 Rh 혈액군 유전자형(genotype)도 마찬가지로 결정될 수 있다고 기술하고 있다. 모체 혈장의 태아 DNA의 절대량은 많지 않으며, 이는 회복 기술뿐만 아니라 재태기간에 의존한다. 정량 PCR에 기초한 추정량은, 임신연령 및 다른 파라미터에 의존하는 전혈 ml 당 태아 DNA의 50-200 게놈 당량(equivalent)의 동량일 수도 있다고 추측한다. Bischoff et al. 2005 Hum Reprod Update 11:59-67). 모체 혈장 유래 DNA의 기원 역시 분명하지 못하다. 많은 연구자들은 대부분의 조직 이 모체순환과 거의 접촉하고 있기 때문에, 영양막(trophoblast)으로부터 유래했을 것이라고 추정하고 있다. 이에 대한 직접적인 증거는 Y 염색체 이상을 위한 태반 모자이크현상(placental mosaicism)을 확인한 단일 간행물에서 유래한다. Flori E, et al., Case report. Hum. Reprod. 19:723-4 (2004). 모체 혈장내 태아 DNA의 존재 설명에 대한 초기의 성공에도 불구하고, 일반적인 삼염색체의 존재 결정과 같은 산전 진단의 주요한 문제는 모체 혈장 유래 DNA를 사용하여 수행되지 않았다는 점이다. 이것은 모체 혈장내 태아 DNA가 모체 DNA와 혼합물로 존재하며, 모체 성분이 일반적으로 더 많다는 사실 때문이다. 태아 대 산모 DNA 비율은 샘플에서 샘플에 따라, 또는 방법에서 방법에 따라 상당히 달라지는 것처럼 보인다. 최소로, DNA양의 약 1%, 그리고 최대로 더 커질 수 있을 수 있다. Benachi A, et al., Clin. Chem. 51:242-4 (2005). PCR은 DNA의 아주 작은 양을 증폭하는 데 사용할 수도 있지만, 태아 DNA를 선택적으로 증폭하기 위한 일반적인 방법은 아니다. 태아 및 엄마에게 일반적인 서열을 증폭하기 위한 임의의 노력은 산모의 서열만을 증폭하는데 성공할 것이다. 그러므로, 모체에는 존재하지 않는 서열(Y 염색체와 같은)에 특이적인 프라이머의 사용을 통하여, 태아 서열의 선택적인 증폭이 수행되어 왔다. 물리적 분리 기술은 혈장 유래 DNA의 태아 성분의 비율을 증가시키기 위해 사용되어왔다. Li Y, et al., Jama 293:843-9 (2005); Li Y, et al., Prenat. Diagn. 24:896-8 (2004a); Li Y, et al., Clin. Chem. 50:1002-11. 그럼에도 불구하고, 이런 기술들은 일상적인 산전 진단을 하기 위한 충분한 순도(purity)의 태아 DNA를 생산하기 위한 가능성이 없다.
임신한 여성의 자궁목에서 얻은 샘플은 태아 세포를 포함하는 것으로 보여지고 있으며, 이는 비침투적 산전 진단을 위해 사용될 수 있는 태아 DNA의 다른 잠재적인 소스로 보여진다. 이 주제에 관한 논문들은 두가지 이슈에 집중되고 있다: 1) 자궁목에서부터 회수하는 태아 세포의 신뢰도(reliability)와 이를 향상시키기 위한 방법, 및 2) 모체 세포의 큰 백그라운드(background)로부터 태아 세포를 분리하는 방법. 다양한 산전 진단이 태아 세포 및 자궁경부 샘플로부터 유래된 DNA를 이용하여 수행될지라도, 이런 이슈들 모두는 이 아이디어의 일상적인 사용에의 중요한 장애로 남아있다. 가장 많이 보고된 산모 자궁경부 샘플에서 얻은 태아 세포의 성공율은 82%이며, 이것은 식염수 점적의 반-침투적 기술을 사용한 때이다. Cioni R, et al., Prenat. Diagn. 25:198-202 (2005). 형태적 방법(Tutschek B, et al., Prenat. Diagn. 15:951-60 (1995); Bussani C, et al., MoI. Diagn. 8:259-63 (2004)) 및 면역방법(Katz-Jaffe M.G., et al., Bjog 112:595-600 (2004)) 모두 모체 세포로부터 태아를 분리하기 위해 사용되어 왔으며, 둘 모두 태아 세포의 퍼센트를 증대시키기 위한 것으로 보여진다. 그러나, 이들 방법으로 얻어진 DNA는 모체 DNA로 크게 오염될 수 있다. 또한, 대규로 또는 체계적인 연구도 보고된 바 없다.
분명히, 모체 DNA와의 혼합물일 때, 영양막(및 태아) DNA 서열의 검출 및 분석을 하게 하는 방법은 매우 유용할 것이다. 모체 혈장이나 자궁경부목(uterine cervix) 둘 중 하나에서 유래된 샘플은 모체 및 태아 세포 또는 DNA의 광범위한 물리적 분리없이 태아 분석에 직접적으로 사용될 수 있을 것이다. 대안적으로, 태아 DNA 농축을 위한 물리적 방법은 둘의 이익을 증대하기 위하여 영양막/태아 특이 증폭과 결합될 수 있을 것이다. 그러므로, 이것은 혼합된 태아/모체 DNA 소스로부터 얻어진 태아 DNA의 선택적인 증폭을 제공하는 방법을 위한 필요로 남아 있다. 본 발명은 이들의 요구를 충족한다.
발명의 요약
본 발명은 혼합된 태아/모체의 DNA 샘플에서 DNA를 추출하는 단계; 메틸화 특이 효소로 DNA를 절단(digesting)하는 단계; 링커로 절단된 DNA를 리게이션(ligating)하는 단계; 절단된 DNA를 링커-매개 PCR 증폭하여 증폭된 PCR 생성물을 얻는 단계; 증폭된 생성물로부터 링커 및 프라이머 DNA를 제거하는 단계; 증폭된 PCR 생성물을 원형화(circularizing)하는 단계; 원형화된 PCR 생성물을 엑소뉴클라아제 절단(digestion)하여, 비원형화된 DNA를 단일 뉴클레오티드로 환원시키는 단계; 및 생성물을 등온 롤링 원형 증폭(isothermal rolling circle amplification)하여 선택적으로 태아 DNA를 증폭하여, 태아 DNA로부터 메틸화-민감성 표현형을 생산하는 단계를 포함하는, 혼합된 태아 및 모체 DNA 샘플로부터 태아 DNA를 선택적으로 증폭하는 방법을 제공한다.
임의의 메틸화 특이 효소가 사용될 수 있으며, 효소 HpyChIV-4, ClaI, AclI 및 BstBI가 바람직할 수 있다. 바람직한 양태로, 링커 매개 PCR 증폭은 12주기 수행된다. 또한, 바람직한 양태로서, Bal-31에 의한 엑소뉴클라아제 절단(exonuclease digestion)이다.
본 발명은 또한 위에서 언급한 태아 DNA의 선택적인 증폭 방법을 이용하여 태아 DNA 및 전혈 DNA로부터 메틸화-민감성 표현형들을 분리하여 준비하는 단계; 태아 DNA 및 전혈 DNA를 라벨링하여 라벨링된 태아 DNA 프로브 및 라벨링된 전혈 DNA 프로브를 생산하는 단계; 라벨링된 DNA 프로브를 올리고뉴클레오티드의 두개의 동일한 어레이(array)에 혼성화 하는 단계로서, 상기 뉴클레오티드 어레이는 주어진 메틸화-민감성 효소에 대하여 예측되는 제한 단편(restriction fragments)에 상응하는 것인 단계; 및 두개의 어레이를 서로 비교하여 태아 DNA 프로브에 배타적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 발견하는 단계; 및 단계 d)에서 얻은 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 태아-특이 엠플리콘으로 동정하는 단계를 포함하는, 태아-특이 엠플리콘을 동정하는 방법을 제공한다. 다른 실시예로서, 태아 DNA 프로브 및 전혈 DNA 프로브는 두개의 다른 라벨로 라벨링되며, 이는 라벨링된 프로브의 혼성화가 단일 어레이에서 수행되게 한다. 라벨은 플루오로크롬(fluorochrome)일 수 있다.
바람직한 실시예로서, 선택적인 증폭에 사용되는 메틸화 민감성 효소는 HpyCh4-IV이다.
태아 DNA는 바람직하게는 임신 첫 3개월에서 얻어지며, 더욱 바람직하게는 임신 약 56 - 84일에서 얻어진다.
본 발명은 또한 위에서 언급한 방법에 의해 생산되는 태아-특이 엠플리콘의 라이브러리(library)를 제공한다. 본 발명은 또한 태아-특이 엠플리콘의 라이브러리를 포함하는 어레이(array)를 제공한다.
본 발명은 또한 태아 및 모체의 DNA 혼합물에서 미리 결정된 유전자좌(predetermined locus)에서 정상 카피수(copy number)에 비교시 태아 DNA의 미리결정된 유전자좌의 카피수의 증감여부를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 위에서 언급한 태아 DNA의 선택적인 증폭법을 이용하여 시험 샘플 및 대조 샘플내에 태아 DNA의 미리 결정된 유전자좌를 선택적으로 증폭하는 단계를 포함한다. 대조 샘플은 태아 DNA의 미리 결정된 유전자좌에서 정상 카피수를 갖는다. 다음으로, 시험 샘플의 증폭된 DNA의 양과 대조 샘플의 증폭된 DNA양을 비교하는 단계; 및 감소된 카피수에 대한 증폭된 DNA의 감소 양, 또는 카피수 증가에 대한 증폭된 DNA의 증가량의 상관성을 파악하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예로서, 상기 비교는 시험 샘플 및 대조 샘플에서 동일한 카피수로 존재하는 미리 결정된 유전자좌로부터의 증폭된 DNA를 대조 유전자좌로부터 증폭된 DNA로 정상화(normalization)하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 전술된 태아 DNA의 선택적인 증폭방법을 이용하여 시험 샘플 및 대조 샘플의 태아 DNA를 선택적으로 증폭하는 단계로서, 상기 대조 샘플은 미리 결정된 유전자좌에서 정상 카피수를 갖는 것인 단계; 상기 a)단계에서 얻은 시험 샘플의 DNA 및 대조 샘플의 DNA를 라벨로 라벨링하여, 라벨링된 시험 DNA 프로브 및 라벨링된 대조 DNA 프로브를 얻는 단계; 라벨링된 시험 DNA 및 라벨링된 대조 DNA 프로브를 위에서 언급한 태아-특이 엠플리콘의 어레이에 혼성화하는 단계; 시험 DNA 프로브 및 대조 DNA 프로브간 혼성화 양을 비교하여, 신호 강도를 결정하는 단계; 및 시험 샘플의 미리 결정된 유전자좌에서 카피수의 증가 또는 감소에 대한 신호 강도의 상관성을 파악하는 단계를 포함하는, 시험 샘플에서 정상 카피수와 비교시 미리 결정된 유전자좌 카피수의 증감여부를 결정하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 시험 샘플 DNA와 대조 샘플 DNA는 두개의 다른 프로브로 라벨링되어 하나의 어레이에서 혼성화가 이루어진다.
도면의 간단한 설명
도 1은 여러 효소로 절단된 혈액 및 영양막/태아 DNA의 에티디움 염색(ethidium-stained) 아가로오즈 겔 전기영동을 나타낸다. "B" 및 "T" 는 각각 혈액 및 영양막/태아 샘플을 나타낸다. 수평의 백색선은 약 1500bp의 분자량을 나타낸다.
도 2는 링커 매개 증폭화의 대표적 실시예를 보여준다. 맨위의 패널은 4개의 다른 샘플의 모체 혈청(maternal serum)으로부터 정제된 DNA의 링커 매개 PCR를 나타낸다. 24주기 이후의 생성물을 보여준다. 맨 아래 패널은 모체 혈청으로부터 정제된 DNA의 링커 매개 PCR을 나타내고 있다. 20주기 이후의 생성물을 보여준다. 레인 1 및 레인 2는 포름알데히드 없이 수집된 것이며, 레인 3 및 레인 4는 포름알데히드를 포함한 튜브에서 수집된 것이다.
도 3은 AclI로 절단된 영양막/태아 및 혈액 DNA의 증폭된 표현형들을 보여주는 겔이다. 레인들은 다음과 같다: 1) 마커(marker); 2) 영양막/태아; 및 3) 혈액. 레인 4 및 레인 5는 링커 리게이션 단계 동안 리가아제를 사용하지 않는 것을 제외하고는 2 및 3의 경우와 같다. 백색선은 클로닝을 위해 절단된 부분을 나타낸다.
도 4는 특이적 AclI 엠플리콘을 위한 프라이머를 이용한 PCR의 결과를 보여준다. 특이적 AclI을 위한 프라이머를 이용한 PCR은 영양막/태아 및 혈액 DNA의 동일하게 제조된 12가지 표현형들에서 수행된다. 4가지 프라이머 세트의 결과를 나타낸다. 영양막/태아 "특이적" 프라이머 세트와 같은 총 10가지가 동정되었다. "T" 및 "B"는 각각 영양막/태아 및 혈액으로부터 유래한 주형을 나타낸다.
도 5는 영양막/태아 및 혈액 DNAs의 Ba1-31 처리된, 등온 증폭된 표현형들에서 영양막/태아 특이 프라이머 세트를 사용한 PCR 생성물을 나타낸다. 각각의 쌍("T" 및 "B")은 영양막/태아 및 혈액 표현형들에서 하나의 프라이머 세트의 결과이다. 맨위의 패널은 PCR 22 주기 이후의 모두 6개의 영양막/태아의 가시적 생성물 및 혈액 샘플의 비가시적 생성물을 나타낸다. 하단은 35 주기 이후의, 프라이머 1 및 2가 혈액 표현형으로부터 가시적 생성물을 가짐을 나타낸다.
도 6은 영양막/태아-특이 엠플리콘에서 유용한 SNP를 포함하는 PCR 생성물의 서열을 보여준다. 패널 A는 투입 혈액 DNA로부터 유래한 것이다. 패널 B는 투입 영양막/태아 DNA로부터 유래한 것이다. 패널 C는 두가지 투입 DNA의 20:1 혼합물로부터 유래한 것이다. 패널 D는 혼합된 DNA 샘플의 메틸화-민감성 증폭화된 표현형으로부터 얻은 것이다. 이것은 영양막/태아 DNA에 존재하는 헤테로 접합체의 SNP가 단지 5%로 존재함에도 불구하고 분명히 증폭되며, 따라서 출발 혼합물에서는 감지할 수 없다는 것을 나타낸다.
도 7은 20:1 혼합물로부터의 이러한 증폭뿐만 아니라, 두개의 출발 DNA의 PCR 생성물을 보여준다. 영양막/태아-특이 AclI 엠플리콘에서 증폭된 CA 반복(repeat) 다형성(polymorphism) 프라이머는 두가지 DNA의 혼합물에서 선택적인 증폭을 보여주기 위해 사용된다. 패널 A는 유전자형 198/202를 갖는 투입-전혈 DNA이다. 패널 B는 유전자형 196/196를 갖는 투입 영양막/태아 DNA이다. 패널 C는 유전자형 198/202를 갖는 20:1 혼합물이다. 패널 D는 전혈 DNA로 95% 오염도를 가짐에도 불구하고 얻어지는 영양막/태아 유전자형을 보이는 20:1 혼합물의 메틸화 민감성 증폭이다.
도 8은 Lucito et al. Genome Res 13:2291-305 (2003)에 의해 기술된 마이크로어레이(microarray)의 데이타를 나타낸다. 각 포인트는 유리 어레이상에 점적된 10,000 올리고들로부터의 세기의 log10 평균 비율과 혼성화된 정도를 나타낸다. 내부의 HindⅢ 자리를 갖는 BglⅡ절편을 나타내는 모든 주소는 훨씬 왼쪽에 위치한다. 내부 HindⅢ 자리를 갖는 절편들의 평균 비율은 일반적으로 1 :1 (100)초과이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 혼합된, 태아-모체 소스로부터 태아 DNA 서열의 특이적 증폭을 위한 방법을 제공한다. 일반적으로 본 방법은 혼합된 태아-모체 소스로부터 DNA를 분리하는 단계; 분리한 DNA를 링커-매개 PCR시키는 단계; 증폭된 PCR 생성물을 원형화하는 단계; 엑소뉴클라아제 절단 단계; 및 마지막으로 등온 롤링 원형 증폭(isothermal rolling circle amplification)하는 단계를 포함한다.
DNA는 혼합된 태아-모체 소스의 DNA로부터 얻어질 수 있다.
DNA의 태아-모체 소스(Fetal-maternal source of DNA)
융모막 융모 검사(Chorionic villus sampling, "CVS") 및 양수천자(amniocentesis)와 같은 침투적인 방법은 산전 진단(prenatal diagnosis)을 위해 사용될 수 있는 순수한 태아 DNA를 제공할 수 있다. 이런 방법들은 일반적으로 사용됨에도 불구하고, 위험을 수반한다. 반면, 태아 DNA를 얻기 위한 여러 비-침투적인 방법(non-invasive route)이 존재한다: 모체 혈장내에 존재하는 세포 유리 DNA의 회수 및 산모 자궁경부(maternal uterine cervix)에서 박리된 태아 세포의 회수에 의함. 그럼에도 불구하고, 일상적인 산전 진단을 위해 태아 DNA를 사용하기 위한 노력은 산모 DNA와의 혼합물내에 태아 DNA가 존재한다는 사실에 의해 억제되어왔다.
본 발명의 방법은 혼합된 태아/모체 DNA 샘플로부터 태아-특이적 서열을 증폭시키기 위해 태아와 모체 DNA의 DNA 메틸화(methylation) 차이를 이용함으로써 태아-모체 DNA 혼합물의 이용을 가능하게 하였다. 이러한 메틸화 차이의 장점을 이용함으로써, 본 발명은 태아 및 모체 DNA의 혼합물로부터 태아 서열의 선택적인 증폭 방법을 제공한다. 그러므로 이 방법은 모체 혈장(maternal plasma) 또는 자궁경부 도말(cervical swab)에서 유래된 DNA의 일반적인 염색체 이상과 같은 산전 검사 수행의 가능성을 제시한다.
위에서 논의한 바와 같이, 본 발명은 태아 및 모체 DNA간 메틸화(methylation)의 차이에 의한 것이다.
태아 및 산모 DNA의 메틸화 차이-영양막(trophoblast)/태아 DNA의 저메틸화(hypomethylation)
DNA 메틸화(methylation)는 변화된 유전자 발현에 의해 세포 기능이 변화하는 후성적인 사건(epigenetic event)으로, CpG 디뉴클레오티드(dinucleotide)의 시토신의 5번째 탄소에, DNA 메틸트랜스퍼라제(methyltransferase, DNMT)에 의해 촉매된, 메틸기의 공유 첨가를 말한다. DNA 메틸화 분석 방법은 두가지 타입으로 나눌 수 있다: 전체적인 것과 유전자-특이적인 메틸화 분석. 포유동물 DNA의 메틸화 양상은 태아 발생동안 드라마틱한 변화를 겪는다. 양 모계와 부계 유전자가 수태되는 시점에 대규모로 메틸화되는 것으로 여겨지고 있다. 초기 소수의 세포가 분화되는 과정동안, 이 메틸화는 상당히 "말소"되며, 이후 착상시점까지 과메틸화가 이루어지고 메틸화의 상당수가 다시 존재하게 된다. Bird A, Genes. Dev. 16:6-21 (2002). 연구되어 온 모든 성체 조직(adult tissues)에서, CpG 디뉴클레오티드의 많은 퍼센트(85%까지)가 메틸화된다. Gruenbaum Y, et al., FEBS Lett 124:67-71 (1981).
어떤 서열이 메틸화되었는지에 대한 지식은 현재 미완성이며 1980년대 이루어진, DNA의 메틸화 및 비-메틸화 민감성 절단(digestion)의 비교와 같은 단순한 기술에 의한 연구들에 기초한다. Bird AP (1980) Nucleic Acids Res. 8:1499-504 (1980). 메틸화 및 유전자 발현 조절에서의 이의 역할에 대한 최근의 관심은 상당히 고조되고 있다. 게놈 DNA의 메틸화에 대한 모든 문헌들은 간 및 전혈(whole-blood)과 같은 성체 소스 또는 태아로부터 유래된 샘플에 기초한다. 오늘날까지 영양막/태아와 같은 배외조직(extra-embryonic tissue)에서의 메틸화에 대한 체계적인 연구는 없었다. 프래더-윌리 증후군(Prader-Willi Syndrome) 및 프래자일 엑스 증후군(fragile X Syndrome)과 같은 질환을 위한 산전 진단을 수행하는 과정에서, 영양막/태아 DNA는 혈액, 간 또는 피부에서 유래된 DNA와 비교하여 상대적으로 저메틸화(hypomethylated)된다는 것이 밝혀졌다. Iida T., Hum. Reprod. 9:1471-3 (1994). 이 차이는 메틸화 민감성제한 효소를 사용하는 서던 블럿(Southern blots)을 수행할 때 가장 분명해진다. 대부분의 포유동물 DNA가 4개의 염기 인식 서열(예를 들어, HpaII)을 갖는 메틸화 민감성 제한 효소로 절단될 때, DNA의 대부분이 고분자량(high molecular weight)으로 남게 된다는 것을 볼 수 있다. 단편들의 평균 분자량은 15 kb 초과인 반면, HpaII의 예상 빈도는 평균 단편 크기보다 훨씬 작은 것으로 예상된다. 이런 절단물들(digests)을 보면(도 1 참조), HpaII 자리의 적어도 80%가 잘리지 않았다는 것을 추측할 수 있다. 도면에서 인식할 수 없을 지라도, 아가로오즈의 고농도 겔을 흘려보면, 한군은 꽤 작고 다른 군은 꽤 큰, 단편들의 두가지 분포양상은 자명하다. 이러한 관찰들은 기본적으로 1983년 보고된, 소위 "HpaII Tiny Fragment" 또는 "HTF 섬(islands)"의 발견의 재현이다. Cooper D.N., et al., Nucleic Acids Res. 11:647-58 (1983). MspⅠ(HpaII와 동일한 인식 서열이나 메틸화 민감성 아님)로 동일한 DNA를 절단시키면, 단편의 평균 분자량은 예상된 크기에 훨씬 가깝다. 그러나, 첫 3개월 영양막/태아로부터 준비된 DNA를 사용하는 동일한 실험에서도 상당히 다른 결과를 얻었다. MspⅠ절단에 의해 얻어진 것과 여전히 동일하지 않을지라도, HpaII로 절단된 영양막/태아 DNA의 평균 분자량은 확연히 감소된다. 이것은 영양막/태아로부터 준비된 DNA가 상대적으로 저메틸화(적은 메틸화)된다는 것을 확실히 보여주며, 저메틸화된 영역은 CpG 나 "HTF" 섬보다 유전자 전체를 통틀어 광범위하게 분포되고 있음에 대한 중요한 예측을 확실히 한다.
전혈(whole-blood) DNA에 비해 영양막/태아 DNA에서의 저메틸화의 정도를 확실하게 결정하는 것은 어려운 일이지만, HpyChIV-4 효소(도 1의 것과 유사)를 사용한 영양막/태아 대 전혈 DNA의 절단으로 측정된 농도(densitometru)는 500 -1,000 bp의 단편 범위에서, 결과 도말의 밀도가 영양막/태아 샘플에서 일관하여 2-3배 높다는 것을 보여준다. 이것은 이 크기 범위내에서, HpyCh4-IV로 절단된 영양막/태아 DNA가 전혈 DNA보다 2 내지 3배 많은 단편들을 포함하는 것을 암시한다.
영양막/태아 및 전혈 유래 DNA간의 메틸화 차이에 의존하는 재태기간(gestational age)에 대해서 정확히 조사되지 않았다. 재태기간 9주부터 20주까지 범위의 10개 샘플에서, HpaII 및 HpyCH4-IV로 처리된 절단(digestion)의 차이는 확인되지 않았다. 그러나 프레더-윌리 및 프레자일 X 유전자좌의 메틸화 민감성 서던 블롯 분석을 수반한 실험은 중간 두번째 3개월까지, 처음 3개월에서보다 영양막/태아 DNA의 메틸화가 더 일어날 수 있음을 나타낸다. 그러므로 바람직하게는 혼합된 DNA 샘플은 10-13주의 임신기간에서 얻어진다(LMP에 의함).
그러므로 본 발명에 따른 방법은 위에서 논의한 태아 DNA와 모체의 DNA간의 메틸화 차이를 이용하여 혼합된 태아와 모체의 DNA 샘플로부터 태아 DNA를 선택적으로 증폭하는 방법을 제공한다. 앞서 언급한 바와 같이, 일반적으로 이 방법은, 혼합된 태아-모체 소스로부터 DNA를 분리하는 단계; 분리한 DNA를 링커-매개 PCR 시키는 단계; 증폭된 PCR 생성물을 원형화하는 단계: 엑소뉴클라아제 절단 단계: 및 최종 등온 롤링 원형 증폭하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 분리한 DNA를 링커-매개 PCR 시키는 단계를 포함한다.
링커-매개 PCR(Linker-mediated PCR)
일반적으로 링커-매개 PCR은 제한효소로 DNA를 절단하고, 이중 가닥 링커를 절단된 말단에 리게이션함으로써 시작된다. 그리고 나서 PCR은 링커에 대응되는 프라이머와 약 1.5 kb이하의 단편들로 수행되어 증폭된다. Saunders, R.D., et al., Nucleic Acids Res. 17:9027-37 (1989) 및 Lisitsyn, N.A., et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59:585-7 (1994) 참조. 이 기술을 이용하여, 단일 세포로부터 DNA를 증폭하는 것과 상대적인 혼성화를 통해 증폭된 생성물을 이용함으로써 연속적으로 이수배수체(aneuploidy)를 검출하는 것이 가능해졌다. Klein, C. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96:4494-9 (1999). 다른 연구에서, 증폭된 표현형들은 BAC 마이크로어레이에 혼성화 프로브로서 이들을 사용함으로써 단일 유전자의 카피 수 변화를 검출하기 위해 사용하여 왔다. Guillaud-Bataille, M., et al., Nucleic Acids Res. 32:e112 (2004).
이 방법에서, 제한효소의 절단(digestion) 빈도는 생성되는 증폭된 생성물의 복잡성(complexity)을 결정한다. 낮은 빈도로 절단하는 효소를 선택함으로써, 증폭된 표현형질의 복잡성은 이후의 혼성화 단계를 보다 수행되기 쉽게 만드는 개시 게놈 DNA의 분획으로 감소시킬 수 있다. 이것은 두개의 복잡한 유전자 소스간 상대적인 혼성화를 수행하고자 하는 경우에 특히 유용하다. 현저한 실시예로서, "ROMA" (Representational Oligonucleotide Microarray Analysis)라고 불리는 기술은 인간에서 게놈 카피수 다양성을 많은 정도로 나타내는 기구로 사용되어왔다. Lucito, R., et al., Genome Res. 13:2291-305 (2003); Sebat, J., et al., Science 305:525-8 (2004); Jobanputra, V., et al., Genet Med 7:111-8 (2005).
실시예 1은 임신여성의 혈장으로부터 추출한 DNA의 링커-매개 증폭의 성공적인 사용을 보여준다. 증폭하기 전에, CpG 메틸화 민감화 효소, HpyCh4-IV는 정제된 DNA를 절단하기 위해 사용되었다. 절단(digestion) 후, 링커는 어닐링(annealed)되고 절단된 DNA에 연결되며 최종적으로 PCR은 다음의 공지 프로토콜의 링커쌍(linker pair)의 맨위 가닥을 사용하여 수행된다. 실시예 1 및 Guillaud-Bataille, M., et al., Nucleic Acids Res. 32:e112 (2004) 참조. 분명하게, 모체 혈액 수집 방법은 포름알데히드를 포함하지 않는 것이 바람직한 것으로 알려져 있다.
실시예 2는 영양막/태아 DNA의 성공적인 링커-매개 메틸화 특이 증폭을 보여준다. 전혈부터의 DNA 샘플뿐만 아니라 영양막/태아 DNA 역시 CpG 메틸화 민감성효소 AclI에 의해 절단되었다. 실시예 1과 유사하게, 효소 절단된 이후에, 링커는 어닐링되고 절단된 DNA와 연결된다. 마지막으로 PCR은 실시예 1에서 언급한 동일한 PCR 프로토콜의 링커 쌍의 맨위 가닥을 사용함으로써 수행된다. 분명하게, 영양막/태아 DNA에서는 전혈에서보다 보다 확고하고 차이가 드러나는 PCR 생성물들이 수득된다. 그러나 CpG 메틸화 민감성효소가 사용된 사실에도 불구하고, 비-영양막/태아 DNA(예를 들어, 전혈에서 얻어진 DNA)가 여전히 증폭됨이 확인되었다. 그러므로, 본 발명자들은 링커-매개 PCR 증폭만으로는 영양막/태아 DNA를 특이적으로 증폭하기에 적절한 것이 아님을 확인하였다.
그러므로, 본 발명의 링커-매개 PCR 단계에서는, DNA의 혼합 샘플은 절단된 말단을 갖는 절단된 DNA을 형성하기 위해 CpG 메틸화 민감성 효소에 의해 얻어지고 절단된다. 메틸화 민감성 효소는 당해 기술에 공지되어 있으며, HpyChIV-4, ClaI, AclI, 및 BstBI을 포함한, 이들에 한정되지 않는다.
링커 리게이션(ligation)이전에 DNA를 절단(cleave)하기 위해서 CpG 메틸화 민감성 제한 효소를 사용함으로써, 비-메틸화된 자리에 의한 단편들만이 증폭될 수 있다. 하나가 다른 하나보다 덜 메틸화된 두개의 다른 소스로부터의 DNA 혼합물이 존재하는 경우, 메틸화 민감성 효소로 절단(digestion), 이후의 링커 리게이션 및 증폭은 다르게 메틸화된 자리에 의해 정해진 절편의 선택적인 증폭을 가능하게 한다. 이 아이디어는 정상과 암성 조직간의 메틸화 차이를 탐지하기 위한 "표현형 차이 분석(representational difference analysis)"과 관련하여 사용되어 왔다. Ushijima, T., et al., Proc Natl. Acad. Sci. U S A 94:2284-9 (1997) 및 Kaneda, A., et al., Acad. Sci. 983:131-41 (2003) 참조. 어떤 차이 있는 증폭에 대한 정도는 현재 어떤 메틸화 차이에 대한 정도에(일부) 의존하는 이 접근법에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들면, 주어진 자리가 한 DNA에서 100% 메틸화되고, 다른 곳에서는 0% 메틸화되는 곳일때, 차이있는 증폭의 상당한 정도가 예상된다.
최근에 어떤 많은 게놈 자리가 메틸화되는 지의 정도에 대해 거의 알려진 바가 없다. 메틸화 자리를 결정하기 위한 도구들로, 즉 서던 블롯(Southern blot) 및 비설파이트 씨퀀싱(bisulfite sequencing)은 일반적으로 특이 자리가 완전히 메틸화 또는 완전히 비메틸화되는지 보여주며, 주어진 자리의 메틸화 상태가 정확하게 조절되고 유지되는 것을 제시한다. 이 아이디어는 더 나아가 각인과 투약보상을 보이는 게놈 구역(regions)에서 특이 유전자좌에 두개의 대립형질이 정확하게 다르게 메틸화된 사실에 의해 확인되었다. 그러나 방대하게 조사되었던 특이 자리의 수는 제한적이다. 또한, 측정 방법(서덧 블롯 및 비설파이트 씨퀀싱)은 메틸화의 정도의 미미한 차이를 구별할 수 없다. 그러나, 본 발명의 방법을 사용하면, 영양막/태아 서열의 매우 특이한 차이 있는 증폭을 측정하였다.
상기 언급한 바와 같이, 포유동물의 게놈의 메틸화는 매우 무작위적이지 않다. GC 풍부 지역 및 CpG 또는 "HTF" 섬은 상대적으로 저메틸화되는 반면, AT 풍부 서열은 상대적으로 더 메틸화된다. 예를 들어, 거의 잘리지 않은 GC 풍부 효소, NotⅠ 자리의 90% 초과가 저메틸화되는 위치이며, GpG 섬은 자연적으로 예상되는 것보다, 이 효소에 의해 훨씬 더 빈번한 절단을 초래한다. Fazzari, M.J., Greally JM, Nat. Rev. Genet. 5:446-55.(2004) 참조. 본 발명은 영양막/태아 특이 서열을 다르게 증폭하기 위해 메틸화 차이를 이용하고, CpG 섬은 영양막/태아 및 다른 DNA에서 저메틸화되는 것처럼 보이기 쉽기 때문에, 본 방법은 비-GC 풍부 DNA에서 CpG 메틸화에 포커스를 둔다. 이 때문에, 제한효소는 메틸화 민감성 CpG를 함유하는 반면에 AT로 구성되는 것이 바람직하다. 네가지 효소들이 이 카테고리에 속한다. 하나는 4개의 염기 효소, HpyChIV-4이고, ACGT에서 자른다. 남은 세가지 효소는 6 염기 효소로, 각각 ATCGTA, AACGTT 및 TTCGAA에서 서열을 갖는 ClaI, AclI 및 BstBI이다.
이런 효소 자리를 가리키는 무작위로 선택된 유전자의 천만개 염기의 비공식적 분석은 CpG 섬에서 현재 거의 관찰되지 않았다. NotⅠ 자리의 제한 지도는 AclI, ClaI 및 BstBI의 것과 비교되었다. 분석결과는 이런 AT 풍부 자리는 CpG 섬에 밀집되지 않으며 반대로 CpG 섬안에서 필수적으로 발생하지 않는 것을 보여준다.
놀랍게도, AclI, BstBI 및 ClaI의 인식자리 또한 거의 드물다. 인간 게놈은 A, C, T 및 G의 빈도에 관한 게놈 서열 추정하 예상될 수 있는 750,000 대신 ~150,000 AclI 자리만을 포함하는 것으로 나타난다. 예상되는 AclI 자리와 비교한 실제 수의 ~80% 감소는 CpG 디뉴클레오티드의 상대적인 결손(paucity)에 기인한다. 링커-매개 PCR은 약 1,500 bp 이하 길이의 절편만을 증폭할 수 있기 때문에, 우리는 400 에서 1500 bp 사이의 모든 예상되는 AclI 절편을 조사하였고, 인간 게놈에서 총수는 단지 ~15,000 임을 발견하였다. 전혈 DNA에서 예상되는 AclI 자리의 90% 이하에서 메틸화에 의해 차단된다고 가정할 때(AT 풍부 서열에서 CpG 메틸화가 증가한다는 사실에 대한 전통적인 가설), 이 크기 범위에서 기대되는 총 수는 1,000 - 2,000 정도 일 수 있다. 전체적으로, 이러한 ~2,000 절편들은 모든 유전서열의 0.1% 미만으로 발현될 것이다. 영양막/태아 DNA의 동일한 계산치(자리의 ~80% 만이 메틸화된다고 가정)도 약 2,000 - 4,000의 증폭 가능한 AclI 절편들이 예상된다. 이 계산은 영양막/태아 DNA의 메틸화-민감성 표현형에서 모든 증폭된 절편들의 약 반수가 "특이적"이거나, 유사하게 준비된 전혈 표현형들에 비해 고도로 풍부할 것으로 예상될 것이라는 중요한 예상을 만들었다.
위에서 언급한 바와 같이, 혼합 샘플에서 DNA를 메틸화 특이 효소에 의해 절단한 후, DNA는 링커에 연결된다. 바람직하게 링커는 제한효소자리에 위치하고, 후에 원형화 단계(circularization step)에 필수적인 상보적인 점착성 말단 (sticky end) 제공을 위해 사용될 것이다. 절단(digestion)에 있어 점착성 말단을 발생하는 어떤 제한효소 자리도 사용될 수도 있다. 가령, MluI는 점착성 말단을 제공한다. 링커와 리게이션한 후, 생성된 DNA는 링커내 자리에 결합하는 프라이머를 사용하여 증폭된다. 이후 PCR 증폭이 수행된다. 주기 수는 다양할 수 있으나 바람직하게 주기 수는 절단된 단편의 크기-선별적인 표현형들을 만들 것이다. 바람직한 실시예로서, 증폭 주기는 5 내지 15 주기로 수행된다. 더 바람직한 실시예에서 증폭주기는 8-14 주기로 수행된다. 가장 바람직한 실시예에서 12 주기의 증폭이 수행된다.
링커-매개 PCR 증폭에 덧붙여, 본 발명은 증폭된 PCR 생성물의 원형화(circularization); 엑소뉴클라아제 절단(exonuclease digestion); 및 최종적으로 등온 롤링 원형 증폭(isothermal rolling circle amplification)(이하 기술)을 추가적으로 포함하고, 본 발명은 링커-매개 PCR이 특이적으로 태아 DNA를 증폭하는데 충분하지 않다는 것을 확인하였다. 실시예 2는 동일한 비-태아 DNA 서열의 증폭된 것을 보여준다.
증폭된 PCR 생성물의 원형화 (Circularization)
증폭 주기가 수행된 후, 증폭된 생성물은 링커를 제거하는 효소에 의해 절단된다. 가령, 링커가 그 안에 MIuI 자리 위치를 가지고 있다면, 생성물은 MIuI 효소 절단물일 것이다. 이후 링커를 떼어내는 절단은, 저분자량 DNA(링커 및 프라이머 DNA)가 제거된다. 아가로오즈 겔 정제(agarose gel purification)나 컬럼 정제(column purification)같은 저 분자량 DNA를 제거하기 위한 어떤 적절한 방법이라도 사용될 수 있다. 바람직한 실시예로는 컬럼 정제법이 사용된다.
이후 정제된 DNA는 극도로 희석된 용액을 만들기 위해 희석된다. 그리고 나서 이 DNA는 초기 효소 절단물로 생성되는 점착성 말단의 리게이션에 의한 원형화(circularization)하기 위해서 T4 DNA 리가아제로 밤새동안 처리된다. 극도로 희석된 용액(예를 들어, 1X 리게이션 완충액내 0.5 ml)에서 절단(digestion) 및 리게이션에 의해, 상보적인 점착성 말단을 갖는 분자의 자기 연결(원형화)는 매우 친화적이다. (PCR 증폭 동안) 12번씩 녹고 부분적으로 재-어닐링(re-annealed)된 원 개시 DNA는 아주 불충분히 절단되며 원형화된다. 또한, 적절한 말단이 없는 비-특이적으로 증폭된 생성물은 공유적으로 폐쇄된 원형을 형성하지 않을 가능성이 높을 것이다.
엑소뉴클라아제 절단(Exonuclease Digestion)
DNA를 침전시킨후(일반적인 공지 방법을 이용하여), 물과 같은 적절한 완충액에 재현탁시키고, 리게이션 혼합물은 DNA 단일 가닥 및 이중 가닥의 말단을 공격하는 엑소뉴클라아제를 갖는 광범위한 절단제를 처리한다(예를 들어, 뉴클레아제 Bal-31). 리게이션으로 얻어진 원형 분자는 절단(digestion)에 저항성 있으나 광범위한 절단은 어떤 선형 분자들을 단일 뉴클레오티드로 감소시킬 것이다. 그러므로 이 절단(digestion)은 비-특이적으로 증폭된 생성물뿐만 아니라 개시 게놈 DNA의 감소시키는데 사용되어 왔다. 대안적으로, Bal-31과 같은 단일 엑소뉴클레아제 대신에, 엑소뉴클레아제의 혼합물을 사용할 수 있을 것이다. 예를 들면, 한 효소가 단일 가닥 DNA를 공격하고(녹두 엑소뉴클라아제) 다른 효소가 이중 가닥 DNA(람바(Lamba) 엑소뉴클라아제)를 공격하되, 여기서 효소들 중 어느 하나도 엔도뉴클라아제(endonuclease) 활성을 갖지 않으며, 어느 하나도 닉(nick)에서 이중 가닥 DNA를 떼어내지 못한다.
용어 '광범위한 절단'에서, 이는 제한되지 않는 효소의 충분한 양 및 제한되지 않는 충분히 긴 절단에 허용되는 시간을 의미한다. 예를 들면, 한 실시예에서, Bal-31 뉴클레아제의 2 단위는 소화 혼합물에서 사용되고, 처리에 45분이 요구된다. 단위(unit)는 10분동안 40 ng/ul 용액에서 선형 DNA의 400개 염기를 절단하는데 요구되는 효소양으로서 기능적으로 정의된다.
등온 롤링 원형 증폭
그리고 나서 뉴클레아제 처리된 리게이션은 등온 롤링 원형 증폭을 위한 주형으로 사용된다. 등온 롤링 원형 증폭은 당해 기술에 공지되어 있으며 일반적으로 엑소뉴클레아제-저항 무작위 프라이머 및 좋은 공정활성의 DNA 폴리머라제를 이용한 원형 DNA의 한 주기 증폭이다. 어떠한 등온 롤링 원형 증폭 과정도 사용될 수 있다. 가능하다면 아머샴(Amersham)사의 일반적으로 알려진 키트 및 다음의 제조사의 추천을 사용한다.
본 발명의 방법을 사용하여, 발명자는 태아 DNA로부터 메틸화-민감 표현형들을 생산하기 위하여 혼합 DNA 샘플에서 영양막/태아 성분(이하, 태아 DNA)의 특이 증폭을 기술할 수 있었다. 실시예 4 참조.
본 발명은 또한 태아-특이 엠플리콘을 동정하는 방법을 제공한다. 구체적인 설명은 실시예 5를 참조한다. 이 방법은 위에서 설명한 선택적인 태아 DNA 증폭 방법을 이용하여, 태아 DNA 및 전혈 DNA로부터 메틸화-민감성 표현형들을 각각 제조하는 단계를 포함한다. 태아-특이 엠플리콘은 영양막/태아 DNA로부터 증폭시키되, 여기서 기술한 방법을 이용한 다른 DNA가 아닌 엠플리콘을 뜻한다. 영양막/태아 DNA는 성체 DNA에 비하여 저메틸화된 DNA이다. 메틸화에 민감성 제한효소는 저메틸화된 태아 유전자좌를 분리할 것이며, 메틸화된 모체 유전자좌를 분리할 수 없을 것이다.
태아 DNA에서 얻은 메틸화-민감성 표현형들은 라벨링된 태아 DNA 프로브 및 라벨링된 전혈 DNA 프로브를 제조하기 위하여 첫번째 플루오로크롬(fluorochrome)으로 라벨링되고 전혈 DNA는 첫번째 플루오로크롬과 다른 두번째 플루오로크롬으로 라벨링된다. 라벨링된 프로브는 주어진 메틸화-민감성 효소의 예상 제한 절편에 대응되는 올리고뉴클레오티드의 어레이와 혼성되어진다. 대안적으로, 만약 두개의 분리되는 동일한 어레이를 사용한다면, 프로브는 다른 플루오로크롬들로 라벨링할 필요는 없다. 어레이(들)은 태아 DNA 프로브와 광범위하게 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 위치를 선정하기 위해 연구되고 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 태아-특이 엠플리콘으로 확인된다.
바람직한 실시예로서, 태아 특이 DNA 증폭에 사용되는 메틸화 민감성효소는 HpyCh4-IV이다.
태아 DNA와 모체 DNA 메틸화에서 차이점은 초기 임신기간에 더 분명한 것으로 추정되기 때문에, 바람직하게 태아 DNA는 약 56-84 일의 처음 3개월 임신기간으로부터 얻어진다.
본 발명은 또한 위에서 기술한 방법에 따라 생산된 태아-특이 엠플리콘을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법을 이용하여 동정된 태아-특이 엠플리콘의 라이브러리를 포함하는 어레이를 제공한다.
본 발명은 또한 태아 및 모체 DNA의 혼합물에서 미리 결정된 유전자좌에서 정상 카피수와 비교시 태아 DNA의 미리 결정된 유전자좌에 대한 카피 수의 증감여부를 결정하는 방법을 제공한다. 구체적인 설명은 실시예 6을 참조한다. 이 방법은 위에서 기술한 선택적인 태아 DNA 증폭 방법을 이용하여 시험 샘플 및 대조 샘플에서 태아 DNA의 미리 결정된 유전자좌를 선택적으로 증폭하는 것을 포함한다. 대조 샘플은 태아 DNA의 미리결정된 유전자좌에서의 정상 카피수를 갖는다.
시험 샘플에서 주어진 유전자좌에 대한 증폭된 DNA의 상대적인 양은 대조 샘플에서 동일한 유전자좌에 대한 증폭된 DNA의 상대량과 비교한다. 증폭된 DNA의 감소량은 감소한 카피수와 관련있으며, DNA의 증가량은 카피수의 증가와 관련있다.
바람직한 일 실시예로서,상기 비교는 시험 샘플 및 대조 샘플에서 동일한 카피수로 존재하는 미리 결정된 유전자좌로부터의 증폭된 DNA를 대조 유전자좌로부터 증폭된 DNA로 정상화하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 미리 결정된 유전자좌에 대한 카피수가 정상 카피수에 비하여 증가되었는지 감소되었는지 시험샘플에서 결정하는 다른 방법을 제공한다. 구체적인 기술은 실시예 7을 참조한다. 이 방법은 위에서 기술한 선택적인 태아 DNA 증폭 방법을 이용하여, 시험 샘플과 대조 샘플에서 태아 DNA를 선택적으로 증폭하는 것을 포함한다. 대조 샘플은 미리결정된 유전자좌에서 정상 카피수를 갖는다.
a)단계로부터 얻은 시험 샘플 및 대조 샘플의 DNA는 라벨링된 프로브를 제공하기 위하여 라벨링된다. 라벨링은 혼성화 감지의 수단으로 쓰이기 위해 수행된다. 예를 들어, 일단 하나의 어레이가 사용된다면, 시험 샘플의 DNA는 첫번째 플루오로크롬으로 라벨링되고 대조 샘플의 DNA는 두번째 다른 플루오로크롬으로 라벨링된다. 대안적으로, 만약 두개의 다른 동일한 어레이가 사용된다면, 시험 DNA 프로브를 위한 것과 시험 샘플 DNA 프로브를 위한 것, 두개의 다른 라벨은 필요하지 않다.
DNA 프로브 라벨링 이후에, 이들은 기술한 바와 같이 태아-특이 엠플리콘의 어레이에 혼성화되고 청구된 발명의 방법에 의해 제조된다. 시험 DNA 프로브와 대조 DNA 프로브간의 혼성화 정도는 신호강도 측정으로 결정된다. 대조 DNA와 비교한 시험 DNA로부터의 강한 신호는 카피수의 증가와 관련있다. 대조 DNA와 비교하여 시험 DNA의 약한 신호는 카피수의 감소와 관련있다.
실시예 1 : 혈장(plasma) DNA로부터의 증폭을 위한 링커-어댑터 PCR
링커 매개 PCR은 임신 여성의 혈장에서 유래된 DNA를 증폭하기 위해 사용되고 있었다. 표준 프로토콜(Johnson, K.L., et al., Clin. Chem. 50:516-21 (2004))은 항-응고처리된 전혈(모체 혈장)의 10ml 샘플에서 DNA를 정제하기 위해 사용되었다. 샘플은 세포를 제거하기 위하여 2차례 원심분리하였다. 생성된 혈장은 DNA 결합 멤브레인 위를 지나도록 했다. DNA는 멤브레인에서 제거되고 결과물 DNA는 HpyCh4-IV로 절단되었다(ACGT에서 잘림). 링커는 어닐링되며 리게이션되고, PCR은 후술되는 공지 프로토콜의 링커 쌍(linker pair)의 맨 위의 가닥을 이용하여 실시된다(Guillaud-Bataille, M., et al., Nucleic Acids. Res. 32:e112 (2004)). 링커는 HpyCh4-IV로 절단된 DNA를 리게이션할 때 MluI 자리를 만들기 위해 약간 변형된다. 링커들은 다음과 같다:
Figure 112008069782622-PCT00001
도 2는 이런 증폭의 대표례들을 보여주며 PCR 생성물들이 쉽게 관찰됨을 보 여준다. 증폭이 특이적이며 링커 매개인 것을 증명하기 위해, PCR 생성물들은 표준 TA 클로닝 프로토콜(TA cloning protocol)을 이용하여 클로닝된다. 열개의 무작위 콜로니(colonies)들을 뽑아 차례로 서열화하여, 10 경우 중 9에서, 서열은 링커 어댑터(linker adapter)가 각 말단의 좋은 HypCH4-N 자리에 연결되는 것을 보였다. 이 실험은 링커-어댑터 PCR이 혈장 유래 DNA로부터 증폭하기 위해 사용될 수 있음에 대한 강한 증거력을 갖는다.
도 2의 하단의 패널의 관찰은 이 프로토콜에 의해 생산된 링커-매개 PCR 생성물들이 모체 혈액의 수집 동안에 포름알데히드를 사용하는가에 매우 다른 의존을 보여준다. 단지 두가지 예들만을 보여주고 있으나 이 결과는 12가지의 각각의 수집 샘플들에 일치한다. 포름알데히드의 존재하에 혈액이 수집된 때에 나타난 래더링(laddering)은 아폽토틱 래더링(apoptotic laddering)을 강하게 연상시키는 것이고, 포름알데히드가 아폽토틱 절편들을 증폭시키는 경향을 추정케 한다. 아마도 단백질을 DNA에 고정(fixation)하는 것은 제한효소에 의해 절단되지 않은 DNA나 PCR 생성물의 복잡성(complexity)의 극적인 감소를 단순하게 나타낼 수 있는 결과를 낳을 것이다. 그러므로, 모체 혈액 수집에서 포름알데히드를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 이 태도는 포름알데히드가 태아 DNA의 비율을 증가시킨다는 견해를 반박하는 최근의 논문들과 일관된다. Chinnapapagari, S.K., et al., Clin. Chem. 51 :652-5 (2005).
실시예 2 : 영양막/태아 DNA의 메틸화 특이적 증폭 설명
영양막/태아 및 전혈 DNA사이의 다른 메틸화를 설명하기 위한 목적으로, 낮은 빈도로 절단하는, AT 풍부 효소의 사용의 결과로 매우 감소된 복잡성(complexitiy)는 유용하다. 그러므로, AclI를 이용한 영양막/태아 및 전혈 DNA 샘플로부터 증폭된 표현형들을 준비했다. 영양막/태아 DNA 샘플은 56 및 80일 재태기간 사이에 임의적으로 종료된 첫 3개월 임신기간에서 유래되었고, 모든 전혈 DNA는 정상 성인 자원자들로부터 준비되었다.
모든 증폭은 공지 프로토콜에 의해 진행되었다. Guillaud-Bataille, M., et al., Nucleic Acids. Res. 32:e112 (2004)를 참조한다. 간략하게, 게놈 DNA의 0.5 ug을 권장 완충액에서 과량의 AclI로 절단(digest)하였다. 이것의 25 ng을 링커/어댑터 쌍에 리게이션하기 위해 사용하였다. 리게이션후, 리게이션된 DNA의 2.5 ng을 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. 14 주기 이후, 생성물의 1/10 부피는 동일한 프라이머를 사용하는 추가의 10주기를 위한 PCR의 두번째 라운드를 위한 주형으로 사용하였다. 이와 관련하여, 생성물들은 미니겔(minigel)에 나타냈다(도 3 참조). 다른 메틸화의 예상과 일관하여, 영양막/태아 DNA로부터의 PCR 생성물들은 전혈 DNA보다 PCR 생성물에서 더 강하고 다른 차이로 수득되었다.
~500와 1,000 bp 사이에서 흐르는 절편들은 겔에서 잘리고, 링커/어댑터를 제거하기 위해 MluI로 절단되며 MluI 절단된 클로닝 벡터에 연결된다. 링커/어댑터는 AclI 오버행(overhand)에의 리게이션이 MluI 자리의 생성을 초래하도록 지정된다. 이런 리게이션들은 영양막/태아 및 전혈 개시 DNA들로부터 증폭된 AclI 절 편들의 미니-라이브러리들을 수득하기 위해 박테리아내로 형질전환된다. 클로닝에 있어서, 영양막/태아 표현형들은 일관하여 많은 콜로니들, 최상의 전혈 라이브러리에 대한 약 3,000과 비교하여 약 8,000개의 재조합체들(recombinants)을 포함하는 최상의 영양막/태아 미니-라이브러리와 같은 많은 콜로니들을 적어도 2배로 수득한다.
영양막/태아 라이브러리(library)로부터 35개의 무작위 콜로니들을 뽑아 그들의 삽입체를 서열화하였다. UCSC 브라우저를 통한 분석은 4개의 서열을 제외한 모두가 1 kb 길이 이하의 예상된 AclI 절편들과 일치함을 보였고, 절단(digestion), 링커 리게이션(linker ligation) 및 증폭(amplication) 단계들이 예상한 대로 발생하였음을 나타낸다. MluI 자리는 링커가 AclI 오버행(overhang)에 리게이션할 때만 만들어지기 때문에, 클로닝 과정이 비의도적인 증폭 생성물에 대해서 강하게 선택됨을 주시하여야 한다.
TA 클로닝 과정을 이용한 PCR 생성물을 클론화를 시도할 때, 클로닝 효율이 낮으며 클론의 높은 퍼센트는 비-특이적 증폭 생성물들을 반영했다. 그러므로, 링커-매개 증폭에 기인한 DNA 양의 두드러진 퍼센트는 비-특이적이라 볼 수 있다.
특이 PCR 프라이머의 총 30쌍은 증폭된 AclI 절편들의 하위-단편의 증폭을 위해 디자인된다. 그리고 PCR은 주형으로 전혈 및 영양막/태아 DNA의 증폭된 AclI 표현형들을 사용하여 이루어진다. 이런 실험들에서, 위에서 기술된 것과 같은 "두번째 라운드" 표현형질은 1 내지 10으로 희석되고 특이 프라이머 세트의 각각을 위한 주형으로 사용되고, 증폭은 조건의 표준 세트하 20 주기동안 이루어 진다.
영양막/태아로부터 증폭되었지만 전혈 표현형으로부터는 아닌, 프라이머 세트들은 6개의 영양막/태아 및 6개의 전혈 표현형로부터 증폭을 통해 추가적으로 시험된다(도 4 참조). 6개의 영양막/태아 표현형들은 모두 명확히 보이는 생성물을 수득한 반면, 6개의 전혈 표현형들의 어느 것도 동일한 조건하에서 생성물을 수득하지 못한 점에서, 이들 중, 10개는 영양막/태아 "특이적"임을 증명하였다. 이것은 10/30 또는 33% 가능성으로, 무작위로 선정되어 증폭된 AclI 제한 절편들만이 출발 DNA가 영양막/태아로부터 유래한 것일때 존재하는 것에 대응한다. 차례로, 이것은 논리적으로 영양막/태아 DNA가 전반적으로 저메틸화되는 정도의 추정치와 일치한다.
남은 20개의 프라이머 세트에서, 영양막/태아 및 혈액 표현형들에서 동등하게 증폭된 10개 및 다른 10개는 불일치된 결과를 보였다. 일부 AclI 표현형들로부터의 증폭을 위해 사용되는 경우, 예상 생성물들은 증폭되는 반면, 다른 경우에서는 그렇지 않았다. 이들 결과는 1) 관련있는 AclI 자리에서 메틸화가 극히 다양하거나; 2) 일부 AclI 자리들이 흔한 SNPs에 의해 변화되거나; 또는 3) PCR 효율이 SNP의 존재에 의해 영향을 받는지에 대해 제안한다. 실은, SNPs가 PCR의 효율에 영향을 줄뿐만 아니라 SNPs가 AclI 자리에 영향을 주는 것에 대한 여러 예들이 확인되고 있다. 서열 변화의 이 유형은 예상되고 무작위로 선정된 AclI 엠플리콘의 높은 퍼센트가 상대적으로 영양막/태아 특이적이라는 결과를 바꾸지는 못한다.
중대한 우려로, 일부 프라이머 세트가 영양막/태아 표현형으로부터 강한 밴드 및 전혈 표현형으로부터 훨씬 약한 밴드를 증폭된다는 관찰이다. 도 4의 위로 부터 3번째 패널에서 약한 밴드를 참고한다. 더 나아가, PCR 주기의 수가 20에서 30으로 증가됨에 따라, 볼수 있는 밴드는 거의 모든 프라이머 세트에 대한 전혈 표현형에서부터 증폭가능하였다(도시하지 않음). 본 발명의 목적은 다른 DNA와 혼합되었을때, 영양막/태아 DNA의 특이 증폭이기 때문에, 비-영양막/태아 DNA의 "새는(leaky)" 증폭은 문제 있을 수 있다.
좁은 선형 범위(linear range)에서, PCR의 3-4 주기는 10배의 증폭에 대응되고 감지(detection)의 역치(threshold)에서 3-4주기 차이는 주형의 양의 log배 차이와 대응되는 예상을 할 수 있다. 혼합물에서 DNA의 1% 존재시 영양막/태아 DNA를 검출하기 위해 6-8 PCR 주기의 다른 증폭이 필요할 것이다. 10개의 영양막/태아 "특이적" 프라이머 세트에서, 1 또는 2 경우만이 이 엄격한 기준을 충족한다.
전혈 표현형들로부터 약한 증폭에의 세가지 가능한 주의가 고려된다. 첫번째는, 증폭된 표현형들에 여전히 존재하는 개시 게놈 DNA의 소량은 약한 생성물을 얻는데 충분한 주형으로 제공될 수 있다는 것이다. 개시 게놈 DNA의 2.5 ng의 소수의 피코그램(picograms)만이 희석된 표현형들내에 존재하는 것으로 계산되었고, 이것이 PCR 20 주기 이후 약하게 증폭된 밴드의 소스인지를 불명확하게 만들었다. 그러나, 이것은 30 주기 이후에는 증폭을 설명하기에 가능할 수 있다. 두번째, 메틸화는 많은 CpG 자리에서 불완전할 수도 있다. 완전하지는 않으나 매우 메틸화된 자리들은 낮으나 감지될 수 있는 수치에서 존재하는 대응 제한 절편들(restriction fragments)이 있는 표현형들을 야기할 수 있다. 분명하게, 이 설명은 말단에서도 유효할 것으로 보인다. 많은 자리들은 시간의 99% 메틸화될 수 있는 반면 다른 것 들은 99.9% 메틸화된다. 위에서 설명한 바와 같이, 전혈 엠플리콘으로부터 약한 증폭의 세번째 설명은 표현형들의 형성되는 동안의 비-특이적인 증폭이다. 반복 서열의 많은 양을 포함하는 복잡한 게놈 DNA의 변성(denaturing), 재-어닐링(re-annealing) 및 프라이머 연장(extension) 수행과정은 비-의도적인 생산물들의 많은 양을 제조하는 것이 확실하다. 이러한 세가지 가능성 중 어느 것이 전혈 DNA로부터 "새는" 엠플리콘의 출처인지 결정하기 위해, 대표적인 엠플리콘의 대안 도식이 수정되었다.
실시예 3 : 뉴클레아제 절단(digestion) 다음의 원형 분자의 등온 증폭
실시예 2에서 논의한 새는(leaky) 엠플리콘 문제를 극복하기 위하여, 본 발명자는 클로닝과 같은 편리한 증폭 방법을 개발하고자 하였으며, 좋은 제한 절편이며 비-특이적 증폭 생성물에 대응하여 엄격히 선별할 것이다.
이와 관련하여, 게놈 DNA는 AclI로 절단되고 링커 리게이션은 위에서 기술한 대로 제조되었다. 링커 프라이머로 증폭 12 주기 이후, 생성물은 MluI(링커를 제거하는)로 절단되고, 컬럼 정제에 의해 저분자(링커 및 프라이머) DNA가 제거되며, 1X 리게이션 완충액에서 0.5 ml 로 희석하여(매우 희석된 용액을 만들기 위해) T4 DNA 리가아제를 밤새동안 처리한다. 이론적 해석은 후술한다. PCR의 첫 12 주기는 원하지 않는, 비-특이적 생성물들뿐만 아니라 AclI 절편들의 크기-선택적 표현형들을 만든다. 매우 희석된 용액을 절단 및 리게이션함으로써, 상호적인 점착성 말단(sticky ends)을 갖는 분자들의 분자내 자기-연결(원형화)가 강하게 선호된다. 12 번 녹고 부분적으로 재-어닐링되는 원 개시 DNA는 매우 불충분하게 절단되고 원형화된다. 적절한 말단이 부족한 비-특이적으로 증폭된 생성물들은 공유적으로 폐쇄된 원형을 형성하기에는 가망성이 매우 없다.
침전 후, 리게이션 혼합물은 뉴클레아제 Bal-31으로 방대하게 절단 처리되고, 엑소뉴클레아제는 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA의 말단을 공격한다. 리게이션에 의한 원형 분자(circular molecules)는 절단에 저항성 있으나, 광범위한 절단은 선형 분자을 단일 뉴클레오티드로 감소시킬 것이다. 이것은 비-특이적으로 증폭된 생성물뿐만 아니라 개시 게놈 DNA를 줄일 것으로 예상된다. 뉴클레아제 처리된 리게이션은 제조사의 추천의 상업적인 키트(Amersham)을 사용하여 등온 롤링 원형 증폭을 위한 주형으로 사용된다. 이것은 녹는 것과 재어닐링을 포함하지 않는 대략적으로 ~10,000배 증폭의 결과를 낳는다. Dean, F.B., et al., Genome Res. 11:1095-9 (2001). 이 과정의 마지막에, 생성된 DNA는 희석되고 위에서 기술된 영양막/태아 "특이적" 프라이머 세트를 갖는 PCR을 위한 주형으로 사용된다.
이 분석은 22주기에서 영양막/태아 표현형들로부터 PCR 생성물을 분명하게 감지할 수 있는 (원래 30개 중) 총 5개의 프라이머 세트을 얻은 반면, 전혈 표현형들이 수반된 35주기 이하에서는 보이는 생성물들이 얻어지지 않았다. 도 5는 성공 및 실패한 예 모두를 보여주고 있다. PCR 검출의 역치에서 13 주기 차이는 최소 1000배의 개시 주형의 차이와 대응되며 이러한 엠플리콘들은 영양막/태아 구성성분이 1%만이라도 포함된 DNA 혼합물에서도 쉽게 감지될 수 있을 것으로 보인다.
본 발명자는 비-특이적 증폭이 전통적인 링커-매개 증폭이 "새는 것(leakiness)"의 주요 원인이거나 배경이며 뉴클레아제/등온 증폭 프로토콜은 이 상황을 분명히 개선한다는 결론을 내렸다. 또한 불완전한 메틸화는 많은 유전자 자리에서 쉽게 발생되며, 이는 강력하게 메틸화 특이 엠플리콘의 총 수를 줄인다.
실시예 4 : 혼합된 영양막/태아 및 전혈 샘플의 증폭
혼합된 DNA 샘플의 영양막/태아 구성성분의 특이적 증폭이 가능한지 시험하기 위해서, 영양막/태아-특이적인 AclI 엠플리콘은 BanII 자리를 바꾸는 일반적인 단일 뉴클레오티드 다형성("SNP")을 포함하하는 것이 확인되었다. 위에서 사용된 6개의 영양막/태아 및 6개의 전혈 시험 DNA는 이 SNP을 위해 유전자화되었으며, 이 유전자좌에서 독특한 유전자형를 수반하는 전혈/영양막/태아 쌍을 찾은 후, 유전자 DNA의 10:1과 20:1 혼합물이 제조되었다. 이들 혼합물내 DNA의 절대량은 25 ng로, 20:1 혼합물에서 영양막/태아 구성성분이 단지 ~100 Pg임을 의미하며, 따라서 혈장의 10ml 샘플에서 태아 구성성분 미만으로 존재한다. 메틸화-민감성 표현형들은 위에서 기술된 바대로 준비되며, 희석된 표현형들은 PCR을 위한 주형으로 사용된다. 생성물들은 직접 서열화된 것뿐만 아니라 제한 절단물에 의해서도 분석된다(도 6). 본 분석의 민감도에 따르면, 전혈 구성성분의 증폭에의 증거는 없는 바이다.
DNA 혼합물의 영양막/태아 구성성분을 선택적으로 증폭하기 위한 능력을 더욱 구체적으로 기술하기 위하여, 본 발명자들은 단순 서열 반복("SSR") 다형성을 사용하였다. 50% 이상의 이형접종성이며, SNPs보다 훨씬 더 유용적인 SSRs은 또한 자동화된 서열기를 통해 상대적인 피크 높이나 영역을 측정함으로써 동일한 DNA에서 대립 유전자(alleles)의 증폭의 상대적인 정도를 쉽게 측정할 수 있는 가능성을 제시한다.
잠재적인 다형성의 SSRs를 포함하는 AclI 엠플리콘을 찾기 위하여, (상기) 영양막/태아 미니-라이브러리(library)로부터 얻은 혈장 DNA는 MluI로 절단되며 새로운 링커는 절편 말단에 연결된다. 링커의 "바닥" 가닥에 대응되는 프라이머 뿐만 아니라 (CA)10으로 구성되는 프라이머를 사용한 PCR을 수행하였다. 이 방법은 CA 반복(repeats)을 포함하는 AclI 절편의 일부분을 증폭할 것으로 예상된다. PCR 생성물들을 복제하고 무작위 클로니들을 뽑아 서열화하였다. 이런 서열 15에서, 모두 1 Kb길이 미만으로 예상되는 AclI 절편들에 대응되며, 다섯은 다형성이 가능하기에 충분한 CA 반복 길이를 포함한다. CA 반복(repeats)을 플랭킹하는 특이적 프라이머는 합성되어 증폭된 표현형들에서 PCR을 위해 사용되고, 5개 중 3개는 영양막/태아 특이적인 것으로 보여진다.
12개의 시험 DNA 중 10개는 이들의 하나를 위한 CA 길이에서 이형접종의 다양성을 보여주고, 독특한 유전자형을 갖는 DNA쌍(영양막/태아 및 전혈)은 10:1 및 20:1 전혈 및 영양막/태아 DNA 각각으로 구성되는 시험 혼합물을 만들기 위해 선택되어진다.
이후, 혼합된 게놈 DNA는 메틸화-민감성 표현형들을 제조하기 위하여 사용되어지며, 이들의 희석액은 다형성(polymorphism)을 위한 프라이머로 PCR의 주형으로 사용된다. 20:1 혼합물로부터 증폭된 것들뿐만 아니라, 두 개시 DNAs의 각각의 PCR 생성물들은 도 7에 나타낸다. 분명하게, 이 메틸화-민감성 엠플리콘의 증폭은 영양막/태아 DNA에 의한 것은 전혈에 의한 것보다 최소 20배 이상 효율적이다. 이들 실헌의 결과는 본 발명의 방법에 의한 영양막/태아 DNA의 차별적인 증폭이 가능함을 입증하였다.
실시예 5 : 영양막/태아-특이 엠플리콘의 대규모 동정을 위한 마이크로어레이(microarray) 분석
영양막/태아 엠플리콘의 라이브러리의 발달은 아래에 기술한 이수배수체(aneuploidy) 검사에 대한 첫번째 단계이다.
맞춤 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에 대한 상대적인 혼성화는 현재 일반적이며, 상업적으로 사용가능한 기술로 게놈의 카피수 차이를 측정하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 동일한 기술은 영양막/태아 특이 엠플리콘의 대규모 동정을 위한 이상적인 방법을 제공한다. 이 목적을 달성하기 위하여, 영양막/태아 및 전혈 DNA로부터 선택적으로 준비된 메틸화-민감성 표현형들은 다른 플루오로크롬로 라벨링화되었으며 주어진 메틸화-민감성 효소에 대하여 예상되는 제한 절편들에 대응하는 올리고뉴클레오티드 어레이에 각각 혼성화된다. 카피수 변화를 위한 어레이 혼성화와 반대로, 혼성화 수치에 있어서의 차이가 극도로 미미한 경우, 영양막/태아 프로브들에 대하여 배타적으로 혼성화하는 이들 올리고뉴클레오티드(어레이 주소)들이 동정되고, 혈액에서 유래한 DNA의 제한 자리에 대응하는 0 또는 0에 근 접한 절단(digestion)을 나타낸다. 다양한 다른 영양막/태아 샘플로부터 만들어진 프로브를 사용하는 이런 마이크로어레이 분석을 행함으로써, 일관하여 매우 다른 증폭을 보이는 이런 엠플리콘들이 확인되고 타겟 염색체(chromosomes)에서 영양막/태아-특이 엠플리콘의 많은 수의 카달로그를 제공하기 위해 사용된다.
제한 효소의 선택
위에 기술된 연구들에서, 목표는 영양막/태아-특이 엠플리콘의 존재를 기술하고, 낮은 빈도로 절단하는 효소에 기한 극도로 감소된 복잡성을 수반하는 증폭된 표현형들은 신중히 사용된다. 향후 산전 진단의 목적을 위해서, 타겟 염색체에서 염색체당 수백개의 영양막/태아 특이 엠플리콘, 13, 18 21 X 및 Y 를 획득하고, 혈장 유래 DNA는 저 평균 분자량 때문에, 짧은 단편에 포커스를 둔다. 그러므로, AclI와 같은 효소들에 의해서는 이 목적을 위한 단편들을 거의 낳을 수 없으며, 마이크로어레이 분석을 위해서는 더욱 잦은 잘림 효소가 사용된다. HpyCh4-IV 효소는 마이크로어레이 실험을 위한 물질들을 생산하는데 이상적이다. 이 효소는 오직 상업적으로 이용가능한 효소로 인식서열(ACGT)는 중앙의 CpG보다 다른 위치에서 A 또는 T에서 작용한다. A, C, G 및 T의 균형된 비율의 유전자에서, AclI보다 HpyCh4-IV의 자리가 16배 더 있어야 할 것으로, 바꾸어말하면 이것은 21번 염색체에서 100 에서 1500 bp 사이에 ~2400개의 절편들이 예상될 것이다. 사실, 21번 염색체에서 예상되는 크기 100-1500의 HpyCh4-IV 절편들의 진짜 수는 17,152로, AT 풍부 서열에 대한 CpG 디뉴클레오티드의 극도로 불균등한 분배를 반영한다. 한 사 람이 영양막/태아 DNA에서 메틸화에 의해 자리의 80%가 차단된다고 가정하면, 타겟 크기 범위에서 21번 염색체 절편의 진짜 수는 2-3000일 것임을 짐작할 수 있다. 만약 15%가 영양막/태아 특이적이라면, 300-450 정도의 엠플리콘이 예상된다.
어레이 구조
최근 기술은 단일 실험에서 전체 게놈의 모든 HpyCh4-IV 절편들의 반 이상을 추정하기에 충분한 ~380,000 다른 올리고들을 포함하는 어레이의 생산이 가능하다. 그러나, 10개의 샘플쌍에서 분석의 이런 유형을 수행하기 위해서는 최소한도로 이런 어레이 20개가 필요할 것이며 결론적으로 매우 고가일 것이다. 비용을 줄이기 위한 방안으로, 4개의 동일한 어레이에 어레이 형태를 제공되고, 각각 ~98,000 올리고들로 구성되고, 동일한 "칩(chip)"에서 합성된다. 이 유형의 단일 "칩"은 4가지 혼성화를 가능케 하고, 이것은 2개의, 색-반대, 이중 혼성화에 충분하다. 98,000개의 올리고들은 복제물에서 각 올리고를 갖는 4가지 관련된 염색체들(13, 18, 21 및 X)의 각각에서 ~12,000 절편들을 묻기 위한 충분한 공간을 제공한다. 12,000개는 21번 염색체에 위치한 100-1500 bp 절편들 대다수에 나타나기 충분하고, 이를 바꾸어 말하면, 염색체당 수백개의 영양막/태아-특이 엠플리콘을 얻을 수 있을 것으로 예상된다. 모든 Y 단편들은 태아-특이적이기 때문에, 1000개의 Y 단편들 만이 어레이에 나타난다. 이것은 ~200개의 Y 염색체 엠플리콘을 얻을 것으로 예상되며, 충분한 양보다 더 많은 것이다.
올리고뉴클레오티드
100 및 1,500 bp 길이 사이의 21, 18, 13, X 및 Y 염색체에서 예상되는 모든 ~17,000개의 HpyCh4-IV 절편들의 서열을 포함하는 데이터베이스가 준비된다. 이들 파일들은 프로브 디자인 및 어레이 합성을 위해 사용된다. 혈장 DNA의 저분자량 때문에, 짧은 절편의 최대 가능한 수는 어레이에 나타날수 있을 것이다. 400 bp 미만의 절편의 약 50%가 올리고뉴클레오티드 디자인에 적합한 서열을 갖지 않기 때문에, 이들은 어레이에 나타내기 위해 약 2,500가 남게 될 것이다. 모든 어레이들은 또한 음성(negative) 대조 올리고뉴클레오티드 시리즈를 포함한다.
영양막/태아 샘플
위에서 논의한 바와 같이, 첫 3 개월 영양막/태아 DNA는 하기의 두 가지 고려사항들 때문에 사용된다: 1) 영양막/태아 DNA 및 다른 DNA간 메틸화의 차이는 초기 재태기간에서 더욱 극명하고; 그리고 2) 첫 3개월 진단 방법이 바람직하다. 동일한 이론으로, 56-84일의 임신기간에서 유래한 영양막/태아로부터 증폭된 표현형들을 사용하여 마이크로어레이 혼성화를 하였다. 이러한 샘플들은 선택적으로 종결된 임신에서 수집될 수 있으며, DNA는 페놀/클로로포름 추출물에 의한 일반적인 프로테나아제-K 절단에 의해 제조될 것이다.
비-영양막/태아 샘플
10개의 무작위로 선택된 여성 샘플은 적절히 개별적인 전혈 DNA 샘플에서 시 도된 것이라기보다 공동 출자된 것이다. 풀링(pooling) 혈액 유도된 DNA에 의해, 평균 메틸화 프로파일을 갖는 단일 표현형들이 생산된다.
모체 DNA가 혼재된 자궁으로부터 얻어진 샘플은 자궁 상피조직으로부터 유래되고 따라서 피부 섬유모세포(fibroblast)로부터 유래된 DNA와 유사할 것으로 추정된다. 혈액 및 피부에서 유래된 DNA의 메틸화를 비교한 체계적인 연구가 없었으나, 이와 관련하여 이들이 다를 것으로 생각되는 이유는 없다. 과거에는, 유전자 맵핑 실험이 메틸화 민감 절단제(소화제)를 수반하는 서던블롯(southern blot)에서 실시되어 20개를 초과하는 다른 프로브에 혼성화되었으며, 혈액 및 섬유모세포 DNA간의 차이는 보여지지 않았다.
프로브 합성
위에서 기술한 뉴클레아제/롤링-원형 증폭 프로토콜(nuclease/rolling-circle amplification protocol)은 영양막/태아 및 비 영양막/태아 DNAs의 메틸화-민감성 표현형들을 제조하기 위해 사용된다. 각 게놈 DNA의 0.5 ug은 과량의 HpyCh4-IV에 의해 절단된다. 이 절단물의 25 ng 은 링커쌍에 연결되고 리게이션의 1/lO은 12 주기동안 PCR을 수행하는데 사용된다. AclI 절단물을 사용한 상기 실시예에서, 절편 말단에의 링커의 원칙적인 리게이션이 MluI위치(ACGCGT)를 만들고, A 뒤를 절단하여 CGT를 남기는 HpyCh4-IV를 사용할 때 동일한 결과를 얻는다. PCR의 12 주기 이후, 결과물인 생성물은 MluI에 의해 절단되고 위와 같이 원형화된다. 다음의 리게이션, 남아있는 선형 DNA는 뉴클레아제 Bal-31로 절단되고, 세파덱스 G50 컬럼으로 완충액을 교환한 후, 등온 롤링-원형 증폭을 상업적으로 이용가능한 키트(아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience))를 이용하여 실시한다. 이때, DNA는 미니겔에서 적절한 생성물이 현재 있는지를 결정하기 위해 체크한다. 이 프로토콜을 이용한 DNA 수득량은 일상적으로 3 에서 5 ug 사이이나, 원형화된 PCR 생성물의 일 부분만이 증폭을 위해 사용되기 때문에, 쉽게 대량생산이 가능할 것이다. 형광광도법(fluorometry)에 의해 정량측정 및 미니겔에서 MluI에 절단된 생성물을 흘려 정성을 측정 한 후, DNA는 프로브 라벨링 및 어레이 혼성화를 위한 님볼젠(NimbleGen)과 같은 어레이 제조사에 제공된다.
마이크로어레이 데이타의 해석
기초 데이터(row data)의 가공처리는 중요한 첫번째 단계이다. 각 어레이 주소(address)에 대한 신호세기(대조 올리고에 관한)가 측정된다. 신뢰하기 어려운 스팟(spots)은 분석에서 제거된다. 적당한 신호를 갖는 각 어레이 주소에 대한, 두 신호(Cy3 및 Cy5)의 세기의 비율이 측정된다. 로그 전환 비(log transfomred ratios)는 단순비(simple ratios)보다 통계학적으로 유용하기 때문에 모든 값은 로그(베이스 2) 전환할 것이다. 어레이 데이터는 어레이의 각 개별값으로부터 전체 어레이에 대한 평균 log2 비를 제함으로써 표준화된다. 복제물에도 각 올리고들이 있기 때문에, 복제물 주소의 표준화된 비율은 평균화되고, 이들 평균값은 동일한 복제물 주소의 색-대조 평균 비와 대응되는 평균값을 의미한다. 그러므로 각 단편에 대한 최종 값은 4개의 혼성화 및 그들의 대응되는 log2 평균 비율에 기초한다. 이 분석은 소프트웨어 패키지 존재시 쉽게 이루어진다.
영양막/태아 표현형에는 존재하나 전혈 표현형에는 없거나 거의 없는 엠플리콘의 위치는 유전적으로 계속 되어온 어레이 주소의 혼성화 비율에서 미묘한 차이를 보이는 전형적인 게놈 대조 실험에서보다 꽤 다른 차이를 보인다. Lucito et al., Genome Res. 13;2291-305 (2003)의 데이터는 어떻게 데이터들이 나타날 수 있을 것인지에 대한 예를 제공한다. 도 8을 참조한다. 이 저자들은 BglII 절편에 대응하는 10,000 개의 올리고뉴클레오티드의 유리 슬라이드 어레이에 상대적인 혼성화를 수행하였다. 한 혼성화 프로브는 게놈 DNA의 "완전한" BglII 표현형질들로 이루어지고 다른 것은 내부 HindⅢ 자리에서 모든 절편이 거의 제거된, HindⅢ으로 절단되는 DNA를 제외하고 유사한 표현형들로 이루어졌다. 이것은 본 발명과 유사한 환경을 만들고, 여기서 한 표현형은 다른 표현형로부터 필수적으로 없는 요소를 표함한다. 상기 도에서 분명한 것과 같이, log10평균 비율 신호는 0에서 1 이상까지 다양하고, 많은 단편들에 대한 신호에서 10배를 초과하는 차이를 반영한다. 본 발명 어레이의 결과는 이와 유사할 것이나, 이 저자들이 사용한 것보다 프로브 증폭 방법은 훨씬 덜 비-특이적 증폭이기 때문에, log10 주평균 비율을 갖는 주소는 1보다 더 높은 퍼센트로 보이기 쉽다.
10배 또는 보다 큰 평균 비를 갖는 이런 주소들은 "영양막/태아-특이적"으로 간주된다. 분명히, 큰 평균 비를 갖는 이런 주소들이 가장 바람직하다. 각 혼성 화 분석은 이 기준에 맞는 신호를 수반한 프로브 주소의 목록을 낳고, 10개의 계획된 혼성화의 쌍 방법(pair-wise) 비교는, 다섯개의 관련있는 염색체에서 영양막/태아 특이 HpyCh4-IV 엠플리콘의 바람직한 카타로그를 제공하는 샘플중에서 일치하는 이런 주소들의 최종 목록을 야기한다.
실시예 6 : 모체 혈장 및 자궁 DNA에의 태아-특이 다형성(polymorphism)의 증폭
태아 다형성의 증폭 또한 비-침투적인 이수성체(aneuploidy) 시험을 위한 가능한 접근방법이다. STR 다형성의 QF-PCR은 전통적인 산전 검사에서 이수성체의 빠른 진단방법으로서 매우 높은 성공율을 보이고 있으며 (Nicolini et al., Hum. Reprod. Update 10:541-48 (2004)), 메틸화-민감성 표현형들을 사용하기 위해 이용될 수 있다. 그러므로, 실시예 5에서 정의된 메틸화 특이 엠플리콘에 위치한 유용한 다형성이 동정되고, 자궁 및 혈장 DNA 샘플에서 이러한 다형성체의 태아 대립형질들은 검출된다.
유용한 다형성의 발견
유전자 지도(genetic mapping)의 목적으로, SNP는 다형성의 가장 유용하고 가장 풍부한 유형이 되어 왔다. 많은 SNP가 공지의 도메인 데이타베이스가 되고 SNPs가 풍부한 위치에 어세이 방법이 있음에도 불구하고, 이수배수체 검사를 위한 이들의 사용에는 STR 다형성보다 더 많은 난제가 있다. 그들이 덜 다형성적이여서 가 아니라, 이수배수체 검사를 위해 이들을 사용하는 방법(Pont-Kingdon, G. et al., Clin. Chem 49:1087-94(2003))은 메틸화 민감성 표현형의 상황에서 현실적이지 않을 수 있는 대립형질의 동등한 증폭에 의존한다. 이러한 점에 있어서, 메틸화 특이 엠플리콘에 위치한 유용한 STRs은 동정된다.
메틸화 특이 엠플리콘에 위치한 STRs의 위치를 정하기 위한 적합성(feasibility)을 기술하기 위해, 21번 염색체는, 거의 400개는 다형성되기 쉬운 STRs을 포함하는 ~17,000 예상되는 절편의 단순 서열의 가능한 다형성의 주행을 포함하는 HpyCh4-IV 절편을 조사했다. 표 1을 참조한다.
[표 1] 잠재적인 21번 염색체 다형성
100-400 bp 400-1,500 bp 총 계
CA/TG(10 이상) 47 260 307
트리 또는 테트라(10 이상) 10 58 68
위의 실시예 5에서 기술된 어레이는 가능한 한 많은 이들과 대응되는 올리고들을 포함하고, 따라서 잠재적인 다형성 자리의 기회 증가는 메틸화 특이 엠플리콘에서 찾게 될 것이다. 절편들의 약 15%는 매우 메틸화 특이적일 수 있고, 21 번 염색체에서 60개 이하로 가능한 다형성 영양막/태아-특이 엠플리콘이 확인된다. 이들은 일반적으로 더욱 쉽게 해석되는 PCR 생성물들을 생산하기 때문에, 트리 및 테트라 뉴클레오티드 반복이 사용된다. 타겟 다형성의 프랭킹(flanking) 프라이머 쌍은 디자인된다. 두 프라이머 중 하나는 자동화 서열기에서 쉽게 절편 길이 분석을 위해 플루오로크롬으로 라벨링되고, PCR은 10개의 무작위 게놈의 DNA 샘플에서 수행된다. 적당한 이형접합체를 갖는 마커는 이 방법에서 나타나고 약속한 지원자들에게 추가적으로 실험된다.
혼합된 DNA 샘플에서 증폭 시험
영양막/태아 및 전혈 DNA 샘플에 존재는 위에서 확인된 다형성에 대한 유전자형이며, 독특한 유전자형을 갖는 혼합 샘플 쌍들이 준비된다. 데이타는 영양막/태아 구성성분이 총 개시 DNA의 5%인 혼합물에서 영양막/태아 유전자형의 검출이 가능함을 보여주고, 따라서 우리는 20:1 혼합물을 처음 시험하고 차례로 50:1 및 100:1 비율의 시험분석을 하였다.
태아-특이적 엠플리콘에 대한 시험
상기 시험에서 기능이 확인된 다형성은 태아 대립형질(alleles)이 모체 샘플에서부터 증폭될 수 있는지 여부를 시험하기 위해 사용된다. 이런 목적을 위해, 모체 및 태아 DNA 모두의 샘플은 각각의 모체 혈장 및/또는 자궁 세척 샘플에서 재획득되었다. 임신 계속중에서 얻은 혈장 샘플에서, 태아 DNA는 CVS 생검 및 세척 샘플에서부터 얻으며, 이는 종결 피검물로부터 얻어진다. 모체 혈액 샘플이나 직접적인 태아 샘플이 아닌 이런 경우에서, 부계 샘플이 태아-특이 대립형질의 확인에서 이루어질 것이다. 모체 및 태아(또는 부체) 샘플은 형광 PCR를 사용한 이런 다형성과 관련한 유전자형된다. 준비된 5-10개의 유전자좌가 있다면, 하나 또는 두개의 유전자좌는 거의 모든 임산부에 대한 유용한 정보를 줄 것이다. 태아 대립 형질의 명백한 확인을 허용하기 위해 예상되는 샘플들이 선택된다.
적절한 샘플들이 동정됨에 따라, 혼합된 태아/모체 샘플(자궁 또는 혈장)의 메틸화-민감성 표현형들은 상술된 바대로 준비된다. 혈장 DNA의 크기 선별은 태아 DNA에 대하여 상당히 풍부하게 나타나기 때문에(Li et al. Clin. Chem. 50:1002-11 (2004)), 크기 선별은 다음과 같다. 초기 절단(digestion), 링커 리게이션(ligationa) 및 12 주기 증폭(amplification) 이후, PCR 생성물은 2% 아가로오즈 미니겔에 로딩된다. 100 에서 400 사이의 절편들을 포함하는 겔 조각은 제거되고차례로 MluI로 절단, 원형화(circularization) 및 등온 증폭 단계에 사용된다. 이 프로토콜은 직접적으로 DNA 크기-선별에 의한 동일한 효과를 얻는다. 세척 피검물로부터 얻어지는 전체 세포 펠렛으로부터의 자궁 세척 샘플(위의 프로토콜에 따라 획득되는)이 준비되고 메틸화-민감성 증폭을 위해 사용된다.
증폭산물은 유용한 다형성의 증폭을 위한 주형으로 사용되고 절편 분석은 태아-특이적 대립형질이 증폭될수 있는지를 나타낸다.
이수배수체를 위한 검사
21번 삼염색체(trisomy 21)의 고 의심군인 임산부로부터, 가능한 때, 샘플을 얻는다. 메틸화-민감성 증폭 표현형들은 이들 샘플로부터 위에서 기술한 바와 같이 준비된다. 위에서 논의한 바와 같이 크기 선별을 위한 동일한 과정이 사용된다. 영양막/태아 특이 21번 염색체 마커(CVS나 종료시 얻은 DNA를 사용)의 패널에 대한 진짜 태아 유전자형을 결정한 후, 증폭된 표현형질들에서 PCR의 동일한 세트 를 흘린다.
실시예 7 : 마이크로어레이 비교 게놈 혼성화(comparative genome hybridization, "CGH")을 위한 메틸화-특이적-표현형의 사용
일반적인 고려사항
올리고뉴클레오티드 어레이의 비교 혼성화는 아주 작은 게놈 결손(deletions) 및 복제(duplications)를 감지할 수 있다(Sebat et al. 2004; Jobanputra et al. 2005; Selzer et al. 2005). 세표유전학적으로 보이는 결손 및 전체 염색체 이수배수체의 검출은 이 기술을 이용하면 상대적으로 단순하다. 역사적으로도, 이 기술의 성공에의 중요한 요인은 증폭된 산물들이, 실제로 타겟 올리고뉴클레오티드에 훨씬 많이 상동(homologous)되는 비를 만드는 프로브의 복잡성(complexity)를 감소시키는 사실이다. 최근, 프로브 라벨링을 위한 기술의 발전은 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에서 라벨링된 전체 게놈의 프로브을 직접적으로 사용하는 것을 가능하게 하였다. 여러 단체들은 이 기술의 사용인 작은, 매우 복잡한 프로브를 갖는 단일의 카피 수 변화를 감지하는 이런 기술이 사용이 일반적으로 성공적임을 보고하고 있다(Brennan et al. 2004; Selzer et al. 2005; Hinds et al. 2006). 그러므로, 영양막/태아-특이 엠플리콘에 대응하는 올리고뉴클레오티드의 어레이를 위한 메틸화-특이 표현형들의 비교 혼성화는 태아 이수배수체를 검출하기 위해 사용될 수도 있다.
이 도식에서, 메틸화-민감 표현형들은 위에서 기술한 바와 같이 임신 여성의 혈장 또는 자궁 샘플로부터 DNA 샘플로부터 제조된다. 두개의 다른 개별체로부터 얻은 증폭된 표현형들, 하나는 정상 대조군이며 다른 것은 미지의 핵형(karyotype)인 경우, 실시예 5에서 정의된 영양막/태아-특이 올리고뉴클레오티드 타겟의 세트에 비교 혼성화 프로브로 사용된다. 만약 두 임산부가 둘다 정상 핵형(및 동일한 성별)을 갖는 다면, 유사하게 균형된 혼성화 신호가 어레이에 나타내는 모든 5개의 염색체에서 예상될 것이다. 만약 두 임산부 중 한명이 전체 염색체 이수배수체(예, 21번 삼염색체)를 갖는다면, 염색체를 나타내는 올리고 세트는 다른 4 염색체와 비교시 두개의 플루오로크롬(fluorochromes)의 전반적으로 상대적으로 불균형되게 보일 것으로 예상된다. 태아의 성별은 성 염색체 프로브 세트로부터의 신호 평균 비율에 의해 반영될 것이다. 염색체를 나타내는 모든 ~100 주소들로부터 얻은 데이터는 집단으로 생각되기 때문에 어레이에서 어떤 주어진 주소에 대한 신호 불균형 정도는 클 필요가 없다.
이 도식의 성공여부를 결정하는 중요한 파라미터는 혼성화 프로브에 나타나는 영양막/태아-특이 엠플리콘의 정도이다. 분명하게, 깨끗한 태아 DNA로 시작하면, 이 기술을 사용한 이수배수체의 감지는 자명할 것이다. 이와 마찬가지로, 태아 및 모체 DNA의 동량 혼합물로 시작하면, 영양막/태아 서열의 메틸화-민감성 표현형들은 프로브 양의 50% 이상에서 잘 종료될 것이며 이수배수체 검출은 순수한 태아 DNA로 개시한 것과 마찬가지의 작업으로 예상된다. 영양막/태아 DNA의 비율이 감소하는 것과 같이, 이런 도식이 성공적으로 명백한 용이성이 감소된다. 이러한 점에, 개시 DNA가 영양막/태아의 1% 와 99% 모체로부터인 경우는 아래에 논의한 다.
이런 99:1 혼합물에서 메틸화-민감 증폭은 2개의 주요한 결과를 갖을 것이다. 첫째, 전체 서열의 복잡성은 ~98% 까지 감소될 것이다(아래 참조); 둘째, 영양막/태아-특이 절편들은 현존할 것이다. DNA 양(mass)의 측면에서, 영양막/태아-유래된 구성성분(특이 및 비-특이 모두)은 전체의 약 1.5-2%만이 있을 것이다. 영양막/태아 DNA가 저메틸화되는 양에서, 증폭의 효용과 비율은 증가하나, 데이타는 영양막/태아 표현형들에서 절편의 30% 이하가 영양막/태아-특이적임을 나타내기 때문에, 이 효과는 작다. 프로브 혼합물의 DNA의 총양의 ~2%만을 나타내는 혼성화 프로브가 믿을 만한 신호를 나타낼 수 있을 것인가? 이는 프로브 혼합물의 전체적인 복잡성에 의존한다. 우리의 메틸화-민감성 과정에 의해 생성되는 프로브의 대략적인 복잡성을 계산하기 위해, 크기 100-1500 bp의 ~17,000개의 HpyCh4-IV 절편들을 포함하는, DNA의 ~49 Mb으로 이루어진, 21번 염색체가 고려되었다. 메틸화는 증폭된 절편들 총 수가 ~1,700-3,400를 만드는 이들의 80-90%의 증폭을 차단할 것이다. 이들의 평균 크기는 ~500 bp이기 때문에, 총 증폭된 복잡성은 약 0.85-1.7 X 106 이거나 총 개시 서열의 약 1.5-3% 이다. 이것은 게놈의 DNA와 비교한 복잡성에서 대략적으로 97-98% 감소에 대응된다. 1%의 영양막/태아 DNA를 포함하는 DNA 샘플로부터 생성되는 혼성화 프로브는 영양막/태아 구성성분으로부터 유래된 이들 덩어리의 ~2%만을 가질 것으로 예상되나, 전체적인 복잡성은 98%까지 감소하기 때문에, 영양막/태아 특이 프로브의 유효한 농도는 전체 게놈 프로브에서 어떤 주어 진 단편의 농도와도 유사하다. 그러므로, 영양막/태아로부터 유래된 최소 1%의 DNA의 메틸화-특이 증폭된 표현형들로부터 유도된 프로브는 전혈 프로브의 것보다 좋거나 동일한 혼성화 신호를 나타낼 것으로 예상된다. 분명하게, 영양막/태아 DNA의 높은 개시 비율은 비례적으로 강한 신호를 제공할 것이다.
실험 디자인
어레이
실시예 5는 5개의 관련있는 염색체로부터의 영양막/태아 특이 엠플리콘을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브에 대해 논하고 있다. 위에서 진술한 것과 같이, 이런 엠플리콘의 수는 염색체당 약 200개 이거나 전체 약 1,000일 것으로 추정된다. 어떤 어레이도 사용될 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 합성된 올리고들이 유리 슬라이드위에 고정된 어레이도 사용될 수도 있다. 유리 슬라이드에서 올리고뉴클레오티드 어레이를 생산하기 위한 많은 과정들이 공지되어 있다(Guo et al. Nucleic Acids Res 22:5456-65(1994); Zammatteo et al. Anal Biochem 280:143-50 (2000); Kimura et al. Nucleic Acids Res 32:e68 (2004)). 실시예 5에서 기술된 ~1,000개의 예상되는 영양막/태아-특이적에 대응되는 올리고뉴클레오티드 서열과 이들의 ~500개에 대해 상업적으로 합성된 올리고들(염색체당 ~100개)을 얻었다. 이러한 올리고들의 어레이는 다음의 프로토콜에 따라 생산된다. 모든 올리고들은 이중으로 표시되고, 유사하게 예상되는 Tm를 갖는 비-동질성(non-homologous) 올리고들은 음성 대조군으로 표시된다. 양성 혼성화 대조군으로, 프로브로부터 유래된 영양막/태아 및 말초혈액에 동일하게 혼성화된 염색체당 ~10 엠플리콘(실시예 5로 부터)들이 포함된다. 아래에 기술된 시험 혼성화에서 잘 작용하지 않는 이러한 올리고들은 어레이에서 제거되며 더 나은 기능의 다른 것들로 대체된다.
어레이의 측정을 위한 혼성화 프로브
초기에 위에서 계획한 바와 같이, 믿을 만한 영양막/태아-특이 혼성화 신호가 비교 혼성화를 통해 얻을 수 있는 지를 결정하였다. 이러한 어레이를 수반한 혼성화의 초기 시도는 실제 모체 샘플 보다는 세포유전학적으로 정상 영양막/태아 및 전혈 DNA의 "인공의" 혼합물을 이용하였다. 초기에, 3가지 이런 혼합물(A, B 및 C)은 3가지 분리되는 영양막/태아/혈액 DNA쌍으로부터 제조되었고, 3가지 모두에서 2 가지 DNA의 1:1 비율이 사용될 것이다. 3가지 각각에서, 전혈 DNA는 여성으로부터이나, 영양막/태아 샘플의 두개는 남성 및 세번째는 여성이다. 그리고나서 메틸화-특이 표현형들은 위와 같이 다음의 동일한 프로토콜에 의해 제조된다. 다음의 선형화(linearization) 및 평균 크기와 농도의 결정, 프로브 라벨링은 다음의 프로토콜에 따를 것이다. (Ushijima et al. Proc Natl Acad Sci USA 94:2284-9 (1997); Brennan et al. Cancer Res 64:4744-8 (2004)). 이들에게 중요한 것은 Klenow 연장(extension)동안 라벨링된 dNTP 뿐만 아니라 직접적으로 라벨링화된 무작위 프라이머의 사용이다. 세가지 혼합물(A, B 및 C) 모두는 각각의 혼합물이 다른 것들뿐만 아니라 자기 자신에 대해서도 상대적으로 혼성화되도록 하기 위해서 각각의 반응액 (6 총 프로브들)에서 Cy3 와 Cy5 모두로 라벨링될 것이다.
1:1 혼합물에서 만들어진 프로브는 매우 강한 혼성화 신호를 나타낼 것이며 영양막/태아 DNA의 비율이 감소함에 따라 신호 세기는 이에 대응하여 감소될 것이다. 6 가지 가능한 쌍의 상대적인 혼성화의 수행은 3가지 영양막/태아/전혈 혼합물로부터 기인하고(AA, AB, AC, BB, BC 및 CC), 기술의 믿을 만한 재생 가능성에 대한 중요 데이타가 얻어진다.
데이타 분석
실시예 5에서와 마찬가지로, 기초 어레이 데이타(row array data)는 복제물의 일치뿐만 아니라 양성 및 음성 혼성화 대조군에 대응하는 신호 강도를 측정함으로써 정성을 평가하고, 신뢰하기 어려운 스팟들은 배제된다. 각각의 혼성화에 있어서, 각 어레이 주소와 관련된 평균 신호 비율이 측정된다. 비율은 log2 전환되고, 어레이의 각각의 개별적인 수치에서 전체 어레이의 평균 로그 비율 값을 제하여 표준화된다. 각 올리고들은 두번씩 표시되고 각 혼성화는 반대 색깔로 두차례씩 이루어지기 때문에, 각 평균-비율은 4개의 혼성화에 기초한다. 3개의 상염색체(autosomes)에 대한 표준화된 log 비율은 모든 세포유전학적으로 정상이기 때문에 모든 이들의 비교에서 0 근처에서 집중된다. 변수 기술의 표준 분석("ANOVA")은 세포유전학적으로 정상 샘플로 수행되는 혼성화간에 보여지는 변수의 정도의 예비 측정을 위해 적용된다. 성 염색체의 신호 비율은 이 분석을 통해 분명해진다. 남성에서 남성으로, 여성에서 남성으로 및 여성에서 여성으로의 세가지 가능성이 시험된다. 이런 상황 모두에서, XX가 상대적으로 XY에 혼성화될때, 한 색깔에서 ~2:1 X 유래한 신호일 것이며, 다른 색깔에서는 Y 신호의 매우 분명하게 다른 비율일 것이다.
영양막/태아 및 전혈 DNA의 1:1 비율은 믿을 만한 혼성화 후, 동일한 DNA를 사용한 대조 혼성화이나 전혈:영양막/태아의 10:1 비율의 동일한 DNA를 사용하여 대조 혼성화 동일 세트를 실시했다. 유사하게, 50:1 혼합물을 사용한 전체 연습도 하였다. 이 연습은 태아 DNA의 초기 비율을 결정하는데 중요하고 샘플은 이 기술을 통해 성공적으로 분석하기 위해 반드시 포함된다. 전혈 영양막/태아 DNA의 50:1 비율이 편리하다면, 증폭된 표현형들을 위해 개시로서 모체 혈장 및/또는 자궁 샘플을 사용하는 것이 가능할 것이다.
이수배수체 검출
위의 실험에서 얻은 데이타는 메틸화-특이 증폭을 이용하여 이수배수체 검출에 사용될수 있다. 이 점에서, 10:1 및 50:1의 비율에서 정상 전혈 DNA 및 21번 삼염색체의 영양막/태아 DNA의 "인공" 혼합물이 제조된다. 이런 혼합물들은 Cy3 와 Cy5 모두로 메틸화 특이 혼성화 프로브를 만드는데 사용되고 이들은 전술된 3 가지 세포유전학적으로 정상 혼합물 뿐만 아니라 상대적으로 자체적으로 혼성화된다. 자체적으로 21번 삼염색체의 상대적인 혼성화에서, 21번 염색체의 평균 비율은 각 프로브가 21번 염색체의 3가지 카피를 갖고 있기 때문에 다른 2가지 상염색체의 평균 비율과 유사하다. 21번 삼염색체 혼합물이 정상 혼합물에 상대적으로 혼성화될 때, 21번 염색체 평균 비율은 한 샘플에서 21번 염색체의 세가지 카피 및 다른 것에서 2가지를 반영하는 다른 상염색체들과는 분명히 다르다.
이 분석을 정식화하기 위해, 모든 3가지 상염색체를 통하는 평균 log2 비율은 ANOVA를 사용하여 비교한다. 이것은 모든 염색체의 평균 log 비율에 대한 동일한 전반적인 귀무가설(null hypothesis)을 시험하기 위한 능력을 제시하고, 귀무가설을 반하는 것은 불균형을 갖는 적어도 하나 이상의 염색체를 포함하는 것을 의미한다. 개별적인 염색체에서부터 다른 염색체부터의 데이타의 log2 평균 비율간 단위 환산 비교(pair- wise comparisons)를 수행함으로써, 어떤 염색체가 불균형 신호를 제공하는지를 결정하는 것이 가능하게 되었다. 3 가지 추가적인 가설이 시험될 것이기 때문에, 본페로니 검정(Bondferroni correction)을 사용한다. 그러므로, 전체 귀무가설은 0.05 레벨에서 시험될 것이고 만약 거절된다면, 염색체-특이 단위 환산 가설은 0.015 레벨에서 시험될 것이다.
염색체 당 대략적으로 100 어레이가 제공됨에 따라, 이수배수체 검출에 매우 효과적이다. 이론적으로, 1.5(log 2 스케일에서 0.58)의 평균 비율에 대응되는 카피수의 어떤 증가를 탐지하는 것은 바람직하다. 그러나 3:2(3 염색체성과 같은)의 카피수에서 증가를 보여주는 실험은 데이타의 노이즈때문에 1.15(log2 스케일에서 0.2)만큼 낮은 비율이 관찰되는 것과 상응한다. 검증력 분석(power analysis)는 만약 log2 평균 신호 비율 범위가 0.1 에서 0.2(전형적인 값)의 표준 편차이며 추정 0.01의 타입 1 에러 비율로 추측된다면, 주어진 단위 환산 비교에서, 0.2(log2 스케일)의 카피수 증가를 감지하기 위해 ~99.99% 검증력 이상일 것 임을 보여준다. 0.4의 표준편차일지라도, 어떤 것은 혼성화의 많은 노이지와 저질을 나타내고, 이수배수체의 검출에 대한 검증력은 97%이다.
실제 모체 샘플의 실험
위에 기술된 공지의 정상 및 공지의 삼염색체 DNA의 혼합물과 비교한 혼성화의 모든 데이타는 믿을만한 혼성화를 얻기 위해 필수적인 태아 DNA의 비율을 결정하기 위해 허용되고 결국 삼염색체 결정이 가능하게 된다. 위에서 인용한 모든 이유들에 기초할때, 태아 DNA의 낮은 비율(2-5%)에서도 성공적임을 알 수 있다. 그러므로, 실시예 6에서와 마찬가지로, 샘플의 각 유형은 자신의 세기와 약함을 가지기 때문에, 혈장 및 자궁 세척에서 유래된 DNA에 대한 분석이 이루어졌다. 실시예 6에서와 마찬가지로 임의로 종료된 경우뿐만 아니라 임신중(모체 혈액 샘플)에서 샘플 수집은 이루어 졌다. 이와 마찬가지로 증폭된 표현형질의 제조 역시 확인되었다. 사실, 동일한 증폭된 표현형들은 이 예뿐만 아니라 실시예 6에서도 사용될 수 있다. 상대적인 혼성화는 일상적인 세포유전학적 분석이나 QF-PCR을 통해서 측정되는 것과 같이 정상 태아 핵형(karyotypes)을 갖는 샘플 쌍과 수행된다.
사실상, 자궁 세척(cervical lavage)군뿐만 아니라 혈장 DNA 군 모두에서 2 개의 비-임신군뿐만 아니라 이런 4개의 임신 샘플이 사용되고, 총 12 샘플이 주어 졌다. 단위 환산 비교(pair-wise comparison)로 각 군에 대한 15가지 분석결과가 나왔다. 각각은 반대 염료로 수행되기 때문에 혼성화의 실제 수는 30이다. 이러한 혼성화로부터의 데이타의 분석은 상술한 바에 따라 실시되며, 이들은 하기의 중요한 정보의 여러 단편들을 제공한다: 상기 배경(background)이 되는 신호를 신뢰할 수 있도록 얻기 위한 능력; 신호 세기에서 예상되는 정상 변수의 범위; 및 세포유전학적으로 정상 샘플에 대하여 염색체간의 log 평균 비율의 비교가 적절히 0 근처에서 중심화되는지에 대한 여부.
믿을 만한 태아 혼성화 신호는 모체 샘플의 메틸화-민감 증폭된 표현형으로부터 얻어질 수 있으며 이수배수체 검사에 사용될 수 있다. 언급한 바와 같이, 이 효과는 가장 관련성이 있으며 가장 유용하기 때문에 21번 삼염색체를 수반하여 시작한다. 프로브들은 21번 삼염색체 임산부로 기록된 환자들로부터 얻은 자궁 및 혈장 샘플로부터 제조된다. 이들은 정상군에서부터 제조되는 프로브뿐만 아니라 서로 상대적으로 혼성화된다. 통계학적 분석은 위에서 기술된 실험에서처럼 정확히 진행된다. 믿을만한 혼성화가 얻어지기 때문에, 이수배수체 검출을 위한 검증력은 매우 높다.
산전 검사의 가능성 뿐만 아니라, 본 발명의 방법은 생물학(biology)를 더욱 자세히 이해하기 위해서도 사용될 수 있다. 예를 들면, 실시예 5에서 논의된 유형의 마이크로어레이 분석은 영양막/태아 메틸화의 산모나이 의존도를 검사하기 위해 사용될 수 있다. 예비 관찰은 임신과정에 따른 메틸화의 광범위한 변화를 추측하나 어떤 변화가 태반 유전자 발현이나 기능에서 무슨 역할을 하는지에 대한 이해는 없는 실정이다. 이와 같이, 질병에서 태반 메틸화의 역할에 대한 조사는 없었다. 본 출원에서 계획된 이런 실용주의 목적에 비추어, 다른 소스로부터 유래된 영양막모세포/태아 및 체성 DNA간의 메틸화 차이의 종합적인 측정에 대한 방법의 발전은 많은 흥미로운 생물학적 용도를 가질 것으로 보인다. 예를 들면, 자간(preclampsia), 자궁내 태아 성장 제한(intrauterine fetal growth restriction), 임신이상(molar pregnancy) 및 기타와 같은 질병상태에서 영양막/태아 메틸화의 전반적인 변화들을 찾을 수 있을 것이다. 장기적으로, 메틸화-민감 증폭과 마이크로어레이 혼성화의 결합은 초기 임신 실패, 자궁내 성장제한, 자간 및 기타과 같은 질병 상태에서의 태반 메틸화의 체계적인 산출을 가능하게 할 것이다.

Claims (15)

  1. a) 혼합된 태아/모체 DNA 샘플에서 DNA를 추출(isolating)하는 단계;
    b) 메틸화 특이 효소로 DNA를 절단(digesting) 하는 단계;
    c) 링커로 절단된 DNA를 리게이션(ligating)하는 단계;
    d) 절단된 DNA를 링커-매개 PCR 증폭하여 증폭된 PCR 생성물을 얻는 단계;
    e) 증폭된 생성물로부터 링커 및 프라이머 DNA를 제거하는 단계;
    f) 증폭된 PCR 생성물을 원형화(circularizing) 하는 단계;
    g) 원형화된 PCR 생성물을 엑소뉴클레아제 절단(exonuclease digestion)하여, 비원형화된 DNA를 단일 뉴클레오티드로 환원시키는 단계; 및
    h) 상기 g)단계에서의 생성물을 등온 롤링 원형 증폭(isothermal rolling circle amplification)하여 선택적으로 태아 DNA를 증폭하여, 태아 DNA로부터 메틸화 민감성 표현형을 생산하는 단계
    를 포함하는 혼합된 태아 및 모체 DNA 샘플에서 태아 DNA를 선택적으로 증폭하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 메틸화 특이 효소는 HpyChIV-4, ClaI, AclI 또는 BstBI인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 링커 매개 PCR 증폭은 12주기동안 수행되는 것인 방 법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제 절단은 Bal-31을 사용하는 것인 방법.
  5. a) 제1항의 방법을 이용하여 태아 DNA 및 전혈 DNA로부터 메틸화 특이 표현형들을 분리하여 준비하는 단계;
    b) 태아 DNA 및 전혈 DNA를 라벨링하여, 라벨링된 태아 DNA-프로브 및 라벨링된 전혈 DNA 프로브를 생산하는 단계;
    c) 라벨링된 DNA 프로브를 올리고뉴클레오티드의 두개의 동일한 어레이에 혼성화하는 단계로서, 상기 뉴클레오티드의 어레이는 주어진 메틸화-민감성 효소에 의해 예측되는 제한 단편에 상응하는 것인 단계;
    d) 두개의 어레이를 서로 비교하여, 태아 DNA 프로브에 배타적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 발견하는 단계;
    e) 상기 d) 단계에서 얻은 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 태아-특이 엠플리콘(amplicon)으로 동정하는 단계
    를 포함하는 태아-특이 엠플리콘을 동정하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 태아 DNA 프로브 및 전혈 DNA 프로브는 두개의 다른 라벨로 라벨링되며, 상기 라벨링된 프로브의 혼성화는 단일 어레이에 대한 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 a) 단계에서 사용된 메틸화 특이 효소는 HpyCh4-IV인 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 태아 DNA는 임신 첫 3개월에서 얻어지는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 태아 DNA는 임신 약 56-84일에서 얻어지는 것인 방법.
  10. 제5항의 방법에 의해 생산되는 태아-특이 엠플리콘의 라이브러리.
  11. 제10항의 태아-특이 엠플리콘의 라이브러리를 포함하는 어레이.
  12. a) 제1항의 방법을 이용하여 시험 샘플 및 대조 샘플내에 태아 DNA의 미리 결정된 유전자좌(locus)를 선택적으로 증폭시키는 단계로서, 상기 대조 샘플은 태아 DNA의 미리 결정된 유전자좌에서 정상 카피수를 갖는 것인 단계;
    b) 시험 샘플에서의 증폭된 DNA 양과 대조 샘플에서의 증폭된 DNA 양을 비교하는 단계; 및
    c) 감소된 카피수(copy number)에 대한 증폭된 DNA의 감소 양 또는 카피수 증가에 대한 증폭된 DNA의 증가량의 상관성을 파악하는 단계
    를 포함하는, 태아 및 모체 DNA의 혼합물에서 미리 결정된 유전자좌에서 정 상 카피수와 비교시, 태아 DNA의 미리 결정된 유전자좌의 카피수의 증감여부를 결정하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 비교는 시험 샘플 및 대조 샘플에서 동일한 카피수로 존재하는 미리 결정된 유전자좌로부터의 증폭된 DNA를 대조 유전자좌로부터 증폭된 DNA로 정상화하는 것을 포함하는 방법.
  14. a) 제1항의 방법을 사용하여 시험 샘플 및 대조 샘플내에 태아 DNA를 선택적으로 증폭하는 단계로서, 상기 대조 샘플은 미리 결정된 유전자좌에서 정상 카피수를 갖는 것인 단계;
    b) 상기 a)단계에서 얻은 대조 샘플로부터의 DNA 및 시험 샘플로부터의 DNA를 라벨로 라벨링하여, 라벨링된 시험 DNA 프로브 및 라벨링된 대조 DNA 프로브를 얻는 단계;
    c) 라벨링된 시험 DNA 및 라벨링된 대조 DNA 프로브를 제11항의 태아-특이 엠플리콘의 어레이에 혼성화하는 단계;
    d) 시험 DNA 프로브 및 대조 DNA 프로브간 혼성화 양을 비교하여, 신호강도를 결정하는 단계;
    e) 시험 샘플의 미리 결정된 유전자좌에서 카피수의 증가 또는 감소에 대한 신호의 상관성을 파악하는 단계
    를 포함하는, 시험 샘플에서 정상 카피수와 비교시, 미리 결정된 유전자좌 카피수의 증감여부를 결정하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 시험 샘플 DNA 및 대조 샘플 DNA는 두개의 다른 프로브로 라벨링되며, 상기 혼성화는 하나의 어레이에 대한 것인 방법.
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