KR20080101303A - 생장이 촉진된 고추 씨에이피엘에이원 (ＣａＰＬＡ１)형질전환 식물체 및 고추 씨에이피엘에이원 (ＣａＰＬＡ１)유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생장이 촉진된 고추 씨에이피엘에이원 (CaPLA1) 형질전환 식물체와 그 유전자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고추 유묘의 뿌리털 발달 과정에서 특이적으로 발현되는 유전자들 중 phospholipase A1을 코딩하는 CaPLA1가 과다발현하는 형질전환 식물체는 뿌리 발생 초기 생장이 빨라질 뿐만 아니라, 잎의 크기가 커지며, 엽병 또한 길어져 전체적으로 빠른 성장을 나타냄으로써, 뿌리 발달 향상으로 인한 생산성과 기능성이 증가된 신기능 작물을 제공할 수 있다.

고추, 뿌리, CaPAL1, phospholipase A1, 효소, 활성

Description

생장이 촉진된 고추 씨에이피엘에이원 (ＣａＰＬＡ１) 형질전환 식물체 및 고추 씨에이피엘에이원 (ＣａＰＬＡ１) 유전자{Rapidly growth phenotype of CaPLA1 overexpressing plants and hot pepper CaPLA1 gene}

도1은 CaPLA1 유전자의 염기서열을 분석한 그림이고,

도2는 CaPLA1 단백질의 아미노산 서열을 분석한 그림이고,

도3은 CaPLA1 단백질의 효소활성을 분석한 그림이고,

도4는 CaPLA1이 과다발현된 형질전환체의 표현형을 심층분석한 결과를 나타 내는 그림이다.

본 발명은 생장이 촉진된 고추 씨에이피엘에이원 (CaPLA1) 형질전환 식물체 및 그 유전자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고추 유묘의 뿌리털 발달 과정에서 특이적으로 발현되는 유전자들 중 phospholipase A1을 코딩하는 CaPLA1가 과다발현하는 형질전환 식물체는 뿌리 발생 초기 생장이 빨라질 뿐만 아니라, 잎의 크기가 커지며, 엽병 또한 길어져 전체적으로 빠른 성장을 나타냄으로써, 뿌리 발달 향상으로 인한 생산성과 기능성이 증가된 신기능 작물을 제공할 수 있다.

지난 몇 년간, 식물 지질의 구조와 그 기능에 있어서 계속된 재기가 있어왔다. 고등 식물에 있어서 지질 물질 대사는 세포 신장, 기공개폐, 화분의 성숙, 노화, 방어기작처럼 다양한 세포 수준의 기능에 관여하는 중요한 역할을 한다. 이러한 과정은 다른 phospholipase들에 의해 중재된 인지질에서 파생한 신호 처리 네트워크와 관련이 있다. 살아있는 유기체에 있는 phospholipase는 인지질의 가수분해 위치에 따라 분류되어 phospholipase A (PLA), phospholipase C (PLC)와 phospholipase D (PLD)로 3개의 주된 형태로 나뉜다. 그 중에서도 PLA는 phospholipase A1 (PLA1)와 phospholipase A2 (PLA2)로 나뉘는데, 이는 인지질의 가수분해가 그들의 sn-1과 sn-2 위치 중 어느 곳에 촉매 작용을 하느냐에 따라 유리지방산과 잘려진 인지질로 잘려지게 된다. PLC는 일반적으로 diacylgrycerol (DAG)을 phosphorylated 머리그룹과 phosphoinositides로 나누는 효소 활성을 가진다. 반면에 PLD는 다양한 인지질을 기질로 사용하는데, phosphatidic 산과 수용성 유리머리그룹으로 나누는 효소 활성을 갖는다.

세 가지의 다른 phospholipase들 중에서 고등식물에서 그 기능이 잘 알려진 것은 PLD이다. PLD는 다양한 식물 스트레스 반응을 포함한 세포 수준에서 일어나는 광범위한 과정에 관여한다는 보고가 있어왔다. PLD의 5가지 이성질체들 중에서 AtPLDδ은 그 기능을 애기장대에서 연구한 결과, 앱사이식산, 추위, 가뭄, 과도한 염과 같은 스트레스 상황에서 이 유전자가 관여한다는 것을 알게 되었다. 한편, PLA2는 세포 신장과 신초의 굴지성에 관련하여 중요한 역할을 하는 옥신 신호 전달 체계에 관여한다. 또한 PLA2가 세포내 산성화를 통해 식물 방어 기작에 작용한다는 것이 알려져 있다. 게다가, PLA2 활성은 PLD에 의해 파생된 PA에 의해 증가되는데, 이는 동물 체계에서의 이차 신호 전달자로 인식되고 있다.

애기장대에서 PLA1은 여러 유전자군으로 존재하며, 최소한 12개의 이성질체가 있다. 이는 다시 세포내에서 각 유전자의 발현 위치에 따라 3개의 군으로 분류가 된다. 엽록체에서 발현되리라 생각되는 단백질들은 classⅠ, 세포질은 classⅡ, 마이토콘드리아는 classⅢ로 분류된다. 그러나 고등 식물에서 이들 PLA1에 대한 생리적 역할에 대한 규명은 다른 phospholipase들에 비해 다소 부족하다. 엽록체에서 발현되리라 생각되는 classⅠ군의 PLA1인 DAD1과 세포질에서 발현되리라 생각되는 classⅡ군의 PLA1, 이들 2개의 이성질체 단백질만이 연구되었다. 이 중 DAD1은 자스모닉산 생합성의 첫 단계에 관여해 리놀레익산을 잘라 내는데, 이는 애기장대에서 화분 성숙과 약의 열 개, 꽃의 개화에 필요하다. 또 다른 하나의 PLA1은 UV-B에 반응하여 그 발현 수준이 올라간다는 것이 밝혀졌다. 이는 classⅡ PLA1단백질이 UV-B 처리에 의해 유도된 PR-1과 관련된 방어기작과 연관 되었으리라는 것을 제기할 수 있게 한다.

본 발명은 고추 유묘의 뿌리 발생 초기에 특별히 발현되는 CaPLA1의 cDNA를 분리하고, 그 효소 활성을 분석한 후 모델 식물로써 애기장대에서 CaPLA1을 과다발 현시킨 형질전환 식물체에서 CaPLA1의 기능을 분석한 내용에 관한 것이다. 본 발명의 CaPLA1 형질전환 식물체는 뿌리 발생 초기 생장이 빨라질 뿐만 아니라, 잎의 크기가 커지며, 엽병 또한 길어져 전체적으로 빠른 성장을 나타냄으로, 뿌리 발달 향상으로 인해 생산성과 기능성이 증가된 신기능 작물을 제공할 수 있음으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 식물의 뿌리 발생 초기에 생장을 촉진시키는 phospholipase A1을 코딩하는 고추 유래의 CaPLA1 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaPLA1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaPLA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaPLA1 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 식물의 뿌리 발생 초기에 생장을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 식물의 뿌리 발생 초기에 생장이 촉진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaPLA1 형질전환 식물체의 종자를 제공하는 것이다.

본 발명은 생장이 촉진된 고추 씨에이피엘에이원 (CaPLA1) 형질전환 식물체 및 고추 씨에이피엘에이원 (CaPLA1) 유전자에 관한 것이다.

본 발명에 따른 CaPLA1 단백질의 범위는 고추로부터 분리된 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 식물의 뿌리 발생 초기에 생장을 촉진시키는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 CaPLA1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 CaPLA1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네 이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아 그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 CaPLA1 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 식물의 뿌리 발생 초기에 생장을 촉진시키는 방법을 제공한다.

식물체에서 CaPLA1 유전자를 과발현시키는 방법으로는 CaPLA1 유전자를 포함하고 있는 식물체 또는 CaPLA1 유전자를 포함하고 있지 않은 식물체 내로 CaPLA1유전자를 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기에서 "유전자의 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 CaPLA1 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 CaPLA1 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 CaPLA1유전 자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다. 또한, 단자엽 식물이나 목본식물체에서 CaPLA1 유전자를 과발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 식물의 뿌리 발생 초기에 생장이 촉진될 수 있는 식물체로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류가 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 식물의 뿌리 발생 초기에 생장이 촉진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에 따른 식물의 뿌리 발생 초기에 생장이 촉진된 식물체는 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　보다 구체적으로, 본 발명의 식물체는 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 CaPLA1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　즉, CaPLA1 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다.　약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다.　뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 식물의 뿌리 발생 초기에 생장이 촉진된 식물체를 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

CaPLA1의 전체 cDNA를 분리한 결과 전사되지 않는 부분을 포함해 1,460bp를 가지고 있다(도1).

CaPLA1 단백질의 아미노산 서열 분석 결과 lipase 도메인을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었고, 다른 종의 lipase들과 상동성이 높음을 알 수 있다(도2).

CaPLA1 단백질의 효소 활성 분석하고자 박테리아 체계를 이용해 단백질을 과다발현시켜 순수 분리, 정제하여 효소 활성 실험을 수행하였다. 먼저CaPLA1 단백질의 아미노산 서열 분석 결과 lipase임을 확인한 후, 특이적인 기질이 phosphatidylethanolamine이라는 것을 알아내었다. 또한 이 단백질의 최적 활성을 나타내기 위한 여러 조건하에서 실험을 수행하였으며, 특히 기질이 결합하는 부위라 예상되는 곳에 인위적으로 돌연변이를 주어 그 부위가 기질이 결합하는 부위가 맞다는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 종합해 볼때, CaPLA1이 phospholipase A1임을 확인할 수 있다(도3).

먼저 MBP와 융합된 CaPLA1을 lipase의 기질인 p-nitrophenol butyrate와 반응을 시켜 lipase의 활성을 가지는지 테스트를 했다 (도 3.A). 그 결과 lipase의 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었고, MBP와 융합하여도 CaPLA1의 활성에는 영향이 없음도 확인하였다. 따라서 MBP와 융합된 CaPLA1으로 효소 활성 실험을 하기로 한다. CaPLA1에 특이적인 기질을 찾기 위해 여러 기질들로 효소 반응을 한 결과 포스파티딜콜린에 특이적임을 알 수 있었다(도 3. B) 또한 CaPLA1의 효소적 특성을 알아 보기 위해 최적의 pH 조건을 실험한 결과 pH 6에서 최적 활성을 나타내었다(도 3. C) CaPLA1의 경우 phopholipase들의 기질 결합 부위인 catalytic triad를 가지고 있는데, 이를 확인하고자 catalytic triad를 돌연변이 시켜서 효소활성을 확인하였다(도 4. D) 그 결과 돌연변이된 효소에서 그 활성이 매우 낮은 것으로 보아 그 부위가 CaPLA1의 활성에 중요한 것으로 판단할 수 있다.

CaPLA1을 과다발현 시킨 애기장대의 표현형을 분석하기 위해 박테리아를 이용해 애기장대에 CaPLA1을 과다발현 시켰다. 3-5일 정도된 유묘의 뿌리 발생 초기에 뿌리의 길이가 야생형보다 더 길어지고, 12일 정도된 식물체에서는 잎이 야생형보다 더 길어지고 엽병이 길어졌다. 또한 꽃대가 야생형보다 더 빨리 오며 키도 커지는 표현형을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 종합해 볼때, CaPLA1이 고추의 생장과 발달에 관여하고 있음을 알 수 있다(도4).

CaPLA1을 과다발현 시킨 애기장대를 4일째에 뿌리를 비교한 결과 야생형 보다 그 길이가 약 1.2-1.5배 정도 길어지는 것을 확인하였다(도4. a). 또한 12일째에 되어서는 잎의 크기가 야생형에 비해 약 2배 정도 커지는데, 특히 잎의 길이가 2배 정도 길어진다. 엽병의 경우도 야생형 보다 2배 정도 길어지는 모습을 확인할 수 있다(도4. b). 약 4주째가 되어서는 위와 같은 반응의 결과에 따라 꽃대가 빨리 올라오고, 키가 커지는 양상을 보였다(도4. c). 이는 야생형에 비해 2,3일 정도 꽃대가 빨리 올라오며, 이에 따라 키도 약 2배 정도 커지는 것으로 확인된다(도4. d).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예1; CaPLA1 유전자의 클로닝 및 분석>

5일된 고추 유묘의 뿌리에서 mRNA를 추출하여 이미 구축된 cDNA 라이브러리에서 이 중 무작위로 2,000개의 cDNA를 선별하고 시퀀싱을 통해 단편의 시퀀스를 확보하였다. 그 후 BLAST 프로그램으로 단편의 뉴클레오타이드를 분석하였다. 그 결과 pCaPLA는 잠정적인 phospholipase의 상동체를 암호화하고 있는 것으로 보여졌다. 그 후 라이브러리 스크리닝을 통해 pCaPLA1의 뉴클레오타이드 전장을 분리하였고, 이는 약 1,460 bp 였다. 이 중 전사되지 않는 부분이 5’ 쪽으로 59 bp, 3' 쪽으로 206 bp가 되며, 전사되는 부분은 1,194 bp로 398개의 아미노산을 암호화하고 있다. pCaPLA1 단백질은 45.1 kDa 이며, pI 값은 6.1이다.

<실시예2; CaPLA1 단백질의 아미노산 서열을 분석>

pCaPLA1은 잠정적인 PLA 단백질들과 비교하였다. CaPLA1을 데이터베이스 검색 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 프로그램을 이용해 상동성이 높은 유전자를 알아냈다. 상동성이 높은 유전자들과 CaPLA1의 아미노산을 얼라인먼트(alignmnet)하였다(http://workbench.sdsc.edu에서 제공하는 얼라인먼트 프로그램 이용). 그 결과 lipase의 컨센서스(consensus) 시퀀스가 일치하는 것을 결과를 얻어서, CaPLA1이 lipase 활성을 갖을 수 있음을 예상할 수 있었다.

<실시예3; CaPLA1 단백질의 발현 및 정제>

말토오즈에 결합하는 단백질과 CaPLA1을 융합시켜 발현시킬 플라스미드를 재조합하기 위해 CaPLA1의 코딩 부분의 5’쪽에 EcoRI을 태깅하고(5’- gaattcatgggtagcatggctgagaa-3’(서열번호3)), 3’쪽은 CaPLA1 specific primer(5’-tcagaactcataatcatcacgatc-3’(서열번호4))를 이용해 PCR을 수행하였다. PCR 결과물과 pMAL-X vector(New England Biolabs, Beverly, MA)를 EcoRI과 XhoI으로 자른 후 라이게이션(ligation)을 하였다. 재조합된 MBP-CaPLA1을 대장균 BL21-CodonPlus (DE3) RIL(Stratagene)에 발현시킨 후, 아밀로즈 컬럼 크로마토그래피를 이용해 정제시켰다. 단백질은 표준 단백질로 BSA를 이용해 정량하였다(Bradford, 1976, A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal Biochem., 72:248-54).

<실시예4; CaPLA1의 효소 활성 측정>

lipase 활성을 측정하기 위해 p-nitrophenyl butyate(PNPB; Sigma-Aldrich)를 기질로 하여 사용하였다. 효소 활성 반응물에 50 mM 칼륨 인산 버퍼, pH 6.0, 0.1 M 염화나트륨, 0.75 mM 기질과 15 ug 효소를 총 100 ul에, 상온에서 5분간 반응시켰다.

CaPLA1 효소에 특이성을 갖는 기질을 찾기 위해 콩에서 추출한 포스파티딜콜린(PC, phosphatidylcholine; Sigma-Aldrich), 밀에서 추출한 모노갈락토실다이아실글리세롤(MGDG, galactosyl diglyceride; Sigma-Aldrich)과 트리아실글라이세롤(TAG, triacylglycerol; Sigma-Aldrich)을 기질로 사용했다. 효소 반응물에는 50 mM 칼륨 인산 버퍼, pH는 5.0에서 8.0까지, 0.8 mg/ml 기질과 15 ug 효소를 총 200 ul에, 30도에서 30분간 반응시켰다. 기질은 반응물에 혼합하기 전에 30초동안 소니케이션 을 이용해 이멀지파이(emulsify) 시킨다. 클로로포름을 넣어 효소 반응을 정지시키고, 유리지방산을 추출한다. 그 후 질소 가스를 이용해 건조시킨다. 유리지방산은 리놀레인산을 표준으로 하고, 그 값은 진단키트로 측정한다(NEFA; Wako Pure Chemical). 대조군으로 Rhizomucor miehei lipase(Sigma-Aldrich)와 Candida rugosa lipase도 반응시켰다.

MBP-CaPLA1을 여러 다른 아미노산으로 바꾼 돌연변이는 Ser²²¹, Asp²⁸⁵, His³²², Asn²³⁷ 그리고 Lys³¹³ 잔기를 돌연변이 프라이머(CaPLA S221G-s; 5'-ctgtgacaggccacGgcctaggtgcatc-3'(서열번호5), CaPLA S221G-as; 5'-GATGCACCTAGGCCGTGGCCTGTCACAG-3(서열번호6)', CaPLA D285G-s; 5'-gattcacaacttattggGtattgttccaaaatac-3(서열번호7)', CaPLA D285G-as; 5'-GTATTTTGGAACAATACCCAATAAGTTGTGAATC-3(서열번호8)', CaPLA H322G-s; 5'-gtggtcagctggGGtttgttggaacc-3(서열번호9)', CaPLA H322G-as; 5'-GGTTCCAACAAACCCCAGCTGACCAC-3(서열번호10)', CaPLA N237G-s; 5'-gacatagccttcGGtggtatcaacaag-3'(서열번호11), CaPLA N237G-as; 5'-CTTGTTGATACCACCGAAGGCTATGTC-3'(서열번호12), CaPLA K313G-s; 5'-aatctccgtatgtggggcctcctggcgaag-3'(서열번호13), CaPLA K313G-as; 5'-cttcgccaggcggccccacatacggagatt-3'(서열번호14))로 PCR하여 Gly잔기로 대체(S221G, D285G, H322G, N237G, K313G)했다. 이를 대장균에 발현시켜 분리, 정제하여 PNPB를 기질로 하여 실험하였다.

<실시예5; CaPLA1이 과다발현된 형질전환체 제작>

CaPLA1을 애기장대에 과다 발현시키기 위해 CaPLA1의 cDNA를 pBI121 운반 벡터(vinary vector)에 재조합하였다. CaPLA1 cDNA의 5’쪽에 BamHI, 3'쪽에 SacI을 붙이기 위한 primer (CaPLA_CDR_5'_BamHI; GGATCCATGGGTAGCATGGC-3’(서열번호15), CaPLA_CDR_3'_SacI; 5'-tcgagctcagaactcataatcatcacgatc-3'(서열번호16))로 PCR을 수행하였다. 이 PCR 반응물과 pBI121 벡터를 BamHI과 SacI으로 자른 후 라이게이션 한다. 이를 식물에서 발현시키기 위해 아그로박테리움 튜메파시엔스에 형질전환시킨다(Joo et al., 2004, Light differentially regulates the expression of two members of the auxin-induced 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene family in mung bean (Vigna radiata L.) seedlings. Planta 218;976-988). 애기장대 형질전환은 플로랄 딥(floral dip) 방법으로 수행했다 (clough and Bent, 1998, Plant J 16; 735-743). 종자는 0.5 X MS, 25 mg/l 카나마이신 배지에서 독립적인 형질전환 개체를 선별하였다.

<실시예6; CaPLA1이 과다발현된 형질전환체의 표현형을 심층분석 결과>

0.5 X MS(비타민 B5포함)와 1% 수크로오즈(sucrose), 0.8% 아가(select agar; Life Technology, Rockvile, MD, USA)를 포함한 배지의 pH를 5.7로 맞추어 제조한 후, 야생종과 과다발현체의 종자 표면을 소독하여 심었다. 뿌리 생장을 관찰하기 위해 종자를 심은지 5일째 될 때까지 22도의 빛 조건에서 키웠다. 뿌리가 생장하는 동안 에 배양접시 바깥쪽에서 뿌리 정단부를 마킹해 놓는다. 그 후 ScionImage software(Scion Corp., Frederic, MD, USA)를 이용하여 뿌리의 길이를 측정하였다.

잎의 크기를 관찰하기 위해서 멸균된 흙에 종자를 심어, 12일째 되었을 때 야생종과 과다발현체에서 각각 자엽부터 세 번째 잎까지 따서 그 크기를 비교해 본다. 또한 두 번째 잎은 ScionImage software(Scion Corp., Frederic, MD, USA)를 이용하여 엽장, 엽폭, 엽병의 길이를 측정한다.

꽃대가 올라오는 시기를 관찰하기 위해 야생종과 과다발현체의 종자를 멸균된 흙에 심고 22도의 계속된 빛조건의 배양실에서 키운다. 심은지 19일째부터 꽃대가 올라온 후의 키를 측정한다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 고추 씨에이피엘에이원 (CaPLA1)은 고추 유묘의 뿌리털 발달 과정에서 특이적으로 발현되는 유전자들 중 phospholipase A1을 코딩하는 CaPLA1로써, CaPLA1가 과다발현하는 형질전환 식물체는 뿌리 발생 초기 생장이 빨라질 뿐만 아니라, 잎의 크기가 커지며, 엽병 또한 길어져 전체적으로 빠른 성장을 나타냄으로써, 뿌리 발달 향상으로 인한 생산성과 기능성이 증가된 신기능 작물을 제공할 수 있다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Rapidly growth phenotype of CaPLA1 overexpressing plants and hot pepper CaPLA1 gene <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1460 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 1 gattggatcc ggcacgaggg aaaaaagagt gaaaaaagca taaaagatca atttgaagaa 60 tgggtagcat ggctgagaaa tgggaggaac ttagtgggaa gaacaactgg gaaggtctat 120 taaacccatt ggatcttgat cttcgtaaat acatcattca atatggagaa ttggctcaag 180 caacttatga cactttcatc tcagagagag catccaaata tgcaggagct agcagatact 240 cgatggaaaa tttctttacc aaagttggac ttgacccatc gaagtatcat gtaaccaaat 300 ttttctatgg tacctcatcc attccacttc ctgatgcttt catgacaagg tcattgtcaa 360 gggaagcatg gagcaaggaa tcaaatttta tggggtacat tgctgtggct actgatgagg 420 gtaaagttgc attgggaagg agggacattg tgattaattg gagaggaact ttgcaagtgt 480 tggagtgggt gaatgacctt cagtttttac ttgtcccagc accaaaagtt tttggtgatg 540 gaggcttgct tcctttgttt catcctttgg tgcatcatgg cttccataac atttatacaa 600 cggaaaatcc acggtcacaa tttaataaga catgtgtcag ggatcaggta atggaagaag 660 tgaaaagatt ggttgaggaa tacaagaatg aagaggtcag cataactgtg acaggccaca 720 gcctaggtgc atcacttgca acactaaatg cagttgacat agccttcaat ggtatcaaca 780 agtcaagcaa tggcaaggag ttcccagtga ctgcatttgt attcgcaagt cctaaagttg 840 gggatctcaa ttttcacaag gcattctcca aactgaagca tcttcacatc ctgaggattc 900 acaacttatt ggatattgtt ccaaaatacc cacccgttgg ctattttgac gttggtcagg 960 agctaatgat tgacaccact aaatctccgt atgtgaagcc tcctggcgaa gtggtcagct 1020 ggcatttgtt ggaaccatac ttgcatggca ttgctggcac ccaaggaatt ggaatgacag 1080 caggttttaa gcttgaagtg aatcgcgata tttcacttgt gaacaaacag tggatgatac 1140 tgaaagatga atattgtatt cctccacttt ggtggtctga gaagcacaaa ggaatggttc 1200 aacaacaaga tggatcttgg cttctccagg atcgtgatga ttatgagttc tgagagacca 1260 attggattcc aaattgttgc tttattattg cctttggttt catgtattgt ttgaataaaa 1320 ggttttcctc atgagcatgg gaaaatctca tcctatttta atgtatgcac gtattatggt 1380 tcctttataa tatgagtttt aatctaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaactcgag 1460 <210> 2 <211> 397 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 2 Met Gly Ser Met Ala Glu Lys Trp Glu Glu Leu Ser Gly Lys Asn Asn 1 5 10 15 Trp Glu Gly Leu Leu Asn Pro Leu Asp Leu Asp Leu Arg Lys Tyr Ile 20 25 30 Ile Gln Tyr Gly Glu Leu Ala Gln Ala Thr Tyr Asp Thr Phe Ile Ser 35 40 45 Glu Arg Ala Ser Lys Tyr Ala Gly Ala Ser Arg Tyr Ser Met Glu Asn 50 55 60 Phe Phe Thr Lys Val Gly Leu Asp Pro Ser Lys Tyr His Val Thr Lys 65 70 75 80 Phe Phe Tyr Gly Thr Ser Ser Ile Pro Leu Pro Asp Ala Phe Met Thr 85 90 95 Arg Ser Leu Ser Arg Glu Ala Trp Ser Lys Glu Ser Asn Phe Met Gly 100 105 110 Tyr Ile Ala Val Ala Thr Asp Glu Gly Lys Val Ala Leu Gly Arg Arg 115 120 125 Asp Ile Val Ile Asn Trp Arg Gly Thr Leu Gln Val Leu Glu Trp Val 130 135 140 Asn Asp Leu Gln Phe Leu Leu Val Pro Ala Pro Lys Val Phe Gly Asp 145 150 155 160 Gly Gly Leu Leu Pro Leu Phe His Pro Leu Val His His Gly Phe His 165 170 175 Asn Ile Tyr Thr Thr Glu Asn Pro Arg Ser Gln Phe Asn Lys Thr Cys 180 185 190 Val Arg Asp Gln Val Met Glu Glu Val Lys Arg Leu Val Glu Glu Tyr 195 200 205 Lys Asn Glu Glu Val Ser Ile Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala 210 215 220 Ser Leu Ala Thr Leu Asn Ala Val Asp Ile Ala Phe Asn Gly Ile Asn 225 230 235 240 Lys Ser Ser Asn Gly Lys Glu Phe Pro Val Thr Ala Phe Val Phe Ala 245 250 255 Ser Pro Lys Val Gly Asp Leu Asn Phe His Lys Ala Phe Ser Lys Leu 260 265 270 Lys His Leu His Ile Leu Arg Ile His Asn Leu Leu Asp Ile Val Pro 275 280 285 Lys Tyr Pro Pro Val Gly Tyr Phe Asp Val Gly Gln Glu Leu Met Ile 290 295 300 Asp Thr Thr Lys Ser Pro Tyr Val Lys Pro Pro Gly Glu Val Val Ser 305 310 315 320 Trp His Leu Leu Glu Pro Tyr Leu His Gly Ile Ala Gly Thr Gln Gly 325 330 335 Ile Gly Met Thr Ala Gly Phe Lys Leu Glu Val Asn Arg Asp Ile Ser 340 345 350 Leu Val Asn Lys Gln Trp Met Ile Leu Lys Asp Glu Tyr Cys Ile Pro 355 360 365 Pro Leu Trp Trp Ser Glu Lys His Lys Gly Met Val Gln Gln Gln Asp 370 375 380 Gly Ser Trp Leu Leu Gln Asp Arg Asp Asp Tyr Glu Phe 385 390 395 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 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Sequence <220> <223> primer <400> 12 cttgttgata ccaccgaagg ctatgtc 27 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aatctccgta tgtggggcct cctggcgaag 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cttcgccagg cggccccaca tacggagatt 30 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ggatccatgg gtagcatggc 20 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tcgagctcag aactcataat catcacgatc 30

Claims (9)

1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 식물의 뿌리 발생 초기에 생장을 촉진시키는 phospholipase A1을 코딩하는 고추 유래의 CaPLA1 단백질.
2. 제1항의 CaPLA1 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
6. 제2항의 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 식물의 뿌리 발생 초기에 생장을 촉진시키는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제6항 또는 제7항의 방법에 의해 식물의 뿌리 발생 초기에 생장이 촉진된 형질전환 식물체.
9. 제8항의 형질전환 식물체의 종자.

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