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KR20080080105A - 바이오애노드, 바이오캐소드 및 바이오연료 전지 내의효소를 사용하는 직접 전자 전달 - Google Patents

바이오애노드, 바이오캐소드 및 바이오연료 전지 내의효소를 사용하는 직접 전자 전달 Download PDF

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KR20080080105A
KR20080080105A KR1020087013197A KR20087013197A KR20080080105A KR 20080080105 A KR20080080105 A KR 20080080105A KR 1020087013197 A KR1020087013197 A KR 1020087013197A KR 20087013197 A KR20087013197 A KR 20087013197A KR 20080080105 A KR20080080105 A KR 20080080105A
Authority
KR
South Korea
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biocathode
bioanode
biofuel cell
enzyme
carbon
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020087013197A
Other languages
English (en)
Inventor
쉘리 디. 민티어
베키 엘. 트레우
로디카 듀마
Original Assignee
세인트 루이스 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 세인트 루이스 유니버시티 filed Critical 세인트 루이스 유니버시티
Publication of KR20080080105A publication Critical patent/KR20080080105A/ko
Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

본 발명은 전자 도체, 하나 이상의 애노드 효소 또는 캐소드 효소 및 효소 고정화 물질을 포함하는 바이오애노드, 바이오캐소드 및 바이오연료 전지에 관한 것이다. 애노드 효소는 연료 유체와 반응하여 산화된 형태의 연료 유체를 생성할 수 있으며, 전자 도체로 전자를 방출할 수 있다. 캐소드 효소는 산화제와 반응하여 물을 생성할 수 있으며, 전자 도체로부터 전자를 수득할 수 있다. 애노드 효소 및 캐소드 효소 둘 모두에 대한 효소 고정화 물질은 효소를 고정화 및 안정화시킬 수 있으며, 연료 유체 및/또는 산화제에 투과성이다.
바이오애노드, 바이오캐소드, 바이오연료 전지, 효소 고정화 물질

Description

바이오애노드, 바이오캐소드 및 바이오연료 전지 내의 효소를 사용하는 직접 전자 전달{DIRECT ELECTRON TRANSFER USING ENZYMES IN BIOANODES, BIOCATHODES, AND BIOFUEL CELLS}
본 발명은 해군연구소 (허가 번호 3-00475), 국방 첨단 연구 기획청 (허가 번호 3-00487), 및 미국 중앙정보국 (허가 번호 300477)에서 제공한 정부 지원을 받아 발명되었다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
본 발명은 일반적으로 생물학적 효소-기재 연료 전지 (또한, 바이오연료 전지로도 공지되어 있음) 및 이들의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 연료 유체와 전자 도체 사이에 직접 전자를 전달할 수 있는 효소를 포함하는 바이오애노드, 바이오캐소드 및 바이오연료 전지, 및 이들의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
바이오연료 전지는 화학 반응으로부터 유래된 에너지를 살아있는 세포 및/또는 이들의 효소의 촉매 활성에 의해 전기 에너지로 전환시키는 전기화학적 장치이다. 바이오연료 전지는 일반적으로 애노드에서 산소를 물로 환원시키는데 필요한 수소 이온을 발생시키고, 전기적 용도로 사용하는 경우에는 유리 전자를 발생시키 는 복합 분자를 사용한다. 바이오애노드는 연료 산화시 전자가 방출되는 바이오연료 전지의 전극이고, 바이오캐소드는 애노드로부터의 전자 및 양자가 촉매에 의해 과산화물 또는 산소를 물로 환원시키는데 사용되는 전극이다. 바이오연료 전지는 전기 화학 반응을 촉매하는데 사용되는 물질에 의해 전통적인 연료 전지와 구별된다. 바이오연료 전지는 촉매로 귀금속을 사용하기 보다는 반응을 수행하는 효소와 같은 생물학적 분자에 의존한다.
대부분의 바이오애노드 및 바이오캐소드는 전자 매개체를 포함한다. 그러나, 전자 매개체를 포함하는 일부 바이오애노드 및 바이오캐소드는 감소된 수명, 감소된 안정성, 바람직하지 않은 열역학, 및 낮은 활성의 전자 매개체를 가질 수 있다. 따라서, 전자 매개체의 포함과 관련된 문제점을 나타내지 않는 바이오애노드 및 바이오캐소드가 요망되고 있다.
<발명의 개요>
본 발명의 다양한 측면 중 하나는 전자 도체; 하나 이상의 애노드 효소; 및 효소 고정화 물질을 포함하는 바이오애노드이다. 상기 애노드 효소는 연료 유체와 반응하여 산화된 형태의 연료 유체를 생성할 수 있으며, 전자 도체로 전자를 방출할 수 있다. 상기 효소 고정화 물질은 효소를 고정화 및 안정화시킬 수 있으며, 연료 유체에 투과성이다.
또다른 측면은 전자 도체; 하나 이상의 캐소드 효소; 및 효소 고정화 물질을 포함하는 바이오캐소드이다. 상기 캐소드 효소는 산화제와 반응하여 물을 생성할 수 있으며, 전자 도체로부터 전자를 수득할 수 있다. 상기 효소 고정화 물질은 효 소를 고정화 및 안정화시킬 수 있으며, 산화제에 투과성이다.
또 다른 측면은 연료 유체, 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드, 및 상기 기재된 바와 같은 바이오캐소드를 포함하는 바이오연료 전지이다. 다른 측면은 연료 유체, 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드, 및 캐소드를 포함하는 바이오연료 전지이다. 또한, 또다른 측면은 연료 유체, 애노드, 및 상기 기재된 바와 같은 바이오캐소드를 포함하는 바이오연료 전지이다.
본원이 기재된 바이오연료 전지를 사용하는 전기 발생 방법은 애노드 또는 바이오애노드에서 연료 유체를 산화시키고, 캐소드 또는 바이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 단계를 포함한다.
도 1A는 직접 전자 전달-기반 빌리루빈 옥시다제 바이오캐소드에서 일어나는 화학 작용을 도시하고 있으며, 도 1B는 전자 매개체를 포함하는 바이오캐소드에서 일어나는 화학 작용을 도시하고 있다.
도 2는 단일 기능성 바이오애노드 또는 바이오캐소드를 도시하고 있다.
도 3은 미세유체 바이오연료 전지를 도시하고 있다.
도 4(a) 내지 (d)는 단일 미세전극 형성 절차를 도시하고 있다.
도 5는 미세유체 바이오연료 전지 적층체를 도시하고 있다.
도 6은 매개된 바이오애노드 (테트라부틸암모늄-개질된 나피온(등록상표) 및 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 포함) 및 직접 전자 전달 바이오캐소드 (테트라 부틸암모늄-개질된 나피온(등록상표) 및 빌리루빈 옥시다제 포함)를 갖는 막이 없는 바이오연료 전지에 대한 전력 곡선이다.
도 7은 매개된 바이오애노드 (테트라부틸암모늄-개질된 나피온(등록상표) 및 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 포함) 및 직접 전자 전달 바이오캐소드 (테트라부틸암모늄-개질된 나피온(등록상표) 및 빌리루빈 옥시다제 포함)를 갖는 막이 없는 바이오연료 전지의 전력을 시간의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 8은 매개된 바이오애노드 (테트라부틸암모늄-개질된 나피온(등록상표) 및 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 포함) 및 직접 전자 전달 바이오캐소드 (테트라부틸암모늄-개질된 나피온(등록상표) 및 빌리루빈 옥시다제 포함)를 갖는 막이 없는 바이오연료 전지의 전력을 온도의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 9는 매개된 바이오애노드 (테트라부틸암모늄-개질된 나피온(등록상표) 및 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제) 및 직접 전자 전달 바이오캐소드 (부틸-키토산 및 빌리루빈 옥시다제)를 갖는 바이오연료 전지에 대한 전력 곡선이다.
도 10은 매개된 바이오애노드 (부틸-키토산 및 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 포함) 및 직접 전자 전달 바이오캐소드 (부틸-키토산 및 빌리루빈 옥시다제 포함)를 갖는 바이오연료 전지에 대한 전력 곡선이다.
도 11은 테트라펜틸암모늄 이온으로 개질된 저분자량 알기네이트의 형광 현미경 사진이다.
도 12는 트리메틸옥틸암모늄 (TMOA)-개질된 나피온(등록상표) 및 수퍼록시드 디스뮤타제를 포함하는 직접 전자 전달 바이오캐소드에 대한 전력 곡선을 도시하고 있다.
본 발명은 전자 도체로 직접 전자를 전달할 수 있는 효소를 포함하는 바이오애노드, 바이오캐소드 및 바이오연료 전지에 관한 것이다. 다르게 설명하면, 바이오애노드, 및 이 바이오애노드를 포함하는 바이오연료 전지는 전자 도체로 전자를 방출할 수 있는 애노드 효소를 함유하고, 바이오캐소드, 및 이 바이오캐소드를 포함하는 바이오연료 전지는 전자 도체로부터 전자를 수득할 수 있는 캐소드 효소를 함유한다. 이와 같이 효소와 전자 도체 사이에서 전자를 전달하는 능력은 전자 매개체가 산화환원 반응 지점 근처로 수송되어야 하고, 매우 효율적인 산화환원 반응을 용이하게 하는 정확한 지역적 농도를 갖지 않을 수 있기 때문에 덜 효율적인 전자 매개성 시스템에 비해 상당히 유리하다. 상기 시스템에서 전자 매개체가 제거됨으로써 반응 속도가 전자 매개체(들)의 집단 수송에 의해 제한되지 않으며, 이에 따라 보다 효율적으로 될 수 있다. 또한, 효소가 전자 도체 상에 고정화된 경우에는 반응물 (효소 및 연료 유체)이 전자 도체에 매우 근접하여 생성된 전자를 수집할 수 있어 산화환원 반응 속도를 최대화시킬 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 바이오전극 조립체는 효소 안정성을 증가시킨다. 바이오캐소드 또는 바이오애노드에 사용한 경우, 고정화 물질은 기계적 및 화학적 안정성을 제공하는 장벽을 형성한다. 따라서, 효소는 이전에 알려진 것보다 더 오랜 기간 동안 안정화된다. 본 발명의 목적상, 효소는 바이오연료 전지가 지속적으로 작동할 때 적어도 약 7일 또는 약 730일 동안 초기 촉매 활성의 적어도 약 75％를 유지하는 경우에 "안정화"된다.
I. 바이오연료 전지
본 발명의 다양한 측면 중 하나의 측면은 고정화된 효소를 갖는 전극에서 일어나는 효소 매개성 산화환원 반응을 통해 전기를 발생시키기 위해 연료 유체를 사용하는 바이오연료 전지이다. 표준 전기화학 전지에서와 같이, 애노드는 동시에 전자를 방출시키면서 연료 유체가 산화 반응하는 위치이다. 전자는 전기 커넥터를 통해 애노드로부터 일부 전력 소모 장치로 향한다. 상기 전자는 상기 장치를 통해 바이오연료 전지의 바이오캐소드로 전자를 수송하는 또 다른 전기 커넥터로 이동하고, 바이오캐소드에서 전자는 산화제를 환원시켜 물을 생성하는데 사용된다. 이러한 방식으로, 본 발명의 바이오연료 전지는 이에 대해 외적인 전기 부하를 위한 에너지 공급원 (전기)으로 작용한다. 연료 유체의 산화환원 반응을 용이하게 위해, 전극은 전자 도체, 효소 및 효소 고정화 물질을 포함한다.
바이오캐소드에서, 바이오애노드로부터 유래된 전자가 바이오캐소드의 전자 도체로 유동한다. 따라서, 전자는 전자 도체로부터 전자를 수득할 수 있는 캐소드 효소와 접촉하고 있다. 다양한 실시양태에서, 산화제에 투과성인 효소 고정화 물질이 존재하며, 이는 효소를 고정화 및 안정화시킬 수 있다.
본 발명의 바이오연료 전지는 바이오캐소드 및/또는 바이오애노드를 포함한다. 일반적으로, 바이오애노드는 연료 유체를 산화시켜 전자를 방출시키고 외부 전기 부하로 향하게 하는 요소를 포함한다. 생성된 전류는 전기 부하에 동력을 제공하며, 이어서 전자는 산화제가 환원되고 물이 생성되는 바이오캐소드로 향한다.
A. 바이오캐소드
본 발명에 따른 바이오캐소드는 전자 도체, 및 효소 고정화 물질에 고정화된 효소를 포함한다. 한 실시양태에서, 이들 성분들은 서로 인접하여 있으며, 이는 이들이 적합한 수단에 의해 물리적으로 또는 화학적으로 연결되어 있다는 것을 의미한다.
1. 전자 도체
전자 도체는 전자를 전도하는 물질이다. 전자 도체는 이 물질을 통해 전자를 전도할 수 있는 한 사실상 유기 물질 또는 무기 물질일 수 있다. 전자 도체는 탄소-기재 물질, 스테인레스 스틸, 스테인레스 스틸 메쉬, 금속성 도체, 반도체, 금속 산화물, 또는 개질된 도체일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 전자 도체는 탄소-기재 물질이다.
특히 적합한 전자 도체는 탄소-기재 물질이다. 탄소-기재 물질의 예로는 탄소 직물, 카본지, 탄소 스크린 인쇄 전극, 카본지 (Toray), 카본지 (ELAT), 카본 블랙 (벌칸(Vulcan) XC-72, E-tek), 카본 블랙, 탄소 분말, 탄소 섬유, 단일벽 탄소 나토튜브, 이중벽 탄소 나노튜브, 다중벽 탄소 나노튜브, 탄소 나노튜브 배열, 다이아몬드-코팅된 도체, 유리질 탄소 및 중간 다공성 탄소가 있다. 또한, 다른 탄소-기재 물질의 예로는 그래파이트, 압착되지 않은 그래파이트 웜(worm), 박리 정제된 플레이크 그래파이트 (슈페리어(Superior; 등록상표) 그래파이트), 고성능 그래파이트 및 탄소 분말 (포뮬라 BT(Formula BT; 상표명), 슈페리어(등록상표) 그래파이트), 고정렬된 열분해 그래파이트, 열분해 그래파이트 및 다결정질 그래파이트가 있다. 바람직한 전자 도체 (지지체 막)는 시트형 카본지이다.
추가의 실시양태에서, 전자 도체는 금속성 도체로 만들어질 수 있다. 적합한 전자 도체는 금, 백금, 철, 니켈, 구리, 은, 스테인레스 스틸, 수은, 텅스텐 및 전극 구축에 적합한 기타 금속으로부터 제조될 수 있다. 또한, 금속성 도체인 전자 도체는 코발트, 탄소 및 다른 적합한 금속으로 제조된 나노입자로 구축될 수 있다. 다른 금속성 전자 도체는 은-플레이팅된 니켈 스크린 인쇄 전극일 수 있다.
또한, 전자 도체는 반도체일 수 있다. 적합한 반도체 물질은, 다른 원자로 도핑될 수 있는 규소 및 게르마늄을 포함한다. 반도체는 인, 붕소, 갈륨, 비소, 인듐 또는 안티모니, 또는 이들의 조합으로 도핑될 수 있다.
다른 전자 도체는 금속 산화물, 금속 황화물, 주요족 화합물 (즉, 전이 금속 화합물), 및 전자 도체로 개질된 물질일 수 있다. 이러한 타입의 전자 도체의 예로는 나노 다공성 산화티탄, 산화주석 코팅된 유리, 산화세륨 입자, 황화몰리브덴, 질화붕소 나노튜브, 탄소와 같은 전도성 물질로 개질된 에어로겔, 탄소와 같은 전도성 물질로 개질된 졸겔, 루테늄 탄소 에어로겔, 및 탄소와 같은 전도성 물질로 개질된 중간 다공성 실리카가 있다.
다양한 바람직한 실시양태에서, 전자 도체는 탄소 직물, 탄소 나노튜브, 확장된 그래파이트 웜, 탄소 페이스트 및 이들의 조합이다. 보다 바람직하게는, 전자 도체는 탄소 나노튜브이다.
2. 효소
본 발명에 있어서, 효소는 바이오캐소드에서 산화제를 환원시킨다. 일반적으로, 하나 초과의 산화환원 반응 중심을 함유하는 효소가 본 발명의 바이오캐소드 및 바이오연료 전지에 유용하다. 예를 들면, 빌리루빈 옥시다제는 제공 기판으로부터 전자를 수용하는 T1 구리 중심 및 산소를 환원시키는 T2-T3 전자 제공 집단을 갖는 4 원자 구리 코어를 함유한다. 이론에 얽매이지 않고, 하나 초과의 산화환원 반응 중심을 갖는 다수의 효소가 전자 도체로 전자를 전달하고 전자 도체로부터 전자를 전달하는 이들 자신의 내부 매개체로 작용할 수 있는 것으로 제안되었다. 바이오캐소드에 사용되는 효소의 예로는 빌리루빈 옥시다제, 라카아제, 수퍼록시드 디스뮤타제, 퍼록시다제 또는 이들의 조합이 있다. 다양한 바람직한 실시양태에서, 산화제가 산소인 경우, 효소는 빌리루빈 옥시다제이다. 몇몇 실시양태에서, 산화제가 과산화물인 경우, 효소는 수퍼록시드 디스뮤타제이다.
3. 효소 고정화 물질
효소 고정화 물질은 바이오연료 전지에서 바이오애노드 및/또는 바이오캐소드에 사용된다. 한 실시양태에서, 바이오애노드의 효소 고정화 물질은 연료 유체에 투과성이고, 효소를 고정화 및 안정화시킨다. 고정화 물질은 연료 유체에 투과성이어서 바이오애노드에서 연료의 산화 반응이 고정화된 효소에 의해 촉매될 수 있다.
일반적으로, 효소는 바이오캐소드 및/또는 바이오애노드에서 산화환원 반응을 촉매하는데 사용된다. 본 발명에 따른 바이오캐소드 및/또는 바이오애노드에서, 효소는 이를 고정화 및 안정화시키는 효소 고정화 물질에 고정화된다. 통상적으로, 용액 중의 유리 효소는 수시간 내지 수일 내에 그의 촉매 활성을 상실하는 반면, 적합하게 고정화되고 안정화된 효소는 적어도 약 7일 내지 약 730일 동안 그의 촉매 활성을 보유할 수 있다. 촉매 활성의 보유는 초기 활성의 적어도 약 75％를 갖는 효소로 정의되며, 이는 화학발광, 전기화학, UV-Vis, 방사성화학 또는 형광 검정으로 측정될 수 있다. 효소는 바이오연료 전지가 적어도 약 7일 또는 약 730일 동안 지속적으로 전기를 발생시키면서 초기 활성의 적어도 약 75％를 유지한다.
고정화된 효소는 그의 촉매 활성을 보유하면서 효소 고정화 물질의 특정 영역에 물리적으로 격리된 효소다. 운반자-결합, 가교 결합 및 엔트랩핑 (entrapping)을 비롯하여 효소 고정화를 위한 다양한 방법이 존재한다. 운반자-결합은 효소를 수불용성 운반자에 결합시키는 것이다. 가교 결합은 효소를 이기능성 또는 다기능성 시약에 의해 분자 사이를 가교 결합시키는 것이다. 엔트랩핑은 효소를 반투과성 물질의 격자에 혼입시키는 것이다. 특정한 효소 고정화 방법은 효소 고정화 물질이 (1) 효소를 고정화시키고, (2) 효소를 안정화시키며, (3) 연료 유체 또는 산화제에 투과성인 한, 결정적으로 중요하지는 않다.
연료 유체 또는 산화제에 대한 효소 고정화 물질의 투과성 및 효소의 고정화와 관련하여, 다양한 실시양태에서 상기 물질은 효소보다 작은 화합물에 투과성이다. 다르게 설명하면, 효소 고정화 물질은 연료 유체 또는 산화제 화합물이 이를 통해 효소와 접촉할 수 있도록 상기 물질을 이동시킨다. 효소 고정화 물질은 이들이 내부 세공, 채널, 개구부 또는 이들의 조합을 함유하여 상기 화합물이 효소 고정화 물질을 통해 이동할 수는 있으나 효소를 효소 고정화 물질 내의 실질적으로 동일한 공간에 격리시키는 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 제한은 효소가 그의 촉매 활성을 보유하도록 한다. 여러 바람직한 실시양태에서, 효소는 효소와 실질적으로 동일한 크기 및 형태를 갖는 공간에 격리되며, 이 때 효소는 실질적으로 그의 촉매 활성을 모두 보유한다. 세공, 채널 또는 개구부는 상기한 요구 조건을 만족시키는 물리적 크기를 가지며, 고정화될 특정 효소의 크기 및 형태에 따라 달라진다.
다양한 실시양태에서, 효소는 바람직하게는 효소 고정화 물질의 세공 내에 위치하고, 화합물은 수송 채널을 통해 효소 고정화 물질의 내외로 이동한다. 세공 및 수송 채널의 상대적 크기는 세공이 효소를 고정화시키기에는 충분히 크지만 수송 채널은 너무 작아 효소가 이들을 통해 이동할 수 없는 크기일 수 있다. 또한, 수송 채널은 바람직하게는 적어도 약 10 nm의 직경을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 세공 직경 대 수송 채널 직경의 비율은 적어도 약 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1 또는 이를 초과한다. 또 다른 실시양태에서, 바람직하게는 수송 채널은 직경이 적어도 약 10 nm이고, 세공 직경 대 수송 채널의 직경의 비율은 적어도 약 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1 또는 이를 초과한다.
효소의 안정화와 관련하여, 효소 고정화 물질은 효소 변성을 막거나 방해하는 화학적 및 기계적 장벽을 제공한다. 이를 목적으로 하여, 효소 고정화 물질은 효소의 언폴딩(unfolding)을 방지하면서 효소를 물리적으로 격리시킨다. 효소가 폴딩(folding)된 3-차원 구조로부터 언폴딩되는 과정이 효소 변성에 대한 하나의 메카니즘이다. 한 실시양태에서, 고정화 물질은 바람직하게는 효소가 적어도 약 7일 내지 약 730일 동안 그의 촉매 활성을 보유하도록 효소를 안정화시킨다. 촉매 활성의 보유는 효소가 바이오연료 전지의 일부로 계속 전기를 발생시키면서 그의 초기 활성의 적어도 약 75％를 보유하는 기간 (일)으로 정의된다. 효소 활성은 화학발광, 전기화학, UV-Vis, 방사성화학 또는 형광 검정으로 측정될 수 있으며, 이 때 상기 특성의 강도는 초기에 측정된다. 통상적으로, 형광 검정이 효소 활성을 측정하는데 이용된다. 용액 중의 유리 효소는 수시간 내지 수일 내에 그의 촉매 활성을 상실한다. 따라서, 효소의 고정화는 안정성에 있어 중요한 이점을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 바람직하게는, 고정화된 효소는 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 365, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 730일 또는 이를 초과하는 기간 동안 그의 초기 촉매 활성의 적어도 약 75％, 바람직하게는 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 365, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 730일 또는 이를 초과하는 기간 동안 그의 초기 촉매 활성의 적어도 약 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 이를 초과하여 보유한다.
몇몇 실시양태에서, 효소 고정화 물질은 미셀 또는 역 (inverted) 미셀 구조를 갖는다. 일반적으로, 미셀로 구성된 분자는 양쪽성이며, 이는 이들이 극성, 친수성 기 및 비극성, 소수성 기를 함유함을 의미한다. 상기 분자는 미셀을 형성하기 위해 집합할 수 있으며, 극성 기는 집합체의 표면 상에 존재하고, 탄화수소의 비극성 기는 집합체의 내부에 격리되어 있다. 역 미셀은 극성 기와 비극성 기가 반대로 배향된 것이다. 집합체를 구성하는 양쪽성 분자는 극성기가 서로 근접하여 있고 비극성 기가 서로 근접하여 있는 한 다양한 방식으로 배열될 수 있다. 또한, 상기 분자는 서로 마주보는 비극성 기 및 서로 반대 방향을 보는 극성 기를 갖는 이중층을 형성할 수 있다. 다르게는, 극성 기가 서로 마주보고 비극성 기가 서로 반대 방향을 보는 이중층을 형성할 수 있다.
특정 효소 고정화 물질, 특히 미셀 효소 고정화 물질 및 개질된-퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체는 미국 특허 출원 제10/931,147호 (미국 특허 출원 공개공보 제2005/0095466호로 공개됨) 및 미국 특허 출원 제10/617,452호 (미국 특허 출원 공개공보 제2004/0101741호로 공개됨) (이 두 문헌은 이들의 전문이 상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 미셀 효소 고정화 물질은 개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 개질된 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체) (개질된 나피온(등록상표) 또는 개질된 플레미온(Flemion; 등록상표) 막이다. 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체 막은 암모늄 (NH4 +) 이온보다 큰 소수성 양이온으로 개질된다. 소수성 양이온은 (1) 막의 세공 크기에 영향을 미치고 (2) 세공의 pH 수준을 유지하는데 도움을 주는 화학적 완충제로서 작용하는 두 가지 기능을 하며, 이 둘은 모두 효소를 안정화시킨다.
소수성 양이온의 제 1 기능과 관련하여, 개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 개질된 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체) (나피온(등록상표) 또는 플레미온(등록상표) 막을 생성하기 위해 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체)를 소수성 양이온과 함께 혼합물-주조하여, 세공 크기가 소수성 양이온의 크기에 따라 달라지는 효소 고정화 물질을 제공한다. 따라서, 소수성 양이온이 커질수록 세공 크기가 커진다. 이러한 소수성 양이온의 기능은 소수성 양이온의 크기를 변화시켜 세공 크기가 특정 효소에 적합하도록 크거나 작아지게 하는 것이다.
소수성 양이온의 제2 기능과 관련하여, 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체) 막의 특성은 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화된 이용 교환 중합체) 막 상의 -SO3 -기에 대한 반대 이온으로서 양자 대신 소수성 양이온을 교체함으로써 달라진다. 반대 이온에서의 이러한 교환은 소수성 양이온이 양자보다 -SO3 - 부위에 대해 훨씬 높은 친화성을 갖기 때문에 pH에 대해 완충 효과를 제공한다. 이러한 막에 대한 완충 효과는 용액의 pH는 변화하더라도 세공의 pH는 실질적으로 변화하지 않고 유지되도록 하며; 다르게 설명하면 세공의 pH가 용액의 pH 변화에 내성을 갖게 한다. 또한, 상기 막은 기계적 장벽을 제공하여, 고정화된 효소를 더 보호한다. 개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체) 막을 제조하기 위해, 제1 단계에서는 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체), 특히 나피온(등록상표)의 현탁액을 소수성 양이온의 용액과 주조하여 막을 형성한다. 막으로부터 과량의 소수성 양이온 및 이들의 염을 추출한 후, 막을 다시-주조한다. 다시-주조할 때, 막은 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 (또는 퍼플루오르화된 이온 교환 중합체) 막의 -SO3 - 부위와 결합된 소수성 양이온을 함유한다. 잉여량의 염은 세공에 트랩핑되거나 막 내에 빈 공간을 초래하기 때문에 막으로부터 소수성 양이온의 염을 제거하면 보다 안정하고 재현가능한 막이 생성된다.
한 실시양태에서, 개질된 나피온(등록상표) 막은 나피온(등록상표) 중합체의 현탁액을 4급 브롬화암모늄과 같은 소수성 양이온의 염의 용액과 주조하여 제조한다. 잉여량의 4급 브롬화암모늄 또는 브롬화수소를 막으로부터 제거한 후에, 이를 다시 주조하여 염-추출된 막을 형성한다. 막의 염 추출은 술폰산 교환 부위에 4급 암모늄 양이온이 계속 존재하도록 하지만, 세공에 트랩핑될 수 있거나 평형화된 막 내에 빈 공간을 초래할 수 있는 잉여량의 염으로 인한 복잡한 상태를 제거한다. 염-추출된 막의 화학적 및 물리적 특성은, 효소 고정화 전에, 전류전압측정, 이온 교환 용량 측정 및 형광 현미경 검사로 특성화된다. 소수성 양이온의 예로는 암모늄-기재 양이온, 4급 암모늄 양이온, 알킬트리메틸암모늄 양이온, 알킬트리에틸암모늄 양이온, 유기 양이온, 포스포늄 양이온, 트리페닐포스포늄, 피리디늄 양이온, 이미다졸륨 양이온, 헥사데실피리디늄, 에티듐, 비올로겐, 메틸 비올로겐, 벤질 비올로겐, 비스(트리페닐포스핀)이미늄, 금속 착체, 바이피리딜 금속 착체, 페난트롤린-기재 금속 착체, [Ru(바이피리딘)3]2+ 및 [Fe(페난트롤린)3]3+이 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 소수성 양이온은 암모늄-기재 양이온이다. 특히, 소수성 양이온은 4급 암모늄 양이온이다. 또 다른 실시양태에서, 4급 암모늄은 화학식 4로 나타낸다.
Figure 112008039047689-PCT00001
상기 식에서, R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 헤테로시클로이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소가 아니다. 다른 실시양태에서, 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실 또는 테트라데실이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소가 아니다. 또 다른 실시양태에서, R1, R2, R3 및 R4는 동일하며, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실이다. 또 다른 실시양태에서, 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4는 부틸이다. 바람직하게는, 4급 암모늄 양이온은 테트라프로필암모늄 (T3A), 테트라펜틸암모늄 (T5A), 테트라헥실암모늄 (T6A), 테트라헵틸암모늄 (T7A), 트리메틸이코실암모늄 (TMICA), 트리메틸옥틸데실암모늄 (TMODA), 트리메틸헥실데실암모 늄 (TMHDA), 트리메틸테트라데실암모늄 (TMTDA), 트리메틸옥틸암모늄 (TMOA), 트리메틸도데실암모늄 (TMDDA), 트리메틸데실암모늄 (TMDA), 트리메틸헥실암모늄 (TMHA), 테트라부틸암모늄 (TBA), 트리에틸헥실암모늄 (TEHA) 및 이들의 조합이다.
미셀 또는 역 미셀 효소 고정화 물질의 예로는 소수성 개질된 다당류가 있고, 이들 다당류는 키토산, 셀룰로스, 키틴, 전분, 아밀로스, 알기네이트 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 다양한 실시양태에서, 미셀 또는 역 미셀 효소 고정화 물질은 다가양이온성 중합체, 특히 소수성 개질된 키토산이다. 키토산은 폴리[β-(1-4)-2-아미노-2-데옥시-D-글루코피라노스]이다. 키토산은 통상적으로 키틴 (폴리[β-(1-4)-2-아세트아미도-2-데옥시-D-글루코피라노스])을 탈아세틸화시켜 제조한다. 통상적으로 시판되는 키토산은 대략 85％ 탈아세틸화된다. 이들 탈아세틸화된 또는 유리 아민 기는 히드로카르빌, 특히 알킬기로 더 관능화될 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 소수성 개질된 미셀 키토산은 화학식 1의 구조에 상응한다.
Figure 112008039047689-PCT00002
상기 식에서, n은 정수이고; R10은 독립적으로 수소, 히드로카르빌 또는 치환된 히드로카르빌이고; R11은 독립적으로 수소, 히드로카르빌 또는 치환된 히드로 카르빌이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, n은 정수이고, 이에 따라 중합체의 분자량은 약 21,000 내지 약 500,000; 바람직하게는 약 90,000 내지 약 500,000; 보다 바람직하게는 약 150,000 내지 약 350,000; 보다 바람직하게는 약 225,000 내지 약 275,000이 된다. 다수의 실시양태에서, R10은 독립적으로 수소 또는 알킬이고, R11은 독립적으로 수소 또는 알킬이다. 또한, R10은 독립적으로 수소 또는 헥실이고, R11은 독립적으로 수소 또는 헥실이다. 다르게는, R10은 독립적으로 수소 또는 옥틸이고, R11은 독립적으로 수소 또는 옥틸이다.
또한, 다양한 실시양태에서, 소수성 개질된 미셀 키토산은 화학식 1B에 상응하는 개질된 키토산이다.
Figure 112008039047689-PCT00003
상기 식에서, R11, R12 및 n은 화학식 1과 관련하여 정의된 바와 같다. 몇몇 실시양태에서, R11 및 R12는 독립적으로 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 알킬; 바람직 하게는 수소, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실 또는 도데실이다. 다양한 실시양태에서, R11 및 R12는 독립적으로 수소, 부틸 또는 헥실이다.
소수성 개질된 미셀 키토산은 소수성 기로 다양한 정도로 개질될 수 있다. 소수성 개질의 정도는 개질되지 않은 키토산 내의 유리 아민기의 개수에 비한 소수성 기로 개질된 유리 아민기의 비율(％)로 결정한다. 소수성 개질의 정도는 산-염기 적정 및/또는 핵 자기 공명 (NMR), 특히 1H NMR 데이타로부터 추정할 수 있다. 소수성 개질의 정도는 매우 크게 달라질 수 있으며, 적어도 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 42, 44, 46, 48％, 또는 이를 초과한다. 바람직하게는, 소수성 개질의 정도는 약 10％ 내지 약 45％; 약 10％ 내지 약 35％; 약 20％ 내지 약 35％; 또는 약 30％ 내지 약 35％이다.
키토산 개질에 사용되는 소수성 기는 (1) 고정화 물질의 세공 크기에 영향을 미치고, (2) 키토산의 전기적 환경을 변화시켜 허용되는 세공 환경을 유지시키는 두 가지 기능을 하며, 이 둘은 모두 효소를 안정화시킨다. 소수성 기의 제1 기능과 관련하여, 키토산의 소수성 개질은 세공 크기가 소수성 기의 크기에 따라 달라지는 효소 고정화 물질을 생성한다. 이에 따라, 소수성 기를 사용한 키토산의 개질의 크기, 형태 및 정도는 세공의 크기 및 형태에 영향을 미친다. 이러한 소수성 양이온의 기능은 소수성 기의 크기 및 분지화 정도를 변화시킴으로써 특정 효소에 적합하도록 세공 크기를 보다 크거나 작게 만들거나 또는 그 형태를 다르게 만든다.
소수성 양이온의 제2 기능과 관련하여, 소수성 개질된 키토산 막의 특성은 키토산을 소수성 기로 개질시켜 변화시킨다. 이러한 키토산의 소수성 개질은 양자에 대한 이용가능한 교환 부위의 개수를 증가시켜 세공 환경에 영향을 미친다. 물질의 pH에 영향을 미치는 것 이외에도, 키토산의 소수성 개질은 기계적 장벽인 막을 제공하고, 이는 고정화된 효소를 더 보호한다.
표 1은 소수성 개질된 키토산 막에서 양자에 대한 이용가능한 교환 부위의 개수를 보여준다.
Figure 112008039047689-PCT00004
또한, 이러한 다가양이온성 중합체는 효소를 고정화시킬 수 있고, 완충 용액 내의 동일한 효소의 활성에 비해 상기 중합체에 고정화된 효소의 활성을 증가시킬 수 있다. 다양한 실시양태에서, 다가양이온성 중합체는 소수성 개질된 다당류, 특히 소수성 개질된 키토산이다. 예를 들면, 언급된 소수성 개질의 경우, 글루코스 옥시다제의 효소 활성은 실시예 6의 절차를 이용하여 측정한다. t-아밀 알코올에 현탁시킨 헥실 개질된 키토산 내의 글루코스 옥시다제에서 최고 효소 활성이 관찰되었다. 이들 고정화 막에서는 완충액 중 효소에 비해 2.53배 증가한 글루코스 옥시다제 효소 활성이 나타났다. 표 2는 다양한 소수성 개질된 키토산에 대한 글루코스 옥시다제의 활성을 기술하고 있다.
Figure 112008039047689-PCT00005
개질제로 알킬기를 갖는 본 발명의 소수성 개질된 키토산을 제조하기 위해, 키토산 겔을 아세트산에 현탁시킨 후에 알코올 용매를 첨가하였다. 이 키토산 겔에 알데히드 (예를 들면, 부타날, 헥사날, 옥타날 또는 데카날)를 첨가한 후에, 나트륨 시아노보로히드라이드를 첨가한다. 생성된 생성물을 진공 여과에 의해 분리하고, 알코올 용매로 세척한다. 이어서, 개질된 키토산을 40 ℃의 진공 오븐에서 건조시켜 조각 모양의 백색 고체를 수득하였다.
개질제로 산화환원 반응 매개체를 갖는 본 발명의 소수성 개질된 키토산을 제조하기 위해, 4,4'-디메틸-2,2'-바이피리딘을 리튬 디이소프로필아민과 접촉시킨 후에 디할로알칸을 첨가하여 4-메틸-4'-(6-할로알킬)-2,2'-바이피리딘을 생성함으로써 산화환원 반응 매개체 리간드를 유도체화시킨다. 이이서, 이 리간드를 무기 염기의 존재하에 Ru(바이피리딘)2Cl2 수화물과 접촉시키고, Ru(바이피리딘)2Cl2가 고갈될 때까지 물-알코올 혼합물 중에서 환류시킨다. 이어서, 생성물을 암모늄 헥사플루오로포스페이트, 임의로는 나트륨 또는 칼륨 과염소산염으로 침전시킨 후에 재결정화시킨다. 이어서, 유도체화된 산화환원 반응 매개체 (Ru(바이피리딘)2(4-메틸-4'-(6-브로모헥실)-2,2'-바이피리딘)+2)를 탈아세틸화된 키토산과 접촉시키고, 가열한다. 이어서, 산화환원 반응 매개체 개질된 키토산을 침전시키고, 재결정화시킨다.
소수성 개질된 키토산 막은 유리한 에탄올 불용성을 갖는다. 예를 들면, 상기 기재된 키토산 효소 고정화 물질은 일반적으로 약 99 중량％ 또는 99 부피％까지 초과하는 에탄올을 갖는 용액 중에서 효소를 고정화 및 안정화시키는 기능을 한다. 다양한 실시양태에서, 키토산 고정화 물질은 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 이를 초과하는 중량％ 또는 부피％의 에탄올을 갖는 용액 중에서 기능성이다.
다른 실시양태에서, 미셀 또는 역 미셀 효소 고정화 물질은 다가음이온 중합체, 예컨대 소수성 개질된 다당류, 특히 소수성 개질된 알기네이트이다. 알기네이트는 β-(1-4)-연결된 D-만누론산 및 α-(1-4)-연결된 L-굴루론산 잔기를 함유하는 분지되지 않은 선형 중합체이다. 양자화되지 않은 형태에서, β-(1-4)-연결된 D-만누론산은 화학식 3A의 구조에 상응하고, 양자화되지 않은 형태에서, α-(1-4)-연결된 L-굴루론산은 화학식 3B의 구조에 상응한다.
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Figure 112008039047689-PCT00007
알기네이트는 만누론산 잔기의 중합체 블럭 및 굴루론산 잔기의 중합체 블럭으로 이루어진 이종 중합체이다.
알기네이트 중합체는 다양한 방식으로 개질될 수 있다. 한 가지 유형은 암모늄 (NH4 +) 이온보다 큰 소수성 양이온으로 개질된 알기네이트이다. 소수성 양이온은 (1) 중합체의 세공 크기에 영향을 미치고, (2) 세공의 pH 수준을 유지하는데 도움을 주는 화학적 완충제로서 작용하는 두 가지 기능을 하며, 이 둘은 모두 효소를 안정화시킨다. 소수성 양이온의 제1 기능과 관련하여, 소수성 양이온을 사용하는 알키네이트의 개질은 세공 크기가 소수성 양이온의 크기에 따라 달라지는 효소 고정화 물질을 생성한다. 이에 따라, 소수성 양이온을 사용하는 알키네이트의 개질의 크기, 형태 및 정도는 세공의 크기 및 형태에 영향을 미친다. 이러한 소수성 양이온의 기능은 소수성 양이온의 크기 및 분지화 정도를 변화시킴으로써 특정 효소에 적합하도록 세공 크기를 보다 크거나 작게 만들거나 또는 그 형태를 다르게 만든다.
소수성 양이온의 제2 기능과 관련하여, 알기네이트 중합체의 특성은 양자 대신 소수성 양이온을 알기네이트 상의 -CO2 - 기에 대한 반대 이온으로 교체함으로써 달라진다. 이러한 반대 이온의 변화는 소수성 양이온이 -CO2 - 부위에 대해 양자보다 훨씬 큰 친화성을 갖기 때문에 pH에 대한 완충 효과를 제공한다. 이러한 알기네이트 막에 대한 완충 효과는 용액의 pH가 변화하더라도 세공의 pH는 실질적으로 변화하지 않고 유지되도록 하며, 다르게 설명하면 세공의 pH가 용액의 pH 변화에 대해 내성을 갖게 한다. 또한, 알기네이트 막은 기계적 장벽을 제공하고, 이는 고정화된 효소를 더 보호한다.
개질된 알기네이트 막을 제조하기 위해, 제1 단계에서 알기네이트 중합체의 현탁액을 소수성 양이온의 용액과 주조하여 막을 형성한다. 이어서, 잉여량의 소수성 양이온 및 이들의 염을 막으로부터 추출하고, 막을 다시 주조한다. 다시 주조할 때, 막은 알기네이트 막의 -CO2 - 부위와 연결된 소수성 양이온을 함유한다. 잉여량의 염은 세공에 트랩핑되거나 막 내에 빈 공간을 초래하기 때문에 막으로부터 소수성 양이온의 염을 제거하면 보다 안정하고 재현가능한 막이 생성된다.
한 실시양태에서, 개질된 알기네이트 막은 알기네이트 중합체의 현탁액을 4 급 브롬화암모늄과 같은 소수성 양이온의 염의 용액과 주조하여 제조한다. 잉여량의 4급 브롬화암모늄 또는 브롬화수소를 막으로부터 제거한 후에, 이를 다시 주조하여 염-추출된 막을 형성한다. 막의 염 추출은 카르복실산 교환 부위에 4급 암모늄 양이온이 계속 존재하도록 하지만, 세공에 트랩핑될 수 있거나 평형화된 막 내에 빈 공간을 초래할 수 있는 잉여량의 염으로 인한 복잡한 상태를 제거한다. 소수성 양이온의 예로는 암모늄-기재 양이온, 4급 암모늄 양이온, 알킬트리메틸암모늄 양이온, 알킬트리에틸암모늄 양이온, 유기 양이온, 포스포늄 양이온, 트리페닐포스포늄, 피리디늄 양이온, 이미다졸륨 양이온, 헥사데실피리디늄, 에티듐, 비올로겐, 메틸 비올로겐, 벤질 비올로겐, 비스(트리페닐포스핀)이미늄, 금속 착체, 바이피리딜 금속 착체, 페난트롤린-기재 금속 착체, [Ru(바이피리딘)3]2+ 및 [Fe(페난트롤린)3]3+가 있다.
바람직한 실시양태에서, 소수성 양이온은 암모늄-기재 양이온이다. 특히, 소수성 양이온은 4급 암모늄 양이온이다. 또다른 실시양태에서, 4급 암모늄 양이온은 화학식 4로 나타낸다.
<화학식 4>
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상기 식에서, R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히 드로카르빌 또는 헤테로시클로이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소가 아니다. 다른 실시양태에서, 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실 또는 테트라데실이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소가 아니다. 또 다른 실시양태에서, R1, R2, R3 및 R4는 동일하며, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실이다. 또 다른 실시양태에서, 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4는 부틸이다. 바람직하게는, 4급 암모늄 양이온은 테트라프로필암모늄 (T3A), 테트라펜틸암모늄 (T5A), 테트라헥실암모늄 (T6A), 테트라헵틸암모늄 (T7A), 트리메틸이코실암모늄 (TMICA), 트리메틸옥틸데실암모늄 (TMODA), 트리메틸헥실데실암모늄 (TMHDA), 트리메틸테트라데실암모늄 (TMTDA), 트리메틸옥틸암모늄 (TMOA), 트리메틸도데실암모늄 (TMDDA), 트리메틸데실암모늄 (TMDA), 트리메틸헥실암모늄 (TMHA), 테트라부틸암모늄 (TBA), 트리에틸헥실암모늄 (TEHA) 및 이들의 조합이다.
세공 특성을 연구하고, 한 가지 소수성 개질된 알기네이트 막에 대한 결과를 도 11에 나타내었다. 상기 막의 세공 구조는 세공이 소수성이고, 미셀 구조를 갖고, 외부 pH 변화에 대해 완충되고, 높은 세공 상호연결성을 가지므로 효소 고정화에 이상적이다.
또다른 실험에서, 초저 분자량 알기네이트 및 도데실아민을 25％ 에탄올에 넣고 환류시켜 카르복실산기의 아미드화에 의해 도데실-개질된 알기네이트를 생성 한다. 다양한 알킬 아민이 도데실아민을 대체하여 다양한 개수의 알키네이트 구조의 반응성 카르복실산기에 부착된 C4-C16 알킬기를 갖는 알킬-개질된 알기네이트를 생성한다. 다양한 실시양태에서, 적어도 약 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48％, 또는 이를 초과하는 카르복실산기가 알킬아민과 반응한다.
소수성 개질된 알기네이트 막은 유리한 에탄올 불용성을 갖는다. 예를 들면, 상기 기재된 알기네이트 효소 고정화 물질은 일반적으로 적어도 약 25 중량％ 또는 25 부피％의 에탄올을 갖는 용액에서 효소를 고정화 및 안정화시키는 기능을 한다. 다양한 실시양태에서, 알기네이트 고정화 물질은 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 이를 초과하는 중량％ 또는 부피％의 에탄올을 갖는 용액에서 기능성이다.
4. 바이오캐소드 실시양태
다양한 바이오캐소드가 본 발명의 바이오연료 전지에 혼입될 수 있다. 예를 들면, 이러한 바이오캐소드는 미국 특허 출원 제10/931,147호 (미국 특허 출원 공개공보 제2005/0095466호로 공개됨) (그 전문이 상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
B. 바이오애노드
한 실시양태에서, 바이오애노드는 효소 고정화 물질에 고정화된 효소 및 전자 도체를 포함한다. 바이오애노드의 상기 확인된 성분들은 서로 인접하여 있으 며, 이는 이들이 적절한 수단에 의해 물리적으로 또는 화학적으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 상기 성분들은 일반적으로 바이오캐소드 성분들과 동일하므로, 하기 논의는 적절하다면 각각의 요소의 조성 차이 및 기능 차이에 관한 것이다
1. 전자 도체
바이오캐소드에서와 같이, 바이오애노드의 전자 도체는 이 물질을 통해 전자를 전도할 수 있는 한 사실상 유기 물질 또는 무기 물질일 수 있다. 한 실시양태에서, 바이오애노드 전자 도체는 카본지이다.
2. 효소
효소는 바이오애노드에서 연료 유체의 산화를 촉매한다. 특히, 바이오애노드에 사용되는 효소의 예로는 연료 유체를 산화시키기 위해 반응하고 하나 초과의 산화환원 반응 중심을 포함하는 효소가 있다. 예를 들면, 적합한 애노드 효소는 PQQ-의존성 데히드로게나제, 리폭시게나제, 또는 이들의 조합을 포함한다. PQQ-의존성 알코올 데히드로게나제 효소는 글루코노박터로부터 추출한다.
3. 효소 고정화 물질
상기 기재된 바와 같이, 효소 고정화 물질은 바이오연료 전지에서 바이오애노드 및/또는 바이오캐소드에 사용된다. 효소 고정화 물질의 조성 및 고정화 메카니즘에 대한 보다 상세한 설명은 상기 I.A.3.에서 찾아볼 수 있다. 한 실시양태에서, 바이오애노드의 효소 고정화 물질은 연료 유체에 투과성이며, 효소를 고정화 및 안정화시킨다. 고정화 물질은 연료 유체에 투과성이어서 바이오애노드에서의 연료 유체의 산화가 고정화된 효소에 의해 촉매될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 효소 고정화 물질은 소수성 개질된 다당류, 특히 소수성 개질된 키토산이다.
4. 바이오애노드 실시양태
바람직한 바이오애노드는 미국 특허 출원 제10/617,452호 (미국 특허 출원 공개공보 제2004/0101741호로 공개됨) (그 전문이 상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 다른 잠재적으로 유용한 바이오애노드는 미국 특허 제6,531,239호 및 동 제6,294,281호 (상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
C. 연료 유체 및 산화제
바이오애노드에서 산화되어 전자를 생성할 수 있는 연료 유체 및 바이오캐소드에서 환원되어 물을 생성할 수 있는 산화제가 본 발명의 바이오연료 전지의 성분이다.
바이오애노드를 위한 연료 유체는 고정화된 효소의 산화환원 반응 중심의 산화 반응에서 소모된다. 연료 유체의 분자 크기는 효소 고정화 물질을 통한 확산 계수가 크도록 충분히 작다. 연료 유체의 예로는 수소, 암모니아, 알코올 (예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소부탄올, 부탄올 및 이소프로판올), 알릴 알코올, 아릴 알코올, 글리세롤, 프로판디올, 만니톨, 글루쿠로네이트, 알데히드, 탄수화물 (예컨대, 글루코스, 글루코스-1, D-글루코스, L-글루코스, 글루코스-6-포스페이트, 락테이트, 락테이트-6-포스페이트, D-락테이트, L-락테이트, 프룩토스, 갈락토스-1, 갈락토스, 알도스, 소르보스 및 만노스), 글리세레이트, 조효소 A, 아세틸 Co-A, 말레이트, 이소시트레이트, 포름알데히드, 아세트알데히드, 아세테이트, 시 트레이트, L-글루코네이트, β-히드록시스테로이드, α-히드록시스테로이드, 락트알데히드, 테스토스테론, 글루코네이트, 지방산, 지질, 포스포글리세레이트, 레티날, 에스트라디올, 사이클로펜탄올, 헥사데칸올, 장쇄 알코올, 코니페릴-알코올, 신나밀-알코올, 포르메이트, 장쇄 알데히드, 피루베이트, 부타날, 아실-CoA, 스테로이드, 아미노산, 플라빈, NADH, NADH2, NADPH, NADPH2, 탄화수소 및 아민이 있다. 다양한 바람직한 실시양태에서, 연료 유체는 알코올, 보다 바람직하게는 메탄올 및/또는 에탄올, 가장 바람직하게는 에탄올이다.
바이오캐소드를 위한 산화제는 바이오애노드에 의해 공급되는 전자를 사용하여 전자 매개체 및 고정화된 효소의 환원 반응에서 소모된다. 산화제의 분자 크기는 효소 고정화 물질을 통한 확산 계수가 크도록 충분히 작다. 당업계에 공지된 산화제의 공급원을 제공하는 다양한 수단이 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 산화제는 기체 산소이며, 이는 확산을 통해 바이오캐소드로 수송된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 산화제는 과산화 화합물이다.
실시양태의 바이오연료 전지는 (i) 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드; (ii) 상기 기재된 바와 같은 바이오캐소드; (iii) 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드 및 바이오캐소드; (iv) 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드 및 미국 특허 출원 제10/931,147호 (미국 특허 출원 공개공보 제2005/0095466호로 공개됨)에 기재된 바와 같은 바이오캐소드; 및 (v) 미국 특허 출원 제10/617,452호 (미국 특허 출원 공개공보 제2004/0101741호로 공개됨)에 기재된 바와 같은 바이오애노드 및 상 기 기재된 바와 같은 바이오캐소드를 포함할 수 있다.
본 발명의 바이오연료 전지는 애노드 분획을 캐소드 분획으로부터 분리시키는 중합체 전해질 막 ("PEM" 또는 염 브릿지, 예를 들면 나피온(등록상표) 117)을 포함할 수 있다. 그러나, 바이오애노드 및 바이오캐소드를 갖는 실시양태의 경우, PEM는 필요하지 않으며, 막이 없는 바이오연료 전지가 생성된다. 산화제 또는 연료 유체 반응의 촉매 작용을 위해 바이오애노드 및 바이오캐소드에 사용되는 효소의 우선적인 선택성이 애노드 분획을 캐소드 분획으로부터 물리적으로 분리시킬 필요가 없도록 한다.
II. 미세유체 바이오연료 전지
본 발명의 다양한 측면 중 하나는 내부에 고정화된 효소를 갖는 미세성형된 미세전극에서 일어나는 효소 매개성 산화환원 반응을 통해 전기를 발생시키기 위한 연료 유체를 사용하는 미세유체 바이오연료 전지이다. 표준 바이오연료 전지에서와 같이, 바이오애노드는 동시에 전자를 방출시키면서 연료 유체가 산화 반응하는 부위이다. 전자는 바이오애노드로부터 전기 커넥터를 통해 일부 전력 소비 장치로 향한다. 전자는 장치를 통해 또다른 전기 커넥터로 이동하고, 이 커넥터는 전자를 바이오연료 전지의 바이오캐소드로 수송하고, 이 바이오캐소드에서 전자가 산화제를 환원시키는데 사용되어 물이 생성된다. 이러한 방식으로, 본 발명의 바이오연료 전지는 그에 대한 외부 전기 부하를 위한 에너지 공급원 (전기)으로 작용한다. 연료 유체의 산화환원 반응을 용이하게 하기 위해, 미세전극은 전자 도체, 효소, 및 효소 고정화 물질을 포함한다.
그러나, 표준 바이오연료 전지와 다르게는, 본 발명의 바이오연료 전지는 하나 이상의 미세성형된 전극을 사용한다. 한 실시양태에서, 미세성형된 전극은 미세전극 내에서 연료가 유동하도록 하는 관통(flow-through) 구조를 갖는다. 통상적인 바이오연료 전지 전극과 비교하였을 때, 이러한 구조에서는 더 많은 양의 미세전극 표면적이 연료와 접촉되기 때문에 더 높은 전류 밀도가 생성된다. 또다른 실시양태에서, 미세성형된 전극은 불규칙적인 지형도를 갖는다. 다시, 더 많은 양의 표면적이 연료와 접촉되기 때문에 미세전극의 전류 밀도는 통상적인 바이오연료 전지 전극보다 더 크다. 이러한 특징들은 본원에 개시된 다른 특징들과 조합되어 크기가 더 작은 공급원으로부터 통상적인 바이오연료 전지에 비해 전류 밀도가 증가된 바이오연료를 생성한다. 마지막으로, 본 발명의 방법은 일회용 연료 전지를 경제적으로 생성하는데 유리하게 사용될 수 있다.
A. 미세유체 채널
바이오애노드 및/또는 바이오캐소드 이외에, 미세유체 바이오연료 전지는 사용시 바이오애노드 및/또는 바이오캐소드, 연료 유체 및 산화제가 하우징되는(housed) 하나 이상의 미세유체 채널을 특징으로 한다. 미세유체 채널의 형태는 용도에 따라 달라질 수 있다. 한 실시양태에서, 미세유체 채널은 간단하게 바이오연료 전지의 바이오애노드 및/또는 바이오캐소드가 내부에 함유된 직사각형 챔버일 수 있다. 도 2를 참조한다. 다른 실시양태에서, 임의의 원하는 목적을 위해, 예컨대 바이오애노드 용액 및 바이오캐소드 용액이 서로 물리적으로 접촉하지 않도록 하기 위해, 미세유체 채널의 형태가 더욱 정교해질 수 있다. 도 3을 참조한다.
도 2 및 3을 참조하여, 연료 유체 및/또는 산화제는, 미세유체 채널의 한쪽 말단 (입구) (33)에서 반대쪽 말단 (출구) (35) 방향으로, 미세전극(들) 상에서 또는 이를 통해 미세유체 채널 (34)을 관통한다. 도 3에서, 바이오애노드는 (41)로 표시되고, 바이오캐소드는 (40)으로 표시된다. 미세유체 채널은 동일한 미세유체 채널 (34) 외부로 연료 유체 및/또는 산화제가 누출되는 것을 방지하면서, 미세전극(들) 상에서의 연료 유체 및/또는 산화제의 대류 유동을 용이하게 해야 한다.
B. 전기 커넥터
전기 커넥터는 미세전극으로부터 미세유체 바이오연료 전지 외부의 전기 부하로 연결시키는 전기적 접촉을 제공한다. 가장 일반적인 의미로, 전기 커넥터는 바이오애노드로부터 전기 부하로, 그리고 다시 바이오캐소드로의 전자 전달을 용이하게 하는 임의의 물질 및 구조일 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 미세유체 바이오연료 전지의 전기 커넥터는 또다른 장치가 물리적 및 전기적 접촉을 만들 수 있는 부착 도선을 제공한다. 이어서 이러한 다른 방치, 예를 들어, 구리 전선은 전자를 수송하고, 전자는 외부 전기 부하로 및 부하로부터 수송된다.
한 바람직한 실시양태에서, 전기 커넥터는 다른 프로세싱 전에 미세유체 바이오연료 전지의 기판 상에 형성된 박층 커넥터이다. 이러한 실시양태에서, 그 후에 형성된 미세전극들은 이들의 각각의 전기 커넥터가 교차하도록 배열된다. 다른 실시양태에서, 전기 커넥터는 미세전극의 프로세싱에 이어서 미세전극에 부착된 전기 전도성인 물질의 실린더형 본체를 갖는다.
III. 미세유체 바이오연료 전지 제작
본 발명에 따른 미세유체 바이오연료 전지의 제작에서, 다른 바이오연료 전지 성분들이 그 위에 구축되는 기판이 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 첫번째 단계는 전기 커넥터를 형성시키는 것이고, 이어서 미세전극이 제작되며, 임의로 바이오연료 챔버를 한정하는 단계가 이어진다. 다른 실시양태에서는, 다른 특징부에 이어서 전기 커넥터가 형성된다.
A. 전기 커넥터 제작
본 발명의 미세유체 바이오연료 전지는 나머지 성분들이 그 위에 형성되는 기판을 제공함으로써 형성된다. 전도성이 아니고, 미세전극의 전도성 물질을 부동태화시키지 않으며, 전도성 물질이 프로세싱을 통해 부착되고, 금형이 가역적으로 실링될 수 있는 임의의 물질로 기판을 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 기판은 유리이다. 바람직한 실시양태에서, 기판은 폴리(디메틸실록산) (PDMS)이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 기판은 폴리카르보네이트이다. 한 실시양태에서, 기판은 편평하다. 다른 실시양태에서, 기판은 특정 용도에 유리하게 적합한 기하학적 형상을 취할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 기판 상에 형성된 첫번째 바이오연료 전지 특징부는 전기 커넥터이고, 이는 완성된 바이오연료 전지 내에서 미세전극과 전기적으로 접촉되어 외부 전기 부하를 미세전극에 연결하는 수단을 제공할 것이다. 커넥터는 임의의 전기 전도성 물질로 제조될 수 있다. 상기 물질의 예로는 백금, 팔라듐, 금, 이러한 귀금속들의 합금, 탄소, 니켈, 구리 및 스테인레스 스틸이 있다. 바람직한 실시양태에서, 커넥터는 백금으로 제조된다.
규소 웨이퍼 산업에 공지된 통상적인 포토리소그래피 기술을 사용하여 커넉터를 기판 상에 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 박층 백금 전기 커넥터를 형성시키기 위해, 먼저 티탄 부착층을 기판 상에 스퍼터링(sputtering)한다. 이어서 백금층을 티탄 층 상에 스퍼터링한다. 상기 2 가지 스퍼터링 공정은, 예를 들면 아르곤-이온 스퍼터링 시스템에서 수행할 수 있다. 이어서, 커넥터를 포토리소그래피에 의해 한정하고, 포토레지스트가 백금 층 상에 도포되어 원하는 커넥터 위치를 보호한다. 시판되는 에칭제로 두 층을 화학적으로 에칭(etching)한 후, 포토레지스트를 벗겨내면, 완성된 백금 전기 커넥터가 생성된다. 다른 실시양태에서, 전기 커넥터는 마지막에 형성되는 특징부이다. 이러한 실시양태는 아래 기술되어 있다.
B. 미세전극의 제작
바이오연료 전지의 기판 상에 전기 커넥터가 생성된 후, 다음 단계는 바이오애노드 및 바이오캐소드의 제작이다. 이들은 연속적으로 또는 동시에 형성될 수 있다.
1. 바이오애노드 제작
한 실시양태에서, 바이오애노드 및 바이오캐소드가 기판 상에 연속적으로 형성되고, 형성 순서는 중요하지 않다. 설명의 목적을 위해서만, 바이오애노드 제작이 먼저 기술될 것이다. 미세규모의 바이오애노드를 제작하는 첫번째 단계는 주조용 금형의 표면에 마이크로채널의 패턴을 생성시키는 것이다. 일반적으로, 전도성이 아니고, 전도성 물질을 부동태화시키지 않으며, 기판에 가역적으로 실링될 수 있는 임의의 물질로 주조용 금형을 제조할 수 있으며, 상기 물질의 예로는 규소, 유리 및 중합체가 있다. 주조용 금형은 바람직하게는 중합체로 제조되고, 더욱 더 바람직하게는 PDMS로 제조된다. 가장 바람직하게는, 주조용 금형은 폴리카르보네이트로 제조된다.
주조용 금형이 중합체인 바람직한 실시양태에서, 공지된 소프트 리소그래피 기술을 이용하여 패턴을 생성시켜 주조용 금형 내에 마이크로 채널을 생성하여, 바이오애노드의 형상 및 크기를 한정한다. 소프트 리소그래피 기술은 일반적으로 원하는 디자인의 양각 이미지를 갖는 리소그래피에 의해 한정된 마스터(master)에 대해 예비중합체를 성형하는 공정을 수반한다. 이용되는 소프트 리소그래피 기술은 약 1 ㎛ 내지 약 1 ㎜ 사이, 약 1 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 사이, 바람직하게는 약 10 ㎛ 내지 약 200 ㎛ 사이, 더욱 바람직하게는 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛인, 가장 바람직하게는 약 10 ㎛ 이하로 작은 주조용 금형 내의 마이크로채널을 생성할 수 있어야 한다. 소프트 리소그래피 기술의 예로는 근접-장 위상 변이 리소그래피(near-field phase shift lithography), 복제(replica) 성형, 미세전달 성형 (μTM: microtransfer molding), 용매-보조 미세접촉 성형 (SAMIM: solvent-assisted microcontact molding), 및 미세접촉 인쇄 (μCP: microcontact printing)가 포함된다. 바람직하게는, 마이크로채널은 복제 성형을 사용하여 형성된다.
마이크로채널이 주조용 금형 내에 형성된 후, 주조용 금형의 패턴화된 측면이 기판에 부착되어 미세전극의 금형이 완성된다. 도 4(a)를 참조한다. 전기 커넥터 (31)가 기판 상에 앞서 형성된 실시양태에서, 마이크로채널은 완성된 미세전극이 커넥터와 전기적으로 접촉되도록 전기 커넥터 상에 정렬되어야 한다. 또한, 배관(tubing) 커넥터 (30)가 기판에 부착되어 나중에 입구 저장소가 될 위치를 유지한다.
이어서, 도 4(b)를 참조하여, 전자 도체 용액은 주조용 금형의 마이크로채널 내로 마이크로채널의 한쪽 말단에서 주조용 금형 내에 생성된 입구 저장소 (32)를 통해 유동한다. 이러한 입구 저장소 (32)는 전통적인 금속 주조 업계에서의 주입 용기와 유사하다. 잉여량의 용액은 입구 저장소 반대편의 마이크로채널의 말단에 위치한 배출구를 통해 마이크로채널을 빠져나갈 것이다.
전자 도체 용액은 고체 미세전극이 생성되도록 경화를 통해 제거될 수 있는, 전자 도체 공급원 및 액체 담체를 포함하는 임의의 용액일 수 있다. 수많은 가능한 전자 도체 물질은 상기 I.A.1에 열거되어 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 전자 도체 공급원은 탄소 공급원이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 전자 도체 공급원은 탄소-기재 잉크이다. 이와 같은 한 실시양태에서, 액체 담체는 탄소-기재 잉크 희석제, 예를 들면 에르콘(Ercon) N160 용매 희석제이다. 용액 내의 액체 담체의 특성에 따라, 2가지 유형의 미세전극 구조가 본 발명에 따라 형성될 수 있다 - 고체 미세전극 또는 관통 미세전극. 액체 담체의 점도가 낮으면, 고체 미세전극이 생성된다. 이러한 미세전극은 실질적으로 연속적이고 고체이며, 사용되는 동안 연료 유체가 상기 미세전극 위에서 유동한다. 액체 담체의 점도가 높으면, 사용되는 동안 연료 유체가 이를 관통하여 유동할 수 있는 구조를 갖는 관통 미세전극이 생성되어, 연료 유체와 접촉된 미세전극의 표면적을 효과적으로 증가시킨다.
특정 구조와 상관없이, 본 발명에 따라 형성된 미세전극은 지형도가 반드시 편평하여야 하는, 전통적인 공정을 사용하여 형성된 미세전극에 비해 여러 장점을 갖는다. 이와 같이, 통상적인 미세전극 위에서 유동하는 임의의 유체는 일반적으로 규칙적인 유동 패턴을 갖고, 일반적으로 한정된 양의 미세전극 표면적과 접촉된다. 이러한 편평한 기하학적 표면적은 편평한 미세전극의 정상부 및 측면의 직사각형 표면적을 합산하여 계산한다. 미세전극 전류의 생성은 연료 유체와 접촉된 표면적에 의해 대부분 결정되므로, 편평한 미세전극의 전류 생성 능력은 단지 이러한 크기를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 반면에, 본 발명에 따라 형성된 미세전극은 매우 불규칙적인 3차원 지형도를 갖고, 이로써 2 개 이상의 명확한 장점이 나타난다. 첫번째로, 본 발명의 미세전극의 유효 표면적은 편평한 스크린 인쇄 미세전극에 비하여 실질적으로 증가한다. 본원에 기재된 미세전극의 유효 표면적은 미세전극의 지형도를 특징짓는 개별적인 피크 및 골의 표면적의 합이다. 이러한 유효 표면적을 계산하는 한 가지 정확한 방법은 본 발명에 따라 형성된 미세전극의 전류 출력을 길이, 폭 및 높이 치수가 동일한 편평한 미세전극과 비교하는 것이다. 예를 들면, 이러한 미세전극 분석을 수행한 결과, 통상적인 유리질 탄소 전극에서는 전류 출력이 2.06 × 10-4 A/㎠인데 비해, 본 발명의 미세전극에서는 9.85 × 10-4 A/㎠이었다. 또한, 미세전극의 불규칙한 지형도는 유체의 난류를 생성시킬 수 있다. 이같은 유동 패턴은 미세전극 상에서 유체의 혼합을 유도하고, 이는 차례로 유체가 미세전극에 수송되는 속도를 증가시키기 때문에 유리하다. 유체의 수송 속도의 증가는 미세전극 내에서 일어나는 반응을 용이하게 함으로써, 미세전극의 전 류 부하 능력을 증가시킨다.
다른 실시양태에서, 프라이머(primer)가 주조용 금형의 마이크로채널 내로 유동되고, 전자 도체 용액의 도입 전에 신속하게 건조된다. 프라이머는 전자 도체가 주조용 금형에 반영구적으로 부착되는 것을 방지하는 것을 돕는 임의의 물질일 수 있다. 예를 들어, 탄소-기재 잉크 실시양태에서, 필요하다면, 탄소-기재 잉크 희석제가 프라이머로 사용될 수 있다.
용액이 주조용 금형의 마이크로채널에 충전된 후에 열을 가하여 전자 도체 용액을 경화시킨다. 일반적으로, 액체 담체를 용액으로부터 제거하기에 충분하지만 생성된 미세전극이 손상되지 않도록 충분히 낮은 온도에서 가열이 수행되어야 한다. 한 바람직한 실시양태에서, 가열은 약 75 ℃에서 일어난다. 또한, 실질적으로 모든 액체 담체를 용액으로부터 제거하기에 충분한 시간 동안 가열하여야 한다. 한 바람직한 실시양태에서, 적어도 약 1 시간 동안 가열한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 약 75 ℃에서 약 1 시간 동안 가열한다. 도 4(c)를 참조하여, 경화 공정으로 고체화된 미세전극 (36)이 생성되고, 이는 담체의 증발로 인해 주조용 금형의 마이크로채널(들)의 원래 크기보다 대략 20％ 더 작다.
본 발명에 따른 방법에서, 효소, 및 효소 고정화 물질이 부여되도록 미세전극이 처리되어 바이오애노드가 형성된다. 특정 실시양태에서, 효소를 함유하는 효소 고정화 물질을 경화된 미세전극에 적용한다. 바이오애노드를 형성시키기 위해, 미세전극을 경화시킨 후 기판으로부터 주조용 금형을 제거한다. 도 4(c)를 참조한다. 도 4(d)를 참조하여, 주조용 금형 대신에 주조용 금형의 마이크로채널의 대 략 2배의 폭을 갖는 마이크로채널 (34)이 있는 기체-투과성 금형이 가역적으로 미세전극 위에서 실링된다. 기체-투과성 금형은 전도성이지 않고, 전자 도체를 부통태화시키지 않으며, 용매의 증발을 용이하게 하는 임의의 물질로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 규소 중합체, 예컨대 PDMS를 기체-투과성 금형 물질로 사용한다. 더욱 바람직하게는, 열가소성 수지, 예컨대 폴리카르보네이트가 기체-투과성 금형 물질이다. 기체-투과성 금형을 위치시킨 후에, 바이오애노드 효소를 함유하는 효소 고정화 물질을 경화된 미세전극에 적용한다. 이는 주조 용액을 입구 저장소 (33) 내로, 그리고 기체-투과성 금형을 통과하여 배출구 (35)로 주사기에 의해 방출시켜 달성된다. 완성된 바이오애노드에 대해서 도 4(d)를 참조한다.
모든 실시양태에서, 효소 고정화 물질, 효소의 특정 조성은 상기 I.B.2. 내지 I.B.3에 기술되어 있다. 바이오애노드에 바람직한 효소 고정화 물질은 테트라알킬 암모늄-개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 중합체 또는 소수성 개지된 다당류, 특히 소수성 개질된 키토산이다. 애노드에서 바람직한 효소는 PQQ-의존성 데히드로게나제이다. 또한, 모든 실시양태에서 주조용 금형은 하나 초과의 마이크로채널을 포함할 수 있다.
2. 바이오캐소드 제작
본 발명에 따른 바이오캐소드를 형성시키기 위해, 바이오애노드를 제작하기 위해 사용된 동일한 일반적인 공정 단계들을 사용하여 바이오캐소드를 제조할 수 있다. 바이오캐소드를 효소 고정화 물질 및 효소로 처리하는 실시양태는 바이오애노드에 대한 것과 동일하다. 효소 고정화 물질 및 효소의 특정 조성은 상기 I.A.2. 내지 I.A.3에 기술되어 있다. 바이오캐소드에 바람직한 효소 고정화 물질은 테트라알킬 암모늄-개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체 또는 소수성 개질된 다당류, 특히 소수성 개질된 키토산이다. 또한, 바이오캐소드에 바람직한 효소는 빌리루빈 옥시다제이다.
3. 작동가능한 바이오연료 전지의 형성
바이오애노드 및 바이오캐소드가 본 발명에 따라 형성된 후, 주조용 금형 또는 기체-투과성 금형이 임의로 제거된다. 이러한 임의의 실시양태에서, 바이오애노드 및 바이오캐소드는 기판 상에서 유지된다. 주조용 금형 또는 기체-투과성 금형이 제거된 후, 미세유체 채널 성형품이 바이오애노드 및 바이오캐소드 위에 정렬된다. 이러한 성형품은 바이오연료 전지의 연료 유체가 이를 통과하여 유동할 수 있는 하나 이상의 미세유체 채널이 생성되도록 미세패턴화된다 성형품은 전도성이지 않고, 전도성 물질을 부동태화시키지 않으며, 기판에 부착되는 임의의 물질로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 성형품은 PDMS이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 오버레이(overlay)는 폴리카르보네이트이다. 성형품 내의 미세유체 채널(들)의 미세패턴은 임의의 공지된 소프트 리소그래피 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 미세유체 채널은 미세전극보다 약 2배 내지 4배 더 크다. 또다른 실시양태에서, 미세유체 채널은 미세전극과 크기가 대략 동일하다. 성형품의 미세유체 채널은 내부에서 연료 유체가 미세전극과 계면(界面)되는 전기화학 전지를 본질적으로 한정한다. 바이오애노드, 바이오캐소드, 연료 유체 및 산화제의 하우징에 오직 하나의 미세유체 채널이 사용되는 경우, 동일한 미세유체 챔버 내의 연료 유체와 산화제의 혼합물은 본 발명의 미세전극의 기능을 손상시키지 않는데, 이는 이들의 산화환원 반응이 선택적이기 때문이다. 다르게 설명하면, 바이오애노드는 연료 유체와만 반응할 것이고, 바이오캐소드는 산화제와만 반응할 것이며, 교차 반응은 일어나지 않는다.
다른 실시양태에서, 주조용 금형 또는 기체-투과성 금형(들)은 기판과 계속 접촉되고, 상기 기재된 미세유체 채널 성형품으로서 작용하면서 바이오연료 전지의 미세유체 채널들을 한정하는 기능을 한다. 이러한 실시양태에서, 연료 유체는 금형(들)의 마이크로채널과 바이오애노드 또는 바이오캐소드 간의 공간을 통해 이동한다. 이러한 실시양태에서, 후속 가공은 개별적인 바이오애노드 미세유체 채널과 바이오캐소드 미세유체 채널 사이의 접합점이 생성되도록 수행되어야 한다. 접합점을 형성시키기 위해, 개별적인 미세유체 챔버들을 연결시키는 통로는 임의의 적절한 수단에 의해, 예컨대 금형(들)의 정상부에 수직의 힘을 가하거나 또는 충분한 물질을 금형(들)로부터 제거함으로써 금형(들) 내에 형성된다. 그 후에, 통로가 접합점을 실링하는 물질로 덮여서, 작동하는 동안 연료 유체 또는 산화제가 누출되지 않도록 한다. 물질은 금형 물질에 결합하여 적절한 실링을 생성시킬 수 있어야 한다. 한 실시양태에서, 덮개 물질은 단순하게 금형 물질, 예컨대 PDMS 또는 폴리카르보네이트의 편평한 조각이다.
4. 임의의 형성 실시양태
상기 III.B.1.에서 기재된 미세전극 제작 기술은 바이오애노드 및 바이오캐소드가 연속적으로 형성된 후에, 바이오애노드와 바이오캐소드를 마이크로채널을 통해 연결하는 방법에 의해 바이오연료 전지가 형성되는 실시양태를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 바이오애노드 및 바이오캐소드는 동시에 형성될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 단일 주조용 금형이 패턴화되어 바이오애노드 및 바이오캐소드 모두가 형성된다. 다르게는, 주조용 금형의 조합이 사용되어 개별적인 바이오애노드 및 바이오캐소드가 형성될 수 있다. 2 가지 경우에서는, 바이오애노드 및 바이오캐소드를 동시에 형성한 후에, 미세유체 채널 성형품을 가하거나 또는 III.B.3에 기술된 바와 같은 주조용 금형(들)을 변형시킴으로써 작동가능한 바이오연료 전지를 형성한다.
상기 III.A.에 기재된 실시양태는 다른 가공 단계 전에 전기 커넥터가 기판 상에 형성되는 것을 기술하고 있다. 다른 실시양태에서, 전기 커넥터는 최종 가공 단계로서 미세유체 바이오연료 전지에 첨가된다. 여기서, 홀들이 미세유체 채널 성형품 또는 개질된 주조용 금형(들) 내에 생성되어, 각 바이오애노드 및 바이오캐소드의 일부가 노출된다. 이어서, 전기 커넥터가 각 바이오애노드 및 바이오캐소드의 노출된 부분에 물리적으로 결합된다. 이러한 실시양태에서, 전기 커넥터는 외부 전기 부하가 바이오애노드 및 바이오캐소드와 전기적으로 접촉되도록 하는 임의 구조의 임의의 물질일 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 전기 커넥터는 실린더형 구리체일 수 있다. 또한, 전기 커넥터와 바이오애노드 및 바이오캐소드 사이의 전기적 접촉을 유지시킬 수 있는 임의의 결합 기술을 사용할 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 은 에폭시 페이스트를 사용하여 전기 커넥터와 바이오애노드 및 바이오캐소드를 전기적으로 결합시킬 수 있다. 이러한 실시양태는 이러한 성분 들 간의 전도성을 증가시키는 장점을 갖는다.
상기의 실시양태들에는 바이오애노드 및 바이오캐소드 둘 모두가 바이오연료 전지의 마이크로채널(들) 내에 하우징된 바이오연료 전지가 기재되어 있다. 이것이 바람직한 실시양태이긴 하지만, 본 발명의 다른 실시양태에는 바이오연료 전지의 마이크로채널(들)의 외부에 위치한 애노드 또는 캐소드가 포함된다. 여기서, 연료 전지는 미세유체 바이오애노드 또는 바이오캐소드를 적절한 외부 애노드 또는 캐소드와 조합함으로써 형성된다.
C. 미세유체 바이오연료 전지의 사용
본 발명의 작동가능한 미세유체 바이오연료 전지의 제작이 완료된 후에, 이는 바이오애노드 및 바이오캐소드 각각에 대해 연료 유체 공급원 및 산화제가 이용가능한 무수한 용도로 사용될 수 있다. 사용 시, 연료 유체 및 산화제는 미세유체 채널(들)을 통해 이동하여 바이오애노드 및 바이오캐소드와 접촉한다. 여기서, 상기 I.에 기재된 산화환원 반응이 일어나 전류 공급원이 생성된다. 본 발명의 미세유체 바이오연료 전지는 전기 공급이 필요한 임의의 용도, 예컨대 전자 장치, 상업용 장난감, 내과용 장치, 및 전기 구동형 비히클에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 미세유체 바이오연료 전지는 살아 있는 생물체 내로 이식될 수 있고, 이 때 연료 유체는 생물체로부터 유래되고 전류는 살아 있는 생물체 내에 이식된 장치에 전력을 공급하기 위해 사용된다.
또한, 본 발명의 다중 미세유체 바이오연료 전지는 일련의 전기 회로에서 결합되어 바이오연료 전지 적층체를 형성할 수 있다. 도 5을 참조한다. 원하는 적 층체가 수득될 때까지, 한 바이오연료 전지의 바이오애노드 (41)가 또다른 바이오연료 전지의 바이오캐소드 (40)에 전기적으로 결합되고, 이 바이오캐소드는 다시 또다른 바이오애노드 (41)에 연결되어 일련의 적층체를 형성한다. 연료 유체 및/또는 산화제는 입구 저장소 (33)에서 미세유체 챔버 내로 유동한다. 적층체를 형성시킴으로써, 미세유체 바이오연료 전지 회로의 전체 전압 출력은 이론적으로 일련의 개별적인 미세유체 바이오연료 전지로부터의 전압 출력의 합이다. 이같은 적층체의 더 큰 전체 전압 출력은 전력 요구량이 개별적인 바이오연료 전지가 제공할 수 있는 것보다 높은 전자 장치, 장난감, 의료 장치 및 비히클에 전기를 공급하는데 유용하다.
IV. 전기 발생 방법
본 발명은 애노드에서 연료 유체를 산화시키고, 캐소드에서 산화제를 환원시키는 단계를 포함하는 전기 발생 방법을 포함하며, 여기서 전기는 상기 기재된 바와 같은 바이오애노드 및/또는 바이오캐소드를 포함하는 바이오연료 전지를 사용하여 발생시킨다.
정의
본원에 사용된 용어 "탄화수소" 및 "히드로카르빌"은 오직 탄소 및 수소 원소로만 이루어진 유기 화합물 또는 라디칼을 설명한다. 이러한 잔기로는 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴 잔기가 있다. 이들 잔기는 또한 다른 지방족 또는 시클릭 탄화수소 기로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐 및 아릴 잔기, 예컨대 알크아릴, 알켄아릴 및 알킨아릴을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 이들 잔기는 바람직하게는 1 내지 20개의 탄소 원자를 포함한다.
본원에 기재된 "치환된 히드로카르빌" 잔기는 하나 이상의 탄소가 아닌 원자로 치환된 히드로카르빌 잔기로, 탄소쇄 원자가 헤테로 원자, 예컨대 질소, 산소, 규소, 인, 붕소, 황, 또는 할로겐 원자로 치환된 잔기를 포함한다. 이러한 치환기로는 할로겐, 헤테로시클로, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아릴옥시, 히드록시, 보호된 히드록시, 케토, 아실, 아실옥시, 니트로, 아미노, 아미도, 니트로, 시아노, 티올, 케탈, 아세탈, 에스테르 및 에테르가 있다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 기재된 알킬기는 바람직하게는 주쇄에 1 내지 8개의 탄소 원자를 함유하고 20개까지의 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬이다. 이들은 직쇄 또는 분지쇄, 또는 고리형일 수 있으며, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 헥실 등을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 기재된 알케닐기는 바람직하게는 주쇄에 2 내지 8개의 탄소 원자를 함유하고 20개까지의 탄소 원자를 함유하는 저급 알케닐이다. 이들은 직쇄 또는 분지쇄, 또는 고리형일 수 있으며, 에테닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, 헥세닐 등을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 기재된 알키닐기는 바람직하게는 주쇄에 2 내지 8개의 탄소 원자를 함유하고 20개까지의 탄소 원자를 함유하는 저급 알키닐이다. 이들은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있으며, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 이소부티닐, 헥시닐 등을 포함한다.
본원에서 단독으로 또다른 기의 일부로 사용된 용어 "아릴" 또는 "아르"는 고리 부분에 6 내지 12개의 탄소를 함유하는 임의로 치환된 호모시클릭 방향족 기, 바람직하게는 모노시클릭 또는 바이시클릭 기, 예컨대 페닐, 바이페닐, 나프틸, 치환된 페닐, 치환된 바이페닐 또는 치환된 나프틸을 나타낸다. 페닐 및 치환된 페닐은 보다 바람직한 아릴이다.
본원에서 단독으로 또는 또다른 기의 일부로 사용된 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 염소, 브롬, 불소 및 요오드를 나타낸다.
본원에서 단독으로 또는 또다른 기의 일부로 사용된 용어 "아실"은 유기 카르복실산의 -COOH 기로부터 히드록실기를 제거하여 형성된 잔기, 예를 들면 RC(O)- (여기서, R은 R1, R1O-, R1R2N- 또는 R1S-이고, R1은 히드로카르빌, 헤테로치환된 히드로카르빌 또는 헤테로시클로이고, R2는 수소, 히드로카르빌 또는 치환된 히드로카르빌임)를 나타낸다.
본원에서 단독으로 또는 또다른 기의 일부로 사용된 용어 "아실옥시"는 산소 연결 (-O-)을 통해 결합된 상기 기재된 아실기, 예를 들면 RC(O)O- (여기서, R은 용어 "아실"과 관련하여 정의된 바와 같음)를 나타낸다.
용어 "헤테로원자"는 탄소 및 수소가 아닌 원자를 의미할 것이다. 본원에서 단독으로 또는 또다른 기의 일부로 사용된 용어 "헤테로시클로" 또는 "헤테로시클릭"은 하나 이상의 고리에 하나 이상의 헤테로원자를 갖고, 바람직하게는 각각의 고리에 5 또는 6개의 원자를 갖는, 임의로 치환되고, 완전히 포화되거나 또는 불포화된 모노시클릭 또는 바이시클릭 방향족 또는 비방향족 기를 나타낸다. 헤테로시 클로기는 바람직하게는 고리에 1 또는 2개의 산소 원자, 1 또는 2개의 황 원자 및/또는 1 내지 4개의 질소 원자를 가지며, 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 결합될 수 있다. 헤테로시클로의 예로는 헤테로방향족, 예컨대 푸릴, 티에닐, 피리딜, 옥사졸릴, 피롤릴, 인돌릴, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 등이 있다. 치환기의 예는 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌, 케토, 히드록시, 보호된 히드록시, 아실, 아실옥시, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아릴옥시, 할로겐, 아미도, 아미노, 니트로, 시아노, 티올, 케탈, 아세탈, 에스테르 및 에테르 기들 중 하나 이상을 포함한다.
하기 실시예로 본 발명을 설명한다.
실시예 1: 상이한 탄소 표면 상의 빌리루빈 옥시다제를 사용하는 직접 전자 전달
탄소 페이스트 전극 개질: 각각의 실험은 새로 충전된 탄소 페이스트 전극을 사용하여 수행하였다. 탄소 페이스트 충전 이후에, 4개의 전극을 다음의 탄소 물질들 중 하나로 개질시켰다: 카본 블랙, 탄소 웜, 탄소 나노튜브 (직경 20 nm 및 길이 5 내지 20 ㎛) 및 벌칸 XC-72 상 Pt. 개질되지 않은 탄소 페이스트 전극을 대조군으로 사용하였다. 개질된 전극을 pH 완충 용액 (pH 7.15) 중 빌리루빈 옥시다제의 용액에 15 분 동안 4 ℃에서 침지시켰다. 빌리루빈 옥시다제 효소 용액은 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 7.15) 10 mL에 용해시킨 빌리루빈 옥시다제 1.0 mg을 함유하였다. 전극이 효소 용액에서 평형화되면, 이들을 진공 데시케이터에 넣어 대략 15 분 동안 건조시켰다. 건조되면, 전극을 탈기된 포스페이트 완충 용액 (pH 7.15)의 대조군 용액에서 전압전류법에 의해 시험하였다. 개질된 탄소 페이스트 전극을 작용 전극으로 사용하고, 이어서 백금 메쉬 반대 전극 및 SCE 기준 전극과 커플링시켰다. 각각의 전극을 0.01 V/s의 스캔 속도로 0.8 V 내지 -0.1 V에서 스캐닝하였다. 각각의 개질된 탄소 페이스트 전극을 탈기된 포스페이트 완충액 중에서 시험한 후에, 시험 용액에 산소를 주입하고, 직접 전자 전달이 일어나는지 여부를 결정하기 위해 이전에 기재된 바와 동일한 파라미터를 이용하여 각각의 전극을 스캐닝하였다.
이들 연구 결과의 데이타를 아래 표에 기재하였다. 이들 데이타는 탄소 나노튜브를 사용한 전극 개질이 가장 크게 유속을 향상시켰음을 보여준다.
<표>
Figure 112008039047689-PCT00009
3 가지 별개의 방법을 이용하여 TBAB 개질된 나피온(등록상표)/탄소 나노튜브 합성물을 제조하였다. 첫번째 방법 (방법 1)은 뷸러(Buehler) 직물 상에서 0.1 ㎛ 알루미나를 사용하여 유리질 탄소 전극을 연마한 후에 메탄올 및 물로 세정하여 사전 전극 부착을 방지하는 것을 포함한다. 이전에 기재된 바와 같이 제조한 빌리 루빈 옥시다제 용액과 함께 나노튜브 0.05 g을 사용하여 탄소 나노튜브 슬러리를 제조하였다. 이 페이스트를 습윤 페이스트가 형성될 때까지 건조시켰다. 이어서, 탄소 페이스트를 진공 데시케이터에 넣고 완전하게 건조시켰다. 다음에, 건조된 페이스트 2.0 mg을 TBAB 개질된 나피온(등록상표) 중합체 용액 100 ㎕와 합하였다. 현탁액을 사이언티픽 인더스트리스 볼텍스 제니 2(Scientific Industries Vortex Genie 2)로 교반하여 적절하게 혼합하였다. 현탁액 20 ㎕를 연마된 유리질 탄소 전극 (GCE)의 정상부에 피펫으로 올렸다. 개질된 전극을 10 내지 50 rpm의 속도로 회전 코팅시킨 후에, 진공 데시케이터에 넣고 대략 15 분 동안 건조시켰다. 현탁액 중 효소/나노튜브 페이스트로 회전 코팅된 TBAB 개질된 나피온(등록상표)을 SCE 기준 전극 및 반대 전극으로서의 백금 메쉬를 사용하여 탈기된 완충 용액 (pH 7.15) 중에서 이전에 기재된 바와 동일한 방식으로 시험하였다. 각각의 전극을 순환 전압전류법을 이용하여 0.01 V/s의 스캔 속도로 0.8 V 내지 -0.1 V에서 스캐닝하였다. 대조 실험 이후에, 포스페이트 완충 용액 (pH 7.15)에 적어도 15 분 동안 산소를 주입한 후에 샘플 실험을 진행하였다. 이들 실험으로부터 수득한 모든 결과는 PC에 연결된 CH 인스트루먼츠(CH Instruments) 일정전위기를 사용하여 결부시켜 기록하였다.
두번째 방법 (방법 2)은 상기 기재된 바와 같이 유리질 탄소 전극을 연마하는 것을 포함한다. 기재된 바와 같이 제조된 빌리루빈 옥시다제 용액 1.0 mL에 현탁시킨 나노튜브 0.05 g을 함유하는 나노튜브 및 빌리루빈 옥시다제 페이스트를 제조하였다. 적절하게 혼합하기 위해 효소/나노튜브 현탁액을 사이언티픽 인더스트 리스 볼텍스 제니 2로 교반하였다. 현탁액 20 ㎕를 연마된 유리질 탄소 전극의 정상부에 피펫으로 올렸다. 전극을 진공 데시케이터에서 대략 15 분 동안 건조시켰다. 건조시킨 후에, TBAB 개질된 나피온(등록상표) 5 ㎕를 나노튜브/빌리루빈 옥시다제 페이스트 개질된 전극 위에서 회전 코팅시켰다. 이어서, 회전 코팅된 전극을 진공 데시케이터에서 대략 15 분 동안 건조시켰다. TBAB 개질된 나피온(등록상표) 전극으로 회전 코팅된 효소/나노튜브 페이스트를 기재된 바와 동일한 방식으로 시험하였다.
세번째 방법 (방법 3)은 다시 유리질 탄소 전극을 연마하여 시작하였다. 이어서, 포스페이트 완충액 (pH 7.15) 1.0 mL에 현탁시킨 나노튜브 0.05 g을 함유하는 나노튜브 페이스트를 제조하였다. 적절하게 혼합하기 위해 나노튜브 현탁액을 사이언티픽 인더스트리스 볼텍스 제니 2로 교반하였다. 나노튜브 현탁액 20 ㎕를 건조된 나노튜브 페이스트 위의 전극의 정상부에 피펫으로 올린 후에 진공 데시케이터에서 대략 15 분 동안 건조시켰다. 상기 기재된 바와 같이 제조된 빌리루빈 옥시다제 효소 용액 20 ㎕를 건조된 나노튜브 페이스트 위의 전극의 정상부에 피펫으로 올렸다. 건조되면, 이들 전극을 TBAB 개질된 나피온(등록상표) 중합체 5 ㎕로 50 rpm에서 회전 코팅시켰다. 전극을 진공 데시케이터에서 대략 15 분 동안 건조시켰다. TBAB 개질된 나피온(등록상표) 전극으로 회전 코팅된 나노튜브 페이스트/효소 용액을 이전에 기재된 바와 동일한 방식으로 시험하였다.
이들 실험 결과를 아래 표에 기재하였다. 이들 데이타는 방법 1이 방법 2 보다 적은 가변성을 나타내면서 유속을 상당히 향상시키므로 탄소 나노튜브/효소 /TBAB 개질된 나피온(등록상표) 합성물의 형성에 바람직한 방법임을 보여준다.
<표 2>
Figure 112008039047689-PCT00010
실시예 2: 바이오연료 전지 내의 빌리루빈 옥시다제 캐소드
바이오연료 전지 내의 애노드 및 캐소드 전극을 생물학적 촉매 (효소)를 사용하여 제조하였다. 테트라부틸암모늄-개질된 나피온(등록상표) NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 바이오애노드를 이들 실험에 사용하였다. 1 cm2 탄소 직물로 이루어진 바이오캐소드를 개발하였다. 빌리루빈 옥시다제 (미로테시움 베루카리아(Myrothecium verrucaria)로부터 입수함, 유닛 활성 = 10 유닛.mg, 시그마(Sigma)) 0.5 mg을 DE 520 나피온 막 현탁액 100 ㎕에 첨가하고, 볼텍스로 20 분 동안 교반하였다. 효소/막 주조 용액 2 ㎕를 탄소 전극 상에 피펫으로 올리고, 12 시간 동안 건조시켰다. 모든 전기화학 실험을 실온 (20 내지 25 ℃)에서 수행하였다. 전극을 용존 산소로 포화된 pH = 7.15, 7.5 및 8.0의 포스페이트 완충액에 도입하였다. PC 컴퓨터에 연결된 CH 인스트루먼츠 일정전위기 모델 900에서 측정을 수행하였다. DE520 나피온 1 mL에 TBAB (테트라부틸브롬화암모늄) 0.09672 g을 첨가하여 DE520 나피온(등록상표) 막 현탁액을 제조하였다. 이어서, 혼합물 용액을 칭량 보트(weigh boat)에서 주조하고, 밤새 건조시켰다. 건조되면, 혼합물-주조 필름을 18 MΩ 물에 24 시간 동안 침지시켜 잉여량의 브로마이드 염을 제거하였다. 염 추출 후에, 필름을 18 MΩ 물로 철저하게 3회 세정하고, 건조시켰다. 필름을 에탄올 1 mL에 재현탁시켰다.
2 가지 유형의 전기화학 전지를 사용하였다. 전통적인 연료 전지를 애노드 및 캐소드 분획이 나피온(등록상표) 117 PEM 막 (알파 아에사; Alfa Aesar)에 의해 분리된 U-형 유리 전지로 시험하였다. 두번째 유형의 연료 전지 (막이 없는 연료 전지)의 경우, 바이오캐소드 및 바이오애노드를 연료 용액을 함유하는 5O mL 비이커에 도입하였다. 연료 용액은 pH 7.15, 7.5 및 8.0의 포스페이트 완충액 중 1.0 mM 에탄올 및 1.0 mM NAD+로 이루어진다. 이 용액을 공기 중에서 평형화시켜 시험 전에 산소가 완충액에 용해되도록 하였다. 전극들을 대략 1 cm 정도 떨어지도록 배치하여 이들이 서로 접촉하지 않도록 하였다.
전통적인 연료 전지는 애노드 및 캐소드 분획이 나피온(등록상표) 117 PEM 막 (알파 아에사)에 의해 분리되어 있는 U-형 유리 전지로 시험하였다. 애노드액은 상이한 pH를 갖는 포스페이트 완충액 중 1.0 mM 연료 용액이고, 캐소드액은 공기에 노출되고 상이한 pH를 갖는 완충 용액이다. 실험 동안, 유일한 산소 공급원은 완충액 중의 용존 산소였다. 완성된 NAD+-의존성 바이오애노드를 빌리루빈 옥시다제 바이오캐소드를 함유하는 자신의 캐소드 챔버에 커플링된 별도의 애노드 연료 전지 챔버에 도입하였다.
공기에 노출시킨 완충 용액 (pH 8.0) 중 1.0 mM NAD+ 및 1.0 mM 에탄올을 함유하는 비이커에 바이오캐소드 및 바이오애노드를 넣어 막이 없는 에탄올/산소 바이오연료 전지를 형성하였다. 이전에 개발된 바이오애노드의 정규 시험 동안, NAD+는 바이오애노드 내에 정전기적으로 고정화되어 있으므로 완충 용액에 첨가하지 않는다. 그러나, 상기 시스템을 시험하는 경우에는 바이오애노드로부터 걸러질 수 있는 임의의 NAD+가 바이오캐소드 반응 또는 바이오캐소드 수명에 영향을 미치지 않도록 하기 위해 NAD+를 용액에 첨가하였다. 막이 없는 바이오연료 전지의 초기 개방 회로 전위는 1.20 V이고, 최대 전력 밀도는 0.64 mW/cm2였다. 개방 회로 전위 및 전력 밀도가 모두 막이 없는 시스템에 비해 더 높다는 것을 알 수 있다. 빌리루빈 옥시다제 바이오캐소드가 산화환원 반응 매개체를 함유하지 않는 바이오연료 전지는 산화환원 반응 매개체를 함유하는 빌리루빈 옥시다제 바이오캐소드를 함유하는 바이오연료 전지에 비해 개방 회로 전위가 0.30 V 증가하고, 전력 밀도가 0.25 mW/cm2 증가하였다.
표 3에서는 실온 및 상이한 완충액 pH에서 상이한 바이오연료 전지를 사용하여 수득한 데이타를 비교하고 있다. 전통적인 바이오연료 전지를 용액의 pH를 증가시켜 사용하였을 때 개방 회로 전위, 전류 밀도 및 전력 밀도도 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. pH 8.0에서 7.65 mA/cm2의 전류 밀도 및 0.45 mW/cm2의 전력 밀 도와 1.16 V의 최대 개방 회로 전위를 수득하였다. 막이 없는 바이오연료 전지의 경우, 동일한 작용 조건하에, pH 8.0에서 11.7 mA/cm2의 전류 밀도 및 0.64 mW/cm2의 전력 밀도와 1.10 V의 최대 개방 회로 전위를 수득하였다. pH 7.15에서 1.20 V의 보다 높은 개방 회로 전위를 수득하였으나, 이 pH에서는 전류 및 전력 밀도가 pH 8에서 보다 낮았다. 이로부터, 막이 없는 바이오연료 전지의 경우, 연료 용액의 pH가 증가하면 개방 회로 전위가 약간 감소하고, 전류 및 전력 밀도는 증가한다는 결론을 내릴 수 있었다.
Figure 112008039047689-PCT00011
상기 기재된 막이 없는 바이오연료 전지에 대한 추가의 실험 결과를 실온에서 포스페이트 완충액 (pH 8.0) 중 1.O mM NAD+ 용액 중에서 수집하였다. 도 6은 상기 시스템에 대한 대표적인 전력 곡선을 도시하고 있다. 도 7은 상기 시스템에 대한 전력 출력을 제작 시점으로부터 시간의 함수로 도시하고 있다. 도 8은 전력 출력을 50％ 습도에서의 온도의 함수로 도시하고 있다. 아래 표는 다양한 에탄올 농도에서의 최대 개방 회로 전위, 최대 전류 밀도 및 최대 전력 밀도를 기술하고 있다.
Figure 112008039047689-PCT00012
실시예 3: 리폭시게나제 바이오애노드의 제조
상기 기재된 바와 같이 다양한 암모늄 염-처리된 나피온(등록상표) 효소 고정화 물질의 현탁액을 제조하였다. 리폭시게나제 효소의 원액을 제조하였다. 동일한 양의 리폭시게나제 용액 및 개질된 나피온(등록상표) 현탁액을 혼합하고, 이 용액을 1 cm2 카본지 지지체의 표면에 피펫으로 올리고, 완전하게 건조시켰다.
애노드 및 캐소드 분획을 분리시키는 나피온(상표명) 117 막을 갖는 U-형 유리 전지를 사용하였다. 연료 전지의 캐소드 측면을 완충액 (pH 약 7.15)으로 충전시키고, 백금 캐소드를 용액에 부분적으로 현탁시켰다. 연료 전지의 애노드 측면을 완충액 100 mL 중에 대두유 10 ㎕를 함유하는 초음파처리된 연료 용액으로 충전시켰다. 애노드를 용액에 완전히 현탁시켰다. 나피온(등록상표)은 테트라부틸브롬화암모늄 (TBAB), 트리에틸헥실브롬화암모늄 (TEHA), 트리메틸헥실브롬화암모늄 (TMHA), 트리메틸옥틸브롬화암모늄 (TMOA), 트리메틸데실브롬화암모늄 (TMDA), 트리메틸도데실브롬화암모늄 (TMDDA) 또는 트리메틸테트라데실브롬화암모늄 (TMTDA)으로 개질시켰다. 아래 표는 개질된 나피온(등록상표) 막 및 리폭시게나제 효소를 함유하는 다양한 바이오애노드의 결과를 기술하고 있다.
Figure 112008039047689-PCT00013
실시예 4: 알킬 개질된 키토산의 제조
중간 분자량 키토산 (알드리치(Aldrich)로부터 입수가능함) (0.500 g)을 1％ 아세트산 15 mL에 빠르게 교반하면서 용해시켰다. 이로부터 점성 겔-유사 용액이 생성되었으며, 이어서 메탄올 15 mL를 첨가하였다. 키토산 겔을 대략 15 분 동안 교반한 후에, 알데히드 (부타날, 헥사날, 옥타날 또는 데카날) 20 mL를 키토산 겔에 첨가하고, 이어서 나트륨 시아노보로히드라이드 1.25 g을 첨가하였다. 현탁액이 실온으로 냉각될 때까지 겔을 계속 교반하였다. 생성된 생성물을 진공 여과에 의해 분리하고, 메탄올의 150 mL 증분으로 3회 세척하였다. 이어서, 개질된 키토산을 40 ℃의 진공 오븐에서 2 시간 동안 건조시킨 결과 백색 고체 조각이 남았다. 각 중합체의 1 중량％의 현탁액이 50％ 아세트산, 클로로포름 및 t-아밀 알코올에서 형성되었다.
실시예 5: 소수성 개질된 키토산의 형광 영상화
각각의 중합체 현탁액 2 ㎕를 유리 현미경 슬라이드 (피셔; Fisher) 위에서 주조하고, 데시케이터에서 건조시켰다. 20 ㎕ 부피의 0.01 mM Ru(bpy)3 2+ 또는 0.01 mM FITC를 중합체 주조물 위에 피펫으로 올리고, 2 분 동안 침지시켰다. 침지시킨 후에, 슬라이드를 18 MΩ 물로 세정하고, 데시케이터에서 건조시켰다. 올림푸스(Olympus) BX60M 에피형광 현미경 (미국 뉴욕 멜빌 소재)을 이용하여 중합체를 영상화시켰다. 비디오 카메라 (소니(Sony) SSC-DC50A)의 40× 초장 작용 거리 렌즈로 중합체를 관찰하였다. 형광 여기는 수은 램프를 사용하여 달성하였다. 프레임 그래버 카드(frame grabber card) (인테그랄 테크놀로지스, 인크.(Integral Technologies, Inc.), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)를 사용하여 영상을 수득하고, 이 영상을 델(Dell) PC에서 SPOT 소프트웨어 (디아그노스틱 인스트루먼츠, 인크.; Diagnostic Instruments, Inc.)를 사용하여 분석하였다. Ru(bpy)3 +2 및 플루오레세인에서 소수성 개질된 다중전해질 각각에 대해 형광 영상화를 수행하여 소수성 개질의 형태학적 효과를 결정하였다. 형광 연구는 집합체가 소수성 개질된 키토산 내에서 형성되고, 형태는 알킬쇄 길이가 변화한다는 것을 보여주었다. 부틸 개질된 키토산은 작은 섬유 모양의 상호연결을 갖는 것으로 나타난 반면, 헥실 개질된 키토산은 보다 작은 미셀 도메인을 함유하는 큰 도메인을 갖는다. 알킬쇄 길이가 증가할수록, 미셀 도메인의 개수는 감소하였으나, 도메인의 크기는 증가하였다. 개질되지 않은 키토산의 형광 현미경 사진에서는 독특한 도메인이 나타나지 않았으며, 또한 개질되지 않은 키토산에서는 미셀 구조가 관찰되지 않았다.
실시예 6: 소수성 개질된 키토산의 전기화학적 측정
유리질 탄소 작용 전극 (직경 3 mm, CH 인스트루먼츠)을 뷸러 연마천 상에서 0.05 ㎛ 알루미나로 연마하고, 18 MΩ 물에서 세정하였다. 각각의 중합체 현탁액 2 ㎕를 유리질 탄소 전극 표면 상에서 주조하고, 사용할 때까지 진공 데시케이터에서 건조시켰다. 순환 전압전류법을 이용하여 전극 표면에서 중합체 막을 통과하는 산화환원 반응 종의 유속을 측정하였다. 작용 전극을 지지 전해질로서의 0.1 M 황산나트륨을 백금 메쉬 반대 전극과 함께 함유하는 1.0 mM 산화환원 반응 종 용액에서 평형화시키고, 포화 칼로멜 기준 전극에 대해 측정하였다. 연구된 산화환원 반응 종은 카페인, 칼륨 페리시아니드 및 Ru(bpy)3 2+이다. 데이타를 CH 인스트루먼츠 일정전위기 모델 810에 연결된 델 컴퓨터에서 수집하여 분석하였다. 순환 전압전류법은 0.05 V/s 내지 0.20 V/s 범위의 스캔 속도로 수행하였다. 모든 실험은 3회 수행하였으며, 표준 편차 1에 상응하는 것은 불확실한 것으로 보고하였다.
2 가지 소수성 개질된 다중전해질의 순환 전압전류법 연구 결과는 소수성 개질된 알킬쇄 길이의 함수로 나타내었다. 모든 순환 전압전류법 실험은 선형 ip 대 v1/2 플롯으로 나타내었으며, 이는 수송-제한된 전기화학을 의미한다. 전기화학적 유속은 방정식 2로 나타낸 바와 같은 농도의 함수로, KD1 /2 값은 여기에서 유속을 비교하는 농도 독립적 방법으로 보고되었다.
<방정식 2>
Figure 112008039047689-PCT00014
여기서, i는 피크 전류이고, n은 전달된 전자의 개수이고, F는 패러데이(Faraday) 상수이고, A는 전극의 면적이고, C*는 산화환원 반응 종의 농도이고, v는 스캔 속도이고, K는 추출 계수이고, D는 확산 계수이다. 용매는 다시 주조하는 동안 중합체가 팽창하는 정도를 결정한다. 키토산 및 키토산 유도체에 대한 대부분의 문헌 연구는 재현탁에 사용되는 용매로 아세트산을 사용하지만, KD1 /2 값으로부터 클로로포름이 보다 높은 평균 유속을 제공함을 유의하는 것이 중요하다. 개질되지 않은 키토산은 아세트산 용액에서만 용해될 수 있다. 카페인 중 개질되지 않은 키토산에 대한 KD1/2 값은 5.52 (±0.14)×10-3이었다. 키토산의 소수성 개질은 카페인의 유속을 감소시킬 수 있으나, 유속을 뚜렷하게 증가시킬 수는 없음이 분명하다.
반면, Ru(bpy)3 +2와 같은 큰 소수성 이온의 수송은 세공 구조/크기의 작은 변화에 크게 영향을 받을 수 있다. 개질되지 않은 키토산을 통한 Ru(bpy)3 +2 수송에 대한 KD1 /2 값은 2.17 (±0.33)×10-4이었다. 키토산의 소수성 개질이 모든 경우에서의 Ru(bpy)3 +2의 수송을 t-아밀 알코올에 재현탁시킨 옥틸 개질된 키토산 막에 비해 11.1배 만큼 증가시켰음이 분명하다.
실시예 7: 전극의 제조
2 중량％의 소수성 개질된 키토산 중합체 용액을 t-아밀 알코올에 현탁시키고, 글루코스 옥시다제 용액을 첨가하였다. 이 용액을 전극 물질 상에 피펫으로 올렸다. 이 전극 물질은 통상적으로 탄소 직물 또는 다른 탄소 물질이었다.
실시예 8: 소수성 개질된 키토산에 대한 글루코스 옥시다제 활성 시험
글루코스 옥시다제 (GOx)는 동시에 과산화수소를 방출시키는 β-D-글루코스의 D-글루코노-δ-락톤으로의 산화를 촉매한다. 이는 β-D-글루코스에 대해 고도로 특이적이며, α-D-글루코스에 대해서는 작용하지 않는다. 퍼록시다제의 존재하에, 과산화수소는 510 nm에서 측정된 퀴논이민 염료 착체의 정량적 형성과 p-히드록시벤조산 및 4-아미노 안티피린이 관련된 분석의 제2 반응에 참여한다. GOx 효소의 활성을 소수성 개질된 나피온 및 키토산 막 각각에서 측정하였다. 소수성 개질된 키토산 막에 GOx 효소를 고정화시키고, 이를 플라스틱 용기에서 주조한 후에 물에 대해 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3회 수행하였으며, 표준 편차 1에 상응하는 것은 불확실한 것으로 보고하였다.
상기 기재하고 표 2에 나타낸 바와 같이, t-아밀 알코올에 현탁시킨 헥실 개질된 키토산 중의 글루코스 옥시다제에서 최고 효소 활성이 관찰되었다. 이들 고정화 막에서는 완충액 중 효소에 비해 2.53배 증가한 GOx 효소 활성이 나타났다.
실시예 9: 키토산-부틸 바이오캐소드
빌리루빈 옥시다제. 소수성 개질된 키토산 (부틸, 헥실, 옥틸 또는 데실) 0.01 g을 나피온(등록상표) DE 520 1 mL와 혼합하고, 혼합 비드와 1 시간 동안 볼텍스로 교반하여 키토산 혼합물을 제조하였다. 이어서, 키토산/나피온(등록상표) 혼합물 분취액 40 ㎕를 빌리루빈 옥시다제 (포스페이트 완충액 (pH 7.15) 10 mL 중 효소 1 mg) 분취액 20 ㎕와 1 분 동안 혼합하였다. 키토산/효소 혼합물을 카본지의 1 cm2 조각에 피펫으로 올려 캐소드를 제작하고, 진공 데시케이터에서 완전하게 건조시켰다. (1) TBA-개질된 나피온(등록상표) NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 애노드 (도 9) 또는 (2) 부틸-키토산 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 애노드 (도 10)와 합한 부틸-키토산 빌리루빈 옥시다제 캐소드에 대한 전력 곡선 데이타를 수집하였다.
또한, 다양한 바이오연료 전지의 작동에 가장 적합한 온도를 결정하기 위한 연구를 수행하였다. (1) TBA-개질된 나피온(등록상표) NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 애노드 및 부틸-키토산 빌리루빈 옥시다제 캐소드, (2) 부틸-키토산 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 애노드 및 TBA-개질된 나피온(등록상표) 빌리루빈 옥시다제 캐소드, 및 (3) 부틸-키토산 NAD+-의존성 알코올 데히드로게나제 애노드 및 부틸-키토산 빌리루빈 옥시다제 캐소드에 대한, 최대 개방 회로 전위 (V), 최대 전류 밀도 (mA/cm2) 및 최대 전력 밀도 (mW/cm2)를 다양한 온도에서 측정하였다. 이 온도 데이타를 하기 표에 기재하였다.
<표>
Figure 112008039047689-PCT00015
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Figure 112008039047689-PCT00016
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Figure 112008039047689-PCT00017
실시예 10: 알킬 개질된 알기네이트의 제조
4급 브롬화암모늄이 혼입된 알기네이트 막은 4급 브롬화암모늄을 3 중량％ 알기네이트 현탁액과 함께 주조하여 형성되었다. 사용되는 중합체는 초저 분자량, 저분자량 또는 중간 분자량 알기네이트이다. 4급 브롬화암모늄을 3 중량％ 현탁액에 첨가하여 혼합물-주조 용액을 제조하였다. 모든 혼합물-주조 용액을 4급 브롬화암모늄의 농도가 알기네이트 현탁액 중 카르복실산 부위의 농도를 초과하도록 제조하였다. 최적화시킨 후에, 가장 안정하고 재현가능한 막이 교환 부위의 농도의 3배에 해당하는 4급 브롬화암모늄 농도를 갖는 것으로 결정되었다.
주조 용액 1 mL를 칭량 보트에 넣고 건조시켰다. 18 MΩ 물 7.0 mL를 칭량 보트에 첨가하고, 밤새 침지시켰다. 물을 제거하고, 필름을 18 MΩ 물로 철저하게 세정하고 건조시켰다. 이어서, 필름을 다시 메탄올 1.0 mL에 현탁시켰다. 테트라프로필암모늄 (T3A), 테트라펜틸암모늄 (T5A), 테트라헥실암모늄 (T6A), 테트라헵틸암모늄 (T7A), 트리메틸이코실암모늄 (TMICA), 트리메틸옥틸데실암모늄 (TMODA), 트리메틸헥실데실암모늄 (TMHDA), 트리메틸테트라데실암모늄 (TMTDA), 트리메틸옥틸암모늄 (TMOA), 트리메틸도데실암모늄 (TMDDA), 트리메틸데실암모늄 (TMDA), 트리메틸헥실암모늄 (TMHA), 테트라부틸암모늄 (TBA), 트리에틸헥실암모늄 (TEHA)의 브롬화암모늄 염을 알기네이트 개질제로 사용하여 어떤 것이 가장 우수한 미셀 구조를 생성하는지 관찰하였다. 미셀 구조는 효소의 효과적인 고정화에 중요하다.
세공 특성을 결정하기 위해, 이어서 각각의 중합체 3 방울을 슬라이드 위에 올리고 건조시켰다. 건조가 완료된 후에, 이들을 에탄올 중 1 mM Ru(bpy)+2에 3 시간 이상 동안 침지시켰다. 에탄올로 세정한 후에, 중합체를 건조시키고, 이어서 형광 현미경으로 영상화시켜 미셀 구조를 관찰하였다. 구조의 한 가지 예를 도 11에 나타내었다.
또다른 실험에서, 초저 분자량 알기네이트 및 도데실아민을 25％ 에탄올에 넣고 환류시켜 카르복실산기의 아미드화에 의해 도데실-개질된 알기네이트를 생성하였다.
실시예 11: 알기네이트 전극의 제조
실시예 10에 기재된 소수성 암모늄 양이온으로 개질된 알기네이트 중합체의 3 중량％ 용액을 알코올에 현탁시키고, 효소 (예를 들면, 빌리루빈 옥시다제)의 용액을 첨가하였다. 이 용액을 전극 물질 상에 피펫으로 올렸다. 이 전극 물질은 통상적으로 탄소 직물 또는 다른 탄소 물질이다.
실시예 12: 알기네이트 바이오연료 전지
소수성 개질된 알기네이트에 고정화된 애노드 효소를 갖는 바이오연료 전지는 소수성 개질된 알기네이트를 효소 및 완충액의 용액과 혼합물-주조하고, 이 혼합물을 탄소 직물 상에 피펫으로 올려 상기 실시예 10에 기재된 것과 유사한 바이오애노드를 형성함으로써 제조하였다. 상기 및 미국 특허 출원 제10/931,147호 (미국 특허 출원 공개공보 제2005/0095466호로 공개됨)에 기재된 바와 같은 소수성 개질된 나피온(등록상표) 막을 포함하는 바이오캐소드는 바이오애노드 및 바이오캐소드를 갖는 바이오연료 전지의 형성에 사용될 수 있다. 별법으로, 소수성 개질된 알기네이트에 고정화된 캐소드 효소를 갖는 바이오연료 전지는 소수성 개질된 알기네이트를 효소 및 완충액의 용액과 혼합물-주조하고, 이 혼합물을 탄소 직물 상에 피펫으로 올려 바이오캐소드를 형성함으로써 제조하였다. 상기 및 미국 특허 출원 제10/617,452호 (미국 특허 출원 공개공보 제2004/0101741호로 공개됨)에 기재된 바와 같은 소수성 개질된 나피온(등록상표) 막을 포함하는 바이오애노드는 바이오애노드 및 바이오캐소드를 갖는 바이오연료 전지의 형성에 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이 제조된 소수성 개질된 알기네이트에 고정화된 캐소드 효소 및 상기 기재된 바와 같이 제조된 소수성 개질된 알기네이트에 고정화된 애노드 효소를 갖는 바이오애노드를 갖는 바이오연료 전지가 제조될 수 있다.
실시예 13: 바이오연료 전지
소수성 개질된 키토산을 효소 및 완충액의 용액과 혼합물-주조하고, 이 혼합물을 탄소 직물 상에 피펫으로 올려 바이오애노드를 형성시킴으로써 소수성 개질된 키토산에 고정화된 애노드 효소를 갖는 바이오연료 전지를 제조하였다. 미국 특허 출원 제10/931,147호 (미국 특허 출원 공개공보 제2005/0095466호로 공개됨)에 기재된 바와 같은 소수성 개질된 나피온(등록상표) 막을 포함하는 바이오캐소드를 사용하여 바이오애노드 및 바이오캐소드를 갖는 바이오연료 전지를 형성할 수 있었다. 다르게는, 소수성 개질된 키토산을 효소 및 완충액의 용액과 혼합물-주조하고, 이 혼합물을 탄소 직물 상에 피펫으로 올려 바이오캐소드를 형성시킴으로써 소수성 개질된 키토산에 고정화된 캐소드 효소를 갖는 바이오연료 전지를 제조하였다. 미국 특허 출원 제10/617,452호 (미국 특허 출원 공개공보 제2004/0101741호로 공개됨)에 기재된 바와 같은 소수성 개질된 나피온(등록상표) 막을 포함하는 바이오애노드를 사용하여 바이오애노드 및 바이오캐소드를 갖는 바이오연료 전지를 형성할 수 있었다. 소수성 개질된 키토산을 효소 및 완충액의 용액과 혼합물-주조하고, 이 혼합물을 탄소 직물 상에 피펫으로 올려 바이오연료 전지에 사용되는 바이오애노드를 형성함으로써 소수성 개질된 키토산에 고정화된 애노드 효소를 갖는 바이오애노드를 제조하였다.
실시예 14: 미세유체 바이오연료 전지
PDMS 미세성형 채널의 생성에 사용되는 마스터는 미세성형 채널에 대해 30 초 동안 1000 rpm의 회전 프로그램에서 작동하는 회전 코터 (브루어 사이언스(Brewer Science), 미국 미주리주 롤라 소재)를 이용하여 SU-8 10 네거티브형 포토레지스트로 4-인치 규소 웨이퍼를 코팅하여 제조하였다. 유동 채널의 경우, 30 초 동안 1750 rpm의 회전 프로그램이 SU-8 50 네거티브형 포토레지스트와 사용된다. 포토레지스트를 90 ℃에서 5 분 동안 미리 베이킹 후에, 미세성형 채널 또는 유동 채널 설계 구조 (조스텐스(Jostens), 미국 캔자스주 토페카 소재)를 함유하는 네거티브 필름을 통해 인접한-UV 투사 공급원 (오토플루드 1000(Autoflood 1000), 옵티컬 어소시에이츠(Optical Associates), 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)을 사용하여 4 분 동안 UV에 노출시켰다. 투명도는 손으로 그린 컴퓨터 디자인으로부터 만들었다 (PC 버젼 8.0, 매크로미디어 인크.(Macromedia Inc.), 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재). 도안은 인쇄 지원으로 2400 dpi의 해상도를 갖는 영상 세터 (조스텐스, 미국 캔자스주 토페카 소재)를 이용하여 투명도로 옮겼다. 이러한 노출에 이어, 웨이퍼를 90 ℃에서 5 분 동안 후속-베이킹하고, 나노(Nano) SU-8 현상기로 현상하였다. 규소 웨이퍼 상에 남아있을 수 있는 임의의 잉여량의 노출되지 않은 포토레지스트를 제거하기 위해, 설계 디자인을 함유하는 웨이퍼를 아세톤 및 이소프로판올로 세정하였다. 포토레지스트의 두께는 프로필로미터(profilometer) (알파 스텝-200(Alpha Step-200), 텐코 인스트루먼츠(Tencor Instruments), 미국 캘리포니아주 마우틴뷰 소재)로 측정하였으며, 이는 PDMS 구조의 채널 깊이에 상응한다.
이어서, 실가드(Sylgard) 184 엘라스토머 및 경화제의 탈기된 10:1 혼합물을 규소 웨이퍼에 붓고, 75 ℃에서 대략 2 시간 동안 경화시켰다. 모서리 주위를 잘라내고 PDMS를 다시 웨이퍼로부터 벗겨내어 PDMS를 마스터 웨이퍼로부터 분리하였다. 마스터는 PDMS 채널의 다수의 카피를 생성하기 위해 다시 사용될 수 있다. 생성된 PDMS 유동 채널은 200 mm 폭, 100 mm 깊이 및 3.0 cm 길이를 갖는다.
소다-라임(Soda-lime) 유리 플레이트를 지역 유리 상점에서 구입하였다. 플레이트는 7 cm 폭, 10 cm 길이 및 1.54 mm 두께를 갖는다. 유리 플레이트를 피라니아(piranha) 용액 (70％ 농축된 H2SO4/30％ H2O2)에 15 분 동안 침지시켜 세척함으로써 유기 불순물을 제거하였다. 이어서, 유리를 나노퓨어(Nanopure) (18 MΩ-cm) 물로 철저하게 세정하고, 질소로 건조시켰다. 전통적인 리소그래피 및 스퍼터링 절차를 이용하여, 팔라듐 전극을 유리 상에서 특정 패턴으로 제작하였다. 각각의 플레이트는 전극을 갖는 여러 유동 채널을 보유할 수 있었다. 이는 특히 한 층의 티탄 (흡착 특성을 위함) 및 한 층의 팔라듐의 아르곤 이온 스퍼터링에 의해 달성된다. 이를 달성하기 위해, 유리를 금속 침착에 이용되는 침착 시스템 (박막 침착 시스템(Thin Film Deposition System), 커트 제이. 레스커사(Kurt J. Lesker Co.))에 넣었다. 금속의 두께는 석영 결정 침착 모니터(인피콘 XTM/2(Inficon XTM/2), 레이볼드 인피콘(Leybold Inficon))를 이용하여 모니터링하였다. 티탄은 Ti-표적으로부터 약 2.3 Å/s의 속도에서 200 Å의 깊이로 침착시켰다. 팔라듐은 Pd-표적으로부터 약 1.9 Å/s의 속도에서 2000 Å의 깊이로 침착시켰다. AZ 1518 포지티브형 포토레지스트는 팔라듐 코팅된 유리 상에서 역학적으로 분산된다. 베이크를 95 ℃에서 1 분 동안 사전 노출시킨 후에 9 초 동안 포지티브 필름을 통해 자외선에 노출시켰다. 필름을 제거하고, 유리를 시판되는 현상기 (AZ 300 MIF 현상기)에 45 초 동안 넣었다. 물로 세정하고, 질소로 건조시킨 후에, 유리를 나중에 95 ℃에서 1 분 동안 베이킹하였다. 왕수(Aqua regia) (8:7:1 H2O:HCl:HNO3)를 사용하는 습윤 에칭을 이용하여 원치않는 팔라듐을 제거하고, 티탄 에칭제로 원치않는 티탄을 유리로부터 제거하였다. 일단 완료되면, 유리를 아세톤 및 이소프로판올로 세정하여 나머지 포토레지스트를 제거하고, 질소로 건조시켰다.
물 속에 잠긴 상태에서 1-mm 다이아몬드 드릴 비트 및 드레멜(Dremel) 회전 공구 (드레멜)로 각각의 유리 플레이트에 흐름 입구를 뚫었다. 이들의 어답터의 주사기 커넥터 부분을 드레멜 회전 공구로 제거하고, 원반형으로 절단하였다. 샌딩 디스크로 연마한 후에, 이들의 어답터를 J.B. 벨트(J.B. Weld)로 유리 플레이트에 부착시켰다. 에폭시를 사용 전에 오븐 (75 ℃)에서 2 시간 동안 경화시켰다. 구리 전선 및 콜로이드성 은에 의해 팔라듐 전극을 연결시켰다.
탄소 잉크 미세전극를 제작하기 위해, 우선 PDMS 미세성형 채널을 철저하게 세척된 팔라듐 도선과 (이들이 부착되어 피팅(fitting)된 상태로) 접촉하고 있는 유리 플레이트로 실링하였다. PDMS 채널은 우선 용매 희석제 (N-160)로 프라이밍하였다. 희석제는 어느 한 저장소에 진공을 적용하여 제거하였다. 희석제가 제거되자마자, 시판되는 탄소 잉크 및 용매 희석제의 혼합물을 채널에 첨가하고, (물 흡입기를 통해) 반대편 말단에 진공을 적용하여 채널을 통해 밀어내었다. 잉크/희석제 혼합물은 첨가된 희석제의 부피가 처음 잉크 중량의 0.2 부피/중량％가 되도록 만들었다. 채널을 탄소 잉크로 충전시킨 후에, 진공이 적용되는 저장소를 잉크/희석제 용액으로 충전시키고, 칩 전체를 75 ℃의 오븐에 1 시간 동안 넣어 두었다. 이 기간 후에, PDMS가 유리로부터 제거되어 유리 표면에 부착된 탄소 미세전극이 남게 할 수 있었다. 최종 경화/조건화 단계는 칩을 12 ℃의 별도의 오븐에 1 시간 동안 넣어 수행한다. 탄소 미세전극의 높이는 프로필로미터로 측정하고, 폭은 현미경을 통해 측정하였다.
탄소 잉크 전극을 더 특성화하기 위해, 순환 전압전류법을 이용하여 CH 인스트루먼츠 810 바이일정전위기 (미국 텍사스주 오스틴 소재)를 사용하는 3-전극 포맷으로 수행하였다. 탄소 미세전극은 은/염화은 기준 전극 및 보조 전극으로서의 백금 전선을 갖는 작용 전극이다. 순환 전압전류법 실험에 사용되는 정전기적 전지는 보다 큰 PDMS 조각 (2 cm×3 cm)을 작은 부분 (1 cm×2 cm)들로 절단하여 만든 PDMS 조각으로 제작하고; 이어서 상기 PDMS 조각을 탄소 전극 위에서 실링하여 전극의 전체 길이가 용액에 노출되도록 하였다. 유동 실험의 경우, PDMS 마이크로채널 (약 200 mm 폭, 100 mm 깊이 및 약 2 cm 길이)을 탄소 전극 위에서 실링하여 전체 전극이 마이크로채널 내부에 실링되도록 하였다. 보조 및 기준 전극은 전기화학 전지 홀더 (CH 인스트루먼츠)를 사용하여 저장소의 출구에 함유시켰다.
유리 플레이트에 뚫어 놓은 흐름 입구는 주사기 펌프 (펌프 11, 하바드 아파라터스(Harvard Apparatus), 미국 메사추세츠주 홀리스톤 소재)로부터의 흐름으로의 접근을 허용한다. 주사기를 선택된 용액으로 충전시키고, 주사기 펌프에 넣었다. 고압 피팅, 이들의 어답터 및 테플론(Teflon) PEEK 배관을 사용하여, 주사기를 유리 마이크로칩에 연결시켰다. 흐름 입구의 한쪽 말단에 정렬된 200 ㎛-폭 PDMS 유동 채널을 통과하는 유속은 0 ㎕/분 내지 15 ㎕/분 범위로 달라진다. 채널을 전극 위에서 직접 실링하였다. 채널의 다른 말단에서, 저장소를 홀 펀치(hole punch)로 형성하고, 여기에 캐소드 또는 기준 및 반대 전극을 넣었다.
탄소 잉크 전극은 일반적으로 전극 길이가 2.5 cm이고, 폭은 55 ㎛이고, 높이는 87 ㎛이다. 1 mM 트리스(2,2'-바이피리딜)디클로로루테늄(II) 6수화물 및 0.1 M 황산나트륨의 용액을 전해질로 사용하여 순환 전압전류법에 의해 전극에 대한 반응을 특성화하였다. 유속이 증가할수록 전류 밀도가 증가하였으며, 이는 유속이 증가함에 따라 분석 물질이 전극 표면에 보다 빠르게 도달하기 때문인 것으로 예상된다. 처음에, 0.05 M 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 중에서 3 분 동안 1.5 V를 적용하는 전기화학적 예비처리를 이용하여 전극을 세척하였다.
전자 도체 및 효소 고정화 물질을 포함하는 전극 형성 과정을 간단하게 하기 위해 상기 절차를 약간 변형시켰다. 이와 같이 하여, 전자 도체 용액은 효소 고정화 물질을 포함하도록 개질되었다. 에르콘 N160 용매 희석제에서 현탁시키고 철저하게 볼텍스로 교반한 t-아밀 알코올 중 소수성 개질된 키토산의 2 중량％ 용액 또는 알코올 용액 중 소수성 개질된 알기네이트의 3 중량％ 용액을 첨가하여 추가의 물질을 제조하였다. 마지막으로, 상기 개질된 희석제 1 mL를 에르콘 E-978(I) 탄소-기재 잉크 0.5 g에 첨가하였다. 이어서, 상기 개질된 전자 도체 용액을 주조용 금형 및 기판에 의해 형성된 금형 공동을 통해 유동시키고, 본 실시예에서 상기 기재한 방법에 따라 경화시켰다.
본 발명에 따른 바이오애노드를 형성하기 위해, 경화 및 활성화 단계 후에 전자 도체 위에 추가의 물질을 유동시켜 완성되는 애노드를, 상기 본 실시예에 기재된 일반적 단계에 이용하였다. t-아밀 알코올 중 소수성 개질된 키토산의 2 중량％ 용액 또는 알코올 중 소수성 개질된 알기네이트의 3 중량％ 용액, 저급 지방족 알코올 중 효소 용액을 합하여 나머지 애노드 요소의 주조 용액을 제조하였다. 이어서, 상기 용액을 함께 철저하게 볼텍스로 교반하고, 대략 100 mm 마이크로채널을 통해 약 1 mL/분의 유속으로 방출하였다. 이어서, 전자 도체 및 주조 용액을 밤새 건조시켰다.
바이오캐소드의 경우, 마이크로칩 및 채널 마스터는 포토리소그래피를 이용하여 상기 본 실시예에서 기재된 바와 같이 제작하였다. 미세성형 절차로부터 제조된 탄소 잉크 미세전극은 상기 기재된 소수성 개질된 키토산 또는 소수성 개질된 알기네이트 막 혼합물로 추가로 개질될 수 있다.
탄소 미세전극을 개질시켜 바이오애노드로 사용하였다. PDMS에 구멍을 뚫어, 미세전극 주위에 위치하고 Ag/AgCl 기준 전극 및 보조 전극으로서의 백금 전선을 포함하는 거대한 저장소를 형성하였다. 특히, 이는 정전기적 전지이다.
효소/소수성 개질된 키토산 혼합물 또는 효소/소수성 개질된 알기네이트 혼합물을 미세전극 위에서 가역적으로 실링된 마이크로채널 및 유체역학 유동을 이용하여 탄소 미세전극 상에 고정화시켰다. 이러한 유동 채널의 크기는 미세전극 위에서의 정렬이 가능한 크기이지만 전극보다 훨씬 넓지는 않다. 이를 달성하기 위해, PDMS 마이크로채널 (130 mm 폭, 100 mm 깊이 및 약 2 cm 길이)을 탄소 전극 (약 40 mm 폭, 약 2 cm 길이 및 약 100 mm 높이) 위에서 실링하여 전극 전체가 마이크로채널 내부에 실링되도록 하였다. 효소 및 소수성 개질된 키토산의 2:1 혼합물 또는 효소 및 소수성 개질된 알기네이트의 2:1 혼합물을 제조하고, 충분히 혼합될 때까지 볼텍스로 교반하였다. 혼합물을 주사기 펌프 (하바드 아파라터스, 미국 오하이오주 브룩필드 소재)를 사용하여 주사기를 통해 1.0 mL/분으로 체널에 도입시켰다. 혼합물이 채널의 전구간을 통과하면 (육안으로 모니터링함), 용매를 실온에서 증발시켰다. 이는 PDMS가 기체에 투과성이기 때문에 가능하였다. 증발이 완료된 후에, PDMS를 제거하자 코팅된 바이오애노드가 남았다.
본 발명에 따른 바이오캐소드를 형성하기 위해, 경화 및 활성화 단계 후에 전자 도체 위에 추가의 물질을 유동시켜 완성된 바이오캐소드를, 본 실시예에 기재된 일반적 단계에 사용하였다.
전자 도체를 개질시키기 위해, 빌리루빈, 빌리루빈 옥시다제 및 소수성 개질된 키토산 또는 소수성 개질된 알기네이트의 주조 용액을 함께 약 20 분 동안 볼텍스로 교반하였다. 이어서, 용액을 약 1 mL/분의 유속으로 대략 100 mm 마이크로채널을 통해 방출하였다. 이어서, 전자 도체 및 주조 용액을 밤새 건조시켰다.
상기 기재된 바이오애노드와 유사한 방식으로 바이오캐소드를 제조하였다. PDMS 마이크로채널은 탄소 잉크 미세전극 위에서 실링하였다. 소수성 개질된 키토산을 캐소드 효소와 혼합하였다. 이어서, 용매를 증발시킨 후에 혼합물이 채널의 말단에 도달할 때까지 혼합물을 채널을 통해 1.0 mL/분으로 방출하였다. PDMS 유동 채널을 제거하자 코팅된 전극이 남았으며, 이를 바이오캐소드로 사용하였다.
상기 관점에서, 본 발명의 여러 목적이 달성되고, 다른 유리한 결과를 얻게되는 것이 관찰될 것이다.
본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 상기 방법에 다양한 변화가 있을 수 있으므로, 상기 상세한 설명에 함유되어 있거나 첨부된 도면에서 보여주는 모든 내용은 단지 설명을 하기 위한 것으로, 제한적 의미로 사용되지는 않는 것으로 해석되어야 한다.
본원의 특허청구범위 내에 포함되는 다른 실시양태는 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 명세서 또는 실시를 고려하여 당업자에게 명백해질 것이다. 본 명세서는 실시예와 함께 단지 예를 들어 설명한 것으로, 본 발명의 범위 및 취지는 실시예 뒤에 첨부하는 특허청구범위에 의해 지시되는 것으로 여겨져야 한다.

Claims (38)

  1. (a) 전자 도체;
    (b) 연료 유체와 반응하여 산화된 형태의 연료 유체를 생성할 수 있으며, 전자 도체로 전자를 방출할 수 있는 하나 이상의 애노드 효소; 및
    (c) 효소를 고정화 및 안정화시킬 수 있으며, 연료 유체에 투과성인 효소 고정화 물질
    을 포함하는 바이오애노드.
  2. (a) 전자 도체;
    (b) 산화제와 반응하여 물을 생성할 수 있으며, 전자 도체로부터 전자를 수득할 수 있는 하나 이상의 캐소드 효소; 및
    (c) 효소를 고정화 및 안정화시킬 수 있으며, 산화제에 투과성인 효소 고정화 물질
    을 포함하는 바이오캐소드.
  3. 연료 유체; 제1항의 바이오애노드; 및 제2항의 바이오캐소드를 포함하는 전기 발생용 바이오연료 전지.
  4. 연료 유체; 제1항의 바이오애노드; 및 캐소드를 포함하는 전기 발생용 바이 오연료 전지.
  5. 연료 유체; 애노드; 및 제2항의 바이오캐소드를 포함하는 전기 발생용 바이오연료 전지.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 고정화 물질이 미셀 또는 역 미셀 구조를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 고정화 물질이 개질된 퍼플루오로 술폰산-PTFE 공중합체를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 고정화 물질이 소수성 개질된 알기네이트를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 효소 고정화 물질이 NH4 + 보다 큰 소수성 양이온으로 개질된 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  10. 제9항에 있어서, 소수성 양이온이 암모늄-기재 양이온, 4급 암모늄 양이온, 알킬트리메틸암모늄 양이온, 유기 양이온, 포스포늄 양이온, 트리페닐포스포늄, 피리디늄 양이온, 이미다졸륨 양이온, 헥스데실피리디늄, 에티듐, 비올로겐, 메틸 비올로겐, 벤질 비올로겐, 비스(트리페닐포스핀)이미늄, 금속 착체, 바이피리딜 금속 착체, 페난트롤린-기재 금속 착체, [Ru(바이피리딘)3]2+ 또는 [Fe(페난트롤린)3]3+를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  11. 제9항에 있어서, 소수성 양이온이 하기 화학식 4로 나타낸 4급 암모늄 이온을 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
    <화학식 4>
    Figure 112008039047689-PCT00018
    상기 식에서, R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, 히드로카르빌, 치환된 히드로카르빌 또는 헤테로시클로이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 수소가 아니다.
  12. 제11항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4가 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 또는 데실이고, 여기서 R1, R2, R3 및 R4 중 하 나 이상은 수소가 아닌 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  13. 제11항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4가 동일하며, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  14. 제11항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4가 부틸인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  15. 제11항에 있어서, R1, R2, R3 및 R4 중 하나가 헥실, 옥틸, 데실, 도데실 또는 테트라데실이고, 나머지는 독립적으로 메틸, 에틸 또는 프로필인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 고정화 물질이 소수성 개질된 다당류인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  17. 제16항에 있어서, 다당류가 키토산, 셀룰로스, 키틴, 전분, 아밀로스, 알기네이트 및 이들의 조합을 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  18. 제17항에 있어서, 상기 소수성 개질된 미셀 다당류가 하기 화학식 1에 상응하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
    <화학식 1>
    Figure 112008039047689-PCT00019
    상기 식에서,
    n은 정수이고;
    R10은 독립적으로 수소, 히드로카르빌 또는 치환된 히드로카르빌이고;
    R11은 독립적으로 수소, 히드로카르빌 또는 치환된 히드로카르빌이다.
  19. 제18항에 있어서, 소수성 개질된 다당류의 분자량이 약 90,000 내지 약 500,000인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  20. 제18항에 있어서, 소수성 개질된 다당류의 분자량이 약 225,000 내지 약 275,000인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  21. 제18항에 있어서, R10이 독립적으로 수소 또는 알킬이고, R11이 독립적으로 수소 또는 알킬인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  22. 제18항에 있어서, R10이 독립적으로 수소 또는 헥실이고, R11이 독립적으로 수소 또는 헥실인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  23. 제18항에 있어서, R10이 독립적으로 수소 또는 옥틸이고, R11이 독립적으로 수소 또는 옥틸인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 전자 도체가 탄소-기재 물질, 금속성 도체, 반도체, 금속 산화물 또는 개질된 도체를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 전자 도체가 탄소-기재 물질을 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  26. 제25항에 있어서, 전자 도체가 탄소 직물, 카본지, 탄소 스크린 인쇄 전극, 카본 블랙, 탄소 분말, 탄소 섬유, 단일벽 탄소 나노튜브, 이중벽 탄소 나노튜브, 다중벽 탄소 나노튜브, 탄소 나노튜브 배열, 다이아몬드-코팅된 도체, 유리 탄소, 중간 다공성 탄소, 그래파이트, 압착되지 않은 그래파이트 웜(worm), 박리 정제된 플레이크 그래파이트, 고성능 그래파이트, 고정렬된 열분해 그래파이트, 열분해 그래파이트 또는 다결정질 그래파이트를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  27. 제25항에 있어서, 전자 도체가 탄소 나노튜브를 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 캐소드 효소 또는 애노드 효소가 하나 초과의 산화환원 반응 중심을 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  29. 제28항에 있어서, 캐소드 효소 또는 애노드 효소가 빌리루빈 옥시다제, 라카아제, PQQ-의존성 히드로게나제, 리폭시게나제, 수퍼록시드 디스뮤타제, 퍼록시다제 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 바이오애노드, 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  30. 제2항, 제3항 및 제5항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 캐소드 효소가 빌리루빈 옥시다제 또는 수퍼록시드 디스뮤타제를 포함하는 것인 바이오캐소드 또는 바이오연료 전지.
  31. 제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 애노드 효소가 PQQ-의존성 데히드로게나제 또는 리폭시게나제를 포함하는 것인 바이오애노드 또는 바이오연료 전지.
  32. 제3항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 산화제가 산소 또는 과산화물을 포함하는 것인 바이오연료 전지.
  33. 제32항에 있어서, 산화제가 산소를 포함하는 것인 바이오연료 전지.
  34. 제3항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 연료 유체가 암모니아, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소부탄올, 부탄올, 이소프로판올, 알릴 알코올, 아릴 알코올, 글리세롤, 프로판디올, 만니톨, 글루쿠로네이트, 알데히드, 탄수화물, 글루코스, 글루코스-1, D-글루코스, L-글루코스, 글루코스-6-포스페이트, 락테이트, 락테이트-6-포스페이트, D-락테이트, L-락테이트, 프룩토스, 갈락토스-1, 갈락토스, 알도스, 소르보스, 만노스, 글리세레이트, 조효소 A, 아세틸 Co-A, 말레이트, 이소시트레이트, 포름알데히드, 아세트알데히드, 아세테이트, 시트레이트, L-글루코네이트, β-히드록시스테로이드, α-히드록시스테로이드, 락트알데히드, 테스토스테론, 글루코네이트, 지방산, 지질, 포스포글리세레이트, 레티날, 에스트라디올, 시클로펜탄올, 헥사데칸올, 장쇄 알코올, 코니페릴-알코올, 신나밀-알코올, 포르메이트, 장쇄 알데히드, 피루베이트, 부타날, 아실-CoA, 스테로이드, 아미노산, 플라빈, NADH, NADH2, NADPH, NADPH2 또는 수소를 포함하는 것인 바이오연료 전지.
  35. 제34항에 있어서, 연료 유체가 메탄올, 에탄올 또는 프로판올을 포함하는 것인 바이오연료 전지.
  36. 제34항에 있어서, 연료 유체가 에탄올을 포함하는 것인 바이오연료 전지.
  37. 제3항 및 제6항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오애노드 및 바이오캐소드가 염 브릿지 또는 중합체 전해질 막에 의해 분리되지 않은 것인 바이오연료 전지.
  38. 애노드 또는 바이오애노드에서 연료 유체를 산화시키고, 캐소드 또는 바이오캐소드에서 산화제를 환원시키는 단계를 포함하는, 제3항 내지 제37항 중 어느 한 항의 바이오연료 전지를 사용하는 전기 발생 방법.
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WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid