[go: up one dir, main page]

KR20080080081A - 글리코페닐화 인자 ⅶ 및 인자 ⅶ에이 - Google Patents

글리코페닐화 인자 ⅶ 및 인자 ⅶ에이 Download PDF

Info

Publication number
KR20080080081A
KR20080080081A KR1020087006691A KR20087006691A KR20080080081A KR 20080080081 A KR20080080081 A KR 20080080081A KR 1020087006691 A KR1020087006691 A KR 1020087006691A KR 20087006691 A KR20087006691 A KR 20087006691A KR 20080080081 A KR20080080081 A KR 20080080081A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
glycosyl
factor
structural formula
factor viia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
KR1020087006691A
Other languages
English (en)
Inventor
숀 디프리스
대비드 에이. 조프
수산 타우드테
더블유. 스코트 윌레트
로버트 제이. 베이어
마튜 칼로
Original Assignee
네오스 테크놀로지스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 네오스 테크놀로지스, 인크. filed Critical 네오스 테크놀로지스, 인크.
Publication of KR20080080081A publication Critical patent/KR20080080081A/ko
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa 펩티드와 PEG 성분 사이에서 콘주게이트(conjugates)를 제공한다.
그 콘주게이트는 그 펩티드와 그 변형기 사이에 삽입되어 공유 결합하는 하나의 무손상(intact) 글리코실 결합기에 의해 결합되어 있다.
그 콘주게이트는 하나의 글리코실 전이효소의 작용에 의해 글리코실화 및 비글리코실화(unglycosylated) 펩티드로부터 형성된다.
그 글리코실 전이효소는 그 펩티드 상에서의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 하나의 변형당 성분을 결합(ligation) 한다.
또, 상기 콘주게이트를 함유한 의약제제를 제공한다.
상기 콘주게이트의 제조방법은 또 본 발명의 범위 내에 존재한다.
Figure P1020087006691
글리코실 링커, 펩티드, 아미노산, 전이효소, 글리코실잔기, 글리코실화.

Description

글리코페닐화 인자 Ⅶ 및 인자 Ⅶ에이{GLYCOPEGYLATED FACTOR Ⅶ AND FACTOR ⅦA}
관련 특허출원
본 특허출원은 미국 가특허출원 60/746,868(2006.05.09출원), 미국 가특허출원 60/756,443(2006.01.05출원), 미국 가특허출원 60/733,646(2005.11.04출원), 미국 가특허출원 60/730,607(2005.10.26출원), 미국 가특허출원 60/725,894 (2005.10.11출원), 미국 가특허출원 60/709,983(2005.08.19출원)에 관한 것으로, 모두 참고로 편집한 것이다.
(발명의 요지)
하나 이상의 폴리(에틸렌글리콜) 성분을 가진 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa의 제어변경(controlled modification)은 그 대응하는 원(미페질화:un-pegylated)인자 Ⅶ 또는 Ⅶa에 대하여 강화 향상시킨 약물 동태성을 가진 하나의 새로운 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트(peptide conjugate)를 제공한다는 것을 발견하였다.
본 발명의 예에서, 본 발명의 "글리코페질화"(glycopeglated)" 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa는 글리코실화 또는 미글리코실화 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa 펩티드와, 폴리머 변형기(폴리(에틸렌글리콜)등) 등 하나의 변형기를 포함하는 효소에 의해 전이할 수 있는 사카릴 성분 사이에서 하나의 콘주게이트(conjugate)의 효소 중개 형(enzymae mediated formation)에 의해 그 구조체 내에서 제조한다.
그 PEG 성분은 사카릴 성분에 직접 결합하거나(즉, 2개의 반응성기의 반응에 의해 형성된 하나의 단일기를 통해) 또는 하나의 링커 성분(inker moiety), 즉 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 등에 의해 결합된다.
이와 같이, 본 발명의 하나의 국면(aspect)에서, 본 발명은 하나의 PEG 성분, 즉 PEG와 유사한 생체내 활성을 갖거나, 또는 종래에 공지된 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa와 유사한 하나의 펩티드 사이에 하나의 콘주게이트(conjugate)를 제공한다.
본 발명의 콘주게이트에서, 그 PEG 성분은 무손상(intact)의 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
본 발명의 예에서 무손상의 글리코실 결합기에는 PEG로 유도화시킨 시알산 성분을 포함한다.
그 폴리머 변형기는 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa의 글리코실 성분의 어느 위치에 결합시킬 수 있다.
또, 그 폴리머 변형기는 야생타입의 아미노산 서열 또는 변이(mutant) 인자 Ⅶ 또는 Ⅶa 펩티드에서의 어느 위치에서 글리코실잔기에 결합시킬 수 있다.
본 발명의 예에서, 본 발명은 글리코실 결합기를 통해 폴리머 변형기에 콘주게이팅(conjugating)시킨 하나의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa를 제공한다.
본 발명의 예에서의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트에는 다음 구조식Ⅰ과 Ⅱ에서 선택한 하나의 구조식을 가진 하나의 글리코실 결합기를 포함한다.
Figure 112008019904915-PCT00001
구조식Ⅰ및 Ⅱ에서,
R2는 H, CH2OR7, COOR7, COO- 또는 OR7이다(여기서, R7은 H, 치환 또는 비치환 알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬이다.
부호 R3, R4, R5, R6 및 ,R6'는 각각 H, 치환 또는 비치환 알킬, OR8, NHC(O)R9이다.
지수 d는 0 또는 1이다.
R8 및 R9는 각각 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 또는 시알산이다.
R3, R4, R5, R6 및 ,R6' 중 최소 하나에는 폴리머 변경기, 즉 PEG를 포함한다.
본 발명의 예에서, 결합되어 있는 탄소를 함께 가진 R6 및 R6'는 시알릴 성분의 측쇄 성분이다.
본 발명의 예에서, 그 폴리머 변형기는 일반적으로 글리코실 코어(core) 상의 헤테로 원자(즉, N,O)를 통해 아래에서 나타낸 바와 같이 하나의 링커 L를 통해 글리코실 결합기에 결합되어 있다.
Figure 112008019904915-PCT00002
상기 링커에서,
R1은 폴리머 변형기이고, L은 하나의 결합(bond)과 하나의 결합기에서 선택한다.
지수 w는 1~6, 바람직하게는 1~3, 더 바람직하게는 1~2에서 선택한 지수를 나타낸다.
본 발명의 예에서의 결합기에는 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 성분 및 시알산을 포함한다.
그 링커의 하나의 예로서의 성분은 아실 성분이다.
또 다른 예로서의 결합기는 아미노산잔기(즉, 시스테인, 세린, 라이신 및 길이가 짧은 올리고 펩티드, 즉 Lys-Lys, Lys-Lys-Lys, Cys-Lys, Ser-Lys 등)이다.
L이 하나의 결합(bond)일 경우 이것은 R1의 전구물질 상에서의 반응성 작용기와 그 글리코실 결합기의 전구물질 상에서의 반응성이 상보적인 반응성 작용기의 반응에 의해 형성된다.
L이 비영 오더(non-zero order) 결합기인 경우, L은 R1 전구물질과의 반응 전에 글리코 성분 상에서 위치할 수 있다.
또, R1과 L의 전구물질은 그 글리코실 성분에 후 결합시키는 하나의 사전에 형성된 카세트(cassette) 내에 결합시킬 수 있다.
여기서 설명한 바와 같이, 적합한 반응성 작용기와 전구물질의 제조 및 선택은 이 분야의 기술자의 능력 범위 내에서 할 수 있다.
또, 그 전구물질의 커플링(coupling)은 이 분야에서 충분히 이해할 수 있는 화학적 특성에 의해 처리할 수 있다.
본 발명의 예에서, L은 하나의 치환 알킬 링커를 통해 폴리머 변형 성분이 결합되어 있는 하나의 변형당을 제공하는 아미노산 또는 소형 펩티드(small peptide)(즉, 1~4 아미노산잔기)에서 형성된다.
본 발명의 예에서서의 링커에는 글리신, 라이신, 세린 및 시스테인을 포함한다.
아미노산 아날로그(analogs)는 여기서 정의한 바와 같이, 링커 성분으로 유용하다.
그 아미노산은 아미노산잔기의 아민 성분을 통해 형성된 아실결합, 예로서 아미드 또는 우레탄에 의해 공유 결합되어 있는 하나의 링커, 즉 알킬, 헤테로알킬의 추가성분으로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 예에서, 글리코실 결합기를 상기 구조식Ⅰ에 의해 하나의 구조체를 가지며, R5에는 폴리머 변형기를 포함한다.
또 다른 예에서, R5에는 폴리머 변형기와 링커 L을 모두 포함하여, 글리코실 코어에 폴리머 변형기를 결합한다.
L은 하나의 선상 또는 분기상 구조체로 할 수 있다.
동일하게, 그 폴리머 변형기는 분기상 또는 선상으로 할 수 있다.
폴리머 변형기는 수용성이거나 또는 수중에서 불용성으로 할 수 있는 2이상의 반복 단위로 이루어진다.
본 발명의 화합물에서 유용한 수용성 폴리머의 예에는 PEG, 즉 m-PEG, PEG, 즉 m-PPG, 폴리시알산, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르페이트, 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 생분해성 고분자(즉, 폴리락티드, 폴리글리세리드) 및 기능성화 PEG, 즉 말단 기능성화 PEG를 포함한다.
상기 인자 Ⅶ 또는 Ⅶa 펩티드 콘주게이트에서 유용한 글리코실 결합기의 글리코실 코어는 천연(natural) 및 비천연 푸라노오스 및 피라노오스 양자로부터 선택한다.
상기 비천연 사카리드에는 알킬화 또는 아실화히드록실 및/또는 아민성분, 즉 그 링(ring) 상에서 에테르, 에스테르 및 아미드 치환체를 선택적으로 포함한다.
다른 비천연(unnatural) 사카리드에는 H, 히드록실, 에테르, 에스테르 또는 아미드 치환체를 이들 치환체 중 하나가 상기 천연 사카리드에 존재하지 않은 링(ring) 상의 하나의 위치에 포함한다.
또, 그 카르보히드레이트는 유도되는 카르보히드레이트, 즉 데옥시당에서 확인되는 하나의 치환기를 상실한다.
발명의 또 다른 예에서 비천연 당에는 산화(즉, -온산 및 -우론산) 및 환원(당 알코올) 카르보히드레이트를 모두 포함한다.
그 당 성분은 모노-, 올리고- 또는 폴리-사카리드로 할 수 있다.
본 발명에서 글리코실 결합기의 성분으로서 유용한 천연당에는 글루코오스, 글루코사민, 갈락토오스, 갈락토사민, 푸코오스, 만노오스, 만노사민, 키실로오스, 리보오스, N-아세틸 글루코오스, N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토오스, N-아세틸 갈락토사민 및 시알산을 포함한다.
본 발명의 하나의 예에서, 본 발명은 다음 구조식 성분으로 이루어진 인자(factor) Ⅶ 또는 인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 제공한다.
Figure 112008019904915-PCT00003
위 구조식에서, D는 -OH와 R1-L-HN-에서 선택한 하나의 멤버이고;
G는 H 및 R1-L- 및 -C(O)(C1~C6) 알킬에서 선택한 하나의 멤버이며,
R1은 하나의 직쇄 또는 분기 폴리(에틸렌글리콜)잔기로 이루어진 하나의 성분(moiety)이고;
L은 하나의 링커(link), 즉 하나의 결합("영 오더":"zero order"), 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬이다.
본 발명의 예에서, D가 OH인 경우 G는 R1-L이고, G가 -C(O)(C1~C6) 알킬인 경 우 D는 R1-L-NH-이다.
본 발명의 또 다른 국면에서, 본 발명은 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa로 할 수 있는 하나의 펩티드로 이루어진 하나의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 제공한다.
또, 그 콘주게이트는 상기 펩티드의 하나의 아미노산 잔기에 결합되고, 아래에서 나타낸 2개의 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조식을 가진 하나의 시알릴 결합기로 이루어진 하나의 글리코실 결합기를 구성한다.
Figure 112008019904915-PCT00004
Figure 112008019904915-PCT00005
R2는 H, CH2OR7, COOR7, COO- 및 OR7에서 선택한 하나의 멤버이다.
R7는 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하나의 멤버이다.
R3 및 R4는 H, 치환 또는 비치환 알킬, OR8 및 NHC(O)R9에서 독립하여 선택한 멤버이다.
R8 및 R9는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 시알릴에서 독립하여 선택한다.
La는 하나의 결합(bond), 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하나의 링커이다.
X5, R16 및 R17은 미반응성기 및 폴리머암(arms)(즉, PEG)에서 독립하여 선택한다.
X2 및 X4는 폴리머 성분 R16 및 R17을 C에 결합하는 결합 프라그멘트(linkge fragments)을 독립하여 선택한다.
지수 j는 1~15에서 선택한 정수이다.
또 다른 예에서, 그 폴리머 변형기는 다음에 나타낸 구조식 Ⅲa에 의한 하나의 구조체를 가진다.
Figure 112008019904915-PCT00006
위 구조식에서,
지수 m 및 n은 0~5000에서 독립하여 선택한 정수이다.
A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 및 A11은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴에서 독립적으로 선택한 멤버들이다.
본 발명의 하나의 예에서, 그 폴리머 변형기는 다음에 나타낸 2개의 구조식에 의한 하나의 구조체를 가진다.
Figure 112008019904915-PCT00007
위 구조식에 의한 또 다른 예에서, 그 폴리머 변형기는 아래에 나타낸 하나의 구조식에 의한 하나의 구조체를 가진다.
Figure 112008019904915-PCT00008
위 구조식에서,
A1 및 A2는 -OH 및 -OCH3에서 선택한 각각의 멤버이다.
이 예에 의한 폴리머 변형기들은 아래에 나타낸 2개의 구조식을 포함한다.
Figure 112008019904915-PCT00009
본 발명은 인자 Ⅶ와 인자 Ⅶa에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 펩티드로 이루어진 하나의 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 제공한다.
또, 그 콘주게이트는 그 펩티드의 하나의 아미노산잔기에 결합되고, 다음에 나타낸 구조식을 가진 하나의 시알릴 결합기로 이루어진 하나의 글리코실 결합기로 이루어진다.
Figure 112008019904915-PCT00010
Figure 112008019904915-PCT00011
지수 s는 1~20에서 선택한 정수이다.
지수 f는 1~2500에서 선택한 정수이다.
Q는 H 및 치환 또는 비치환 C1~C6 알킬에서 선택한 하나의 멤버이다.
본 발명의 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 구조식을 가진 하나의 변형당(modified sugar)을 제공한다.
Figure 112008019904915-PCT00012
본 발명은 인자 Ⅶ 펩티드, 즉 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa의 콘주게이트를 형성하는 방법을 제공한다.
이들의 방법에는 하나의 당(sugar)에 공유 결합한 하나의 변형기를 가진 하나의 변형당 도너(donor)에 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 접촉하는 것을 포함한다.
그 변형당 성분은 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 아미노산 또는 글리코실잔기 상의 상기 도너에서 효소의 작용에 의해 전이시킨다.
대표적인 효소에는 글리코실 전이효소, 즉 시알릴 전이효소를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.
그 방법에는 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를
a) 하나의 변형당 도너에, 그리고
b) 그 펩티드의 아미노산 또는 글리코실잔기 상의 상기 변형당 도너에서 변형당 성분을 전이할 수 있는 효소에,
그 도너에서의 하나의 변형당 성분을 그 펩티드의 아미노산 또는 글리코실잔 기로 전이하는데 적합한 조건하에서 접촉함으로써 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 합성하는 것을 포함한다.
하나의 바람직한 예에서, 상기 공정(a) 처리 전에,
그 펩티드는 시알리다아제(sialidase)로 접촉함으로써 그 펩티드 상에서 시알산의 최소 일부분을 제거한다.
또 다른 바람직한 예에서, 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 시알리다아제, 글리코실 전이효소 및 변형단 도너로 접촉한다.
이 예에서, 그 펩티드는 여러 가지의 성분의 첨가순서와 관계 없이 시알리다아제, 글리코실 전이효소 및 변형당 도너와 동시에 접촉한다.
그 반응은 시알리다아제에 적합한 조건하에서 실시하여 그 펩티드에서 시알산잔기를 제거하며; 글리코실 전이효소에 의해 그 변형당 도너에서의 변형당 성분을 그 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기로 전이한다.
또 다른 바람직한 예에서, 탈 시알릴화(desialylation) 및 콘주게이션(conjugation)은 동일한 레벨에서 실시하며, 그 탈 시알릴화 펩티드는 그 콘주게이팅 처리공전 전에 정제하지 않는 것이 바람직하다.
또 다른 예에서, 그 방법은 그 펩티드 콘주게이트의 시알릴화를 포함하는 "캐핑공정"(capping step)으로 이루어진다.
이 공정은 사전정제 없이 시알릴다아제, 시알릴 전이효소 및 변형단 도너를 함유하는 동일한 반응 용기 내에서 실시한다.
또 다른 바람직한 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 탈 시알릴화를 실 시하여, 아시알로(asialo) 펩티드를 정제한다.
그 다음, 정제된 아시알로 펩티드는 콘주게이션 반응조건에 따라 처리한다.
또 다른 예에서, 그 방법은 펩티드 콘주게이트의 시알릴화를 포함하는 "캐핑"(capping)공정을 더 구성한다.
이 공정은 사전(prior) 정제 없이, 시알리다아제, 시알리전이효소 및 변형당 도너를 포함하는 동일한 반응용기 내에서 실시한다.
그 캐핑공정의 또 다른 예에서, 그 펩티드 콘주게이트의 시알릴화는 시알리다아제, 시알릴전이효소 및 변형당 도너를 사전 정제 없이 함유하는 동일한 반응용기 내에서 실시한다.
하나의 예에서, 그 접촉처리(contacting)는 20시간 이하의 시간, 바람직하게는 16시간 이하의 시간, 더 바람직하게는 12시간 이하의 시간, 더욱더 바람직하게는 8시간 이하의 시간, 가장 바람직하게는 4시간 이하의 시간이다.
본 발명의 또 하나의 국면에서, 본 발명은 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트 반응 혼합물을 제공한다.
그 반응 혼합물은 a) 하나의 시알리다아제; b) 글리코실전이효소, 엑소(exo) 글리코시다아제 및 엔도(endo) 글리코시다아제에서 선택한 하나의 멤버인 효소; c) 하나의 변형당; 및 d) 하나의 인자 Ⅶ/ 인자 Ⅶa 펩티드로 이루어진다.
또 다른 예에서, 시알리다아제와 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 비는 0.1U/L:2㎎/mL~10U/L:1㎎/mL, 바람직하게는 0.5U/L:2㎎/mL, 더 바람직하게는 1.0U/L:2㎎/mL, 더욱더 바람직하게는 10U/L:2㎎/mL, 또 바람직하게는 0.1U/L:1㎎/mL, 더 바람 직하게는 0.5U/L:1㎎/mL, 더욱더 바람직하게는 1.0U/L:1㎎/mL 및 가장 바람직하게는 10U/L:1㎎/mL에서 선택한다.
본 발명의 예에서, 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%에는 대부분 2개의 PEG 성분을 포함한다.
그 PEG 성분은 1-폿(pot) 프로세스에서 첨가할 수 있거나, 또는 이들은 아시알로 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa를 정제한 후에 첨가할 수 있다.
또 다른 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%는 대부분 하나의 PEG 성분을 포함한다.
그 PEG 성분은 하나의 1-폿 프로세스에서 첨가할 수 있거나, 또는 그 아시알로 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa를 정제시킨 후 첨가할 수 있다.
또 다른 예에서, 그 방법은 그 펩티드 콘주게이트에 시알산을 "캐핑"(capping) 또는 첨가하는 것을 더 포함한다.
또 다른 예에서, 시알리다아제를 첨가한 다음에, 이어서 30분, 1시간, 1.5시간 또는 2시간 동안 지연(delay)시킨 후 이어서 글리코실전이효소, 엑소글리코시라아제 또는 엔도글리코시다아제를 첨가한다.
또 다른 예에서, 시알리다아제를 첨가하고, 이어서 30분간, 1시간, 1.5시간 또는 2시간 지연시킨 후, 글리코실전이효소, 엑소글리코시다아제 또는 엔도글리코시다아제를 첨가한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 다음의 구체적 설명에서 당업자에 의해 이해할 수 있다.
또 다른 예에서, 그 방법에는 (a) 다음에 나타낸 기
Figure 112008019904915-PCT00013
에서 선택한 하나의 글리코실기로 이루어진 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 다음에 나타낸 구조식을
Figure 112008019904915-PCT00014
가진 하나의 변형당과, 상기 글리코실기의 GalNAc, Gal 및 Sia에서 선택한 하나의 멤버상에서 글리코실 결합기를 전이하는 하나의 적합한 전이효소와 함께 전이에 적합한 조건하에서, 접촉하는 것을 포함한다.
하나의 예의 변형당은 하나의 링커 성분을 통해 하나의 폴리머, 즉 하나의 직쇄 또는 분기 폴리머(에틸렌글리콜) 성분으로 변형시킨 CMP-시알산이다.
그 펩티드는 위에서 설명한 바와 같이 변형하기 전에 하나의 예에서 어느 소오스(source)에서 얻어지나, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 하나의 적합한 숙주(host)에서 발현된다.
포유동물(즉, BHK, CHO), 세균(즉, 에. 콜리) 및 곤충 세포(즉, Sf-9)는 여기서 설명한 조성물과 방법에서 유용한 인자(Factor) Ⅶ 또는 인자(Factor) Ⅶa를 제공하는 대표적인 발현 시스템이다.
발명의 예에서, 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 핍 혈(ischemia), 트라우마(trauma), 염증 또는 독성물질과의 접촉 등 조직 손상의 치료를 위해 환자에 투여할 수 있다.
또 다른 예에서, 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 혈우병(Hemophilia) A를 보유한 환자, 혈우병 B를 보유한 환자, 인자-Ⅷ에 항체를 가진 혈우병 A를 보유한 환자, 인자 Ⅸ에 항체를 가진 혈우병 B를 보유한 환자 및 간경변(liver cirrhosis)을 가진 환자의 치료를 위해 환자에 투여할 수 있다.
또 다른 예에서, 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 긴급시의 출혈, 선택적 수술, 심장수술, 척수수술, 간이식, 부분간 절개, 골반-관절구 골절 재구성 및 동종 줄기세포이식의 치료를 위해 환자에 투여할 수 있다.
또 다른 예에서, 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 급성 뇌내출혈, 외상성 뇌손상, 배리실(Variceal)출혈 및 상부위장관, 출현의 치료용으로 환자에 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 국면에서, 본 발명은 하나의 인자(Factor) Ⅶ/인자(Factor) Ⅶa 펩티드 콘주게이트와 하나의 의약적으로 허용할 수 있는 캐리어(carrier)를 함유한 의약제제를 제공한다.
그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트에 있어서, 글리코실 결합기 또는 변형기가 결합되어 있는 아미노산잔기 각각은 주로 동일한 구조를 가진다.
예로서, 하나의 펩티드가 하나의 Thr 결합 글리코실잔기를 포함할 경우 그 개체조에서 최소 약 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99.2%, 99.4%, 99.6% 또는 더 바람직하게는 99.8%의 펩티드는 동일한 Thr 잔기에 공유 결합된 동일한 글리코실 결합기를 가진다.
본 발명의 다른 목적과 이점은 다음의 구체적 설명에서 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 유용한 변형 시알산 뉴클레오티드의 예를 나타낸다. 도 1A는 분기(즉, 30KDa, 40KDa)CMP-시알산-PEG당 뉴클레오티드의 구조체이고, 도 1B는 선상 인자(Factor) Ⅶ-SA-PEG-10KDa의 구조체이다.
도 2는 본 발명의 콘주게이트를 제조할 때 유용한 하나의 예로서 PEG-글리코실 결합기 전구물질(변형당)의 합성 제조공정(스킴:Scheme)을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 글리코 콘주게이트를 형성하는데 유용한 시알릴전이효소를 나타낸 표이다[즉, 변형 시알산을 가진 글리코페질레이트(glycoPEGylate) 펩티드]/
도 3은 도 3A, 도 3B, 도 3C, 도 3D, 도 3E, 도 3F, 도 3G, 도 3H, 도 3I, 도 3J, 도 3K, 도 3L, 도 3N을 포함하여 각각 나타낸다.
도 4는 인자 Ⅶ 및 인자 Ⅶa 상에서 글리칸 구조를 재 모델링(remodeling)하는 공정예를 설명한 도 4A ~ 도 4E를 포함한다.
도 4A는 재 모델링하는데 예측하는 글리칸(glycans)에 결합되어 있는 잔기를 표시한 인자 Ⅶ 및 인자 Ⅶa 펩티드의 설명도이다.
도 4B는 재 모델링하는데 예측되는 글리칸에 결합되어 있는 잔기를 표시한 인자 Ⅶ 및 인자 Ⅶa 펩티드 A(실선) 및 B(점선)의 설명도와 글리칸의 식을 나타낸다.
도 4C ~ 도 4E는 펩티드가 발현되는 세포타입에 의한 도 4B의 펩티드의 글리칸의 재 모델링 공정과 소정의 재 모델링한 글리칸 구조의 설명도이다.
도 5A와 도 5B를 포함하는 도 5는 하나의 예로 나타낸 뉴클레오티드가 그 대응하는 인자 Ⅶa의 아미노산 서열(SEG ID NOS:1 및 2, 각각)을 나타낸다.
도 6은 아시알로-인자 Ⅶa의 등전점 분획 전기영동겔(isoelectric focusing gel)(pH 3-7)에 대한 영상(image)이다. 레인(lane) 1은 인자 Ⅶa이고, 레인 2-5는 아시알로-인자 Ⅶa이다.
도 7은 인자 Ⅶa의 MALDI 스펙트럼의 그래프이다.
도 8은 인자 Ⅶa-SA-PEG-1KDa의 MALDI 스펙트럼의 그래프이다.
도 9는 인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa의 MALDI 스펙트럼의 그래프이다.
도 10은 페질화(PEGylated) 인자 Ⅶa의 SDS-PAGE 겔의 영상(image)이다. 레인(lane) 1은 아시알로-인자 Ⅶa이다. 레인(lane) 2는 아시알로-인자 Ⅶa 및 CMP-SA-PEG-1KDa를 ST3Gal3과 반응시켜 48시간 후 얻은 생성물이다. 레인(lane) 3은 아시알로-인자 Ⅶa 및 CMP-SA-PEG-1KDa를 ST3Gal3과 반응시켜 48시간 후 얻은 생성물이다. 레인(lane) 4는 아시알로-인자 Ⅶa 및 CMP-SA-PEG-10KDa를 ST4Gal3과 반응하여 96시간에서 얻은 생성물이다.
도 11A ~ 도 11B는 시알리다아제를 적게하여 탈시알릴화와 피질화(PEGylation)를 동시에 실시한 반응을 나타낸다. 이들 도면에서는 시알리다아제의 존재하에서 캐핑(capping)이 효과적인 것을 나타내는 부분이 가장 밝은 부분이다.
도 11A는 시알리다아제가 0.5U/L의 레벨일 경우 반응과정을 나타낸다. 레인 1은 미변성(native) 인자 Ⅶa에 대응하나, 레인 2는 아시알로 인자 Ⅶa이다. 레인 3에서 레인 7까지는 시간 진행에 따라 페질화 생성물의 양이 증가한다. 레인 3에서는 주생성물이 모노페질화 되고[64에서 스폿(spot)을 참조할 수 있음], 소정기간 후 검정할 일정부분에서는 디(di)(97 바로 아래 스폿 참조), 트리(tri)(97 바로 위 스폿 참조) 및 더 높은 페질화 생성물의 양 증가와 생성을 나타낸다. 레인 8 및 9는 반응에서 시알산의 "캐핑"(capping) 또는 첨가 결과를 나타낸다. 그 반응이 캐핑될 경우, 레인 5, 8 및 9에서 확인된 동일한 페질화 생성물 분포에서 알 수 있는 바와 같이 그 반응이 정지된다.
도 11B는 시알리다아제가 0.1U/L인 경우 반응과정을 나타낸다.
도 12A는 시알리다아제가 글리코실전이효소를 동시에 첨가할 경우의 상태를 나타낸다.
도 12B는 시알리다아제를 1차로 첨가시킨 다음, 30분간의 지연 후에 글리코실전이효소를 첨가할 때의 상태를 나타낸다.
도 13은 하나 이상의 글리코실 결합기가 별첨 도면의 순서(order)에 따라 첨부되어 본 발명의 펩티드 콘주게이트를 형성하는 펩티드의 표이다(도 13에서는 도 13A, 도 13B, 도 13C, 도 13D, 도 13E, 도 13F, 도 13G, 도 13H, 도 13I, 도 13J, 도 13K, 도 13L, 도 13M, 도 13N, 도 13O, 도 13P, 도 13Q, 도 13R, 도 13S, 도 13T, 도 13U, 도 13V, 도 13W, 도 13X, 도 13Y, 도 13Z, 도 13AA, 도 13BB, 도 13CC가 포함되어 있는 각각의 표를 나타냄).
도 14A 및 도 14B는 HPLC 실험결과를 표시하는 크로마토그램을 나타낸다,
도 14A는 L사출방법(light chain method)에 의해 분석한 인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa(도면 상부)와 미변성(native) 인자 Ⅶa 대조(도면 하부)의 라벨링한 크로마토그램을 나타낸다. 다른 생성물로부터 LC(L사슬), 1×10KDa-PEG-LC, 2×10KDa-PEG-LC 및 3×10KDa-PEG-LC의 분리를 나타낸다.
도 14B는 H사슬방법(heavy chain method)에 의해 분석한 인자 Ⅶa-SA-PEG-10LDa(도면 상부)와 미변성(native) 인자 Ⅶa 대조(도면 하부)의 라벨링한 크로마토그램을 나타낸다. 다른 생성물로부터 HC(heavy chain), 1×10KDa-PEG-LC, 2×10KDa-PEG-LC 및 3×10KDa-PEG-LC의 분리를 나타낸다.
도 15A 및 도 15B는 HPLC 실험결과를 표시한 크로마토그램을 나타낸다.
도 15A는 L사슬법에 의해 분석한 축소된 미변성(native) 인자 Ⅶa 대조(도면 상부)와 축소된 인자 Ⅶa-SA-PEG-40KDa(도면 하부)의 라벨링(labeled)한 크로마토그램을 나타낸다. 다른 생성물에서 LC(light chain), 1×40KDa-PEG-LC, 2×40KDa-PEG-LC 및 3×40KDa-PEG-LC의 분리를 나타낸다.
도 15B는 H사슬방법(heavy chain method)에 의해 분석한 축소된 미변성 인자 Ⅶa 대조(도면 상부)와 인자 Ⅶa-SA-PEG-40KDa(도면 하부)의 라벨링한 크로마토그램을 나타낸다. 다른 생성물로부터 HC(heavy chain), 1×40KDa-PEG-LC, 2×40KDa-PEG-LC 및 3×40KDa-PEG-LC의 분리를 나타낸다.
약어
PEG는 폴리(에틸렌글리콜)의 약어이고; PPG는 폴리(프로필렌글리콜)의 약어 이며; Ara는 아라비노실의 약어고; Fru는 프루코실의 약어이며; Fuc는 푸코실의 약어이고; Gal은 갈락실의 약어이며; GalNAc는 N-아세틸갈락토사머닐의 약어이고; Glc는 글루코실의 약어이며; GlcNAc는 N-아세틸글루코사미닐의 약어이고; Man은 만노실의 약어이며; ManAc는 만노사미닐아세테이트의 약어고; Xyl은 키실로실의 약어이며; NeuAc는 시알릴 또는 N-아세틸뉴라미닐의 약어이고; Sia는 시알릴 또는 N-아세틸뉴라미닐의 약어이며; 이들의 유도체 및 동족체이다.
정의
특별한 정의가 없는 경우, 여기서 사용되는 모든 과학적 용어는 일반적으로 본 발명에 속한 기술에서 기술자에 의해 통상적으로 이해할 수 있는 동일한 의미를 가진다.
일반적으로, 여기서 사용된 명칭, 세포배양, 분자 유전학, 유기화학 및 핵산화학에서의 실험 처리공정 및 혼성화는 이 기술분야에서 통상적으로 사용되고, 공지된 것이다.
핵산 및 펩티드 합성에서는 표준기술을 사용한다.
기술과 처리공정은 일반적으로 통상의 방법과 여러 가지의 일반적인 참고문헌에 따라 실시한다[일반적으로, Sambrook 등, Molcular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Clod Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 참고로 여기서 인용함].
여기서 사용한 명칭과 분석화학에서의 실험 처리공정 및 아래에서 설명한 유기합성은 이 가술분야에서 공지되고, 관용된 것이다. 표준기술 또는 그 변형기술 은 화학적 합성 및 화학적 분석에 사용한다.
여기서 기재된 모든 올리고사카리드는 비환원 사카리드(즉, Gal)의 명칭 또는 약어로, 그 다음 글리코시드 결합 구성(α 또는 β), 링결합(1 또는 2), 결합(2, 3, 4, 6 또는 8)에 포함된 환원 사카리드의 링 위치에 따라, 그 다음 환원 사카리드의 명칭 또는 약어(즉, GlcNAc)로 기재한다. 각각의 사카리드는 하나의 피라노오스가 바람직하다. 글리코(glyco) 생물학 명칭을 참조할 수 있다[Essentials of Glycobiology Varki 등, eds. CSHL Press(1999) 참조].
올리고사카리드는 하나의 환원단(reducing end)을 가진 그 사카리드가 실제로 하나의 환원당인지의 여부에 관계 없이 하나의 환원단과 하나의 비환원단을 가진 것으로 한다.
허용되는 명칭에 따라, 올리고사카리드는 그 좌측에 비환원단과 그 우측에 환원단을 가진 것으로 여기서 나타낸다.
용어 "시알산" 또는 "시알릴"은 9개 탄소의 카르복실화당의 하나의 패밀리(family) 중 어느 멤버이다.
그 시알산 패밀리의 가장 통상적인 멤버는 N-아세틸뉴라민산[2-케토-5-아세트아미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노눌로피라노오스-1-온산(약어로, Neu5Ac, NeuAc 또는 NANA로 기재함)]이다.
그 패밀리의 제 2멤버는 N-글리코실-뉴라민산(Neu5Gc 또는 NeuAc)이며, 여기서 NeuAc의 N-아세틸기는 가수분해 한다.
패밀리 멤버의 제 3 시알산은 2-케토-3-데옥시-노눌로손산(KDN)이다(Nadano 등, (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori 등, Biol. Chem. 265: 21811-21819(1990)).
또, 9-O-락틸-Neu5Ac 또는 9-0-아세틸-Neu5Ac, 9-데옥시-9-플루오로-Neu5Ac 및 9-아지도-9-데옥시-Neu5Ac와 같은 하나의 9-0-C1-C6아실-Neu5Ac 동 9-치환 시알산이 포함된다.
시알산 패밀리에 대해서는 다음 참고문헌을 참조할 수 있다.
Varki, Glycobiology 2:25-40(1992);
Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)).
시알릴화 처리공정에서 시알산 화합물의 합성 및 사용은 국제출원 공개문헌 WO 92/16640(1992.10.01자 공개되었음)에서 개시되었다.
"펩티드"(peptide)는 하나의 폴리머를 말하며, 여기서 그 모노머는 아미노산이며, 아미드결합을 통해 함께 결합되어 있어, 또 하나의 폴리 펩티드이다.
또, 비천연(unnatural) 아미노산, 예로서, β-알라닌, 페닐글리신 및 호모아르기닌이 포함된다.
본 발명에서는 또 유전자 엔코딩(gene-encoding)되지 않은 아미노산도 사용할 수 있다.
또, 본 발명에서는 변형시켜 반응성기, 글리코실화 부위, 폴리머, 치료성분, 바이오 분자 등을 포함하는 아미노산을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 모든 아미노산은 D-또는 L-이성체(isomer)로 할 수 있다.
그 L-이성체가 일반적으로 바람직하다. 또, 다른 펩티드 유사물(peptidomimetics)이 본 발명에서 유용하다.
여기서 사용된 바와 같이, "펩티드"는 글리코실화 및 언글리코실화(unglycosylated) 펩티드 모두를 포함한다.
그 펩티드를 나타내는 하나의 시스템(system)에 의해 불충분하게 글리코실화된 펩티드를 포함한다.
일반적인 참고문헌으로 다음 문헌을 참조할 수 있다.
Spatola, A. F., in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO A CIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267(1983).
본 발명의 펩티드의 리스트(list)는 도 13에서 제공한다.
용어 "펩티드 콘주게이트"(peptide conjugate)는 본 발명의 특징을 말하며, 여기서 하나의 펩티드가 여기서 설명한 바와 같이 하나의 변형당(modified sugar)으로 콘주게이팅(conjugating)되어 있는 것을 말한다.
용어 "아미노산"은 천연 및 합성 아미노산과, 아미노산 아날로그(analogo) 및 아미노산 유사체(mimetics)(천연 아미노산과 동일하게 작용함)를 말한다.
천연 아미노산은 유전자 코드에 의해 엔코딩되는 아미노산과, 후 변형시킨 아미노산, 즉 히드록피롤린,
Figure 112008019904915-PCT00015
-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다.
아미노산 아날로그는 천연 아미노산과 동일한 기본적인 화학구조를 가진 화 합물, 즉 하나의 수소, 하나의 카르복실기, 하나의 아미노기 및 하나의 R그룹(group)에 결합된
Figure 112008019904915-PCT00016
탄소, 즉 호모세린, 노르류신, 메티오닌술폭시드, 메티오닌 메틸술포늄을 말한다.
이와 같은 아날로그는 변형 R그룹(즉, 노르류신) 또는 변형 펩티드 골격을 가지나, 천연 아미노산과 동일한 기본적인 화학구조를 보유한다.
아미노산 유사물은 아미노산의 일반적인 화학구조와 다르나 천연 아미노산과 동일하게 작용하는 구조를 가진 화학적 화합물을 말한다.
여기서 사용되는 용어 "변형당(modified sugar) 또는 "변형당 잔기"(modified sugar residue)는 본 발명의 하나의 프로세스에서 아미노산 또는 펩티드의 글리코실잔기에 효소에 의해 첨가되는 천연 또는 비천연 카르보히드레이트를 말한다.
그 변형당은 당뉴클레오티드(모노, 디 및 트리-포스페이트), 활성화당(즉, 글리코실할라이드, 글리코실메실레이트) 및 활성화하지 않으며 뉴클레오티드가 아닌 당(sugars)을 포함하나 한정되지 않은 효소 기질에서 선택한다.
그 "변형당"은 변형기(modifying groups)로 공유 결합에 의해 기능화한다.
유용한 변형기에는 PEG 성분, 치료성분, 진단성분, 바이오 분자 등을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.
그 변형기는 천연 카르보히드레이트 또는 비변형카르보히드레이트가 아닌 것이 바람직하다.
그 변형기로 기능화하는 부위(locus)는 그 변형당이 펩티드에 효소에 의해 첨가하는 것을 방해하지 않도록 선택한다.
용어 "수용성"(water-soluble)은 수중에서 검출할 수 있는 용해도를 가진 성분을 말한다.
물 용해도를 검출 및/또는 정량하는 방법은 이 분야기술에서 공지되었다.
수용성 폴리머의 예로는 펩티드, 사카리드, 폴리(에테르), 폴리(아민), 폴리(카르복실산) 등이 있다.
펩티드는 하나의 단순 아미노산(simple amino acid)으로 이루어진 혼합 서열(mixed sequences), 즉 폴리(라이신)을 가진다.
하나의 예의 폴리사카리드는 폴리(시알산)이다.
하나의 예의 폴리(에테르)는 폴리(에틸렌글리콜)이다.
폴리(에틸렌 이민)은 하나의 예의 폴리 아민이며, 폴리(아크릴)산은 하나의 대표적인 폴리(카르복실산)이다.
그 수용성 폴리머의 폴리머 골격은 폴리(에틸렌 글리콜)(즉, PEG)로 할 수 있다.
그러나, 다른 관련된 폴리머는 또 본 발명의 실시에서 사용에 적합하고, 그 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용이 이 발명에서 포함할 수 있도록 하며 제외하지 않도록 하는 것을 이해할 필요가 있다.
용어 PEG에는 알콕시 PEG, 2기능성 PEG, 다중암(multiarmed) PEG, 포크상(forked) PEG, 분기 PEG, 현수(pendent) PEG(즉 PEG 또는 폴리머 골격에 현수된 하나 이상의 작용기를 가진 관련 폴리머), 또는 분해성 연결을 가진 PEG를 포함하 여, 여러 형태들 중 어느 하나의 폴리(에틸렌 글리콜)를 포함한다.
그 폴리머 골격은 선상 또는 분기상으로 할 수 있다.
분기 폴리머 골격은 일반적으로 이 분야기술에서 공지되었다.
일반적으로, 하나의 분기 폴리머는 하나의 중심 분기 코어(central branch core) 성분과 그 중심 분기 코어에 결합된 다수의 선상 폴리머 사슬을 포함한다.
PEG는 글리세롤, 펜타에리트리톨 및 소르비톨 등 여러 가지의 폴리올에 에틸렌옥사이드를 부가시켜 제조할 수 있는 분기형태로 통상 사용된다.
그 중심 분기성분은 또 라이신 등 수개의 아미노산에서 유도시킬 수 있다.
그 분기 폴리(에틸렌 글리콜)은 R(-PEG-OH)m(여기서, R은 글리세롤 또는 펜타에리트리톨 등 코어성분을 나타내며, m은 암(arm)의 수를 나타낸다.)과 같이 일반형태로 나타낼 수 있다.
여기서 인용한 특허문헌 USP 5,932,462에서 기재된 PEG 분자 등 다 암(multi-armed) PEG 분자는 또 폴리머 골격으로서 사용할 수 있다.
다수의 다른 폴리머도 본 발명에 적합하다.
결합부위(loci) 약 2 ~ 약 300개 이내에서 수용성이며, 비펩티드 형상인 폴리머 골격은 특히 본 발명에서 유용하다.
적합한 폴리머의 예로는 여기서 참고로 인용한 특허문헌 USP 5,629,384 명세서에서 기재된 바와 같이, 폴리(프로필렌글리콜("PPG"), 에틸린글리콜과 프로필렌글리콜의 코폴리머 등 다른 폴리(알킬렌글리콜), 폴리(옥시에틸렌화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시프로필메타크릴아미드), 폴 리(
Figure 112008019904915-PCT00017
-히드록시산), 폴리(비닐알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로모르폴린) 및 이들의 코폴리머, 테르폴리머 및 혼합물이 포함되나, 한정되어 있는 것은 아니다.
그 폴리머 골격의 각각의 사슬의 분자량은 변동할 수 있으나, 일반적으로 약 100Da ~ 약 100,000Da의 범위이며, 주로 약 6,000Da ~ 약 80,000Da이다.
환자에 펩티드 약제를 투여할 때, 여기서 사용되는 바와 같이 "곡선 하부영역"(area under the curve) 또는 "AUC"는 0에서 무한대(infinity)의 시간함수로서 환자의 전신순환에서의 약제의 농도를 기술하는 곡선하의 전체영역으로 정의한다.
환자에 펩티드 약제 투여시에, 여기서 사용되는 용어 "반감기" 또는" t½"은 환자에서 약제의 혈장농도가 1/2로 감소하는데 필요로 하는 시간으로 정의한다.
멀티플 클리어런스(multiple clearance) 메카니즘, 재분배 및 공지된 다른 메카니즘에 따라, 펩티드 약제와 관련된 반감기는 1이상 이다.
통상적으로, 알파 및 베타 반감기는 알파상(phase)이 재분배와 관련되고 베타상이 클리어런스에 관련되도록 한다.
그러나, 대부분 혈류(blood stream)에 한정되어 있는 단백질 약제에서는 최소 2의 클리어런스 반감기로 할 수 있다.
글리코실화 펩티드에 있어서, 신속한 베타상 클리어런스는 마크로파아지, 또는 말단갈락토오스, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 만노오스 또는 푸코오스를 인식하는 내피 세포상에서 리셉터(recaptors)에 의해 중개할 수 있다.
더 느린 베타상 클리어런스는 유효 반경 < 2㎚(약 68KD)을 가진 분자에 대한 신장사구체여과(renal glomerular filtration) 및/또는 조직 내에서 특이 또는 비특이 흡수(uptake) 및 대사에 발생할 수 있다.
글리코페질화(glycoPEGylation)는 말단당(즉, 갈락토오스 또는 N-아세틸갈락토사민)을 캐핑(capping)할 수 있어, 이들의 당을 인식하는 리셉터에 의해 신속한 알파상 클리어런스를 차단한다.
또, 이것은 더 큰 유효 반경을 참조할 수 있으므로 분배 및 조직 흡수의 용량(volume)을 감소시켜 느린 베타상을 연장한다.
이와 같이, 알파상 및 베타상 반감기에 있어서, 글리코펠질화의 정밀한 영향력(impact)은 그 크기, 글리코실화의 상태 및 이 기술분야에서 공지된 기타 파라미터에 따라 변동할 수 있다.
또, "반감기"의 설명은 다음 참고문헌에서 기재되어 있다[Pharmaceutical Biotechnology(1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101-120)].
여기서 사용되는 용어 "글리코 콘주게이션'(glycoconjugation)은 본 발명의 폴리 펩티드, 즉 G-CSF 펩티드의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 변형당 종(modified sugar species)의 효소에 의해 중개한 콘주게이션(conjugation)을 말한다.
"글리코콘주게이션"의 이차적인 용어(subgenus)는 "글리코페질화"(glycoPEGylation)로서, 그 변형당의 변형기(modifying group)가 폴리(에틸렌 글리콜)과, 그 알킬 유도체(즉, m-PEG) 또는 반응성 유도체(즉, H2N-PEG, HOOC-PEG)이다.
용어 "대규모"(large-scale) 및 "산업상 규모"(industrial-scale)는 혼용하며, 단일 반응 사이클이 완료될 때 글리코콘주게이트 최소 약 250㎎, 바람직하게는 최소 약 500㎎, 더 바람직하게는 최소 약 1gr을 생산하는 반응 사이클을 말한다.
여기서 사용되는 용어 "글리코실 결합기"(glycosyl linking group)는 하나의 변형기(즉, PEG 성분, 치료성분, 바이오 분자)가 공유 결합되는 하나의 글리코실 잔기를 말한다.
그 글리코실 결합기는 그 콘주게이트의 잔부(remainder)에 그 변형기를 결합한다.
본 발명의 방법에서, 그 "글리코실 결합기"는 글리코실화 또는 언글리코실화(unglycoosylated) 펩티드에 공유 결합되므로, 그 펩티드 상에서 아미노산 및/또는 글리코실 잔기에 그 약제(agent)를 결합한다.
"글리코실 결합기"는 그 펩티드의 아미노산 및/또는 글리코실잔기에 "변형당"의 효소에 의한 결합에 의해 "변형당"으로부터 일반적으로 유도된다.
그 글리코실 결합기는 변형기-변형당 카세트의 형성 중에 분해되는 하나의 사카리드 유도 구조로 할 수 있거나(즉, 산화→쉬프염기 형성→환원), 또는 그 글리코실 결합기는 무손상(intact)으로 할 수 있다.
"무손상 글리코실 결합기"는 글리코실 성분에서 유도된 하나의 결합기를 말 하며, 여기서 사카리드 모노머는 변형기를 결합하며, 그 콘주게이트의 잔부는 분해되지 않는다. 즉, 소듐 메타퍼아이오데이트에 의해 산화되지 않는다.
본 발명의 "무손상 글리코실 결합기"는 하나의 모(parent) 사카리드 구조에서 글리코실 단위의 부가 또는 하나 이상의 글리코실 단위의 제거에 의해 하나의 천연 올리고 사카리드에서 유도할 수 있다.
여기서 사용되는 용어 "비-글리코시드 변형기"는 글리코실 결합기에 직접 결함된 천연당을 함유하지 않은 변형기를 말한다.
여기서 사용되는 용어 "표적성분"(tageting moiety)은 신체(body)의 특정조직 또는 부위에 선택적으로 위치 설정하는 종(species)을 말한다.
그 위치설정은 표적제 또는 콘주게이트의 분자 결정인자(molecular determinants), 분자크기, 이온 상호작용, 소수성 상호작용 등의 특수인식에 의해 매개(mediation)된다.
특수조직 또는 부위에 하나의 약제를 표적으로 하는(targeting) 다른 메카니즘은 이 기술분야에서 이 기술자에 의해 공지되었다.
표적성분(targeting moiety)의 예로는 항체, 항체 프라그멘트, 트랜스 페린(transferrin), HS-글리코 단백질, 응집인자(coagulation factors), 혈청 단백질(serum proteins), β-글리코 단백질, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO 등이 있다.
여기서 사용되는 "치료성분(therapeutic moiety)은 항생제, 항염증제, 항종양제, 사이토톡신(cytotoxins) 및 방사성제를 포함하나 한정되지 않는 치료에 유용한 처리제를 말한다.
"치료성분"에는 바이오 활성제(bioactive agents)의 프로드러그(prodrugs), 하나의 치료성분이 하나의 캐리어에 결합되어 있는 구성물, 즉 다가약제(multivalent agent)를 포함한다.
또, 치료제에는 단백질 및 단백질을 함유한 구성물을 포함한다.
단백질의 예에는 그라눌로사이트 콜로니 자극 인자(Granulocyte Colony Stimulating Factor)(GCSF), 그라눌로사이트 마크로파아지 콜로니 자극인자(Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor)(GMCSF), 인터페론(Interferon)(,즉, 인터페론-
Figure 112008019904915-PCT00018
,-
Figure 112008019904915-PCT00019
,
Figure 112008019904915-PCT00020
, 인터류킨(Interleukin)(즉, 인터류킨 Ⅱ), 혈청 단백질(Serum proteins)(즉 인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ 및 Ⅹ), 휴맨 코리온 고나도트로핀(Human Chorionic Gonadotropin)(HCG), 폴리클 자극 호르몬(Follicle Stimulating Hormone(FSH) 및 루테니징 호르몬(Lutenizing Hormone)(LH), 항체 융합 단백질(antibody fusion proteins)[즉, 종양 괴사 인자 리텝터(Tumor Necrosis Factor)(TNFR)/Fc도 메인 융합 단백질]을 포함하나 한정되어 있는 것은 아니다.
여기서 사용되는 "의약적으로 허용할 수 있는 캐리어"에는 어느 재료라도 포함한다. 여기서, 콘주게이트와 배합할 경우 콘주게이트의 활성을 보유하며, 피검자의 면역 시스템과 미반응성(non-reactive)이다.
그 캐리어의 예에는 포스페이트 버퍼 식염 수용액, 물, 오일/물 에멀션 등 에멀션 및 여러 가지 종류의 습윤제 등 표준이 되는 의약용 캐리어 중 어느 것이라도 포함하며, 한정되어 있는 것은 아니다.
또, 다른 캐리어에는 멸균용액, 피복정제를 포함하는 정제와 캡슐을 포함할 수 있다. 일반적으로 이와 같은 캐리어에는 전분, 우유, 당, 어느 종류의 점토, 젤라틴, 스테아린산 또는 그 염, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 탈크, 식물성 유지, 검, 글리콜 등 부형제 또는 다른 공지의 부형제를 포함한다.
또, 이와 같은 캐리어에는 향미(flavor) 및 착색 첨가제 또는 다른 성분을 포함할 수 있다.
이와 같은 캐리어를 함유하는 조성물은 공지의 통상의 방법에 의해 제제한다.
여기서 사용되는 "투여"(administering)는 피검자에 경구투여, 좌약(suppository)투여, 국소접촉투여, 정맥내투여, 복강내투여, 균육내투여, 병소내(lesional)투여, 비강내투여 또는 피하투여 또는 서방디바이스(slow-release device), 즉 소형 삼투압 펌프(mini-osmotic pump)의 체내이식을 말한다.
투여는 비경구와 경점막(transmucosal)(즉, 경구, 비강, 질, 직장 또는 경피)를 포함하는 어느 루트에 의해 행하여진다.
비경구 투여에는 즉 정맥내투여, 균육내투여, 소동맥(arteriole)투여, 피내투여, 피하투여, 복강내투여, 심실내투여 및 두개내(intracranial)투여를 포함한다.
더욱이, 종양을 치료하기 위하여 주사하여 세포사멸(apoptosis)을 유발할 경우, 종양 및/또는 그 종양을 둘러싼 조직 내에 직접 투여할 수 있다.
투여의 다른 방식에는 리포솜 제제(liposomal formulations), 정맥내 주입, 경피패치 등의 사용을 포함하나 한정된 것은 아니다.
용어 "개선(회복)"(ameliorating) 또는 "개선(회복) 하다"(ameliorate)는 환자의 신체적 또는 정신적 건강에서 개선 또는 증상의 감퇴, 완화 또는 점감(diminishing) 등 객관적 또는 주관적 파라미터를 포함하여 병리상태의 치료에서의 성공표시(indicia)를 말한다.
증상의 회복(개선)은 신체검사 및/또는 정신 의학적 평가의 결과를 포함하여 객관적 또는 주관적 파라미터를 기준으로 할 수 있다.
용어 "치료"(therapy)는 질병에 걸리기 용이하나 그 질병의 증상을 경험하지 않았거나 나타낸 바 없는 동물에서 그 질병 또는 상태의 발생을 예방하며(예방치료) 그 질병을 억제하며(그 질병발생의 지연 또는 정지), 그 질병의 증상 또는 부작용에서의 경감(완화)을 제공하며(고식적 치료 포함), 그 질병을 경감하는 (그 질병의 퇴행발생) 것을 포함하는 질병 또는 상태의 치료를 말한다.
용어 "유효량" 또는 "…에 유효한 량" 또는 "치료 유효량" 또는 어느 동일한 의미의 용어는 질병치료를 위해 동물에 투여할 때 그 질병을 치료하는데 충분한 양을 의미한다.
용어 "분리"(isolated)는 재료를 제조하기 위하여 사용되는 성분들로부터 유리하는 하나의 재료를 말한다.
본 발명의 펩티드 콘주게이트에 있어서, 그 용어 "분리"는 그 펩티드 콘주게이트를 제조하는데 사용되는 혼합물 중에서 재료를 정상적 상태에서 동반하는 성분에서 유리하는 재료를 말한다.
"분리"(isolated) 및 "순수"(pure)는 혼용한다.
일반적으로, 본 발명의 분리된 펩티드 콘주게이트는 어느 범위에서 바람직하게 나타낸 순도(purity)의 레벨을 가진다.
그 펩티드 콘주게이트의 순도 레벨의 하한(lower end)은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이고, 그 순도 레벨의 상한(upper end)은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 95% 이상이다.
그 펩티드 콘주게이트가 순도 약 90% 이상인 경우, 이들의 펩티드 콘주게이트의 순도는 어느 범위에서 바람직하게 나타낸 것이다. 그 순도범위의 하한은 약 90%, 92%, 약 94%, 약 96% 또는 약 98%이다. 그 순도범위의 상한은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98%m 또는 100% 순도이다.
순도는 어느 공지된 분석방법(즉, 은 염색 겔 상에서의 밴드강도, 폴릴아크릴아미드겔 전기영동, HPLC 또는 동일한 수단)에 의해 측정한다.
여기서 사용되는 "개체군의 각각의 멤버"는 하나의 펩티드에 부가한 선택%의 변형당을 그 펩티드 상에서의 다중의 동일한 수용체부위에 부가하는 본 발명의 펩티드 콘주게이트의 하나의 개체군의 특성을 기술한 것이다.
"그 개체군의 각각의 멤버"는 변형당에 콘주게이팅한 펩티드 상에서 부위(sites)의 "균질성"(homogeneity)을 나타내며, 본 발명의 콘주게이트로서, 이들의 콘주게이트는 균질성이 최소 약 80%, 바람직하게는 최소 약 90%, 더 바람직하게는 최소 약 95%이다.
"균질성"(균일성)은 그 변형당이 콘주게이팅되는 수용체성분(acceptor moieties)의 하나의 개체군에 걸친 구조적인 컨시스턴시(structural consistency) 를말한다.
이와 같이, 모든 다른 변형당이 콘주게이팅되는 수용체부위와 동일한 구조를 가진 하나의 수용체부위에 각각의 변형당 성분이 콘주게이팅되는 본 발명의 하나의 펩티드 콘주게이트에 있어서, 그 펩티드 콘주게이트는 균질성이 약 100%이다.
균질성은 일반적으로 하나의 범위로 나타낸다. 그 펩티드 콘주게이트에 대한 균질성 범위의 하한은 약 60%, 약 70% 또는 약 80%이고, 그 순도범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 90% 이상이다.
그 펩티드 콘주게이트는 균질성이 약 90% 또는 그 이상인 경우, 이들의 균질성은 또 하나의 범위로 나타내는 것이 바람직하다.
그 균질성 범위의 하한(lower end)은 약 90%, 액 92%, 약 94%, 약 96% 또는 98%이다. 그 순도범위의 상한은 약 92%, 약 94%, 약 96%, 약 98% 또는 약 100% 균질성이다.
그 펩티드 콘주게이트의 순도는 일반적으로 이 분야 기술의 기술자에 의해 공지된 하나 이상의 방법, 즉 액상 크로마토그래피-매스(mass) 스펙트로메트리(LC-MS), 플라이트 스펙트로메트리의 매트릭스 협조레이저 탈착 매스시간(matrix assisted laser desorption time), 모세관 전기영동법 등에 의해 측정한다.
하나의 글리코펩티드종에 대하여 말할 때, "거의 균일한 글리코폼")substamtially uniform glycoform) 또는 거의 균일한 글리코실화패턴"은 관련된 글리코실전이효소(즉, 푸코실전이효소)에 의해 글리코실화한 수용체 성분의 %를 말한다.
예로서, α1,2푸코실전이효소의 경우, 거의 균일한 푸코실화패턴은 Galβ1,4-GleNAc-R과 그 시알릴화아날로그의 거의 전부(아래에서 정의한 것과 같음)가 본 발명의 펩티드 콘주게이트에서 푸코실화할 경우 존재한다.
여기서 설명한 푸코실화구조에 있어서 그 Fuc-GlcNAc 결합은 일반적으로 α1,6 또는 1,3이며, α1,6이 일반적으로 바람직하다.
그 출발재에는 글리코실화 수용체 성분(즉, 푸코실화Galβ1,4-GlcNAc-R 성분)을 함유할 수 있다는 것은 이 기술분야의 기술자에 의해 이해할 수 있다.
이와 같이, 상기 계산 %의 글리코실화에는 본 발명의 방법에 의해 글리코실화한 수용체 성분과, 그 출발재에서 이미 글리코실화한 수용체 성분을 포함한다.
"거의 균일한"(substantially uniform)의 상기 정의에서 용어 "거의"는 하나의 특정의 글리코실전이효소의 수용체 성분의 최소 약 40%, 최소 약 70%, 최소 약 80%, 또는 더 바람직하게는 최소 약 90%, 가장 더 바람직하게는 최소 약 95%가 글리코실화함을 일반적으로 의미한다.
치환기가 좌측에서 우측으로 기재한 이들의 치환기의 통상의 화학식에 의해 특정될 경우, 이들의 치환기는 화학적으로 동일한 치환기를 동일하게 포함하며, 이들의 동일한 치환기들은 우측에서 좌측으로 그 구조를 기재한 것으로 한다. 즉, -CH2O-는 또 -OCH2-로 인용하여 기재하도록 한다.
용어 "알킬"은 그 자체 또는 또 다른 치환기의 일부로서 특별한 설명이 없는 경우, 하나의 직쇄 또는 분기사슬, 또는 사이클릭 탄화수소래디컬, 또는 그 조합을 의미하며, 완전 포화할 수 있고, 모노 또는 다불포화할 수 있으며, 지정한 탄소원자 수(즉, C1-C10은 1~10개의 탄소원자를 의미함)를 가진 디- 및 다가래디컬을 포함할 수 있다.
포화 탄화수소래디컬의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 예로서 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 동족체(homologs) 및 이성체 등의 그룹(groups)을 포함하나 한정된 것은 아니다.
하나의 불포화 알킬기는 하나 이상의 2중 결합 또는 3중 결합을 가진 것이다. 불포화 알킬기의 예에는 비닐,2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부탈디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 그 고급 동족체 및 이성체를 포함하나, 한정된 것은 아니다.
용어 "알킬"은 특별한 설명이 없는 경우, 또 "헤테로알킬" 등, 아래에서 구체적으로 정의한 알킬의 유도체를 포함하는 것을 의미한다. 탄화수소기로 한정되어 있는 알킬기를 "호모알킬"이라 한다.
용어 알킬렌은 그 자체 또는 또 다른 치환체의 일부로서 하나의 알칸에서 유도된 2가 래디컬을 의미하며, -CH2 CH2 CH2 CH2-를 예시하나, 한정되어 있는 것은 아니며, 또 "헤테로알킬렌"과 같이 아래에서 설명한 기(groups)를 포함한다.
일반적으로, 알킬(또는 알킬렌)기는 탄소원자 1-24개를 가지며, 이들의 기는 10개 또는 그 이하의 탄소원자 수를 가지며 본 발명에서 바람직하다.
"저급알킬"(lower alkyl) 또는 "저급알킬렌"(lower alkylene)은 길이가 더 짧은 사슬의 알킬 또는 알킬렌기이며, 일반적으로 8개 또는 그 이하의 탄소원자를 가진다.
용어 "알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)는 통상의 의미로 사용되며, 각각 산소원자, 아미노기, 또는 황 원자에 의해 그 분자의 잔부에 결합된 알킬기를 말한다.
용어 "헤테로알킬"은 그 자체 또는 다른 용어와 조합하여, 특별한 설명이 없는 경우, 안정성 있는 직쇄 또는 분기사슬, 또는 시클릭 탄화수소래디컬 또는 그 결합을 의미하며, 위에서 설명한 탄소원자 수와 O, N, Si 및 S로 이루어진 그룹에서 선택한 최소 하나의 헤테로원자로 이루어진 것이다.
여기서, 질소원자와 황원자는 선택적으로 산화시킬 수 있고, 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차원화할 수 있다.
그 헤테로원자 O, N 및 S와 Si는 헤테로알킬기의 어느 내부위치에, 또는 그 분자의 잔부에 알킬기가 결합되어 있는 위치에 설정할 수 있다.
이들의 예에는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(0)-CH3, -CH2-CH2S(0)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3를 포함하나 한정되어 있는 것은 아니다.
2개까지의 헤테로원자는 예로서 -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3 등 연속적으로 할 수 있다.
동일하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체 또는 또 다른 치환체의 일부로서 헤테로알킬에서 유도된 2가 래디컬을 의미하며, 예로서 -CH2-CH2-S-CH2-와 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-를 들 수 있으나, 한정된 것은 아니다.
헤테로알킬렌기에 있어서, 헤테로원자는 또 사슬말단 모두 또는 어느 하나를 점유할 수 있다(즉, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등).
더 나아가서, 알킬렌과 헤테로알킬렌 결합기에 있어서, 그 결합기의 식을 기재한 방향에 따라 그 결합기의 배향(orientation)을 의미하는 것은 아니다. 예로서, 식 -C(0)2R'-는 -C(0)2R'-와 -R'C(0)2- 모두를 나타낸다.
용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 이들 자체 또는 다른용어와 조합하여, 특별한 설명이 없는 경우, "알킬"과 "헤테로알킬" 각각에서의 시클릭(cyclic)의 버젼(versions)을 나타낸다.
또, 헤테로시클로알킬에 있어서, 하나의 헤테로원자는 그 헤테로시클이 그 분자의 잔부에 결합되어 있는 위치를 점유할 수 있다.
시클로알킬의 예에는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 포함하나 한정된 것은 아니다. 헤테로시클로알킬의 예에는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포 함하나 한정된 것은 아니다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 이들 자체에 따라 또는 또 다른 치환체의 일부로, 특별한 설명이 없는 경우 플루오린, 클로린, 브로민 또는 요오드원자를 의미한다.
또, "할로알킬" 등의 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예로서, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하는 것을 의미하나 한정되어 있는 것은 아니다.
용어 "아릴"(aryl)은 특별한 설명이 없는 경우, 하나의 폴리불포화 방향족치환기를 의미하며, 그 치환기는 하나의 단일링 또는 다중링(multiple ring)(바람직하게는 1~3개의 링)으로, 함께 축합되거나 또는 공유결합된다.
용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S에서 선택하는 1-4개의 헤테로원자를 포함하는 아릴기(또는 링)을 말하며, 여기서, 질소와 황원자는 선택적으로 산화되며, 질소원자는 선택적으로 4차원화 한다.
헤테로아릴기는 헤테로원자에 의해 그 분자의 잔부에 결합할 수 있다.
아릴 및 헤테로아릴기의 비한정예에는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴. 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이소옥사졸릴, 4-이소옥사졸릴, 5-이소옥소졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3- 푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살닐, 3-퀴놀릴, 테트라졸릴, 벤조[b]푸라닐, 벤조[b]티에닐, 2,3-디히드로벤조[1,4]디옥신-6-일, 벤조[1,3]디옥솔-5-일 및 6-퀴놀릴을 포함한다.
상기 기재한 아릴 및 헤테로아릴링계 각각의 치환기들은 아래에서 설명한 허용할 수 있는 치환기의 그룹에서 선택한다.
다른 용어(즉, 아릴옥시, 아릴티오옥시, 아릴알킬)와 조합하여 사용할 때 용어 "아릴"(aryl)에는 위에서 정의한 바와 같이 아릴 및 헤테로아릴링 모두를 포함한다.
이와 같이, 용어 "아릴알킬"은 하나의 탄소원자(즉, 하나의 메틸렌기)가 예로서 하나의 산소원자(즉, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)에 의해 치환되는 알킬기를 포함하여 하나의 알킬기에 하나의 아릴기가 결합되는 래디컬(즉, 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등)을 포함하는 것을 의미한다.
각각의 상기 용어(즉, "알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴")는 그 표시한 래디컬의 치환 및 비치환 형태 모두를 포함하는 것을 의미한다. 각각의 종류의 래디컬에 있어서 바람직한 치환기를 아래에서 설명한다.
알킬 및 헤테로알킬래디컬에 대한 치환체(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐)는 일반적으로 "알킬기치환체"라고 말할 수 있고, 이들은 다음에 나타낸 기들로부터 선택한 여러 가지의 기들 중 하나 이상으로 할 수 있고, 이들 기의 예시는 한정된 것이 아니다.
Figure 112008019904915-PCT00021
R', R", R"' 및 R""는 각각 독립하여 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴(즉, 1~3개의 할로겐원자로 치환시킨 아릴), 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기 또는 아릴알킬기이다.
본 발명의 하나의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 경우, 예로서 그 R기들의 각각은 각각의 R', R", R"' 및 R""와 같이 독립하여 선택한다(이들의 기들 중 하나 이상이 존재할 때).
R'과 R"가 동일한 질소원자에 결합할 경우, 이들은 그 질소원자와 결합하여 하나의 5-, 6- 또는 7-멤버링을 형성할 수 있다.
예로서, 상기 치환체의 설명으로부터, 상기 용어"알킬"이 할로알킬(즉, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(즉, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH2OCH3 등) 등 수소기 이외의 기에 결합된 탄소원자를 포함하는 기(groups)를 포함한다는 것을 의미함은 이 분야의 기술자에 의해 이해할 수 있다.
알킬래디컬에 대하여 설명한 치환체와 동일하게, 아릴 및 헤테로아릴기의 치환체는 "아릴기치환체"이다.
그 치환체는 예로서 다음에 열거한 기에서 선택한다:
할로겐, -OR', =0, =NR', =N-OR', -NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(0)R', -S(0)2NR'R", -NRSO2R', -CN 및 -NO2, -R', -N3, -CH(ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로 (C1-C4)알킬.
여기서, 방향족링계 상에서 0~개방가의 총수까지의 범위내에 있는 수임.
R', R", R"' 및 R""는 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴에서 독립하여 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 하나의 화합물이 1개 이상의 R기를 포함할 경우, 예로서 그 R기 각각은 이들 기 중 1개 이상이 존재할 때 각각의 R', R", R"' 및 R""와 같이 독립하여 선택한다. 다음의 제조공정(schemes)에서 부호 Ⅹ는 위에서와 같이 "R"을 나타낸다.
그 아릴 또는 헤테로아릴링의 인접원자 상에 치환기 중 2개는 식 -T-C(0)-(CRR')u-U-중 하나의 치환기로 선택치환시킬 수 있다. 여기서, T와 U는 독립하여 -NR-, -0-, -CRR'- 또는 하나의 단일결합이고, U은 0~3의 정수이다.
또, 그 아릴 또는 헤테로아릴링의 인접원자 상에서 치환기 중 2개는 식 -A-(CH2)r-B-의 하나의 치환기로 선택치환시킬 수 있다. 여기서, A와 B는 독립하여 -CRR'-, -0-, -NR-, -S-, -S(0)-, S(0)2-, -S(0)2NR'- 또는 하나의 단일결합이고, r은 1~4의 정수이다.
이와 같이 형성된 새로운 링의 단일결합 중 하나는 하나의 2중 결합으로 선택치환시킬 수 있다.
또, 그 아릴 또는 헤테로아릴링의 인접원자 상에서 치환기 중 2개가 식 -(CRR')z-X-(CR"R"')d-의 하나의 치환기로 선택치환시킬 수 있다. 여기서, z와 d는 독립하여 0~3의 정수이고, X는 -0-, -NR'-, -S-, -S(0), -S(0)2-, 또는 -S(0)2NR'-이다.
치환기 R, R', R" 및 R"'는 독립하여 수소 또는 치환 또는 비치환(C1-C6)알킬에서 선택하는 것이 바림직하다.
여기서 사용되는 용어 "헤테로원자"는 산소(0), 질소(N), 황(S) 및 실리콘(Si)을 포함하는 것을 의미한다.
여기서 사용된 인자(factor) Ⅶ펩티드는 인자(factor) Ⅶ 및 인자(factor) Ⅶa펩티드(peptides) 모두를 말한다.
이들의 용어는 부가(addition), 결실(deletion), 치환 및 융합 단백질 돌연변이체(protein mutants)를 포함하는 이들 펩티드의 변이체(variants) 및 돌연변이체(mutants)를 일반적으로 말한다.
인자 Ⅶ 및 인자 Ⅶa 모두가 사용될 경우 그 사용에서는 그 속(renus) "인자 Ⅶ 펩티드"의 2종(species)을 설명한 것이다.
본 발명에서는 여기서 설명한 화합물에서 확인된 특정치환기에 따라 비교적 비독성인 산과염기로 제조하는 본 발명의 화합물의 염을 포함한다.
본 발명의 화합물이 비교적 산성인 작용성을 포함할 경우, 염기부가염은 적합한 불활성 용매 중에서 또는 청정한 상태(neat)에서, 중성 형태의 본 발명 화합물을 충분한 양의 바람직한 염기와 접촉시켜 얻을 수 있다.
염기부가염의 예에는 소듐, 포타슘, 리튬, 칼슘, 암모늄, 유기아미노 또는 마그네슘염, 또는 하나의 유사염을 포함한다.
본 발명의 화합물이 비교적 염기성인 작용성을 포함할 경우, 산부가염은 적합한 불활성 용매 중에서 또는 청정한 상태에서 중성 형태의 본 발명 화합물을 충분한 양의 바람직한 산과 접촉시켜 얻을 수 있다.
산부가염의 예에는 염산, 보롬산, 질산, 카르본산, 모노히드로겐카르본산, 인산, 모노히드로겐인산, 디히드로겐인산, 황산, 모노히드로겐황산, 히드로요오드산 또는 아인산 등 무기산에서 유도된 염과, 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말로산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨릴술폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄술폰산 등 비교적 비독성인 유기산에서 유도된 염을 포함한다.
또, 아르기네이트 등 아미노산의 염과, 글루쿠론산 또는 갈락투노르산 등 유기산의 염을 포함한다[예로서, Berge 등, "Parmaceutical Salts" Journal of Parmaceutical Science 66:1-19(1977) 참조].
본 발명의 어느 특정 화합물에는 이들의 화합물이 염기부가염 또는 산부가염 중에 포함하도록 하는 염기성과 산성의 작용성 모두를 포함한다.
상기 중성형태의 화합물은 상기 염을 염기 또는 산과 접촉시켜, 모(parent) 화합물을 통상의 방법으로 분리하여 재생성하는 것이 바람직하다.
그 모형태(parent form)의 화합물은 극성용매 중에서의 용해도 등 어느 물성에서의 여러 가지의 염 형태와 다르다.
여기서 사용되는 "염반대이온"(salt counterion)은 구성성분 중 하나가 음전하를 가질 때(즉, COO-), 본 발명의 하나의 화합물과 회합하는 양전하 이온을 말한다.
염 반대이온의 예에는 H+, H3O+, 암모늄, 포타슘, 칼슘, 리튬, 마그네슘 및 소듐을 포함한다.
여기서, 사용되는 용어"CMP-SA-PEG"는 하나의 폴리에틸렌글리콜 성분으로 이루어진 하나의 시알산에 콘주게이팅(conjugating)되어 있는 하나의 시티딘 모노포스페이트 분자이다.
그 폴리에틸렌글리콜 사슬의 길이가 특정되어 있지 않을 경우, 어느 PEG사슬 길이라도 가능하다(즉, 1KDa, 2KDa, 5KDa, 10KDa, 20KDa, 30KDa, 40KDa). 하나의 예로서 CMP-SA-PEG는 스킴(scheme) 1에서 화합물 5이다.
Ⅰ. 발명의 개요( Introduction )
본 발명은 인자(Factor)Ⅶ의 재모델링(remodeling) 및 변형(modification)하는 하나의 방법을 포함한다.
혈액응고 경로(blood coagulation pathway)는 여러 가지 사건(events)으로 이루어진 하나의 복합 반응이다.
이 경로에서 하나의 중개사건(intermediate event)에는 조직인자(tissue factor)와 칼슘이온의 존재하에서 인자(Factor)Ⅹ를 인자 Ⅹa로 전환시켜(인자 Ⅷa로 활성화할 때) 혈액응고의 외인성 경로에 참가하는 하나의 프로엔자임(proenzyme)으로서 인자 Ⅶ이 있다.
그 다음으로, 인자 Ⅹa는 인자 Ⅴa, 칼슘이온 및 인지질(phospholipid)의 존재하에서 프로트롬빈(prothrombin)을 트롬빈(thrombin)으로 전환한다.
인자 Ⅹ의인자 Ⅹa로서의 활성화는 혈액응고의 내인성 및 외인성 경로 모두가 공유하는 하나의 사건이다.
따라서, 인자 Ⅷa는 인자 Ⅷ이 결핍되거나 억제되는 환자의 치료에 사용될 수 있다.
또, 인자 Ⅶa가 내인성 경로에 참가할 수 있다는 것을 나타낸 확인자료도 있어, 혈액응고에 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa의 역할에 대한 중요성이 현저하게 증대하였다.
인자 Ⅶ은 불활성(inactive) 지모겐(zymogen)으로서 혈액 중에서 순환하는 하나의 단일 사슬의 당단백질이다.
인자 Ⅶa의 대표적인 뉴클레오티드와 아미노 서열은 도 5에서 기재되어 있다.
인자 Ⅶ의 인자 Ⅶa로의 활성화는 인자 ⅩⅡa 등 수종의 다른 플라즈마 프로테아제(plasma proteases)에 의해 촉진시킬 수 있다.
인자 Ⅶ의 활성화는 인자 Ⅶ 펩티드 골격이 아스파라긴 152에서 절단(cleaved)될 경우 발생한다.
그 활성화 생성물, 인자 Ⅶa는 최소 하나의 디술피드 결합에 의해 함께 가진 하나의 H사슬(heavy chain)과 하나의 L사슬(light chain)로 이루어진 하나의 당단백질(glycoprotein)이다.
또, 인자 Ⅶa로 전환시킬 수 없는 변형 인자 Ⅶ 분자는 이미 설명한 바 있으며, 혈병(blood clots), 혈전증(thrombosis) 등의 경우 항응고 치료 구제(remedy)로 유용하다.
그 혈액응고 경로에서 인자 Ⅶ의 중요성과, 혈액응고의 증감 레벨 치료로서의 그 사용에 대하여 설명한 바와 같이, 생물학적 반감기가 더 긴 하나의 분자가 포텐시(potency)를 증가시키며, 일반적으로 건강한 사람의 인체 내에서 합성 및 분비될 때 야생형 인자 Ⅶ와 더 유사한 치료 프로필(profile)에 혈액응고 장애(질병)치료에 유효하고 유용하다.
인자 Ⅶ가 치료 적용에 있어서 하나의 중요하고 유용한 화합물이나 재조합 세포에서 인자 Ⅶ를 생성하는 현행 방법에서는 하나의 생성물(product)을 얻었으나, 그 생성물은 생물학적 반감기가 오히려 짧고, 잠재적으로 면역원성(immununogenicity)을 유도하는 글리코실화 패턴이 비최석화(non-optimal)되었으며, 기능이 상실되었고, 동일한 효과를 얻기 위하여 용량(does)을 더 자주 더 많이 사용할 필요성이 증대되는 등 여러 가지의 결점을 가진다.
치료용으로 사용되는 재조합 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa의 효과를 향상(개선)하기 위 하여, 본 발명에는 하나의 변형기를 가진 글리코실화 및 언글리코실화(unglycosylated) 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 콘주게이트(conjugates)를 제공한다.
그 변형기는 PEG(m-PEG), PPG(m-PPG) 등의 폴리머 변형기, 치료성분, 진단성분, 표적성분(targeting moieties) 등에서 선택할 수 있다.
수용성 폴리머 변형기로 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa를 변형(modification)하여, 환자의 혈액순환 중에 재조합 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa의 안정성과 보유시간을 향상(개선)시킬 수 있고, 또 재조합 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa의 항원성(antigenicity)을 감소할 수 있다.
본 발명의 펩티드 콘주게이트는 글리코실화 또는 언글리코실화 펩티드에 하나의 당을 효소에 의해 결합시켜 형성할 수 있다.
하나의 글리코실화 분위(site) 및/또는 하나의 변형 글리코실기는 하나의 변형기를 가진 하나의 변형당을 글리코 콘주게이션(glyco conjugation)에 의해 콘주게이팅 하는 하나의 부위(locus)를 제공한다.
또, 본 발명의 방법은 하나의 거의 균질성 있는 유도화 패턴을 가진 펩티드 콘주게이트와 글리코 펩티드 콘주게이트를 집합(assembling)할 수 있도록 한다.
본 발명에서 사용되는 효소는 그 펩티드의 하나의 특정 아미노산잔기, 아미노산잔기의 조합, 특정 글리코실잔기, 또는 글리코실잔기의 조합에 대하여 일반적으로 선택적이다.
또, 그 방법은 펩티드 콘주게이트의 대규모 생산에 실용적이다.
이와 같이, 본 발명의 방법은 균일한 유도체화 패턴을 사전에 선택한 펩티드 콘주게이트를 대규모로 제조하는 실용적 수단을 제공한다.
본 발명의 방법들은 세포배양 세포(즉, 포유동물세포, 곤충세포, 식물세포, 균세포, 효모세포 또는 원핵생물 세포) 또는 형질 전환식물 또는 동물 중에서 생산할 때 불충분하게 글리코실화 한 글리코 펩티드를 포함하나, 한정되지 않는 치료용 펩티드의 변형에 특히 적합하다.
그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 하나의 펩티드 콘주게이트와 하나의 의약적으로 허용할 수 있는 캐리어로 이루어진 의약제제로 제조할 수 있다.
그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 출혈사건이 있는 혈우병 환자, 혈우병 A환자, 혈우병 B환자, 인자 Ⅶ에 항체를 가진 혈우병 A환자, 인자 Ⅸ에 항체를 가진 혈우병 B환자, 간경변증 환자, 간이식 조직을 가진 간경변증 환자, 상부 위장관 출혈을 가진 간경변증 환자, 뼈 골수이식 환자, 간 절제 환자, 부분간 절제(partial hepatectomy) 환자, 골반-관절구 골절 재구성 실시중인 환자, 급성 뇌내출혈의 출혈 환자, 동종 줄기세포이식 환자, 외상성 뇌손상 출혈 환자, 응급시 출혈 환자, 외상(trauma) 출혈 환자, 바리실(variceal) 출혈 환자, 선택적 수술 출혈 환자, 심장수술 환자, 척수수술 출혈 환자, 간절제(liver resection) 환자의 군(group)에서 선택한 한명의 환자에 투여할 수 있다.
하나의 예에서 그 환자는 사람이다.
본 발명은 또 면역 또는 망상 내피계(reticuloendothelial system)(RES)에 의해 예로서 흡수율 감소 또는 클리어런스율(clearance rate) 감소 때문에 치료 반 감기를 증가시킨 글리코실화 및 언글리코실화 펩티드의 콘주게이트를 제공한다.
더욱이, 본 발명의 방법에는 펩티드 상에서 항원성 결정 인자를 차폐(masking)하여 그 펩티드에 대한 숙주 면역응답을 감소 또는 제거하는 수단을 제공한다.
또, 표적제의 선택적 결합을 사용하여 특정 표적제에 특이성이 있는 특정조직 또는 세포 수용체에 펩티드를 표적으로 정한다.
수용성 폴리머를 가진 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 콘주게이트의 제조에 대한 최적 조건 결정에는 여러 가지의 파라미터의 최적화가 포함한다.
이들의 파마미터는 그 펩티드와 수용성 폴리머의 동정(identity)에 따라 좌우한다.
예로서, 그 폴리머가 폴리(에틸렌 글리콜), 즉 하나의 분기 폴리(에틸렌 글리콜)인 경우, 반응에 사용되는 폴리머의 양과, 그 폴리머의 존재에 의한 반응 혼합액의 점도 사이에는 밸런스(balance)를 설정하는 것이 바람직하다. 그 폴리머가 너무 높게 농축될 경우 그 반응 혼합액은 점조성이 있어 반응 및 물질 절단속도를 느리게 한다.
더 나아가서, 과잉의 효소 첨가를 고려할 수 있으나, 효소가 너무 많이 존재할 경우 과잉의 효소는 하나의 오염물질이 되어, 그 제거에는 별도의 정제공정을 필요로 하여 최종 제품의 코스트를 불필요하게 증가시킨다.
또, 일반적으로 변형(modification)을 조정하여 펩티드를 생성하는 것이 바람직하다.
어느 예에서는 하나의 변형당을 우선적으로 첨가하는 것이 바람직하다.
또 다른 예에서는 2종의 변형당을 우선적으로 첨가하는 것이 바람직하다. 따라서, 그 반응조건은 펩티드에 변형기의 콘주게이션을 하는 정도에 영향을 주도록 조정하는 것이 바람직하다.
본 발명은 바람직한 레벨의 콘주게이션을 가진 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 수율을 극대화하는 조건을 제공한다.
또, 본 발명의 예에서의 조건들은 그 생성물을 정제하는데 필요한 시간과 재료, 여러 가지의 시약의 코스트를 고려할 필요가 있다.
여기서 설명한 반응조건을 최적화하여 고가시약의 소비를 최소화하면서 바람직한 생성물의 우수한 수율을 제공한다.
Ⅱ. 물질( matter )/펩티드 콘주게이트(peptide conjugates)의 조성물
제 1국면(aspect)에서, 본 발명은 하나의 변형당과 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶ a 펩티드 사이에 하나의 콘주게이트를 제공한다.
또, 본 발명은 하나의 변형기와 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 사이에 하나의 콘주게이트를 제공한다.
하나의 펩티드 콘주게이트는 수종 형태 중 하나를 가질 수 있다.
하나의 예에서, 하나의 펩티드 콘주게이트는 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드와 하나의 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드의 아미노산에 결합된 하나의 변형기로 구성할 수 있다.
또 다른 예에서, 하나의 펩티드 콘주게이트는 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티 드와, 하나의 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드의 글리코실잔기에 결합된 하나의 변형기로 구성할 수 있다.
또 하나의 다른 예에서, 그 펩티드 콘주게이트는 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드와, 하나의 글리코 펩티드 카르보히드레이트와 그 펩티드 골격의 아미노산 잔기에 모두 직접 결합되어 있는 하나의 글리코실 결합기로 구성할 수 있다.
또 하나의 예에서, 하나의 펩티드 콘주게이트는 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드와, 그 펩티드의 아미노잔기에 직접 결합되어 있는 하나의 변형기로 구성할 수 있다.
이 예에서, 펩티드 콘주게이트는 하나의 글리코실기로 구성할 수 없다. 이들 예 중 어느 예에서도, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 글리코실화 할 수 없다.
본 발명의 콘주게이트는 일반적으로 아래에 나타낸 일반 구조에 대응한다:
Figure 112008019904915-PCT00022
위 구조에서,
부호 a, b, c, d 및 s는 영(zero)이 아닌 양(+)의 정수이고,
부호 t는 0 또는 양(+)의 정수이다.
"처리제"(agent) 또는 변형기는 하나의 치료제, 하나의 바이오 활성제(bioaetive agent), 하나의 검출할 수 있는 라벨, 하나의 폴리머 변형기[수용성 폴리머(즉, PEG, m-PEG, PPG 및 m-PPG) 등] 등으로 할 수 있다.
그 "처리제" 또는 변형기는 하나의 펩티드, 즉 효소, 항체, 항원 등으로 할 수 있다.
그 링커(linker)는 범위가 넓은 링커 그룹(linker groups) 중 어느 하나로 할 수 있다(상기 참고문헌 참조).
또, 그 링커는 하나의 단일 결합 또는 하나의 "제로 오더 링커"(zero order linker)로 할 수 있다.
Ⅱ. A. 펩티드( peptide )
인자 Ⅶ는 길이가 약 406의 아미노산이고, 분자량이 약 50KDa인 하나의 단 사슬 폴리펩티드(single-chain polypeptide)이다.
인자 Ⅶ 펩티드 골격이 아스파라긴 152에서 절단(cleaving)될 때 인자 Ⅶa로 인자 Ⅶ의 전환이 발생한다. 인자 Ⅶ 및/또는 인자 Ⅶa 펩티드에는 2개의 N-글리칸 부위(sites)를 포함한다. 하나의 부위는 아스파라긴 145에서 위치가 설정되고, 다른 하나는 아스파라긴 322에서 위치가 설정된다.
아스파라긴 145에서의 N-글리칸 부위는 인자 Ⅶa의 L사슬(light chain) 상에 위치되고, 아스파라긴 322에서의 N-글리칸 부위는 인자 Ⅶa의 H사슬(heavy chain) 상에 위치된다.
인자 Ⅶ 및/또는 인자 Ⅶa 펩티드에는 2개의 O-글리칸 부위를 포함한다.
인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa는 클로닝(cloning) 하고, 시퀸싱(sequencing)(서열결정)을 한다.
하나의 예에서, 그 인자 Ⅶa 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 서열을 가진다.
본 발명은 여기서 설명한 인자 Ⅶ 핵산 및 아미노산 서열로 한정하는 것은 아니다.
변이시켜 특성을 증감하거나 펩티드의 구조 특성을 변형하는 다른 서열의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 사용은 본 발명의 범위내에 속한다.
예로서, 본 발명에서 유용한 변이체 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드에는 다른 위치에서 부가 O-글리코실화 부위 또는 상기 부위를 제공하는 펩티드를 포함한다.
더욱이, 하나 이상의 N-글리코실화 부위를 포함하는 변이체 펩티드는 본 발명에서 유용하다.
인자 Ⅶ의 변이체(variants)는 예로서 특허문헌 USP 4,784,950 및 USP 5,580,560 명세서에서 기재되어 있으며, 여기서 라이신-38, 라이신-32, 아르기닌-290, 아르기닌-341, 이소류신-42, 타이로신-278 및 타이로신-322가 다수의 아미노산에 의해 치환되어 있다.
또, 특허문헌 USP 5,861,374; USP 6,039,944; USP 5,833,982; USP 5,788,965; USP 6,183,743; USP 5,997,864 및 USP 5,817,788 명세서에서는 인자 Ⅶa를 형성하기 위하여 절단(cleaving)되지 않은 인자 Ⅶ 변이체에 대하여 기재되어 있다.
그 혈액응고 경로와 여기서의 인자 Ⅶ의 역할은 공지되어 있다는 것을 이 기술분야의 기술자들은 이해할 수 있다. 따라서, 위에서 설명한 바와 같이 다수의 변이체로서 천연 변이체와 처리 변이체 모두가 본 발명에 포함된다.
하나의 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 활성을 가진 하나의 펩티드는 여기서 설명 한 아미노산 서열에 대하여 최소 약 95%가 상동성인 하나의 아미노산 서열을 가진다.
그 아미노산 서열은 여기서 설명한 아미노산 서열에 대하여 최소 약 96%, 97% 및 98% 또는 99%가 상동성인 것이 바람직하다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합기 결합되어 있는 아미노산 잔기는 세린, 트레오닌 및 아스파라긴에서 선택한 하나의 멤버이다.
또 다른 예에서, 그 펩티드는 SEQ. ID. NO 2의 서열을 가진다.
또 다른 예에서, 그 아미노산 잔기는 Asn 145, Asn 322 및 그 조합에서 선택한 하나의 멤버이다.
또 다른 예에서, 그 펩티드는 하나의 바이오 활성(boiactive) 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드이다.
또 하나의 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트 상에서 그 변형당 및/또는 PEG 성분은 L사슬(light chain) 상에 위치한다.
또 다른 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트 상에서 그 변형당 및/또는 PEG 성분은 H사슬(heavy chain) 상에 주로 위치한다.
또 다른 예에서, 인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 하나의 개체군에서 그 L 사슬에는 하나의 변형당 및/또는 PEG 성분을 주로 포함한다.
또 다른 예에서, 인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 하나의 개체군에서 그 H사슬(heavy chain)에는 하나의 변형단 및/또는 PEG 성분을 주로 포함한다.
또 다른 예에서,그 개체군(population)에서 L사슬의 기능 화(functionalization) 비는 약 33:66이다.
또 다른 예에서, 그 개체군에서 L사슬:H사슬의 기능화 비는 약 35:65이다.
또 다른 예에서, 그 개체군에서 L사슬:H사슬의 기능화 비는 약 40:60이다.
또 다른 예에서, 그 개체군에서 L사슬:H사슬의 기능화 비는 약 45:55이다.
또 다른 예에서, 그 기능화 비는 약 50:50이다.
또 다른 예에서, 그 기능화 비는 약 55:45이다.
또 다른 예에서, 그 기능화 비는 약 60:40이다.
또 다른 예에서, 그 기능화 비는 약 65:35이다.
또 다른 예에서, 그 기능화 비는 약 66:33이다.
또 다른 예에서, 그 기능화 비는 약 70:30이다.
또 다른 예에서, 그 기능화 비는 약 75:25이다.
또 다른 예에서, 그 기능화 비는 약 80:20이다.
또 다른 예에서, 그 기능화 비는 약 85:15이다.
또 다른 예에서, 그 기능화 비는 약 90:10이다.
또 다른 예에서, 그 개체군에서 L사슬:H사슬의 기능화 비는 약 90:10 이상이다.
인자 Ⅶ/Ⅶa의 활성 측정방법과, 발현방법은 이 기술분야에서 공지되었으며, 예로서 특허문헌 USP 4,784,950 명세서에 기재되어 있다.
간단히 말하면, 인자 Ⅶ 또는 그 변이체의 발현은 바쿨로바이러스(baculovirus) 발현 시스템을 사용하는 에.콜리(E. coli), CHO 세포, BHK 세포, 곤충세포를 포함하여 원핵 시스템과 진핵 시스템 모두에서 얻을 수 있으며, 모두 이 기술분야에서 공지되었다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 활성에 대한 아세이(assay)는 이 분야에서 공지된 방법을 사용하여 얻을 수 있다.
하나의 비한정 예로서, 참고문헌[Quick 등, Hemorragic Disease and Thrombosis, 2nd ed. Leat Febiger, Philadelphia, 1996]에서는 본 발명의 방법에 의해 제조된 하나의 인자 Ⅶ 분자의 생물학적 활성 측정에 유용한 일단 응고 아세이(one-stage clotting assay)에 대하여 기재되었다.
본 발명에서 사용되는 펩티드는 그 다음 변형기가 아래에 나타낸 구조식인 경우 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa를 포함하나, 한정된 것은 아니다:
Figure 112008019904915-PCT00023
이들의 경우, 그 펩티드 콘주게이트에서 펩티드는 도 13의 펩티드에서 선택한 하나의 멤버이다.
이들의 경우, 그 펩티드 콘주게이트에서 그 펩티드는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅶa, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI, 하나의 펩티드(a peptide)에서 선택한 하나의 멤버이다.
여기서, 그 하나의 펩티드는 에리트로포이에틴(erythropoietin), 그라눌로사이트 콜로니(granulocyte colony) 자극 인자(G-CSF), 그라눌로사이트-마크로파아지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마,
Figure 112008019904915-PCT00024
1-앤티트립신(ATT, 또는
Figure 112008019904915-PCT00025
-1 프로테아제 억제제), 글루코세레브로시다아제, 티슈(tissue)-타입 플라스미노겐 액티베이터(TPA), 인터류킨-2(IL-2), 우로키나아제, 사람 DN 효소, 인슐린, 간염(Hepatitis) B 표면 단백질(HbsAg), 사람 성장 호르몬, TNF 리셉터-IgG Fc 부위 융합 단백질(Enbrel: 상품명), 앤티-HER2 모노클로날항체(Herceptin: 상품명), 레스피레이토리 신시티얼 바이러스(Respiratory Syncytial Vrius)(Synagis: 상품명)의 단밸질 F에 대한 모노클로날 항체, TNF-
Figure 112008019904915-PCT00026
(Remicade: 상품명)에 대한 모노클로날 항체, 글리코 프로테인 Ⅱb/Ⅲa(상품명 : Reopro)에 대한 모노클로날 항체, CD20(Rituxan: 상품명)에 대한 모노클로날 항체, 앤티-트롬빈Ⅲ(AT Ⅲ), 사람 코리온 고나도트로핀(human Chorionic Gonadotropin)(hCG), 알파-갈락토시다아제(Fabrazyme: 상품명), 알파-이두로니다아제(iduronidase) (Aldurazyme: 상품명), 여포자극 호르몬(follicle stimulating hormone), 베타-글루코시다아제, 앤티-TNF-알파 모노클로날 항체(MLB 5075), 글루카곤(gluagon) 형상 펩티드-1(GLP-1), 베타-글루코시다아제(MLB 5064), 알파-갈락토시다이제 A(MLB 5082) 및 섬유 아세포 증식 인자(fibroblast growth factor)에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 예에서, 그 폴리머 변형기는 아래에 나타낸 구조식에 의한 하나의 구 조를 가진다.
Figure 112008019904915-PCT00027
본 발명에서 사용된 펩티드는 그 변형기가 다음에 나타낸 구조식인 경우 인자 Ⅶ 또는 인자 Ⅶa를 포함하나, 한정되는 것은 아니다.
Figure 112008019904915-PCT00028
하나의 예로서, 상기 구조식에서 A1 및 A2는 각각 -OH와 -OCH3에서 선택한 멤버이다.
이 예에 의한 폴리머 변형기의 예는 다음 구조식을 포함한다.
Figure 112008019904915-PCT00029
그 변형기가 위에서 나타낸 것 등 하나의 분기 수용성 폴리머인 하나의 예에서, 사알리다아제의 농도가 반응 혼합 중에서 약 1.5 ~ 약 2.5 U/L인 것이 일반적으로 바람직하다.
시알리다아제의 양은 약 2U/L인 것이 더 바람직하다.
또 다른 예에서, 펩티드 기재 약 5 ~ 약 9gr을 위에서 설명한 시알리다아제의 양과 접촉한다.
그 변형당은 그 반응 혼합액 중에서 약 1gr ~ 약 6gr, 바람직하게는 약 3gr ~ 약 4gr이 존재한다.
하나의 분기 수용성 폴리머 변형기, 즉 위에서 나타낸 성분을 가진 하나의 변형당의 농도를 약 0.5mM 미만에서 유지하는 것이 일반적으로 바람직하다.
하나의 바람직한 예에서, 그 변혀기는 분자량 약 20KDa ~ 약 60KDa, 더 바람직하게는 약 30KDa ~ 약 50KDa, 좀더 바람직하게는 약 40KDa를 가진 분기 폴리(에틸렌 글리콜)이다.
분자량 약 40KDa를 가진 하나의 예의 변형기는 약 35KDa ~ 약 45KDa의 분자량을 가진 변형기이다.
위에서 설명한 변형기를 사용하는 하나의 바람직한 예에서, 그 글리코실전이효소의 농도에 있어서는 글리코실전이효소와 펩티드의 비가 전이효소 약 40㎍/mL 대 펩티드 약 200μM이다.
Ⅱ. B. 변형당( modified sugar )
하나의 예에서, 본 발명의 펩티드는 하나의 변형당과 반응함으로써 하나의 펩티드 콘주게이트를 형성한다.
하나의 변형당은 하나의 "당 도너성분"(sugar donor moiety)과 하나의 "당 트랜스퍼성분"(sugar transfer moiety)으로 이루어진다.
그 당 도너성분은 본 발명의 하나의 콘주게이트로서, 하나의 글리코실성분 또는 아미노성분에 의해 그 펩티드에 결합되어 있는 변형당의 어느 부분이다.
그 당 도너성분에는 그 펩티드 콘주게이트의 변형당에서 글리코실 결합기로 전환(conversion)할 때 화학적으로 변화하는 원자들(atoms)을 포함한다.
상기 당 트란스퍼(transfer)성분은 본 발명의 하나의 콘주게이트로서 그 펩티드에 결합되지 않은 변형당의 어느 부분이다.
예로서, 본 발명의 하나의 변형당은 페질화당 뉴클레오티드(PEGylted sugar nucleotide), PEG-시알산 CMP이다.
PEG-시알산 CMP에 있어서, 그 당 도너성분 또는 PEG-시알릴 도너성분은 PEG-시알산으로 이루어진 것이며, 반면에 당 트란스퍼성분 또는 시알릴 트란스퍼성분은 CMP로 이루어진 것이다.
본 발명에서 유용한 변형당에서, 그 사카릴성분은 하나의 사카리드, 하나의 데옥시-사카리드, 하나의 아미노-사카리드 또는 하나의 N-아실 사카리드가 바람직하다.
그 용어 "사카리드"(saccharide) 및 그 등가 화합물, "사카릴", "당"(sugar) 및 "글리코실"은 모노머, 디머(dimers), 올리고머 및 폴리머이다.
또, 그 당 성분은 하나의 변형기로 기능화한다.
그 변형기는 사카릴성분에 일반적으로 그 당(sugar) 상에서 하나의 아민, 술프히드릴 또는 히드록실, 즉 1급 히드록실성분과의 콘주게이션(conjugation)을 통해, 콘주게이팅(conjugating)된다.
하나의 예에서, 그 변형기는 그 당(sugar) 상에서 하나의 아민성분을 통해, 즉 그 변형기의 하나의 반응성 유도체와 그 아민의 반응으로 형성되는 하나의 아미드, 하나의 우레탄 또는 하나의 우레아를 통해 결합된다.
어느 사카릴 성분이라도 그 변형당의 당 도너성분으로 사용할 수 있다.
그 사카릴 성분은 만노오스, 갈락토오스 또는 글루코오스 또는 하나의 공지된 당의 입체 화학적 특성을 가진 종(species) 등 하나의 공지된 당(known sugar)으로 할 수 있다.
이들의 변형당의 일반 구조식은 다음의 구조식에서 나타낸다:
Figure 112008019904915-PCT00030
본 발명의 조성물의 형성에 유용한 다른 사카릴 성분에는 푸코오스 및 시알산과, 글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, 시알산의 5-아민 아날로그 등의 아미노당을 포함하나, 한정된 것은 아니다.
그 사카릴 성분은 자연에서 발견되는 하나의 구조체로 할 수 있고, 또 변형시켜 변형기를 콘주게이팅하는 하나의 부위(site)를 제공할 수 있다.
예로서, 그 변형당은 9-히드록시 성분을 하나의 아민으로 치환하는 하나의 시알산 유도체를 제공한다.
그 아민은 하나의 선택된 변형기의 활성화 아날로그로 용이하게 유도시킨다.
본 발명에서 유용한 변형당의 예는 여기서 참고로 인용하는 특허문헌 PCT 특허출원 PCT/US05/002522의 명세서에 기재되어 있다.
또 하나의 예에서, 본 발명은 위에서 설명한 바와 같이 하나의 링커-변형기 카세트(cassette)를 가진 그 대응하는 아민성분으로 그 6-히드록실 위치를 전환시키는 변형당을 사용한다.
이들의 변형당의 코어(core)로서 사용할 수 있는 대표적인 글리코실기에는 Gal, GalNAc, Glc, GlcNAc, Fuc, Xyl, Man 등을 포함한다.
이 예에 의한 하나의 대표적인 변형당은 아래에 나타낸 구조식을 가진다.:
Figure 112008019904915-PCT00031
위 구조식에서,
R11-R14는 H, OH, C(O)CH3, NH 및 NHC(O)CH3에서 독립하여 선택한 멤버이며,
R10은 또 다른 글리코실 잔기(-O-글리코실) 또는 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드(-NH-(인자 Ⅶ/인자 Ⅶa)의 하나의 아미노산에의 하나의 결합이고,
R14는 OR1, NHR1 또는 NH-L-R1이다.
R1 및 NH-L-R1은 위에서 설명한 것과 같다.
Ⅱ. C. 글리코실 결합기( glycosyl linking g roups )
하나의 예에서, 본 발명은 본 발명의 하나의 변형당과 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 사이에 합성된 하나의 펩티드 콘주게이트를 제공한다.
또 다른 예에서, 그 변형당에서의 변형기가 다음에 나타낸 구조식을 가질 경우,
Figure 112008019904915-PCT00032
그 펩티드 콘주게이트에서의 펩티드는 도 13의 펩티드에서 선택한 하나의 멤버이다.
또 다른 하나의 예에서, 그 펩티드 콘주게이트에서의 펩티드가 인자(Factor)Ⅶ, 인자(Factor)Ⅶa, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 그라눌로사이트 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor)(G-CSF), 그라눌로사이트-마크로파아지(Granulocyte-Macrophage) 자극인자(Stimulating Factor)(GM-CSF), 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase), 조직-타입 플라스미노겐 액티베이터(Tissue-Type Plasminogen Activator)(TPA), 인터류킨(Interleukin)-2(IL-2), 우로키나아 제(urokinase), 사람 DN효소(human DNase), 인슐린, 간염 B 표면 단백질(Hepatitis B surface protein)(HbsAg), 사람 성장호르몬, TNF 리셉터(Receptor)-IgGFc 부위 융합 단백질(fusion protein)(상품명: Enbrel), 앤티(anti)-HER2 모노클로날항체(monoclonal antibody)(Hercepting 상품명), 레스피레이토리 신시티얼 바이러스(Respiratory Syncytial Virus)(상품명: Synagis)의 단백질 F에 대한 모노클로날항체, TNF-
Figure 112008019904915-PCT00033
(상품명: Remicade)에 대한 모노클로날항체, 글리코프로레인(glycoprotein)Ⅱb/Ⅲa(상품명: Reopro)에 대한 모노클로날항체, CD20(Rituxan: 상품명)에 대한 모노클로날항체, 앤티-트롬빈(anti-thrombin)Ⅲ(AT Ⅲ), 사람 코리온고나도트로핀(human Chorionic Gonadotropin(hCG), 알파-갈락토시다아제(Fabrazyme: 상품명), 알파-이두로니다아제(iduronidase)(Aldurazyne: 상품명), 여포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone), 베타-글루코시다아제, 앤티-TNF-알파 모노클로날항체(HLB 5075), 글루카곤(glucagon)형상 펩티드-1-(GLP-1), 베타-글루코시다아제(MLB 5064), 알파-갈락토시다아제 A(MLB 5082) 및 섬유 아세포 증식 인자(fibroblast growth factor)에서 선택한 하나의 멤버이다.
이 예에서, 그 변형당의 당 도너성분(사카릴 성분 및 변형기 등)은 하나의 "글리코실 결합기"이다.
그 "글리코실 결합기"는 그 펩티드와 그 변형기 사이에 설정되어 있는 글리코실 성분으로 할 수 있다.
하나의 예에서, 그 폴리머 변형기는 다음에 나타낸 구조식에 의한 하나의 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00034
하나의 예에서, 그 변형당 상의 변형기는 아래에 나타낸 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00035
하나의 예에서, A1 및 A2는 각각 -OH 및 -OCH3에서 선택한 멤버이다.
이 예에 의한 폴리머 변형기는 아래에 나타낸 구조들을 포함한다:
Figure 112008019904915-PCT00036
하나의 펩티드 상에서 글리코실를 부가 및/또는 변형하는데 유용한 방법의 적용이 광범위하기 때문에 그 글리코실 결합기는 실질상 어느 구조라도 가질 수 있다.
다음에 이어지는 설명에서, 본 발명은 푸라노오스 및 피라노오스의 선택된 유도체의 사용에 대하여 참고로 설명한다.
그 설명의 요지를 명백하게 하여, 설명한 구조와 조성물이 글리코실 결합기와 변형당의 종류에 따라 일반적으로 적용할 수 있다는 것을 이 분야의 기술자들은 이해할 수 있다.
그 글리코실 결합기는 실질상 어느 모노-또는 올리고-사카리드라도 구성할 수 있다.
그 글리코실 결합기는 그 측쇄 또는 그 펩티드 골격을 통해 하나의 아미노산에 결합할 수 있다.
또, 그 글리코실 결합기는 하나의 사카릴 성분을 통하여 그 펩티드에 결합할 수 있다.
이 사카릴 성분은 그 펩티드 상에서 O-결합 또는 N-결합 글리칸 구조의 일부분으로 할 수 있다.
하나의 예에서, 본 발명은 다음에 나타낸 구조식(Ⅰ및Ⅱ)에서 선택한 하나의 구조식을 가진 하나의 무손상(intact) 글리코실 결합기로 이루어진 하나의 펩티드 콘주게이트를 제공한다.
Figure 112008019904915-PCT00037
위 구조식 Ⅰ에서, R2는 H, CH2OR7, COOR7또는 OR7이고, 여기서 R7은 H, 치환 또는 비치환 알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬이다.
COOR7이 하나의 카르복실산 또는 카르복실레이트인 경우 두 가지 형태가 단일 구조 COO- 또는 COOH의 설정에 의해 나타낸다.
위 구조식 Ⅰ및Ⅱ에서, 부호 R3, R4, R5, R6 및 R6'는 독립하여 H, 치환 또는 비치환 알킬, OR8, NHC(O)R9를 나타낸다.
지수 d는 0 또는 1이다.
R8 및 R9는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 시알산 또는 폴리시알산에서 독립하여 선택한다.
R3, R4, R5, R6 또는 R6' 중 최소 하나에는 하나의 변형기를 포함한다.
이 변형기는 하나의 결합(bond) 또는 하나의 결합기를 통해 결합된 하나의 폴리머 변형 성분, 즉 PEG로 할 수 있다.
하나의 예에서, 결합되어 있는 탄소를 함께 가진 R6 및 R6'는 시알산의 피루빌 측쇄의 성분이다.
또 다른 예에서, 결합되어 있는 탄소를 함께 가진 R6 및 R6'는 시알산의 측쇄 성분이며, 그 폴리머 변형기가 R5의 하나의 성분이다.
하나의 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 구조식을 가진 하나의 글리코실 결합기를 사용한다.
Figure 112008019904915-PCT00038
위 구조식에서,
J는 하나의 글리코실 성분이고,
L은 하나의 결합 또는 하나의 링커(linker)이고,
R1은 하나의 변형기, 즉 폴리머 변형기이다.
대표적인 결합(bonds)은 글리코실 성분 상에서 하나의 NH2 성분과 그 변형기 상에서 상보 반응성의 하나의 기 사이에 형성되어 있는 결합이다.
예로서, R1은 하나의 카르복실산 성분을 포함할 경우, 그 구조 NHC(O)R1를 가진 하나의 결합을 제공하는 글리코실잔기 상에서 NH2 성분과 활성화하여 결합할 수 있다.
J는 그 피라노오스 또는 푸라노오스 구조를 절단하는 상태, 즉 산화상태, 즉 소듐 퍼아이오데이트의 노출에 의해 분해되지 않거나 "무손상"(intact)인 하나의 글리코실 성분이 바람직하다.
대표적인 링커(linkers)에는 알킬 및 헤테로알킬 성분이 있다. 그 링커에는 결합기, 예로서 아실계 결합기, 즉 -C(O)NH-, -OC(O)NH- 등을 포함한다.
그 결합기는 본 발명의 종들(species)의 성분들 사이, 즉 글리코실 성분과 그 링커(L)의 사이 또는 그 링커와 그 변형기(R1) 사이에서 형성된 결합이다.
다른 대표적인 결합기는 에테르, 티오에테르 및 아민이다.
예로서, 하나의 예에서는 그 링커가 하나의 글리신잔기 등 하나의 아미노산잔기이다.
그 글리신의 카르복실산 성분은 그 글리코실잔기 상에서 하나의 아민과의 반응에 의해 그 대응하는 아미드로 전환되고, 그 글리신의 아민은 그 변형기의 하나의 활성화 카르복산 또는 카르보네이트와의 반응에 의해 그 대응한 아미드 또는 우레탄으로 전환된다.
NH-L-R1의 하나의 대표적인 종(species)은 다음 식을 가진다:
-NH{C(O)(CH2)aNH}s{C(O)(CH2)b(OCH2(CH2)cO(CH2)dNH}tR1
위 식에서,
지수 s 및 t는 각각 독립하여 0 또는 1이다.
지수 a, b 및 d는 각각 독립하여 0 ~ 20의 정수이다.
지수 c는 1 ~ 2500의 정수이다.
다른 유사한 링커는 하나의 -NH 성분이 또 다른 기, 예로서 -S, -O 또는 CH2에 의해 치환되는 종들(species)을 기재로 한다.
지수 s 및 t에 상당하는 하나 이상의 괄호내 성분은 하나의 치환 또는 비치환 알킬 또는 헤테로알킬 성분과 치환된다는 것을 이 기술분야의 기술자들은 이해 할 수 있다.
더 구체적으로 말하면, 본 발명은 NH-L-R1이 아래에 열거한 식인 화합물을 이용한다:
Figure 112008019904915-PCT00039
및 NHR1
이들의 식에서, 지수 a, b 및 d는 정수 0 ~ 20, 바람직하게는 1 ~ 5에서 선택한다.
그 지수 c는 1 ~ 약 2500의 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, 지수 c는 PEG 성분이 약 1KD, 5KD, 10KDM 15KD, 20KD, 25KDM 30KDM 35KDM 40KD 또는 45KD가 되도록 선택한다.
간편하게 하기 위하여, 이 섹션(section)의 나머지 부분에서 글리코실 결합기는 하나의 시알릴 성분을 기재로 한다.
그러나, 만노실, 갈락토실, 글루코실 또는 푸코실 등 또 다른 글리코실 성분은 시알릴 성분 대신 사용할 수 있다는 것을 이 분야의 기술자들은 이해할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 그 글루코실 결합기는 하나의 무손상(intact) 글리코실 결합기이며, 그 무손상 글리코실 결합기에서는 그 글리코실 성분 또는 그 결합기의 형성성분이 화학적 프로세스(즉, 소듐 메타퍼아이오데이트) 또는 효소 프로세스(즉, 산화효소)에 의해 분해되지 않는다.
본 발명의 선택된 콘주게이트에는 하나의 아미노-시카리드의 아민 성분, 즉 만노사민, 글루코사민, 갈락토사민, 시알산 등에 결합되어 있는 하나의 변형기를 포함한다.
이 발명의 주 구성에 의한 대표적인 변형기-무손상 글리코실 결합기 카세트(cassettes)는 아래에 나타낸 구조식을 가진 구조체 등 하나의 시알산 구성체를 기재로 한다:
Figure 112008019904915-PCT00040
위 구조식에서, R1 및 L은 위에서 설명한 내용과 같다.
대표적인 R1기의 구조에 대한 더 구체적인 설명은 아래에서 기술한다.
또 다른 예에서, 그 콘주게이트는 하나의 펩티드와, 변형당의 6-탄소 위치에서 하나의 링커를 통해 그 변형기가 결합되어 있는 하나의 변형당 사이에 형성된다.
이와 같이, 이 예에 의한 글리코실 결합기는 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00041
위 식에서,
래디컬은 위에서 설명한 내용과 같다.
글리코실 결합기에는 한정함이 없이 글루코오스, 글루코사민, N-아세틸-글루코사민, 갈락토오스, 갈락토사민, N-아세틸-갈락토사민, 만노오스, 만노사민, N-아세틸-만노사민 등이 있다.
하나의 예에서, 본 발명은 아래의 구조식으로 나타낸 글리코실 결합기로 이루어진 하나의 펩티드 콘주게이트를 제공한다.
Figure 112008019904915-PCT00042
위 구조식에서,
D는 -OH와 R1-L-NH-에서 선택된 하나의 멤버이고,
G는 H와 R1-L- 및 -C(O)(C1-C6) 알킬에서 선택된 하나의 멤버이며,
R1은 하나의 직쇄 또는 분기 폴리(에틸렌 글리콜)잔기로 이루어진 하나의 성분이고,
L은 하나의 링커, 즉 하나의 결합("제로오더":zero order), 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로 알킬이다.
대표적 예에서, D가 OH일 때, G는 R1-L-이고, G가 -C(O)(C1-C6) 알킬일 때 D는 R1-L-NH이다.
하나의 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 구조식을 가진 글리코실 결합기로 이루어진 하나의 펩티드 콘주게이틀 제공한다.
Figure 112008019904915-PCT00043
위 구조식에서,
D는 -OH와 R1-L-HN-에서 선택된 하나의 멤버이고,
G는 R1-L 및 -C(O)(C1-C6) 알킬-R1에서 선택된 하나의 멤버이며,
R1은 하나의 직쇄 폴리(에틸렌 글리콜)잔기와 분기 폴리(에틸렌 글리콜)잔기에서 선택된 하나의 멤버이고,
M은 H, 하나의 염 반대이온 및 하나의 단일 음전하에서 선택된 멤버이며,
L은 하나의 결합, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 링커이다.
하나의 대표적 예에서, D가 OH일 때, G는 R1-L이다.
또 다른 대표적 예에서, G가 -C(O)(C1-C6) 알킬일 때 D는 R1-L-NH-이다.
본 발명의 어느 화합물에서, 하나의 COOH 기는 변형하여 COOM으로 할 수 있다. 여기서 M은 H, 하나의 음전하와 하나의 염 반대이온에서 선택된 하나의 멤버이다.
본 발명은 아래에 나타낸 구조식을 가진 하나의 글리코실 결합기를 포함하는 하나의 펩티드 콘주게이트를 제공한다.
Figure 112008019904915-PCT00044
다른 예에서, 그 글리코실 결합기는 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00045
위 구조식에서, 지수 t는 0 또는 1이다.
또 다른 대표적 예에서, 그 글리코실 결합기는 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00046
위 구조식에서, 지수 t는 0 또는 1이다.
하나의 또 다른 예에서, 그 글리코실 결합기는 아래에 나타낸 구조식을 가진 다:
Figure 112008019904915-PCT00047
위 구조식에서,
지수 p는 1 ~ 10의 정수를 나타내며,
지수 a는 0 또는 1이다.
또 다른 대표적 예에서, 그 펩티드 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 글리코실 성분으로 이루어진다:
Figure 112008019904915-PCT00048
Figure 112008019904915-PCT00049
Figure 112008019904915-PCT00050
Figure 112008019904915-PCT00051
Figure 112008019904915-PCT00052
Figure 112008019904915-PCT00053
Figure 112008019904915-PCT00054
Figure 112008019904915-PCT00055
Figure 112008019904915-PCT00056
Figure 112008019904915-PCT00057
Figure 112008019904915-PCT00058
Figure 112008019904915-PCT00059
Figure 112008019904915-PCT00060
위 구조식에서,
지수 a와 링커 La는 위에서 설명한 내용과 같다.
지수 p는 1 ~ 10의 정수이다.
지수 t와 a는 독립하여 0 또는 1에서 선택한다.
이들 기의 각각은 위에서 설명한 모노, 비, 트리 및 테트라-안테나형상 사카리드 구조체의 성분으로 포함할 수 있다.
AA는 그 펩티드의 하나의 아미노산 잔기이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 PEG 성분은 분자량 약 20KDa를 가진다.
다른 하나의 대표적인 예에서, 그 PEG 성분은 분자량 약 5KDa를 가진다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 PEG 성분은 분자량 약 10KDa를 가진다.
또 다른 하나의 대표적인 예에서, 그 PEG 성분은 분자량 약 40KDa를 가진다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 시스테인 잔기를 기재로 한 하나의 분기 SA-PEG-10KDa 성분이며, 1개 또는 2개의 이들의 글리코실 결합기는 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
또 다른 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 라이신 잔기를 기재로 한 하 나의 분기 SA-PEG-10KDa 성분이고, 1개 또는 2개의 이들 글리코실 결합기가 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 시스테인 잔기를 기재로 한 하나의 분기 SA-PEG-10KDa 성분이고, 1개 또는 2개의 이들 글리코실 결합기가 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 라이신 잔기를 기재로 한 하나의 분기 SA-PEG-10KDa 성분이고, 1개 또는 2개의 이들 글리코실 결합기가 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 시스테인 잔기를 기재로 한 하나의 분기 SA-PEG-5KDa 성분이고, 1, 2 또는 3개의 이들 글리코실 결합기가 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 라이신 잔기를 기재로 한 하나의 분기 SA-PEG-5KDa 성분이고, 1, 2 또는 3개의 이들 글리코실 결합기가 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 시스테인 잔기를 기재로 한 하나의 분기 SA-PEG-40KDa 성분이고, 1개 또는 2개의 이들 글리코실 결합기가 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 라이신 잔기를 기재로 한 하나의 분기 SA-PEG-40KDa 성분이고, 1개 또는 2개의 이들 글리코실 결합기가 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
하나의 예에서, 본 발명의 하나의 글리코페질화 펩티드(glycoPEGylated peptide) 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한다:
Figure 112008019904915-PCT00061
위 구조식에서, 지수 t는 0 ~ 1의 정수이고,
지수 p는 1 ~ 10의 정수이다.
부호 R15는 H, 0H(즉, Gal-OH), 하나의 시알릴 성분, 하나의 시알릴 결합기 [즉, 시알릴 결합기-폴리머 변형기(Sia-L-R1), 또는 하나의 폴리머 변형 시알릴 성분(즉, Sia-Sia-L-R1)("Sia-Siap")를 결합하는 하나의 시알릴 성분]을 나타낸다.
대표적인 폴리머 변형 사카릴 성분은 식Ⅰ및 Ⅱ에 의한 하나의 구조를 가진다.
본 발명의 하나의 대표적인 펩티드 콘주게이트에는 식Ⅰ또는 Ⅱ에 의한 하나의 구조를 포함하는 하나의 R15'를 가진 최소 하나의 글리칸을 포함한다.
개방가(open valence)를 가진 식Ⅰ및 Ⅱ의 산소는 하나의 Gal 또는 GalNAc 성분의 하나의 탄소에 하나의 글리코시드 결합을 통해 결합하는 것이 바람직하다.
하나의 또 다른 예에서, 그 산소는 하나의 갈락토오스 잔기의 위치 3에서 탄소에 결합되어 있다.
하나의 대표적인 예에서, 그 변형 시알산은 그 갈락토오스 잔기에
Figure 112008019904915-PCT00062
2, 3-결합되어 있다.
또 다른 예에서, 그 시알산은 그 갈락토오스 잔기에
Figure 112008019904915-PCT00063
2, 6-결합되어 있다.
하나의 대표적인 예에서, 그 시알릴 결합기는 하나의 폴리머 변형 시알릴 성분(즉, Sia-Sia-L-R1)("Sia-Siap")을 결합하는 하나의 시알릴 성분이다.
여기서, 그 글리코실 결합기는 아래에 나타낸 바와 같이 하나의 시알릴 성분을 통하여 하나의 갈락토실 성분에 결합되어 있다:
Figure 112008019904915-PCT00064
본 발명의 상기 주요구성에 의한 하나의 대표적인 종(species)은 Sia-Sia 결합, 즉 CST-Ⅱ, ST8Sia-Ⅱ 및 ST8Sia-Ⅳ을 형성하는 하나의 효소를 사용하여 하나의 글리칸의 말단 시알산에 Sia-L-R1을 콘주게이팅 함으로 제조한다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 펩티드 콘주게이트 상에서의 글리칸은 아래에 나타낸 그룹(group)에서 선택한 하나의 구조식 및 그 조합을 가진다.
Figure 112008019904915-PCT00065
상기 구조식 각각에서, R15'는 위에서 설명한 것과 같다.
더욱이, 하나의 대표적인 본 발명의 펩티드 콘주게이트에는 구조식Ⅰ또는 Ⅱ에 의한 하나의 구조를 R15 성분이 최소 하나의 글리칸을 포함한다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 글리코실 결합기는 아래에 나타낸 구조식을 가진 최소 하나의 글리콜 결합기를 구성한다:
Figure 112008019904915-PCT00066
위 식에서,
R15은 상기 시알릴 결합기이고, 그 지수 p는 1 ~ 10에서 선택한 정수이다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합 성분은 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00067
위 식에서,
지수 b는 0과 1의 정수이다.
지수 s는 1 ~ 10의 정수이다. 지수 f는 1 ~ 2500의 정수이다.
하나의 예에서, 그 폴리머 변형기는 PEG이다.
또 다른 예에서, 그 PEG 성분은 분자량 약 20KDa를 가진다.
또 다른 예에서, 그 PEG 성분은 분자량 약 5KDa를 가진다.
또 다른 예에서, 그 PEG 성분은 분자량 약 10KDa를 가진다.
또 다른 예에서, 그 PEG 성분은 분자량 약 40KDa를 가진다.
또 다른 예에서, 그 글리코실 결합기는 Asn145, Asn322, Ser52, Ser60 또는 그 조합에 결합되어 있다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 선상 SA-PEG-10KDa 성분이며, 1개 또는 2개의 이들 글리코실 결합기가 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
또 다른 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 선상 SA-PEG-20KDa 성분이고, 1개 또는 2개의 이들 글리코실 결합기가 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 선상 SA-PEG-5KDa 성분이고, 1개, 2개 또는 3개의 이들 글리코실 결합기가 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
하나의 예에서, 그 글리코실 결합기는 하나의 선상 SA-PEG-40KDa 성분이고, 1개 또는 2개의 이들 글리코실 결합기가 그 펩티드에 공유 결합되어 있다.
또 다른 예에서, 그 글리코실 결합기는 다음 구조식을 가진 하나의 시알릴 결합기이다:
Figure 112008019904915-PCT00068
또 다른 예에서, Q는 H와 CH3에서 선택된 하나의 멤버이다.
또 다른 예에서, 상기 글리코실 결합기는 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00069
위 식에서,
R15는 상기 시알릴 결합기이고, 지수 p는 1 ~ 20에서 선택된 정수이다.
하나의 예에서,그 글리코실 결합기는 아래에 나타내 구조식으로 이루어진다.
Figure 112008019904915-PCT00070
위 식에서, 지수 b는 0 및 1에서 선택한 정수이다.
하나의 예에서, 그 지수 s는 1이고, 그 지수 f는 약 200 ~ 약 300에서 선택한 정수이다.
또 다른 예에서, 그 글리코실 결합기는 SA-PEG-10KDa와 SA-PEG-20KDa에서 선택한 하나의 멤버이고, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드에 공유 결합되어 있는 상기 글리코실 결합기의 수는 1 ~ 2에서 선택된 정수이다.
또 다른 예에서, 그 글리코실 결합기는 SA-PEG-5KDa와 SA-PEG-40KDa에서 선택한 하나의 멤버이고, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드에 공유 결합되어 있는 상기 글리코실 결합기의 수는 1 ~ 3에서 선택한 정수이다.
Ⅱ. D. 변형기( modifying groups )
본 발명의 펩티드 콘주게이트는 하나의 변형기로 이루어진다.
이 변형기는 하나의 아미노산 또는 하나의 글리코실 결합기에 의해 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드에 공유 결합할 수 있다.
또 다른 예에서, 그 변형기가 아래에 나타낸 구조식일 때,
Figure 112008019904915-PCT00071
그 펩티드 콘주게이트에서의 펩티드가 도 13에서의 펩티드로부터 선택된 하 나의 멤버이다.
또 다른 예에서, 그 펩티드 콘주게이트에서의 펩티드는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅶa, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI, 에리트로포이에틴, 그라눌로사이트콜로니 자극 인자(G-CSF), 그라눌러사이트-마크로파아지콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마,
Figure 112008019904915-PCT00072
1-앤티트립신(ATT, 또는
Figure 112008019904915-PCT00073
-1 프로테아제 억제제), 글루세레브로사다아제, 리슈(tissue)-타입 플라스미노겐 액티베이터(plasminogen Activator)(TPA), 인터류킨-2-(IL-2), 우로키나아제(urokinase), 사람 DN효소, 인슐린, 감염 B 표면 단백질(HbsAg), 사람 성장호르몬, TNF 리셉터-IgFc 부위 융합 단백질(Enbrel: 상품명), 앤티-HER2 모노클로날항체(Herceptin: 상품명), 레스피레이로토리 신시티얼바이러스(synagis: 상품명)의 단백질 F에 대한 모노클로날항체, TNF-
Figure 112008019904915-PCT00074
(Remicade: 상품명)에 대한 모노클로날항체, 글리코 프로테인 Ⅱb/Ⅲb(Reopro: 상품명)에 대한 모노클로날항체, CD20(Rituxan: 상품명)에 대한 모노클로날항체, 앤티-트롬빈(anti-thrombin)Ⅲ(AT Ⅲ), 사람 코리온 고나도트로핀(human Chorionic Gonadotropin)(hCG), 알파-갈락토시다아제(Fabrazume: 상품명), 알파-이두로니다아제(iduronidase)(Aldurazyme: 상품명), 여포(follicle)자극 호르몬, 베타-글루코시다아제, 앤티-TNF-알파 모노클로날항체(MLB 5075), 글루카콘(glucagon)형상 펩티드-1(GLP-1), 베타-클루코시다아제(MLB 5064), 알파-갈락토시다아제 A(MLB 5082) 및 섬유 아세포 증식 인자에서 선택한 하나의 멤버이다.
"변형기"(modifying groups)에는 표적성분, 치료성분, 바이오분자(biomolecules)를 포함하는 여러 가지의 구조를 포함할 수 있다.
또, "변형기"에는 폴리머 변형기를 포함하며, 이들의 폴리머 변형기는 바이오(bio) 이용율(vioavailability) 또는 생체의 반감기 등 펩티드의 특성을 변경할 수 있는 폴리머이다.
하나의 예에서, 그 폴리머 변형기는 다음에 나타낸 구조식에 의한 하나의 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00075
상기 구조식에 의한 또 다른 예에서, 그 폴리머 변형기는 아래에 나타낸 구조식에 의한 하나의 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00076
하나의 예에서, A1 및 A2는 각각 -OH 및 -OCH3에서 선택한 멤버이다.
이 예에 의한 대표적인 폴리머 변형기는 아래에 나타낸 구조식을 포함한다:
Figure 112008019904915-PCT00077
간단하게 하기 위하여, 이 센션의 잔부(remander)에서 변형기는 수용성 및 수불용성 폴리머 등 폴리머 변형기를 주로 기재로 한다.
그러나, 표적성분, 치료성분 및 바이오분자 등 다른 변형기를 그 폴리머 변형기 대신 사용할 수 있다는 것을 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.
Ⅱ. D. i. 변형기(modifying groups)의 링커( linkers)
그 변형기의 링커는 그 변형기(즉, 폴리머 변형기, 표적성분, 치료성분, 바이오분자)를 그 펩티드에 결합하는데 사용한다.
하나의 예에서, 그 폴리머 변형기는 일반적으로 하나의 헤테로 원자, 즉 질소를 통하여 아래에 나타낸 바와 같이 하나의 링커 L를 통한 코어(core) 상에서 하나의 글리코실 결합기에 결합되어 있다.
Figure 112008019904915-PCT00078
위 링커에서,
R1은 폴리머 성분이고, L은 하나의 결합과 하나의 결합기(linking group)에 서 선택한다.
지수 w는 1-6, 바람직하게는 1-3, 더 바람직하게는 1-2에서 선택한 정수를 나타낸다.
대표적인 결합기(linking group)에는 치환 또는 비치환 알킬 성분, 치환 또는 비치한 헤테로 알킬 성분 및 시알산을 포함한다.
그 링커의 하나의 대표적인 성분은 하나의 아실 성분이다.
본 발명에 의한 하나의 대표적인 화합물은 식Ⅰ및 Ⅱ에 의한 하나의 구조를 가진다. 여기서, R2, R3, R4, R5, R6 및 R6' 중 최소 하나는 아래에 타나낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00079
이 예에 의한 또 다른 예에서, R2, R3, R4, R5, R6 및 R6' 중 최소 하나는 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00080
위 식에서, 지수 s는 0 ~ 20의 정수이고, R1은 하나의 선상 폴리머 변형 성분이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 폴리머 변형기-링커 구조는 하나의 분기구조이며, 그 분기구조에는 중심성분(central moiety)에 결합된 2개 이상의 폴리머 사슬 을 포함한다.
이 예에서, 그 구성을 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00081
이 구조식에서, R1 및 L은 위에서 설명한 것과 같으며, w'는 2 ~ 6, 바람직하게는 2 ~ 4, 더 바람직하게는 2 ~ 3의 정수이다.
L이 하나의 결합인 경우, 그 L은 R1의 하나의 전구물질 상에서의 하나의 반응성 작용기와 그 사카릴 코어 상에서 상보 반응성을 가진 하나의 반응성 작용기 사이에서 형성된다.
L이 하나의 비제로 오더 링커(non-zero order linker)인 경우, L의 하나의 전구물질은 R1 전구물질(precursor)과의 작용 전에 글리코실 성분 상에서 적합하게 할 수 있다.
또, R1과 L의 전구물질은 글리코실 성분에서 후 결합되어 있는 하나의 사전형성된 카세트(cassette)에 결합시킬 수 있다.
여기서 설명한 바와 같이, 적합한 반응성 작용기를 가진 전구물질의 선택과 제조는 이 기술분야의 기술자의 인식능력 범위 내에서 가능한 것이다.
더욱이, 그 전구물질의 결합(coupling)은 이 기술분야에서 이해할 수 있는 화학적 처리기술에 의해 진행할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, L은 하나의 결합기(linking group)로, 그 결합기는 폴리머 변형기가 하나의 치환 알킬 링커에 의해 결합되어 있는 하나의 변형당을 형성하는 소형 펩티드(즉, 1 ~ 4 아미노산잔기) 또는 하나의 아미노산에서 형성된다.
대표적인 링커에는 글리신, 라이신, 세린 및 시스테인을 포함한다.
그 PEG 성분은 하나의 아미드 또는 우레탄 결합을 통해 그 링커의 아민성분에 결합시킬 수 있다.
그 PEG 성분은 각각 티오 에테르 또는 에테르 결합을 통해 시스테인과 세린의 황 또는 산소에 결합되어 있다.
하나의 대표적인 예에서, R5는 폴리머 변형기를 포함한다.
또 다른 대표적인 예에서, R5에는 그 폴리머 변형기와 하나의 링커 L 모두를 포함하며, 그 링커는 그 변형기를 그 분자의 잔부에 결합한다.
위에서 설명한 바와 같이, L은 하나의 선상 또는 분기구조로 할 수 있다. 동일하게, 그 폴리머 변형기는 분기 또는 선상으로 할 수 있다.
Ⅱ. D. ii. 수용성 폴리머( water - soluble polymers )
다수의 수용성 폴리머는 이 분야의 기술자에 의해 공지되었으며, 본 발명을 실시하는데 유용하다.
용어 수용성 폴리머는 사카리드(즉, 덱스트란, 아밀로오스, 히알로우론산, 폴리(시알산), 헤파란, 해파린 등);
폴리(아미노산), 즉 폴리(아스파르트산) 및 폴리(글루탐산);
핵산; 합성 폴리머(즉, 폴리(아크릴산), 폴리(에테르), 즉 폴리(에틸렌 글리 콜); 펩티드, 단백질 등 종(species)을 포함한다.
본 발명은 그 콘주게이트이 잔부(remainder)를 결합시킬 수 있는 하나의 지점을 반드시 포함할 필요가 있는 유일한 제한을 가진 어느 수용성 폴리머라도 실시할 수 있다.
또, 폴리머의 활성화 방법은 특허문헌 WO 94/17039; USP 5,324,844; WO 94/18247; WO 94/04193; USP 5,219,564; USP 5,122,614; WO 90/13540; USP 5,281,698 및 WO 93/15189 명세서에서 확인할 수 있으며, 활성화 폴리머와 펩티드, 즉 응고인자 Ⅷ(WO 94/15625), 헤모글로빈(WO 94/09027), 산소를 가진 분자(USP 4,412,989), 리보뉴클레아지 및 수퍼옥사이드(superoxide) 디스뮤타아제(dismutase)(Veronses 등, App. Biochem, Biotech. 11: 141-45 (1985) 사이의 콘주게이션(conjugation)에 대하여 확인할 수 있다.
대표적인 수용성 폴리머는 그 폴리머의 샘플 중에서 실질상의 비의 그 폴리머 분자가 거의 동일한 분자량을 가진 것들이다.
이와 같은 폴리머는 "호모 분산성"(homodisperse)이 있다.
또, 본 발명은 하나의 폴리(에틸렌 글리콜) 콘주게이트를 참고로 하여 설명한다.
PEG의 기능화와 콘주게이션에 대한 수종의 참고문헌과 단행본(monographs)을 참고로 예시할 수 있다:
예로서, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985);
Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987);
Wong 등, Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992);
Delgado 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug
Carrier Systems 9: 249-304 (1992);
Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995); 및
Bhadra 등, Pharmazie, 57: 5-29 (2002).
그 반응성 분자들을 사용하여 반응성 PEG 분자를 제조하여 콘주게이트를 형성하는 루트(routes)는 이 기술분야에서 공지되었다.
예로서, 특허문헌 USP 5,672,662 명세서에서는 선상 또는 분기 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(옥사에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올) 및 폴리(아크릴로모르폴린)에서 선택한 하나의 폴리머 산의 활성 에스테르의 수용성이며 분리할 수 있는 콘주게이트에 대하여 개시되어 있다.
특허문헌 USP 6,376,604 명세서에서는 수용성 비-펩티드 폴리머의 말단 히드록실과 디(1-벤조트리아졸릴) 카르보네이트를 유기 용매 중에서 반응시켜 그 수용성 비 펩티드 폴리머의 수용성 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트 에스테르를 제조하는 방법에 대하여 기술하였다.
그 활성 에스테르를 사용하여 단백질 또는 펩티드 등 생물학적 활성제를 가진 콘주게이트를 형성하였다.
특허문헌 WO 99/45964 명세서에서는 하나의 생물학적 활성제와, 하나의 안정성 결합을 통해 폴리머 골격에 결합된 최소 하나의 말단을 가진 하나의 폴리머 골격으로 이루어진 하나의 활성화 수용성 폴리머로 구성된 하나의 콘주게이트에 있어 서, 최소 하나의 말단이 분기형성 성분에 결합된 근접 반응성 기를 가진 하나의 분기형성 성분으로 구성되고, 그 생물학적 활성제가 그 근접 반응성기 중 최소 하나에 결합되는 것을 특징으로 하는 콘주게이트에 대하여 기재되어 있다.
다른 분기 폴리(에틸렌 글리콜)은 특허문헌 WO 96/21469 명세서에 기재되어 있고, 특허문헌 USP 5,932,462 명세서에서는 반응성 작용기를 포함하는 하나의 분기 말단을 포함한 하나의 분기 PEG 분자로 형성된 하나의 콘주게이트에 대하여 기재되어 있다.
그 유리 반응성기는 하나의 단백질 또는 펩티드 등 하나의 생물학적 활성종과 반응하여, 그 폴리(에틸렌 글리콜)과 그 생물학적 활성종 사이에 콘주게이트를 형성하는데 이용할 수 있다.
특허문헌 USP 5,446,090 명세서에서는 하나의 2 작용성 PEG 링커와 그 PEG 링커 말단 각각에서 하나의 펩티드를 가진 콘주게이트를 형성할 때 그 사용에 대하여 기재되어 있다.
분해할 수 있는 PEG 결합을 함유한 콘주게이트는 특허문헌 WO 99/34833; WO 99/14259 및 USP 6,348,558 명세서에 기재되어 있다.
이와 같은 분해 가능한 결합은 본 발명에서 적용할 수 있다.
위에서 설명한 폴리머 활성에 대한 공지된 방법은 여기서 설명한 분기 폴리머의 형성과, 또 다른 종, 즉 당, 당뉴클레오티드 등에 이들의 분기 폴리머의 콘주게이션에 대하여도 본 발명의 구성에 유용하다.
하나의 대표적인 수용성 폴리머는 폴리(에틸렌 글리콜), 즉 메톡시-폴리(에 틸렌 글리콜)이다.
본 발명에서 사용된 그 폴리(에틸렌 글리콜)은 어느 특정형태 또는 분자량 범위에 한정되어 있는 것이 아니다.
무분기(unbranched) 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 있어서, 그 분자량은 500 ~ 100,000이 바람직하다.
분자량 2000 ~ 60,000의 사용이 바람직하며, 분자량 약 5,000 ~ 약 40,000이 바람직하다.
Ⅱ. D. ⅲ. 분기 수용성 폴리머( branched water soluble polymers )
또 다른 예에서, 그 폴리(에틸렌 글리콜)은 하나 이상의 PEG 성분을 결합시킨 하나의 분기 PEG이다.
분기 PEG의 예는 다음 특허문헌과 참고문헌에 기재되어 있다: 특허문헌 USP 5,932,462; USP 5,919,455; USP 6,113,906; USP 5,183,660; WO 02/09766; 참고문헌(Kodera Y. Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); 참고문헌(Yamasaki 등, Agric. Biol. Chem, 52: 2125-2127, 1998).
하나의 바람직한 예에서, 그 분기 PEG의 각 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량은 40,000 달톤(daltons) 또는 그 이하이다.
대표적인 폴리머 변형기에는 측쇄 함유 아미노산, 즉 세린, 시스테인, 라이산과, 소형 펩티드, 즉 lys-lys를 기재로 하는 구조를 포함한다.
대표적인 구조에는 다음 식을 포함한다:
Figure 112008019904915-PCT00082
Figure 112008019904915-PCT00083
그 디-라이신 구조에서 유리아민은 하나의 아미드 또는 우레탄 결합을 통하여 하나의 PEG 성분으로 페질화(pegylation) 할 수도 있다는 것을 이 분야의 기술자들은 이해할 수 있다.
또 하나의 예에서, 그 폴리머 변형 성분은 하나의 트리-라이신 펩티드를 기 재로 하는 하나의 분기 PEG 성분이다.
그 트리-라이신 펩티드는 모노-, 다-, 토리-, 또는 테트라페질화 할 수 있다.
이 예에 의한 대표적인 종은 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00084
위 식에서,
지수 e, f 및 f'는 독립하여 1 ~ 2500의 정수를 선택한다.
지수, q, q' 및 q''는 독립하여 1 ~ 20의 정수를 선택한다.
본 발명에서 유용한 그 분기 폴리머는 이 분야의 기술자가 이해하고 있는 바와 같이, 위에서 설명한 구성 상에서의 변형(variations)을 포함한다.
예로서, 위에서 나타낸 디-라이신-PEG 콘주게이트는 3개의 폴리머 서브유닛(subunits)을 포함하며, 그 3번째 서브유닛은 위 구조에서 변경되지 않는 것과 같이 나타낸
Figure 112008019904915-PCT00085
-아민에 결합되어 있다.
동일하게, 그 폴리머 변형 성분으로 바람직하게 라벨링(labeling) 한 3 또는 4개의 폴리머 서브유닛에 의해 기능화시킨 하나의 트리-라이신의 사용은 본 발명의 범위에 포함한다.
여기서 설명한 바와 같이, 본 발명의 콘주게이트에서 유용한 PEG는 선상 또는 분기상으로 할 수 있다.
본 발명의 이 예에 의한 그 분기 PEG 함유 펩티드 콘주게이트를 형성하는데 유용한 하나의 대표적인 전구물질(precursor)은 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00086
본 발명의 이 예에 의한 상기 분기 PEG 함유 펩티드 콘주게이트를 형성하는데 유용한 또 다른 대표적인 전구물질은 아래에 나타낸 구조식을 가진다.
Figure 112008019904915-PCT00087
(Ⅲa)
이 구조식에 의한 분기 폴리머 종은 주로 순수 수용성 폴리머이다.
여기서, X3'는 하나의 이온화할 수 있는 기(즉, OH, COOH, H2PO4, HSO3, HPO3 및 그 염 등) 또는 다른 반응성 작용기(즉, 위 참고문헌에서와 같음)를 포함하는 하나의 성분이다.
C는 탄소이다. X5, R16 및 R17은 독립하여, 미 반응성(non-reactive) 기(즉, H, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬)와 폴리머 암(arms)(즉, PEG)에서 선택한다.
X2 및 X4는 생리적 상태하에서 주로 미반응성인 것이 바람직한 결합 프라그멘트이며, 같거나 다르다.
하나의 대표적인 링커에는 방향족 성분 또는 에스테르 상분도 포함하지 않는다.
또, 이들의 결합에는 생리적으로 관련된 상태하에서 분해하도록 형성된 하나 이상의 성분, 즉 에스테르, 디술피드 등을 포함할 수 있다.
X2 및 X4는 폴리머 암(arms) R16 및 R17을 C에 결합한다.
X3'가 하나의 링커, 당 및 링커-당 카세트 상에서 상보성의 반응성을 가진 하나의 반응성 작용기와 반응할 경우, X3'는 결합 프라그멘트 X3의 하나의 성분으로 전환한다.
X2, X3 및 X4에 대한 대표적인 결합 프라그멘트(fragments)는 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), (O)CNH 및 NHC(O)O, OC(O)NH, CH2S, CH20, CH2CH2O, CH2CH2S, (CH2)oO, (CH2)oS 또는 (CH2)oY'-PEG를 독립하여 선택적으로 포함한다.
여기서, Y'는 S, NH, NHC(O), C(0)NH, NHC(O)O, OC(O)NH 또는 O이며, 지수 o 는 1 ~ 50의 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 결합 프라그멘트 X2 및 X4는 같거나 다른 프라그멘트이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 전구물질(식 Ⅲ) 또는 하나의 그 활성화 유도체는 당성분, 즉 하나의 아민 상에서 X3'와 상보성인 반응성이 있는 하나의 기 사이의 반응을 통해 하나의 당, 하나의 활성화당 또는 하나의 당뉴클레오티드와 반응함으로써 결합되어 있다.
또, X3'는 하나의 전구물질 상에서 하나의 반응성 작용기와 함께 링커 L에 반응한다.
구조식 Ⅰ및 Ⅱ의 R2, R3, R4, R5, R6 또는 R6' 중 1개 이상에는 분기 폴리머 변형 성분을 포함할 수 있으며, 또는 이 변형 성분이 링커 L를 통해 결합된다.
하나의 대표적인 예에서, 그 폴리머 변형기는 다음에 나타낸 구조식에 의한 하나의 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00088
상기 구조식에 의한 또 다른 대표적인 예에서, 그 분기 폴리머는 다음에 나 타낸 구조식에 의한 하나의 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00089
하나의 대표적인 예에서, A1 및 A2는 각각 -OH 및 -OCH3에서 선택한다.
이 예에 의한 대표적인 폴리머 변형기에는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112008019904915-PCT00090
하나의 대표적인 예에서, 아래에 나타낸 성분은 링커 암(linker arm) L이다.
Figure 112008019904915-PCT00091
이 예에서, 하나의 대표적인 링커는 하나의 천연산 또는 비천연산의 아미노산, 아미노산 아날로그 또는 아미노산 유사체 또는 하나 이상의 상기 종(species)에서 형성된 하나의 소형 펩티드(small peptide)에서 유도된다.
예로서, 본 발명의 화합물에서 확인되는 어느 분기 폴리머는 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00092
위 구조식에서, Xa는 분기 폴리머 변형성분의 전구물질 상에서 하나의 반응성 작용기, 즉 X3와 당 성분 또는 하나의 전구물질 상에서 하나의 반응성 작용기를 하나의 링커에 반응시켜 형성되는 하나의 결합 프라그멘트이다.
예로서, X3가 하나의 카르복실산인 경우 이것은 활성화시켜, 하나의 아미노-사카리드(즉, Sia, GalNH2, GlcNH2, ManNH2 등)에서 현수된 하나의 아민기에 직접 결합함으로써, 하나의 아미드인 Xa를 형성한다.
대표적인 추가 반응성 작용기와 활성화 전구물질을 아래에서 설명한다.
지수 c는 1 ~ 10의 정수를 나타내고, 기타 부호는 위에서 설명한 것과 같이 동일한 동정(indentity)을 가진다.
또 다른 대표적인 예에서, Xa는 아래에 나타낸 또 다른 링커로 형성된 하나의 결합 성분이다:
Figure 112008019904915-PCT00093
위에서 나타낸 링커에서, Xb는 하나의 제 2 결합 프라그멘트이며, Xa에 대하 여 설명한 그룹(groups)에서 독립적으로 선택하고, L와 유사한다.
L1은 하나의 결합, 치환 또는 비치환 알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬이다.
Xa 및 Xb에 대한 대표적인 종(species)에는 S, SC(O)NH, HNC(O)S, SC(O)O, O, NH, NHC(O), C(O)NH 및 NHC(O)O 및 OC(O)NH를 포함한다.
또 다른 대표적인 예에서, X4는 R17에 결합하는 하나의 펩티드 결합이며, 그 R17은 하나의 아미노산, 다-펩티드(즉, Lys-Lys) 또는 트리-펩티드(즉, Lys-Lys-Lys)이며, 이 펩티드에서는 그 알파-아민 성분 및/또는 측쇄 헤테로 원자가 하나의 폴리머 변형성분으로 변형시킨다.
또 하나의 대표적인 예에서, 본 발명의 펩티드 콘주게이트는 하나의 성분, 즉 R15 성분을 포함하며, 그 R15는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00094
위 구조식에서, 여러 가지 부호에 의해 나타낸 래디컬의 동정(identity)은 위에서 설명한 것과 동일하다.
La는 L 및 L1에 대하여 위에서 설명한 하나의 링커 또는 하나의 결합이다. 즉 치환 또는 비치환 알킬 또는 비치 또는 비치환 헤테로알킬 성분이다.
하나의 대표적인 예에서, La는 구조식에서 나타낸 바와 같이 폴리머 변형성분으로 기능화하는 시알산 측쇄의 하나의 성분이다.
대표적인 La 성분에는 하나 이상의 OH 또는 NH2를 포함하는 치환 또는 비치환 알킬 사슬이 있다.
또 다른 대표적인 예에서, 본 발명은 하나의 성분, 즉 구조식(Ⅵ) 및 (Ⅶ)을 가진 R15 성분을 가진 펩티드 콘주게이트를 제공한다.
Figure 112008019904915-PCT00095
위 식에서, 여러 가지의 부호를 나타낸 래디컬의 동정(identity)은 위에서 설명한 것과 동일하다.
이 분야의 기술자들에 의해 알 수 있는 바와 같이,
구조식 Ⅵ 및 Ⅶ에서의 링커 암(linker arm)은 위에서 설명한 다른 변형당에 동일하게 적용할 수 있다.
대표적인 예에서, 위 구조식 Ⅵ 및 Ⅶ의 종(species)은 위에서 설명한 글리칸 구조에 결합한 R15이다.
또 하나의 다른 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트에는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조식을 가진 R15 성분을 포함한다.
Figure 112008019904915-PCT00096
위 구조식에서,
래디컬의 동정(identity)은 위에서 설명한 것과 같다.
La에 대한 하나의 대표적인 종(species)은 -(CH2)jC(O)NH(CH2)hC(O)NH- 이며, 여기서 지수 h와 j는 독립하여 0 ~ 10의 정수에서 선택한다.
하나의 다른 대표적인 종은 -C(O)NH-이다.
그 지수 m 및 n은 0 ~ 5,000에서 독립하여 선택한 정수이다.
A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 및 A11은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 시클로알ㅋ리, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, -NA12A13, -OA12 및 SiA12A13에서 독립하여 선택한 멤버이다.
A12 및 A13은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클로 헤테로아킬, 치환 또는 비치환 아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴에서 독립하여 선택한 멤버이다.
위에서 설명한 본 발명의 예는 그 폴리머가 하나의 수용성 폴리머, 특히 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG"), 즉 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)인 종(species)을 참고로 예시한다.
하나의 대표적인 폴리머로서 PEG를 사용하여 구체적으로 기재하는 설명과 여러 가지의 구성을 명백하게 하기 위한 다음에 이어지는 설명 섹션의 주 구성은 PEG 이외의 하나의 폴리머를 사용하는 종에 동일하게 적용할 수 있다는 것을 이 분야의 기술자에 의해 이해할 수 있다.
어느 분자량, 즉 1KDa, 2KDa, 5KDa, 10KDa, 15KDa, 20KDa, 25KDa, 30KDa, 35KDa, 40KDa 및 45KDa의 PEG는 본 발명에서 유용하다.
하나의 대표적인 예에서, 그 R15 성분은 아래에 나타낸 구조 그룹에서 선택한 하나의 멤버이다:
Figure 112008019904915-PCT00097
상기 구조의 각각에서 링커 프라그멘트-NH(CH2)a-는 존재할 수도 있고, 또는 없을 수도 있다.
다른 대표적인 예에서, 그 펩티드 콘주게이트에는 아래에 나타낸 구조식의 그룹에서 선택한 하나의 R15 성분을 포함한다.
Figure 112008019904915-PCT00098
위에서 나타낸 각각의 구조식에서, 지수 e 및 f는 독립하여 1 ~ 2500의 정수에서 선택한다.
또 다른 대표적인 예에서, e 및 f는 약 1KDa, 2KDa, 5KDa, 10KDa, 15KDa, 20Kda, 25KDa, 30KDa, 35KDa, 40KDa 및 45KDa인 하나의 PEG 성분을 구성하도록 선택한다.
부호 Q는 치환 또는 비치환 알킬(즉, C1-C6 알킬, 즉 메틸), 치환 또는 비치환 헤테로알킬 또는 H를 나타낸다.
다른 분기 폴리머는 디-라이신(Lys-Lys) 펩티드를 기재로한 구조, 즉 아래에 나타낸 구조식과,
Figure 112008019904915-PCT00099
트리-라이신 펩티드(Lys-Lys-Lys)를 기재로 한 구조, 즉 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00100
위에서 나타낸 구조식 각각에서, 지수 e, f, f' 및 f''은 독립하여 1 ~ 2500에서 선택한 정수를 나타낸다.
지수 q, q' 및 q''는 독립하여 1 ~ 20에서 선택한 정수를 나타낸다.
또 다른 대표적인 예에서, 다음 구조식을 나타낸 변형기는
Figure 112008019904915-PCT00101
다음에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조식이다:
Figure 112008019904915-PCT00102
위 구조식에서, Q는 H 및 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬에서 선택한 하나의 멤버이다.
지수 e 및 f는 1 ~ 2500에서 독립하여 선택한 정수이고, 지수 q는 0 ~ 20에서 선택한 정수이다.
또 다른 대표적인 예에서, 다음에 나타낸 구조식의 변형기는
Figure 112008019904915-PCT00103
다음에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00104
위 구조식에서, Q는 H 및 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬에서 선택한 하나의 멤버이다.
지수 e, f 및 f'는 1 ~ 2500에서 독립하여 선택한 정수이고, 지수 q 및 q'는 1 ~ 20에서 선택한 정수이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 분기폴리머는 아래에 나타낸 구조식에 의한 하나의 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00105
(Ⅲa)
위 구조식에서,
지수 m 및 n은 0~5000에서 독립하여 선택한 정수이다.
A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10 및 A11은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, -NA12A13, -OA12 및 -SiA12A13에서 독립하여 선택한 멤버이다.
A12 및 A13은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴에서 독립하여 선택한 멤버(members)이다.
구조식 Ⅲa는 구조식 Ⅲ의 하나의 서브셋트(subset)이다. 구조식 Ⅲa에 의해 설명한 구조는 또 구조식 Ⅲ에 의해 포함한다.
하나의 대표적인 예에서, 그 폴리머 변형기는 아래에 나타낸 구조식에 의한 하나의 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00106
상기 구조식에 의한 또 다른 대표적인 예에서, 그 분기폴리머는 아래에 나타낸 구조식에 의한 하나의 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00107
하나의 대표적인 예에서, A1 및 A2는 -OH 및 -OCH3에서 독립하여 선택한 멤버이다.
이 예에 의한 대표적인 폴리머변형기는 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00108
하나의 예에서, 그 변형당은 시알산이며, 본 발명에서 유용한 선택된 변형당 화합물은 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00109
위 구조식에서,
지수 a, b 및 d는 0~20에서의 정수이다. 지수 e는 1~2500에서의 정수이다.
위에서 설명한 구조들은 R15의 화합물로 할 수 있다.
또 다른 예에서. 그 당의 1급 히드록실 성분은 그 변형기로 기능화시킨다. 예로서, 시알산의 그 9-히드록실은 그 대응하는 아민으로 전환시킬 수 있고, 기능화시킬 수 있어 본 발명에 의한 하나의 화합물을 구성한다. 이 예에 의한 구조식은 아래에 나타낸 구조식을 포함한다:
Figure 112008019904915-PCT00110
위에서 설명한 구조체들은 R15의 성분으로 할 수 있다.
이 분야의 기술자들이 이해하고 있는 바와 같이 본 발명을 PEG를 기준으로 하여 앞 섹션에서 예시한 바 있으나, 폴리머 변형성분은 여기서 설명한 화합물과 방법에서 유용하다.
선택한 예에서, R1 또는 C-R1은 하나의 분기 PEG이며, 예로서 위에서 설명한 종들(species) 중 하나이다. 하나의 대표적인 예에서, 그 분기 PEG 구조체는 하나의 시스테인펩티드를 기재로 한다. 이 예에 의해 구체적으로 설명한 변형당은 아래에 나타낸 구조식을 포함한다:
Figure 112008019904915-PCT00111
위 구조식에서,
X4는 하나의 결합 또는 0이다. 상기 구조의 각각에서, 알킬아민링커 -(CH2)aNH-는 존재할 수 있거나, 없을 수도 있다. 위에서 설명한 구조들은 R15/R15'의 성분으로 할 수 있다.
여기서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 유용한 폴리머-변형시알산은 또 선상구조로 할 수도 있다. 이와 같이, 본 발명은 아래에 나타낸 구조식의 하나의 구조에서 유도된 하나의 시알산 성분을 포함하는 콘주게이트를 제공한다.
Figure 112008019904915-PCT00112
위 구조식에서, 지수 q 및 e는 위에서 설명한 것과 같다.
대표적인 변형당은 수용성 또는 수불용성폴리머로 변형시킨다. 유용한 폴리머의 예는 아래에서 더 예시한다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 펩티드는 곤충세포에서 유도하며, GleNAe 및 Gal을 그 만노오스코어(core)에 부가하여 리모델링(remodeling)하고, 하나의 선상PEG 성분을 가진 하나의 시알산을 사용하여 글리코페질화시켜, 아래에 나타낸 구조식을 가진 최소 하나의 성분으로 이루어진 하나의 인자 Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드를 제공한다.
Figure 112008019904915-PCT00113
위 구조식에서,
지수 t는 0~1의 정수이다.
지수 s는 1~10의 정수이다.
지수 f는 1~2500의 정수이다.
하나의 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 구조식을 가진 글리코실결합기로 이루어진 하나의 펩티드 콘주게이트를 제공한다:
Figure 112008019904915-PCT00114
위 구조식에서,
D는 -OH 및 R1-L-HN-에서 선택한 하나의 멤버이고,
R1은 하나의 직쇄 폴리(에틸렌글리콜)잔기와 분기 폴리(에틸렌글리콜)잔기에서 선택한 하나의 멤버이며,
M은 H, 하나의 염 반대이온 및 하나의 단일음전하에서 선택한 하나의 멤버이고,
L은 하나의 결합, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 링커이다.
하나의 대표적인 예에서, D가 OH인 경우 G는 R1-L-이다. 또 다른 대표적인 예에서, G가-C(0)(C1-C6)알킬인 경우, D는 R1-L-NH-이다.
하나의 대표적인 예에서, L-R1은 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00115
위 구조식에서,
a는 0~20에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, R1은 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조체를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00116
위 구조식에서,
지수 e, f, m 및 n은 1~2500에서 독립하여 선택한 정수이다.
지수 q는 0~20에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, R1은 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조체이다.
Figure 112008019904915-PCT00117
위 구조식에서,
지수 e, f 및 f'는 1~2500에서 독립하여 선택한 정수이다.
지수 q 및 q'는 1~20에서 독립하여 선택한 정수이다.
또 다른 대표적인 예에서, R1은 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조체이다.
Figure 112008019904915-PCT00118
위 구조식에서,
지수 e, f 및 f'는 1~2500에서 독립하여 선택한 정수이다.
지수 q 및 q'는 1~20에서 독립하여 선택한 정수이다.
또 다른 대표적인 예에서, R1은 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조체이다:
Figure 112008019904915-PCT00119
위 구조식에서,
지수 e 및 f는 1~2500에서 독립하여 선택한 정수이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 글리코실링커는 아래에 나타낸 구조식을 가진다.
Figure 112008019904915-PCT00120
또 다른 대표적인 예에서, 그 펩티드 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 구조식에 의한 상기 글리코실링커 중 최소 하나를 구성한다:
Figure 112008019904915-PCT00121
위 구조식에서,
AA는 상기 펩티드 콘주게이트의 하나의 아미노산 잔기이고, 지수 t는 0 및 1에서 선택한 정수이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 펩티드 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식에서 독립적으로 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조체를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00122
Figure 112008019904915-PCT00123
위 구조식에서,
AA는 상기 펩티드 콘주게이트의 하나의 아미노산 잔기이고, 지수 t는 0 및 1 에서 선택한 정수이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 펩티드 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 구조식에 의한 상기 글리코실링커 중 최소 하나를 구성한다:
Figure 112008019904915-PCT00124
Figure 112008019904915-PCT00125
위 구조식에서,
AA는 상기 펩티드 콘주게이트의 하나의 아미노산 잔기이고, 지수 t는 0 및 1에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, G를 함유하지 않은 시알릴 성분의 O과 2개에서 선택한 하나의 멤버는 존재하지 않는다.
하나의 대표적인 예에서, G를 함유하지 않은 시알릴 성분의 1과 2개에서 선택한 하나의 멤버는 존재하지 않는다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 펩티드 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 구조식에 의한 상기 글리코실 링커 중 최소 하나를 구성한다:
Figure 112008019904915-PCT00126
Figure 112008019904915-PCT00127
위 구조식에서,
AA는 상기 펩티드 콘주게이트의 하나의 아미노산 잔기이고, 지수 t는 0과 1에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, G를 함유하지 않은 시알릴성분의 0과 2개에서 선택한 하나의 멤버는 존재하지 않는다.
하나의 대표적인 예에서, G를 함유하지 않은 사일릴성분의 1과 2개에서 선택한 하나의 멤버가 존재하지 않는다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 펩티드 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 구조식에 의한 상기 글리코실 링커 중 최소 하나를 구성한다:
Figure 112008019904915-PCT00128
Figure 112008019904915-PCT00129
위 구조식에서,
AA는 상기 펩티드 콘주게이트의 하나의 아미노산 잔기이고, 지수 t는 0과 1에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, G를 함유하지 않은 시알릴 성분의 0과 2개에서 선택한 하나의 멤버는 존재하지 않는다. 하나의 대표적인 예에서, G를 함유하지 않은 시알릴 성분의 1과 2개에서 선택한 하나의 멤버는 존재하지 않는다.
또 다른 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드는 아미노산 서열 SEQ.ID.NO:1을 가진다. 또 다른 대표적인 예에서, 글리코실링커는 세린과 트레오닌에서 선택한 하나의 아미노산 잔기에 의해 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드에 결합된다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 아스파라긴 잔기는 N152, N322 및 그 조합에서 선택한 하나의 멤버이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶa펩티드는 하나의 바이오활성(bioactive) Ⅶa 펩티드이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 글리코실링커는 하나의 아스파라긴 잔기인 하나의 아미노산을 통해 상기 인자 Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드에 결합되어 있다.
또 다른 대표적인 예에서, 본 발명은 하나의 적합한 숙주(host)에서 생산되는 하나의 인자Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드를 제공한다. 또, 본 발명은 이 펩티드를 발현하는 방법을 제공한다. 또 다른 대표적인 예에서, 그 숙주는 하나의 포유동물 발현 시스템(mammalian expression system)이다.
또 다른 대표적인 예에서, 본 발명은 필요시에 피검자의 응고잠재력 절충력(compromised clotting potency)에 특징이 있는 상태치료를 하는 방법에 있어서, 피검자의 상기 상태를 회복(개선)하는데 효과적인 본 발명의 인자Ⅶ/ 인자Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 양을 피검자에 투여하는 스텝으로 이루어짐을 특징으로 하는 치료 방법을 제공한다. 또 다른 대표적인 예에서, 그 방법은 여기서 설명한 방법에 의해 생성된 인자 Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 양을 상기 포유동물에 투여하는 것을 구성한다.
또 다른 국면(aspect)에서, 본 발명은 아래에 나타낸 구조식을 가진 하나의 변형 시알릴 잔기를 구성하는 하나의 글리코실 링커로 이루어진 하나의 인자Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 제조하는 방법을 제공한다:
Figure 112008019904915-PCT00130
위 구조식에서,
R2는 H, CH2OR7, COOR7 또는 OR7이고,
R7은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬을 나타낸다. R3 및 R4는 H, 치환 또는 비치환 알킬, OR8, NHC(0)R9에서 독립하여 선택한 멤버이고, R8 및 R9는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 또는 시알산에서 독립하여 선택한다.
R16 및 R17은 폴리머암(arms)을 독립하여 선택한다. X2 및 X4는 폴리머 성분 R16 및 R17을 탄소(C)에 결합하는 결합 프라그멘트를 독립하여 선택한다.
X5는 하나의 미 반응성 기이고, La는 하나의 링커기이다. 그 방법은 (a)아래에 나타낸 글리코실 성분으로 이루어진 하나의 인자Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드와,
Figure 112008019904915-PCT00131
아래에 나타낸 구조식을 가진 하나의 PEG-시알산도너 성분과
Figure 112008019904915-PCT00132
상기 글리코실 성분의 Gal 상에서 PEG-시알산을 전이하는 효소를 그 전이에 적합한 조건 하에서 접촉하는 것으로 이루어진다.
또 다른 대표적인 예에서, 아래에 나타낸 성분은
Figure 112008019904915-PCT00133
아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조식을 가진다.
Figure 112008019904915-PCT00134
Figure 112008019904915-PCT00135
위 구조식에서,
지수 e, f, m 및 n은 1~2500에서 독립하여 선택한 정수이고,지수 q는 0~20에서 선택한 정수이다.
또 다른 대표적인 예에서, 아래에 나타낸 성분은
Figure 112008019904915-PCT00136
아래에서 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00137
위 구조식에서,
지수 e, f 및 f'는 1~2500에서 독립하여 선택한 정수이고, 지수 q 및 q'는 1~20에서 독립하여 선택한 정수이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 글리코실 링커는 아래에 나타낸 구조식으로 구성된다:
Figure 112008019904915-PCT00138
또 다른 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식을 가진 최소 하나의 글리코실링커로 구성한다:
Figure 112008019904915-PCT00139
위 구조식에서,
AA는 상기 펩티드의 하나의 아미노산 잔기이며, 지수 t는 0과 1에서 선택한 정수이다. R15는 변형시알릴 성분이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드는 아미노산 서열 SEQ.ID.NO:1을 가진다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 글리코실링커는 하나의 아스파리긴 잔기인 하 나의 아미노산 잔기를 통해 상기 인자 Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드에 결합된다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 아스파리긴 잔기는 N152, N322 및 그 조합에서 선택된 하나의 멤버이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶa 펩티드는 하나의 바이오 활성 인자Ⅶa 펩티드이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 방법은 스텝(a) 전에 (b) 하나의 적합한 숙제 내에서 인자 Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드를 발현하는 것을 구성한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 피검자의 응고 잠재력 절충에 특징이 있는 상태를 치료하는 방법에 있어서 상기 피검자의 상태를 개선(회복)하는데 효과적이며, 여기서 설명한 방법에 의해 생성된 인자Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 양을 피검자에 투여하는 스텝으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 또 다른 대표적인 예에서, 그 방법은 여기서 설명한 방법에 의해 제조된 인자Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 양을 상기 포유동물에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 하나의 인자Ⅶ 또는 인자Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 합성하는 방법에 있어서,
(a) 시알리다아제와, (b) 글리코실 전이효소, 엑소글리코시다아제 및 엔도글리코시다아제에서 선택한 하나의 멤버인 효소와, (c) 변형당/변형 시알릴 잔기와 (d) 상기 인자Ⅶ 또는 인자 Ⅶa 펩티드를 배합하여 이와 같이 인자 Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 합성하는 것으로 이루어지는 방법을 제공한다.
하나의 대표적인 예에서, 그 배합은 10시간 이하의 시간이다. 또 다른 대표 적인 예에서, 본 발명은 하나의 캐핑스텝(capping step)을 더 포함한다.
Ⅱ.D.iv. 수-불용성 폴리머
위에서 설명한 것과 동일한 또 다른 예에서, 그 변형당에는 수용성 폴리머보다 오히려 물에 불용성인 폴리머를 포함한다. 본 발명의 콘주게이트에는 또 하나 이상의 수-불용성 폴리머를 포함한다. 본 발명의 이 예에서는 치료 펩티드를 조절 방식으로 투여하는 하나의 비히클(vehicle)로서 그 콘주게이트를 사용하여 설명한다. 폴리머 약제 투여 시스템은 종래 기술에서 공지되어 있다. 예에서, 다음 참고문헌을 참조할 수 있다(Dunn 등, Eds. Polymeric Dreugs and drug Delivery systems, ACS Symposium. Series. Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991.)
실제로 어느 공지된 약제투여 시스템은 본 발명의 콘주게이트에 적용할 수 있다는 것을 이 분야의 기술자들은 이해할 수 있다.
위에서 설명한 R1, L-R1, R15, R15'에 대한 구성과 다른 래디컬은 이 기술 분야의 기술자에 의해 용이하게 접근할 수 있는 화학적 특성을 이용하여 제한 없이 선상 및 분기 구조에 결합시킬 수 있는 수-불용성 폴리머에 동일하게 적용할 수 있다.
대표적인 수-불용성 폴리머에는 폴리포스파진, 폴리(비닐알코올), 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리알킬렌, 폴리아크릴아미드, 폴리알킬렌글리콜, 폴리알킬렌옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐에테르, 폴리비닐에스테르, 폴 리비닐할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜리드, 폴리실록산, 폴리우레탄, 폴리(메틸 메타아크릴레이트), 폴리(에틸 메타아크릴레이트), 폴리(부틸 메타아크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타아크릴레이트), 폴리(헥실 메타아크릴레이트), 폴리(이소데실 메타아크릴레이트), 폴리(라우릴 메타아크릴레이트), 폴리(페닐 메타아크릴레이트), 폴리(메틸아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타테실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(에틸렌옥사이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 아세테이트), 폴리비닐클로리드, 폴리스티렌, 폴리비닐피롤리돈, 플루로닉스 및 폴리비닐페놀과 그 코폴리머가 있으며, 한정되어 있는 것은 아니다.
본 발명의 콘주게이트에서 유용한 합성변형 천연(natural)폴리머에는 알킬셀룰로오스, 히드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르 및 니트로 셀룰로오스가 있으나, 한정되어 있는 것은 아니다.
광범위한 분류의 합성변형 천연폴리머 중 특히 바람직한 멤버에는 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시 부틸메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 프로피오네이트, 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 카르복시메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 트리아세테이트, 셀룰로오스 술페이트염과, 아크릴 및 메타아크릴 에스테르와 알긴산의 폴리머가 있으며, 한정되어 있는 것은 아니다.
여기서 설명은 폴리머 및 다른 폴리머는 상품 공급원으로 용이하게 얻을 수 있으며[상품공급원:Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA), Fluka(Ronkonkoma, NY, USA), BioRad(Richmond,CA,USA)], 또는 표준기술을 사용하여 이들의 상품 공급업자로부터 얻은 모너머에서 합성할 수 있다.
본 발명의 콘주게이트에 유용한 대표적인 생분해성 폴리머에는 폴리락티드, 폴리글리코리드 및 그 코폴리머, 폴리(에틸렌테레 프탈레이트), 폴리(부티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락티드-코-카포로락톤), 폴리(락티드-코-글리코리드), 폴리안히드리드(poly anhydrides), 폴리오르토에스테르, 그 블렌드(blends) 및 코폴리머가 있으며, 한정되어 있는 것은 아니다. 콜라겐, 플루노닉 등을 포함하는 조성물 등 겔 형성 조성물이 특히 유용하다.
본 발명에서 유용한 폴리머에는 "하이브리드"(hybrid) 폴리머(혼성 폴리머)가 있으며, 이들의 혼성 폴리머는 이들의 구조 중 최소 일부분 중에 하나의 바이오재흡수성(bioresorbable) 분자를 가진 수-불용성재를 포함한다. 이와 같은 폴리머의 하나의 예는 하나의 수-불용성 코폴리머를 포함하는 것으로, 그 코폴리머는 하나의 바이오 재 흡수성 영역, 하나의 친수성 영역 및 폴리머 사슬에 대하여 다수의 가교결합 작용기를 가진다.
본 발명에서, "수-불용성재"(water-insoluble materials)에는 수(water) 또는 수 함유환경 하에 실질상 불용성인 재료가 있다. 이와 같이, 그 코폴리머의 어느 영역 또는 세그멘트가 친수성이거나, 또는 수용성으로 할 수 있어도, 전체로서 그 폴리머 분자는 수중에서 실질상 용해하지 않는다.
본 발명에서, 용어 "바이오재흡수성 분자"에는 생체(body)에 의한 정상적인 배설경로에 의해 대사작용을 하거나, 절단(broken down)하며 재흡수 및/또는 제거할 수 있는 하나의 영역을 포함한다. 이와 같은 대사물 또는 절단 생성물은 실질상 그 생체에 대하여 비 독성인 것이 바람직하다.
그 바이오재흡수성 영역은 그 코폴리머 조성물이 전체로서 수용성으로 되지않는 한 소수성 또는 친수성으로 할 수 있다. 이와 같이, 그 바이오재흡수성 영역은 전체로서 그 폴리머가 수-불용성으로 남아있는 구성특징을 기준으로 하여 선택한다. 따라서, 상대적 특성, 즉 함유된 작용기의 종류와 바이오재흡수성 조성물이 수-불용성으로 남아있도록 확보한다.
대표적인 재흡수성 폴리머에는 예로서, 합성에 의해 제조된 폴리(α-히드록시-카르복실산)/폴리(옥시알킬렌)의 재흡수성 블록 코폴리머를 포함한다(참조:Cohn 등, USP 4,826,945). 이들의 코폴리머는 가교결합되지 않으며. 수용성이므로 그 생체는 그 분해블록 코폴리머 조성물을 배설할 수 있다[참조:Younes 등, J.Biomed.Mater.Res.21:1301-1316(1987);Cohn 등, J.Biomed.Master.Res.22:993-1009(1988)].
바람직한 바이오재흡수성 폴리머에는 폴리(에스테르), 폴리(히드록시산), 폴리(락톤), 폴리(아미드), 폴리(에스테르-아미드), 폴리(아미노산), 폴리(안히드리드), 폴리(오르토에스테르), 폴리(카르보네이트), 폴리(포스파진), 폴리(포스포에스테르), 폴리(티오에스테르), 폴리사카리드 및 그 혼합물에서 선택한 하나 이상의 성분이 있다. 그 바이오재흡수성 폴리머에는 하나의 폴리(히드록시)산 성분이 포함되는 것이 더 바람직하다. 그 폴리(히드록시)산 중에서 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리카프로산, 폴리부티르산, 폴리발레르산과 그 코폴리머 및 혼합물이 바람직하다.
생체 내 흡수하는 ("바이오재흡수":bioresorbed) 프라그멘트의 형성외에, 본 발명의 방법에 사용하는 바람직한 폴리머코팅도 배설할 수 있고 대사 작용할 수 있는 하나의 프라그멘트(fragment)를 형성할 수 있다.
또 본 발명에서는 고차(higher order) 코폴리머를 사용할 수 있다. 예로서, 특허문헌(casey 등, USP 4,438,253)(1984.3.20자 특허취득)에서는 폴리(글리콜산)과 히드록실말단(ended)폴리(알킬렌글리콜)의 에스테르 전이반응으로부터 생성된 트리-블록코폴리머가 개시되어 있다. 이와 같은 조성물은 재흡수성 모노필라멘트 구조체로서 사용에 대하여 개시되어 있다. 이와 같은 조성물의 가요성(flexibility)은 그 폴리머 구조 중에서 테트라-p-톨릴 오르토카르보네이트 등 방향족 오트로카르보네이트의 결합에 의해 조절한다.
또, 락트산 및/또는 글리콜산을 기재로 한 다른 폴리머를 사용할 수 있다. 예로서, 특허문헌(Spinu, USP 5,202,413;1993.4.13.특허취득)에서는 올리고머디올 또는 디아민 잔기 상에서 락티드 및/또는 글리코리드의 개환(ring-opeing)중합한 다음, 이어서 디이소시아네이트, 디아실클로리드 또는 디클로로실란 등 하나의 2기능성 화합물에 의한 사슬연장(chain extension)에 의해 생성된 폴리락티드 및/또는 폴리글리코리드의 순차블록(sequentially ordered blocks)을 가진 생분해성 멀티-블록(multi-block) 코폴리머에 대하여 개시되어 있다.
본 발명에서 유용한 코팅의 바이오재흡수성 영역은 가수분해 및/또는 효소에 의해 절단할 수 있도록 구성할 수 있다. 본 발명에서, "가수분해에 의해 절단가능성"(hydrolytically cleavable)은 수중에서 또는 물 함유 환경하에서 가수분해에 대한 그 코폴리머, 특히 바이오재흡수성 영역의 감수성(suseptibility)을 말한다. 동일하게, 여기서 사용되고 있는 바와 같이 "효소에 의한 절단가능성"(enzymatically cleavable)은 내인성(endogenous) 또는 외인성 효소에 의한 절단(cleavage)에 있어서 그 코폴리머, 특히 바이오재흡수성 영역의 감수성을 말한다.
그 친수성 영역이 그 생체 내에서 설정될 경우 그 친수성 영역은 배설 가능성 있는 프라그멘트 및/또는 대사 가능성 있는 프라그멘트 중에서 처리를 진행시킬 수 있다. 이와 같이, 그 친수성 영역에는 예로서 폴리에테르, 폴리알킬렌옥사이드, 폴리올, 폴리(비닐피롤리딘), 폴리(비닐알코올), 폴리(알킬옥사졸린), 폴리사카리드, 카르보히드레이트, 펩티드, 단백질과 그 코폴리머 및 혼합물을 함유할 수 있다. 더 나아가서, 그 친수성 영역은 또 예로서 하나의 폴리(알킬렌)옥사이드로 할 수 있다. 이와 같은 폴리(알킬렌)옥사이드에는 예로서 폴리(에틸렌)옥사이드, 폴리(프로필렌)옥사이드와 그 혼합물 및 코폴리머를 포함할 수 있다.
하이드로겔의 성분인 폴리머는 본 발명에서 유용하다.하이드로겔(hydrogels)은 폴리머재이며, 이들의 폴리머재는 비교적 다량의 물을 흡수할 수 있다. 하이드로겐 형성 화합물의 예에는 폴리아크릴산, 소듐카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리딘, 젤라틴, 카라기난 및 다른 폴리사카리드, 히드록시에틸렌 메타아크릴산(HEMA)과 그 유도체 등이 있으나, 한정되어 있는 것은 아니다. 안 정성이 있고, 생분해성이 있으며 바이오재흡수성이 있는 히드로겔을 제조할 수 있다. 더욱이, 하이드로겔 조성물에는 하나 이상의 이들 특성을 나타내는 서브유닛(subunits)을 함유할 수 있다.
가교결합에 의해 보존성(integrity)을 조정할 수 있는 생(bio)-상용성 하이드로겔 조성물은 공지되었으며, 본 발명의 방법에서 사용하는데 바람직하다. 예로서, 특허문헌(Hubbell 등, USP 5,410,016;1995.4.25.특허취득; USP 5,529,914;1996.06.25.특허취득)에서는 수용성계(water-soluble systems)에 대하여 개시되어 있다. 이들의 수용성계는 가수분해에 의해 불안정한 두개의 연장부(extensions) 사이에 삽입된 하나의 수용성 중심블록 세그멘트를 가진 가교결합된 블록코폴리머를 가진다. 이와 같은 코폴리머는 광 중합할 수 있는 아크릴레이트 기능성으로 더 엔드-캐핑(end-cappong)이된다. 가교결합될 때, 이들의 계는 하이드로겔이 된다. 이와 같은 코폴리머의 수용성 중심블록은 폴리(에틸렌글리콜)을 포함할 수 있다. 이와 같이, 그 가수분해에 의해 불안정하게 되는 연장부는 폴리글리콜산 또는 폴리락트산 등 하나의 폴리(α-히드록시산)으로 할 수 있다 (참조:Sawhney 등, Macromolecules 26:581-587(1993)).
또 다른 바람직한 예에서, 그 겔은 하나의 열가역겔(thermoreversible gel)이다. 플루로닉(pluronics), 콜라겐, 젤라틴, 히알우론산, 폴리사카리드, 폴리우레탄 하이드로겔, 폴리우레탄-우레아하이드로겐 및 그 조합 등의 성분을 포함하는 열가역겔이 바람직하다.
또 다른 대표적인 예에서, 본 발명의 콘주게이트에는 하나의 리포 솜(liposome)의 성분을 포함한다. 리포솜은 예로서 특허문헌(Eppstein 등, USP 4,522,811)에서 기재되어 있는 바와 같이 이 분야의 기술자에 의해 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예로서, 리포솜제제는 무기용매 중에서 적합한 지질(lipids) (스테아로일 포스파티딜 에타놀아민, 스테아로일 포스파티딜콜린, 아라카도일 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤)을 용해시킨 다음, 증발시켜 그 용기의 표면상에 건조지질의 박막을 잔존시켜 제조할 수 있다.그 다음, 그 활성 화합물의 수용액 또는 의약적으로 허용할 수 있는 그 염을 그 용기 내에 도입한다. 도입 후에, 그 용기를 수동으로 회전시켜 그 용기의 측면에서 지질재를 유리하고 지질응집을 분산시킴으로써 리포솜 현탁액을 형성한다.
위에서 설명한 마이크로파티클과 그 마이크로파티클의 제조방법은 실시예에 의해 제공되며, 본 발명에서 유용한 마이크로파티클의 범위를 한정하는 것은 아니다. 서로 다른 방법에 의해 제조된 마이크로파티클(microparticle)이본 발명에서 유용하다는 것은 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.
직쇄 및 분기 모두를 가진 수용성 폴리머에 있어서 위에서 설명한 구조형식은 일반적으로 수-불용성 폴리머에 대해서도 적용할 수 있다. 이와 같이, 예로서 시스테인, 세린, 디라이신 및 트리라이신 분기형성 코어(branching cores)는 2종의 수-불용성 폴리머 성분으로 기능화할 수 있다. 이들의 종(species)을 제조하는데 사용되는 방법은 일반적으로 상기 수용성 폴리머를 제조하는데 사용되는 방법과 유사하다.
Ⅱ.D.V. 폴리머 변형기(polymeric modizying groups)의 제조방법
폴리머 변형기는 하나의 글리코실 또는 사카릴성분 또는 하나의 아미노성분 과의 반응에서 활성화할 수 있다. 활성화 종의 대표적인 구조체(즉, 카르보네이트 및 활성에스테르)는 아래에 나타낸 구조식을 포함한다:
Figure 112008019904915-PCT00140
Figure 112008019904915-PCT00141
상기 구조식에서, 지수 q는 1~40에서 선택한 정수이다. 여기서 설명한 화합물의 제조에 유용한 선상 및 분기PEG를 활성화하는데 적합한 다른 활성 또는 분리기(leaving groups)는 아래에 나타낸 구조식을 가진 종(species)을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다:
Figure 112008019904915-PCT00142
상기 구조식을 가진 종 및 다른 종으로 활성화하는 PEG분자와 그 활성화 PEG의 제조방법은 특허문헌 WO04/083259 명세서에서 기재되어 있다.
위에서 나타낸 분기폴리머의 하나 이상의 m-PEG암(arms)이 하나의 다른 말단 (즉, OH, COOH, NH2, C2-C10-알킬 등)을 PEG성분에 의해 치환시킬 수 있다는 것은 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다. 더욱이, 위 구조들은 그 α-탄소원자와 아미노산 측쇄의 작용기 사이에 알킬링커를 삽입(또는 탄소원자를 제거)함으로써 용이하게 변형시킨다.
이와 같이, "효모"(homo) 유도체 및 고급(higher)호모로그(homologues)와, 저급(lower)호모로그는 본 발명에서 유용한 분기PEG의 코어(cores)범위 내에 있다.
여기서 설명한 분기PEG종은 아래에 나타낸 스킴(scheme)에서 설명한 방법에 의해 용이하게 제조한다:
Figure 112008019904915-PCT00143
위 스킴에서,
Xd는 0 또는 S이고, r은 1~5의 정수이다.
지수 e 및 f는 독립하여 1~2500의 정수를 선택한다.
하나의 대표적인 예에서, 이들 지수의 하나 또는 둘은 그 폴리머가 분자량 약 5KDa, 약 10KDa, 15KDa, 20KDa, 25KDa, 30KDa, 35KDa 또는 40KDa로 되도록 선택한다.
이와 같이, 위 스킴에 의해, 하나의 천연 또는 비천연아미노산은 하나의 활성화 m-PEG 유도체, 이 경우 토실레이트와 접촉시켜, 측쇄헤테로원자 Xd를 알킬화시켜 구조식 1을 형성한다. 그 모노-기능화 m-PEG 아미노산은 하나의 반응성 m-PEG 유도체와 함께 N-아실화 조건에 따르도록 처리하여, 분기 m-PEG 2를 집합한다.
이 분야의 기술자들이 이해하고 있는 바와 같이, 그 토실레이트 이탈기는 어느 적합한 이탈기, 즉 할로겐, 메실레이트, 트리플레이트 등으로 대치할 수 있다. 동일하게, 그 아민을 아실화(acylation) 하는데 사용되는 반응성 카르보네이트는 하나의 활성에스테르, 즉 N-히드록시 숙신이미드 등으로 대치할 수 있거나, 또는 그 산을 디시클로헥실 카르보디이미드, 카르보닐 디이미다졸 등 하나의 탈수제를 사용하여 반응 현장에서 활성화시킬 수 있다.
다른 대표적인 예에서, 그 우레아성분은 하나의 아미드 등 하나의 기(group)로 대치한다.
Ⅱ.E. 물질( matter )의 호모분산성 펩티드 콘주게이트 조성물( homodisperse peptide conjugate compositions )
화학적으로 또한 효소에 의해 부가하는 글리코실 결합기에 의해 형성되는 펩티드 콘주게이트의 구성 이외에, 본 발명은 치환패턴에서 균질성이 높은 펩티드 콘주게이트를 함유하는 물질의 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여, 인자Ⅶ/인자Ⅶa 콘주게이트의 하나의 개체군에서 글리코실 결합기의 실질상 부분과 글리코실 성분이 구조가 동일한 하나의 아미노산 또는 글리코실 잔기에 결합되어 있는 펩티드 콘주게이트를 형성할 수 있다. 이와 같이, 하나의 제 2 국면에서 본 발명은 하나의 글리코실 결합기, 즉, 하나의 무손상(intact) 글리코실 결합기를 통하여 펩티드 콘주게이트에 공유결합되어 있는 수용성폴리머 성분의 개체군(population)을 가진 하나의 펩티드 콘주게이트를 제공한다. 본 발명의 하나의 대표적인 펩티드 콘주게이트에서, 그 수용성 폴리머 개체군의 각 멤버는 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드 콘주게이트의 하나의 글리코실 잔기에 결합되어 있고, 그 글리코실 결합기가 결합되어 있는 그 펩티드 콘주게이트의 각각의 글리코실 잔기가 동일한 구조를 가진다.
또, 본 발명은 하나의 글리코실 결합기에 의해 하나의 변형기, 즉 치료성분, 진단성분, 표적성분, 독성성분(toxin moety) 등에 그 펩티드가 콘주게이팅 하는 위 에서 설명한 콘주게이트와 유사한 콘주게이트를 제공한다. 위에서 인용한 변형기 각각은 하나의 소형분자, 천연폴리머(즉, 폴리펩티드) 또는 합성폴리머로 할 수 있다. 그 변형기가 하나의 시알산에 결합되어 있는 경우, 그 변형기가 실질상 비형광(non-fluorescent)인 것이 일반적으로 바람직하다.
하나의 대표적인 예에서, 본 발명의 그 펩티드에는 최소 하나의 0-결합 또는 N-결합 글리코실화 부위(site)를 포함하여, 하나의 폴리머변형기, 즉, 하나의 PEG 성분을 포함하는 하나의 변형당으로 글리코실화 한다.
하나의 대표적인 예에서, 그 PEG는 하나의 무손상글리코실 결합기에 의해, 또는 하나의 비-글리코실링커(non-glycosyl linker), 즉 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬에 의해 그 펩티드에 공유결합되어 있다. 그 글로키실 결합기는 그 펩티드의 하나의 아미노산 잔기 또는 하나의 글리코실 잔기에 공유결합되어 있다. 또, 그 글리코실 결합기는 하나의 글리코펩티드의 하나 이상의 글리코실 단위에 결합되어 있다. 또, 본 발명은 하나의 글리코실 결합기가 하나의 아미노산 잔기와 하나의 글리코실 잔기에 결합되어 있는 콘주게이트를 제공한다.
본 발명의 펩티드 상에서의 글리칸(glycans)은 포유동물(BHK, CHO) 세포 또는 곤충(즉, sf-9)세포에 의해 생성되는 하나의 인자Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드 상에서 확인되는 글리칸에 일반적으로 대응되어, 여기서 설명한 방법에 의해 리모델링(remodeling)한다. 예로서, 하나의 트리-만노실코어로 발현되는 곤충-유도인자 Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드가 하나의 GleNAc 도너 및 하나의 GlcNAc 전이효소와 하나의 Gal 도너 및 하나의 Gal 전이효소로 계속해서 접촉한다.
그 트리-만노실코어에서 GleNAc와 Gal의 부속(appending)은 2 스텝(step) 또는 단일스텝으로 완성된다. 하나의 변형시알산은 여기서 설명한 바와 같이, 글리코실 성분의 최소 하나의 분기(branch)에 부가된다. 그 변형시알산으로 기능화되지 않은 Gal성분은 하나의 시알릴 전이효소의 존재하에서 하나의 시알산 도너와의 반응에 의해 선택적으로 "캐핑"(capping)된다.
하나의 대표적인 예에서, 펩티드의 하나의 개체군에서 말단 Gal성분 최소 60%가 시알산과 캐핑되며, 바람직하게는 최소 70%, 더 바람직하게는 최소 80%, 더욱 바람직하게는 최소 90%, 더욱더 바람직하게는 최소 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 시알산과 캐핑된다.
Ⅱ. F. 뉴클레오티드당( nucleotide sugars )
본 발명의 또 다른 국면에서, 또 본 발명은 당뉴클레오티드(sugar nucleotides)을 제공한다. 이 예에 의한 대표적인 종(species)은 아래에 나타낸 구조식을 포함한다:
Figure 112008019904915-PCT00144
위 구조식에서,
지수 y는 0,1 및 2에서 선택한 정수이다.
염기 (base)는 아데닌, 티민, 구아닌, 시티딘 및 우리딘 등 하나의 핵산염기 이다. R2, R3 및 R4는 위에서 설명한 것과 같다. 하나의 대표적인 예에서, L-(R1)w는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버이다:
Figure 112008019904915-PCT00145
위 구조식에서, 변수들은 위에서 설명한 것과 같다.
하나의 대표적인 예에서, L-(R1)w는 아래에 나타낸 구조식에 의한 하나의 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00146
하나의 대표적인 예에서, A1 및 A2는 각각 -OH와 -OCH3에서 선택한다.
이 예에 의한 대표적인 폴리머 변형기들은 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00147
또 다른 대표적인 예에서, 그 뉴클레오티드는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00148
Figure 112008019904915-PCT00149
이 예에 의한 하나의 대표적인 뉴클레오티드당은 아래에 나타낸 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00150
이 예에 의한 하나의 대표적인 뉴클레오티드당은 아래에 나타낸 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00151
또 다른 대표적인 예에서, 그 뉴클레오티드당은 아래에 나타낸 구조식을 기재로 한다:
Figure 112008019904915-PCT00152
위 구조식에서,
R기 및 L은 위에서 설명한 성분을 나타낸다.
지수 y는 0,1 또는 2이다.
하나의 대표적인 예에서, L은 NH와 R1 사이의 하나의 결합이다.
그 염기(base)는 하나의 핵산염기이다.
하나의 대표적 예에서, L-R1은 아래에 나타내 구조식에서 선택한 하나의 멤버이다:
Figure 112008019904915-PCT00153
위 구조식에서, 부호를 위에서 설명한 것과 같다.
하나의 대표적인 예에서, L-R1은 아래에 나타낸 구조식에 의한 하나의 구조이다.:
Figure 112008019904915-PCT00154
하나의 대표적인 예에서, A1 및 A2는 각각 -OH와 -OCH3에서 선택한다.
Ⅲ. 방법(the methods)
위에서 설명한 콘주게이트(conjugates) 이외에, 본 발명은 이들의 콘주게이트와 다른 콘주게이트의 제조방법을 제공한다.
더욱이 본 발명은 질병 보유 피검자 또는 질병발생 위험이 있는 피검자에 본 발명의 하나의 콘주게이트를 투여하여 질병상태를 예방, 치료 또는 개선(회복)하는 방법을 제공한다.
대표적인 예에서, 그 콘주게이트는 하나의 폴리머 변형 성분과 하나의 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드 사이에 형성된다.
그 폴리머는 하나의 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드에 콘주게이팅 되어 있으며, 그 글리코실 결합기는 그 펩티드(또는 글리코실잔기)와 그 변형기(즉, 수용성 폴리머) 사이에 삽입되어 공유 결합한다.
그 방법에는 하나의 변형당과, 하나의 효소, 즉 그 변형당을 그 기질(substrate)에 콘주게이팅하는 하나의 글리코실 전이효소를 함유한 하나의 혼합물과 그 펩티드를 접촉하는 것을 포함한다.
그 변현당의 당 성분은 뉴클레오티드 당에서 선택하는 것이 바람직하다.
하나의 인자 Ⅶ/ 인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 합성하는 방법은
a) 시알리다아제와;
b) 하나의 글리코실 전이효소, 엑소(exo) 글리코시다아제 또는 엔도(endo) 글리코시다아제 등 하나의 글리코실 결합기의 전이를 촉진할 수 있는 하나의 효소와,
c) 변형당과,
d) 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 배합하여
그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 합성하는 것을 구성한다.
그 반응은 그 변형당과 그 펩티드 사이에 하나의 공유 결합을 형성하는 적합한 조건하에서 실시한다.
그 변형당의 당 성분은 뉴클레오티드 당에서 선택하는 것이 바람직하다.
하나의 대표적인 예에서, 위에서 설명한 변형당 등 그 변형당은 그 대응하는 뉴클레오티드 당과 같이 활성화한다.
본 발명에서 사용되는 대표적인 변형 형태의 당 뉴클레오티드에는 뉴클레오티드 모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 그 아날로그(analogs)를 포함한다.
하나의 바람직한 예에서, 그 변형당 뉴클레오티드는 하나의 UDP-글리코시드, CMP-글리코시드 또는 하나의 GDP-글리코시드에서 선택한다.
그 변형당 뉴클레오티드의 당 뉴클레오티드 부분은
UDP-갈락토오스, UDP-갈락토사민, UDP-글루코오스,
UDP-글루코사민, GDP-만노오스, GDP-푸코오스,
CMP-시알산 또는 CMP-NeuAc에서 선택하는 것이 더 바람직하다.
하나의 대표적인 예에서, 그 뉴클레오티드 포스페이트는 C-1에서 결합되어 있다.
또, 발명은 6-탄소 위치에서 L-R1으로 변형시킨 당 뉴클레오티드의 사용을 제공한다.
이 예에 의한 대표적인 종(species)에는 다음에 나타낸 구조식을 포함한다:
Figure 112008019904915-PCT00155
위 구조식에서, 모든 R기는 및 L은 위에서 설명한 것과 같은 성분을 나타낸다. 지수 y는 0, 1 또는 2이다. 하나의 대표적인 예에서, L은 NH와 R1 사이의 하나의 결합이다. 그 염기는 하나의 핵산 염기이다.
본 발명에서 유용한 6-위치에서 탄소가 변형되는 대표적인 뉴클레오티드 당은 GDP 만노오스의 입체 화학적 특성을 가진 종으로 아래에 나타낸 구조식을 포함한다:
Figure 112008019904915-PCT00156
위 구조식에서, X5는 하나의 결합 또는 0이다.
지수 i는 0(zero) 또는 1을 나타낸다.
지수 a는 1 ~ 20의 정수를 나타낸다.
지수 e 및 f는 독립하여 1 ~ 2500의 정수를 나타낸다.
Q는 위에서 설명한 것과 같이, H 또는 치환 또는 비치환 C1~C6 알킬이다.
또, S가 O로 치환되는 세린 유도체가 이 일반 구조식내에 포함된다는 것은 이 분야 기술자가 알 수 있다.
또 다른 하나의 대표적인 예에서, 본 발명은 그 변형당이 UDP 갈락토오스의 입체 화학적 작용을 기준으로 하는 하나의 콘주게이트를 제공한다.
이 발명에서 유용한 하나의 대표적인 뉴클레오티드당은 아래에 나타낸 구조 식의 구조를 가진다.
Figure 112008019904915-PCT00157
또 다른 대표적인 예에서, 그 뉴클레오티드당은 글루코오스의 입체화학적 작용을 기준으로 한다. 이 예에 의한 대표적인 종(species)은 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00158
Figure 112008019904915-PCT00159
이와 같이, 글리코실 성분이 시알산인 하나의 대표적인 예에서 본 발명의 방법은 아래에 나타낸 구조식을 가진 화합물을 사용한다:
Figure 112008019904915-PCT00160
위 구조식에서, L-R1은 위에서 설명한 것과 같으며, L1-R1은 변형기에 결합된 하나의 링커를 나타낸다. L에서와 같이, L1에 의한 대표적인 링커종(linker species)에는 하나의 결합, 알킬 또는 헤테로 알킬 성분을 포함한다.
더욱이, 위에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 직쇄 또는 분기 수용성 폴리머로 변형시킨 뉴클레오티드당의 사용을 제공한다. 예로서, 아래에 나타낸 구조식을 가진 화합물을 본 발명의 범위 내에서 콘주게이트의 제조에 유용하다:
Figure 112008019904915-PCT00161
위 구조식에서,
X4는 O(산소) 또는 하나의 결합이다.
일반적으로, 그 당성분 또는 당성분-링커 카세트(cassette) 또는 PEG 또는 PEG-링커 카세트 그룹(groups)은 반응성기를 사용하여 함께 결합되며, 그 반응성기들은 결합프로세스에 의해 하나의 유기 작용기 또는 미반응성종으로 일반적으로 변형시킨다. 그 당반응성 작용기는 그 당성분상의 어느 위치에서도 위치된다. 본 발명의 실시에 유용한 반응성기와 여러가지 유별의 반응은 바이오콘주게이트의 화학적 작용기술에서 일반적으로 공지된 것이다.
반응성 당 성분으로 이용할 수 있는 바람직한 현행반응유별(classes)은 비교적 온화한 조건 하에서 처리되는 반응이다.
이들의 반응에는 구핵(nucleophilic) 치환(즉, 아민 및 알코올과 아실할라이드, 활성에스테르의 반응), 구전자(electrophilic)치환(즉, 에나민반응) 및 탄소-탄소와 탄소-헤테로원자 다중결합의 부가(즉, 미카엘반응, 딜스-알더 부가)를 포함하나 한정된 것은 아니다.
이들의 반응과 다른 유용한 반응은 예로서 아래의 참고문헌에서 기재되어 있 다. :
March, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; Feeney 등, Modification of proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982
하나의 당핵 또는 변형기에서 부속(또는 현수)(pendent)되어 있는 유용한 반응성 작용기들은
(a) N-히드록시 숙신이미드에스테르, N-히드록시 벤즈트리아졸 에스테르, 산할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스테르, P-니트로페닐에스테르, 알킬, 알케닐, 알머닐 및 방향족에스테르를 포함하나 한정되지 않은 카르복실기 빛 여러가지의 그 유도체;
(b) 에스테르, 에테르, 알데히드 등으로 전환시킬 수 있는 히드록실기;
(c) 할로알킬기(여기서 할라이드가 하나의 구핵기(예로서 하나의 아민, 하나의 카르복실레이트 아니온, 티올 아니온, 카르바니온, 또는 하나의 알콕시드 이온등)로 후치환됨으로써 할로겐 원자의 작용기에서 하나의 새로운 기의 공유결합을 얻음);
(d) 디에노필(dienophile)기 (예로서, 말레이미도기등 딜스-알더(Diels-Alder) 반응에 참가할 수 있는 기(groups)임);
(e) 카르보닐 유도체(예로서, 이민, 히드라존, 세미카르바존, 또는 옥심)의 형성에 의해, 또는 그리냐르(Grignard) 부가 또는 알킬리튬 부가 등의 메카니즘에 의해 후속 유도체가 가능하도록 하는 알데히드 또는 케톤기;
(f) 아민과의 후속반응으로, 예로서 술폰아미드를 형성하는 술포닐 할라이드기;
(g) 예로서, 디술피드로 전환시킬수 있거나 또는 아실할라이드와 반응시킬 수 있는 티올기;
(h) 예로서, 아실화, 알킬화 또는 산화시킬 수 있는 아민 또는 술프히드릴기;
(i) 예로서, 시클로부가, 아실화, 미카엘 부가 등을 실시할 수 있는 알켄 및
(j) 예로서, 아민 및 히드록실 화합물과 반응할 수 있는 에폭사이드를 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.
그 반응성 작용기를 선택하여 그 반응성 당핵 또는 변형기를 집합하는데 필요한 반응에 참가하지 않게 하거나, 또는 그 반응을 방해하지 않게 한다. 또, 하나의 반응성 작용기는 하나의 보호기의 존재에 의해 그 반응의 참가로부터 보호받을 수 있다. 이 분야의 기술자들은 반응조건의 선택설정을 방해하지 않도록 하나의 특정 작용기를 보호하는 방법을 이해하고 있다. 유용한 보호기의 예는 아래의 참고문헌을 참조할 수 있다(Greene 등, Prothective Groups in organic synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.).
다음에 이어지는 설명에서, 본 발명의 실시에서 유용한 변형당의 다수의 특정예를 설명한다.
하나의 대표적인 예에서, 하나의 시알산 유도체는 그 변형기가 결합되어 있 는 당행으로 이용된다.
시알산 유도체에 대한 설명 요지는 설명만을 명백하게 하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정한 것으로 해석할 필요는 없다.
다수의 다른 당성분은 하나의 예로서 시알산을 사용하여 설명한 것과 동일한 방식으로 활성화시켜 유도화시킬 수 있다는 것을 이 분야의 기술자들은 이해할 수 있다. 예로서, 다수의 방법은 공지된 방법에 의해 용이하게 변형시키는 수종의 당기질을 지칭하는 갈락토오스, 글루코오스, N-아세틸갈락토사민을 변형하는데 이용할 수 있다. 예로서, 다음 참고문을 참조할 수 있다(Elhalabi 등, Curr. Med. Chem. 6: 93(1999); Schafer 등, J. Org. Chem. 65: 24(2000).).
하나의 대표적인 예에서, 그 변형당은 6-아미노-N-아세틸-글리코실 성분을 기준으로 한다.
상기 스킴(scheme)에서, 지수 n은 정수 1~2500을 나타낸다. 하나의 대표적인 예에서, 이 지수는 그 폴리머의 분자량이 약 10KDa, 15Kda 또는 20KD가 되도록 선택한다.
부호 "A"는 하나의 활성기, 즉 하나의 할로, 하나의 활성화 에스테르의 하나의 성분(즉, 하나의 N-히드록시 숙신 이미드 에스테르), 하나의 카르보네이트의 하나의 성분(즉, P-니트로페닐 카르보네이트) 등을 나타낸다. 이 분야의 기술자들은 다른 PEG-아미드 뉴클레오티드당이 이 방법 및 동일한 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다는 것을 알 수 있다.
그 펩티드는 원핵세포(즉, 에.콜리등 세균세포) 또는 진핵세포(포유동물, 효 모, 곤충, 진균 및 식물세포 등)에서 일반적으로 다시(de novo) 새로 합성하거나, 또는 재조합에 의해 발현시킨다.
그 펩티드는 하나의 장편 단백질(full-lenghth protein) 또는 하나의 프라그멘트(fragment) 단백질로 할 수 있다.
더욱이, 그 펩티드는 하나의 야생형 펩티드 또는 변이 펩티드로 할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 그 펩티드에는 1개 이상의 N-또는 O-결합 글리코실화 부위를 그 펩티드 서열에 부가하는 하나의 변이(mutation)를 포함한다.
또, 발명의 방법은 재조합에 의해 생성되는 불완전 글리코실화 펩티드의 변형(modification)하는 것을 제공한다.
재조합에 의해 생성된 다수의 글리코프로테인은 글리코실화가 불충분하게 되어, 바람직하지 않은 성질, 즉 면역원성, RES에 의한 인식을 가질 수 있는 카르보 히드레이트 잔기를 나타낸다.
본 발명의 하나의 방법에서 하나의 변형당을 사용하여 그 펩티드가 하나의 수용성 폴리머, 치료제 등과 함께 동시에 더 글리코실화시켜 유도체화할 수 있다.
그 변형당의 당성분은 하나의 완전 글리코실화 펩티드 중에서 그 수용체에 적합하게 콘주게이팅하는 잔기 또는 바람직한 성질을 가진 또 다른 당성분으로 할 수 있다.
이 분야의 기술자들은 실질상 어느 펩티드 또는 글리코 펩티드라도 어느 소오스(source)에서 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명을 실시할 수 있는 대표적인 펩티드는 특허문헌 WO 03/031464 및 여 기서 설명한 다수의 참고문헌에서 기재되어있다.
본 발명의 방법에 의해 변형한 펩티드는 합성 또는 야생형 펩티드로 할 수 있고, 또 이들의 펩티드는 부위특이적 변이유발(site-directed mutagenesis) 등 종래기술에서 공지된 방법에 의해 생성된 변이 펩티드로 할 수 있다.
펩티드의 글리코실화는 일반적으로 N-결합 또는 O-결합이다. 하나의 대표적인 N-결합은 하나의 아스파라긴잔기의 측쇄에서의 그 변형당의 결합이다.
그 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 어느 아미노산이다.)은 그 아스파라긴 측쇄에서 하나의 카르보히드레이트 성분의 효소에 의한 결합 인식서열(recognition sequences)이다.
이와 같이, 하나의 폴리펩티드에서 이들의 트리펩티드 서열 존재로, 하나의 잠재적인 글리코실화 부위를 형성한다.
O-결합 글리코실화는 비천연(non-natural) 아미노산, 즉 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신을 또 사용할 수 있어도, 하나의 히드록시 아미노산(바람직하게는 세린 또는 트레오닌)의 히드록시 측쇄에 하나의 당(즉, N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 만노오스, GlcNAc, 글루코오스, 푸코오스 또는 커실로오스)의 결합(attchment)을 말한다.
더욱이, 펩티드이외에, 본 발명의 방법은 다른 생체구조(즉, 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 글리코리피드, 리피드(lipids), 스핀고이드(sphingoids), 세라미드, 전세포(whole cells)등)로 실시할 수 있다.
하나의 펩티드 또는 다른 구조에 글리코실화부위의 부가는 1개 이상의 글리 코실화 부위를 포함하도록 그 아미노산 서열을 변경(altering)함으로써 간편하게 얻어진다.
또 그 부가는 그 펩티드(O-결합글리코실화 부위용)의 서열내에서 하나의 -OH기를 제공하는 1개 이상의 종(species), 바람직하게는 세린 또는 트레오닌 잔기의 결합에 의해 얻어질 수 있다.
그 부가는 변이에 의해, 또는 그 펩티드의 전체적인 화학적 합성에 의해 얻어진다.
그 펩티드 아미노산 서열은 DNA레벨에서 변경에 의해, 특히 바람직한 아미노산으로 번역하는 코돈(codon)을 발생하도록한 사전선택염기에서 그 펩티드를 엔코딩하는 DNA를 변이함으로써, 변경되는 것이 바람직하다.
그 DNA변이는 종래기술에서 공지된 방법을 사용하여 실행하는 것이 바람직하다.
하나의 대표적인 예에서, 그 글리코실화 부위는 폴리 뉴클레오티드를 셔플링(shuffling)함으로써 부가된다.
하나의 후보 펩티드(candidate peptide)를 엔코딩하는 폴리 뉴클레오티드는 DNA 셔플링 프로토콜(protocols)로 변조(modulation)할 수 있다.
DNA 셔플링은 재조합 및 변이의 반복 프로세스로, 관련 유전자의 하나의 풀(pool)의 임의 세편화(random fragmentation)에 의해 실시하고, 이어서 하나의 폴리머 효소 사슬반응 프로세스에 의해 그 세편(fragments)을 집합한다.
참고문헌을 아래에 예시한다: Stemmer, Proc. NAH. Acad. SCi USA 91: 10747-10751(1994); Stemmer, Nature 370; 389-391(1994); USP 5,605,793;,USP 5,837,458; USP 5,830,721 및 USP 5,811,238.
본 발명을 실시할 수 있는 대표적인 펩티드, 글리코실화 부위를 부가 또는 제거하는 방법 및 글리코실 구조체 또는 서브구조체를 부가 또는 제거하는 방법은 특허문헌 WO03/031464와 그 관련 US 특허출원 및 PCT출원에서 구체적으로 기재되어 있다.
또, 본 발명은 하나의 펩티드에서 하나 이상의 선택 글리코실잔기를 부가 또는 제거한 다음, 하나의 변형당을 그 펩티드의 최소 1개의 선택 글리코실잔기에 콘주게이팅하는 이점(효과)을 가진다.
본 발병의 이예는 예로서 하나의 펩티드 상에 존재하지 않거나 소정량으로 존재하지 않는 하나의 선택 글리코실 잔기에 그 변형당을 콘주게이팅하고자 할 경우 유용하다.
이와 같이, 하나의 펩티드에 하나의 변형당을 결합(coupling)하기 전에, 그 선택 글리코실 잔기가 효소에 의한 결합 또는 화학적 결합에 의해 그 펩티드에 콘주게이팅된다.
또 다른 예에서, 하나의 글리코펩티드의 글리코실화 패턴은 그 글리코펩티드에서 하나의 카르보히드레이트 잔기의 제거에 의해, 그 변형당의 콘주게이션 전에 변경된다. 예로서, 특허문헌 WO98/31826을 참조할 수 있다.
그 글리코펩티드 상에 존재한 어느 카르보히드레이트 성분의 부가 또는 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 이루어진다. 하나의 대표적인 화학적 탈글리코실 화(deglyfosylation)는 화합물 트리플루오로매탄술폰산 또는 하나의 등가화합물에 그 폴리펩티드 변종(varients)의 노출에 의해 발생한다.
이 처리결과, 그 결합당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민) 이외에 거의 모든당을 절단하여, 동시에 그 펩티드를 무손상 상태로 잔류하도록 한다.
화학적 탈글리코실은 다음 참고문헌에 기재되어있다(Hakimuddin 등, Arch, Biochem, Biophys. 259; 52(1987); Edge 등, Ana. Biochem. 118; 131(1981)).
폴리펩티드 변종상에서 카르보히드레이트 성분의 효소에 의한 절단은 다음참고문헌에 의해 기재된 바와 같이 다수의 엔도-및 엑소-글리코시다아제를 사용하여 얻을 수 있다(참고문헌: Thotakura 등, Meth, Enzymol. 138: 350(1987)).
하나의 대표적인 예에서, 그 펩티드는 그 펩티드 상에서 글리코콘주게이션 또는 리모델링(remodeling)을 실시하기 전에 뉴라미니다아제(neuraminidase)로 주로 완전히 탈시알릴화한다. 그 다음에 이어서 글리코콘주게이션 또는 리모델링하며, 그 펩티드는 하나의 시알릴 전이효소를 사용하여 선택적으로 재시알릴화한다. 하나의 대표적인 예에서, 그 재시알릴화(re-sialylation)는 시알릴 수용체의 하나의 개체군에서 주로 각각의 말단사카릴수용체에서 발생한다(즉, >80%, 바람직하게는 85%이상, 90%이상, 바람직하게는 95%이상, 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99%이상).
하나의 바람직한 예에서, 그 사카리드는 실제적으로 하나의 균일한 시알릴화 패턴(즉, 실질상 균일한 글리코실화 패턴)을 가진다.
글리코실 성분의 화학적인 부가는 어느 공지된 방법에 의해 실시한다.
당성분의 효소에 의한 부가는 본 발명에서 사용되는 변형당의 무변성(native) 글리코실단위를 치환시키는 여기서 설명한 방법 중 하나의 변형방법을 사용하여 얻는 것이 바람직하다.
당 성분을 부가하는 다른 방법은 다음 특허문헌에서 개시되어 있다(USP 5,876,980; USP6,030,815; USP 5,728,554 및 USP 5,922,577).
선택글리코실 잔기의 대표적인 결합지점(attachment points)에는
(a) N-결합글리코실화의 공통부위와 O-결합글리코실화부위;
(b) 하나의 글리코실전이효소의 수용체인 말단 글리코실 성분;
(c) 아르기닌, 아스파라긴 및 히스티딘;
(d) 유리 카르복실기;
(e) 유리술프히드릴기(시스테인의 상기기등);
(f) 유리히드록실기(세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 상기기등);
(g) 방향족잔기(페닐알라닌, 타이토신 또는 트립토판의 상기기등); 또는
(h) 글루타민의 아미드기를 포함하나, 한정되어있는 것은 아니다.
본 발명에서 유용한 대표적인 방법은 다음 참고문헌에서 기재되어있다(특허문헌 WO87/05330; 1987. 09.11 공개; Aplin 및 Wriston, CRC CRIT. REV. Biochem. pp 259-306)1981)).
하나의 예에서, 본 발명은 하나의 결합기에 의해 2개 이상의 펩티드를 결합하는 하나의 방법을 제공한다.
그 결합기는 어느 유용한 구조이며, 직쇄 및 분기구조에서 선택할 수 있다. 하나의 펩티드에 결합되어 있는 그 링커의 각각의 말단에는 하나의 변형당(즉, 하나의 초기의 무손상 글리코실 결합기)을 포함한다.
하나의 대표적인 본 발명의 방법에서, 2개의 펩티드는 하나의 폴리머(즉, PEG링커)를 포함하는 하나의 링커에 의해 함께 결합된다.
그 구성은 위에서 설명한 일반 구조체와 일치한다. 여기서 설명한 바와 같이 본 발명의 구성에서는 2개의 무손상 글리코실 결합기(즉, s + t=1)를 포함한다.
2개의 글리코실기를 포함하는 하나의 PEG링커 상의 포커스(focus)는 구성을 명백하게 하기 위한 것이며, 본 발명의 이 예에서 유용한 링커암(arms)의 동정(identity)을 한정하는 것으로 볼 필요는 없다.
이와 같이, 하나의 PEG 성분은 하나의 제 1 글리코실 단위를 가진 하나의 제 1 말단과 하나의 제 2 글리코실 단위를 가진 하나의 제 2 말단에서 기능화한다.
상기 제 1 및 제 2 글리코실 단위는 다른 전이효소의 기질인 것이 바람직하며, 각각 제 1 및 제 2 글리코실 단위에 제 1 및 제 2 펩티드의 직립결함(orthogonal Attachment)을 하도록 한다.
실제로, 그 (글리코실)1-PEG-(글리코실)2 링커는 제 1 글리코실 단위가 하나의 기질인 제 1 펩티드와 하나의 제 1 전이효소와 접촉하여, (펩티드)1-(글리코실)1-(글리코실)2를 형성한다.
그 다음, 전이효소 및/ 또는 미반응 펩티드는 선택적으로 그 반응혼합물에서 제거한다.
제 2 글리코실 단위가 하나의 기질인 제 2 펩티드와 하나의 제 2 전이효소는 상기 (펩티드)1-(글리코실)1-PEG-(글리코실)2 콘주게이트에 부가되어 (펩티드)1-(글리코실)1-PEG-(글리코실)2-(펩티드)2를 형성한다;
그 글리코실 잔기들 중 최소 하나는 직접 또는 간접적으로 O-결합된다.
위에서 개략적으로 설명한 방법이 예로서 하나의 분기 PEG, 덴드라이머(dendrimer), 폴리(아미노산), 폴리사카리드등을 사용하여 2개 이상의 펩티드 사이에 콘주게이트를 형성하는데 적용할 수 있다는 것은 이 분야의 기술자에 의해 이해할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 본 발명의 하나의 방법에 의해 변형시킨 펩티드는 포유동물세포(즉, CHO세포) 또는 형질전환동물에서 생성된 하나의 글리코펩티드이며, 따라서 불완전하게 시알릴화한 N-및/또는 O-결합 올리고사카리드 사슬을 포함한다.
하나의 시알산이 결여되고 하나의 말단 갈락토오스 잔기가 함유되어있는 글리코펩티드의 올리고사카리드 사슬은 페질화(PEGylation), PPG화(PPGylation)할 수 있거나, 또는 하나의 변형시알산으로 변형시킬 수 있다.
아래에 나타낸 스킴(scheme)(제조공정도) 1에서, 아미노 글리코시드 1을 하나의 보호아미노산(즉, 글리신) 유도체의 활성에스테르로 처리하여, 그 당아민잔기를 그 대응하는 보호아미노산 아미드 부가물(adduct)로 전환한다.
그 부가물을 하나의 알돌라아제로 처리하여 α-히드록시 카르복실레이트 2를 생성한다. 그 화합물 2를 CMP-SA 합성효소의 작용과 그 다음 CMP 유도체의 촉매 수소첨가반응에 의해 그 대응하는 CMP 유도체로 전환시켜 화합물 3을 생성한다. 그 글리신 부가물의 생성에 의해 도입된 아민을 PEG결합의 하나의 부위로 사용하여, 그 화합물 3을 하나의 활성화 PEG 또는 PPG 유도체(즉, PEG-C(O)NHS, PEG-OC(O)O-P-니트로페닐)와 반응시킴으로써 각각 4 또는 5등의 종(species)을 생성한다.
스킴(scheme) 1
Figure 112008019904915-PCT00162
하나의 대표적인 예에서, 하나의 변형당은 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 상에서의 하나의 O-글리칸 결합부위에 결합시킬 수 있다.
사용하여 이 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 생성할 수 있는 글리코실 전이효소에는 아래의 것이 포함되어있다:
Ser56-Gle-(Xyl)n-Gal-SA-PEG-갈락토실전이효소 및 시알릴전이효소; Ser56-Glc-(Xyl)n-Xyl-PEG-키실로실전이효소; Ser60-Fuc-GlcNAc-(Gal)n-(SA)m-GlcNAc 전이효소.
Ⅲ. A. 펩티드에 변형당의 콘주게이션( conjugation of modified sugars to peptides )
PEG 변형당은 그 콘주게이션을 매개(mediate)하는 하나의 적합한 효소를 사용하여 하나의 글리코실화 또는 비(non)글리코실화 펩티드에 콘주게이팅 한다.
그 변형 도너당, 효소 및 수용체 펩티드의 농도를 선택하여 그 수용체가 소비될 때까지 글리코실화를 진행하도록 하는 것이 바람직하다.
시알릴전이효소에 대하여 설명한 아래의 구체적인 고찰은 일반적으로 다른 글리코실 전이효소 반응에 적용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 바람직한 시알릴전이효소의 리스트는 도 3에 제공하여 설명한다.
글리코실전이효소를 사용하여 바람직한 올리고사카리드 구조를 합성하는 여러 가지의 방법은 공지되어 있어, 일반적으로 본 발명에 적용할 수 있다.
대표적인 방법은 예로서 특허문헌 WO 96/32491; Ito 등, Pure Appl. Chem. 65:753 (1993); 특허문헌 USP 5,352,670; USP 5,374,541; USP 5,545,553; USP 6,399,336 및 USP 6,440,703(소유권 공유); PCT 출원(소유권 공유), WO 03/031464, WO 04/033651 및 WO 04/099231에서 기재되어 있다.
본 발명은 하나의 단일 글리코실전이효소 또는 글리코실전이효소의 조합물을 사용하여 실시한다.
예로서, 그 하나는 하나의 시알릴전이효소와 하나의 갈락토실전이효소의 하나의 조합물을 사용할 수 있다.
1종 이상의 효소를 사용하는 이들의 예에서, 그 효소와 기질은 초기반응 혼합물 중에서 조합하는 것이 바람직하며, 또는 제 1 효소반응이 완료되거나 거의 완료된 경우 제 2 효소반응의 효소와 시약을 그 반응 배지에 첨가한다.
하나의 단일 용기 내에서 2종의 효소만을 차례로 실시함으로서, 전체적인 수율은 하나의 중간 종을 분리시키는 처리공정에 비하여 향상된다. 더욱이, 추가용매와 부산물의 청소 및 폐기하는 것을 감소시킨다.
하나의 바람직한 예에서, 각각의 제 1 효소와 제 2 효소는 하나의 글리코실전이효소이다.
또 다른 바람직한 예에서, 하나의 효소는 하나의 엔도(endo) 글리코시다아제이다. 하나의 추가하는 바람직한 예에서, 2종 이상의 효소는 사용하여 본 발명의 변형 글리코프로테인을 집합한다.
그 효소들을 사용하여 그 펩티드에 변형당의 부가 전후 어느 시점에서 그 펩티드 상에서의 하나의 사카리드 구조를 변경시킨다.
또 다른 예에서, 그 방법에 의해 하나 이상의 엑소 또는 엔도 글리코시다아제를 사용하도록 한다.
그 글리코시다아제는 일반적으로 하나의 변이체로, 그 변이체가 작용하여 글리코실 결합을 파괴(rupture)하기 보다 그 결합을 형성한다.
그 변이체 글리카나아제에는 일반적으로 하나의 활성 부위의 산성 아미노산잔기에 대한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다.
예로서, 엔도글리카나아제가 엔도-H인 경우, 그 치환 활성부위 잔기를 일반 적으로 위치 130에서 Asp, 위치 132에서 Glu 또는 그 조합으로 할 수 있다. 그 아미노산은 일반적으로 세린, 알라닌, 아스파라긴 또는 글루타민으로 치환시킨다.
그 변이체 효소는 통상적으로 엔도 글리카나아제 가수분해 스텝의 역반응과 동일한 하나의 합성 스텝에 의해, 그 반응을 촉진한다.
이들의 예에서, 그 글리코실 도너분자(즉, 하나의 바람직한 올리고 또는 모노 사카리드 구조)에는 하나의 이탈기를 포함하고 있어, 그 반응은 그 단백질 상에서 하나의 GlcNAc 잔기에 그 도너분자를 부가하면서 진행한다.
예로서, 그 이탈기는 플루오리드 등 하나의 할로겐으로 할 수 있다. 다른 예에서, 그 이탈기는 하나의 Asn 또는 하나의 Asn-펩티드 성분이다. 또 다른 예에서, 그 글리코실 도너분자 상에서의 GlcNAc 잔기는 변경된다. 예로서, 그 GlcNAc 잔기는 하나의 1, 2 옥사졸린 성분으로 구성할 수 있다.
하나의 바람직한 예에서, 본 발명의 하나의 콘주게이트를 생성하는데 사용되는 각각 효소는 촉매량으로 존재한다.
하나의 특정 효소의 촉매량은 그 효소의 기질의 농도와 반응조건(온도, 시간 및 pH 값 등)에 따라 변화한다.
사전에 선택된 기질농도와 반응조건 하에서 주어진 효소의 촉매량을 측정하는 수단은 이 분야의 기술자에 의해 공지되었다.
위 처리공정을 실시하는 온도는 바로 위 동결(freezing) 온도에서 가장 감온성인 효소가 변성되는 온도까지의 범위로 할 수 있다.
바람직한 온도는 약 0℃ ~ 약 55℃의 범위, 더 바람직하게는 약 20℃ ~ 약 37℃의 범위이다.
또 다른 대표적인 예에서, 본 발명의 방법의 하나 이상의 성분은 하나의 고온성 효소(thermophilic enzyme)을 사용하여 고온에서 실시한다.
그 반응 혼합물은 그 수용체가 글리코실화 하는데 충분한 시간 동안 유지함으로써, 소정의 바람직한 콘주게이트를 형성한다.
그 콘주게이트의 일부는 24시간 이내에서 통상적으로 얻어지는 회수 가능한 양으로 하여 수시간 후에 자주 검출할 수 있다.
그 반응속도는 하나의 선택계(selected system)에 최적화하는 다수의 변동 팩터(variable factors)(즉, 효소농도, 도너농도, 수용체농도, 온도, 용매용량)에 따라 좌우된다는 것은 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.
또, 본 발명은 변형 펩티드의 산업적 규모의 생산을 제공한다.
여기서, 사용하고 있는 바와 같이, 산업적 규모(industrial scale)에서는 일반적으로 최소 1g의 완성된 순수 콘주게이트를 생산한다.
다음에 이어지는 설명에서, 본 발명은 하나의 글리코실화 펩티드에 변형 시알산 성분의 콘주게이션(conjugation)을 예시한다.
대표적인 변형 시알산은 PEG로 라벨링(labeling)한다.
PEG-변형 시알산과 글리코실화 펩티드의 사용에 대한 다음 설명의 구성요지(focus)는 설명을 명백하게 하기 위한 것으로, 이들의 2개 패턴의 콘주게이션으로 본 발명을 한정시키는 것을 의미하지 않는다.
그 설명은 일반적으로 시알산 이외 변형 글리코실 성분의 부가에 적용할 수 있다는 것은 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.
더욱이, 그 설명에서는 다른 PEG 성분, 치료성분, 바이오 분자(biomolecules)를 포함하는 PEG 이외 처리제(agents)로 하나의 글리코실 단위의 변형(modification)에 동일하게 적용할 수 있다.
하나의 효소에 의한 접근방법에서는 하나의 펩티드 또는 글리코 펩티드 상에서 페질화(PEGylated) 또는 PPG화(PPGylated) 카르보히드레이트의 선택적 도입을 사용할 수 있다.
그 방법은, PEG, PPG, 또는 하나의 차폐(masked))된 반응성 작용기를 함유한 변형당을 이용하여 적합한 글리코실전이효소 또는 글리코 합성효소와 배합한다.
바람직한 그 카르보히드레이트 결합을 형성하는 글리코실전이효소를 선택하고, 그 도너기질로서 그 변형당을 이용함으로써, 그 PEG 또는 PPG는 그 펩티드 골격상에, 하나의 글리코 펩티드의 기존의 당 잔기 상에 또는 하나의 펩티드에 부가되는 당 잔기 상에 직접 도입할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 하나의 시알릴전이효소의 하나의 수용체(acceptor)는 하나의 천연구조로서 변형되는 펩티드 상에 존재하거나, 또는 재조합에 의해, 효소처리에 의해 또는 화학적 처리에 의해 그 펩티드 상에 위치된다.
적합한 수용체에는 예로서 Galβ1,4GlcNAc, Galβ1,4GalNAc, Galβ1,3GalNAc, 락토-N-테트라오오스, Galβ1,3GlcNAc, Galβ1,3Ara, Galβ1,6GlcNAc, Galβ1,4Glc(락토오스) 및 이 분야의 기술자에 의해 공지된 기타 수용체 등 갈락토실 수용체를 포함한다(참고문헌: Paulson 등, J. Biol, Chem. 253: 5617- 5624(1978)). 대표적인 시알릴전이효소는 여기서 설명한다.
하나의 예에서, 그 시알릴전이효소의 하나의 수용체는 그 글리코 펩티드의 생체내 합성을 할 때 변형되는 글리코 펩티드 상에 존재한다.
이와 같은 글리코 펩티드는 그 글리코 펩티드의 글리코실화 패턴의 사전변형 없이 청구항의 청구방법을 사용하여 시알릴화 할 수 있다.
또, 본 발명의 방법(methods)을 사용하여 하나의 적합한 수용체를 포함하지 않은 하나의 펩티드를 시알릴화 할 수 있고; 이 처리기술에서는 이 분야의 기술자에 의해 공지된 방법에 의해 하나의 수용체를 포함하는 펩티드를 1차적으로 변형한다.
하나의 대표적인 예에서, 하나의 GalNAc 잔기는 하나의 GalNAc 전이효소의 작용에 의해 부가된다.
하나의 대표적인 예에서, 갈락토실 수용체는 그 펩티드, 즉 하나의 GlcNAc에 결합된 하나의 적합한 수용체에 하나의 갈락토오스 잔기를 결합하여 집합시킨다.
상기 방법에서는 하나의 적합한 양의 갈락토실 전이효소(즉, Galβ1, 3 또는 Galβ1, 4)와 하나의 적합한 갈락토실 도너(즉, UDP-갈락토오스)를 함유하는 하나의 반응 혼합물로 변형시키는 펩티드를 배양하는 것을 포함한다.
그 반응은 실질상 완료할 때까지 처리를 진행하도록 하거나, 또는 사전에 선택한 양의 갈락토오스 잔기를 부가할 때 그 반응을 완료시킨다.
하나의 선택 사카리드 수용체를 집합하는 다른 방법은 이 분야의 기술자에 의해 알 수 있다.
또 다른 예에서, 글리코 펩티드-결합 올리고 사카리드는 전체 또는 부분적으로 1차 "트리밍(trimmed)되어 시알릴 전이효소의 하나의 수용체 또는 하나 이상의 적합한 잔기가 부가되어 하나의 적합한 수용체를 얻을 수 있는 하나의 성분으로 나타낸다(exposing).
글리코실 전이효소와 엔도 글리코시다아제 등 효소(예로서, 특허문헌 USP 5,716,812 참조)는 결합 및 트리밍 반응에 유용하다.
이 방법의 또 다른 예에서, 그 펩티드의 시알산 성분은 주로 완전 제거되어(즉, 최소 90%, 최소 95% 또는 최소 99%) 하나의 변형 시알산의 하나의 수용체를 나타낸다(exposing).
다음에 이어지는 설명에서, 본 발명의 방법은 결합되어 있는 하나의 PEG 성분을 가진 변형당의 사용을 예시한다.
이 설명의 구성요지는 구체적 설명을 명확하게 하기 위한 것이다.
이 설명에서는 그 변형당이 하나의 치료성분, 바이오분자 등을 가진 이들의 예에 동일하게 적용할 수 있다는 것을 이 기술분야의 기술자들에 의해 알 수 있다.
변형당의 부가 전에 하나의 카르보히드레이트 잔기를 "트리밍"(trimming)하는 본 발명의 하나의 대표적 예에서, 제 1세대 2(bi) 안테나형상 구조에 고급 만노오스를 트리밍 백(trimming back)한다.
하나의 PEG 성분을 가진 하나의 변형당은 그 "트리밍 백"에 의해 나타낸 하나 이상의 당 잔기에 콘주게이팅 된다.
하나의 예에서, 하나의 PEG 성분은 그 PEG 성분에 콘주게이팅 된 하나의 GlcNAc 성분에 의해 부가된다.
그 변형된 GlcNAc는 2 안테나형상 구조의 1개 또는 2개의 말단 만노오스 잔기에 부가된다.
또, 하나의 비변형 GlcNAc가 그 분기 종의 말단 중 하나 또는 2개에 부가할 수 있다.
또 다른 대표적 예에서, 하나의 PEG 성분은 그 말단 만노오스 잔기 상에 부가된 하나의 GlcNAc 잔기에 콘주게이팅 되어 있는 하나의 갈락토오스 잔기를 가진 하나의 변형당을 통해 그 2 안테나형 구조의 말단 만노오스 잔기의 하나 또는 2개에 부가되어 있다.
또, 하나의 비변형 Gal은 하나 또는 2개의 말단 GlcNAc 잔기에 부가할 수 있다.
또 다른 예에서, 하나의 PEG 성분은 위에서 설명한 바와 같이 하나의 변형 시알산을 사용하여 하나의 Gal 잔기 상에 부가한다.
또 다른 대표적인 예에서, 하나의 고급 만노오스 구조는 그 2 안테나형상 구조가 분기된 만노오스에 "트리밍 백" 되어 있다.
하나의 예에서, 하나의 PEG 성분은 그 폴리머로 변형된 하나의 GlcNAc를 통해 부가되어 있다.
또, 하나의 비변형 GlcNAc는 그 만노오스에 부가된 후, 이어서 하나의 결합된 PEG 성분으로 하나의 Gal에 부가된다.
또 다른 예에서, 비변형 GlcNAc와 Gal 잔기는 그 만노오스에 차례로 부가되 고, 이어서 하나의 PEG 성분으로 변형된 하나의 시알산 성분에 부가된다.
또 하나의 고급 만노오스 구조는 그 기본(elementary)적인 트리-만노실 코어에 트리밍 백(trimming back)된다.
또 다른 하나의 대표적인 예에서, 고급 만노오스는 제 1 만노오스가 결합되어 있는 GlcNAc에 "트리밍 백"된다.
그 GlcNAc는 하나의 PEG 성분을 가진 하나의 Gal 잔기에 콘주게이팅된다.
또, 하나의 비변형(unmodified) Gal은 그 GlcNac에 부가된 다음, 이어서 하나의 수용성 당으로 변형시킨 하나의 시알산을 부가한다.
또 하나의 예에서, 그 말단 GlcNAc는 Gal과 콘주게이팅하고, 다음으로 그 GlcNAc는 하나의 PEG 성분을 가진 하나의 변형 푸코오스로 푸코실화 한다.
또, 고급 만노오스는 그 펩티드의 Asn에 결합된 제 1 GlcNAc로 트리밍 백 할 수 있다.
하나의 예에서, 그 GlcNAc-(Fuc)a 잔기의 GlcNAc가 하나의 수용성 폴리머를 가진 하나의 GlcNAc와 콘주게이팅 된다.
또 다른 예에서, 그 GlcNAc-(Fuc)a 잔기의 GlcNAc는 Gal로 변형되어 하나의 수용성 폴리머를 가진다.
하나의 또 다른 예에서, 그 GlcNAc는 Gal로 변형된 다음에, 이어서 하나의 PEG 성분으로 변형시킨 하나의 시알산의 그 Gal과 콘주게이션에 의해 변형된다.
다른 대표적인 예는 특허문헌[미국 특허출원 공개 공보: 20040132640; 20040063911; 20040137557; 미국 특허출원 10/369,979; 10/410,913; 10/360,770; 10/410,945 및 PCT/US02/32263]에 기재되어 있다. 이들의 특허문헌을 여기서 참고로 예시한다.
위에서 기재한 예들은 여기서 설명한 방법의 구체적 설명을 제공한 것이다. 여기서 설명한 방법을 사용하여 어느 바람직한 구조의 하나의 카르보히드레이트 잔기를 "트리밍 백"하여 구성할 수 있다.
그 변형당은 여기서 설명한 바와 같이 카르보히드레이트 성분의 말단에 부가할 수 있거나, 또는 그 카르보히드레이트의 말단과 펩티드 코어 사이에서 중간체로 할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 하나의 기존의 시알산은 하나의 시알리다아제를 사용하여 하나의 글리코 펩티드에서 제거함으로써 그 기초가 되는 갈락토실 잔기의 모두 또는 대부분을 나타낸다(unmasking).
또, 하나의 펩티드 또는 글리코 펩티드는 갈락토오스 잔기 또는 하나의 갈락토오스 단위에서 종료되는 하나의 올리고 사카리드로 라벨링(labeling)된다.
그 갈락토오스 잔기의 노출 또는 부가한 다음에, 하나의 적합한 시알릴 전이효소를 사용하여 하나의 변형 시알산을 부가한다.
또 다른 대표적인 예에서, 시알산 상에서 시알산을 전이하는 하나의 효소를 사용한다.
하나의 시알릴화 글리칸을 하나의 시알리다아제로 처리하지 않고 이 방법을 실시하여 그 시알산 바로 아래에 있는 글리칸 잔기를 노출시킬 수 있다.
하나의 대표적인 폴리머-변형 시알산은 폴리(에틸렌 글리콜)로 변형시킨 하나의 시알산이다.
시알산과 변형 시알산 성분을, 하나의 시알산 잔기를 함유한 글리칸 상에 부가하거나, 또는 하나의 기존의 시알산 잔기를, 이들의 종의 하나의 글리칸 상에서 치환하는 다른 대표적인 효소에는 ST3Gal3, CST-Ⅱ, ST8Sia-Ⅱ, ST8Sia-Ⅲ 및 ST8Sia-Ⅳ가 있다.
또 다른 접근방법에서, 하나의 차폐(masked) 반응성이 있는 기능성(reactive functionality)은 그 시알산에 존재한다.
그 차폐 반응성이 있는 작용기는 그 변형 시알산을 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드에 결합하는데 사용되는 조건에 의해 영향을 받지 않는 것이 바람직하다.
그 펩티드에 그 변형 시알산을 공유 결합한 다음에, 그 차폐(mask)를 제거하고, 그 펩티드를 PEG 등 하나의 처리제로 콘주게이팅 한다.
그 처리제(agent)는 그 변형당 잔기 상에서 노출된 반응성기와의 반응에 의해 특정지게 그 펩티드에 콘주게이팅 되어 있다.
어느 변형당이라도 그 글리코 펩티드의 올리고 사카리드 측쇄 말단 당에 따라, 적합한 글리코실 전이효소로 사용할 수 있다.
위에서 설명한 바와 같이, 그 PEG화 구조 도입에 필요로 하는 글리코 펩티드의 말단 당은 발현할 때 자연적으로 도입할 수 있거나, 또는 적합한 글리코시다아제, 글리코실 전이효소 또는 글리코다아제와 글리코실 전이효소의 혼합물(mix)을 사용하여 후 발현(post expression)을 얻을 수 있다.
또 하나의 대표적인 예에서, UDP-갈락토오스-PEG를 β1,4-갈락토실 전이효소와 처리함으로써, 그 변형 갈락토오스를 적합한 말단 N-아세틸 글로코사민 구조로 전이한다.
그 글리코 펩티드 상의 말단 GlcNAc 잔기는 포유동물, 곤충, 식물체 또는 진균 등에서와 같은 발현 시스템에서 발생할 수 있는 바와 같이 발현할 때 얻을 수 있으나, 또 그 글리코 펩티드를 하나의 시알리다아제 및/또는 글리코시다아제 및/또는 글리코실 전이효소와 필요에 따라 처리하여 얻을 수 있다.
또 다른 대표적인 예에서, GNT1-5 등 하나의 GlcNAc 전이효소는 하나의 글리코 펩티드 상에서 페질화(PEG화)-GlcNAc를 하나의 말단 만노오스 잔기로 전이하는데 사용된다.
하나의 또 다른 대표적인 예에서, 하나의 N-및/또는 O-결합 글리칸 구조는 하나의 글리코 펩티드에서 효소에 의해 제거시켜 그 변형당으로 콘주게이팅하는 하나의 아미노산 또는 하나의 말단 글리코실 잔기를 노출시킨다.
예로서, 하나의 엔도 글리카나아제를 사용하여 하나의 글리코 펩티드의 N-결합 구조를 제거시켜 그 글리코 펩티드 상에서 하나의 GlcNAc-결합-Asn과 같이 하나의 말단 GlcNAc를 노출시킨다.
UDP-Gal-PEG와 적합한 갈락토실 전이효소를 사용하여 그 노출된 GlcNAc 상에 PEG-갈락토오스 기능성을 도입한다.
하나의 또 다른 예에서, 그 변형당은 그 펩티드 골격으로 당 잔기를 전이하는데 공지되어 있는 하나의 글리코실 전이효소를 사용하여 그 펩티드 골격에 적접 부가한다.
본 발명의 실시에서 유용한 대표적인 글리코실 전이효소에는 GalNAc 전이효소(GalNAc T1-14), GlcNAc 전이효소, 푸코실 전이효소, 글루코실 전이효소, 키실로스 전이효소, 만노실 전이효소 등을 포함하나, 한정되어 있는 것은 아니다.
이와 같은 접근방법을 사용함으로써, 어느 카르보히드레이트라도 결여되어 있는 펩티드 상에서, 또는 기존의 글리코 펩티드 상에서 변형당의 직접 부가를 하도록 한다.
상기 두 경우에서, 그 변형당의 부가는 그 글리코실 전이효소의 기질 특이성(substrate specificity)에 의해 규정되어 있는 바와 같이 그 펩티드 골격 상의 특정위치에서 발생하며, 화학적 방법을 사용하여 하나의 단백질의 펩티드 골격을 변형할 때 발생하는 것과 같이 임의로 발생하지 않는다.
처리제(agents)는 그 폴리 펩티드 사슬에 적합한 아미노산 서열을 작용하여 글리코실 전이효소 기질의 펩티드가 결여되어 있는 단밸질 또는 글리코 펩티드에 도입할 수 있다.
위에서 설명한 각각의 대표적인 예에서, 하나 이상의 추가한 화학적 또는 효소에 의한 변형 스텝(modification steps)을 이용하여 그 펩티드에 변형당을 콘주게이션 한다.
하나의 대표적인 예에서, 하나의 효소(즉, 푸코실 전이효소)를 사용하여 하나의 글리코실 단위(즉, 푸코오스)를 그 펩티드에 결합된 말단 변형당에 현수(부속)(appending)한다.
또 다른 예에서, 하나의 효소에 의하 반응을 사용하여 그 변형당이 콘주게이팅 되지 않은 부위(site)를 "캐핑"(capping) 한다.
예로서, 그 콘주게이팅된 변형당은 처리제(agents)와 반응하여, 그 처리제는 그 변형당이 결합되어 있는 펩티드 성분과의 결합을 안정화 또는 탈안정화(destabilization)한다.
또 다른 예에서, 그 변형당의 하나의 성분은 탈보호 되어 그 펩티드에 콘주게이션 된다.
그 변형당이 그 펩티드에 콘주게이팅된 후 하나의 단계(a stage)에서 본 발명의 방법에서 유용한 효소 및 화학적 처리공정이 있다는 것은 이 분야의 기술자에 의해 이해할 수 있다.
그 변형당-펩티드 콘주게이트의 또 다른 제조는 본 발명의 범위내에 존재한다.
본 발명의 콘주게이트의 제조를 위한 효소 및 반응조건은 본 발명 출원과 특허문헌 WO 03/031464, WO 04/033651 및 WO 04/099231(본 특허출원의 출원인의 공동소유 임)에서 구체적으로 기재되어 있다.
하나의 선택한 예에서, 곤충 세포에서 발현된 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 리모델링(remodeling)하여, 그 리모델링된 글리코 펩티드 상의 글리칸에는 하나의 GlcNAc-Gal 글리코실 잔기를 포함하도록 한다.
GlcNAc와 Gal의 부가는 하나의 단일 용기 중에서 하나의 단일반응으로 또는 분리반응으로 하여 발생할 수 있다.
이 예에서는 GlcNAc-전이효소 Ⅰ및 Gal-전이효소 Ⅰ이 사용된다.
그 변형 시알릴 성분은 ST3Gal-Ⅲ를 사용하여 부가한다.
또 다른 예에서, GlcNAc, Gal 및 변형 Sia의 부가는 또 위에서 설명한 효소를 사용하여 하나의 단일반응 용기내에서 발생할 수 있다.
각각의 효소에 의한 리모델링과 글리코 페질화(glyoPEGylation) 스텝은 개별적으로 실시한다.
그 펩티드가 포유동물 세포에서 발현될 경우, 다른 방법들이 유용하다.
하나의 예에서, 그 펩티디는 Sia-Sia-L-R1을 형성하는 그 펩티드 상에서 하나의 시알산에 직접 그 변형 시알산을 전이하거나, 또는 Sia-L-R1을 형성하는, 그 변형 시알산의 펩티드 상에서 하나의 시알산을 치환하는 하나의 시알릴전이효소와 그 펩티드를 접촉시켜 콘주게이션 하기 전에 리모델링할 필요 없이 콘주게팅 한다.
이 방법에서 유용한 하나의 대표적인 효소는 CSR-Ⅱ이다.
시알산을 시알산에 부가하는 다른 효소는 이 기술분야의 기술자에 의해 공지되었으며, 이와 같은 효소의 예는 여기서 첨부된 도면에서 기재되었다.
본 발명의 콘주게이트를 제조하는 다른 방법에서, 하나의 포유동물 시스템에서 발현된 상기 펩티드는 하나의 시알리다아제를 사용하여 탈시알릴화(desialylation)한다.
그 노출된 Gal 잔기는 O-결합 글리칸에 특이성이 있는 하나의 시알릴 전이효소를 사용하여 하나의 변형 시알산으로 시알릴화하여, 하나의 O-결합 변형 글리칸 을 가진 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 제공한다.
그 탈시알릴화한 변형 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 ST3GalⅢ 등 하나의 시알릴 전이효소를 사용하여 선택적으로, 부분 또는 완전 리시알릴화(re-sialylation)시킨다.
또 다른 국면(aspect)에서, 본 발명은 본 발명의 하나의 페질화(PEGylated) 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 제조방법을 제공한다.
그 방법은 (a) 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 글리코실기를 함유하는 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를
Figure 112008019904915-PCT00163
아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 구조식을 가진 하나의 PEG-시알산 도너
Figure 112008019904915-PCT00164
및 상기 글리코실기의 GalNAc, Gal 및 Sia에서 선택한 하나의 멤버 상에서 상기 도너로부터 PEG-시알산을 전이하는 하나의 효소와 함께, 상기 전이에 적합한 조건하에서 접촉하는 것을 포함한다.
하나의 대표적인 변형 시알산 도너는 하나의 링커 성분을 통해, 하나의 폴리머, 즉 하나의 직쇄 또는 분기 폴리(에틸렌 글리콜) 성분으로 변형시킨 CMP-시알산 이다.
위에서 설명한 바와 같이, 그 펩티드는 그 변형당을 결합하기 전에 GalNAc 및/또는 Gal 및/또는 Sia("리모델링": remodeling)로 선택적으로 글리코실화 한다.
그 리모델링 스텝(remodeling steps)은 차례로 동일 용기 내에서 스텝 사이에서 글리코실화 펩티드를 정제하지 않고 실시할 수 있다.
또, 하나 이상의 리모델링 스텝을 밟은 후에, 이어지는 다음의 글리코실화 스텝 또는 글리코 페질화(glycoPEGylation) 스텝으로 진행하기 전 그 글리코실화 펩티드를 정제할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 그 방법은 하나의 숙주 내에서 그 펩티드를 발현하는 것을 더 포함한다.
하나의 대표적인 예에서, 그 숙주는 하나의 포유동물 세포 또는 하나의 곤충 세포이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 포유동물 세포는 하나의 BHK 세포와 하나의 CHO 세포에서 선택된 하나의 멤버이며,
그 곤충세포는 하나의 스포도프테라 프루기페르다 세포(spodoptera frugiperda cell)이다.
상기 예에서, 구체적으로 설명되고, 아래에서 더 설명한 바와 같이, 그 PEG-당의 하나의 수용체 성분의 위치 설정은 어느 소정의 스텝에서 얻어진다.
예로서, 하나의 예에서, 그 펩티드에 GalNAc의 부가 후에 제 2 스텝에 의해 그 PEG-당은 동일한 반응용기 내에서 그 GalNAc에 콘주게이팅 한다.
또, 이들의 2개의 스텝은 거의 동시에 하나의 단일 용기 내에서 실시할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 그 PEG-시알산 도너는 아래에 나타낸 구조식을 갖니다:
Figure 112008019904915-PCT00165
Figure 112008019904915-PCT00166
또 다른 대표적인 예에서, 그 PEG-시알산 도너는 다음 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00167
하나의 다른 대표적 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 글리코 페질화 또는 리모델링하기 전에 하나의 적합한 발현 시스템에서 발현된다.
대표적인 발현 시스템에는 Sf-9/바쿠로바이러스(baculovirus) 및 차이니즈 햄스터 난소(또는 CHO 세포)[Chinese Hamster Ovary(CHO) cells]를 포함한다.
하나의 대표적인 예에서, 본 발명은 아래에 나타낸 구조식을 가진 하나의 변형 시알릴 잔기를 함유하는 하나의 글리코실 링커로 이루어진 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 제조방법을 제공한다.
Figure 112008019904915-PCT00168
위 구조식에서,
D는 -OH 및 R1-L-NH에서 선택한 하나의 멤버이다.
G는 R1-L- 및 -C(O)(C1 -C6) 알킬-R1에서 선택한 하나의 멤버이고,
R1은 하나의 직쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기와 분기 폴리(에틸렌 글리콜) 잔 기에서 선택한 하나의 멤버를 함유하는 하나의 성분(moiety)이며,
M은 H, 하나의 금속 및 하나의 단일 음전하에서 선택한 하나의 멤버이고,
L은 하나의 결합, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하나의 멤버인 링커이다.
여기서, D가 OH일 경우, G는 R1-L이고,
G가 -C(O)(C1-C6)알킬일 경우, D가 R1-L-NH-로 되도록 한다.
본 발명의 상기 방법은 (a) 아래에 나타낸 글리코실 성분을 함유하는 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를
Figure 112008019904915-PCT00169
아래에 나타낸 구조식을 가진 하나의 PEG-시알산 도너 성분 및
Figure 112008019904915-PCT00170
상기 PEG-시알산을 상기 글리코실 성분의 Gal 상에 전이하는 하나의 효소와 함께 상기 전이에 적합한 조건하에서 접촉하는 것으로 이루어진다.
하나의 대표적인 예에서, L-R1은 아래에 나타낸 구조식을 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00171
위 구조식에서,
지수 a는 0 ~ 20에서 선택한 하나의 정수이다.
또 다른 대표적인 예에서, R1은 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조를 가진다:
Figure 112008019904915-PCT00172
Figure 112008019904915-PCT00173
위 구조식에서,
지수 e, f, m 및 n은 1 ~ 2500에서 독립하여 선택한 정수이고, 지수 q는 1 ~ 20에서 선택한 하나의 정수이다.
인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 대규모량(large scale amounts) 또는 소규모량(small scale amounts)은 여기서 설명한 본 발명의 방법(methods)에 의해 생산할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 양은 약 0.5㎎ ~ 약 100㎏에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 양은 약 0.1㎏ ~ 약 1㎏에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 양은 약 0.5㎏ ~ 약 10㎏에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 양은 약 0.5㎏ ~ 약 3㎏에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 양은 약 0.1㎏ ~ 약 5㎏에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 양은 약 0.08㎏ ~ 약 0.2㎏에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 양은 약 0.05㎏ ~ 약 0.4㎏에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 양은 약 0.1㎏ ~ 약 0.7㎏에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 양은 약 0.3㎏ ~ 약 1.75㎏에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 양은 약 25㎏ ~ 약 65㎏에서 선택한 하나의 멤버이다.
여기서 설명한 반응에서 사용되는 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 농도는 약 0.5 ~ 약 10㎎의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드/mL 반응 혼합액에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 농도는 약 0.5㎎ ~ 약 1㎎의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드/mL 반응 혼합액에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 농도는 약 0.8㎎ ~ 약 3㎎의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드/mL 반응 혼합액에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 농도는 약 2㎎ ~ 약 6㎎의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드/mL 반응 혼합액에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 농도는 약 4㎎ ~ 약 9㎎의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드/mL 반응 혼합액에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 농도는 약 1.2㎎ ~ 약 7.8㎎의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드/mL 반응 혼합액에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드/mL 반응 혼합액에서 선택한 하나의 멤버이다.
여기서 설명한 반응에서 사용할 수 있는 CMP-SA-PEG의 농도는 약 0.1 ~ 약 1.0mM에서 선택한 하나의 멤버이다.
그 농도를 증감할 수 있는 팩터(factors)에는 PEG의 크기, 배양시간, 온도, 버퍼성분과, 사용되는 글리코실 전이효소의 종류(type)와 농도가 포함한다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG 농도는 약 0.1 ~ 약 1.0mM에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG 농도는 약 0.1 ~ 약 0.5mM에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG 농도는 약 0.1 ~ 약 0.3mM에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG 농도는 약 0.2 ~ 약 0.7mM에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG 농도는 약 0.3 ~ 약 0.5mM에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG 농도는 약 0.4 ~ 약 1.0mM에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG 농도는 약 0.5 ~ 약 0.7mM에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG 농도는 약 0.8 ~ 약 0.95mM에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG 농도는 약 0.55 ~ 약 1.0mM에서 선택한 하나의 멤버이다.
여기서 설명한 반응에서 사용할 수 있는 CMP-SA-PEG의 몰 당량의 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 단밸질에 첨가할 수 있는 SA-PEG의 이론적인 수를 기준으로 한다.
그 SA-PEG의 이론적인 수는 CMP-SA-PEG의 분자량(MW) 및 몰(moles)과 대비할 때, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 단백질 상에서의 시알레이션(sialation) 부위의 이론적 수와 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 단백질의 분자량을 기준으로 한다.
인자 Ⅶ/인자 Ⅶa에 있어서, 이것은 N-글리칸을 기준으로 하여 약 4개 또는 5개의 PEG이며, 그 글리칸은 2개의 글리칸 부위만으로 초기에 비(bi) 및 트리(tri) 안테나형상으로 형성되어 있다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG의 몰 당량은 1 ~ 20에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG의 몰 당량은 2 ~ 6에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG의 몰 당량은 3 ~ 17에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG의 몰 당량은 4 ~ 11에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG의 몰 당량은 5 ~ 20에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG의 몰 당량은 1 ~ 10에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG의 몰 당량은 12 ~ 20에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG의 몰 당량은 14 ~ 17에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG의 몰 당량은 7 ~ 15에서 선택한 정수이다.
하나의 대표적인 예에서, CMP-SA-PEG의 몰 당량은 8 ~ 16에서 선택한 정수이다.
III. B. 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa의 동시 탈시알릴화 및 글리코페질화( simultaneous Desialylation and GlycoPEGylation of Factor Ⅶ/ Factor Ⅶa)
본 발명은 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa를 글리코페질화하는(glycopegylating) 하나의 "원-폿"(one-pot)방법을 제공한다.
상기 원-폿방법은 하나의 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 제조하는 다른 대표적인 방법과 현저한 차이가 있다. 그 다른 제조방법에서는 시알리다아제로 순차적으로 탈-시알랄화하고, 그 다음 아니온치환 컬럼상에서 아시알로(asialo)인자 Ⅶ/인자 Ⅶa를 순차적으로 정제하며, 그 다음 CMP-시알산-PEG와 글리코실 전이효소(ST3Gal3 등), 엑소글리코시다아제 또는 엔도글리코시다아제를 사용하여 글리코페질화하는 것을 사용하여 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 제조한다.
그 다음 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 아니온치환에 의해 정제하고, 이어서 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 그 정제된 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩 티드 콘주게이트를 생성한다.
그 원-폿방법은 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 제조하는 하나의 개량방법을 제공한다.
이 방법에서, 앞에서 설명한 프로세스에서 사용한 제 1 아니온치환 크로마토그래피를 제거한 하나의 원-폿반응에서 그 탈시알릴화반응과 글리코페질화 반응을 조합시켜 그 아시알로 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 정제한다.
이 프로세스 스텝에서의 스텝감축은 수종의 잇점을 얻는다. 첫째로, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 제조에 필요로 하는 프로세스 스텝의 수를 감소시켜, 그 프로세스 스텝의 조작복잡성을 감축한다.
둘째로, 그 펩티드 콘주게이트의 제조 프로세스시간을 감축한다. 즉 4일에서 2일로 감축한다. 이것은 프로세스 스텝(in-process) 중에서의 조절과 관련된 품질제어비용과 원료의 필수요건을 감축한다.
셋째로, 본 발명이 더 적은양의 시알리다아제를 사용한다. 즉, 20배의 더 적은양의 시알리다아제를 사용한다. 즉, 이 프로세스에 관련된 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 제조에 500mU/L가 필요하다. 시알리다아제를 사용할 때 이와같은 감소로 인하여, 이 반응 혼합물 중에서 시알리다아제 등 오염물질의 양을 현저하게 감소한다.
하나의 대표적인 예에서, 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 다음에 설명한 방법에 의해 제조한다.
제 1 스텝에서, 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 본 발명의 하나의 시알리 다아제, 하나의 변형당과, 그 변형당에서 그 펩티드로 글리코실 결합기의 전이를 촉진할 수 있는 하나의 효소를 배합하여, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 제조한다. 어느 시알리다아제라도 이 방법에서 사용할 수 있다. 본 발명에서 유용한 대표적인 시알리다아제는 CAZY 데이터베이스에서 확인할 수 있다(http :/ afmb . cnrs - mrs . fr / CAZY / index . html 및 WWW . cazy . org / CAZY 참조).
대표적인 시알리다아제는 입수원(sources)의 어느 멤버에서도 구입할 수 있다(QA-Bio, Calbiochem, Marukin, prozyme 등).
하나의 대표적인 예에서, 그 시알리다아제는 사이토플라즘(cytoplasmic) 시알리다아제, 라이소소말(lysosomal) 시알리다아제, 엑소(exo)-
Figure 112008019904915-PCT00174
시알리다아제 및 엔도시알리다아제에서 선택한 하나의 멤버이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 사용되는 시알리다아제는 클로스트리듐 퍼프링겐스(Clostridium perfringens)등 세균, 또는 아데노바이러스(adenovirus) 등 바이러스에서 생성된다.
하나의 대표적인 예에서, 그 변형당에서 그 펩티드로 글리코실 결합기의 전이를 촉진할 수 있는 그 효소는 시알릴전이효소 및 무코실전이효소 등 하나의 글리코실 전이효소와, 엑소글리코시다아제 및 엔도글리코시다아제에서 선택한 하나의 멤버이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 효소는 하나의 글리코실 전이효소로 ST3 Gal3이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 사용되는 효소는 에쉐리키아 콜리(Escherichia Coli)등 세균 또는 아스페로길러스 니거(Aspergillus niger)등 진균에서 생성한다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 시알리다아제는 소정시간 동안 그 글리코실전이효소의 부가전에 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드에 부가시켜, PEG-시알산 반응물질과 글리코실전이효소를 부가하면서 글리코페질화반응을 개시하기 전에, 그 시알리다아제 반응을 처리하도록 한다.
여러 가지의 이들의 예를 설명하였으나, 최종적으로, 여기서 설명한 어느 변형당이라도 이 반응에서 사용할 수 있다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 방법은 하나의 "캐핑"(capping)스텝을 더 포함한다.
이 스텝에서, 추가하는 비페질화(non-PEGylated) 시알산은 이 반응 혼합물에 첨가할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 이 시알산은 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 또는 펩티드 콘주게이트에 부가시켜, PEG-시알산의 부가를 더 방지한다.
또 다른 대표적인 예에서, 이 시알산은 이 반응 혼합물 중에서 그 글리코실전이효소의 작용(기능)을 방해하여, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 또는 펩티드 콘주게이트에 글리코실 결합기의 부가를 효과적으로 정지시킨다.
가장 중요한 것으로, 그 반응혼합물에 첨가한 그 시알산은 비글리코페질화 글리칸을 캐핑(capping)함으로써, 약물동태(pharmaceokinetics)를 개선(향상)하는 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 제공한다. 또, 이 시알리다아제는 사전 정제없이 소정량까지 페질화 범위가 바람할 때 그 글리코페질화 반응혼합물에 직접 첨가할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 그 캐핑스텝(capping step) 후에 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 또는 펩티드 콘주게이트 상에서 시알릴화부위 중 약 50% 이하가 하나의 시알릴성분을 함유하지 않는다.
하나의 대표적인 예에서, 그 캐핑스텝 후에 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 또는 펩티드 콘주게이트 상에서 시알릴화 부위 중 약 40% 이하가 하나의 시알릴 성분을 함유하지 않는다.
하나의 대표적인 예에서, 그 캐핑스텝 후에 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 또는 펩티드 콘주게이트 상에서 그 시알릴화 부위 중 약 30%이하가 하나의 시알릴성분을 함유하지 않는다.
하나의 대표적인 예에서, 그 캐핑스텝 후에 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 또는 펩티드 콘주게이트 상에서 그 시알릴화 부위 중 약 20%이하가 하나의 시알릴 성분을 함유하지 않는다.
하나의 대표적인 예에서, 그 캐핑스텝 후에 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 또는 펩티드 콘주게이트 상에서 그 시알릴화 부위 중 약 10%이하가 하나의 시알릴 성분을 함유하지 않는다.
하나의 대표적인 예에서, 그 캐핑스텝 후에 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 또는 펩티드 콘주게이트 상에서 그 시알릴화 부위 중 약 20%~약 5%가 하나의 시알릴 성분을 함유하지 않는다.
하나의 대표적인 예에서, 그 캐핑스텝 후에 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 또는 펩티드 콘주게이트 상에서 그 시알릴화 부위 중 약 25%~약 10%가 하나의 시알릴 성분을 함유하지 않는다.
하나의 대표적인 예에서, 그 캐핑스텝 후에 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 또는 펩티드 콘주게이트 상에서 그 시알릴화 부위 모두가 하나의 시알릴 성분을 함유하지 않는다.
III. C. 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 탈시알릴화 및 선택변형 ( Desialylation and selective modification of Factor Ⅶ Factor Ⅶa peptides )
또 다른 대표적인 예에서, 본 발명은 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 탈 시알릴화하는 방법을 제공한다.
그 방법은 최소 약 40%, 바람직하게는 45%, 바람직하게는 50%, 바람직하게는 약 55%, 바람직하게는 약 60%, 바람직하게는 약 65%, 바람직하게는 약 70%, 바람직하게는 약 75%, 바람직하게는 약 80%, 바람직하게는 최소 85%, 더 바람직하게는 최소 90%, 좀 더 바람직하게는 최소 92%, 바람직하게는 최소 94%, 더 바람직하게는 최소 96%, 더욱더 바람직하게는 최소 98%, 가장 더 바람직하게는 100% 탈시알릴화하는 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 제공하는 것이 바람직하다.
그 방법에는 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 하나의 시알릴다아제와 바람직하게는 소정의 시간동안 접촉하는 것을 포함한다.
그 사전에 선택한 시간은 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 바람직한 정도까지 탈시알릴화하는데 충분하다.
하나의 바람직한 예에서, 그 탈시알릴화한 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 소정 정도의 탈시알릴화가 얻어질 때 그 시알리다아제에서 분리한다. 하나의 대표적인 탈시알릴화반응과 정제 사이클을 여기서 설명한다.
이 분야의 기술자들은 그 탈시알릴화 반응을 실시하는 시간에 대하여 적합한 소정의 시간을 측정할 수 있다. 하나의 대표적인 예에서, 그 소정의 바람직한 시간은 24시간 이하, 바람직하게는 8시간 이하, 더 바람직하게는 6시간 이하, 더 바람직하게는 4시간 이하, 더 바람직하게는 2시간이다. 더욱더 바람직하게는 1시간 이하이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 탈시알릴화 반응종료시에 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 제조에서 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 개체군의 멤버 중 최소 10%가 결합된 하나의 단일 시알산만을 가지며, 바람직하게는 최소 20%, 더 바람직하게는 최소 30%, 더 바람직하게는 최소 40%, 더 바람직하게는 최소 50%, 더 바람직하게는 최소 60%가 그 단일 시알산만을 가지고, 완전 탈시알릴화한 것이 더 바람직하다.
하나의 또 다른 예에서, 그 탈 시알릴화 반응이 종료할 때 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 제조에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 개체군 멤버 중 최소 10%가 완전 탈시알릴화하며, 바람직하게는 최소 20%, 더 바람직하게는 최소 30%, 더 바람직하게는 최소 40%, 더 바람직하게는 최소 50%, 가장 더 바람직하게는 최소 60%가 완전 탈시알릴화한다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 탈시알릴화 반응이 종료할 때, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 제조에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 개체군 멤버의 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%가 하나의 단일 시알산만을 가지며, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 의 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%가 완전 탈시알릴화한다.
하나의 바람직한 예에서, 그 탈시알릴화 반응이 종료할 때 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 제조에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 개체군의 최소 50%가 완전 탈시알릴화되며, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 개체군의 멤버 최소 40%가 하나의 단일시알산 성분만을 가진다.
탈시알릴화의 다음에 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 하나의 변형당으로 선택적으로 콘주게이팅을 한다. 하나의 대표적인 변형당에는 하나의 분기 또는 선상 폴리(에틸렌글리콜) 성분에 결합된 하나의 사카릴 성분을 포함한다. 그 콘주게이션은 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 하나의 아미노산 또는 글리코실 잔기 상에 하나의 변형당 도너에서 그 변형당을 전이하는 하나의 효소에 의해 촉진한다.
하나의 대표적인 변형당 도너는 하나의 분기 또는 선상 폴리(에틸렌글리콜)성분을 가진 하나의 CMP-시알산이다. 하나의 대표적인 폴리(에틸렌글리콜)성분은 분자량 최소 약 2KDa, 더 바람직하게는 최소 약 5KDa, 더 바람직하게는 최소 약 10KDa, 바람직하게는 최소 약 20KDa, 더바람직하게는 최소 약 30KDa, 더 바람직하게는 최소 약 40KDa를 가진다.
하나의 대표적인 예에서, 그 변형당 도너에서 그 변형당 성분을 전이하는데 사용되는 효소는 하나의 글리코실 전이효소, 즉 시알릴 전이효소이다. 본 발명의 방법에서 유용한 하나의 대표적인 시알릴 전이효소는 ST3 Gal3이다.
본 발명의 하나의 대표적인 방법은 최소 1개, 바람직하게는 최소 2개, 바람직하게는 최소 3개의 변형기(modifying groups)를가진 하나의 변형 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 얻는데 있다.
하나의 예에서, 생성된 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 L사슬 (light chain) 상에서 하나의 단일 변형기를 가진다.
또 다른 예에서, 그 방법에서는 그 H 사슬(heavy chain) 상에서 하나의 단일 변형기를 가진 하나의 변형 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 제공한다.
또 하나의 다른 예에서, 그 방법에서는 그 L 사슬상에서 하나의 단일 변형기와 그 H 사슬 상에서 하나의 변형기를 가진 하나의 변형 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 제공한다.
또 다른 주변(aspect)에서 본 발명은 하나의 변형 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 제조방법을 제공한다. 그 방법에서는 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 하나의 변형기를 가진 하나의 변형당 도너 및 그 펩티드의 하나의 아미노산 또는 글리코실 잔기 상에 그 변형당 도너로부터 하나의 변형당 성분을 전이할 수 있는 하나의 효소와 함께 접촉하는 것을 포함한다.
하나의 대표적인 예에서, 그 방법에서는 개체군 멤버의 최소 40%, 바람직하게는 최소 50%, 바람직하게는 최소 60%, 더 바람직하게는 최소 70% 및 가장 바람직하게는 최소 80%가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 L 사슬상에서 모노(mono) 콘주게이팅을 하는 변형 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 하나의 개체군을 제공한다.
하나의 대표적인 예에서, 그 방법에서는 개체군 멤버의 최소 40%, 바람직하게는 최소 50%, 바람직하게는 최소 60%, 더 바람직하게는 최소 70% 및 더 바람직하게는 최소 80%가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 L 사슬 상에서 디(di)-콘주게이팅 을 하는 변형 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 하나의 개체군을 제공한다.
이 국면의 하나의 대표적인 예에서, 그 방법에서는 개체군 멤버의 50%이하, 바람직하게는 30% 이하, 바람직하게는 20%이하, 더 바람직하게는 10% 이하가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 H 사슬 상에서 모노(mono) 콘주게이팅을 하는 변형 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 하나의 개체군을 제공한다.
이 국면의 하나의 대표적인 예에서, 그 방법에서는 개체군 멤버의 50%이하, 바람직하게는 30%이하, 바람직하게는 20%이하, 더 바람직하게는 10%이하가 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 H 사슬 상에서 디(di)콘주게이팅을 한 변형 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드의 하나의 개체군을 제공한다.
그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 그 접촉스텝을 실시하기 전에 하나의 시알리다아제의 작용으로 처리할 수 있고, 또는 사전 탈시알릴화 처리없이 사용할 수 있다. 상기 펩티드가 시알릴다아제와 접촉할 경우, 주로 완전 탈시알릴화 할 수 있거나, 부분적으로만 탈시알릴화할 수 있다.
하나의 바람직한 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 그 접촉 스텝을 실시하기 전에 최소 부분적으로 탈시알릴화한다. 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 주로 완전 탈시알릴화(주로, 아시알로) 하거나 또는 부분적으로 탈시알리화한다.
하나의 바람직한 예에서, 그 탈시알릴화 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 위에서 설명한 탈시알리화 예 중 하나의 예이다.
Ⅲ. D. 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 합성에서 첨가 시약의 추가 알리쿼트( additional aliquots of reagents added in the synthesis of Factor Ⅶ /Factor Ⅶa peptide conjugate )
여기서 설명한 펩티드 콘주게이트의 합성에 대한 하나의 대표적인 예에서, 하나의 반응성분/시약의 하나 이상의 추가 알리쿼트(additional aliquots)를 선택시간 후에 그 반응 혼합물에 첨가한다.
하나의 대표적인 예에서, 그 펩티드 콘주게이트는 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 반응성분/시약에는 하나의 변형당 뉴크레오티드를 첨가한다.
그 반응성분/시약에 하나의 변형당 뉴클레오티드의 도입으로 글리코 페질화 반응(GlyoPEGylation reaction)의 완료를 유도할 수 있는 가능성을 높힌다.
하나의 대표적인 예에서, 그 뉴클레오티드 당은 여기서 설명한 하나의 CMP-SA-PEG이다.
하나의 대표적인 예에서, 그 반응성분/시약에는 하나의 시알리다아제를 첨가한다.
하나의 대표적인 예에서, 그 반응성분/시약에는 하나의 글리코실 전이효소를 첨가한다.
하나의 대표적인 예에서, 그 반응성분/시약에는 마그네슘을 첨가한다.
하나의 대표적인 예에서, 첨가한 그 추가 알리쿼트는 그 반응을 개시할 때 첨가되는 원 량(original amount)의 약 10%, 또는 20%, 또는 30%, 또는 40%, 또는 50%, 또는 60%, 또는 70%, 또는 80%, 또는 90%를 나타낸다.
하나의 대표적인 예에서, 그 반응성분/시약은 그 반응개시 약 3시간, 또는 6시간, 또는 8시간, 또는 10시간, 또는 12시간, 또는 18시간, 또는 24시간, 또는 30시간, 또는 36시간 후에 그 반응에 첨가한다.
Ⅲ. E. L사슬 페질화 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 선택적 생성( selective production of light chain PEGylated Factor Ⅶ/ Factor Ⅶa peptide conjugates )
하나의 대표적인 예에서, 본 발명은 그 H사슬에 비하여, L사슬 상에서 변형시킨 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 생성을 증가시키는 방법을 제공한다.
이 방법에서는 그 H사슬의 불활성화 또는 격리를 포함하고 있어,그 L사슬 상에서 글리코 페질화가 우선적으로 발생하도록 한다.
그 인자 Ⅶa의 H사슬의 세린 프로테아제 활성은 이 격리(sequestration)를 기초로 하여 사용할 수 있다.
세린 프로테아제에 대한 위친화성(pseudoaffinity) 수지 및/또는 벤즈아민딘 매트릭스를 글리코 페질화 반응 혼합물에 첨가하여 그 H사슬을 격리하는 한편, 그 L사슬 상에서는 글리코 페질화가 진행된다.
그 다음, 그 L사슬은 이 분야 기술에서 공지된 표준기술에 의해 그 H사슬에서 격리된 상태에서 정제할 수 있다.
그 H사슬은 벤즈아미딘을 첨가시켜 그 매트릭스에서 제거시킬 수 있고, 또 그 용액의 pH를 저하시켜 그 수지에서 제거시킬 수 있다.
이 스텝에서 도입된 벤즈아미딘 불순물은 다이어 필트레이션(diafiltration) 에 의해 제거시킬 수 있다.
Ⅲ. F. 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 정제( purification of Factor Ⅶ/ Factor Ⅶa peptide conjugates )
위 프로세스에 의해 생성된 생성물은 정제 없이 사용할 수 있다.
그러나, 그 생성물과 하나 이상의 중간체 생성물, 즉 뉴클레오티드당, 분기 및 선상 PEG 종, 변형당 및 변형 뉴클레오티드당을 회수하는 것이 통상적으로 바람직하다.
두께가 엷거나 두꺼운 층 크로마토그래피, 컬럼 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 또는 막 여과 등 글리코실화 펩티드의 회수를 위한 공지된 표준기술을 사용할 수 있다.
그 회수에 있어, 막 여과를 사용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 역삼투막, 또는 여기서 설명한 바와 같이, 또 여기서 인용한 참고문헌에서 설명한 바와 같이 그 회수를 위한 1종 이상의 컬럼 크로마토그래피 기술을 사용한다.
예로서, 분자량을 약 3000 ~ 약 10,000으로 컷 오프(cutoff)하는 막 여과를 사용하여 글리코실 전이효소 등 단백질을 제거할 수 있다.
어느 예에서는 생성물의 정제를 확보하기 위하여 불순물과 생성물 사이에 분자량의 컷 오프차(cutoff differences)를 이용한다.
예로서, 미반응(unreacted) CMP-SA0-PEG-40KDa에서 생성물 인자 Ⅶa-SA-PEG-40KDa를 정제하기 위하여 인자 Ⅶa-SA-PEG-40KDa를 그 보유액(retentate) 중에 잔유하도록 함과 동시에 CMP-SA-PEG-40KDa를 그 여액(filtrate) 중에 유동하도록 하 나의 여과기(filter)를 선택할 필요가 있다.
그 다음, 나노여과 또는 역삼투를 사용하여 염(salts)을 제거하며 생성물 사카리드(즉, 특허문헌 WO 98/15581 참조)를 정제할 수 있다.
나노여과막은 역삼투막의 하나의 종류로, 이들의 역삼투막은 1가염(monovalent salts)을 통과시키거나, 그 사용되는 막에 따라 분자량이 약 100Da 보다 크고 약 2,000Da 까지의 무전하 용질(solutes) 및 다가염을 잔류시킨다.
이와 같이, 일반적인 적용에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 사카리드는 그 막에서 잔류되며, 혼입되는 염은 통과한다.
제 1 스텝에서와 같이, 그 펩티드가 세포 내에서 생성될 경우, 그 입자단편(particulate debris)으로 숙주세포(host cells) 또는 용해단편(lysed fragments)이 제거된다.
그 다음으로, 글리코 페질화시킨 후, 그 글리코 페질화 된 펩티드는 공지의 방법, 예로서, 원심분리 또는 한외여과에 의해 정제시킨다. 선택적으로, 그 단백질은 시판되는 단백질 농축 필터로 농축시킨 다음, 아래에 나타낸 처리스텝에서 선택한 하나 이상의 스텝에 의해 다른 불순물에서 폴리 펩티드 변이체를 분리할 수 있다.
아래에 나타낸 그 처리스텝은 다음과 같다.
면역 친화성 크로마토그래피(immunoaffinity chromatography); 이온교환 컬럼 분획법(column fractionation)(즉, 디에틸아미노에틸(DEAE) 또는 카르복시메틸 또는 술포프로필기 함유 매트릭스 상에서); 블루-세파로오스(Blue-Sepharose), CM 블루-세파로오스, MONO-Q, MONO-S, 렌틸 렉틴(lentil lectin)-세파로오스, WGA-세파로오스, Con A-세파로오스, 에테르 토요펄(Ether Toyopearl), 부틸 토요펄, 페닐 토요펄, 또는 단백질 A 세파로오스 상에서의 크로마토그래피; SDS-PAGE 크로마토그래피; 실리카 크로마토그래피; 크로마토포커싱(chromatofocussing); 역상(reverse phase) HPLC(즉, 현수 지방족기를 가진 실리카겔); 세파덱스(Sephadex) 분자시브(molecular sieve)를 사용하는 겔 여과 또는 사이즈배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography); 폴리 펩티드를 선택 결합하는 컬럼 상에서의 크로마토그래프 및 에타놀 또는 암모늄 술페이트 침전법.
이 섹션 다음에 더 구체적으로 설명한 바와 같이, 정제를 사용하여 다른 사슬에서 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 하나의 사슬을 분리할 수 있다.
배양에서 생성된 변형 글리코 펩티드는 세포, 효소 등으로부터 초기 추출에 의해 통상적으로 분리시킨 후, 이어서 하나 이상의 농축, 염석(salting-out), 수성 이온교환 또는 사이즈배제 크로마토그래피 스텝에 의해 분리한다.
또, 그 변형 글리코 프로테인은 친화성 크로마토그래프에 의해 정제할 수 있다. 최종적으로, 최종 정체 스텝에서는 HPLC를 사용할 수 있다.
상기 스텝 중 어느 스텝에서 하나의 프로테아제 인히비터(inhibitor)를 함유시켜 단백질 분해를 억제할 수 있고, 항생물질 또는 보존제를 함유시켜 외래 오염균(adventitious contaminants)의 증식을 방지할 수 있다.
위 스텝에서 사용한 프로테아제 인히비터는 앤티파인(antipain), 알파-1-앤티트립신, 앤티-트롬빈, 류펩틴, 아마스타틴(amastatin), 키모스타 틴(chymostatin), 반즈아미딘(banzamidin)과 다른 세린 프로테아제 인히비터(즉, 세르핀: serpins)을 포함하여 저분자량의 인히비터로 할 수 있다.
일반적으로, 세포 배양액 중에서 키모스타틴이 농도 200μM 이상으로 사용할 수 있으나 세린 프로테아제 인히비터는 농도 범위 0.5~100μM에서 사용할 필요가 있다.
다른 세린 프로테아제 인히비터는 세린 프로테아제의 키모트립신 형상 족, 서브틸리신 형상 족, 알파/베타 히드로라아제 족, 또는 시그날 펩티다아제 족(clans)에 특이성이 있는 인히비터를 포함한다.
세린 프로테아제 이외에, 또 다른 타입의 프로테아제 인히비터는 시스테인 프로테아제 인히비터(1~10μM) 및 아스파라긴 프로테아제 인히비터(1~5μM)와, 펩스타틴(1~5μM) 등의 비특이성 프로테아제 인히비터를 포함하여, 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 프로테아제 인히비터에는 또 거머리(leech)에서 분리된 히루스타신(hirustasin) 인히비터 등 자연 프로테아제 인히비터를 포함할 수 있다.
어느 예에서, 프로테아제 인히비터는 합성 펩티드 또는 항체를 함유하며, 그 프로테아제 촉매부위에 특이성 있게 결합하여 글리코 페질화 반응을 방해함이 없이 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa를 안정화할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 발명의 변형 글리코 펩티드를 생성하는 시스템에서 얻은 상청액(supernatants)은 시판되는 단백질 농축 여과기(filter)(예로서, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛)를 사용하여 1차 농축시킨다.
농축 스텝 처리 다음에, 그 농축액을 하나의 적합한 정제 매트릭스에 사용할 수 있다.
예로서, 하나의 적합한 친화성 매트릭스는 그 펩티드의 하나의 리간드(ligand), 하나의 적합한 지지체에 결합되어 있는 하나의 렉틴(lectin) 또는 항체 분자를 함유할 수 있다.
또, 하나의 아미노 교환수지는 예로서 현수(부속) DEAE 기를 가진 하나의 매트릭스 도는 기질(substrate)를 사용할 수 있다.
적합한 매트릭스에는 아크릴 아미드, 아가로오스(agarose), 덱스트란, 셀룰로오스 또는 단백질 정제에서 통상 사용되는 다른 타입을 포함한다.
또, 하나의 카티온 교환 스텝을 사용할 수 있다.
적합한 카티온 교환제에는 술포프로필 또는 카르복시메틸기를 함유하는 여러 가지의 불용성 매트릭스를 포함한다.
술포프로필 기가 특히 바람직하다.
정제에 유용한 다른 방법에는 사이즈배제 크로마토그래피(SEC), 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 블루세파로오스(Blue Sepharose) 상에서의 크로마토그래피를 포함한다.
상기 이들의 방법과 다른 유용한 방법은 특허문헌으로서 본 특허출원의 출원인이 공유한 미국 가특허출원(대리인 문서번호: 40853-01-5168-P1, 2005.05.06 출원) 명세서에서 구체적으로 기재되어 있다.
소수성 RP-HPLC 배지, 즉 현수(부속) 메틸 또는 다른 지방족 기를 가진 실리 카 겔을 사용하는 1개 이상의 RP-HPLC 스텝을 사용하여 하나의 폴리 펩티드 콘주게이트 조성물을 더 정제할 수 있다.
여러 가지의 조합에 있어서, 상기 정제 스텝 일부 또는 전부를 또 사용하여 하나의 균질 또는 주로 균질인 변형 글리코 프로테인을 제공할 수 있다.
대규모(large-scale)의 발효에서 얻은 본 발명의 변형 글리코 펩티드는 참고문헌(Urdal 등, J. Chromatog. 296: 171 (1984))에서 개시되어 있는 방법과 유사한 방법에 의해 정제할 수 있다.
이 참고문헌에서는 하나의 분리용(preparative) HPLC 컬럼 상에서 재조합 사람 IL-2의 정제에 대한 2개의 연속적인 RP-HPLC 스텝이 기재되어 있다.
또, 친화성 크로마토그래피 등의 기술을 사용하여 그 변형 글리코 프로테인을 정제할 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 그 정제는 특허문헌으로 미국 가특허출원 60/665,588(2005.3.24 출원) 명세서에서 설명한 방법에 의해 얻어진다.
본 발명에 의해, 페질화 펩티드(pegylated peptides), 즉 연속적인 탈시알릴화 또는 동시 시알릴화에 의해 생성된 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 또는 펩티드 콘주게이트는 마그네슘 클로리드의 증감액(gradient)을 사용하여 정제 또는 용해시킬 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 하나의 L사슬과 하나의 H사슬로 분리할 수 있고, 하나의 사슬은 다른 사슬에서 분리하여 정제시킬 수 있다.
또 다른 대표적인 예에서, 하나의 생성물은 그 생성물 중 최소 80%의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 L사슬부분인 생성물에서 얻어진다.
또 다른 대표적인 예에서, 하나의 생성물은 그 생성물 중 최소 90%의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 L사슬부분인 생성물에서 얻어진다.
또 다른 대표적인 예에서, 하나의 생성물이 그 생성물 중 최소 95%의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 L사슬 부분인 생성물에서 얻어진다.
또 다른 대표적인 예에서, 하나의 생성물은 그 생성물 중 주로 전체의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 L사슬부분인 생성물에서 얻어진다.
이 생성물은 본 발명의 어느 화합물에 대하여서도 가능하다.
또 다른 대표적인 예에서, 하나의 생성물은 그 생성물 중 최소 80%의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 H사슬부분인 생성물에서 얻어진다.
또 다른 대표적인 예에서, 하나의 생성물은 그 생성물 중 최소 90%의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 H사슬부분인 생성물에서 얻어진다.
또 다른 대표적인 예에서, 하나의 생성물은 그 생성물 중 최소 95%의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 H사슬부분인 생성물에서 얻어진다.
또 다른 대표적인 예에서, 하나의 생성물은 그 생성물 중 주로 전체의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트가 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 H사슬부분인 생성물에서 얻어진다.
이 생성물은 본 발명의 어느 화합물이라도 가능하다.
Ⅲ. G. 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 콘주게이트의 특성( propeties Factor Ⅶ/ Factor Ⅶa Conjugates )
하나의 대표적인 예에서, 본 발명의 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 하나의 미변성(native) 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드로서 동일한 생화학적 특성(즉, 응고: clotting)을 주로 가진다.
하나의 대표적인 예에서, 본 발명의 그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 페질화(PEGylation)부위, 부가 PEG의 사이즈 및 부가 PEG의 수에 따라, 하나의 미변성(native) 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드에 비하여 생화학적 증감특성(reduced, or enhanced properties)(즉, 응고: clotting)을 가진다.
인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 혈액응고 프로세스(blood clotting process) 중에 포함되어 있다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 미변성(native) 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa의 응고활성(clotting activity) 약 20%, 또는 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50%, 또는 약 55%, 또는 약 60%, 또는 약 65%, 또는 약 70%, 또는 약 75%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90%, 또는 약 95%를 보유한다.
인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 아미도 용해 활성(amidolytic activity)을 가진다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 미변성(native) 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa의 아미도 용해 활성 약 20%, 또는 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50%, 또는 약 55%, 또는 약 60%, 또는 약 65%, 또는 약 70%, 또는 약 75%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90%, 또는 약 95%를 보유한다.
인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 인자 Ⅹ를 인자 Ⅹa로 전환시킬 수 있다.
하나의 대표적인 예에서, 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 미변성(native) 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa의 Ⅹ전환 활성(conversion activity) 약 20%, 또는 약 25%, 또는 약 30%, 또는 약 35%, 또는 약 40%, 또는 약 45%, 또는 약 50%, 또는 약 55%, 또는 약 60%, 또는 약 65%, 또는 약 70%, 또는 약 75%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90%, 또는 약 95%를 보유한다.
Ⅳ. 의약조성물( pharmaceutical compositions )
또 다른 국면에서 , 본 발명은 의약조성물을 제공한다.
그 의약조성물은 하나의 의약적으로 허용할 수 있는 희석제와, 하나의 비천연 PEG 성분, 치료성분 또는 바이오분자와 하나의 글리코실화 또는 비글리코실화 펩티드 사이에 있는 하나의 공유 결합 콘주게이트(covalent conjugate)를 포함한다.
그 폴리머 치료성분 또는 바이오분자는 그 펩티드와 그 폴리머 치료성분 또는 바이오분자 사이에 삽입되어 공유 결합되는 하나의 무손상(intact) 글리코실 결합기에 의해 그 펩티드에 콘주게이팅 되어 있다.
본 발명의 의약조성물은 여러 가지의 약제 투여 시스템(drug delivery systems)의 사용에 적합하다.
본 발명에서 사용하는 적합한 제제는 다음 참고문헌에서 확인된다(Remingtion's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)).
약제 투여방법의 간단한 설명에 대해서는 다음 참고문을 참조할 수 있다(Langer, Science 249:1527-1533 (1990)).
하나의 대표적인 예에서, 그 의약제제는 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트와, 소듐 클로리드, 칼슘 클로리드 디히드레이트, 글리실 글리신, 폴리소르베이트 80 및 만니톨에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 의약적으로 허용할 수 있는 희석제를 함유한다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 의약적으로 허용할 수 있는 희석제는 소듐 클로리드와 글리실 글리신이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 의약적으로 허용할 수 있는 희석제는 칼슘 클로리드 디히드레이트와 폴리 소르베이트 80이다.
또 다른 대표적인 예에서, 그 의약적으로 허용할 수 있는 희석제는 만니톨이다.
그 의약조성물은 예로서, 국소투여, 경구투여, 비강(nasal)투여, 정맥내투여, 두개내(intracranial)투여, 복강내투여, 피하투여 또는 근육내투여를 포함하여 어느 적합한 투여방식으로 제제할 수 있다.
피하주사 등 비경구 투여에 있어서, 그 캐리어는 물, 식염수, 알코올, 지방(fat), 왁스 또는 버퍼(buffer)를 함유하는 것이 바람직하다.
경구투여에 있어서, 상기 캐리어 또는 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈컴(talcum), 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스 및 마그네슘 카르보네이트 등 하나의 고형 캐리어 중 어느 것이라도 사용할 수 있다.
생분해성 마이크로 스피어(microspheres)(즉, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)도 이 발명의 의약조성물용 캐리어로 사용할 수 있다.
적합한 생분해성 마이크로스피어는 예로서 특허문헌 USP 4,897,268 및 USP 5,075,109의 명세서에 개시되어 있다.
일반적으로, 그 의약조성물은 비경구투여, 즉 정맥내투여 한다.
따라서, 본 발명은 하나의 허용할 수 있는 캐리어, 바람직하게는 수용성 캐리어, 즉 물, 버퍼수, 식염수, PBS 등에서 용해 또는 현탁시킨 화합물을 함유하는 비경구투여용 조성물을 제공한다.
그 조성물에는 pH 조정제 및 버퍼링제, 긴장성(tonicity) 조정제, 습윤제, 청정제(detergents) 등 근접 생리적 조건에 필요로 하며 의약적으로 허용할 수 있 는 보조물질을 함유할 수 있다.
이들의 조성물은 통상의 살균기술에 의해 살균할 수 있고, 또는 살균여과 할 수 있다.
그 결과 얻어진 수용액은 그대로 용도에 따라 패키징할 수 있고, 또 동결건조할 수 있다. 동결건조제제는 투여 전에 살균 캐리어 수용액과 배합한다.
그 제제의 pH는 일반적으로, 3~11, 더 바람직하게는 5~9, 가장 바람직하게는 7~8이다.
어느 일부 예에서, 본 발명의 글리코 펩티드는 표준 소포(vesicle)형성 리피드(lipids)에서 형성된 리포솜 내에서 결합시킬 수 있다.
여러 가지의 방법은 아래의 참고문헌에서 기재한 바와 같이 리포솜의 제조에 이용할 수 있다(Szoka 등, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980); USP 4,235,871; USP 4,501,728 및 4,837,028).
여러 가지의 표적제(즉, 본 발명의 시알릴 갈락토시드)를 사용하는 리포솜의 표적(targeting)은 이 기술에서 공지되었다(특허문헌 USP 4,957,773 및 USP 4,603,044 참조).
리포솜에 표적제를 커플링하는 표준방법을 사용할 수 있다.
이들의 방법은 일반적으로, 표적제의 결합을 위하여 활성화할 수 있는 포스파티닐에타놀아민 또는 본 발명의 리피드-유도체화 글리코 펩티드 등 유도체화 친지성 화합물 등 리피드 성분의 리포솜 내에 결합하는 것을 포함한다.
표적 메카니즘(targeting mechanisms)에서는 표적, 예로서 하나의 세포 표면 수용체와의 상호작용에 그 표적성분을 이용할 수 있게 그 리포솜의 표면상에 표적제의 위치설정을 필요로 한다.
본 발명의 카르보히드레이트는 이 분야의 기술자에 의해 공지된 방법을 사용하여 그 리포솜을 형성하기 전에 하나의 리피드 분자에 결합시킬 수 있다(즉, 각각의 사슬이 긴 하나의 알킬 할라이드 또는 하나의 지방산과 그 카르보히드레이트 상에 존재한 하나의 히도록실기의 알킬화 또는 아실화).
또, 그 리포솜은 그 막 형성할 때 그 막에 1차적으로 하나의 연결부분이 결합할 수 있게 형성할 수 있다.
그 연결부분(connector portion)은 하나의 친지성 부분을 가질 필요가 있으며, 그 친지성 부분은 그 막(memvrane) 내에 견고하게 매입(embeded)하며 고정한다.
그 연결부분은 하나의 반응성 부분을 가질 필요가 있으며, 그 반응성 부분은 그 리포솜의 수용성 표면상에서 화학적으로 이용할 수 있다.
그 반응성 부분은 후에 부가되는 표적제 또는 카르보히드레이트와 안정성 있는 화학적 결합 형성에 화학적으로 적합하도록 선택한다.
일부 어느 경우에, 그 표적제를 그 연결분자(connector molecule)에 직접 결합할 수 있으나, 대부분의 예에서는 하나의 화학적 브리지(chemical bridge)로 작용하는 하나의 제 3 분자의 사용이 더 적합하여, 그 소포표면(vesicle surface) 상에서 3차원적으로 형성하는 표적제 또는 카르보히드레이트를 가진 그 막 내에 있는 연결분자(connector molecule)를 결합한다.
또, 본 발명의 방법에 의해 제조한 화합물은 진단 시약으로 사용할 수 있다.
예로서, 표지(labeled) 화합물을 사용하여 염증을 가진 것으로 의심되는 환자의 염증 또는 궤양전이(metastasis) 부위를 설정할 수 있다.
이 사용에서, 상기 화합물은 125I, 14C 또는 트리튬으로 표시할 수 있다.
본 발명의 의약조성물에서 사용되는 활성성분은 혈병생성(blood clot production)을 자극(촉진)하는 생물학적 특성을 가진 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트이다.
그 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 비경구 투여하는 것이 바람직하다(즉, Ⅳ,IM, SC 또는 IP).
유효용량은 치료조건과 투여 루트에 따라 상당히 변동되나, 그 활성재 약 0.1(~7U) ~ 100(~7000U)㎍/㎏ 체중량의 범위에 있는 것으로 예측된다.
빈혈상태(anemic condition) 치료용으로 바람직한 용량은 1주일에 3회로 하여 약 50 ~ 약 300Units/㎏ 이다.
본 발명은 생체내 정주시간(residence time)을 높힌 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 함유한 물질의 조성물을 구성하고 있어, 상기 용량(dosages)은 본 발명의 조성물을 투여할 때 선택적으로 감소시킨다.
본 발명의 조성물을 제조할 때 유용한 종(species)의 제조방법은 다수의 특허문헌, 즉 특허출원 공개 US 20040137557; WO 04/083258; 및 WO 04/033651의 명세서에서 일반적으로 기재되어 있다.
다음 실시예를 들어 본 발명의 콘주게이트와 방법을 설명하며, 본 발명을 한정한 것은 아니다.
실시예 1
인자(Factor) Ⅶa의 탈시알릴화(desialylation)
혈청 없는 배지(serum-free media)에서 발현한 인자 Ⅶa, 혈청 함유 배지에서 생성한 인자 Ⅶa는 3종의 인자 Ⅶa 변이체 N145Q, N322Q 및 유사체(analogue) DVQ(V158D/E296V/M298Q)를 가한다.
효소에 의한 탈시알릴화 제조에서, 인자 Ⅶa는 10KDa의 MWCO를 튜브에 넣은 스네이크 스킨(Snakeskin) 투석(dialysis)에서, 4℃에서 하룻밤 MES, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, 50mM MES, pH 6으로 하여 투석하였다.
인자 Ⅶa(1㎎/mL)의 탈시알릴화는 그 교환 버퍼(exchanged buffer) 중에서 18시간 동안 32℃로 하여 아르트로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens)(Calbiochem)로부터 10U/L의 가용성 시알리다아제로 실시하였다.
실시예 2
인자 Ⅶa의 시알릴-페질화(sialyl-PEGylation)
시알릴-페질화("글리코 페질화": GlycoPEGylation)는 2~6시간 동안 탈시알릴화 버퍼 중에서 온도 32℃로 하여 아시알로(asialo)-인자 Ⅶa(1㎎/mL) 상에서 100U/L ST3Gal-Ⅲ과 200μM CMP-시알산-PEG(40KDa, 20KDa, 10KDa, 5KDa 및 2KDa)로 실시하였다.
적합한 반응시간이 완료된 후에, 그 페질화 샘플을 즉시 정제시켜 글리코 페질화를 더 최소화 하였다.
시알산으로 캐핑(capping)한 샘플로 글리코 페질화 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa를 캐핑하기 위하여, 아래에서 나타낸 바와 같이 아니온 교환 크로마토그래피에 의해 그 아시알로-인자 Ⅶa로부터 그 시알리다아제를 1차적으로 제거하였다.
과잉의 CMP-시알산(5mM)을 첨가하여 2시간 동안 32℃에서 배양하여, 시알산으로 글리코 페질화 인자 Ⅶa를 캐핑하였다.
인자 Ⅶa의 시알릴-페질화 형(forms)은 인비트로겐(Invitrogen)에 의해 기술되어 있는 바와 같이 비환원성(non-reducing) SDS-PAGE(트리스-글리신 겔 및/또는 NuPAGE 겔)와 콜로이덜 블루 스테이닝 킷(Colloidal Blue Staining Kit)에 의해 분석하였다.
실시예 3
페질화 인자 Ⅶa의 정제(Purification of PEGylated Factor Ⅶa)
인자 Ⅶa의 글리코 페질화 샘플을 하나의 아니온-교환 변형방법으로 정제하였다.
샘플(samples)을 5℃에서 처리하였다.
그 컬럼에 로딩(loading)하기 직전에, 100mL의 인자 Ⅶa 용액 당 1g의 켈렉 스(Chelex) 100(BioRad)을 리모델링한(remodeled) 샘플에 첨가하였다.
10분간 교반 후에 그 현탁액을 진공 시스템으로 셀룰로오스 아세테이트 막(0.2㎛) 상에서 여과하였다.
그 필터 상에 잔류된 킬레이터 수지(chelator resin)을 100mL 벌크(bulk) 당 1~2mL의 물로 1회 세척하였다.
그 얻어진 여액(filtrate)의 전도율은 온도 5℃에서 10mS/㎝로 조정하였으며, 필요할 경우, pH 8.6으로 조정하였다.
아니온 교환은 8~10℃에서 실시하였다.
Q 세파로오스(Sepharose) FF 함유 컬럼은 로딩(loading) 전에 1M NaOH(10 컬럼 용량), 물(5 컬럼 용량), 2M NaCl, 50mM HOAc, pH 3(10 컬럼 용량)으로 세척하고, 175mM NaCl, 10mM 글리실 글리신, pH 8.6(10 컬럼 용량)으로 평형화시켜 조제하였다.
각각의 페질화 반응에 있어서, 15~20㎎의 인자 Ⅶa는 유속(flow rate) 100㎝/h로 하여 10mL의 Q Sepharose FF(1mL 수지당 2㎎ 이하의 단백질)를 가진 XK 16 컬럼(Amersham Biosciences) 상에 로딩하였다.
2KDa의 선상 PEG에 있어서, 20㎎의 인자 Ⅶa는 유속 100㎝/h에서 40mL의 Q Sepharose FF(1㎎의 수지당 0.5㎎의 단백질)를 가진 XK 26컬럼(Amersham Biosciences) 상에 로딩하였다.
로딩(loading) 후에, 그 컬럼을 175mM NaCl, 10mM 글리실 글리신, pH 8.6(10컬럼 용량)과 50mM NaCl, 10mM 글리실 글리신, pH 8.6(2 컬럼 용량)으로 세척하였 다.
50mM NaCl, 10mM 글리실 글리신, 15mM CaCl2, pH 8.6(5 컬럼 용량)을 사용하여 15mM CaCl2의 하나의 스텝 증감액(step gradient)으로 용출을 실시하였다.
그 다음 그 컬럼을 1M NaCl, 10mM 글리실 글리신, pH8.6(4 컬럼 용량)으로 세척하였다.
그 용출액(effluent)은 280㎚에서의 흡광도(absorbance)에 의해 모니터링(monitoring)하였다.
프랙션(fractions)(5mL)은 병류(flow-through)와 2회 세척할 때 수집하였고, 2.5mL의 프랙션은 CaCl2와 1M 염 용출할 때 수집하였다.
인자 Ⅶa 함유 프랙션은 비환원성 SDS-PAGE(트리스-글리신 겔 및/또는 NUPAGE 겔)와 콜로이덜 블루 스테닝 킷(Colloidal Blue Staining Kit)에 의해 분석하였다.
인자 Ⅶa를 가진 적합한 트랙션은 풀링(pooling) 하였으며, 4M HCl를 사용하여 그 pH를 7.2로 조정하였다.
인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa는 다음 변경사항을 제외하고 위에서 설명한 바와 같이 정제하였다.
EDTA(10mM)를 그 페질화 인자 Ⅶa 용액에 첨가하여, 그 pH를 pH 6으로 조정하였으며, 그 전도율은 5℃에서 5mS/㎝로 조정하였다.
약 20㎎의 인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa는 유속 10㎝/h로 하여 10mL의 포로 소(Poros) 50마이크론(Micron) HQ 수지(수지 1mL당 2㎎ 이하의 단밸질)를 가진 XK 16컬럼(Amersham Bioscience) 상에 로딩하였다.
로딩한 후, 그 컬럼을 175mM NaCl, 10mM 히스티딘, pH 6(10 컬럼 용량)과 50mM, NaCl, 10mM 히스티딘, pH 6(2 컬럼 용량)으로 세척하였다.
50mM NaCl, 10mM 히스티딘, pH 6(5 컬럼 용량) 중에서 20mM CaCl2의 스텝 증감액(step gradient)으로 용출을 실시하였다.
그 다음 그 컬럼을 1M NaCl, 10mM 히스티딘, pH 6(5컬럼 용량)으로 세척하였다.
인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa 함유 아니온-교환 용출액(eluate)(25mL)은 원심분리 필터 디바이스(centrifugal filter device)(Amicon Ultra-15 10K)를 사용하여, 제조업자의 사용지침(Millipore)에 따라 5-7mL로 농축하였다.
농축시킨 다음, 사이즈배제 크로마토그래피를 실시하였다.
그 샘플(5-7mL)은 Superdex 200(HiLoad 16/60, 프레프 그레이드(prep grade); Amersham Biosciences) 함유 컬럼 상에서 로딩하였으며, 그 페질화 변이체 대부분에 대하여 50mM NaCl, 10mM 글리실 글리신, 15mM CaCl2, pH 7.2에서 정형화 하였다.
인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa는 유속 1mL/min에서 변형되지 않은 아시알로(asialo)-인자 Ⅶa로부터 분리하였으며, 그 흡광도는 280㎚에서 모니터링(monitoring)하였다.
인자 Ⅶa 함유 프랙션(fraction)(1mL)를 수집하여 비환원성 SDS-PAGE(트리스-글리신 겔 및/또는 NUPAGE 겔)와 콜로이덜 블루 스테이닝 킷(Colloidal Blue Staining Kit)에 의해 분석하였다.
표적 페질화 이소형(isoform)을 함유하며 변성되지 않은 아시알로-인자 Ⅶa가 없는 프랙션을 풀링(pooling)하였으며, 원심분리 필터 디바이스(Amicon Ultra-15 10K)를 사용하여 1㎎/mL까지 농축하였다.
단백질 농도는 흡광계수(extinction coefficient) 1.37(㎎/mL)-1㎝- 1를 사용하여 280㎚에서의 흡광도로부터 측정하였다.
실시예 4
역상 HPLC 분석에 의한 페질화 이소형 측정(determination of PEGylated isoforms by reversed phase HPLC analysis)
페질화 인자 Ⅶa는 역상 컬럼(Zorbax 300SB-C3, 5㎛ 파티클 사이즈, 2.1×150㎜) 상에서 HPLC에서 분석하였다.
그 용리액 (A)은 수중에서 0.1% TFA와 용리액 (B)는 아세토니트릴 중에서 0.09% TFA 이었다. 검출은 214㎚에서 실시하였다.
그 구배(gradient)(증감액), 유속 및 컬럼 온도는 그 PEG 길이(40KDa, 20KDa 및 10KDa PEG: 30분, 0.5mL/min, 45℃에서 35~65% B; 10KDa PEG: 30분, 0.5mL/min, 45℃에서 35~60% B; 5KDa PEG: 40분, 0.5mL/min, 45℃에서 40~50% B; 2KDa PEG: 67 분, 0.6mL/min, 55℃에서 38~43% B)에 따라 좌우된다.
각각의 피크(peak)의 동정(identity)은 4가지의 다른 다음 기술사항 중 2가지 이상을 기준으로 하여 정하였다:
미변성(native) 인자 Ⅶa의 공지된 보유시간, 각각 분리된 피크의 SDS-PAGE 이동(migration), 각각 분리된 피크의 MALDI-TOF 매스스펙트럼 및 결합 PEG의 수의 증가에 대한 각각의 피크의 보유시간의 순차적인 진행.
실시예 5
역상 HPLC에 의한 PEG 결합 부위 측정(determination of site of PEG attachment by reversed phase HPLC)
인자 Ⅶa와 페질화 인자 Ⅶa 변이체는 샘플(1㎎/mL의 농도에서 10μL)과 환원성 버퍼(buffer)(40μL, 50mM NaCl, 10mM 글리실 글리신, 15mM EDTA, 8M 우레아, 20mM DTT, pH 8.6)를 15분간 실온에서 혼합하여 환원시켰다.
물(50μL)을 첨가시키고, 그 샘플을 그 HPLC(<12시간) 상에서 주입(injected)할 때까지 4℃로 냉각하였다.
그 HPLC 컬럼, 용출액 및 검출은 그 비환원성 샘플에 대하여 위에서 설명한 것과 같이 하였다.
그 유속은 0.5mL/min 이었고, 그 구배(증감액)는 90분에서 30~55% B 이었으며, 그 다음으로 간단한 세척 사이클에서는 90% B 이내이었다.
각각의 피크의 동정은 실시예 4에서와 같이 하여 정하였다.
실시예 6
인자 Ⅶa 응고 아세이(clotting assay)
페질화 샘플과 표준품을 2 반복 테스트하여, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.1% BSA(wt/vol), 50mM Tris, pH 7.4에서 희석하였다.
그 표준품과 샘플을 0.1~10ng/mL의 범위에 걸쳐 분석 실험하였다.
동일 용량의 희석 표준품과 샘플을 인자 Ⅶa 결핍 플라즈마(Diagnostica Stagpo)와 혼합시켜, 분석실험 전 4시간 이내에 얼음(ice) 상에서 저장하였다.
응고시간(clotting times)은 STart 4 응고계(coagulometer)(Diagnostica Stago)로 측정하였다.
샘플 쿠베트(sample cuvette) 내에서 하나의 자석볼의 약한 전후운동의 정지에 의해 나타내는 것과 같이, 생체 외혈병(in vitro clot)이 형성될 때까지 경과시간을 그 응고계에 의해 측정하였다.
각각의 쿠베트(cuverte)내에 하나의 자석볼(magnetic ball)을 침착시키고(deposited), 100μL의 인자 Ⅶa 샘플/결핍 혈장과 100μL의 희석시킨 랫(rat) 뇌 세팔린 용액(4시간 이하 동안 얼음에서 보관하였음)을 가하였다.
각각의 시약을 각각의 웰(well) 사이에서 5초 동안 첨가하였으며, 최종 혼합액을 37℃에서 300초간 배양하였다.
희석시킨 랫 뇌(rat brain) 세팔린(RBC) 용액을 2mL의 RBC 원액(stock solution)(10mL의 150mM NaCl를 가한 1 바이얼(vial) RBC 원액, Haemachem에서 조 제)과 4mL의 100mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.1% BSA(wt/vol), 50mM Tris, pH 7.4로 조제하였다.
100mM Nacl, 12.5mM CaCl2, 0.1 BSA(wt/vol), 50mM Tris, pH 7.4에서 가용성 조직인자(2㎍/mL; 아미노산 1~209)의 예열(37℃) 용액 100μL를 첨가시켜 300초에, 그 아세이(assay)를 개시하였다.
다시, 그 다음 용액을 샘플간의 간격을 5초로 하여 첨가하였다.
그 희석한 표준품에서의 응고시간을 사용하여 하나의 표준 커브(standard curve)(log 인자 Ⅶa 농도 대(versus) log 응고시간)를 형성하였다
그 결과 커브에서 얻어진 직선 회귀(linear regression)를 사용하여 페질화 변이체의 상대응고 활성을 측정하였다.
페질화 인자 Ⅶa 변이체는 인자 Ⅶa의 분취량 원액(aliquotted stock)과 비교하였다.
실시예 7
BHK 세포 중에서 생성한 재조합 인자 Ⅶa의 글리코 페질화(GlycoPEGylation of Recombinant Factor Ⅶa produced in BHK cells)
이 실시예는 BHK 세포 중에서 생성딘 재조합 인자 Ⅶa의 페질화를 설명한 것이다.
아시알로-인자 Ⅶa의 제조
재조합 인자 Ⅶa는 BHK 세포(boby hamster kidney cells)에서 생성하였다.
인자 Ⅶa(14.2㎎)는 버퍼용액(pH 7.4, 0.05M Tris, 0.15M NaCl, 0.001M CaCl2, 0.5% NaN3) 중 1㎎/mL에서 용해시켜, 3일간 32℃에서 300mU/mL의 시알리다아제(비브리오 콜레라: Vibrio cholera)-아가로오스 콘주게이트와 함께 배양하였다.
그 반응을 모니터링(monitoring) 하기 위하여, 그 반응액의 소량의 분취량을 적합한 버퍼용액과 IEF 겔로 희석시켜 인비트로겐(Invitrogen) 처리공정(도 157)에 의해 실시하였다.
그 혼합액을 3,500rpm으로 원심분리시켜 그 상증액을 수집하였다.
그 수지를 3회(3×2mL) 상기 버퍼용액(pH 7.4, 0.05M Tris, 0.15M CaCl, 0.05% NaN3)으로 세척하였으며, 그 합친 세척액을 센트리콘-플러스(Centricon-Plus)-20의 농축장치 내에서 농축하였다.
그 남아있는 용액을 버퍼용액(0.05M Tris(pH 7.4), 0.15M NaCl, 0.05% NaN3)으로 최종 용량 14.4mL로 될 때까지 버퍼 교환하였다.
인자 Ⅶa-SA-PEG-1KDa와 인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa의 제조
인자 Ⅶa 용액의 탈시알릴화 반응에서는 2개의 동일한 7.2mL의 샘플로 분할하였다.
각각의 샘플에 CMP-SA-PEG-1KDa(7.4㎎) 또는 CMP-SA-PEG-10KDa(7.4㎎)를 첨가하였다.
두개의 튜브에 ST3Gal3(1.58U)을 첨가하여, 그 반응 혼합액을 32℃에서 96시 간 동안 배양하였다.
인비트로겐(Invitrogen)에 의해 설명한 시약과 조건을 사용하여 그 반응을 SDS-PAGE 겔에 의해 모니터링 하였다.
그 반응이 완료되었을 때, 그 반응 혼합액은 PBS 버퍼(pH 7.1)를 사용하는 Toso Haas Tsk-3000의 조제용 컬럼을 사용하여 정제하였으며, UV 흡수를 기준으로 한 프랙션을 수집하였다.
그 생성물을 함유한 합친 프랙션(fractions)을 Centricon-Plus-20의 원심분리 필터(제조업자: Millipore, Bedford, MA, USA)에서 4℃로 하여 농축하였다.
그 농축 용액을 재제제하여(reformulated), 인자 Ⅶa-SA-PEG 1.97㎎을 얻었다(비신코닌산 단백질 아세이, BCA 아세이, Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA).
그 반응 생성물은 인비트로겐(Invitrogen)에 의해 공급한 시약과 그 처리공정에 의한 SDS-PAGE 및 IEF 분석을 사용하여 분석하였다.
샘플은 물로 투석(dialyzed) 하였으며 MALDI-TOF에 의해 분석하였다.
도 7은 미변성(native) 인자 Ⅶa의 MALDI 결과를 나타낸다. 도 8은 인자 Ⅶa-SA-PEG-1KDa의 MALDL 결과가 포함되어 있는 것을 나타낸다.
도 9는 인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa의 MALDI 결과가 포함되어 있는 것을 나타낸다.
도 10은 그 반응 생성물 전체의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것으로, 여기서 인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa의 밴드(band)가 선명하다(evident).
실시예 8
인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa: 원폿방법(one pot method)
인자 Ⅶa(최종 농도 1㎎/mL의 생성물의 제제 버퍼 중에서 희석한 5㎎), CMP-SA-PEG-10KDa(10mM, 60μL) 및 아. 니거(A. niger) 효소 ST3Gal3(33U/L) 및 10mM 히스티딘, 50mM NaCl, 20mM CaCl2를 하나의 반응 용기 내에서 10U/L, 1U/L, 0.5U/L 또는 0.1U/L의 시알리다아제(CalBiochem)와 함께 배양하였다.
이들의 성분을 혼합시켜 32℃에서 배양하였다.
1차로 4시간 동안 30분 간격으로 분취량을 분석하여 진행하는 반응을 측정하였다.
그 다음 20시간이 되는 시점에서 분취량을 옮겨 SDS-PAGE에 처리하였다.
페질화 정도는 1.5시간, 2.5시간 및 3.5시간이 되는 시점에서 분취량 1mL을 채취하여 측정하였으며 그 샘플을 Poros 50HQ의 컬럼 상에서 정제하였다.
10U/L의 시알리다아제 함유 반응조건에서, 상당량의 인자 Ⅶa-SA-PEG 생성물이 생성되지 않았다.
1U/L의 시알리다아제 함유 반응조건에서, 그 반응 혼합물 중에서 약 17.6%의 그 인자 Ⅶa가 1.5시간 후에 모노(mono) 또는 디(di) 페질화 되었다.
이것은 2.5시간 후에 29%로 증가되었고, 3.5시간 후에 40.3%로 증가되었다.
0.5U/L의 시알리다아제 함유 반응조건에 있어서, 그 반응 혼합물 중에서 약 44.5%의 그 인자 Ⅶa가 3시간 후에 모노 또는 디페질화 되었고, 0.8% 또는 그 이상 이 트리 페질화 되었다. 20시간 후에 69.4%가 모노 또는 디페질화 되었고, 18.3% 또는 그 이상이 트리 페질화 되었다.
0.1U/L의 시알리다아제 함유 반응조건에 있어서,
그 반응 혼합물 중에서 약 29.6%의 인자 Ⅶa가 3시간 후에 모노 또는 디페질화 되었다.
20시간 후에 71.3%가 모노 또는 디페질화 되었고, 15.1% 또는 그 이상이 트리페질화 되었다.
그 결과를 도 11 및 도 12에 나타낸다.
실시예 9
시스테인-PEG2 (2)의 제조
Figure 112008019904915-PCT00175
a. 혼합물 1의 합성
포타슘히드록시드(분말로서 84.2㎎, 1.5m㏖)을 무수메타놀(20L)에 용해시킨 용액에 첨가하였다.
얻어진 혼합액을 30분간 실온에서 교반시킨 다음, 분자량 20KDa의 mPEG-O-토 실레이트(Ts; 1.0g, 0.05m㏖)를 수회 조금씩 나누어 2시간에 걸쳐 첨가하였다.
얻어진 혼합액을 실온에서 5일간 교반시키고, 회전식 증발에 의해 농축하였다. 그 잔류물(residue)을 물(30mL)로 희석시켜, 실온에서 2시간 동안 교반하여 과잉의 20KDa를 가진 mPEG-0-토실레이트를 파괴하였다.
그 다음, 얻어진 용액을 아세트산으로 중화시키고, 그 pH를 pH 5.0로 조정하여 역상 크로마토그래피(C-18 실리카) 컬럼 상에서 로딩(loading) 하였다.
그 컬럼을 메타놀/물의 증감액(gradient)으로 용출시켜(그 생성물은 약 70%의 메타놀에서 용출하였음), 생성물 용출은 증발용 광산란(evaporative light scattering)에 의해 모니터링 하였으며, 그 적합한 프랙션을 수집하여 물(500mL)로 희석하였다.
얻어진 이 용액을 크로마토그래피에 의해 처리하였으며(이온교환, XK 50 Q, BIG Beads, 300mL, 히드록시드형; 물과 물/아세트산 -0.75N의 증감액), 적합한 프랙션의 pH는 아세트산을 사용하여 pH 6.0으로 저하시켰다.
그 다음, 이 용액을 역상 컬럼(C-18 실리카) 상에서 포집(capturing)하고, 위에서 설명한 바와 같이, 메타놀/물의 증감액(gradient)으로 용출하였다.
그 생성물 프랙션을 푸링(pooling)하고, 농축하며, 수중에서 재용해하고 냉동 건조시켜 백색고체(1) 453㎎(44%)을 얻었다.
그 화합물의 구조 데이터는 다음과 같다: 1H-NMR(500 MHz; D2O)δ2.83(t, 2H, O-C-CH 2-S), 3.05(q, 1H, S-CHH-CHN), 3.18(q, 1H, S-CHH-CHN), 3.38(s, 3H CH 3O), 3.7(t, OCH 2CH 2O), 3.95(q, 1H, CHN).
그 생성물의 순도는 SDS-PAGE에 의해 확인하였다.
b. 시스테인-PEG2 (2)의 합성
무수 CH2Cl2(30mL) 중에 화합물 1(440㎎, 22μ㏖)을 용해시킨 용액이 염기성으로 될 때까지 그 용액에 트리에틸아민(~0.5mL)을 적가하였다.
CH2Cl2(20mL) 중에 20KDa의 mPEG-O-p-니트로페닐 카르보네이트(660㎎, 33μ㏖)와 N-히드록시숙신이미드(3.6㎍, 30.8μ㏖)를 용해한 용액을 실온에서 1시간에 걸쳐 수회 조금씩 첨가하였다.
얻어진 그 반응 혼합액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다.
그 다음 용제를 회전식 증발에 의해 제거하였으며, 얻어진 그 잔류물을 물(100mL)에 용해시키고, 그 pH는 1.0N NaOH를 사용하여 pH 9.5로 조정하였다.
그 얻어진 염기성 용액을 실온에서 2시간 동안 교반시킨 다음, 아세트산으로 중화시켜 pH 7.0으로 하였다.
그 다음, 그 얻어진 용액을 역상 크로마토그래피(C-18 실리카) 컬럼 상에서 로딩(loading) 하였다.
그 컬럼은 메타놀/물의 증감액(gradient)으로 용출시켰다(그 생성물은 약 70%의 메타놀에서 용출하였음).
생성물 용출은 증발용 광산란에 의해 모니터링 하였으며, 적합한 프랙션을 수집하여 물(500mL)로 희석하였다.
얻어진 이 용액을 크로마토그래피에 의해 처리하여(이온교환, XK 50 Q, BIG Beads, 300mL, 히드록시드형; 물과 물/아세트산-0.75N의 구배(증감액)) 적합한 프랙션의 pH는 아세트산을 사용하여 pH 6.0으로 저하하였다.
그 다음, 이 용액을 역상 컬럼(C-18 실리카) 상에서 포집하여, 위에서 설명한 바와 같이 메타놀/물의 증감액(gradient)으로 용출하였다.
그 생성물 프랙션을 푸링(pooling)하고, 농축시키며, 수 중에서 재용해시키고, 동결 건조시켜 백색고체(2) 575㎎(70%)을 얻었다.
상기 화합물의 구조 데이터는 다음과 같다: 1H-NMR(500 MHz; D2O)δ2.83(t, 2H, O-C-CH 2-S), 2.95(t, 2H, O-C-CH 2-S), 3.12(q, 1H, S-CHH-CHN), 3.39(s, 3H CH 3O), 3.71(t, OCH 2CH 2O).
실시예 10
인자(Factor) Ⅶa-SA-PEG-40KDa
인자 Ⅶa의 글리코 페질화(glycoPEGylation)(캐핑을 가진 원 폿 : one pot with capping)
인자 Ⅶa의 글리코 페질화는 하나의 원 폿 반응(one pot reaction)에서 얻어진다. 여기서, 탈시알화(desialation)와 페질화는 동시에 발생하며, 그 다음 이어서 시알산으로 캐핑된다.
그 반응은 재순환하는 수조(waterbath)에 의해 32℃에서 조절하는 하나의 재 킷형 글라스제 용기(jacked glass vessel) 내에서 실시하였다.
1차적으로, 상기 용기내에 농축시켜 0.2㎛로 여과한 인자 Ⅶa를 도입시켜, 20분간 교반바(stir bar)에 의해 혼합시키면서 32℃로 가열하였다.
시알리다아제 용액은 농도 4,000U/L에서 10mM 히스티딘/50mM NaCl/20mM CaCl2, pH 6.0 버퍼 중에 건조 분말로부터 조제하였다.
그 인자 Ⅶa가 일단 온도 32℃에 도달될 경우, 그 시알리다아제 용액을 그 인자 Ⅶa에 첨가시켰으며, 얻어진 그 반응액을 약 5분간 혼합하였다.
그 혼합을 정지시킨 후에는 균일한 용액을 확보하도록 하였다.
32℃에서 1.0시간 동안 처리하여 탈시알화(desialation) 반응을 하도록 하였다.
그 탈시알화 반응을 할 때 그 CMP-SA-PEG-40KDa는 10mM 히스티딘/502mM NaCl/20mM CaCl2, pH 6.0 버퍼 중에서 용해시켜, 그 농도는 271㎚에서의 UV 흡광도에 의해 측정하였다.
그 CMP-SA-PEG-40KDa를 용해시킨 후에, 그 CMP-SA-PEG-40KDa를 그 반응액과 그 ST3Gal3에 첨가하였으며, 그 반응액을 약 15분간 교반바(stir bar)로 혼합시켜, 균일한 용액을 확보하였다. 버퍼 85mL를 추가하여 반응액 1.0 L를 조제하였다.
얻어진 그 반응액을 CMP-SA를 첨가하기 전에 24시간 동안 교반 없이 농도 4.3mM으로 될 때까지 처리하도록 하여 그 반응액을 급냉하고 그 잔류되어 있는 말단 갈락토오스 잔기를 시알산으로 캐핑하였다.
그 급냉(quenching)은 그 반응액을 32℃에서 30분간 혼합시키면서 처리하도록 하였다.
그 반응액의 전량은 급냉 전에 1.0 L이었다.
처리과정 시점에 있는 샘플(timepoint samples)(1mL)을 0시간, 4.5시간, 7.5시간 및 24시간에 얻어 CMP-SA와 함께 급냉시키고 RP-HPLC와 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
인자 Ⅶa-SA-PEG-40KDa의 정제
캐핑 후에, 그 용액은 4℃에 하룻밤 저장한 10mM 히스티딘(pH 6.0) 2.0 L로 희석하였으며, 그 샘플은 Millipak 60의 0.2㎛ 필터를 통해 여과하였다.
그 결과 얻어진 로드 용량(load volume)은 3.1 L이었다.
AEX2의 크로마토그래피를 Akta Pilot의 시스템 상에서 20~25℃ (실온)에서 실시하였다.
로딩(loading) 후에, 평형 버퍼(equilibrium buffer)로 10컬럼 용량 세척을 실시하여, 생성물은 MgCl2의 10컬럼 용량 증감액(gradient)을 사용하여 상기 컬럼에서 용출되었다.
여기서, 그 결과 비페질화(unPEGlyated) 인자 Ⅶa로부터 페질화 인자 Ⅶa 종의 분해농(resolution)을 얻었다.
이 컬럼의 로딩은 < 2㎎ 인자 Ⅶa/mL 수지의 낮은 표적화(targeting)을 유지하도록 하였다.
벌크 생성물(bulk produect)의 풀(pool)을 형성하기 위하여 선택된 프랙션과 프랙션 풀(pools)의 RP-HPLC 분석 이외에, SDS-PAGE 겔을 실시하였다.
풀 프랙션(pooled fractions)은 1M NaOH를 사용하여 pH를 pH 6.0으로 조정하여 하룻밤 동안 온도 2~8℃의 냉방(cold room) 중에서 저장하였다.
최종 농축/다이아필트레이션(diafiltration), 무균(aseptic) 여과 및 분취(aliquoting)
상기 풀 프랙션은 Millipak 20의 0.2㎛ 필터를 통하여 여과시켜 온도 2~8℃에서 하룻밤 저장하였다.
상기 농축/다이아필트레이션을 실시하기 위하여, Millipore의 재생 셀루로오스막(0.1㎡의 30KDa)을 하나의 연동펌프(peristaltic pump)와 실리콘제 튜빙(tubing)으로 장착한 하나의 시스템 내에서 사용하였다.
그 시스템을 조립시켜 물로 플러싱(flushing) 시킨 다음, 최소 1시간 동안 0.1M NaOH로 위생처리한 다음, 사용 직전에 10mM 히스티딘/5mM CaCl2/100mM NaCl pH 6.0 디아필트레이션 버퍼(diafiltration buffer)로 균형화(equilibration)할 때까지 0.1M NaOH 중에 저장하였다.
그 생성물을 약 400mL로 농축시킨 다음, 약 5 다이어 보륨(diavolumes)의 버퍼를 사용하여 일정한 용량으로 다이어필터링(diafiltering)을 하였다.
그 다음, 그 생성물을 약 300mL로 농축시키고, 5분간 저압 재순환(low pressure recirculation) 후에 회수하였으며, 그 막은 5분간 재순환에 의해 다이어 필트레이션 버퍼 200mL로 린싱(rinsing) 하였다.
그 세척액을 생성물과 함께 회수하였으며, 또 다른 50mL의 버퍼를 최종 세척액에 대하여 또 5분간 재순환시켰다.
그 결과 얻어진 벌크(bulk)는 약 510mL 이었으며, 이것은 0.2㎛ PES막(Millipore)으로 장착한 하나의 1L용 진공 필터를 통해 여과하였다.
그 다음, 무균여과 벌크(aseptically-filtered bulk)를 50mL용 무균팔콘 튜브(sterile falcon tubes) 중에서 25mL의 분취량으로 분취하여 -80℃에서 냉동하였다.
HPLC에 의한 페질화 반응액의 분석(실시예 10)
콘주게이션 반응시간 정제
0시간 4.5시간 7.5시간 24시간 크로마토그래피 후
비페질화 % 94.7 76.1 66.6 51.0 0.6
모노페질화 % 0.9 17.9 26.1 39.1 85.6
디페질화 % 0.1 0.9 1.9 5.1 5.1
트리페질화 % 0.0 0.0 0.0 0.2 0.2
24시간 후, 그 벌크 생성물 PEG-상태 분포는 다음과 같다:
비페질화(unpegylated) 0.7%, 모노페질화(mono-pegylated) 85.3%,
디페질화(di-pegylated) 11.5%, 트리-페질화(tri-pegylated) 0.3%
컬럼 크로마토그래피는 모노-및 디-페질화 종에서 비페질화재를 주로 제거하여 그 생성물의 분포를 형성하는 프로세스에서 주 스텝(main step)이다.
실시예 11
인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa
다음 실시예에서는 인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa의 L 및 H사슬에 변형당의 결합수를 역상 HPLC에 의해 측정하는 하나의 처리공정을 설명한다.
인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa는 L사슬에서 H사슬을 분리하기 위해 환원상태로 처리하였다.
분리 후, 그 H사슬과 L사슬을 역상 HPLC 실험으로 처리하였다.
피크(peaks)는 무변성(native) 인자 Ⅶa 대조(control)의 크로마토그램(chromatograms)에서 무변성 인자 Ⅶa 피크에 대한 위치(position)를 기준으로 하여 배정하였다.
다음 표에서는 L사슬에 대한 HPLC 용제 구배 파라미터를 설명한 것이다. 그 컬럼의 온도는 39℃이었다.
HPLC의 L사슬에 대한 용제 구배 파라미터
시간, 분 용제 B, % 유속, mL/min 비고
0 30 0.5 초기상태
60 47 0.5 구배용출
60.2 90 0.5 개시 세척액
70 90 0.5 세척액
L사슬 인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa의 크로마토그램(상부)과 무변성(native) L사슬 인자Ⅶa의 크로마토그램(하부)을 도 14A에서 나타낸다.
다음 표에는 H사슬에 대한 HPLC 용제 구배 파라미터를 설명한 것이다. 그 컬럼의 온도는 52℃이었다.
HPLC의 H사슬에 대한 용제 구배 파라미터
시간, 분 용제 B, % 유속, mL/min 비고
0 42.5 0.5 초기상태
36 52.5 0.5 구배용출
36.1 90 0.5 개시 세척액
41 90 0.5 세척액
H사슬 인자 Ⅶa-SA-PEG-10KDa의 크로마토그램(상부)과 무변성(native) H사슬 인자 Ⅶa의 크로마토그램(하부)을 도 14B에서 나타낸다.
실시예 12
인자 Ⅶa-SA-PEG-40KDa
다음 실시예에서는 인자 Ⅶa-SA-PEG-40KDa의 L사슬과 H사슬에 대한 변형당 결합수를 역상 HPLC에 의해 측정하는 하나의 처리공정을 설명한 것이다.
인자 Ⅶa-SA-PEG-40KDa는 L사슬에서 H사슬을 분리하기 위하여 환원상태로 처리하였다.
분리 후, 그 H사슬과 L사슬은 역상 HPLC 실험에 위해 분리하였다.
피크(peaks)는 그 무손상(native) 인자 Ⅶa 대조의 크로마토그램에서 비변형당 피크에 대한 위치를 기준으로 하여 배정하였다.
아래의 표는 L사슬에 대한 HPLC의 용제 구배 파라미터를 설명한 것이다. 그 컬럼온드는 25℃이었다.
HPLC의 L사슬에 대한 용제 구배 파라미터
시간(분) 용리액 B(%) 비고
0 30 초기상태
60 47 구배용출
60.5 90 개시 새척액
65.5 90 종료 세척액
66 42.5 H사슬방법 개시, 평형
70 42.5 실시 종료
L사슬 인자 Ⅶa-SA-PEG-4KDa의 크로마토그램(하부)과 무변성(native) L사슬 인자 Ⅶa의 크로마토그램(상부)을 도 15A에 나타낸다.
다음 표는 H사슬에 대한 HPLC 용제 구배 파라미터를 설명한 것이다. 그 컬 럼온도는 40℃이었다.
HPLC의 H사슬에 대한 용제 구배 파라미터
시간(분) 용리액 B(%) 비고
0 42.5 초기상태
36 52.5 구배용출
36.5 90 개시 새척액
41.5 90 종료 세척액
42 30 H사슬방법 개시, 평형
47 30 실시 종료
H사슬 인자 Ⅶa-SA-PEG-4KDa의 크로마토그램(하부)과 무변성(native) H사슬 인자 Ⅶa의 크로마토그램(상부)을 도 15B에 나타낸다.
여기서 설명한 실시예와 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것에 불과하며, 본 발명의 목적에서 볼 때 통상의 기술자에 의해 여러 가지로 변형 또는 변경할 수 있다는 것을 교시하며, 그 변형 또는 변경은 첨부된 청구범위와 본원 발명의 구제척 설명 범위내에 포함된다는 것을 알 수 있다.
여기서 인용한 모든 참고문헌의 간행물 및 특허문헌은 본 발명을 참조하기 위하여 여기에 인용하여 기재한다.
<110> NEOSE TECHNOLOGIES, INC. <120> GLYCOPEGYLATED FACTOR VII AND FACTOR VIIA <130> 040853-5175-WO <150> US 60/746,868 <151> 2006-05-09 <150> US 60/756,443 <151> 2006-01-05 <150> US 60/733,649 <151> 2005-11-04 <150> US 60/730,607 <151> 2005-10-26 <150> US 60/725,894 <151> 2005-10-11 <150> US 60/709,983 <151> 2005-08-19 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1332 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120 gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180 tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240 tcttacatag atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300 gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga attgtggggg gcaaggtgtg ccccaaaggg 600 gagtgtccat ggcaggtcct gttgttggtg aatggagctc agttgtgtgg ggggaccctg 660 atcaacacca tctgggtggt ctccgcggcc cactgtttcg acaaaatcaa gaactggagg 720 aacctgatcg cggtgctggg cgagcacgac ctcagcgagc acgacgggga tgagcagagc 780 cggcgggtgg cgcaggtcat catccccagc acgtacgtcc cgggcaccac caaccacgac 840 atcgcgctgc tccgcctgca ccagcccgtg gtcctcactg accatgtggt gcccctctgc 900 ctgcccgaac ggacgttctc tgagaggacg ctggccttcg tgcgcttctc attggtcagc 960 ggctggggcc agctgctgga ccgtggcgcc acggccctgg agctcatggt gctcaacgtg 1020 ccccggctga tgacccagga ctgcctgcag cagtcacgga aggtgggaga ctccccaaat 1080 atcacggagt acatgttctg tgccggctac tcggatggca gcaaggactc ctgcaagggg 1140 gacagtggag gcccacatgc cacccactac aggggcacgt ggtacctgac gggcatcgtc 1200 agctggggcc agggctgcgc aaccgtgggc cactttgggg tgtacaccag ggtctcccag 1260 tacatcgagt ggctgcaaaa gcatcatgcg ctcagagcca cgccaggagt cctcctgcga 1320 gccccatttc cc 1332 <210> 2 <211> 444 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln 1 5 10 15 Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val 20 25 30 Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 35 40 45 Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Glu Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60 Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly 85 90 95 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110 Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile 115 120 125 Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Gly Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr 130 135 140 Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 145 150 155 160 Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile 165 170 175 Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val 180 185 190 Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu 195 200 205 Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile 210 215 220 Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg 225 230 235 240 Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly 245 250 255 Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr 260 265 270 Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln 275 280 285 Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg 290 295 300 Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser 305 310 315 320 Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met 325 330 335 Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser 340 345 350 Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala 355 360 365 Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 370 375 380 Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val 385 390 395 400 Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr 405 410 415 Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu 420 425 430 Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 435 440

Claims (35)

  1. 다음에 나타낸 구조식을 가진 하나의 변형시알릴 잔기로 이루어진 하나의 글리코실링커를 구성하는 하나의 인자(factor) Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 제조 방법에 있어서,
    Figure 112008019904915-PCT00176
    (위 구조식에서,
    D는 -OH와 R1-L-NH-에서 선택한 하나의 멤버(member)이고; G는 R1-L-과 -C(0)(C1-C6)알킬-R1에서 선택한 하나의 멤버이며; R1은 하나의 직쇄폴리(에틸렌글리콜) 잔기와 하나의 분기폴리(에틸렌글리콜) 잔기에서 선택한 하나의 멤버로 이루어진 하나의 성분이고; M은 H, 하나의 금속 및 하나의 단일 음전하에서 선택한 하나의 멤버이며; L은 하나의 결합, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 링커(link)이고; D가 OH인 경우 G는 R1-L-이고, G가 -C(0)(C1-C6)알킬인 경우 D는 R1-L--NH이다.)
    상기 제조방법은 (a) 다음에 나타낸 글리코실 성분으로 이루어진 하나의 인자 Ⅶ/인자Ⅶa 펩티드를
    Figure 112008019904915-PCT00177
    다음에 나타낸 구조식을 가진 하나의 PEG-시알산도너 성분과
    Figure 112008019904915-PCT00178
    상기 PEG-시알산도너 성분을 상기 글리코실 성분의 Gal상에서 전이하는 하나의 효소와 함께 상기 전이에 적합한 조건하에서 접촉하는 것으로 이루어짐을 특징으로 하는 상기 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    L-R1은 아래에 나타낸 구조식을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00179
    위 구조식에서,
    a는 0~20에서 선택한 하나의 정수이다.
  3. 제 1항에 있어서,
    R1은 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구성체를 가짐을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00180
    위 구조식에서,
    e, f, m 및 n은 1~2500에서 독립하여 선택한 정수이고;
    q는 0~20에서 선택한 하나의 정수이다.
  4. 제 1항에 있어서,
    R1은 다음에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구성체를 가짐을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00181
    위 구조식에서,
    e, f 및 f'는 1~2500에서 독립하여 선택한 정수이고;
    q 및 q'는 1~20에서 독립하여 선택한 정수이다.
  5. 제 1항에 있어서,
    R1은 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구성체를 가지 며,
    Figure 112008019904915-PCT00182
    e 및 f는 1~2500에서 독립하여 선택한 정수임을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 글리코실 링커는 아래에 나타낸 구조식을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00183
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 구조식에 의해 상기 글리코실 링커 중 최소 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00184
    위 구조식에서,
    AA는 상기 펩티드 콘주게이트의 하나의 아미노산 잔기이고,
    t는 0과 1에서 선택한 하나의 정수이다.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드 콘주게이트는 최소 하나의 상기 글리코실 링커로 이루어지며, 상기 글리코실 링커의 각각은 아래에 나타낸 구조식에서 독립하여 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조체를 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00185
    Figure 112008019904915-PCT00186
    위 구조식에서,
    AA는 상기 펩티드 콘주게이트의 하나의 아미노산 잔기이고,
    t는 0과 1에서 선택한 하나의 정수이다.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 구조식에 의한 최소 하나의 상기 글리코실 링커로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00187
    Figure 112008019904915-PCT00188
    위 구조식에서,
    AA는 상기 펩티드 콘주게이트의 하나의 아미노산 잔기이고,
    t는 0과 1에서 선택한 하나의 정수이며,
    G로 구성하지 않은 시알릴 성분들 중 0~2종의 성분에서 선택한 하나의 멤버는 존재하지 않는다.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 구조식에 의한 최소 하나의 상기 글리코실 링커로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00189
    Figure 112008019904915-PCT00190
    위 구조식에서,
    AA는 상기 펩티드 콘주게이트의 하나의 아미노산 잔기이고,
    t는 0과 1에서 선택한 하나의 정수이며;
    G로 구성되지 않은 시알릴 성분 중 0~2 종의 성분에서 선택한 하나의 멤버는 존재하지 않는다.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 아미노산 서열 SEQ. ID. NO: 1을 가짐을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 글리코실 링커는 세린 및 트레오닌에서 선택한 하나의 아미노산 잔기에 의해 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드에 결합되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 글리코실 링커는 하나의 아스파라긴 잔기인 하나의 아미노산 잔기에 의해 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드에 결합하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 아스파라긴 잔기는 N152, N322 및 그 조합에서 선택한 하나의 멤버인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 인자 Ⅶa 펩티드는 하나의 바이오 활성(bioactive) 인자 Ⅶa 펩티드인 것을 특징으로 하는 상기 제조방법.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 스텝(a) 전에, (b) 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 하나의 적합한 숙주(host)에서 발현하는 스텝을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 숙주(host)는 하나의 포유동물 발현계(mammalian expresion system)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  18. 필요할 때 응고(응혈) 잠재력 절충(compromised clotting potency)에 특징이 있는 피검자의 상태를 치료하는 방법에 있어서,
    상기 피검자의 상태를 개선하는데 효과적인, 제 1항의 제조방법에 의해 제조된 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 소정량을 피검자에 투여하는 스텝을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 포유동물의 응고(응혈) 잠재력을 촉진하는 방법에 있어서,
    제 1항의 제조방법에 의해 제조된 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 소정량을 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 다음에 나타낸 구조식을 가진 하나의 변형 시알릴 잔기로 이루어진 하나의 글리코실 링커를 함유한 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 제조방법에 있어서,
    Figure 112008019904915-PCT00191
    (위 구조식에서,
    R2는 H, CH2OR7, COOR7 또는 OR7이고, 여기서 R7은 H, 치환 또는 비치환 알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로 알킬이며; R3 및 R4는, H, 치환 또는 비치환 알킬, OR8, NHC(O)R9에서 독립하여 선택한 멤버이고, 여기서 R8과 R9는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 또는 시알산에서 독립하여 선택되며; R16 및 R17은 독립하여 폴리머 암(polymeric arms)을 선택하며, X2 및 X4는 C에 폴리머 성분 R16 및 R17을 결합하는 결합 프라그멘트를 독립하여 선택하고; X5는 하나의 비반응성(non-reactive)기 이고; La는 하나의 기이다.)
    상기 제조방법은 (a) 아래에 나타낸 글리코실 성분으로 이루어진 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를
    Figure 112008019904915-PCT00192
    아래에 나타낸 구조식을 가진 하나의 PEG-시알산 도너 성분 및
    Figure 112008019904915-PCT00193
    상기 글리코실 성분의 Gal 상에서 PEG-시알산을 전이하는 하나의 효소와 함께 상기 전이에 적합한 조건하에서 접촉하는 것을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    다음에 나타낸 상기 성분은
    Figure 112008019904915-PCT00194
    아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조식을 가짐을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00195
    위 구조식에서,
    e, f, m 및 n은 1~2500에서 독립하여 선택한 정수이고,
    q는 0~20에서 선택한 하나의 정수이다.
  22. 제 20항에 있어서,
    다음에 나타낸 상기 성분은
    Figure 112008019904915-PCT00196
    아래에 나타낸 구조식에서 선택한 하나의 멤버인 하나의 구조식을 가짐을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00197
    위 구조식에서,
    e, f 및 f'는 1~2500에서 독립하여 선택한 정수이고,
    q 및 q'는 1~20에서 독립하여 선택한 정수이다.
  23. 제 20항에 있어서,
    상기 글리코실 링커는 다음에 나타낸 구조식으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00198
  24. 제 20항에 있어서,
    상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트는 아래에 나타낸 구조식을 가진 최소 하나의 글리코실 링커로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure 112008019904915-PCT00199
    위 구조식에서,
    AA는 상기 펩티드의 하나의 아미노산 잔기이고;
    t는 0과 1에서 선택한 하나의 정수이며;
    R15는 변형 시알릴 성분이다.
  25. 제 20항에 있어서,
    상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드는 아미노산 서열 SEQ. ID. NO: 1을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  26. 제 20항에 있어서,
    상기 글리코실 링커는 하나의 아스파라긴 잔기인 하나의 아미노산 잔기에 의해 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드에 결합하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 아스파라긴 잔기는 N152, N322 및 그 조합에서 선택한 하나의 멤버인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  28. 제 20항에 있어서,
    상기 인자 Ⅶa 펩티드는 하나의 바이오 활성(bioactive) 인자 Ⅶa 펩티드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  29. 제 20항에 있어서,
    상기 스텝 (a)전에 (b) 하나의 적합한 숙주에서 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 발현하는 것을 더 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
  30. 제 29항에 있어서,
    상기 숙주는 하나의 포유동물 발현계(mammalian expression system)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  31. 피검자의 응고(응혈) 잠재력 절충(compromised clotting potency)을 특징으로 하는 상태를 필요시에 치료하는 방법에 있어서,
    상기 피검자의 상태를 개선하는데 효과적인, 제 20항의 제조방법에 의해 제조된 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 소정량을 피검자에 투여하는 스텝을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 하나의 포유동물의 응고(응혈) 잠재력을 촉진하는 방법에 있어서,
    제 20항의 제조방법에 의해 제조된 상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 소정량을 상기 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 하나의 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트의 합성방법에 있어서,
    a) 시알리다아제,
    b) 글리코실 전이효소, 엑소글리코시다아제 및 엔도글리코시다아제에서 선택한 하나의 멤버인 효소,
    c) 변형당/변형 시알릴 전기,
    d) 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드를 배합하여,
    상기 인자 Ⅶ/인자 Ⅶa 펩티드 콘주게이트를 합성하는 것을 특징으로 하는 합성방법.
  34. 제 33항에 있어서,
    상기 배합(combining)은 10시간 이하의 시간 동안인 것을 특징으로 하는 합성방법.
  35. 제 33항에 있어서,
    하나의 캐핑 스텝(capping step)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 합성방법.
KR1020087006691A 2005-08-19 2006-08-21 글리코페닐화 인자 ⅶ 및 인자 ⅶ에이 Ceased KR20080080081A (ko)

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US70998305P 2005-08-19 2005-08-19
US60/709,983 2005-08-19
US72589405P 2005-10-11 2005-10-11
US60/725,894 2005-10-11
US73060705P 2005-10-26 2005-10-26
US60/730,607 2005-10-26
US73364905P 2005-11-04 2005-11-04
US60/733,649 2005-11-04
US75644306P 2006-01-05 2006-01-05
US60/756,443 2006-01-05
US74686806P 2006-05-09 2006-05-09
US60/746,868 2006-05-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080080081A true KR20080080081A (ko) 2008-09-02

Family

ID=37758493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087006691A Ceased KR20080080081A (ko) 2005-08-19 2006-08-21 글리코페닐화 인자 ⅶ 및 인자 ⅶ에이

Country Status (12)

Country Link
US (2) US20090305967A1 (ko)
EP (1) EP1937719A4 (ko)
JP (1) JP2009515508A (ko)
KR (1) KR20080080081A (ko)
CN (1) CN102719508A (ko)
AU (1) AU2006280932A1 (ko)
BR (1) BRPI0614839A2 (ko)
CA (1) CA2619969A1 (ko)
IL (1) IL189586A0 (ko)
MX (1) MX2008002395A (ko)
NO (1) NO20080970L (ko)
WO (1) WO2007022512A2 (ko)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7157277B2 (en) * 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
DE60336555D1 (de) 2002-06-21 2011-05-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylierte glykoformen von faktor vii
EP1608688B1 (en) 2003-03-14 2013-02-27 BioGeneriX AG Branched water-soluble polymers and their conjugates
US20070026485A1 (en) 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
AU2004240553A1 (en) 2003-05-09 2004-12-02 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
NZ548123A (en) 2004-01-08 2010-05-28 Novo Nordisk As O-linked glycosylation of peptides
US20080300173A1 (en) * 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
CN101098854B (zh) 2004-07-23 2012-12-05 恩多塞特公司 二价连接体及其轭合物
WO2006031811A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
EP2586456B1 (en) 2004-10-29 2016-01-20 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
JP4951527B2 (ja) 2005-01-10 2012-06-13 バイオジェネリックス アーゲー 糖ｐｅｇ化顆粒球コロニー刺激因子
US9187546B2 (en) 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US20110003744A1 (en) * 2005-05-25 2011-01-06 Novo Nordisk A/S Glycopegylated Erythropoietin Formulations
WO2006127910A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
US20080255026A1 (en) 2005-05-25 2008-10-16 Glycopegylated Factor 1X Glycopegylated Factor Ix
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
US20080248959A1 (en) 2006-07-21 2008-10-09 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
JP2010505874A (ja) 2006-10-03 2010-02-25 ノヴォ ノルディスク アー／エス ポリペプチドコンジュゲートの精製方法
NZ599239A (en) 2007-03-14 2013-10-25 Endocyte Inc Binding ligand linked drug delivery conjugates of tubulysins
AU2008237411B2 (en) 2007-04-03 2013-10-03 Ratiopharm Gmbh Methods of treatment using glycopegylated G-CSF
KR101047925B1 (ko) * 2007-04-19 2011-07-08 주식회사 엘지화학 아크릴계 점착제 조성물 및 이를 포함하는 편광판
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
US9877965B2 (en) 2007-06-25 2018-01-30 Endocyte, Inc. Vitamin receptor drug delivery conjugates for treating inflammation
US9138484B2 (en) 2007-06-25 2015-09-22 Endocyte, Inc. Conjugates containing hydrophilic spacer linkers
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
WO2009108806A1 (en) 2008-02-27 2009-09-03 Novo Nordisk A/S Conjugated factor viii molecules
TWI538916B (zh) * 2008-04-11 2016-06-21 介控生化科技公司 經修飾的因子vii多肽和其用途
WO2011018515A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Novo Nordisk Health Care Ag Method of purifying pegylated proteins
WO2011064247A1 (en) * 2009-11-24 2011-06-03 Novo Nordisk Health Care Ag Method of purifying pegylated proteins
KR20120002129A (ko) * 2010-06-30 2012-01-05 한미홀딩스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 제７인자（Ｆａｃｔｏｒ Ⅶａ）약물 결합체
TWI595004B (zh) 2010-11-03 2017-08-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
WO2013126797A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Purdue Research Foundation Cholecystokinin b receptor targeting for imaging and therapy
US20140080175A1 (en) 2012-03-29 2014-03-20 Endocyte, Inc. Processes for preparing tubulysin derivatives and conjugates thereof
AP2014008049A0 (en) 2012-04-16 2014-11-30 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Optimised subcuraneous therapeutic agents
CN104661685A (zh) 2012-10-15 2015-05-27 诺和诺德保健Ag（股份有限公司） 因子vii缀合物
US9662402B2 (en) 2012-10-16 2017-05-30 Endocyte, Inc. Drug delivery conjugates containing unnatural amino acids and methods for using
PL2938351T3 (pl) 2012-12-24 2020-03-31 Coagulant Therapeutics Corporation Krótko działające polipeptydy czynnika VII
MX2016004702A (es) 2013-10-15 2016-07-22 Novo Nordisk Healthcare Ag Polipeptidos del factor vii de coagulacion.
AR099328A1 (es) * 2014-02-12 2016-07-13 Novo Nordisk As Conjugados de factor vii
US20210069306A1 (en) 2019-08-15 2021-03-11 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration and on-demand treatment
CA3194956A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Glympse Bio, Inc. Ex vivo protease activity detection for disease detection/diagnostic, staging, monitoring and treatment
US20250197917A1 (en) * 2022-03-09 2025-06-19 Glympse Bio, Inc. Method of protease detection

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1479268A (en) * 1973-07-05 1977-07-13 Beecham Group Ltd Pharmaceutical compositions
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
CH596313A5 (ko) * 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
US4385260A (en) * 1975-09-09 1983-05-24 Beckman Instruments, Inc. Bargraph display
US4414147A (en) * 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
JPS57206622A (en) * 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4451566A (en) * 1981-12-04 1984-05-29 Spencer Donald B Methods and apparatus for enzymatically producing ethanol
US4438253A (en) * 1982-11-12 1984-03-20 American Cyanamid Company Poly(glycolic acid)/poly(alkylene glycol) block copolymers and method of manufacturing the same
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4565653A (en) * 1984-03-30 1986-01-21 Pfizer Inc. Acyltripeptide immunostimulants
US4879236A (en) * 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4675414A (en) * 1985-03-08 1987-06-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Maleimidomethyl-carbonate polyethers
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
JPS6238172A (ja) * 1985-08-12 1987-02-19 株式会社　高研 抗血栓性医用材料の製造方法
SE451849B (sv) * 1985-12-11 1987-11-02 Svenska Sockerfabriks Ab Sett att syntetisera glykosidiska bindningar samt anvendning av pa detta sett erhallna produkter
IT1213029B (it) * 1986-01-30 1989-12-07 Bracco Ind Chimica Spa Chelati di ioni metallici paramagnetici.
US4767702A (en) * 1986-02-06 1988-08-30 Cohenford Menashi A Paper strip assay for neisseria species
US4925796A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US5272066A (en) * 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
IL82834A (en) * 1987-06-09 1990-11-05 Yissum Res Dev Co Biodegradable polymeric materials based on polyether glycols,processes for the preparation thereof and surgical artiicles made therefrom
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8810808D0 (en) * 1988-05-06 1988-06-08 Wellcome Found Vectors
US5169933A (en) * 1988-08-15 1992-12-08 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5104651A (en) * 1988-12-16 1992-04-14 Amgen Inc. Stabilized hydrophobic protein formulations of g-csf
US5047335A (en) * 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
US6166183A (en) * 1992-11-30 2000-12-26 Kirin-Amgen, Inc. Chemically-modified G-CSF
US5194376A (en) * 1989-02-28 1993-03-16 University Of Ottawa Baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5342940A (en) * 1989-05-27 1994-08-30 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same
US5977307A (en) * 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US5672683A (en) * 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
US5527527A (en) * 1989-09-07 1996-06-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
US5154924A (en) * 1989-09-07 1992-10-13 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
US5182107A (en) * 1989-09-07 1993-01-26 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
US5032519A (en) * 1989-10-24 1991-07-16 The Regents Of The Univ. Of California Method for producing secretable glycosyltransferases and other Golgi processing enzymes
US5324663A (en) * 1990-02-14 1994-06-28 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
DE4009630C2 (de) * 1990-03-26 1995-09-28 Reinhard Prof Dr Dr Brossmer CMP-aktivierte fluoreszierende Sialinsäuren sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
WO1991016449A1 (en) * 1990-04-16 1991-10-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis
US5399345A (en) * 1990-05-08 1995-03-21 Boehringer Mannheim, Gmbh Muteins of the granulocyte colony stimulating factor
US5219564A (en) * 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
US5410016A (en) * 1990-10-15 1995-04-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Photopolymerizable biodegradable hydrogels as tissue contacting materials and controlled-release carriers
US5164374A (en) * 1990-12-17 1992-11-17 Monsanto Company Use of oligosaccharides for treatment of arthritis
US5278299A (en) * 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
US5352670A (en) * 1991-06-10 1994-10-04 Alberta Research Council Methods for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides
US5374655A (en) * 1991-06-10 1994-12-20 Alberta Research Council Methods for the synthesis of monofucosylated oligosaccharides terminating in di-N-acetyllactosaminyl structures
KR950014915B1 (ko) * 1991-06-19 1995-12-18 주식회사녹십자 탈시알로당단백-포함화합물
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5384249A (en) * 1991-12-17 1995-01-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α2→3 sialyltransferase
US6037452A (en) * 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
US5614184A (en) * 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
US5308460A (en) * 1992-10-30 1994-05-03 Glyko, Incorporated Rapid synthesis and analysis of carbohydrates
US5202413A (en) * 1993-02-16 1993-04-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alternating (ABA)N polylactide block copolymers
US5409817A (en) * 1993-05-04 1995-04-25 Cytel, Inc. Use of trans-sialidase and sialyltransferase for synthesis of sialylα2→3βgalactosides
US5374541A (en) * 1993-05-04 1994-12-20 The Scripps Research Institute Combined use of β-galactosidase and sialyltransferase coupled with in situ regeneration of CMP-sialic acid for one pot synthesis of oligosaccharides
WO1994026906A2 (en) * 1993-05-14 1994-11-24 The Upjohn Company CLONED DNA ENCODING A UDP-GALNAc:POLYPEPTIDE,N-ACETYLGALACTOS AMINYLTRANSFERASE
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US5369017A (en) * 1994-02-04 1994-11-29 The Scripps Research Institute Process for solid phase glycopeptide synthesis
US5492841A (en) * 1994-02-18 1996-02-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Quaternary ammonium immunogenic conjugates and immunoassay reagents
US5432059A (en) * 1994-04-01 1995-07-11 Specialty Laboratories, Inc. Assay for glycosylation deficiency disorders
US5545553A (en) * 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
US5834251A (en) * 1994-12-30 1998-11-10 Alko Group Ltd. Methods of modifying carbohydrate moieties
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5728554A (en) * 1995-04-11 1998-03-17 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of glycosidic linkages
US6030815A (en) * 1995-04-11 2000-02-29 Neose Technologies, Inc. Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US5922577A (en) * 1995-04-11 1999-07-13 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of glycosidic linkages
US5876980A (en) * 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US6015555A (en) * 1995-05-19 2000-01-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
CA2658039A1 (en) * 1995-09-21 1997-03-27 Genentech, Inc. Human growth hormone variants
US5716812A (en) * 1995-12-12 1998-02-10 The University Of British Columbia Methods and compositions for synthesis of oligosaccharides, and the products formed thereby
AU725376B2 (en) * 1996-10-15 2000-10-12 Transave, Inc. Peptide-lipid conjugates, liposomes and liposomal drug delivery
ATE263841T1 (de) * 1997-01-16 2004-04-15 Neose Technologies Inc Praktische in vitro sialylierung von rekombinanten glykpproteinen
US5945314A (en) * 1997-03-31 1999-08-31 Abbott Laboratories Process for synthesizing oligosaccharides
US6183738B1 (en) * 1997-05-12 2001-02-06 Phoenix Pharamacologics, Inc. Modified arginine deiminase
US20030027257A1 (en) * 1997-08-21 2003-02-06 University Technologies International, Inc. Sequences for improving the efficiency of secretion of non-secreted protein from mammalian and insect cells
CA2312843A1 (en) * 1997-12-01 1999-06-10 Neose Technologies Inc. Enzymatic synthesis of gangliosides
EP0924298A1 (en) * 1997-12-18 1999-06-23 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Protein expression in baculovirus vector expression systems
CA2323048C (en) * 1998-03-12 2006-10-10 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
DE19852729A1 (de) * 1998-11-16 2000-05-18 Werner Reutter Rekombinante Glycoproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung
US6261805B1 (en) * 1999-07-15 2001-07-17 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Sialyiation of N-linked glycoproteins in the baculovirus expression vector system
WO2001045796A2 (en) * 1999-12-22 2001-06-28 Shearwater Corporation Method for the preparation of 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol)
PT1311285E (pt) * 2000-05-15 2005-06-30 Hoffmann La Roche Composicao farmaceutica liquida contendo um derivado de eritropoietina
ATE309385T1 (de) * 2000-06-28 2005-11-15 Glycofi Inc Verfahren für die herstellung modifizierter glykoproteine
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7795210B2 (en) * 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
CA2462930C (en) * 2001-10-10 2012-07-10 Shawn De Frees Remodeling and glycoconjugation of peptides
US7265084B2 (en) * 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
DE60336555D1 (de) * 2002-06-21 2011-05-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylierte glykoformen von faktor vii
WO2004018214A1 (en) * 2002-08-22 2004-03-04 Mvm Products, Llc Universal inkjet printer device and methods
AU2003270341A1 (en) * 2002-09-05 2004-03-29 The General Hospital Corporation Modified asialo-interferons and uses thereof
US20070026485A1 (en) * 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
ES2445948T3 (es) * 2003-11-24 2014-03-06 Ratiopharm Gmbh Eritropoyetina glicopegilada
US8633157B2 (en) * 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
AU2004296860B2 (en) * 2003-12-03 2010-04-22 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
AU2004296855B2 (en) * 2003-12-03 2011-01-06 Ratiopharm Gmbh Glycopegylated Granulocyte Colony Stimulating Factor
NZ548123A (en) * 2004-01-08 2010-05-28 Novo Nordisk As O-linked glycosylation of peptides
ES2674129T3 (es) * 2004-02-12 2018-06-27 Archemix Llc Agentes terapéuticos de base aptámeros útiles en el tratamiento de trastornos relacionados con complemento
US7904787B2 (en) * 2007-01-09 2011-03-08 International Business Machines Corporation Pipelined cyclic redundancy check for high bandwidth interfaces

Also Published As

Publication number Publication date
IL189586A0 (en) 2008-08-07
AU2006280932A1 (en) 2007-02-22
US20090305967A1 (en) 2009-12-10
WO2007022512A3 (en) 2007-10-04
EP1937719A4 (en) 2010-11-24
EP1937719A2 (en) 2008-07-02
MX2008002395A (es) 2008-03-18
US20100113743A1 (en) 2010-05-06
BRPI0614839A2 (pt) 2009-05-19
JP2009515508A (ja) 2009-04-16
CA2619969A1 (en) 2007-02-22
CN102719508A (zh) 2012-10-10
NO20080970L (no) 2008-05-19
WO2007022512A2 (en) 2007-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2068907B1 (en) Glycerol linked pegylated sugars and glycopeptides
US8911967B2 (en) One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
KR20080080081A (ko) 글리코페닐화 인자 ⅶ 및 인자 ⅶ에이
US8633157B2 (en) Glycopegylated erythropoietin
AU2006203792B2 (en) Glycopegylated Granulocyte Colony Stimulating Factor
KR101209111B1 (ko) 글리코페질화 인자 나인
US20060040856A1 (en) Glycopegylated factor IX
US20120107867A1 (en) Glycopegylated erythropoietin
WO2006127910A2 (en) Glycopegylated erythropoietin formulations
US20130137157A1 (en) Glycopegylated factor vii and factor viia
CN101374861A (zh) 糖基聚乙二醇化的因子ⅶ和因子ⅶa

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20080319

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
N231 Notification of change of applicant
PN2301 Change of applicant

Patent event date: 20090710

Comment text: Notification of Change of Applicant

Patent event code: PN23011R01D

A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20110809

Comment text: Request for Examination of Application

PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20121219

Patent event code: PE09021S01D

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20130322

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20121219

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I