KR20080071841A - 조효소 ｑ10의 분리 및 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 높은 순도의 조효소 Q10의 분리 및 정제방법에 관한 것으로, 상세하게는 조효소 Q10 생산성 미생물 균주 배양액으로부터 유기용매로 추출한 조효소 Q10 함유 균주 추출액을 얻는 단계, 이를 비극성 용매에 용해하여 실리카젤 수지가 채워져 있는 컬럼에 통과시켜 상기 추출액 중의 조효소 Q10 성분 및 부산물을 실리카젤 수지에 흡착시키는 단계, 상기 컬럼에 비극성 용매를 통과시켜 비극성 부산물을 탈착시키는 단계, 및 상기 컬럼에 용리액을 통과시켜 조효소 Q10을 회수하는 단계를 포함하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명은 별도의 화학처리 없이 재결정이 가능한 수준의 비교적 높은 순도로 조효소 Q10을 분리하며, 신속하고 경제적으로 조효소 Q10의 대량 정제를 가능하게 하는 실용적 분리 및 정제법에 관한 것이다.

로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 조효소 Q10, 분리 및 정제 방법, n-헥산, 에틸아세테이트, 극성, 비극성

Description

조효소 Ｑ10의 분리 및 정제 방법{Separating and Purifying Method of Coenzyme Q10}

본 발명은 높은 순도의 조효소 Q10의 효율적인 분리 및 정제방법에 관한 것으로, 상세하게는 조효소 Q10 생산성 미생물 균주 배양액으로부터 유기용매로 추출한 조효소 Q10함유 추출액을 획득하여, 비극성 용매에 용해하여 부가적인 화학처리 없이 이를 실리카젤 수지가 채워져 있는 컬럼에 통과시켜 상기 추출액 중의 조효소 Q10 성분 및 부산물을 실리카젤에 흡착시키고, 상기 컬럼에 비극성 용매를 통과시켜 비극성 부산물을 분리한 후, 용리액을 수지 컬럼에 통과시켜 조효소 Q10을 회수하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.

조효소 Q10은 유비퀴논(Ubiquinone) 또는 2,3-디메톡시, 5-메틸, 6-폴리이소프렌 파라벤조퀴논으로도 불리며, 세포막에서 발견되는 이소프레노이드(Isoprenoids) 군의 화합물로서 10개의 이소프렌 단위를 갖고 있다. 조효소 Q10은 미토콘드리아에서 일어나는 산화적 인산화(oxidative phosphorylation) 과정에 참여하며, 자유 라디칼의 제거 및 세포의 산화/환원적 신호전달 조절과정에도 참여한다고 알려져 있다(Crane, J. Am. Coll . Nutr . 2001, 20, 591). 조효소 Q10은 이러한 생화학적 기능 때문에 심장질환의 치료약으로 사용되어왔으며, 그 외에도 건강 보조식품의 원료 (neutraceuticals), 화장품의 원료(cosmetics) 등의 다양한 용도가 개발되고 있다.

조효소 Q10을 얻는 방법으로는 화학적 합성법이 있으나, 그 합성 프로세스는 복잡하며, 고비용이 요구된다. 본 발명의 정제 방법은 조효소 Q10을 생산하는 균주로부터 얻어진 발효 생성물인 조효소 Q10에 관한 것이다.

조효소 Q10 생산성 균주 배양액으로부터 조효소 Q10을 얻는 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법으로 수행되며, 예를 들어 배양이 끝난 균주를 젖은 상태 혹은 마른 상태에서 파쇄하고 유기용매로 추출하면 저순도(1~10%)의 균주 추출액을 얻어낼 수 있다. 세포를 파쇄하는 방법은 산 혹은 염기를 사용하여 고온에서 파쇄하는 방법(미국특허 제 4,447,362호, 미국특허 제 4,220,719호, 미국특허 제6,762,037호), 계면활성제를 사용하여 파쇄하는 방법(일본특허 제 60094092호), 유기 용매를 사용하여 파쇄하는 방법(미국특허 제 4,070,244호, 일본특허 제 57063094호) 또는 기계적으로 파쇄하는 방법(미국특허 제 2004/0209368 A1호) 등이 있다. 상기 추출액에는 목적하는 화합물인 조효소 Q10, 친수성 세포 부산물, 및 친수성 및 친지질성 화학적 부산물이 포함되어있다.

균주를 배양하여 얻은 발효 추출물로부터 상기와 같은 조효소 Q10을 분리 및 정제하는 방법은 일반적으로 먼저, 균주에서 추출된 발효 생성물인 조효소 Q10에 포함되어있는 불순물을 제거한 후, 마지막으로 불순물이 제거된 조효소 Q10을 크로마토그래피법 단독으로 혹은 재결정법과 병행한 정제법으로 고순도화 하는 방법으로 이루어진다.

불순물을 제거하는 방법에 있어서, 균주 추출액의 대부분을 구성하는 물질인 세포 부산물은 친수성 물질로 구성되어 있는데, 세포 벽의 구성 물질인 당 단백질과 인지질에서 유래된 화학적 부산물 등이 주요 구성 물질이다. 이러한 부산물은 주로 염기를 사용한 비누화 반응을 통해 수용성 물질로 변환시켜 제거가 가능하다고 알려져 있다. Ko Aida의 특허에서는, 조효소 Q10 균주 추출액을 메탄올 수용액 상에서 염화나트륨(NaOH) 및 피로가롤(Pyrogaloll)을 첨가하여 85^oC에서 비누화시키고 석유에테르(pretrolum ether)로 추출하여 조효소 Q10 추출용액을 얻어내었다(미국특허 제 4,220,719호, Biochemistry. 1963, 2, 196). 베타 케로텐 발효 후, 균주 추출액의 비누화 반응도 소개되어있으나(미국특허 제7,015,014 B2호), 조효소 Q10은 녹는점이 낮고, 수용액 상에서의 결정성도 좋지 않아 카로텐의 예를 적용할 수 없다. 즉, 반응 후 물을 첨가할 때, 결정이 생성되지 않으므로, 반응용액을 다량의 유기 용매로 추출하여야 하며, 이 때 비누화 되지 않은 세포 부산물이 석유 에테르 층으로 같이 추출이 되었고, 이를 컬럼 크로마토그래피법으로 추가로 분리 정제한 후 재결정하여 고순도의 조효소 Q10을 얻어야 한다. 그러나 상기 방법을 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 균주로 조효소 Q10을 발효 배양 한 후, 균주로부터 유기용매를 사용하여 추출한 추출액에서 친수성 세포 부산물을 제거 하기 위해 수행하는 경우, 비누화 반응 후의 수용액에서부터 조효소 Q10화합물을 추출하기 위해서는 과량의 유기용매가 필요하였으며, 추출 시 에멀젼이 심하게 생겨 층 분리가 어려운 단점이 있어 실용적이지 않다.

균주 추출액에서 세포의 화학적 부산물 및 부가 화합물인 스테롤을 침전법을 통해서 제거하는 예도 소개되어 있다(일본특허 제57063094호). 발효 배양이 끝난 슈도모나스 캡슈레이트(Psuedomonas casulate) 균주의 수분을 제거한 상태에서 에탄올을 첨가하여, 40^oC에서 1시간 동안 추출하여 균주 추출용액을 얻고, 이 용액을 15^oC에서 25시간 동안 정치하면, 세포의 부산물과 스테롤이 침전으로 가라 앉는다. 필터를 사용하여 침전물을 제거한 후 에탄올 재결정화를 통해 고순도 조효소 Q10을 얻는다. 그러나, 상기 방법을 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 균주에 적용하는 경우, 생성되는 침전물의 점도가 높아 필터를 통한 분리가 용이하지 않으며, 필터 용액을 재결정하더라도, 용액 중에 잔존하는 과량의 세포 부산물이 함께 혼합된 조효소 Q10 침전이 생성되어, 대량 생산에 사용하기에는 실용적이지 못하는 문제점이 있다.

상기 언급된 대부분의 특허 및 논문에서는 균주 추출 용액에서부터 비누화 혹은 침전화 방법 등의 사전 정제과정을 거쳐 순도가 낮은 조효소 Q10 혼합 화합물을 보다 순도가 높은 혼합물로 일차 정제한 후에 크로마토그래피법을 적용하여, 추가로 순도를 높이는 정제방법을 취하고 있다(미국특허 제 4,447,362호, 미국특허 제 4,220,719호, Biochemistry. 1963, 2, 196). 또는, 조효소 Q10이 함유된 균주 추출용액의 컬럼 크로마토그래피 정제법만을 보고한 특허도 있다.

그러나, 상기 보고된 특허 및 문헌들에 의한 조효소 Q10의 정제법은, 균주 배양액으로부터 고순도 조효소 Q10을 얻을 수 있는 방법들이기는 하나, 일부는 매우 소량의 조효소 Q10을 정제하여 분석고자 하는 목적으로 사용되어 대량생산에 적합한 예가 되기 힘들며(미국특허 제 4,447,362호, 미국특허 제 4,220,719호, Biochemistry. 1963, 2, 196), 일부는 대량 생산에 적합하기는 하나, 컬럼 크로마토그래피 정제법 적용 전까지 최소 한 단계 이상의 정제단계를 추가로 거쳐서 조효소 Q10혼합물을 비교적 고순도(70%)로 정제해야 하는 번거로움이 있다(일본특허 제62-240643). 또한, 효율적 분리를 위해서는 용매의 유량은 상대적으로 적은 1mL/min(미국특허 제5,547,589호) 내지 10.8ml/min(일본특허 제62-240643호)을 사용하여야 하며, 크로마토그래피법을 적용 시, 컬럼 크로마토그래피 정제법이 수행되는 동안 컬럼 분류액마다 생성물의 분석이 수반되어야함에 따라 비교적 분리시간이 오래 걸리고 과정이 번거로우며, 과량의 용매를 사용해야 하는 단점이 있다.

따라서, 조효소 Q10의 발효 배양액을 별도의 부가적인 단계 없이 고수율, 고순도로, 보다 신속하게 정제하여 대량 생산을 가능케 하는 실용적인 조효소 Q10의 정제방법의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명에서 균주 배양액으로부터 유기용매로 추출한 추출용액을 별도의 부가적인 화학적 사전 처리 없이 사용하되, 상업용 실리카젤을 수지로 사용하여 추출액을 구성하는 화합물들을 적절한 극성을 가진 용매 및 용리액의 선택에 따라 흡착 및 탈착 과정을 거치면서 높은 순도의 조효소 Q10을 신속하고 용이하게 부리 및 정제하는 방법을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 실리카젤을 수지로 사용하여 조효소 Q10을 포함한 모든 균주 추출액을 흡착시킨 후, 용매를 변경하여 선택적으로 탈착시켜 원하는 화합물을 분리 회수하여, 조효소 Q10의 발효 배양액을 고수율, 고순도로 정제하여 대량 생산을 가능케 하는 실용적인 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법을 제공한다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 조효소 Q10 생산성 미생물 균주 배양액으로부터 유기용매로 추출한 조효소 Q10이 함유 추출액을 얻고, 이를 비극성 용매에 용해 하고 실리카젤 수지가 채워져 있는 컬럼에 통과시켜 상기 추출액 중의 조효소 Q10 성분 및 부산물을 실리카젤에 흡착시키고, 상기 컬럼에 비극성 용매를 통과시켜 비극성 부산물을 선택적으로 탈착하여 제거 한 후, 최종적으로 원하는 화합물인 조효소 Q10을 용리액을 통과시켜 선택적으로 회수하여 높은 순도의 조효소 Q10을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서 조효소 Q10 생산성 미생물 균주는 제한되지 않으나, 바람직하게는 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter spheroids)를 균주로 하여 조효소 Q10의 발효 배양을 실시하며, 상기 균주로부터 조효소 Q10을 추출하는 방법은 당업자에게 알려진 통상적인 방법을 통해 수행한다. 조효소 Q10을 포함하는 발효 배양액으로부터 조효소 Q10을 추출하는 방법은 예를 들면, 다음과 같이 수행된다. 즉, 발효가 끝난 배양액을 고속 회전 원심분리기를 통해 탈수 처리하여 젖은 상태(wet cell)의 균주를 얻고, 이 균주를 따듯한 아세톤과 같은 유기용매로 추출하고 감압 증발하여, 조효소 Q10, 세포 부산물 및 발효과정에서 생성된 화학적 부산물이 포함된 추출액을 얻는다. 상기 추출액에 n-헥산을 가하여 물 층과 분리시킨 후 감압 증발하여 점도가 높은 균주 추출액을 얻는다.

이렇게 얻은 최종 추출액을 질량분석, HPLC 분석 및 화학적 시험법을 통해 분 석해 보면, 추출액의 구성성분은 조효소 Q10 함량이 약 10중량%로서 분자량이 700~1000 정도에 해당하고 친수성 성질을 가지며, 고분자 물질로서 세포 부산물 50중량%, 및 분자량이 800~810에 해당하며 친지질성 성질을 가지고, UV 비활성인 발효 부산물 40중량%로 이루어져 있다.

본 발명에서는, 상기의 순도 10% 미만의 조효소 Q10 추출액을 별도의 부가적인 사전처리 없이 사용하여 n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 시클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 등의 탄화수소류 비극성 용매로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 비극성 용매, 바람직하게는 n-헥산에, 용해시키며, 다만 회수를 고려하여 단일 용매의 사용이 바람직하다. 상기 용해된 추출액을 수지에 부하하여 흡착시키며, 바람직하게는 상업화되어 시중에서 쉽게 구할 수 있는 실리카젤 (Merck, Silicagel 60, 0.063~0.2mm) 수지가 채워져 있는 컬럼 관에 부하하여 용액 중의 조효소 Q10, 친지질성 및 친수성 부산물들을 흡착시킨다.

친지질성 부산물을 탈착시키기 위한 비극성 용매는 n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 시클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 등의 탄화수소류 비극성 용매로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 비극성 용매가 사용될 수 있으며, 바람직하게는n-헥산 용액을 사용한다. 다만 회수를 고려하는 경우 단일 용매의 사용이 경제적이므로 바람직하게는 단일의 용매를 사용한다.

컬럼 부피의 약 3 내지 5 배에 해당하는 양의 상기 비극성 용매를 30~40 mL/min의 속도로 흘려주어 분자량 800~810에 해당하는 친 지질성 발효부산물을 선택적으로 분리한다. n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 시클로헥산 등의 탄화수소류 용매에서는 상기 부산물만 선택적으로 탈착되는 선택성을 보여주며, 특히 n-헥산 용매는 실리카젤에 흡착된 화합물 중 분자량 800~810에 해당하고 UV 비활성인 비극성 발효 화학물질을 선택적으로 탈착시키는 선택성을 보여준다. 그러나, 그 외의 알코올 용매류, 카르보닐기를 포함한 용매류, 에테르 용매류, 할로겐화 용매류, 디N,N'-메틸 포름아미드, 디메틸술폭시드 등의 화합물에서는 조효소 Q10 또는 친수성 세포 부산물이 함께 탈착되어 선택성이 나타나지 않는다.

상기에서 비극성 용매로 흡착시킬 때와 분리할 때 각각 다른 비극성 용매가 사용될 수 있으나, 이 경우 추후 회수 및 재사용의 경제성을 고려하여, 실리카젤에 흡착시킬 때 사용될 수 있는 비극성 용매와 비극성 발효 부산물을 분리할 때 사용될 수 있는 비극성 용매는 동일한 종류의 용매가 사용되는 것이 바람직하다.

그 후 조효소 Q10을 회수하기 위해 일정한 극성을 가진 용리액을 수지 컬럼에 통과시키며, 이때 조효소 Q10을 선택적으로 탈착시키기 위해서 사용되는 용리액은 석유 에테르, 디에틸 에테르 및 이소프로필 에테르 등의 에테르 용매류로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 1 종 이상을 단독으로 사용할 수 있으나 상기 극성 용매를 단독으로 사용하는 경우에는 CoQ10의 선택적 탈착 효율이 떨어지므로, 상기 용매에 n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 시클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 등의 탄화수소류 비극성 용매로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 비극성 용매가 0~50 부피% 포함된 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기의 일정한 극성을 가진 용리액으로 클로로포름, 디클로로메탄 등의 할로겐화 용매류, 메틸이소부틸케톤, 디메틸아세톤, 에틸 아세테이트 등의 케톤기를 포함한 용매류로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 1 종 이상의 용매 0~50 부피% 및 n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 시클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 등의 탄화수소류 비극성 용매로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 비극성 용매 50~100 부피%로 이루어진 혼합 용매를 사용할 수 있다. 에틸 아세테이트만을 용리액으로 사용하는 경우 수율은 낮지 않을 수 있으나, 순도가 낮아서 추후 실시하는 재결정 과정이 순조롭지 않게 되어 바람직하지 않다.

즉, 상기의 용리액은 n-헥산 및 에틸 아세테이트가 90:10 내지 97:3비율로 혼합되는 범위에서 나타나는 일정한 극성을 포함하도록 하며, 적절한 극성의 범위를 획득하기 위해 탄화수소류 비극성 용매를 적절히 혼합하여 혼합 용매로서 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 용리액 중 석유 에테르, 디에틸 에테르 및 이소프로필 에테르 등의 에테르 용매류, 클로로포름, 디클로로메탄 등의 할로겐화 용매류, 메틸이소부틸 케톤, 디메틸아세톤, 에틸 아세테이트 등의 케톤기를 포함한 용매류로 구성된 그룹으로부터 선택된 2 종 이상이 혼합된 용매와 비극성 용매를 혼합하여 적절한 극성을 가진 용매를 제조하는 경우, 조효소 Q10의 선택적 탈착은 가능하나, 회수하여 재 사용 시 비효율적이므로 상기 용매 중 단일의 용매와 비극성 용매를 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

바람직하게, 용리액은 n-헥산 및 에틸 아세테이트를 혼합한 혼합 용매를 사용하며, 이 경우 혼합되는 용매의 비는 n-헥산 80~99 부피% 및 에틸 아세테이트 20~1 부피%로 하며, 이 경우 수율은 낮지 않지만 순도가 다소 낮게 되어 추후 실시하는 재결정 과정이 순조롭지 않게 되므로, 바람직하게는 n-헥산을 85~99 부피%로 하며, 더욱 바람직하게는 n-헥산 90~97 부피% 및 에틸 아세테이트 10~3 부피%로 한다. 상기에서, 에틸 아세테이트가 10부피% 이상의 비율을 갖는 혼합 용매를 탈착 용매로 사용하였을 경우, 분자량 700~1000에 해당하고 친수성 성질을 갖는 세포 부산물이 소량 같이 탈착되어 분리 회수한 조효소 Q10의 순도가 감소되는 결과를 보였으며, 3 부피% 이하의 혼합비율에서는 조효소 Q10의 선택적 회수가 이루어지지만, 탈착 시간 및 사용되는 용매의 양이 증가하였다. 그러나, 사용될 수 있는 혼합용매는 이에 한정되지 않으며, 선택적인 조효소 Q10의 회수에는 n-헥산:에틸 아세테이트 혼합 용매의 비가 90:10 내지 97:3정도에 해당하는 혼합 용매와 유사한 극성을 지니는 어떠한 단일의 용매 또는 다른 혼합 용매가 용리액으로서 제한 없이 사용될 수 있다.

상기의 용리액을 조효소 Q10의 노란색 용액이 더 이상 나오지 않을 때까지 30~40 mL/min 유량으로 컬럼에 계속해서 흘려주며 조효소 Q10을 선택적으로 회수한다. 상기 회수한 조효소 Q10용액을 감압 농축하면, 수율 약 95% 이상, 순도 약 84% 이상의 조효소 Q10을 얻을 수 있다.

또한, 상기에서 회수한 조효소 Q10을 1g당 500 mL의 에탄올에 녹이고, 5 ^OC에서 12시간 방치하는 방법으로 3회 재결정하면 약 98% 이상의 순도를 갖는 조효소 Q10을 약 95%의 수율로 얻을 수 있다.

선택적으로 본 발명에서 사용된 실리카젤 수지를 재사용할 수 있으며, 이를 위해 조효소 Q10을 회수한 후 실리카젤 수지에 흡착되어 잔존하는 친수성 세포 부산물을 탈착용 극성 용매를 흘려주어 분리시키고, 사용된 실리카젤 수지의 용매를 치환시킨 후 재사용한다. 실리카젤 수지의 재사용을 위해 흡착된 친수성 세포 부산물을 탈착하는 탈착용 극성 용매로 사용될 수 있는 용매로서 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 알코올 용매류, 에틸 아세테이트, 아세톤 등의 카르보닐기를 포함한 용매류, 디에틸 에테르, 석유 에테르 등의 에테르 용매류, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 등의 할로겐화 용매류, 디N,N'-메틸 포름아미드, 디메틸술폭시드 등의 용매 등이 있으며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 알코올 용매류가 다른 용매류 등과 비교하여, 탈착 효율이 좋으며, 회수가 간편하였으며, 더 바람직하게는 메탄올이 사용될 수 있다. 상기 극성 용매는 2종 이상 혼합하여 사용이 가능 하지만, 바람직하게는 단일의 용매를 사용하는 것이 회수 및 재사용 시 경제적이다.

본 발명에서, 화합물의 선택적 흡착 및 탈착 시 사용된 용매는 유량에 따라 분리 효율이 크게 상이하지 않았으며, 따라서 높은 유량의 범위를 이용한 신속한 정제를 가능케 한다. 즉, 유량의 범위는 특히 제한되지 않으나, 바람직하게는 6 mL/min내지 40 mL/min의 유량으로 한다. 상세하게는, n-헥산을 탈착 용매로 하여 분자량 800~810에 해당하고 UV 비활성인 비극성 발효 화학물질을 선택적으로 탈착시키는 과정에서, 상기 용매는 6 mL/min내지 40 mL/min유량 범위에서 모두 선택적 탈착 과정에 유용하였다. 또한, n-헥산 및 에틸 아세테이트 혼합 용매를 용리액으로 사용하여 조효소 Q10을 선택적으로 탈착하는 과정에서, 유량의 범위 6 mL/min내지 40 mL/min의 모든 범위에서 선택성을 훼손하지 않는다. 나아가, 메탄올을 분자량 700~1000에 해당하고 친수성 성질을 갖는 세포 부산물의 탈착 용매로 사용하는 경우, 유량의 범위 6 mL/min내지 40 mL/min에서 모두 탈착 과정에 유용하였다.

이하 실시 예를 통하여 본 발명을 구체적으로 살펴보며, 다만 이는 단지 바람직한 구현 예로서 하기의 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.

<비교예 1>

고속 원심분리기를 통해 수분을 제거한 100g의 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 균주에 400g의 아세톤을 넣고 50 ^oC에서 2시간 30분 동안 교반한다. 반응 혼합액을 필터하고 얻은 반응용액을 감압 증류한 후, 여기에 메탄올 206g, 60% 수산화나트륨 51g, 피로가롤(pyrogaloll) 10.6g을 넣고 85 ^oC에서 1시간 동안 교반한다. 반응이 끝나면, 상온에 방치하여 온도를 내리고 반응용액에 증류수 400g을 첨가한다. 반응 수용액을 석유 에테르 1L씩을 사용하여 3회 추출한다. 유기층을 모아 무수 Na₂SO₄로 말린 후, 필터하고, 감압 증류하여 수율 70%, 순도 60%의 조효소 Q10 혼합물을 얻었다.

<비교예 2>

고속 원심분리기를 통해 수분이 제거된 100g의 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 균주에 400g의 에탄올을 넣고 40 ^oC에서 2시간 30분 동안 교반한다. 반응 혼합액을 필터 하여 얻은 에탄올 용액을 15^oC 냉각조에 24 시간 동안 방치한다. 녹색의 침전이 가라앉은 에탄올 용액을 필터 하여 침전을 걸러낸다. 침전이 제거된 에탄올 용액을 감압 증류하여 점성이 있는 조효소 Q10 혼합물을 수율 92%, 순도 23%의 순도로 얻었다.

<실시예 1>

고속 원심분리기를 통해 수분을 제거한 3,140g의 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 균주에 12.56Kg의 아세톤을 넣고 50 ^oC에서 2시간 30분 동안 교반한다. 반응 혼합액을 필터하여 얻은 아세톤 용액을 감압 증류한 후 남은 균주 추출용액에 250mL의 n-헥산을 넣고 3회 추출한다. 유기 용매층을 모아 무수 Na₂SO₄로 말린 후 필터한다. 직경이 600mm인 빈 컬럼에 실리카젤(Merck, Silicagel 60, 0.063~0.2mm) 200g을 채우고, 500 mL의 헥산을 사용하여 적신다. 실리카젤을 적시기 위해 사용한 n-헥산은 따로 모아 놓는다. 상기에서 얻은 750 mL의 조효소 Q10 혼합 n-헥산 용액을 실리카젤 수지 컬럼에 부하하고, 40mL/min의 유량으로 압축공기를 이용하여 통과시킨다. 추가로 180mL의 n-헥산 용매를 이용하여 같은 유량으로 두 번 통과시킨다. 계속해서, n-헥산-에틸 아세테이트가 97:3의 비율로 혼합된 탈착 용매를 사용하여 같은 유량으로 실리카젤 수지 컬럼을 통과시킨다. 노란색 용액이 흘러나오기 시작하면, 혼합용액을 모으기 시작하여, 무색의 용매가 흘러나올 때 중지한다. 모아진 조효소 Q10 혼합용액 약 1L를 감압 증류하여 95%의 수율과 84%의 순도를 갖는 조효소 Q10을 얻었다. 이렇게 얻은 조효소 Q10을 소량의 에탄올로 5^oC에서 재결정하여 95%의 수율로 98%이상의 순도를 갖는 고순도 조효소 Q10을 얻었다.

고동색을 띈 실리카젤 수지 컬럼에 색이 없어질 때까지 메탄올을 같은 유량으 로 계속 통과시킨 후, 다시 180 mL의 n-헥산 용액을 2~3회 통과시킨 후 수지를 재 사용 한다.

<실시예 2>

실시예 1에서 사용한 방법과 동일한 방법을 사용하되, 흡착 및 탈착 용매의 유량을 20 mL/min으로 하여 실시하여, 동등한 결과를 얻었다.

<실시예 3>

실시예 1에서 사용한 방법과 동일한 방법을 사용하되, 흡착 및 탈착 용매의 유량을 10 mL/min으로 하여 실시하여, 동등한 결과를 얻었다.

<실시예 4>

실시예 1에서 사용한 방법과 동일한 방법을 사용하되, 조효소 Q10 탈착용 용매로 n-헥산:에틸 아세테이트가 부피 비로 80:20인 혼합용매를 사용하여 본바, 96%의 수율과 65%의 순도를 갖는 조효소 Q10을 얻었다.

<실시예 5>

실시예 1에서 사용한 방법과 동일한 방법을 사용하되, 조효소 Q10 탈착용 용매로 에틸 아세테이트 용매를 사용하여 본바, 96%의 수율과 43%의 순도를 갖는 조효소 Q10을 얻었다.

<실시예 6>

실시예 1에서 사용한 방법과 동일한 방법을 사용하되, 조효소 Q10 탈착용 용매로 석유 에테르를 용매를 사용하여 본바, 95%의 수율과 56%의 순도를 갖는 조효소 Q10을 얻었다.

<실시예 7>

실시예 1에서 사용한 방법과 동일한 방법을 사용하되, 5회 재생된 실리카젤 컬럼을 사용하여 분리를 수행하여본 바, 실시예 1과 동등한 결과를 얻었다.

본 발명에서는, 발효 배양을 통해 생성된 조효소 Q10을 분리 및 정제하는 방법에 있어서, 통상적인 유기용매를 사용한 추출법을 통해 얻을 수 있는 저순도의 조효소 Q10 추출용액을 부가적인 화학처리 없이 실리카젤 수지에 흡착시키고, 용매의 선택을 통한 선택적 흡착 및 탈착 과정을 수행케 함으로써, 바로 재결정이 가능한 정도의 순도를 갖는 조효소 Q10으로 분리 정제를 수행할 수 있다. 이때, 흡착 및 탈착 용매를 30~40 mL/min 유량으로 하면 단시간에 고속으로 흡착 및 탈착을 수행하여 고순도의 조효소 Q10으로 대량의 분리 및 정제를 가능하게 한다.

Claims (11)

1. 조효소 Q10 생산성 미생물 균주 배양액으로부터 유기용매로 추출한 조효소 Q10 함유 추출액을 얻는 단계;

   상기 추출액을 비극성 용매에 용해하고, 이를 실리카젤 수지가 채워져 있는 컬럼에 통과시켜 상기 추출액 중의 조효소 Q10 성분 및 부산물을 실리카젤에 흡착시키는 단계;

   상기 컬럼에 비극성 용매를 통과시켜 비극성 부산물을 탈착시키는 단계; 및

   상기 컬럼에 용리액을 통과시켜 조효소 Q10을 회수하는 단계;

   를 포함하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법.
2. 제 1항에 있어서, 비극성 용매는 n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 시클로헥산, 벤젠 및 톨루엔으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법.
3. 제 1항에 있어서, 추출액을 비극성 용매에 용해하는 단계 및 비극성 부산물을 탈착시키는 단계에 사용되는 비극성 용매는 동일한 것을 특징으로 하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법.
4. 제 1항에 있어서, 용리액은 석유 에테르, 디에틸 에테르 및 이소프로필 에테르로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이거나, 또는 상기 용매에 n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 시클로헥산, 벤젠 및 톨루엔으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 용매가 최대 50 부피% 더 포함된 것을 특징으로 하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법.
5. 제 1항에 있어서, 용리액은 클로로포름, 디클로로메탄, 메틸이소부틸케톤, 디메틸아세톤 및 에틸 아세테이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 용매 0~50 부피% 및 n-펜탄, n-헥산, n-헵탄, 시클로헥산, 벤젠 및 톨루엔으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 용매 100~50 부피%로 이루어진 것을 특징으로 하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법.
6. 제 5항에 있어서, 용리액은 에틸 아세테이트 10~3 부피% 및 n-헥산 90~97 부피%로 구성되는 것을 특징으로 하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법
7. 제 1항에 있어서, 회수한 조효소 Q10을 에탄올로 재결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법.
8. 제 1항에 있어서, 실리카젤 컬럼의 재사용을 위해 극성 용매를 컬럼에 통과시켜 실리카젤 컬럼에 잔존하는 친수성 부산물을 탈착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법.
9. 제 8항에 있어서, 극성 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 아세테이트, 아세톤, 디에틸 에테르, 석유 에테르, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 디N,N'-메틸 포름아미드 및 디메틸술폭시드로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 1종 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법.
10. 제 1항에 있어서, 균주는 로도박터 스페로이데스(Rhodobacter sphaeroides)인 것을 특징으로 하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법.
11. 제 1항에 있어서, 흡착, 탈착 및 회수 단계에서 사용된 용매의 유량은 6 mL/min 내지 40 mL/min인 것을 특징으로 하는 조효소 Q10의 분리 및 정제 방법.