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KR20080042843A - 치료제의 점막 전달 향상을 위한 밀착 연접 조절 펩티드성분 - Google Patents

치료제의 점막 전달 향상을 위한 밀착 연접 조절 펩티드성분 Download PDF

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KR20080042843A
KR20080042843A KR1020087004636A KR20087004636A KR20080042843A KR 20080042843 A KR20080042843 A KR 20080042843A KR 1020087004636 A KR1020087004636 A KR 1020087004636A KR 20087004636 A KR20087004636 A KR 20087004636A KR 20080042843 A KR20080042843 A KR 20080042843A
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KR
South Korea
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peptide
compound
active agent
formulation
permeability
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Application number
KR1020087004636A
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English (en)
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스티븐 씨. 퀴
슈-치흐 첸. 퀴
쿠니우안 쿠이
안토니 피. 씨레노
폴 히치콕 존슨
마이클 이. 휴스톤
헨리 알. 코스탄티노
마이클 브이. 템플린
나집 람할지
Original Assignee
나스텍 파마수티컬 컴퍼니 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

활성제의 점막 상피 수송을 위한 순서를 포함하는 화합물들 및 구성요소들이 개시된다. 밀착 연접 조절 펩티드 성분들이 수송 및 전달에서의 이용을 위해 설명된다. 투과성은 가역성과 함께 향상될 수 있다. 향상된 전달을 위한 화합물들 및 성분들은 펩티드 또는 단백질 변이체들, 접합체들, 또는 다른 유사체 유형들 및 구조들일 수 있다.
밀착 연접 조절 펩티드, 점막 전달, 활성제, 투과성, 생체 이용도

Description

치료제의 점막 전달 향상을 위한 밀착 연접 조절 펩티드 성분{TIGHT JUNCTION MODULATING PEPTIDE COMPONENTS FOR ENHANCING MUCOSAL DELIVERY OF THERAPEUTIC AGENTS}
피검자에게 치료제 약물의 안전하고 효과적인 전달을 보장하는 것이 임의의 질병이나 상태의 처리에 기본적인 관심사이다. 기존의 치료제 전달 경로는 정맥 주사 및 경구 투여를 포함한다. 그러나, 이러한 전달 방법은 단점이 있어서 대체적인 전달 시스템이 요구된다.
주사에 의한 약물 투여의 중요한 단점은 약물 투여를 위해 훈련된 요원을 종종 필요로 한다는 것이다. 또한, 훈련된 요원은 주사로 약물을 투여시에 위험한 상황에 처할 수 있다. 자가-투여 약물에 대하여, 많은 환자들은 정기적으로 스스로에게 마지못해 주사를 가하거나 주사를 가할 수 없다. 또한 주사는 감염의 위험이 높은 것과 관련되어 있다. 약물 주사의 다른 단점은 약물 작용의 예측 불가능한 강도 및 지속뿐만 아니라 전달 결과가 개인간에 다를 수 있음을 포함한다.
단점이 있음에도, 주사는 많은 중요한 치료 화합물에 대하여 유일하게 입증된 전달 방식으로 남아있다. 여기에는 펩티드 및 단백질 생체치료제들의 급속히 팽창하는 목록뿐만 아니라 종래의 약물들도 포함한다. 예를 들어, 경구, 비강 및 다른 점막 경로와 같은 대체(alternate) 투여 경로를 통한 이러한 화합물들의 전달은 바람직하지만, 낮은 생체 이용도(bioavailability)를 제공할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 및 단백질 치료 화합물과 같은 거대분자(macromolecular) 종에 대해, 대체 투여 경로는 비활성화되기 쉬운 특성(susceptibility to inactivation) 및 점막 장벽을 가로지르는 흡수가 낮은 것으로 인하여 제한될 수 있다.
몇몇 치료제들의 경구 투여는 간의 최초 통과(first-pass) 대사 및/또는 위장관에서의 분해로 인한 극히 낮은 생체 이용도 및 작용에서의 상당한 시간 지체를 보인다.
치료제 화합물의 점막 투여는 예를 들어, 순응 문제(compliance problems) 및 부작용을 감소시키거나 제거하는 것뿐만 아니라 편리성 및 전달 속도의 측면에서 주사 및 다른 투여 방식보다 일정한 장점들을 제공한다. 그러나, 생물학적 활성제의 점막 전달은 점막 장벽 기능 및 다른 요인들에 의해 제한된다.
상피 세포는 점막 장벽을 구성하고 외부 환경과 점막 및 점막하(submucosal) 조직 및 세포외 구획(extracellular compartments) 사이의 중요한 계면(interface)을 제공한다. 점막 상피 세포의 가장 중요한 기능들 중 하나는 점막 투과성을 측정하고 조절하는 것이다. 이런 맥락에서, 상피 세포는 다른 생리적 구획들 사이에 선택적 투과성 장벽들을 발생시킨다. 선택적 투과성은 세포질을 통한 분자들의 조절된 전달(세포횡단 경로(transcellular pathway)) 및 세포간 공간의 조절된 투과성(세포주위 경로(paracellular pathway))의 결과이다.
상피세포 사이의 세포간 연접은 상피 장벽 기능의 유지 및 조절의 양쪽 모두와 세포-세포 부착(cell-cell adhesion)에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 상 피 및 내피 세포의 밀착 연접(tight junction: TJ)은 세포주위 경로의 투과성을 조절하는 세포-세포 연접에 특히 중요하며 또한 세포 표면을 첨부 및 기저측부(apical and basolateral) 구획으로 나눈다. 밀착 연접은 상피 세포간의 연속적인 주위 세포간 접촉(circumferential intercellular contact)을 형성하고 물, 용질 및 면역 세포의 세포주위 이동에 조절된 장벽을 발생시킨다. 또한 첨부 및 기저측부 막 영역 사이에 막 지질의 교환을 제한함으로써 세포 극성에 기여하는 제2 유형의 장벽을 제공한다.
세포 연접은 세포주위 경로를 통한 용질의 확산에 반하는 제1 장벽을 발생시키는 세포간 봉합(intercellular seal)을 생성하고 세포 극성을 생성하고 유지하는 첨부 및 기저측부 원형질막 영역 사이의 경계로서 각각 작용함으로써 상피 세포의 장벽 및 울타리(fence) 기능에 직접 관련되어 있는 것으로 여겨진다. 밀착 연접은 또한 염증을 앓고 있는 사이트에 백혈구를 이르게 하는 유출(transmigration)에 관련되어 있다. 화학-유인물질(chemo-attractants)에 반응하여, 백혈구는 내피를 가로질러 혈액으로부터 배출되고, 점막 감염의 경우, 염증을 앓고 있는 상피를 가로지른다. 유출은 주로 세포주위 경로를 따라 발생하고 밀착 연접의 개폐를 통해 고도로 배위되고(coordinated) 가역적인 방식으로 조절되는 것으로 보인다.
내재성 및 표재성(integral and peripheral) 원형질막 단백질 양쪽 모두를 포함하는 수많은 단백질들이 밀착 연접과 관련된 것으로 확인되었다. 이러한 단백질들의 복합 구조 및 상호간 작용(interactive functions)의 현상태의 이해는 한정되어 있다. 상피 접합과 관련된 많은 단백질들 중에, 상피 연접의 생리학적 조절에 작용할 수 있는 몇 가지 범주의 경-상피막 단백질들(trans-epithelial membrane proteins)이 확인되었다. 여기에는 수많은 "접합 부착 분자들"("junctional adhesion molecules": JAMs) 및 오클루딘(occludins), 클라우딘(claudins) 및 조눌린(zonulins)으로 명명된 다른 TJ-관련 분자들을 포함한다.
JAMs, 오클루딘, 및 클라우딘은 세포주위 공간으로 연장되고, 이러한 단백질들이 특히 상피 세포층을 통해 인접 상피 세포와 채널들 사이의 상피 장벽을 발생시키는 후보군으로서 고려되어 왔다. 일 모델에서, 오클루딘, 클라우딘 및 JAM은 상피 세포들 사이의 물, 용질 및 면역 세포들의 세포주위 이동에 조절된 장벽을 발생시키는 친동종 결합(homophilic binding) 파트너로서 상호작용하는 것으로 제안되었다.
약물 전달의 맥락에서, 약물이 전달 향상제에 의해 보조받지 않고 점막 표면의 상피 세포층을 투과하는 능력은 분자 크기, 지질 용해도 및 이온화를 포함하는 수 많은 인자들에 관련되어 있는 것 같다. 일반적으로, 약 300 내지 1,000 달톤 미만의 작은 분자들은 종종 점막 장벽을 투과할 수 있지만, 분자 크기가 증가함에 따라, 투과성은 급속히 감소한다. 이런 이유들로 인하여, 점막 약물 투여는 일반적으로 주사에 의한 투여보다 더 많은 양의 약물을 필요로 한다. 고유의 낮은 투과성에 더하여, 큰 거대분자 약물은 종종 점막 사이트에서 루미날(lumenal) 및 세포 효소 분해 및 급속한 소실(rapid clearance)뿐만 아니라 제한된 확산을 받기 쉽다. 따라서, 이러한 큰 분자들을 치료학적으로 효과적인 양으로 전달하기 위해서, 이러한 점막 표면을 가로질러 전달하여 이들이 목표 조직상에 급속히 작용할 수 있는 시스 템적인 순환이 일어나도록 보조하는 데 세포 투과 향상제들이 필요하다.
점막 조직들은 거대분자들의 자유로운 확산에 실질적인 장벽을 제공하는 반면에, 점막 분비에 존재하는 효소 활동은 치료학적 작용체(therapeutic agents), 특히 펩티드 및 단백질의 생체 이용도를 심각하게 제한할 수 있다. 비강 점막과 같은 일정한 점막 사이트들에서, 전달되는 단백질 및 다른 거대 분자종들의 일반적인 체류시간(residence time)은 급속한 점액섬모성 소실(mucociliary clearance)로 인하여 예컨대 약 15 - 30 분 이하로 제한된다.
중앙 신경계에서와 같이 목표 조직 및 생리학적 구획을 포함하는 향상된 점막 전달을 제공하는 치료학적 화합물들의 약학적 제형 및 투여 방법에 대한 업계의 장기간의 충족되지 않은 요구가 있어 왔다.
좀더 특정하게는, 포유류 피검자에게서 질병 및 다른 해로운 상태의 처리를 위한 치료학적 화합물들의 점막 전달을 위한 안전하고 신뢰할 만한 방법 및 조성물에 대한 업계의 요구가 있다.
신속히 작용하고, 쉽게 투여되며, 점막 자극 또는 조직 손상과 같은 해로운 부작용을 제한적으로 가지는 거대분자 약물을 치료학적 양으로 하나 이상의 점막 경로를 통하여 효과적으로 전달을 제공하는 방법 및 조성물에 대한 관련된 요구가 존재한다.
점막 상피 장벽 메커니즘을 극복할 생체치료학적 화합물의 점막 전달을 향상시킬 방법 및 조성물에 대한 업계의 요구도 존재한다. 이제까지 점막 상피 세포의 선택적 투과는 생물학적 활성 펩티드 및 단백질들을 포함하는 치료학적 거대분자들 의 점막 전달에 중대한 장애가 되어왔다. 따라서, 생체치료학적 화합물의 점막 전달을 용이하게 하는 새로운 방법 및 도구에 대한 업계의 충족되지 않은 요구가 여전히 남아있다. 특히, 이제까지 점막 장벽을 가로지르는 전달에 무반응이 증명된 생체치료학적 화합물의 점막 전달을 용이하게 하는 새로운 방법 및 제형에 대한 업계의 요구가 있다.
본 발명은 앞선 요구들을 만족하고 포유류 피검자에게 생물학적 활성제의 점막 전달을 향상시킬 새롭게 발견된 밀착 연접-개방 펩티드들의 신규한 이용을 포함하는 신규한 약학적 조성물을 제공함으로써 추가적인 목적과 장점들을 충족한다.
본 발명의 일 태양은 생물학적 활성제 및 포유류 피검자에게 생물학적 활성제의 점막 상피 수송을 가역적으로 향상시키는 밀착 연접 조절 펩티드(TJMP)의 점막 전달-향상 유효량을 포함하는 약학적 제형이다.
바람직하게는, 밀착 연접 조절 성분은 2 내지 500 개의 아미노산 잔기들, 또는 2 내지 100 개의 아미노산 잔기들, 또는 2 내지 50 개의 아미노산 잔기들로 구성된 펩티드 또는 단백질 부분을 함유한다. 상기 밀착 연접 조절 펩티드 또는 단백질은 모노머 또는 예를 들어, 다이머 같은 올리고머일 수 있다.
상기 밀착 연접 조절 펩티드는 관련 업계의 당업자에게 알려진 기술과 일치하는 재조합 또는 화학적 합성 수단에 의해 생산될 수 있다.
상피 밀착 연접의 기능 변조가 가능한 펩티드들은 이전에 설명되었다(Johnson, P.H. and S.C. Quay, Expert . Opin . Drug Deliv . 2:281-98, 2000). 특히, 신규한 밀착 연접 조절(TJM) 펩티드, PN159는 조직 장벽을 가로질러 경상피 전기 저항(TER)을 감소시키고 세포독성이 낮으며 높은 세포 생존 보유도(retetion of cell viability)를 갖는 3,000 달톤 분자량의 덱스트란의 세포주위 수송을 증가시키는 것을 보였다.
본 발명의 바람직한 일 실시예들에서, 상기 밀착 연접 조절 펩티드(TJMP)는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된다:
NH2-KLALKLALKALKAALKLA-amide
NH2-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-amide
NH2-LLETLLKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHRR-amide
NH2-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-amide
NH2-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-amide
NH2-RQIKIWFQNRRMKWKK-amide
NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide
NH2-KLWSAWPSLWSSLWKP-amide
NH2-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-amide
Maleimide-GLGSLLKKAGKKLKQPKSKRKV-amide
NH2-KETWWETWWTEWSQPGRKKRRQRRRRPPQ-amide.
본 발명의 다른 바람직한 실시예들에서, 상기 TJMP는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된다:
CNGRCGGKKKLKLLLKLL
LRKLRKRLLRLRKLRKRLLR.
일 태양에서, 본 발명은 점막 전달이 밀착 연접 조절 펩티드의 존재에 의해 용이하게 되고 펩티드가 수용성 고분자와 접합되어 있는 경점막(transmucosal) 전달에 적합한 치료학적 작은 분자들, 펩티드 및 단백질들의 제형들을 설명한다. 바람직하게는, 상기 수용성 고분자는 알파-치환된 폴리알킬렌 옥사이드 유도체들(alpha-substituted polyalkylene oxide derivatives), 알킬-캡드 폴리에틸렌 옥사이드류(alkyl-capped polyethylene oxides), 비스-폴리에틸렌 옥사이드류(bis-polyethylene oxides), 폴리(락틱-코-글리콜리드)(poly(lactic- co-glycolide)) 및 그 유도체들과 같은 폴리(오르소에스테르류)(poly(orthoesters)), 폴리에틸렌 글리콜 동종중합체들(polyethylene glycol (PEG) homopolymers) 및 그 유도체들, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체들(polypropylene glycol homopolymers) 및 그 유도체들, 폴리(알킬렌 옥사이드류)의 공중합체들(copolymers of poly(alkylene oxides)), 및 폴리알킬렌 옥사이드류의 블럭 공중합체들(block copolymers of poly(alkylene oxides)) 또는 그 활성 유도체들로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 폴리알킬렌 옥사이드는 약 200 내지 약 50,000의 분자량을 가진다. 더 바람직하게는, 상기 폴리알킬렌 옥사이드는 약 200 내지 약 20,000의 분자량을 가진다. 특히 바람직한 폴리알킬렌 옥사드류는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 옥사이드이다.
상기 TJMP는 하나 이상의 수용성 사슬에 접합될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서 상기 폴리(알킬렌 옥사이드) 사슬은 약 0.2 내지 약 200 킬로달톤(kiloDaltons: kDa) 사이의 분자 크기를 가질 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬이다.
상기 수용성 고분자는 스페이서(spacer)를 통해 밀착 연접 조절 펩티드에 접합될 수 있다. 이러한 연결은 가역적일 수 있다. 상기 수용성 고분자는 선형이거나 측쇄형(branched)일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 펩티드는 단일 폴리(알킬렌 옥사이드) 사슬에 공유적으로 연결된다. 관련된 일 실시예에서, 상기 폴리(알킬렌 옥사이드)는 2.00 미만 또는 1.20 미만의 다분산도(polydispersity) 값(Mw/Mn)을 가진다. 상기 폴리(알킬렌 옥사이드) 사슬은 측쇄형이거나 비측쇄형일 수 있다.
폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 PEG의 유도체들과 같은 수용성 고분자들과의 접합(conjugation)은 단백질의 반감기(half life), 특히 주사 투여형(injected dosage form)에 대해 단백질의 반감기를 향상시키는 전략으로 사용되어 왔다(Caliceti, P. and F.M. Veronese, Adv. DrugDeliv. Rev. 55:1261-77, 2003). PEG와 같은 고분자들을 가진 펩티드 및 단백질들의 조절로 얻는 다른 잠재적인 이점들은 화학적(Diwan, M. and T.G. Park, Int . J. Pharm. 252:111-22, 2003) 및 생화학적 안정화(Na, D.H., et al., J. Pharm . Sci . 93:256-61, 2004) 및 면역원성의 약화(attenuation of immunogenicity)(Yang, Z., et al., Cancer Res. 64:6673-78, 2004)를 포함한다.
단백질에 접합된 PEG의 이용에 대한 대부분의 예들은 PEG 사슬이 상기 설명된 효과를 주기 위하여 충분한 길이의 분자량을 가지는 곳에서이다. 특히, 적어도 하나의 20 킬로달톤 분자량의 PEG가 필요하다는 것이 설명되었다. 예를 들어, Holtsberg et al. (Holtsberg, F.W., et al., J. Control Rel. 80:259-71, 2002)은 PEG가 20 kDa 이상일 때, PEG에 접합된 아르기닌 디이미나제(arginine deiminase)에 대하여, 쥐에게 정맥내에 투여하면 상기 제형의 약동학적(pharmacokinetic and pharmacodynamic) 특성에서 증가가 있었다는 것을 보였다. PEG 분자량이 20 킬로달톤 미만일 때, 효과가 거의 없었다. 다른 예에서, 펩티드 살몬 칼시토닌에 단일-페질화반응(mono-PEGylation)은 생쥐에서의 비강내 생체 이용도의 증가를 가져오며, PEG 분자량에 반비례 증가하는 향상을 보였다(Lee, K. C., Calcif . Tissue Int . 73:545-9, 2003, and Shin, B. S., et al., Chem . Pharm . Bull. (Tokyo) 52:957-60, 2004), 여기에 그대로 참조로 포함되었다.
몇몇 바람직한 폴리(알킬렌 옥사이드류)는 알파-치환된 폴리(알킬렌 옥사이드) 유도체들, 폴리(예틸렌 글리콜)(PEG) 동종중합체들 및 그 유도체들, 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG) 동종중합체들 및 그 유도체들, 폴리(에틸렌 옥사이드류)(PEO) 고분자들 및 그 유도체들, 비스-폴리(에틸렌 옥사이드류) 및 그 유도체들, 폴리(알킬렌 옥사이드류)의 공중합체들, 및 폴리(알킬렌 옥사이드류)의 블럭 공중합체들, 폴리(락티드-코-클리콜리드) 및 그 유도체들, 또는 그 활성 유도체들로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 상기 수용성 고분자는 약 200 내지 약 40000 달톤의 분자량을 가질 수 있으며, 바람직하게는 약 200 내지 약 20000 달톤, 또는 약 200 내지 10000 달톤, 또는 약 200 내지 5000 달톤의 분자량을 가질 수 있다.
상기 밀착 연접 조절 펩티드 및 PGE 또는 다른 수용성 고분자 사이의 접합은 단백질가수분해, 효소 작용 또는 일반적으로 가수분해를 포함한 생리학적 공정들에 내성이 있을 수 있다. 또한, 접합은 프로 드러그(pro-drug) 접근법과 같은 생분해 공정들에 의해 쪼개질 수 있다. 바람직하게는, 분자는 비측쇄형 이든 측쇄형이든 단일 폴리(알킬렌 옥사이드) 사슬에 공유적으로 연결된다. 접합 수단은 예를 들어, U.S. 특허 번호 5,595,732; U.S. 특허 번호 5,766,897; U.S. 특허 번호 5,985,265; U.S. 특허 번호 6,528,485; U.S. 특허 번호 6,586,398; U.S. 특허 번호 6,869,932; 및 U.S. 특허 번호 6,706,289호와 같이 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 다른 태양에서, 상기 TJMP는 점막 조직 장벽을 가로질러 전기 저항을 감소시킨다. 바람직한 일 실시예에서, 전기 저항의 감소는 투과 향상제를 적용하기 전의 전기 저항의 적어도 80 %이다. 관련된 일 실시예에서, 상기 TJMP는 점막 조직 장벽을 가로지르는 분자의 투과성을 바람직하게는 적어도 2 배 증가시킨다. 다른 실시예에서, 상기 증가된 투과성은 세포주위성(paracellular)이다. 다른 실시예에서, 상기 증가된 투과성은 밀착 연접의 조절로부터 발생한다. 또 다른 일 실시예에서, 상기 증가된 투과성은 세포횡단성, 또는 세포횡단- 및 세포주위성의 결합이다.
본 발명의 다른 태양에서, 조직막은 상피 세포층으로 구성되어 있다. 바람직한 일 실시예에서, 상피 세포는 기관, 기관지, 폐포, 비강, 폐, 위장관, 표피 또는 구강, 바람직하게는 비강으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 태양에서, 활성제는 펩티드 또는 단백질이다. 상기 펩티드 또는 단백질은 2 내지 1000 개 사이의 아미노산을 가질 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 펩티드 또는 단백질은 2 내지 50 개 사이의 아미노산으로 구성되어 있다. 다른 실시예에서, 상기 펩티드 또는 단백질은 고리형이다. 다른 실시예에서, 상기 펩티드 또는 단백질은 물리적 또는 화학적 결합을 통해 다이머 또는 고-차원 올리고머들을 형성한다.
바람직한 일 실시예에서, 상기 펩티드 또는 단백질은 GLP-1, PYY3 -36, PTH1 -34 및 Exendin-4를 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시예에서, 생물학적 활성제는 바람직하게는 베타-인터페론, 알파-인터페론, 인슐린, 적혈구생성소, G-CSF, 및 GM-CSF, 성장 호르몬 및 이것들의 임의의 유사체들로 구성된 그룹으로부터 선택된 단백질이다.
본 발명에 따른 투과가능한 펩티드들(permeabilizing peptides)은 서열 WEAALAEALAEALAEHLASQPKSKRKV(서열번호 57)을 가지는 PN159를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 동물에게 분자를 투여하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은 상기 제형중 어느 하나를 제조하고, 그 제형을 동물의 점막 표면에 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양태는, 상기 제형중 어느 하나를 포함하는 투여 형태에 관한 것으로, 이러한 투여 형태는 액체, 바람직하게는 방울 형태이다. 또 다르게는, 투여 형태는 또한 고체일 수도 있는데, 투여되기 전에 액상화하거나, 분말 형태로 투여되거나, 또는 캡슐, 정제 또는 겔(gel) 형태로 투여될 수도 있다.
본 발명의 또다른 양태는 포유동물에서 생물학적 물질의 점막 상피 전달을 가역적으로 향상시키는 분자에 관한 것으로, 이러한 분자는 밀착 연접 조절 펩티드(TJMP), TJMP 유사체, TJMP 또는 TJMP 유사체의 접합체, 또는 이들의 복합체를 포함한다.
본 발명의 투과가능한 펩티드들은 NH2-KLALKLALKALKAALKLA-amide 서열을 가지는 PN159를 포함한다. 여기에 개시된 바와 같이, PN159의 유사체들, PN159의 그러한 유사체들, 및 임의의 유도체들, 변이체들, 단편들, 모방체들, 또는 융합분자들(fusion molecules)의 결합들이 본 발명에 포함된다.
투과화제(permeabilizing agent)는 일반적으로 피검자의 점막 상피 표면에서 상피 밀착 연접 구조 및/또는 생리를 조절하여 점막 상피 세포주위 수송을 가역적으로 향상시킨다. 이러한 효과는 일반적으로 인접한 상피 세포들의 상피막 부착 단백질들 사이에 동형 또는 이형 접합의 투과화제에 의한 억제를 포함한다. 동형 또는 이형 접합의 이러한 차단을 위한 목표 단백질들은 다양한 관련 연접 부착 단백질들(JAMs), 오클루딘 또는 클라우딘으로부터 선택될 수 있다.
상피 세포 생물학
쥐 연접 부착 단백질-1(JAM-1)을 엔코딩하는 cDNA는 클론되고 약 32-킬로달톤의 분자량을 지닌 예상형 I 막 관통 단백질(predicted type I transmembrane protein)(단일한 막 관통 영역을 포함)에 해당한다(Williams, et al., Molecular Immunology 36:1175-1188, 1999; Gupta, et al., IUBMB Life 50:51-56, 2000; Ozake, et al., J. Immunol . 163:553-557, 1999; Martin-Padura, et al., J. Cell . Biol. 142:117-127, 1998). 상기 분자의 세포외 세그먼트는 아미노 터미널 "VH-형" 및 카복시-터미널 "C2-형" 카복시-터미널 β-샌드위치 폴드로 설명되는 2개의 Ig-like 영역을 포함한다(Bazzoni et al., Microcirculation 8:143-152, 2001). 쥐 JAM-1은 또한 N-당부가에 대한 2가지 사이트 및 세포질 영역을 포함한다. 상기 JAM-1 단백질은 면역글로불린(Ig) 상과(superfamily)의 멤버이며 상피 및 내피 세포 양쪽 모두의 밀착 연접에 한정된다. 초미세 구조 연구는 JAM-1이 오클루딘 및 클라우딘의 원섬유를 포함하는 막 부위에 한정된다는 것을 보인다.
"혈관 내피 접합-관련 분자(vascular endothelial junction-associated molecule: VE-JAM)"로 명명된 다른 JAM 과 멤버는 두 개의 세포외 면역글로불린-유사 영역들, 막관통 영역, 및 상대적으로 짧은 세포질 꼬리를 포함한다. VE-JAM은 상피 세포들의 세포간 경계에 주로 한정된다(Palmeri, et al., J. Biol . Chem . 275:19139-19145, 2000). VE-JAM은 세정맥의 상피 세포들에 의해 고도로 표현되며, 다른 혈관의 내피에 의하여도 표현된다. 다른 보고된 JAM 과 멤버인, JAM-3은 JAM-2와 JAM-1에 각각 36 % 및 32 % 동일성을 드러내는 예상된 아미노산 서열을 가진다. JAM-3은 신장, 뇌, 및 태반에 명백한 더 높은 수준을 지닌 조직 표현을 광범위하게 보인다. 세포 수준에서, JAM-3 전사는 내피 세포 내에서 표현된다. JAM-3과 JAM-2는 접합 파트너들인 것으로 보고되었다. 특히, 상기 JAM-3 엑토도메인(ectodomain)은 보고에 의하면 JAM2-Fc에 접합한다. JAM-3 단백질은 활성화 이후에 주변 혈액 림프구(peripheral blood lymphocyte) 상에 상향 조절된다(up-regulated)(Pia Arrate, et al., J. Biol. Chem. 276:45826-45832, 2001).
상피세포 밀착 연접 조절에 관련된 다른 제안된 막관통 부착 단백질은 오클루딘이다. 오클루딘은 네 개의 막관통 영역들, 두 개의 세포외 루프들, 및 큰 C-터미널 시토졸 영역(cytosolic domain)으로 구성된 약 65-킬로달톤 II 형 막관통 단백질이다(Furuse, et all., J. Cell . Biol . 123:1777-1788(1993); Furuse, et all., J. Cell . Biol . 127:1617-1626, 1994). 면역-급속 동결 전자 현미경으로 관찰시에, 오클루딘은 밀착 연접 원섬유 내에서 직접적으로 농축된다(Fujimoto, J. Cell . Sci . 108:3443-3449, 1995).
밀착 연접의 두 개의 추가적인 내재성 단백질인 클라우딘-1과 클라우딘-2sms 닭의 간으로부터 연접-농축된(enriched) 막들의 직접적인 생화학적 분별법에 의해 식별되었다(Furuse, et al., J. Cell. Biol. 141:1359-1550, 1998). 클라우딘-1과 클라우딘-2는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide) 젤 전기영동 상에 넓은 약 22-킬로달톤 젤 밴드로서 오클루딘과 함께 공동 정제(copurify)하는 것을 보였다. 쥐 cDNA 라이브러리로부터 클론된 두 개의 밀접하게 관련된 단백질들의 추론된 서열들로 네 개의 막 횡단 나선들, 두 개의 짧은 세포외 루프들, 및 짧은 세포질 N- 및 C-터미널을 예측한다. 오클루딘의 형상과 비슷한 형상들에도 불구하고, 형상들은 서열 상동성을 공유하지 않는다. 이어서, 여섯 개의 다른 클라우딘 유전자 산물들(클라우딘-3 내지 클라우딘-8)이 클론되었으며 이뮤노골드 급속 동결 라벨링(Morita, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96:511-516, 1999). 오클루딘의 부재시에 장벽이 남아있음이 주어지면, 클라우딘-1 내지 클라우딘-8은 세포외 공간의 제1 실-형성 원소들에 대한 후보로 여겨진다.
상피세포 연접에 한정되는 다른 세포질 단백질들은 조눌린(zonulin), 심플레킨(symplekin), 신굴린(cingulin), 및 7H6를 포함한다. 보고에 따르면 조눌린은 오클루딘의 세포질 꼬리를 접합하는 세포질 단백질이다. 단백질들의 이러한 과의 표현은 "ZO-1, ZO-2, 및 ZO-3"이다. 조눌린은 비브리오 콜레라 유도된 조눌라 오클루덴스 톡신(zonula occludens toxin: ZOT)의 인간 단백질 유사체인 것으로 가정된다.
조눌린은 조직 형태형성(morphogenesis), 유체 이동, 소장강(intestinal lumen)과 간질(interstitium) 사이의 거대분자들 및 백혈구(leukocyte), 및 염증성/자가면역성 질환을 포함한 발달성, 생리학적, 및 병리학적 과정들 도중에 밀착 연접 조절에 역할을 할 것 같다(see, e.g., Wang, et al., J. Cell . Sci . 113:4435-40, 2000; Fasano , et al ., Lancet 355:1518-9, 2000; Fasano, Ann . N. Y. Acad . Sci., 915:214-222, 2000). 밀착 연접이 개방되고 투과성이 증가되는 임상 상태인, 만성소화장애증(coeliac disease)의 급성기(acute phase) 동안에 조눌린 표현은 장 조직(intestinal tissue) 내에서 증가하였다. 조눌린은 비-인간 영장류 장 상피 생체외(in vitro)에서 밀착 연접 분해(disassembly) 및 장 투과성에서의 후속적인 증가를 유도한다.
활성 V. cholerae ZOT 단편과 인간 조눌린에서의 아미노산을 비교하여 두 개의 단백질들의 N-터미널 부위 내에서 추정적인(putative) 수용체 접합 영역을 식별하였다. 상기 ZOT 생물학적 활성 영역은 세포간 밀착 연접의 분해로 이어지는 세포내의 시그널링(intracellular signaling)의 후속적인 활성화를 지닌 포유류 세포 수용체와 상호작용하여 장 투과성을 증가시킨다. 상기 ZOT 생물학적 활성 영역은 단백질의 카르복실 터미널쪽으로 한정되며 V. cholerae에 의해 발생되는 예상된 분해산물과 일치한다. 이러한 영역은 추정적인 수용체-접합 모티프(motif)를 상기 ZOT 포유류 유사체인 조눌린과 공유하게 한다. 특정부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 실험들과 결합된 상기 ZOT 활성 단편과 조눌린 사이의 아미노산 비교는 아미노산 비교는 처리된 ZOT의 아미노 말단과 조눌린의 아미노 말단으로 향하는 옥타펩티드 수용체-접합 영역을 제안한다. (Di Pierro, et al., J. Biol. Chem. 276:19160-19165, 2001). ZO-1은 보고에 의하면 액틴, AF-6, ZO-관련 키나아제(ZAK), 포트린(fodrin), 및 α-카테닌(catenin)을 접합한다.
본 발명 내에서 이용을 위한 투과가능한 펩티드들은 천연 또는 합성, 치료학적 또는 예방적 활성 펩티드들(두 개 이상의 공유적으로 연결된 아미노산들로 구성됨), 단백질들, 펩티드 또는 단백질 단편들, 펩티드 또는 단백질 유사체들, 펩티드 또는 단백질 모방체들, 및 활성 펩티드들 또는 단백질들의 화학적으로 변형된 유도체들 또는 염들을 포함한다. 따라서, 여기에 사용된 "투과가능한 펩티드"라는 용어는 종종 이러한 활성종, 즉, 펩티드들 및 단백질들, 펩티드 및 단백질 단편들, 펩티드 및 단백질 유사체들, 펩티드 및 단백질 모방체들, 및 활성 펩티드들 또는 단백질들의 화학적으로 변형된 유도체들 및 염들을 포함하는 것으로 의도된다. 종종, 투과가능한 펩티드들 또는 단백질들은 자연적으로 발생하거나 천연(예컨대, 야생형, 자연적으로 발생하는 돌연변이체, 또는 알레익 변이체(alleic variant)) 펩티드 또는 단백질 서열 내에서 아미노산들의 부분 치환, 첨가 또는 결실에 의하여 용이하게 구할 수 있는 뮤테인들이다. 또한, 천연 펩티드들 또는 단백질들의 생물학적 활성 단편들은 포함된다. 그러한 돌연변이 유도체들 및 단편들은 실질적으로 천연 펩티드 또는 단백질들의 원하는 생물학적 활성을 유지한다. 탄수화물 사슬들을 지니는 펩티드들 또는 단백질들의 경우, 이러한 탄수화물 종들에서의 변화에 의해 표시되는 생물학적 활성 변이체들도 본 발명 내에 포함된다.
본 발명의 방법들 및 조성물들 내에 이용을 위한 투과가능한 펩티드들, 단백질들, 유사체들 및 모방체들은 종종 포유류 피검자의 상피 연접 구조 및/또는 생리를 조절하여 점막 상피 세포주위 수송을 가역적으로 향상시키는 투과가능한 펩티드, 단백질, 유사체 또는 모방체의 점막 전달-향상 또는 투과가능 유효량을 포함하는 약학적 조성물내에 제형된다.
생물학적 활성제( Biologically Active Agents )
본 발명의 방법들 및 조성물들은 포유류 피검자들의 치료학적, 예방적 또는 다른 원하는 생리학적 결과들을 이루기 위해 생물학적 활성제들의 광범한 스펙트럼의 생물학적 활성제들의 예컨대, 비강내와 같은 점막 전달의 향상에 지향되어 있다. 여기에 사용된 "생물학적 활성제"라는 용어는 여기 방법들 및 조성물들에 따라서 포유류 피검자에게 점막으로 투여시에 생리학적 반응을 일으키는 임의의 물질을 포함한다. 본 맥락의 유용한 생물학적 활성제들은 영양소, 보조인자, 효소(내생적 또는 이종의), 항산화제 및 유사물뿐만 아니라 임상 의학의 모든 중요 분야들에 적용되는 치료학적 또는 예방적 작용체를 포함한다. 따라서, 상기 생물학적 활성제는 수용성 또는 비수용성일 수 있으며, 더 큰 분자량의 단백질, 펩티드, 탄수화물, 당단백질, 지질, 및/또는 당지질, 뉴클레오시드, 폴리뉴클레오시드 및 다른 활성제들을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법들 및 조성물들 내의 유용한 약학적 작용체들은 저분자 약물, 펩티드, 단백질 및 백신제들을 포함한 광범한 스펙트럼의 화합물들을 포함하는 약물 및 거대분자의 치료학적 또는 예방적 작용체들을 포함한다.
본 발명 내에서 사용을 위한 대표적인 약학적 작용체들은 피검자에게서 선택된 질병 또는 상태의 처리 또는 예방을 위한 생물학적 활성이다. 이런 맥락에서의 생물학적 활성은 실제 환자, 세포 배양, 표본 검사, 또는 수용 가능한 동물 모델을 포함하는 적절한 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 검사 시스템에 의해 평가되는 피검자 질병 또는 상태와 관련된 생리학적 파라미터, 표지, 또는 임상 증상에 미치는 임의의 중요한(즉, 측정 가능한, 통계적으로 중요한) 효과로 결정될 수 있다.
본 발명의 방법들 및 조성물들은 포유류 피검자들에게 질병 및 다른 상태의 처리를 위한 예상치 않은 이점들을 제공하며, 그러한 이점들은 예를 들어, 치료적 및 예방적 화합물들의 점막 전달의 향상된 속도, 지속, 적합도 또는 조절을 제공하여 상기 피검자의 선택된 생리학적 구획들에 이르도록 조정된다(예컨대, 비점막 속 또는 횡단하여, 체순환 또는 중추 신경계 속으로, 또는 피검자 내의 임의의 선택된 목표 기관, 조직, 유체 또는 세포 또는 세포외 구획들로).
다양한 대표적인 실시예들에서, 본 발명의 방법들 및 조성물들은 하기로부터 선택된 하나 이상의 생물학적 활성제(들)을 포함할 수 있다:
몰핀, 하이드로몰폰(hydromorphone), 옥시몰폰(oxymorphone), 로보르파놀(lovorphanol), 레발로판(levallorphan), 코데인(codeine), 날메펜(nalmefene), 날로르핀(nalorphine), 날로존(nalozone), 날트렉손(naltrexone), 부프레노르핀(buprenorphine), 부토르파놀(butorphanol), 및 날부핀(nalbufine)과 같은 오피오드류(opiods) 또는 오피오드 길항제들(opiod antagonists);
코르티손(cortisone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 플루드로코르티손(fludrocortisone), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 트라이암시놀론(triamcinolone), 덱사메토아손(dexamethoasone), 베타메토아손(betamethoasone), 파라메토아손(paramethoasone), 및 플루오시놀론(fluocinolone)과 같은 코르티코스테론류(corticosterones);
콜히친(colchicine), 이부프로펜(ibuprofen), 인도메타신(indomethacin), 및 피록시캄(piroxicam)과 같은 다른 소염제(anti-inflammatories);
아시클로버(acyclovir), 리바바린(ribavarin), 트리플루오로시리딘(trifluorothyridine), Ara-A 아라비노퓨라노실아데닌(Arabinofuranosyladenine), 아실구아노신(acylguanosine), 노르데옥시구아노신(nordeoxyguanosine), 아지도티미딘(azidothymidine), 디데옥시아데노신(dideoxyadenosine), 및 디데옥시시티딘(dideoxycytidine)과 같은 항바이러스제(anti-viral agents);
스파이로놀락톤(spironolactone)과 같은 항안드로겐(antiandrogens); 테스토스테론과 같은 안드로겐; 에스트라디올(estradiol)과 같은 에스로겐; 프로제스틴(progestins); 파파베린(papaverine)과 같은 근이완제; 니트로글리세린(nitroglycerin), 혈관활성 장 펩티드(vasoactive intestinal peptide) 및 칼시토닌 관련 유전자 펩티드(calcitonin related gene peptide)와 같은 혈관확장제(vasodilators); 시프로헵타딘(cyproheptadine)과 같은 항히스타민제(antihistamines); 독세핀(doxepin), 이미프라민(imipramine), 및 시메티딘(cimetidine)과 같은 히스타민 수용체 사이트 차단 활성을 지닌 작용체(agents with histamine receptor site blocking activity); 덱스트로메토르판(dextromethorphan)과 같은 진해제(antitussives); 클로자릴(clozaril)과 같은 신경이완제(neuroleptics); 항부정맥제(antiarrhythmics); 항간질제(antiepileptics); 수퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase) 및 뉴로엔케팔리나제(neuroenkephalinase)와 같은 효소; 암포테리신 B(amphotericin B), 그리세오풀빈(griseofulvin), 미코나졸(miconazole), 케토코나졸(ketoconazole), 티오코나졸(tioconazol), 이트라코나졸(itraconazole), 및 플루코나졸(fluconazole)과 같은 항진균제(anti-fungal agents); 페니실린(penicillins), 세팔로스포린(cephalosporins), 테트라사이클린(tetracyclines), 아미노글루코시드(aminoglucosides), 에리스로마이신(erythromicin), 겐타마이신(gentamicins), 폴리믹신 B(polymyxin B)와 같은 항균제(antibacterials); 5-플루오로우라실(5-fhiorouracil), 블레오마이신(bleomycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 히드록시우레아(hydroxyurea), 디데옥시이노신(dideoxyinosine), 플록수리딘(floxuridine), 6-메르캅토퓨린(6-mercaptopurine), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), I-다루비신(I-darubicin), 택솔(taxol) 및 파클리탁셀(paclitaxel)과 같은 항암제(anti-cancer agents); 토코페롤(tocopherols), 레티노이드(retinoids), 카로테노이드(carotenoids), 유비퀴논(ubiquinones), 금속 착염(metal chelators), 및 피트산(phytic acid)과 같은 항산화제(antioxidants); 퀴니딘(quinidine)과 같은 항부정맥제(antiarrhythmic agents); 그리고 프라조신(prazosin), 베라파밀(verapamil), 니페디핀(nifedipine), 및 딜티아젬(diltiazem)과 같은 항고혈압제(antihypertensive agents); 아세트아미노펜 및 아스피린과 같은 진통제(analgesics); 인간화된 항체 및 항체 단편들을 포함하는 모노클로날 및 폴리클로날 항체들; 안티-센스 올리고뉴클레오티드; 및
치료학적 펩티드류 및 단백질류를 엔코딩하는 유전자들을 포함하는 RNA, DNA 및 바이러스성 벡터들.
이러한 대표적인 활성제들에 더하여, 본 발명의 방법들 및 조성물들은 상기 또는 여기 어딘가에 설명되거나 업계에 알려진 다중 활성제들의 임의의 조합뿐만 아니라 포유류 피검자에게 선택된 질병 또는 상태의 처리 또는 방지를 위한 본 발명의 방법들 및 조성물들 내에서 단독 또는 조합되어 효과가 있는 임의의 생리학적 활성제를 포함한다(Medical Economics Company, a division of Litton Industries, Inc가 발간한 Physicians' Desk Reference 참조).
사용된 화합물의 종류에 관계없이, 본 발명내에 사용을 위한 생물학적 활성제는 피검자에게 상당한, 수용할 수 없는 독성 또는 나쁜 부작용없이 원하는 생리학적 효과를 제공하는 데 충분한 양으로 본 발명의 조성물들 및 방법들 내에 존재할 것이다. 모든 생물학적 활성제들의 적절한 투여 수준은 당업자에 의한 과도한 실험을 하지 않고서도 용이하게 결정될 것이다. 본 발명의 방법들 및 조성물들은 생물학적 활성제(들)의 향상된 전달을 제공하기 때문에, 기존의 투여 수준보다 상당히 더 낮은 투여 수준이 성공적으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 활성 물질은 채용되는 특정한 물질에 의존하여 전체 비강내 제형의 중량비 약 0.01 % 내지 약 50 %, 종종 약 0.1 % 내지 약 20 % 사이, 및 흔히 약 1.0 % 내지 5 % 또는 10 % 사이의 양으로 상기 조성물 내에 존재할 것이다.
본원에서 사용된 생물학적 활성 "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어들은 다양한 크기의 폴리펩티드들을 포함하며 임의의 특정한 크기의 아미노산 폴리머들에 본 발명을 한정하지 않는다. 펩티드-펩티드, 단백질-단백질 융합(protein-protein fusions) 및 단백질-펩티드 융합뿐만 아니라 몇 개의 아미노산 정도의 길이만큼 적은 것에서부터 임의의 크기의 단백질에 이르기까지의 펩티드들은 상기 단백질 또는 펩티드가 특정한 생리학적, 면역학적, 치료적 또는 예방적 효과 또는 반응을 도출하는 맥락에서 생물학적으로 활성이기만 하면, 본 발명에 의해 포함된다.
본 발명은 생물학적으로 활성인 펩티드들 및 단백질들의 향상된 점막 전달을 위한 신규한 제형들 및 동등 투여(coordinate administration) 방법들을 제공한다. 본 발명 내에서 사용을 위한 치료적 펩티드들 및 단백질들의 실례들은 하기를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다: 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator: TPA), 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor: EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF) (FGF-산성 또는 염기성), 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor: PDGF), 전환 성장 인자(transforming growth factor: TGF) (TGF-알파 또는 베타), 혈관활성 장 펩티드, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF), 시상하부 유리 인자(hypothalamic releasing factors), 프로락틴(prolactin), 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone:TSH), 부신피질자극 호르몬(adrenocorticotropic hormone: ACTH), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone: PTH), 여포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone: FSH), 황체형성 호르몬 방출 호르몬(luteinizing hormone releasing hormone: LHRH), 엔돌핀(endorphins), 글루카곤(glucagon), 칼시토닌(calcitonin), 옥시토신(oxytocin), 카르베토신(carbetocin), 알도에테콘(aldoetecone), 엔카팔린(enkaphalins), 소마토스틴(somatostin), 소마토트로핀(somatotropin), 성장촉진제(somatomedin), 생식선자극호르몬(gonadotrophin), 에스트로겐, 프로게스테론(progesterone), 테스토스테론(testosterone), 알파-멜라닌세포 자극 호르몬(alpha-melanocyte stimulating hormone), 비-천연적 발생 오피오드류, 리도카인(lidocaine), 케토프로펜(ketoprofen), 수펜타이닐(sufentainil), 터부탈린(terbutaline), 드로페리돌(droperidol), 스코폴라민(scopolamine), 고나도렐린(gonadorelin), 시클로피록스(ciclopirox), 부스피론(buspirone), 칼시토닌, 크로몰린 나트륨 또는 미다졸람(cromolyn sodium or midazolam), 사이클로스포린(cyclosporin), 리시노프릴(lisinopril), 캅토프릴(captopril), 델라프릴(delapril), 시메티딘(cimetidine), 라니티딘(ranitidine), 파모티딘(famotidine), 수퍼옥시드 디스무타아제, 아스파라기나아제(asparaginase), 아르기나제(arginase), 아르기닌 데아미네아제(arginine deaminease), 아데노신 데아미나제 리보뉴클레아제(adenosine deaminase ribonuclease), 트립신(trypsin), 케모트립신(chemotrypsin), 및 파파인 (papain). 유용한 펩티드들의 다른 예들은 봄베신(bombesin), 물질 P(substance P), 바소프레신(vasopressin), 알파-글로불린(alpha-globulins), 트랜스페린(transferrin), 피브리노겐(fibrinogen), 베타-리포프로테인들(beta-lipoproteins), 베타-글로불린(beta-globulins), 프로트롬빈(prothrombin), 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 알파2-글리코프로테인(alpha2-glycoproteins), 알파2-글로불린들(alpha2-globulins), 페투인(fetuin), 알파1-리포 프로테인(alpha1-lipoproteins), 알파1-글로불린(alpha1-globulins), 알부민(albumin), 프레알부민(prealbumin), 그리고 다른 생체활성 단백질들 및 재조합 단백질 제품들을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
본 발명의 더 상세한 태양들에서, 현재 질병 또는 상태를 처리하기 위하여(즉, 현재 질병 또는 상태의 증세 발생 또는 심함을 제거하거나 경감시키기 위하여), 또는 피검자의 질병 또는 상태로 위험에 처한 것으로 판명된 피검자에게서 질병 또는 상태의 발병을 방지하기 위하여 특정한 생물학적 활성 펩티드 또는 단백질 치료제들의 점막 전달을 증가시킬 목적으로 방법들 및 조성물들이 제공된다.
본 발명의 이러한 태양들 내에서 유용한 생물학적 활성 펩티드들 및 단백질은 하기를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다: 조혈제(hematopoietics); 항감염제(antiinfective agents); 항치매제(antidementia agents); 항바이러스제(antiviral agents); 항종양제(antitumoral agents); 해열제(antipyretics); 진통제; 항염증제(antiinflammatory agents); 항궤양제(antiulcer agents); 항알레르기제(antiallergic agents); 항우울제(antidepressants); 향정신성제(psychotropic agents); 강심제(cardiotonics); 항부정맥제; 혈관확장제(vasodilators); 저혈압 이뇨제(hypotensive diuretics)와 같은 혈압강하제(antihypertensive agents); 항당뇨병제(antidiabetic agents); 항응고제(anticoagulants); 콜레스테롤 저하제(cholesterol lowering agents); 골다공증 치료제; 호르몬; 항생제; 백신; 및 그 유사체.
본 발명의 이러한 태양들 내에서 사용을 위한 생물학적 활성 펩티드들 및 단백질들은 하기를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다: 사이토카인(cytokines); 펩티드 호르몬; 성장 인자; 심혈관계 상에 작용하는 인자; 세포 접착 유착 인자(cell adhesion factors); 중추 및 말초 신경계 상에 작용하는 인자; 체액성 전해질(humoral electrolytes) 및 혈액 유기 물질(hemal organic substances) 상에 작용하는 인자; 뼈 및 골격 성장 또는 생리에 작용하는 인자; 위장계에 작용하는 인자; 신장 및 비뇨기에 작용하는 인자; 결합 조직 및 피부에 작용하는 인자; 감각기관에 작용하는 인자; 면역계에 작용하는 인자; 호흡계에 작용하는 인자; 생식기관에 작용하는 인자; 및 다양한 효소들.
예를 들어, 본 발명의 방법들 및 조성물들 내에서 투여될 수 있는 호르몬들은 안드로겐, 에스트로겐, 프로스타글란딘(prostaglandins), 소마토트로핀, 생식선자극호르몬, 인터루킨(interleukins), 스테로이드 및 사이토카인을 포함한다.
본 발명의 방법들 및 조성물들 내에서 투여될 수 있는 백신들은 간염, 인플루엔자, 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus: RSV), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus: PIV), 결핵, 카나리아 발진증(canary pox), 수두, 홍역, 유행성 이하선염(mumps), 풍진(rubella), 폐렴, 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)를 포함한다.
본 발명의 방법들 및 조성물들 내에서 투여될 수 있는 세균성 톡소이드(bacterial toxoids)는 디프테리아, 파상풍, 슈도노마스(pseudonomas) 및 결핵균(mycobactrium tuberculosis)을 포함한다.
본 발명과 함께 유용하게 투여되는 항체 시약들은 모노클로날 항체들, 폴리클로날 항체들, 인간화된 항체들, 항체 단편들, 융상 및 다합체들(fusions and multimers), 및 면역글로빈들을 포함한다.
본원에서 사용된 "보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"이라는 용어는 유사한 측쇄들을 가진 아미노산 잔기들의 일반적인 호환성(interchangeability)을 뜻한다. 예를 들어, 지방족 측쇄들을 가진 아미노산들의 보통 호환가능한 그룹은 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이며; 지방족-수산기(aliphatic-hydroxyl) 측쇄들을 가진 아미노산들의 그룹은 세린 및 트레오닌이다; 아미드-함유 측쇄들을 가진 아미노산들의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이며; 방향족 측쇄들을 가진 아미노산들의 그룹은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이며; 염기성 측쇄들을 가진 아미노산들의 그룹은 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이며; 그리고 황-함유 측쇄들을 가진 아미노산들의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 보존적 치환의 예들은 다른 것에 대한 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 비-극성(소수성) 잔기의 치환을 포함한다. 또한, 본 발명은 아르기닌 및 라이신 사이, 글루타민 및 아스파라긴 사이, 및 트레오닌 및 세린 사이와 같은 극성(친수성) 잔기의 치환을 고려한다. 또한, 다른 것에 대한 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기의 치환 또는 다른 것에 대한 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 산성 잔기의 치환도 고려된다. 대표적인 보존적 아미노산 치환 그룹들은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다.
생물학적 활성 펩티드 또는 단백질 유사체라는 용어는 20 개의 통상적인 아미노산들 또는 α,α-이중치환된 아미노산들, N-알킬 아미노산들, 젖산과 같은 비천연 아미노산들의 입체이성질체들(예컨대, D-아미노산들)을 포함하는 자연 펩티드 또는 단백질의 변형된 형태들을 더 포함한다. 이러한 것과 다른 비종래형(unconventional) 아미노산들은 또한 본 발명 내에서 유용한 천연 펩티드들 및 단백질들 내에 치환되거나 삽입될 수 있다. 비종래형 아미노산들의 예들은 하기를 포함한다: 4-히드록시프롤린(hydroxyproline), γ-카르복시글루타메이트(carboxyglutamate), ε- N,N,N-트리메틸라이신(trimethyllysine), ε-N-아세틸라이신(acetyllysine), O-포스포세린(phosphoserine), N-아세틸세린(acetylserine), N-포르밀메티오닌(formylmethionine), 3-메틸히스티딘(methylhistidine), 5-히드록시라이신(hydroxylysine), ω-N-메틸아르기닌(methylarginine), 및 다른 유사한 아미노산들 및 이미노산들(예컨대, 4-히드록시프롤린). 또한, 생물학적 활성 펩티드 또는 단백질 유사체들은 종속 펩티드 또는 단백질(subject peptide or protein)의 구조적 성분들로 천연적으로나 인공적으로 발생하거나 그러한 펩티드 또는 단백질에 결합되거나 관련된 탄수화물, 지질 및/단백성 성분들(moieties)의 단일 또는 다중 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다.
일 태양에서, 본 발명 내에 유용한 펩티드들(폴리펩티드들 포함)은 예를 들어 알킬, 저급 알킬(lower alkyl), 사이클릭 4-, 5-, 6-, 내지 7-멤버 알킬, 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 히드록시, 카르복시 및 그의 저급 에스테르 유도체들과 같은 다른 측쇄들을 지니거나 4-, 5-, 6-, 내지 7-멤버 헤테로사이클릭들(heterocyclics)을 지닌 상기 20 개의 유전적으로 엔코딩된 아미노산들(또는 D 아미노산들)의 하나 이상의 천연적으로 발생하는 측쇄들을 치환하여 펩티드 모방체들(mimetics)을 생성하도록 변형된다. 예를 들어, 프롤린 유사체들은 프롤린 잔기의 고리 크기가 5 멤버에서 4, 6, 또는 7 멤버들로 변화하도록 제작될 수 있다. 사이클릭 그룹들은 포화되거나 불포화될 수 있으며, 불포화된다면 방향족이거나 비-방향족일 수 있다. 헤테로사이클릭 그룹들은 하나 이상의 질소, 산소, 및/또는 황 헤테로원자들(heteroatoms)을 포함할 수 있다. 그러한 그룹들의 예들은 푸라자닐(furazanyl), 푸릴(furyl), 이미다졸리디닐(imidazolidinyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 이미다졸리닐(imidazolinyl), 이소티아졸릴(isothiazolyl), 이속사졸릴(isoxazolyl), 모르폴리닐(morpholinyl) (예컨대, 모르폴리노(morpholino)), 옥사졸릴(oxazolyl), 피페라지닐(piperazinyl) (예컨대, 1-피페라지닐(piperazinyl)), 피페리딜(piperidyl) (예컨대., 1-피페리딜, 피레리디노(piperidino)), 피라닐(pyranyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 피라졸리닐(pyrazolinyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피리다지닐(pyridazinyl), 피리딜(pyridyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl) (예컨대, 1-피롤리디닐), 피롤리닐(pyrrolinyl), 피롤릴(pyrrolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 티에닐(thienyl), 티오모르폴리닐(thiomorpholinyl)(예컨대, 티오모르폴리노(thiomorpholino)), 및 트리아졸릴(triazolyl)을 포함한다. 이러한 헤테로사이클릭 그룹들은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 일 그룹이 치환될 때, 상기 치환기는 알킬, 알콕시, 할로겐, 산소, 또는 치환되거나 치환되지 않은 페닐일 수 있다.
펩티드 및 단백질 유사체들 및 모방체들뿐만 아니라 펩티드들 및 단백질들은 또한 하나 이상의 다양한 비단백성 고분자들, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알켄류(polyoxyalkenes)에 미국 특허 번호 4,640,835; 미국 특허 번호 4,496,689; 미국 특허 번호 4,301,144; 미국 특허 번호 4,670,417; 미국 특허 번호 4,791,192; 또는 미국 특허 번호 4,179,337에 설명된 방식으로 공유적으로 접합될 수 있다.
본 발명 내에 다른 펩티드 및 단백질 유사체들 및 모방체들은 당부가 반형체들, 및 다른 화학적 성분들과 공유 또는 덩어리 접합체들을 포함한다. 공유 유도체들은 아미노산 측쇄들 내에서나 상기 N- 또는 C- 말단에서 발견되는 그룹들에 업계에 공지된 수단에 의하여 작용기들을 결합하여 제조될 수 있다. 이러한 유도체들은 제한 없이 카르복실 말단 또는 카르복실 측쇄들을 포함하는 잔기들의 지방족 에스테르 또는 아미드들, 하이드록실 그룹-함유 잔기들의 O-아실 유도체들, 및 예컨대 라이신 또는 아르기닌과 같은 아미노 말단 아미노산 또는 아미노-그룹 함유 잔기들의 N-아실 유도체들을 포함한다. 아실 그룹들은 C3 내지 C18 노말 알킬을 포함하여 알카노일 아로일(alkanoyl aroyl) 종들을 형성하는 알킬-성분들의 그룹으로부터 선택된다. 예컨대, 면역원성 성분들과 같은 운반체 단백질들에 공유적 부착도 채용될 수 있다.
이러한 변형들에 더하여, 예컨대, 펩티드의 합성 및 처리 도중에 펩티드의 당부가 패턴들을 조절하거나 더 많은 처리 단계들에서 생물학적 활성 펩티드들 및 단백질들의 당부가 변조(alterations)를 할 수 있다. 이러한 것을 달성하는 특히 바람직한 수단은 상기 펩티드를 그러한 처리를 보통 제공하는 세포들로부터 유도된 당부가 효소들 예컨대, 포유류 당부가 효소들에 노출시키는 것이다. 탈당 (deglycosylation) 효소들은 또한 본 발명 내에 유용한 변형된 펩티드들 및 단백질들을 생성하도록 성공적으로 채용될 수 있다. 포스포릴화된(phosphorylated) 아미노산 잔기들, 예컨대, 포스포티로신(phosphotyrosine), 포스포세린, 또는 포스포트레오닌(phosphothreonine), 또는 리보실 그룹들(ribosyl groups) 또는 교차-결합 시약들을 포함하는 다른 성분들을 포함하는 약간의 다른 변형들을 지닌 자연적인 1차 아미노산 서열의 버젼들(versions)도 포함된다.
모방펩티드들(peptidomimetics)은 또한 다른 성분들, 특히 포스페이트 그룹들과 유사한 분자 형태를 지닌 것들의 인산화, 술폰화, 바이오티닐레이션(biotinylation), 또는 첨가 또는 제거에 의해 화학적으로 변형된 아미노산 잔기들을 가질 수 있다.
본 발명 내에서 사용을 위한 활성 펩티드들을 사이클화할 수 있거나 펩티드의 말단에서 데스아미노(desamino) 또는 데스카르복시(descarboxy) 잔기를 포함하여 말단 아미노 또는 카르복실 그룹이 없이 프로테아제들에 감수성을 저하시키거나 펩티드의 컨포메이션(conformation)을 제한한다. 본 발명의 펩티드 유사체들 및 모방체들 사이의 C-터미널 작용기 그룹들은 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 히드록시, 및 카르복시, 및 그들의 저급 에스테르 유도체들, 및 그들의 약학적으로 수용가능한 염들을 포함한다.
단백질 안정성을 향상시키기 위해 물의 함량을 효과적으로 제어하는 다양한 첨가제, 희석제, 염기 및 전달 운반체들이 본 발명 내에 제공된다. 이러한 의미에서 항-응집제들로 예를 들어, 효과적인 이러한 시약들과 운반체 물질들은 함께 부착되거나 거기에 연결된 펩티드들 및 단백질들의 안정성을 상당히 향상시키고 고체-상태 응집을 감소시키는 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 디에틸아미노에틸 덱스트란, 및 카르복시메틸 셀룰로오스와 같은 다양한 작용기들의 고분자들을 포함한다. 몇가지 경우에, 단백질들의 활성 또는 물리적 안정성은 또한 펩티드 또는 단백질 약물들의 수용액에 다양한 첨가제들을 첨가하여 향상될 수 있다. 예를 들어, 폴리올들(설탕 포함), 아미노산들, 콜라겐 및 젤라틴과 같은 단백질들, 및 다양한 염들과 같은 첨가제들이 사용될 수 있다.
일정한 첨가제들, 특히 설탕류 및 다른 폴리올들은 또한 건조한, 예컨대, 동결건조된 단백질들에 상당한 물리적 안정성을 준다. 이러한 첨가제들은 동결건조 동안뿐만 아니라 건조 상태로 저장 중에도 단백지들을 응집되지 않게 보호하도록 본 발명 내에서 사용될 수 있다. 예를 들어 수크로오스(sucrose) 및 Ficoll 70(수크로오스 단위들을 지닌 고분자)은 다양한 조건들 하에서 고체-상태 항온 배양하는 동안 펩티드 또는 단백질 응집에 대항하여 충분한 보호를 보인다. 이러한 첨가제들은 또한 고분자 매트릭스 내부에 임베드된 고체 단백질의 안정성을 향상시킬 수 있다.
그러나 다른 첨가제들, 예를 들어 수크로오스는 본 발명의 일정한 서방성(sustatined-release) 제형들에서 발생할 수 있는 바와 같이, 높은 온도의 습한 대기 내에서 고체-상태 응집되지 않도록 단백질을 안정화시킨다. 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질들은 또한 이런 맥락의 불안정한 단백질들의 변성 및 응집을 감소시키도록 안정화제 또는 충진제(bulking agents)로 작용한다. 이러한 첨가제들은 본 발명 내의 고분자 용융 공정들 및 조성물들로 포함될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 미세입자들은 상기에 설명된 다양한 안정화 첨가제들을 함유하는 용액을 단순히 동결건조시키거나 스프레이 건조시켜 제조될 수 있다. 응집되지 않은 펩티드들 및 단백질들의 지속성 방출은 연장된 시간에 걸쳐 그렇게 확보될 수 있다.
특정한 제형 첨가제들뿐만 아니라 다양한 추가적인 제조 성분들 및 방법들이 응집-취약성(aggregation-prone) 펩티드들 및 단백질들의 점막 전달을 위한 제형들을 생성하는 다양한 제조 성분들 및 방법들이 여기에 제공되어, 상기 펩티드 또는 단백질은 실질적으로 순수한, 응집되지 않은 형태로 안정화된다. 구성성분들 및 첨가제들의 범위가 이러한 방법들 및 제형들 내에 사용하기 위해 고려된다. 이러한 항-응집 작용체들의 예는 폴리펩티드들의 소수성 측쇄들을 선택적으로 접합하는 사이클로덱스트린들의 결합된 다이머들이다. 이러한 사이클로덱스트린 다이머들은 응집을 상당히 억제하는 방식으로 단백질들의 소수성 패치들(hydrophobic patches)에 접합하는 것을 보여주었다. 이러한 억제는 사이클로덱스트린 다이머와 관련된 단백질 양쪽 모두에 대하여 선택적이다. 단백질 응집의 그러한 선택적 억제는 본 발명의 비강내 전달 방법들 및 제형들 내에서 추가적인 이점들을 제공한다. 이러한 맥락에서 사용을 위한 추가적인 작용체들은 펩티드들 및 단백질들의 응집을 특정하게 차단하는 링커들(linkers)에 의해 제어되는 다양한 기하학적 형태를 지닌 사이클로덱스트린 트리머들 및 테트라머들을 포함한다(Breslow et al., J Am . Chem . Soc . 118:11678-11681, 1996; Breslow et al., PNAS USA 94: 11156-11158, 1997).
전하 변경( charge modifying ) 및 pH 조절 작용체들 및 방법들
소수성 점막 막 장벽을 횡단한 향상된 전달을 위한 생물학적 활성제들(예컨대, 거대분자 약물들, 펩티드들 또는 단백질들)의 수송 특성을 개선하기 위하여, 본 발명은 또한 여기에 설명된 선택된 생물학적 활성제들 또는 전달-향상제들의 전하 변경을 위한 기술 및 시약들을 제공한다. 이런 점에서, 거대분자들의 상대적 투과성은 일반적으로 그들의 분배 계수들(partition coefficients)에 관련되어 있다. 분자의 pKa 및 점막 막 표면에서의 pH에 의존하는 분자들의 이온화도는 또한 분자들의 투과성에 영향을 미친다. 생물학적 활성제들 및 점막 전달을 위한 투과화제(permeabilizing agent)들의 투과 및 분배는 예를 들어, 전하된 작용기 그룹들의 변경, 활성제가 전달되는 전달 운반체 또는 용액의 pH 변화 또는 활성제와 전하- 또는 pH-변화 시약의 동등 투여에 의하여 달성되는 활성제 또는 투과화제의 전하 변화 또는 전하 퍼짐(charge spreading)에 의해 촉진될 수 있다.
보존제들
클로로부탄올, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산 나트륨(0.5 %), 페놀, 크레졸, p-클로로-m-크레졸, 페닐에틸 알콜, 벤질 알콜, 페닐수은 아세테이트(phenylmercuric acetate), 페닐수은 보레이트(phenylmercuric borate), 페닐수은 나이트레이트(phenylmercuric nitrate), 티메로살(thimerosal), 소르브산(sorbic acid), 벤제토니움 클로라이드(benzethonium chloride) 또는 벤질코늄 클로라이드(benzylkonium chloride)와 같은 보존제들이 본 발명의 제형들에 첨가되어 세균의 성장을 억제할 수 있다.
pH 및 완충 시스템들
시트르산 및 시트르산 나트륨과 같은 시트르산 염(들)로 구성된 시스템과 같은 완충제를 이용하여 pH가 일반적으로 조절된다. 다른 적절한 완충제 시스템들은 아세트산과 아세트산염 시스템, 숙신산 및 숙신산염 시스템, 말산 및 말산염 시스템, 및 글루콘산 및 글루콘산염 시스템을 포함한다. 또한, 아세트산 및 시트르산 나트륨 시스템, 시트르산, 아세트산 나트륨 시스템, 및 시트르산, 시트르산 나트륨, 벤조산 나트륨 시스템과 같은 혼합된 산/염 시스템들로 구성된 완충제 시스템들이 채용될 수 있다. 임의의 완충제 시스템에 대하여, 염산과 같은 다른 산들 및 수산화 나트륨과 같은 다른 염기들이 최종 pH 조절을 위해 첨가될 수 있다.
상피 연접 구조 및/또는 생리를 조절하는 다른 작용체들
상피 밀착 연접은 본 발명 내에서 제공된 바와 같이 실질적인 연접 개구를 자극하는 연접 생리학적 제어 작용체들로 처리되지 않으면 일반적으로 약 15 옹스트롬의 반경을 가진 분자들에는 투과되지 않는다. 본 발명의 방법들 및 조성물들 내의 제2 생리학적 변형을 위한 유용한 작용체들로 기능하는 "제2" 밀착 연접 조절 구성성분들 중에는, ZO1-ZO2 헤테로다이머릭(heterodimeric) 복합체는 점막 상피에서 세포주위 투과성을 용이하게 그리고 효과적으로 변경할 수 있는 외인성 작용체들에 의해 생리학적 조절에 순응하는 것을 보여주었다. 광범위하게 연구된 그러한 작용체에 대해 "조눌라 오클루덴스 톡신(zonula occludens toxin: ZOT)"으로 알려진 Vibrio cholerae로부터 나온 세균성 독소이다. 또한 WO 96/37196; 미국 특허 번호 5,945,510; 5,948,629; 5,912,323; 5,864,014; 5,827,534; 5,665,389; 및 5,908,825호를 참조하시오. 따라서, 상기 ZO1-ZO2 복합체를 조절하는 ZOT 및 다른 작용체들은 하나 이상의 생물학적 활성제들과 결합하여 제형되거나 동등하게 투여될 것이다.
제형 및 투여
본 발명의 점막 전달 제형들은 하나 이상의 약학적으로 수용가능한 운반체들 및, 선택적으로, 다른 치료적 성분들과 일반적으로 함께 투여되는 생물학적 활성제를 포함한다. 상기 운반체(들)은 제형의 다른 성분들과 융화될 수 있으며 피검자에게 수용할 수 없는 해로운 효과를 도출하지 않아야 한다는 의미에서 "약학적으로 수용가능할 수"있어야 한다. 그러한 운반체들은 상기에 설명되어 있거나 약리 업계의 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직하게, 상기 제형은 투여되는 생물학적 활성 작용체가 함께 융화될 수 없다고 알려져 있는 효소들 또는 산화제들을 포함해서는 안된다. 상기 제형들은 제약 업계에 잘 알려진 방법들 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물들 및 방법들은 경구, 직장, 질, 비강내, 폐내, 또는 경피성 전달에 의하거나 안구, 귀, 피부 또는 기타 점막 표면들에 국소적 전달에 의한 방법을 포함하는 다양한 점막 투여 방식들에 의해 피검자들에게 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물들은 종종 비강 또는 폐 스프레이와 같은 수용액으로 투여되고 당업자에게 알려진 다양한 방법들에 의해 스프레이의 형태로 분배될 수 있다. 비강 스프레이로 액체를 분배하는 바람직한 시스템들은 미국 특허 번호 4,511,069호에 개시되어 있다. 그러한 제형들은 본 발명에 따른 조성물들을 물에 용해시켜 수용액을 만들고 상기 용액을 멸균시켜 알맞게 제조할 수 있다. 상기 제형들은 예를 들어 미국 특허 번호 4,511,069호에 개시된 밀봉된 분배 시스템에서 처럼 다회-용량(multi-dose) 용기에 담아 놓을 수 있다. 다른 적당한 비강 스프레이 전달 시스템들은 Transdermal Systemic Medication, Y.W. Chien Ed., Elsevier Publishers, New York, 1985; 및 미국 특허 번호 4,778,810호에 기재되어 있다. 다른 에어로졸 전달 형태들은 예컨대, 물, 에탄올, 또는 그 혼합물과 같은 약학적 용매 내에 생물학적 활성제를 용해시키거나 현탁시킨 채 전달하는 예컨대, 압축 공기-, 제트-, 초음파-, 및 압전식 분무기들을 포함할 수 있다.
본 발명의 비강 및 폐 스프레이 용액들은 일반적으로 비이온성 계면활성제(예컨대, 폴리소르베이트-80), 및 하나 이상의 완충제들, 안정화제들 또는 긴장제들(tonicifiers)과 같은 표면 활성제로 선택적으로 제형된 약물 또는 전달되는 약물을 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시예들에서, 비강 스프레이 용액은 분사제를 더 포함한다. 상기 비강 스프레이 용액의 pH는 선택적으로 약 pH 3.0 및 7.2 사이에 있지만, 원한다면 상기 pH는 실질적으로 비이온화된 상태에서 대전된 거대분자 종들(예컨대, 치료적 단백질 또는 펩티드)의 전달을 최적화하도록 조정된다. 채용된 약학적 용매들은 또한 약산성 수용액 완충제(pH 3-6)일 수 있다. 본 조성물들 내에 사용을 위한 적당한 완충제들은 상기에 설명되거나 업계에 알려져 있다. 보존제들, 계면활성제들, 분산제들 또는 가스들을 포함하는 다른 구성요소들이 첨가되어 화학적 안정성을 향상시키거나 유지할 수 있다. 적당한 보존제들은 페놀, 메틸 파라벤, 파라벤, m-크레졸, 티오메르살, 벤질알코늄 클로라이드 등을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 적당한 계면활성제들은 올레산(oleic acid), 솔비탄 트리올레이트(sorbitan trioleate), 폴리소르베이트류, 레시틴(lecithin), 포스포티딜 콜린류(phosphotidyl cholines), 및 다양한 장쇄 디글리세리드류(diglycerides) 및 인지질류(phospholipids)를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 적당한 분산제들은 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid),등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 적당한 가스들은 질소, 헬륨, 클로로플루오로카본(CFCs), 하이드로플루오로카본(HFCs), 이산화탄소, 공기등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 적당한 안정화제들 및 긴장성 작용체들(tonicifying agents)은 설탕류 ㅁ및 다른 폴리올류, 아미노산류, 및 유기 및 무기 염류를 포함하지만, 여기에 ㅎ하한정되지 않는다.
액체 경점막 제형은 예컨대, 인스톨레이션(installation)처럼 드롭(drops)으로 또는 드롭플릿(droplets)(스프레이)로 투여될 수 있다. 상기 스프레이는 펌프, 분무, 또는 업계에 알려진 다른 방법들에 의해 생성될 수 있다. 폐 전달을 위해, 심부 폐 침착(deep lung deposition)을 위한 액체 작은 방울들은 허파 도관들(pulmonary passages) 내의 점착을 위해 적절한 최소 입자 크기는 종종 약 10 ㎛ 미만 질량 평균 당량 기체역학 직경(mass median equivalent aerodynamic diameter: MMEAD), 보통 약 5 ㎛ 미만 MMEAD, 보통 약 2 ㎛ 미만 MMEAD이다. 비강 전달을 위해, 액체 드로플릿 입자 크기는 보통 약 1000 ㎛ 미만 MMEAD, 보통 100 ㎛ 미만 MMEAD이다.
다른 실시예들 내에서, 점막 제형들은 비강내 전달을 위해 적절한 입자크기 또는 적절한 입자 크기 범위 내의 건조한, 주로 동결건조된 형태의 생물학적 활성제를 포함하는 건조한 분말 제형들로 투여된다. 폐 전달을 위해, 심부 폐 침착을 위한 분말 입자는 허파 도관들 내의 침착에 적절한 최소 입자 크기는 종종 약 10 ㎛ 미만 MMEAD, 보통 약 5 ㎛ 미만 MMEAD, 보통 약 2 ㎛ 미만 MMEAD이다. 비강 전달을 위한, 분말 입자 크기는 보통 약 1000 ㎛ MMEAD 미만, 보통 100 ㎛ MMEAD 미만이다. 이러한 크기 범위 내의 비강내 호흡가능한 분말들은 제트 분쇄, 스프레이 건조, 용매 침전(precipitation), 초임계 유체 응축등과 같은 다양한 종래 기술들에 의하여 생성될 수 있다. 적절한 MMEAD의 이러한 건조한 분말은 폐 또는 비강 흡입시에 상기 분말을 에어로졸화된 양으로 분산시키도록 환자의 호흡에 의존하는 종래 건조 분말 흡입기(dry powder inhaler: DPI)를 통해 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 상기 건조 분말은 분말을 에어로졸화된 양으로 분산시키도록 외부 동력원을 이용하는 예컨대, 피스톤 펌프와 같은 공기 보조 장치를 통해 투여될 수 있다. 약제 분말 입자들은 락토오스와 같은 적절한 운반체를 포함하는 큰 입자들(> 100 ㎛ MMEAD)로 응집된 입자들과 같이 건조한 상태로 제형될 수 있으며, 상기 약제 입자들 및 운반체 입자들의 응집체들(agglomerates)은 분말 분배시에 분쇄된다.
건조 분말 장치들은 일반적으로 단일 에어로졸화된 양("퍼프(puff)")을 생성하기 위하여 약 1 ㎎에서 20 ㎎의 범위의 분말 질량을 필요로 한다. 생물학적 활성제의 필요하거나 원하는 양이 이러한 양보다 더 적을 경우, 상기 분말 활성제는 일반적으로 약학적 건조 충진 분말과 함께 결합하여 필요한 전체 분말 질량을 제공한다. 바람직한 건조 충진 분말들은 수크로오스, 락토오스, 덱스트로스, 마니톨, 글리신(glycine), 트레할로스(trehalose), 인간 혈청 알부민(HSA), 및 전분을 포함한다. 다른 적당한 건조 충진 분말들은 셀로비오스(cellobiose), 덱스트란, 말토트리오스(maltotriose), 펙틴(pectin), 시트르산 나트륨, 아스코르빈산 나트륨(sodium ascorbate) 등을 포함한다.
본 발명 내의 점막 전달을 위한 조성물들을 제형하기 위하여, 생물학적 활성제는 상기 활성제(들)의 분산을 위한 염기 또는 운반체뿐만 아니라 다양한 약학적으로 수용가능한 첨가제들과 함께 결합될 수 있다. 원하는 첨가제들은 아르기닌, 수산화 나트륨, 글리신, 염산, 시트르산 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 또한, 국소 마취제들(예컨대, 벤질 알콜), 등장화제들(isotonizing agents)(예컨대, 염화 나트륨, 마니톨, 솔비톨), 흡착 억제제들(예컨대, Tween 80), 용해도 향상제들(예컨대, 사이클로덱스트린류 및 그 유도체들), 안정화제들(예컨대, 혈청 알부민), 및 환원제들(예컨대, 글루타티온)이 포함될 수 있다. 점막 전달을 위한 상기 조성물이 액체일 때, 0.9 %(w/v) 생리 식염수의 긴장도(tonicity)를 한 단위로 하여 측정시에 상기 제형의 긴장도는 일반적으로 어떠한 실질적, 비가역적 조직 손상을 투여 사이트의 비강 점막에 유도할 수 없는 값으로 조절된다. 일반적으로, 용액의 긴장도는 약 1/3 내지 3, 또는 1/2 내지 2, 또는 3/4 내지 1.7의 값으로 조절된다.
생물학적 활성제는 활성제 및 임의의 원하는 첨가제들을 분산시킬 능력이 있는 친수성 화합물을 포함할 수 있는 염기 또는 운반체에 담겨 분산될 수 있다. 상기 염기는 하기를 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 다양한 범위의 적당한 운반체들로부터 선택될 수 있다: 폴리카르복실산류 또는 그 염류의 공중합체들, 다른 모노머들(예컨대, 메틸(메트)아크릴레이트, 아크릴산, 등)과의 카르복실 무수화물들(예컨대, 말레익 무수화물), 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 비닐 고분자들, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체들, 및 키토산, 콜라겐, 알긴산 나트륨, 젤라틴, 하이알루론산(hyaluronic acid) 및 그 비독성 금속 염류와 같은 자연 고분자들. 종종, 생물분해성 고분자는 예를 들어, 폴리락틱산, 폴리(락틱산-글리콜산) 공중합체, 폴리하이드록시부틸산(polyhydroxybutyric acid), 폴리(하이드록시부틸산-글리콜산) 공중합체 및 그 혼합물들과 같은 염기 또는 운반체로 선택된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 폴리글리세린 지방산 에스테르류, 수크로오스 지방산 에스테르류 등과 같은 합성 지방산 에스테르류는 운반체들로 채택될 수 있다. 친수성 고분자들과 다른 운반체들은 단독 또는 결합하여 사용될 수 있으며, 부분 결정화, 이온 결합, 교차 결합 등에 의하여 상기 운반체에 향상된 구조적 일체성(structural integrity)이 부여될 수 있다. 상기 운반체는 유체 또는 점성 용액, 겔, 페이스트, 분말, 마이크로스피어(microspheres) 및 비강 점막에 직접 도포되기 위한 필름을 포함하는 다양한 형태들로 제공될 수 있다. 이런 문맥에서 선택된 운반체의 사용은 생물학적 활성제의 흡수 촉진으로 나타날 수 있다.
생물학적 활성제는 다양한 방법들에 따른 염기 또는 운반체와 결합될 수 있고, 상기 활성제의 방출은 상기 운반체의 붕해(disintegration), 또는 수 채널들의 관련된 제형에 의할 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 활성제는 예컨대, 이소부틸 2-사이아노아크릴레이트와 같은 적당한 고분자로부터 제조된 미세캡슐들(마이크로스피어) 또는 나노캡슐들(나노스피어)에 담겨 분산되며(예컨대,Michael, et al., J. Pharmacy Pharmacol. 43:1-5, 1991 참조), 장기간의 시간에 걸쳐 지속성 전달 및 생물 활성을 내는 비강 점막에 적용되는 생체적합성 분산 매질에 담겨 분산된다.
본 발명 내의 약학적 작용체들의 점막 전달을 더 향상시키기 위하여, 활성제를 포함하는 제형들은 또한 염기 또는 부형제로 친수성 저분자량 화합물을 포함할 수 있다. 그러한 친수성 저분자량 화합물들은 생리학적 활성 펩티드 또는 단백질과 같은 수용성 활성제가 흡수되는 신체 표면에 염기를 거쳐 확산될 수 있도록 통과하는 통과 매질(passage medium)을 제공한다. 상기 친수성 저분자량 화합물은 점막 또는 투여 분위기(administration atmosphere)로부터 수분을 선택적으로 흡수하고 수용성 활성 펩티드를 용해시킨다. 친수성 또는 저분자량 화합물의 분자량은 일반적으로 10000 정도이며 바람직하게는 3000 정도이다. 대표적인 친수성 저분자량 화합물은 올리고-, 디-와 같은 폴리올 화합물 및 수크로오스, 마니톨, 락토오스, L-아라비노스, D-에리트로스(erythrose), D-리보오스, D-자일로스, D-마노스(mannose), D-갈락토스, 락툴로스, 셀로비오스, 겐티비오스(gentibiose), 글리세린 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 본 발명 내의 운반체들로서 유용한 친수성 저분자량 화합물들의 예들은 N-메틸피롤리돈, 및 알콜류(예컨대, 올리고비닐 알콜, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등)를 포함한다. 이러한 친수성 저분자량 화합물들은 단독 또는 서로 함께 또는 비강내 제형의 다른 활성 또는 비활성 구성요소들과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물들은 대안적으로 예를 들어, 아세트산 나트륨, 젖산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 솔비탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate), 트리에탄올아민 올레이트(triethanolamine oleate) 등과 같은 pH 조절 및 완충제, 긴장도 조절제, 습윤제 등과 같은 약학적으로 수용가능한 운반체 물질들을 대안적으로 포함하여 생리학적 상태를 필요한 바와 같이 근접시킬 수 있다. 고체 조성물들에 대하여, 예를 들어, 마니톨, 락토오스, 전분, 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate), 사카린 나트륨, 활석, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 탄산 마그네슘 등을 포함하는 종래 비독성인 약학적으로 수용가능한 운반체들이 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들에서, 생물학적 활성제는 예를 들어, 지속 방출 고분자를 포함하는 조성물에 담겨 시간 방출 제형으로 투여된다. 상기 활성제는 예를 들어, 고분자, 마이크로캡슐화된 전달 시스템 또는 생체접착 겔과 같은 조절 방출 운반체처럼 급속한 방출로부터 보호하는 담체들과 함께 제조될 수 있다. 본 발명의 다양한 조성물들에서 상기 활성제의 지속성 전달은 상기 조성물에 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 하이드로겔류 및 젤라틴과 같은 흡수를 늦추게 하는 작용체들을 포함시켜 발생시킬 수 있다.
여기에 사용된 "피검자"라는 용어는 본 발명의 조성물들이 투여될 수 있는 임의의 포유류 환자를 의미한다.
키트들
본 발명은 포유류 피검자들에게서 질병 및 다른 상태들의 방지 및 처리에 사용을 위한 상기 설명된 약학적 조성물들, 활성 성분들, 및/또는 동일한 것들의 투여 수단을 포함하는 키트들, 포장 및 다중용기 유니트들을 포함한다. 간단히 말해서, 이러한 키트들은 점막 전달을 위한 약학적 제조에 제형되는 하나 이상의 생물학적 활성제를 포함하는 용기 또는 제형을 포함한다. 상기 생물학적 활성제(들)은 선택적으로 대량 배분 용기 또는 일회 또는 다회 투여 형태로 선택적으로 포함된다. 예를 들어, 폐 또는 비강내 스프레이 도포기와 같은 선택적 분배 수단이 제공될 수 있다. 포장 물질들은 특정한 질병 또는 상태의 처리 또는 방지를 위해 예컨대, 비강내와 같이 점막으로 약학적 작용체가 사용될 수 있는 것을 보여주는 함께 포장된 라벨 또는 지시사항을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 전달 향상 폴리펩티드들
본 발명의 다른 실시예들 내에서, 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드는 양친매성 아미노산 서열을 포함하도록 선택되거나 합리적으로 설계된다. 예를 들어, 대전된 서열 영역 또는 모티프(motif)를 형성하는 복수의 대전된 아미노산 잔기들에 연결된 소수성 서열 영역 또는 모티프를 형성하는 복수의 비-극성 또는 소수성 아미노산 서열들을 포함하여 양친매성 펩티드를 생성하는 유용한 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드들이 선택될 수 있다.
다른 실시예들에서, 상기 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드는 단백질 전달 영역(protein transduction domain) 또는 모티프, 및 융합생성(fusogenic) 펩티드 영역 또는 모티프를 포함하도록 선택된다. 단백질 형질도입 영역은 세포들의 막에 삽입하고 바람직하게는 세포들의 막을 통해 횡단할 수 있는 펩티드 서열이다. 융합생성 펩티드는 예를 들어 엔도솜(endosome)을 둘러싸는 플라스마 막 또는 막과 같은 지질막을 불안정하게 할 수 있으며, 낮은 pH에서 향상될 수 있는 펩티드이다. 대표적인 융합생성 영역들 또는 모티프들은 광범위하게 다양한 바이러스성 융합 단백질 및 예를 들어, 섬유아세포 성장 인자 4(FGF4)와 같은 다른 단백질들에서 발견된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드들을 합리적으로 설계하기 위하여, 단백질 전달 영역이 원형질막(plasma membrane)을 통해 세포로 핵산의 도입을 용이하게 할 모티프로 채용된다. 특정 실시예들에서, 상기 수송되는 핵산은 엔도솜으로 캡슐화될 것이다. 엔도솜들의 내부는 pH가 낮아서 융합생성 펩티드 모티프가 상기 엔도솜의 막을 불안정하게 한다. 상기 엔도솜 막의 불안정화 및 파괴는 세포질에 siNA의 방출을 허용하게 되어 상기 세포질에 siNA가 RISC 복합체와 결합하고 그것의 목표 mRNA와 향할 수 있게 된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드들로 선택적 융합을 위한 단백질 전달 영역의 예들은 하기를 포함한다:
1. TAT 단백질 전달 영역(PTD)(서열번호 1) KRRQRRR;
2. 페네트라틴(Penetratin) PTD(서열번호 2) RQIKIWFQNRRMKWKK;
3. VP22 PTD(서열번호 3) DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD;
4. 카포시(Kaposi) FGF 신호 서열들(서열번호 4) AAVALLPAVLLALLAP, 및
(서열번호 5) AAVLLPVLLPVLLAAP;
5. 인간 β3 인테그린 신호 서열(서열번호 6) VTVLALGALAGVGVG;
6. gp41 융합 서열(fusion sequence)(서열번호 7) GALFLGWLGAAGSTMGA;
7. Caiman crocodylus Ig(v) 경사슬(light sequence)(서열번호 8) MGLGLHLLVLAAALQGA;
8. hCT-유도 펩티드(hGO-derived sequence)(서열번호 9) LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP;
9. 트랜스포르탄(Transportan)(서열번호 10) GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL;
10. 롤리고머(Loligomer)(서열번호 11) TPPKKKRKVEDPKKKK;
11. 아르기닌 펩티드(서열번호 12) RRRRRRR; 및
12. 양친성 펩티드(Amphiphilic model peptide)(서열번호 13)
KLALKLALKALKAALKLA.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드들로 선택적 융합을 위한 바이러스성 융합 펩티드들의 융합생성 영역들의 예들은 하기를 포함한다:
1. 인플루엔자 HA2(서열번호 14) GLFGAIAGFIENGWEG;
2. 센다이(Sendai) Fl(서열번호 15) FFGAVIGTIALGVATA;
3. 호흡기 합포체 바이러스 Fl(서열번호 16) FLGFLLGVGSAIASGV;
4. HIV gp41(서열번호 17) GVFVLGFLGFLATAGS; 및
5. 에볼라 GP2 (서열번호 18) GAAIGLAWIPYFGPAA.
본 발명의 또 다른 실시예들 내에서, 본 발명의 방법들 및 조성물들 내에서 폴리펩티드-siNA 복합체 형성을 용이하게 하고/하거나 siNA들의 전달을 향상시키는 DNA-결합 영역 또는 모티프를 포함하는 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드들이 제공된다. 이런 맥락에서의 대표적인 DNA 결합 영역들은 DNA-결합 조절 단백질 및 하기에 확인된 다른 단백질들에 대해 설명된 다양한 "징크 핑거(zinc finger)" 영역들을 포함하다(예컨대, Simpson, et al., J. Biol . Chem . 278:28011-28018, 2003 참조).
하기 표 1은 여러 DNA-결합 단백질들의 예시적인 징크 핑거 모티프들을 나타낸 것이다:
Figure 112008014196339-PCT00001
*상기 표는 본 발명에 따른 추가적인 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드들을 선택하고 설계하는 데 이용될 수 있는 C-x(2,4)-C-x(12)-H-x(3)-H 모티프 패턴에 의해 특징되는 이중 가닥 DNA 결합을 위한 보존적인 징크 핑거 모티프를 설명한다.
**표 1에 보인 Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, DroBtd, DrosSp, CeT22C8.5, 및 Y4pB1A.4에 대한 서열들은 여기에 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 및 26으로 각각 할당되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드들의 구축에 유용한 대안적인 DNA 결합 영역들은 예를 들어, HIV Tat 단백질 서열의 부분들을 포함한다(하기 실시예들 참조).
여기 아래에 설명된 본 발명의 대표적인 실시예들 내에서, 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드들은 앞선 siNA들의 목표 세포들로 향상된 전달을 중재하는 데 효과적인 단일한 폴리펩티드로 앞선 구조적 성분들, 영역들 또는 모티프들 중 임의의 것을 결합시켜 합리적으로 설계되고 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 TAT 폴리펩티드의 단백질 전달 영역은 HA2로 명명된 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소 단백질의 N-말단 20 개의 아미노산들에 융합되어 여기에 하나의 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드를 생성하였다. 다양한 다른 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드 구성체들이 본 개시에 제공되어 본 발명의 개념들이 광범위하게 적용되어 siNA 전달을 위한 효과적인 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드들의 다양한 조립을 발생시키고 사용할 수 있음을 명시하고 있다.
본 발명 내의 또 다른 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드들은 하기의 펩티드들로부터 선택될 수 있다:
WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR (서열번호 27);
GKINLKALAALAKKIL (서열번호 28), RVIRVWFQNKRCKDKK (서열번호 29),
GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ (서열번호 30),
GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK (서열번호 31), Poly Lys-Trp, 4:1, 분자량 20,000-50,000; 및 Poly Orn-Trp, 4:1, 분자량 20,000-50,000. 여기에 조성물들 및 방법들 내에 유용한 다른 폴리뉴클레오티드 전달-향상 폴리펩티드들은 멜리틴 단백질 서열 모두 또는 일부를 포함한다.
하기 실시예에 의해 본 발명을 설명하고자 한다. 단, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
점막 전달-투과 반응 속도론 및 세포독성
오가노타이픽 모델( organotypic model )
하기의 방법들은 포유류 피검자에게서 상피 연접 구조 및/또는 생리를 조절하여 생물학적 활성 치료제 및 점막 상피 세포주위 수송을 가역적으로 향상시키는 투과화 펩티드의 점막 전달-향상 효과적인 양에 대한 점막 전달 변수들, 반응 속도론 및 부작용들을 평가하는데 일반적으로 유용하다.
상기 EpiAirwayTM 시스템은 기도를 라이닝하는 위중층(pseudostratified) 상피의 모델로서 MatTek Corp (Ashland, MA)에 의해 개발되었다. 상기 상피 세포들은 다공성 막-바닥(bottomed) 세포 배양 삽입물 상의 공기-액체 계면에서 성장하여 상기 세포들의 분화로 고도로 극성화된 형태를 가지게 되었다. 상기 첨부 표면은 미세 융모가 많은 미세구조로 섬모로 되어 있으며 상피조직이 점액을 생성한다(뮤신(mucin)의 존재는 면역블로팅(immunoblotting)에 의해 확인되었다). 상기 삽입물들은 0.875 ㎝의 직경을 가지고 있어, 표면적이 0.6 ㎠이다. 상기 세포들은 선적되기 약 3 주일 전에 공장에서 상기 삽입물들 상에 플레이트된다. "키트" 하나는 24 개의 유니트들로 이루어져 있다.
A. 유니트들이 도착하면, 상기 유니트들은 6-웰 마이크로플레이트들 내에서 멸균된 서포트들(supports) 상으로 옮겨진다. 각각의 웰은 특허된 배양 배지 5 mL를 받는다. 이러한 DMEM-계 배지는 혈청이 없지만 상피 성장 인자 및 다른 인자들에 의해 보충된다. 상기 배지는 비강내 전달을 위해 고려되고 있는 임의의 시토카인이나 성장 인자의 내인성 수준에 대해 시험되지만 인슐린을 제외한 지금까지 연구된 모든 시토카인류 및 인자들은 없었다. 상기 5 mL 부피는 그 스탠드들 상에 유니트들의 바닥에 접촉할 만큼 충분하지만, 상피조직의 첨부 표면은 공기와 직접 접촉을 한 상태를 유지하도록 한다.이 단계 및 유니트들을 액체-함유 웰들에 이전을 포함하는 모든 후속 단계들에 멸균된 핀셋을 사용하여 어떠한 공기도 유니트의 바닥과 배지 사이에 트랩되지 않도록 한다.
B. 그 플레이트들 내의 유니트들은 공기 중에 5 % CO2의 대기로 되어있는 인큐베이터 내에 24 시간 동안 37 ℃를 유지한 채 둔다. 이 시간이 지난 후, 상기 배지를 신선한 배지로 교체하고 상기 유니트들을 인큐베이터에 돌려 넣어 24 시간 더 둔다.
실험 프로토콜 - 투과 반응속도론
A. 24 개의 EpiAirwayTM 유니트들의 "키트"는 5 개의 다른 제형들을 평가하도록 관례대로 채용되어 제형 각각이 4벌의 웰들에 적용된다. 각각의 웰은 투과 반응속도론(4 개의 시간 지점들), 경상피 전기 저항(TER)의 측정을 위해 채용된다. 추가적인 웰들의 셋이 대조군으로 채용되어, 투과 반응속도론을 측정하는 동안 거짓 시험되지만(sham-treated), 경상피 저항 및 생존도의 측정을 위해 시험 표본-함유 유니트들에 동등하게 다뤄진다.
B. 모든 실험들에서, 연구되는 점막 전달 제형은 전체 첨부 표면를 덮기에 충분한 양인 100 μL의 부피로 각각의 유니트의 첨부 표면에 적용된다. 상기 첨부 표면에 적용되는 농도에서 시험 제형의 적절한 부피(100 μL 정도가 일반적으로 필요하다)는 ELISA 또는 다른 지정된 검사법에 의해 활성 물질의 농도를 이후에 측정하기 위해 책정해 둔다.
C. 상기 유니트들은 실험을 위한 스탠드들이 없이 6 개의 웰 플레이트들에 놓아둔다: 각각의 웰은 유니트의 다공성 막 바닥을 접촉하기에 충분한 0.9 mL의 배지를 포함하지만, 상기 유니트에 임의의 충분한 상향 유체정역학(hydrostatic) 압력을 발생시키지 않는다.
D. 잠재적인 오류 원천들을 최소화하고 임의의 농도 구배가 형성되지 않도록 하기 위하여, 상기 유니트들은 연구의 각 시간 지점에 하나의 0.9 mL-함유 웰로부터 다른 웰로 옮겨진다. 시험 물질 100 μL 부피가 첨부 표면에 적용되었던 0 시간에 근거하여 하기의 시간 지점들에서 이러한 이전을 한다: 15 분, 30 분, 60 분, 120 분.
E. 시간 지점들 사이에서 그 플레이트들에 있는 유니트들이 37 ℃ 인큐베이터에 보관된다. 웰당 0.9 mL를 함유하는 플레이트들은 또한 멸균 집게를 사용하여 플레이트들이 제거되고 유니트들이 한 웰에서 다른 웰 옮겨지는 짧은 기간 동안에 최소한의 온도 변화가 발생하도록 인큐베이터 내에 유지된다.
F. 각각의 시간 지점이 완료시에, 상기 배지는 각각의 유니트가 옮겨졌던 웰로부터 제거되고 투과된 시험 물질의 농도 측정을 위해, 그리고 상기 시험 물질이 세포독성이 있는 경우에, 사이토솔의 효소인 젖산염 탈수소효소(lactate dehydrogenase)를 상피로부터 방출시키기 위하여 두 개의 튜브들(하나의 튜브는 700 μL이고 다른 것은 200 μL이다)에 분취된다. 만약 상기 표본들은 24 시간 이내에 실시하고자 한다면 냉장고에 보관하거나 상기 표본들은 세부적으로 더 분취시켜 시험을 위해 일단 해동될 때까지 -80 ℃에서 냉동 보관한다.
G. 오류를 최소화하기 위하여, 모든 튜브들, 플레이트들, 및 웰들은 실험을 개시하기 전에 사전라벨을 붙인다.
H. 120 분 시간 지점이 끝나면, 유니트들은 마지막 0.9 mL 함유 웰들로부터 웰 당 0.3 mL 배지를 함유하는 24-웰 마이크로플레이트들로 옮겨 놓는다. 이 부피는 유니트들의 바닥을 다시 접촉하기에 충분한 양이지만, 유니트들에 상향 유체정역학 압력을 가하지 않을 만큼의 양이다. 유니트들은 경상피 저항의 측정 전에 인큐베이터에 되돌려진다.
실험 프로토콜- 경상피 전기 저항
A. 호흡기 상피 세포들은 생체 외(in vitro)뿐만 아니라 생체 내(in vivo) 밀착 연접을 형성하여 조직을 가로질러 용질들의 흐름을 제한한다. 이러한 연접은 절제된 기도 조직들에 수백 옴(ohms) x ㎠의 경상피 저항을 부여한다. MatTekEpiAirwayTM 유니트들에서, 경상피 전기 저항(TER)은 제작자에 의해 통상 1000 ohms x ㎠ 정도인것으로 보고된다. 여기에 측정된 데이터는 투과 연구에서 일련의 단계들 도중에 거짓-노출된(sham-exposed) 대조군 MatTekEpiAirwayTM 유니트들의 TER이 다소간 낮음(700-800 ohms x ㎠)을 보이지만, 작은 분자들의 투과는 TER의 역수에 비례하기 때문에, 이 값은 여전히 투과에 상당한 장애가 될 만큼 충분히 큰 값이다. 역으로, 세포가 없는 다공성 막-바닥 유니트들은 최소한의 막관통 저항(약 5-20 ohms x ㎠)만을 제공한다ㅏ.
B. TER의 정확한 측정은 저항계의 전극들이 막의 위 아래에 있는 상당한 표면적에 걸쳐서 위치시켜야 되고, 상기 막으로부터 전극들의 거리가 재현가능하도록 제어되어야 함을 요구한다. MatTek에 의해 추천되고 여기의 모든 실험들에 대해 채용된 방법은 World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL 사의 "EVOM"TM 상피 볼트옴미터(voltohmmeter) 및 "ENDOHM"TM 조직 저항 측정 챔버를 채용한다.
C. 상기 챔버를 처음에 전극들의 평형을 유지하기 위하여 TER 측정 전에 적어도 20 분 동안 Dulbecco's 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워 넣는다.
D. 챔버 내의 PBS 1.5 mL와 막-바닥 유니트 내의 PBS 350 μL를 측정하며 TER 측정을 한다. 아무런 세포들도 함유하지 않은 유니트(그렇지만 PBS 350 μL 함유)의 막 바로 위 자리에 상부 전극을 조정하고 나서 위치 조정이 재현될 수 있도록 고정시킨다. 세포-없는 유니트의 저항은 일반적으로 5-20 ohms x ㎠("배경 저항(background resistance)")이다.
E. 상기 챔버가 준비되고 배경 저항이 기록되면, 투과 측정에 채용된 24-웰 플레이트 내의 유니트들을 상기 인큐베이터에서 제거하고 TER 측정을 위해 상기 챔버 내에 개별적으로 위치시킨다.
F. 각각의 유니트를 우선 PBS를 함유하는 페트리 접시에 옮겨넣고 막 바닥이 촉촉히 젖게 한다. 350 μL PBS 분취량을 상기 유니트에 첨가하여 라벨을 부착한 튜브로 조심스럽게 빨아들여 첨부 표면을 헹군다. 350 μL PBS의 두번째 세정액을 상기 유니트에 적용하고 동일한 수집 튜브로 빨아 들이들이다.
G. 챔버(신선한 PBS 1.5 mL 분취량 함유)로 옮기기 바로 직전에 외부 표면 상에 여분의 PBS 없이 상기 유니트를 천천히 빨아 들여 자국을 남긴다(blotted). 상부 전극이 챔버 상에 위치되어 상기 TER이 EVOM 미터 상에 판독되기 전에 350 μL PBS의 분취량을 상기 유니트에 첨가한다.
H. 상기 유니트의 TER이 ENDOHM 챔버 내에 판독된 후에, 상기 유니트는 제거되고, PBS는 빨아들여지고 모아두고, 상기 유니트는 웰당 0.3 mL 배지를 함유하는 24-웰 플레이트에 첨부 표면 상의 공기 계면이 있는 채로 돌려보낸다.
I. 상기 유니트는 하기의 순서로 판독된다: 모든 거짓-처리된 대조군들은 이후 모든 제형-처리된 표본들, 그리고 거짓-처리된 대조군들의 각각을 두번째 TER 판독한다. 모든 TER 값들은 조직의 표면의 함수로 기록된다.
TER은 하기와 같이 계산되었다:
TER = (RI - Rb) x A
RI는 막이 있는 삽입물의 저항이며, Rb는 블랭크 삽입물(blank insert)의 저항이며, A는 막의 면적(0.6 ㎠)이다. 비강내 전달-향상제, 예를 들어, 투과화 펩티드(permeabilizing peptides)를 포함하는 약학적 제형들의 효과는 EpiAirwayTM Cell Membrane(점막 상피 세포층)을 가로지르는 TER에 의해 측정된다. 투과화 펩티드는 1.0 mM의 농도로 EpiAirwayTM Cell Membrane에 적용된다. 상기 대조군 값(대조군 = 약 1000 ohms-㎠; 100으로 정상화됨.)에 대한 TER 값의 감소는 세포막 저항의 감소 및 점막 상피 세포 투과성에서의 증가를 나타낸다.
실험 프로토콜- LDH 시험법( assay )
세포 사망의 양은 CytoTox 96 Cytoxicity Assay Kit(Promega Corp., Madison, WI)을 이용하여 세포들로부터 젖산 탈수소효소(LDH)의 감소를 측정하여 시험되었다. 표본의 50 마이크로리터를 96-웰 시험 플레이트들에 옮겨 넣었다. 신선한, 무세포 배양 배지를 블랭크로 사용하였다. 기질 용액 50 μL를 각각의 웰에 첨가하였고 상온 암실에서 30 분 동안 플레이트들을 배양하였다. 배양 후, 정지 용액 50 μL를 각각의 웰에 첨가하였고 광학 밀도 플레이트 판독기 상에 490 ㎚에서 플레이트들을 판독하였다.
실험 프로토콜- EIA 방법
EIA 키트(p/n S-1178(EIAH6101))을 Peninsula Laboratories Inc.사로부터 구입하였다(Division of BACHEM, San Carlos, CA, 800-922-1516). 17x120 ㎚ 폴리프로필렌 원추형 튜브들(p/n 352097, Falcon, Franklin Lakes, NJ)을 모든 표본 제제들에 사용하였다. 8 개의 표준을 PTH 정량(quantitation)을 위해 사용하였다. 나머지 시험 절차는 키트 삽입물들과 동일하였다.
실시예 2
PN159 에 의한 상피 투과 향상
이하의 예들은 PN159에 의해 예증된 본 발명의 투과 향상 펩티드들은 PTH 및 펩티드 YY를 포함하는 펩티드 치료 약제들에 점막 투과를 향상시킨다는 것을 예증하고 있다. PN159에 대하여 드러난 바와 같이, 본 발명의 이러한 펩티드들의 투과 향상 활성은 하나 이상의 작은 분자 투과 향상제들의 사용을 통해 달성된 상피 투과 향상과 동일하거나 더 클 수 있다.
펩티드 YY3 -36(PYY3 -36)은 수많은 임상 시험의 대상이 되었던 34 개 아미노산 펩티드이다. 이러한 생물학적 활성 펩티드의 점막 전달은 작은 분자 투과 향상제들을 포함하는 제형들에서 향상될 수 있다. 따라서, 본 연구들은 PN159에 의하여 예증된 본 발명의 투과 향상 펩티드들이 작은 분자 투과 향상제들의 역할을 대체하여 펩티드 YY의 점막 전달을 촉진할 수 있는지의 여부를 평가한다. 이러한 연구들은 생체 외 결과들과 일치하는 것으로 판명된 관련 생체 내 연구들뿐만 아니라 경상피 전기 저항(TEER)을 감소시키고 표지 물질(marker substances)의 투과를 증가시키는 PN159의 생체 외 효과의 평가를 포함하였다.
현재의 예들에서, PN159와 PTH의 결합은 설명된다. PTH는 전체 길이 펩티드(1-84) 또는 (1-34)와 같은 단편일 수 있다. 상기 제형은 또한 PTH, 투과화 펩티드, 및 하나 이상의 다른 투과 향상제들의 결합일 수 있다. 상기 제형은 또한 완충제들, 긴장성 작용체들, pH 조절 작용체들, 및 아미노산, 설탕류 또는 폴리올들, 고분자들 및 염류와 같은 펩티드/단백질 안정제들을 포함할 수 있다.
본 연구는 PN159 자체 또는 다른 투과 향상제들과의 결합된 PN159의 PTH 투과에 미치는 효과를 평가하도록 설계되었다. 평가된 PN159의 농도들은 25, 50, 및 100 μM이다. 다른 투과 향상제들은 45 mg/ml M-β-CD, 1 mg/ml DDPC, 및 1 mg/ml EDTA이다. 솔비톨을 긴장제(146-190 mM)로 사용하여 제형들의 삼투 몰농도(osmolarity)를 220 mOsm/㎏으로 조절하였다. 상기 제형 pH는 4.5로 고정하였다. PTH는 본 예에서 모델 펩티드로 선정되었다. 2 mg/ml PTH는 다른 투과 향상제들과 함께 또는 없이 PN159와 함께 결합되었다. 상기 결합은 생체 외 상피 조직 모델을 이용하여 시험되어 PTH 투과, 경상피 전기 저항(TER), 및 LDH 시험법에 의한 제형의 세포독성을 모니터하였다.
경상피 전기 저항
본 연구들로부터 TER 측정들의 결과는 PN159에 의해 80 % 이상의 TER 감소가 있었음을 보여준다. PN 159 농도를 증가시키면 TER 감소가 더 크게됨을 관찰하였다. 첨부 측면에 적용된 배지들은 TER을 감소시키지 않은 반면에 트리톤(triton) X 처리된 그룹은 예상한 바와 같이 상당한 TER 감소를 보였다.
세포독성
본 연구들로부터 LDH에 대한 데이터는 세포들이 25-100 μM의 PN159로 처리되면 상당한 세포독성이 관찰되지 않았음을 보여주었다. 첨부 측면에 적용된 배지들은 세포독성을 보여주지 않은 반면에 트리톤 X 처리된 그룹은 예상한 바와 같이 상당한 세포독성 감소를 보였다.
투과
다른 향상제들이 있고 없고에 따른 PN159에 대한 PTH1 -34 투과 데이터가 도 1 및 2에 각각 도시된다. PN159가 존재하면 PTH 투과에서 상당한 증가가 관찰되었다. % 투과에서의 어떠한 상당한 차이도 25, 50, 및 100 μM PN159 사이에서 관찰되지 않았다. PTH 투과에 PN159가 미치는 효과는 45/1/1 mg/ml M-β-CD/DDPC/EDTA에 필적할 만하다. 45/1/1 mg/ml M-b-CD/DDPC/EDTA 및 PN159를 결합하면 PTH 투과가 추가로 증가하는 것을 관찰하였다.
실시예 3
펩티드 호르몬 치료제에 대한 PN159 에 의한 생체 내 투과 증가는 작은 분자 투과 향상 제들의 투과와 동등하거나 더 향상된다
3-6 개월된 2.1-3.0 kg 나가는 20 마리의 뉴질랜드 백색 토끼들을 무작위로 그룹당 4 마리로 무리지은 5 개의 처리 군 중 하나에 할당한다. 시험 동물들에게 피펫을 통해 비강내로 15 μl/kg 가 투여되었다. 본 연구들에서 작은 분자 향상제들은 메틸-β-사이클로덱스트린, 포스파티딜콜린 디데카노일(phosphatidylcholine didecanoyl: DDPC), 및/또는 EDTA를 포함한다. 투여 그룹 2는 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해된 PYY를 받았다. 투여 그룹 3-5에 대하여, 다양한 농도의 PN159가 투여 그룹 2에 첨가되어, 투여 그룹 3-5 각각은 PYY, PN159, 및 PBS를 구성하였다.
그룹 동물 투과 향상제들 투여 농도(mg/ml) 투여 부피(ml/kg) PYY 투여(㎍/㎏)
1 수컷 4 마리 작은 분자 투과 향상제들 13.67 0.015 205
2 수컷 4 마리 없음 13.67 0.015 205
3 수컷 4 마리 25 μM PN159 13.67 0.015 205
4 수컷 4 마리 50 μM PN159 13.67 0.015 205
5 수컷 4 마리 100 μM PN159 13.67 0.015 205
말단 귀 정맥에 직접 정맥천자(venipuncture)하여 항응고제로서 EDTA를 포함하는 혈액 수집 튜브들에로 계열 혈액 표본들(각각 약 2 ml)을 수집하였다. 투여 후 0, 2.5, 5, 10, 15, 30, 45, 60 및 120 분에 혈액 표본들을 수집하였다. 혈액 수집 후, 상기 튜브들을 항-응집을 위해 천천히 수차례 흔들고, 이후 50 μl 아프로티닌(aprotinin) 용액을 첨가하였다. 상기 혈액을 약 4 ℃에서 15 분 동안 약 1,600 x g로 원심분리하였고, 원형질 표본을 2 벌의 분취량으로 분배하여 약 -70 ℃의 온도에서 냉동 저장하였다.
일 처리 그룹에서 4 마리 동물들을 평균하면, 하기와 같은 PYY의 혈장 농도들을 측정하였다(표 3):
그룹 1 그룹 2 그룹 3 그룹 4 그룹 5
시간, 분 작은 분자 투과 향상제들 투과 향상제들 없음 25 μM PN159 50 μM PN159 100 μM PN159
0 183.825 257.3 228.675 424.4 294.225
2.5 1280.7 242.8 526.375 749.975 1748.225
5 1449.425 273.675 1430.15 1293.4 3088.2
10 8251.8 372.05 6521.7 12517.2 14486.6
15 13731.2 398.225 12563.075 34455.3 20882.725
30 19537.55 476.475 15222.6 35294.375 25470.475
45 13036.075 340.7 9081.125 21582.225 16499.55
60 7080.875 283.825 4843.15 9461.925 10676.625
120 1671.9 192.575 1224.2 2337.775 1891.275
상기 데이터로부터 계산된 약동학적 데이터는 하기 표 4에 나타내었다:
변수 그룹 평균 SD SE
Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 19832.18 32.5 991732.1 1357132 23.69 516.725 26.25 36475.72 60847.41 84.5919 15533.95 22.5 748104.1 796354.7 24.8467 40995.53 26.25 1692499 1787348 25.5355 27974.4 33.75 1384241 1518949 20.4628 17737.21 20.6155 930296.3 928368.5 1.713 196.492 14.3614 9926.104 17688.31 26.8859 13225.88 8.6603 661213.8 721017.8 4.3108 32112.71 7.5 1339896 1395185 8.6139 17584.31 18.8746 817758.8 1030623 6.5069 8868.605 10.3078 465148.1 535993.8 0.989 98.246 7.1807 4963.052 8844.156 13.4429 6612.941 4.3301 330606.9 360508.9 2.1554 16056.35 3.75 669947.8 697592.4 4.3069 8792.754 9.4373 408879.4 595030.3 3.7568
상기 그룹 2(향상제가 없음) 제형과 비교했을 때, 하기의 상대적인 향상 비율들이 결정되었다(표 5):
그룹 제형 상대적 Cmax 상대적 AUC last
1 작은 분자 투과 향상제들 38x 27x
3 PN159, 25μM 30x 21x
4 PN159, 50μM 79x 46x
5 PN159, 100μM 54x 38x
앞선 데이터는 도 3에서 생생하게 묘사되어 있고, PN159에 의해 예시되는 바와 같이, 본 발명의 투과화 펩티드들은 인간 호르몬 펩티드 치료제의 생체 내 비강내 투과를 작은 분자 투과 향상제들과 동일하거나 더 큰 정도로 향상시킬 수 있다는 것을 예증한다. 펩티드의 가장 큰 효과는 50 μM 농도일 때 보여진다. 50 μM와 100 μM 농도 양쪽 모두 작은 분자 투과 향상제들보다 더 높은 투과를 나타냈지만, 100 μM 농도가 약간 더 낮은 투과를 나타내었다.
실시예 4
올리고펩티드 치료제에 대한 PN159 에 의한 투과 향상
본 예는 본 발명의 대표적인 펩티드인 PN159의 포유류 세포 수용체에 대한 모델 올리고펩티드 길항제인 사이클릭 펜타펩티드, 멜라노코르틴-4 수용체 작용제(melanocortin-4 receptor agonist: MC-4RA)에 대한 상피 투과 향상의 효과를 실증한다. 본 예에서, 하나 이상의 투과화 펩티디들과 MC-4RA와의 결합이 설명된다. 본 맥락의 유용한 제형들은 올리고펩티드 치료제, 투과화 펩티드 및 하나 이상의 다른 투과 향상제들의 결합을 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 완충제들, 긴장제들, pH 조절제들, 및 아미노산, 설탕류 또는 폴리올류, 고분자들 및 염류와 같은 펩티드/단백질 안정화제들을 포함할 수 있다.
본 연구에서 MC-4RA의 투과에 미치는 PN159의 효과를 평가하였다. MC-4RA는 MC-4 수용체의 활성을 조절하는 분자량 약 1,100 Da의 메탄술포네이트 염(methanesulphonate salt)이었다. 평가된 PN159의 농도들은 5, 25, 50, 및 100 μM이다. 45 mg/ml M-β-CD를 모든 제형들에 대한 가용화제(solubilizer)로서 사용하여 10 mg/ml 펩티드 농도를 달성한다. PN159의 효과는 그 자체 또는 EDTA(1, 2.5, 5, 또는 10 mg/ml)과 결합하여 평가되었다. 상기 제형 pH는 4로 고정되었고 삼투 몰농도는 220 mOsm/kg이었다.
HPLC 법
기저측부 배지(basolateral media) 내에서의 MC-4RA의 농도는 유량 1 mL/분 속도 및 25 ℃의 칼럼 온도의 C18 RP 크로마토그래피를 이용한 RP-HPLC에 의해 분석되었다.
용매 A: 물 속의 0.1 TFA; 용액 B: ACN 속의 0.1 % TFA
분사 부피: 50 μL
검출: 220 ㎚
RUN TIME: 15 분
MC-4RA는 5, 25, 50, 및 100 μM PN159, pH 4 및 삼투 몰 농도 ~220 mOsm/kg과 결합되었다. 상기 결합을 MTT 및 LDH 시험법에 의한 제형의 PTH 투과, 경상피 전기 저항(TER), 및 세포독성을 모니터하기 위하여 생체 외 상피 조직 모델을 이용하여 시험하였다.
MC-4RA의 투과의 연구 결과들이 도 4에 도시된다. 이러한 연구들은 PN159가 펩티드 호르몬 치료제들에 대한 점막 투과를 향상시키는 것 이외에, 올리고펩티드 체료제들에 대한 상피 투과를 또한 상당히 향상시킨다는 것을 명시한다.
실시예 5
작은 분자 약제에 대한 PN159 에 의한 투과 향상
본 예는 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase: ACE) 억제제 갈란타민(galantamine)에 의해 예증된 작은 분자 약제에 대한 본 발명의 대표적 펩티드인 PN159의 상피 투과 향상 효과를 실증한다. 본 예에서, 하나 이상의 투과화 펩티드들과 작은 분자 약제와의 결합을 설명한다. 본 맥락의 유용한 제형들은 작은 분자 약제, 투과화 펩티드 및 하나 이상의 다른 투과 향상제들의 결합을 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 완충제들, 긴장제들, pH 조절제들, 안정화제들 및/또는 보존제들을 포함할 수 있다.
본 발명은 갈란타민을 PN159와 결합시켜 비점막을 가로질러 갈란타민의 투과를 향상시킨다. 약물 투과에서 이러한 증가는 갈란타민이 비강 상피막을 독립적으로 투과시킬 수 있는 작은 분자이기 때문에 예상치 못한 것이다. 그러므로 펩티드들의 투과를 향상시키는 부형제들의 첨가에 의해 매개되는 상피를 가로지르는 갈란타민 투과의 상당한 향상은 그러한 부형제들이 보통은 상피 조직층을 가로질러 갈란타민의 투과를 상당히 증가시키지 않는다는 근거에서, 놀라운 것이다. 본 발명은 그러므로 갈란타민과 다른 작은 분자 약제들의 생체이용도를 증가시켜 비강 전달을 촉진할 것이다.
본 연구들에서, 젖산염 형태의 40 mg/ml 갈란타민은 25, 50, 및 100 μM PN159 용액, pH 5.0 및 삼투 몰 농도 ~270 mOsm과 결합되었다. 상기 결합을 상기 설명된 바와 같이 LDH 및 MTT 시험법에 의한 제형의 갈란타민 투과, 경상피 전기 저항(TER), 및 세포독성을 모니터하기 위하여 생체 외 상피 조직 모델을 이용하여 시험하였다. 갈란타민에 대한 투과 측정은 하기와 같이 표준 HPLC 분석에 의해 수행되었다.
HPLC 분석
제형 및 기저측부 배지(투과 표본들) 내의 갈란타민 농도는 UV 검출이 되는 등용리(isocratic) LC(Waters Alliance) 방법을 이용하여 측정되었다.
칼럼: Water Symmetry Shield, C18, 5 um, 25 x 0.46 ㎝
이동상(mobile phase): 50 mM 포름산 암모늄에 5 % ACN, pH 3.0
유량: 1 ml/min
칼럼 온도: 30 ℃
보정 곡선: 0-400 ㎍/ml 갈란타민 HBr
검출: 285 nm의 자외선
앞선 연구들에 근거하여, PN159는 작은 분자들의 경상피 전달을 개선한다. 갈란타민은 모델 저분자량 약제로서 선정되었고, 이 분자에 대한 결과들은 다른 작은 분자 약제들에 대한 투과화 펩티드 활성의 예측으로 고려된다. 본 맥락에서 투과화 활성을 평가하기 위하여, 젖산염 형태의 40 mg/ml 갈란타민은 25, 50, 및 100 μM PN159 용액, pH 5.0 및 삼투 몰 농도 ~270 mOsm과 결합되었다. 상기 결합을 LDH 및 MTT 시험법에 의한 제형의 갈란타민 투과, 경상피 전기 저항(TER), 및 세포독성을 모니터하기 위하여 생체 외 상피 조직 모델을 이용하여 시험하였다.
생체 외 조직 모델에서, PN159를 첨가하면 세포 장벽을 가로질러 약물 투과에 극적인 증가를 일으켰다. 특히, 40 mg/ml 갈란타민의 Papp에서 2.5 - 3.5 배 증가가 있었다.(도 5 참조)
PN159는 실시예 2에서 설명된 바와 같이 갈란타민이 존재시에 TER을 감소시켰다.
시험된 모든 농도들에서 갈란타민 락테이트(galantamine lactate) 및 PN159가 존재하면 세포 생존도는 높은 상태(> 80 %)를 유지하였다. 역으로, LDH에 의해 측정된 바와 같이 PN159 및 갈란타민 락테이트가 존재하면 세포독성은 낮았다. 이러한 시험법들 양쪽 모두는 PN159가 상피막에 독성이 있지 않다는 것을 제시한다.
앞선 결과들을 요약하면, PN159는 여기서 모델 저분자량 약제로서 갈란타민의 상피 투과를 놀라울 만큼 증가시키는 것으로 실증되었다. 갈란타민 용액에 PN159를 첨가하면 상피 단일층들을 가로질러 갈란타민 투과를 상당히 향상시킨다. PN159는 높은 세포 생존도 및 낮은 세포독성으로 측정된 바와 같이, 막에서의 세포들을 손상시키지 않고 상피막을 가로질러 TER을 잠정적으로 낮추는 것으로 실증되었다. 그러므로 PN159는 생체 외 모델들을 이용하여 여기에 실증된 동일한 메커니즘을 통해 생체 내 상의 갈란타민 및 다른 작은 분자 약제들의 생체 이용도를 향상시키는 대표적인 펩티드이다. PN159는 또한 더 높은 농도에서 갈란타민의 투과를 향상시킬 것이라고 더 예상된다.
화학적 안정성
PN159의 화학적 안정성은 치료적으로 적절한 저장 조건 하에서 결정되었다. HPLC 방법을 나타내는 안정성이 채용되었다. 용액들(50 mM)은 다양한 pH(4.0, 7.3, 및 9.0) 및 온도(5 ℃, 25 ℃, 35 ℃, 40 ℃, 및 50 ℃) 조건들에서 저장되었다. pH 4의 표본들은 10 mM 시트르산 완충제를 포함하였다. pH 7.3 및 9.0의 표본들은 10 mM 완충제를 포함하였다. 대표적인 저장 안정 데이터(아레니우스 플롯 포함)가 도 6에 묘사된다. 도시된 바와 같이 PN159는 낮은 온도와 pH에서 화학적으로 매우 안정하였다. 예를 들어, 5 ℃ 및 pH 4.0 또는 pH 7.3에서, 6 개월 저장하는 동안 실질적으로 PN159의 100 %로 회복이 있었다. 저장 온도가 25 ℃로 높아지면, 6 개월 후에, pH 4 또는 pH 7에서는 표본에 대한 천연 PN159가 각각 7 % 및 26 %의 감소가 있었다. pH 9 및/또는 상승된 온도, 예컨대 40 내지 50 ℃에서 PN159의 급속한 열화(deterioration)가 뒤따랐다. 4.0 내지 7.3의 pH 범위 및 냉동 내지 대기 상의 온도 범위는 비강내 제형들에 대하여 매우 적절하다. 그러므로, 이러한 데이터는 PN159는 IN 제형들에 적절한 저장 조건 하에서 화학적 일체성을 유지할 수 있다는 것을 지지한다. 시간 대 투과되는 약물의 속도에서 주목할 만한 증가가 있었다. 이러한 데이터는 표 6에 제시된 투과율 상수(Papp)를 계산하는 데 사용되었다.
생체 외 조직 모델을 이용하여 측정된 Papp
약제 제형 [PN159](μM) Papp(㎝/s) 상대적 Papp
갈란타민 40 mg/mL, pH 5.0 0 2.1 x 10-6 1.0
25 5.1 x 10-6 2.4
50 6.2 x 10-6 3.0
100 7.2 x 10-6 3.4
칼시토닌 1 mg/mL, pH 3.5 0 9.7 x 10-8 1.0
25 2.2 x 10-6 23.
50 3.3 x 10-6 34.
100 4.6 x 10-6 47.
PTH1 -34 1 mg/mL, pH 4.5 0 1.1 x 10-7 1.0
25 3.4 x 10-7 3.0
50 4.9 x 10-7 4.5
100 4.3 x 10-7 3.9
PYY3-36 1 mg/mL, pH 7.0 0a 1.3 x 10-7 1.0
25 1.6 x 10-6 12.
100 2.2 x 10-6 17.
apH는 5.0 이었다.
PN159가 없는 경우, 갈란타민에 대한 Papp는 약 2.1 x 10-6 cm/s이었다. 25, 50, 및 100 mM PN159가 존재하는 경우, Papp는 각각 5.1 x 10-6, 6.2 x 10-6, 및 7.2 x 10- 6 이었다. 따라서, PN159는 본 모델 저분자량 약제의 Papp에서 2.4- 내지 3.4-배 증가를 부여하였다.
저분자량 화합물들의 경점막 제형들에 대한 PN159의 효용성(utility)을 입증하면, 이렇게 관찰한 것들은 예컨대, 치료적 펩티드들 및 단백질들과 같은 더 큰 분자들에 대하여 외삽하여 추정될 수 있는지의 여부를 구별하는 것이 중요하였다. 본 목적을 위하여, 25, 50, 및 100 mM PN159의 부존재 및 존재시에 모델 치료 펩티드로서 연어 칼시토닌에 대한 생체 외 조직 연구들을 수행하였다. PN159가 존재하지 않을 때에는, 칼시토닌에 대한 상기 Papp는 약 1 x 10-7 cm/s이었는데, 추측하건대 분자량의 차이로 인하여 갈란타민에 대한 크기보다 약 한 차수 정도 더 낮은 값이었다. 상기 데이터는 PN159의 존재시에 칼시토닌 투과에서 칼시토닌 단독으로 있는 경우(표 6)와 비교하여 Papp에서 최대 23 내지 47배 증가한 극적인 증가를 드러낸다.
이렇게 발견한 것들의 일반화를 모색하기 위하여, 두 개의 펩티드들, 즉 인간 부갑상선(parathyroid) 호르몬 1-34(PTH1 -34) 및 인간 펩티드 YY 3-36(PYY3 -36)을 추가로 PN159의 부존재 및 존재시의 생체 외 모델에서 시험하였다. PN159가 부재시에, 이러한 두 개의 펩티드들의 Papp는 칼시토닌에 대한 것과 일치하였다. PTH1 -34의 경우, PN159가 존재하면 Papp에서 약 3-5 배 증가되었다. PYY3 -36이 PN159가 존재할 때 제형되면, Papp는 약 12- 내지 17-배 증가되었다. 이러한 데이터는 PN159가 경점막 약물 전달의 향상에 대한 효용성을 가진다는 우리가 발견한 것의 일반화를 확인한 것이다.
실시예 6
PN159 의 D-아미노산 버젼들
표 7에 수록된 D-아미노산 치환된 PN159 펩티드들은 합성되어 정제되고 상기 예들에서 설명된 방법들을 이용하여 TER 및 투과성을 향상시키는 그 능력에 대하여 시험되었다.
D-아미노산 치환들
펩티드 서열 설명 TER(x)/TER(159)+/- SEM Perm(x)/Perm(159)+/- SEM
PN159 KLALKLALKALKAALKLA-amide (서열목록 34) 모델 양친매성 펩티드 1.00 +/- 0.14 1.00 +/- 0.13
PN393 NH2-klalklalkalkaalkla-amide (서열목록 35) 모든 D-치환된 1.06 +/- 0.00 1.02 +/- 0.16
PN407 NH2-LKlLKkLlkKLLkLL-amide (서열목록 36) D-치환체가 풍부한 류신 및 라이신 1.08 +/- 0.01 1.20 +/- 0.05
PN434 NH2-KLaLKlALkAlkAALkLA-amide (서열목록 37) D-치환된 0.12 +/- 0.01 0.02 +/- 0.00
PN408 NH2-alklaaklaklalklalk-amide (서열목록 38) PN159 역순(retro-inverso) 1.05 +/- 0.01 1.16 +/- 0.07
PN407은 투과성에 대하여 작지만 통계적으로 의미있는 개선점을 보인다. 모든 D 및 PN159의 역순 형태들은 TER 회복의 감소됨을 보였는데, 이는 생체 내 전달에 유용할 수 있는 더 오래 지속된 TER 감소 효과를 제시한다. 무작위적인(random) D 치환(PN434)은 TER 감소 및 투과율 향상 양쪽 모두에 대하여 비활성(null activities)을 초래할 수 있다.
실시예 7
PN159 길이 변화들
표 8에 수록된 길이 변화를 보인 PN159 펩티드들을 합성하고 정제하며, 상기 예들에서 설명된 방법들을 이용하여, TER 및 투과성을 향상시키는 능력에 대해 시험하였다.
다른 크기들
펩티드 서열 설명 TER(x)/TER(159) +/- SEM* Perm(x)/Perm(159) +/- SEM*
PN159 NH2-KLALKLALKALKAALKLA-amide 모델 펩티드 1.00 +/- 0.14 1.00 +/- 0.13
PN417 NH2-KLALKLALKALKAA-amide (서열번호 39) 단축된 14 aa 0.19 +/- 0.01 0.04 +/- 0.01
PN418 NH2-KLALKLALKALKAALK-amide (서열번호 40) 단축된 16 aa 1.05 +/- 0.05 0.64 +/- 0.08
PN419 NH2-KLALKLALKALKAALKLALK-amide (서열번호 41) 연장된 20 aa 1.23 +/- 0.01 0.74 +/- 0.13
PN420 NH2-KLALKLALKALKAALKLALKLA-amide (서열번호 42) 연장된 22 aa 0.77 +/- 0.05 0.24 +/- 0.05
PN421 NH2-KLALKLALKALKAALKLALKLALK-amide (서열번호 43) 연장된 24 aa 0.74 +/- 0.11 0.17 +/- 0.06
PN422 NH2-KLALKLALKALKAALKLALKLALKAL-amide (서열번호 44) 연장된 26 aa 0.47 +/- 0.07 0.07 +/- 0.01
*다중 반복으로부터 평균 값
상기 결과들은 PN159의 길이가 TER 감소 및 향상된 투과성 활성에 중요하다는 것을 보여준다. PN 159를 20개의 아미노산으로 연장시키면 TER 감소 효과가 증가하였지만 투과성 효과는 감소시켰다. TER 회복은 더 느려진다. PN159를 16 아미노산으로 단축시키면 TER 감소에는 아무런 효과가 없지만 감소된 투과성 효과를 보인다. PN159를 14개의 아미노산으로 단축시키면 투과율을 극적으로 감소시키는데, 이는 PN159의 길이가 투과성에 결정적이라는 것을 제시한다. 투과성 효과에 반하여, TER 감소에 미치는 PN159 길이의 효과는 좀 더 점진적이다.
실시예 8
PN159 에서의 트립토판 및 아르기닌 치환들
표 9에 수록된 아미노산 치환을 가진 PN159 펩티드들을 합성하고 정제하며, 상기 예들에서 설명된 방법들을 이용하여, TER 및 투과성을 향상시키는 능력에 대해 시험하였다.
아미노산 치환체들
펩티드 서열 명칭 상대적 TER 감소 상대적 투과율
PN159 NH2-KLALKLALKALKAALKLA- amide 모델 펩티드 1.0 1.0
PN394 NH2-RLALRLALRALRAALRLA- amide (서열번호45) 아르기닌 0.7 0.1
PN395 NH2-RLAWRLALRALRAALRLA- amide (서열번호 46) 아르기닌 및 단일 트립토판 0.8 0.2
PN0425 KLAWKLALKALKAALKLA- amide (서열번호 47) 단일 트립토판 1.0 1.2
PN0427 KLAWKLALKALKAAWKLA- amide (서열번호 48) 두 개의 트립토판 1.0 1.0
PN0428 KLAWKLAWKALKAAWKLA- amide (서열번호 49) 세 개의 트립토판 0.7 1.0
PN406 NH2-LKLLKKLLKKLLKLL- amide (서열번호 50) 류신 및 라이신 풍부 0.9 0.6
PN407 NH2-LKlLKkLlkKLLkLL-amide D-치환체가 풍부한 류신 및 라이신 1.1 1.2
PN443 NH2-LKTLATALTKLAKTLTTL- amide (서열번호 51) 트레오닌 0.3 0.1
PN448 NH2-KLALKLALKNLKAALKLA- amide (서열번호 52) 아스파라긴 0.4 0.0
상기 결과들은 아르기닌 구아니디움 헤드그룹(arginine guanidinium headgroup)은 라이신 및 히스티딘 보다 더 효과적이라는 것을 보여준다. 트립토판은 물-막 계면1에서의 우선적인 아미노산이다. PN407은 투과율에 대하여 작지만 통계적으로 의미있는 개선점을 보인다. 라이신을 아르기닌으로 교체하면 투과성은 감소시키지만 TER 감소에 대해 거의 영향을 주지 않는데, 이는 라이신의 투과성에서의 중요성을 제시해 준다. 10개의 아미노산 상의 알라닌을 아스파라긴으로 단독 교체하면 투과성을 제거하는 데, 이는 PN159 활성에 대해 알파 나선의 중요성을 제시해 준다.
PN159 에서의 소수성 변화들
표 10에 수록된 아미노산 치환을 가진 PN159 펩티드들을 합성하고 정제하며, 상기 예들에서 설명된 방법들을 이용하여, TER 및 투과성을 향상시키는 능력에 대해 시험하였다.
소수성 국면들
펩티드 서열 설명 TER(x)/TER(159 ) +/- SEM* Perm(x)/Perm(15 9 )+/- SEM*
PN159 NH2-KLALKLALKALKAALKLA- amide 모델 펩티드 1.00 +/- 0.14 1.00 +/- 0.13
PN424 NH2-KALKLKAALALLAKLKLA- amide (서열번호 53) 비-양친매성 0.59 +/- 0.07 0.20 +/- 0.04
PN441 NH2-KLAAALLKKAKKLAAALL- amide (서열번호 54) 200°소수성 국면 0.54 +/- 0.04 0.35 +/- 0.04
PN442 NH2-KALAALLKKAAKLLAALK- amide (서열번호 55) 180°국면 0.93 +/- 0.03 0.81 +/- 0.03
PN444 NH2-KALAALLKKLAKLLAALK- amide (서열번호 56) 180°국면 0.82 +/0.05 0.41 +/- 0.08
*다중 반복으로부터 평균 값
PN159는 소수성 국면들을 280°가진다. 상기 결과들은 상기 소수성 국면들의 감소는 PN159 활성의 감소를 일으킬 수 있음을 보여준다. PN159의 양친매성은 또한 그 활성에 대해 중요하다.
생체 외 방법들 및 프로토콜들
각각의 TJMP를 경상피 전기 저항(TER), TER 회복, 세포독성(LDH), 및 표본 투과(EIA)에 대하여 시험하였다. 각각의 시험에 대한 세포 배양 조건들 및 프로토콜들을 하기에 자세히 설명한다.
실시예 10
생체 외 방법들 및 프로토콜들
밀착 연접 조절 펩티드들 또는 TJMP들은 상피 세포들 사이에 개구부들을 발생시켜 상피의 장벽 기능을 감소시키는 효과를 지닌 밀착 연접들의 일체성에 손상을 줄 수 있는 펩티드들이다. 밀착 연접 일체성의 상태는 인간 비강 상피 조직 모델 시스템을 가로지르는 전기 저항 수준 및 표본 투과의 정도를 측정함으로써 생체 외에서 시험될 수 있다. 전기 저항의 감소 및 향상된 투과성은 상기 밀착 연접이 손상되어 상피 세포들 사이에 개구부가 발생했음을 제시한다. 사실상, TER 감소라고 칭하는 조직막을 가로질러 전기 저항에서의 측정 감소를 유도하고, 조직막을 통해 작은 분자의 향상된 투과를 촉진시키는 펩티드들은 TJMP들로 분류된다. 또한, TJMP들에 대한 세포 독성의 수준도 산정하여 이러한 펩티드들이 점막 표면을 가로지르는 약물 전달, 예를 들어 비강내(IN) 약물 전달에서 밀착 연접 조절 펩티드들로서 기능할 수 있는지의 여부를 결정한다.
본 발명의 대표적인 펩티드들을 스크린하는 데 사용된 시험법들은(실시예 25의 표 23) 본 예에서 설명된다. 이러한 시험법들은 경상피 전기 저항(TER), 세포독성(LDH), 및 표본 투과를 포함한다. 사용된 시약들과 세포 배양 조건들도 설명된다.
표 11은 후속 예들에 사용된 표본 시약들을 도시한 것이다.
표본 시약들
시약 등급 제조자 도시, 주 로트 # 분자량
1X DPBS++ TC Gibco/InvitrogenTM Carlsbad, CA 1213061
Sterile, Nuclease-Free Water AmbionTM Austin, TX 065P053618A
Fluorescent Dextran Molecular Probes/InvitrogenTM Carlsbad, CA 111105 3000
Air-100 MediumTM TC MatTekTM Ashland, MA 11110565
Air-196 insertsTM MatTekTM Ashland, MA 7118
CytoTox 96 AssayTM PromegaTM Madison, WI 210634
TC = 조직 배양(tissue culture)
조직 배양들
상기 EpiAirwayTM 시스템은 기도를 라이닝하는 위중층 상피의 모델로서 MatTek Corp (Ashland, MA)에 의해 개발되었다. 상기 상피 세포들은 다공성 막-바닥 세포 배양 삽입물 상의 공기-액체 계면에서 성장하여 상기 세포들의 분화로 고도로 극성화된 형태를 가지게 되었다. 상기 첨부 표면은 미세 융모가 많은 미세구조로 섬모로 되어 있으며 상피조직이 점액을 생성한다(뮤신(mucin)의 존재는 면역블로팅(immunoblotting)에 의해 확인되었다). 상기 세포들은 선적되기 약 3 주일 전에 공장에서 상기 삽입물들 상에 플레이트된다.
실험들이 개시되기 전날에 EpiAirwayTM 배양 막들을 수취하였다. 이들은 페놀 레드가 없으며 하이드로코티존-없는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에 선적된다. 상기 세포들은 섬모가 있고 위중층화 되어 있으며, 폴리카보네이트 필터 시스템을 구성하는 Millipore Multiscreen Caco-2 96-웰 시험 시스템 상의 콘플루언시(confluency)까지 성장된다. 상기 인서트 시스템(insert system)은 수령 즉시, 4 ℃에서 개봉하지 않은 상태로 저장되고/되거나 사용전 24 시간 동안 37 ℃/5 % CO2에서 웰당 250 μl 염기성 배지(페놀 레드가 없으며 하이드로코티존-없는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM))에 배양하게 될 것이다.
이러한 모델 시스템을 사용하여 TJMP들의 효과를 평가하여 TEER을 조절하고, 세포독성에 영향을 주고 상피 세포 단일층의 투과를 향상시킨다.
세포계 MatTek Corp. (Ashland, MA)는 정상적인, 인간-유도된 기관/기관지 상피 세포들의 원천이 될 것이다(EpiAirwayTM Tissue Model). 상기 세포들은 투명한 친수성 테플론(PTFE)으로 구성된 Millipore Millicell-CM 필터들 상의 콘플루언시까지 성장되는 삽입물들로 제공된다. 수령받는 즉시, 막들은 사용전 24-48 시간 동안 37 ℃/5 % CO2에서 1 ml 염기성 배지(페놀 레드가 없으며 하이드로코티존-없는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM))에 배양된다. 삽입물들은 각각의 회복일 동안 공급된다.
Madin-Darbey 개 신장 세포들(MDCK), 인간 장 상피 세포들(Caco02), 및 인간 기관지 상피 세포들(16HBE14o-)을 Millipore로부터 구매한 Multi-Screen Caco-2 96-well 삽입물들에 도입시킨다. 이러한 세포들은 단일층으로 그리고 EpiAirway 상피 세포과 유사한 조건 하에서 성장되었다.
펩티드 합성
NovaBiochem TGR 수지를 이용한 50 umol 스케일의 Rainin Symphony synthesizer 상에서 펩티드 합성을 수행하였다. 10 분 동안 DMF 내의 20 % 피페리딘(piperidine)을 2 회 처리하여 탈보호(deprotection)를 수행하였다. 탈보호 후에 상기 수지를 5 % 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)을 포함하는 10 mL DMF로 1 회(30 초) 그리고 10 mL DMF로 4 회(30 초)로 세척하였다. DMF 내에 5-배 과량의 Fmoc 아미노산을 반응 용기로 옮겨 넣어 결합(couplings)을 수행하고 이후 6.25-배 과량 N-메틸모르폴린(methylmorpholine) 및 5-배 과량의 HCTU를 포함하는 동일한 부피의 활성화제(activator)의 전달이 뒤따른다. 전체 합성을 통해 40 분의 결합 시간을 사용하였다. 제1 결합 반응 후에 제2 결합 단계를 시작하기 전 상기 수지를 DMF 10 mL로(30 초) 2 회 세척하였다. 페질화된 펩티드들에 대해, 펩티드 합성이 완료되면 상기 N-말단 Fmoc 그룹을 제거하고 DMF 내에 2 당량(equivalent)의 O-(N-FMO-2-아미노에틸)-O'-(2-카르복시에틸)-언데카에틸렌글리콜(undecaethylenenglycol)을 상기 반응 용기에 수동으로 첨가한다. 수동식으로 하는 동안, 활성화제 용액 2 당량을 상기 반응 용기에 전달하고 상기 결합이 진행하도록 하룻밤 동안 둔다. 일반적으로, 97 %를 초과하는 결합 효율을 달성하였고 임의의 미반응 펩티드는 아세트산 무수화물(acetic anhydride)로 캡핑(capped)하였다.
2.5 % TIS, 2.5 % 물을 포함하는 10 mL TFA를 전달하여 개별 반응 용기들 상에서 분해(cleavage)를 수행하고 이어서 3 시간 동안 질소로 천천히 교반하였다. 상기 분해 용액을 원추형 튜브들에 자동으로 모아서, 풀(pool)을 이루고 감압 하에서 증발시켜 부피를 줄였다. 그렇게 해서 나온 용액을 과량의 냉 에테르로 분쇄하였고(triturate), 여과시켜 냉 에테르로 광범위하게 세척하였다. 이를 건조시킨 후에, 미정제 펩티드를 Millipore water 내에 녹이고 동결건조시켰다.
FITC ( 플루오르세인 -5- 이소타이오사이안산염 ( isothiocyanate ))- 덱스트란 투과 시험
FITC로 표지된 분자량 3000의 덱스트란(FD3)을 사용하여 상피 세포 단일층 투과에 미치는 개별 TJMP의 효과를 평가하였다. 조직 삽입물 플레이트들을 염기성 배지로서 200 μl DPBS++를 포함하는 96-웰 리시버 플레이트에 옮겨 넣었다. 각각의 조직 배양 삽입물의 첨부 표면을 단일 시험 제형(시험 제형에 대한 상세한 사항은 실시예 25의 표 24 참조)의 20 μl 표본과 함께 진탕 교반기(shaker)(~100 rpm) 상에 37 ℃의 암실에서 한 시간 동안 배양하였다. 상기 1-시간 배양 후, 바닥에 깔린 염기성 배지 표본들을 각각의 조직 배양 삽입물로부터 추출하여 FD3 레벨을 형광 현미경으로 정량화할 때까지 상온 암실에 임시로 저장하였다. FD3 측정에 대해, 150 μl 염기성 배지 표본을 흑색의 청정한 바닥 96-웰 플레이트로 옮겨 넣었다. 485/20 에서의 여기 상태 이후에 528/20에서의 형광 방출을 Biotek Instruments의 FLx800 형광 플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다.
투과 정도를 하기와 같이 계산하였다:
Figure 112008014196339-PCT00002
Figure 112008014196339-PCT00003
투과 정도에 대한 상기 식에 사용된 용어는 하기와 같이 정의된다:
Cb: 기저측부 농도(Basolateral concentration)
Ca: 첨부 농도(Apical Concentration)
Vb: 기저측부 부피(Basolateral Volume)
Va: 첨부 부피(Apical Volume)
SA: 여과 표면적(Filter Surface Area)
dt: 경과 시간(Elapsed Time)
각각의 조직 삽입물을 1 ml MatTek 염기성 배지를 포함하는 개별 웰에 둔다. 상기 삽입물들의 첨부 표면 상에, 시험 제형 25 μl 를 연구 설계에 따라 적용하고, 상기 표본들을 37 ℃에서 1.5 시간 동안 진탕 교반기 상에 넣는다. FITC-라벨된 덱스트란 용액을 삽입물들에 첨부으로(apically) 첨가하고 배양 기간 후에 기저측부 배지로부터 형광 측정을 실시한다. FITC-덱스트란의 농도는 세포들에 적용되는 시작 물질의 퍼센트로 표시된다. 분자량 3000의 FITC로 표지된 덱스트란을 이용하여 개별 TJMP 투과율에 미치는 카고(cargo) 크기 제한을 산정하였다. 다양한 크기의 FITC-표지된 덱스트란들은 크기 제한 연구의 수행에 이용가능하다는 것이 중요하다.
경상피 전기 저항( TER ) 및 TER 회복
전극 리드들(electrode leads)을 갖춘 EVOM 경상피 볼토미터(World Precision Instruments, Sarasota, FL)에 연결된 Endohm-12 Tissue Resistance Measurement Chamber를 이용하여 TER 측정을 수행한다. 보정 점검 전에 전원을 끈 채로 MatTek 배지에서 적어도 20 분 동안 상기 전극들과 조직 배양 블랭크 삽입물의 평형을 유지시킨다. 백그라운드 저항은 Endohm 조직 챔버 내에서 1.5 ml 배지와 함께 그리고 블랭크 삽입물 내에서는 300 ㎕ 배지와 함께 측정된다. 상부 전극을 삽입물 막의 상부 표면에 가까이 두지만, 접촉은 하지 않도록 조절한다. 상기 블랭크 삽입물의 백그라운드 저항은 약 5 내지 20 ohms 정도이어야 한다. 각각의 TER 측정에 대해, MatTek 배지 300 ㎕를 상기 삽입물에 첨가한 후에 상기 Endohm 챔버 내에 둔다. 모든 TER 값들은 조직의 표면적 함수로 기록된다.
TER은 하기와 같이 계산되었다.
TER = (RI - Rb)x A
여기서 RI는 막이 있는 삽입물의 저항이며, Rb는 블랭크 삽입물의 저항이며, A는 막의 면적(0.6 ㎠)이다. 상기 기준치(기준 = 약 1000 ohms-㎠; 100으로 정상화시킴)에 대한 TER 값의 감소는 세포막 저항의 감소 및 점막 상피 세포 투과성의 증가를 나타낸다.
TER 회복에 대해, TER은 처리 후 1, 3, 5, 및 21 시간에 측정되었다. 퍼센트 TER은 하기와 같이 계산되었다:
% TER = (TER Tpost treatment/TER T0)/(대조군 배지에서의 TER Tpost treatment/TER T0).
일정한 실시예들에서, 전극 리드들을 갖춘 REMS Autosampler를 이용하여 TER 측정들을 실시하였다. 보정 점검 전에 전원을 끈 채로 MatTek Air-100TM 배지에서 적어도 20 분 동안 상기 전극들과 조직 배양 블랭크 삽입물의 평형을 유지시킨다. 상기 삽입물 시스템의 배경 저항은 블랭크 삽입물 플레이트의 다중 측정에 의하여 수립되고 동일한 값이 상기 플랫폼 상의 각각의 시험에 대해 사용되었다. 0 시간 측정(TER0)은 시험 제형을 지닌 삽입물들의 배양 전에 측정되었다. 상부 전극은 상기 삽입물막의 상부 표면에 근접하지만, 접촉은 하지 않도록 조절될 것이다. 상기 블랭크 삽입물의 배경 저항은 약 5 내지 20 ohms 정도 이어야 한다. 각각의 TER 측정에 대하여, MatTek Air- 100TM 배지 100 μl를 상기 삽입물에 첨가하였고 염기성 웰에 250 μl를 두고, 이후 Endohm 챔버에 둔다. 모든 값들은 조직의 표면적의 함수로 기록된다. 저항은 Ohms*㎠ 및 퍼센트 원본(original) TER 값의 양쪽 모두로 표시되었다.
TER 값들은 하기와 같이 계산되었다:
공칭 저항값, Ohm*㎠ = (TERt - blank)*0.12
Figure 112008014196339-PCT00004
TER 계산에 대한 공식의 용어들은 하기와 같이 정의된다:
TER0: 0 시간에서의 TER 측정
TERt: 시험 제형 배양 후의 t 시간에서 측정된 TER 측정
blank: 배경 저항 측정
대조군 값에 대한 TER 값의 감소는 세포막 저항의 감소 및 점막 상피 세포 투과성에의 증가를 나타낸다.
세포독성( LDH 시험)
세포 사망량은 CytoTox 96 Cytotoxicity Assay Kit (Promega Corp., Madison, WI)을 이용하여 세포들로부터 젖산염 탈수소화제(LDH)의 손실을 측정하여 분석될 것이다. 50 마이크로리터의 표본을 96-웰 분석 플레이트들로 옮겨 놓을 것이다. 신선하고, 세포-없는 배양 배지를 블랭크로 사용할 것이다. 기질 용액 50 μl를 각각의 웰에 첨가하였고 상온 암실에서 30 분 동안 플레이트들을 배양할 것이다. 배양 후, 정지 용액 50 μL를 각각의 웰에 첨가하였고 광학 밀도 플레이트 판독기 상에 490 ㎚에서 플레이트들을 판독하였다. 기저측부 배지로의 LDH 방출 측정은 표본들의 상대적 세포독성을 나타낸다. 0.3 % 옥틸페놀폴리(에틸렌글리콜에테르)x(TritonX-100)를 지닌 대조군 삽입물의 100 퍼센트 용균은 LDH 값들이 전체 용균의 퍼센티지로 표시되게 한다.
또한, 세포독성은 WST-1 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 상기 WST-1 분석은 미토콘드리아 대사 활성도에 근거한 세포 생존도를 측정한다. 펩티드 처리, 세척, 및 10 분의 후 처리에서 TER 측정 후에 세포 단일막의 첨부면이 37 ℃에서 4 시간 동안 WST-1 시약(Roche)과 함께 배양되었다. 첨부 세포 상청액들은 마이크로 판독기를 이용하여 OD 450 nm에서 측정되었다. % 값들 = 표본OD450/배지 대조군OD450
일정한 실시예들에서, 세포 사망량은 CytoTox 96 Cytotoxicity Assay Kit (Promega Corp., Madison, WI)을 이용하여 세포들로부터 첨부 배지로의 젖산염 탈수소화제(LDH)의 방출을 측정하여 분석되었다. 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석된 1 % 옥틸페놀폴리(에틸렌글리콜에테르)x(Triton X-100TM)은 배양된 세포들에서 100 % 용균을 발생시키고 여기에서는 LDH 시험에 대한 양성 대조군으로 작용하였다. 일 시험 제형 (시험 제형들을 상세히 살펴 보려면 실시예 25의 표 24 참조)으로 한 시간 동안 배양한 후, 각각의 삽입물의 총 액체 부피는 배양 배지가 있는 200 μl의 최종 부피가 되었다. 첨부 배지를 100 μl 부피로 맞춘 다중채널 피펫으로 4 회 피펫팅하여 혼합하였다. 혼합 후에, 각각의 삽입물의 첨부 측면으로부터 100 μl 표본을 새로운 96-웰 플레이트로 이송하였다. 첨부 배지 표본들을 플레이트 봉인기로 봉인시켜 동일자 분석을 위해서 상온에서 저장하거나 익일자 분석을 위해 4 ℃에서 밤새 저장하였다. LDH 수준들을 측정하기 위하여, 상기 100 μl의 첨부 표본 5 μl를 새로운 96-웰 플레이트에 있는 45 μl DPBS에서 희석시켰다. 신선한 무세포 배양 배지를 블랭크로 사용할 것이다. 기질 용액 50 마이크로리터를 각각의 웰에 첨가하여 직사 광선으로부터 벗어난 상온에서 30 분 동안 배양하였다. 30 분 배양 후에, 정지 용액 50 μl를 각각의 웰에 첨가하였다. Biotek Instruments 사의 uQuant 흡광도 플레이트 판독기로 490 ㎚에서 광학 밀도를 측정하였다. 상기 첨부 배지로 LDH 방출을 측정하면 표본들의 상대세포독성을 얻는다. 각각의 시험 제형에 대한 퍼센트 세포독성을 개별 시험 제형의 측정된 흡광도로부터 PBS 대조군 (LDH 방출의 기저 수준)의 측정된 흡광도를 차감하고 그 값을 1 % Triton X-100TM 양성 대조군에 대한 측정된 흡광도로 나눈 다음, 100을 곱하여 계산하였다.
퍼센트 세포독성의 계산에 사용된 공식은 하기와 같다:
삼투몰농도(osmolality)
Advanced Instruments Inc. (Norwood, MA)의 Model 20200으로 표본들을 측정하였다.
Figure 112008014196339-PCT00005
실시예 11
상피 밀착 연접을 조절하고 생체 외 상피 세포층 투과를 향상시키는 펩티드들
표 12는 밀착 연접 단백질들을 조절하고 TER 분석 및 투과 반응속도론으로 측정된 생체 외 상피 세포층 투과를 향상시키는 11 가지 펩티드들의 아미노산 서열을 보여준다. 본 예들의 목적을 위해, 유사한 활성으로 인하여 PN27과 PN28 양쪽을 대표하는 것으로 PN27을 선택하였다.
펩티드 아미노산 서열
PN159 NH2-KLALKLALKALKAALKLA-amide
PN161 NH2-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-amide (서열번호 63)
PN202 NH2-LLETLLKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHRR-amide (서열번호 64)
PN27 NH2-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-amide (서열번호 65)
PN28 NH2-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-amide (서열번호 66)
PN58 NH2-RQIKIWFQNRRMKWKK-amide (서열번호 67)
PN73 NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide (서열번호 68)
PN228 NH2-KLWSAWPSLWSSLWKP-amide (서열번호 69)
PN250 NH2-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-amide (서열번호 70)
PN283 Maleimide-GLGSLLKKAGKKLKQPKSKRKV-amide (서열번호 71)
PN183 NH2-KETWWETWWTEWSQPGRKKRRQRRRRPPQ-amide (서열번호 72)
실시예 12
TER을 감소시키는 밀착 연접 조절 펩티드들
본 예는 TER 감소에 의해 분석된 생체 외 상피 세포 단일막에서의 밀착 연접 단백질들을 조절하는 다양한 펩티드들의 효능을 평가하였다. 각각의 TJMP에 대한 EpiAirway 상피 세포들에서 실시된 실험들로부터 얻은 TER 데이터의 요약을 표 13에 제시한다. 이 표에서 강조된 박스들은 시험된 농도 범위 내에서의 TJMP에 대하여 관찰된 가장 높은 TER 감소를 나타낸다.
펩티드 1000 μM 500 μM 250 μM 125 μM 100 μM 50 μM 25 μM 10 μM 2.5 μM 1 μM
PN159 94% 89% 79% 54%
PN161 84% 73% 43% 11%
PN202 95% 95% 57% 3%
PN27 94% 91% 81%
PN283 92% 86% 39%
PN250 84% 79% 58% 17% 3%
PN228 82% 9%
PN73 83% 38% 8%
PN58 88% 64% -6%
PN183 55% 41% 25%
PN159, PN202, PN27, 및 PN283은 90 % 초과하여 TER을 감소시킨 반면에, PN161, PN250, PN228, PN73, 및 PN58은 82 % 내지 88%까지 TER을 감소시켰다. PN28은 도시되지 않지만, 기능적으로 PN27과 동등하다. 최종적으로 PN183은 55 %의 TER 감소가 있었다. 본 데이터는 시험된 모든 TJMP가 생체 외 상피 세포 밀착 연접들을 손상시킬 수 있음을 보여준다.
또한, TJMP들과 처리 후에 EpiAirway 상피 세포층이 회복하는 속도를 측정하기 위하여 TER 회복 분석을 실시하였다. 놀랍게도, 결과는 PN250, PN202, 및 PN161이 시험된 모든 TJMP들 중에 가장 회복 시간이 빠르다는 것을 보여준다. 본 데이터는 상피 세포층에 미치는 TJMP의 효과는 본래 일시적이라는 것을 보여준다.
실시예 13
밀착 연접 조절 펩티드들의 생체 외 투과 반응속도론
본 예에서, EpiAirway 상피 세포 투과를 매개하는 TJMP들의 효능을 밝혀 두었다. 하기 표 14는 각각의 TJMP에 대한 투과 반응속도론의 퍼센트 투과율로 표기한 것을 보여준다. 본 표에서 강조된 박스들은 시험된 농도 범위 내에서의 TJMP에 대하여 관찰된 가장 높은 투과율을 나타낸다.
펩티드 1000 μM 500 μM 250 μM 125 μM 100 μM 50 μM 25 μM 10 μM 2.5 μM 1 μM
PN159 12.5% 6.5% 1.9% 0.6%
PN161 7.1% 2.9% 1.6% 0.3%
PN202 5.9% 2.8% 1.5% 0.2%
PN27 8.4% 7.3% 7.7%
PN283 5.2% 3.9% 0.7%
PN250 4.2% 3.3% 1.7% 0.5% 0.3%
PN228 1.7% 0.2%
PN73 0.8% 0.2% 0.1%
PN58 6.3% 4.5% 0.9% 0.3% 0.3%
PN183 0.6% 0.5% 0.2%
본 데이터는 시험된 모든 TJMP들은 상피 세포 단일막의 생체 외 투과를 향상시킬 수 있다는 것을 보여준다. 일반적으로, 투과의 정도는 TER을 감소시키는 펩티들의 능력과 관계있다.
실시예 14
밀착 연접 조절 펩티드들은 상당한 세포독성을 발생시키지 않는다
본 예는 TJMP들에 노출시킨 후에 상피 세포들에 미치는 세포독성 효과를 평가하였다. 각각의 펩티드와 15 분 및 60 분 처리 후에 LDH 시험을 실시하였다. 모든 경우에, 15 분 처리 후에는 거의 어떠한 LDH 방출도 관찰되지 않았다. 60 분 처리 후, 세포독성 레벨들은 시험된 펩티드들 사이에 변하였지만 수용 가능한 레벨들 내에 있으므로 시험된 모든 펩티드들이 상당한 세포 손상을 발생시키지 않음을 보이고 있다.
실시예 15
밀착 연접 조절 펩티드들에 의한 TER 감소는 시험된 모든 상피 세포 유형들 사이에서 일치한다
EpiAirway 상피 세포 배양 시스템에서 관찰된 TER 결과들이 다른 상피 세포 유형들 MDCK, Caco-2, 및 16HBE14o를 대표하는지의 여부를 결정하기 위하여 세포를 TJMP들로 처리하고 TER에 대해 분석하였다. 모든 경우에, 이러한 세포 유형들로 관찰된 TER 결과들은 EpiAirway 상피 세포와 관찰된 TER 결과들과 일치하였는데, 이는 이러한 TJMP들이 모든 상피 세포 유형들 사이에서 TER을 감소시키는 능력을 가진다는 것을 보여준다.
실시예 16
성과에 기초하여 순위를 매긴 밀착 연접 조절 펩티드들
표 15에 도시된 바와 같이 투과율 레벨, TER 값, TER 회복 속도, 및 세포독성에 따라 9개 TJMP들의 순위를 매겨 4 개의 다른 성과층들(performance tiers)로 분류하였다. PN183 및 PN28은 표 15에 포함되지 않았다. 하기 표는 각각의 TJMP의 최적 농도 (즉, 가장 큰 TER 감소 정도는 가장 높은 투과율 레벨과 관련되어 있고 상당한 세포독성도 보이지 않았다) 및 펩티드로 EpiAirway 상피 세포들의 15 분 처리 후 및 펩티드로 EpiAirway 상피 세포들의 60 분 처리 후의 해당 퍼센트 투과율을 요약한 것이다. 또한, 15 분 및 60 분 처리에 대한 LDH 값들(세포독성)이 각각의 펩티드에 대하여 도시된다. TER 회복도 도시된다. TER 회복 속도는 기울기 값과 직접 관련되어 있다(즉, 기울기 값이 클수록 빠른 TER 회복과 관련되어 있다).
펩티드 최적 농도 %Perm15 %Perm60 LDH15 LDH60 TER 회복 기울기
TierI PN161 100 μM 2.82% 7.42% 0.0017 0.01 74.81 높은 투과율
PN159 25 μM 2.72% 8.01% 0.007 0.002 65.44 낮은 세포독성,빠른 회복
TierII PN27 250 μM 3.12% 7.31% 0.0056 0.035 62.19 높은 투과율
PN228 500 μM 2.67% 6.99% 0.0063 0.046 49.59 중간 정도의 세포독성
TierIII PN250 500 μM 1.99% 5.19% 0.0016 0.031 88.94 더 낮은 투과율
PN202 100 μM 1.39% 4.44% 0.0011 0.02 78.52 빠른 회복, 낮은 세포독성
TierIV PN58 500 μM 0.60% 5.66% 0.0007 0.02 61.24 낮은 투과율
PN73 500 μM 0.23% 2.20% 0.0006 0.005 65.29 가장 늦은 회복
PN283 1000 μM 1.06% 4.99% 0.0007 0.032 62.32 낮은 세포독성
실시예 17
밀착 연접 조절 펩티드들은 상피 세포 단일막을 가로질러 FITC - 덱스트란 (분자량 4000)의 투과를 향상시켰다.
본 예에서, 각각의 TJMP가 존재시에 FITC-덱스트란 MW4000의 투과 반응속도론을 측정하기 위한 연구를 실시하였다. 본 실험은 투과가 상피 세포 단일막과 펩티드를 함께 배양하는 배양 시간에 의존하는지 여부 및 투과가 카고 사이즈(cargo size)에 의존하는지의 여부를 평가하였다. 세포들을 TJMP 및 FITC-덱스트란(분자량 4000) 과 15 분 처리 후 세포 투과율을 평가하였고 60 분 처리 후에도 평가하였다(도 7). PYY 제형은 양성 대조군으로 사용되었고 인산염 완충 식염수(PBS)는 음성 대조군으로 사용되었다. 펩티드들은 TER 감소가 가장 큰 정도는 투과율이 가장 높은 레벨과 관련이 있고 상당한 세포독성을 보이지 않은 농도에서 시험되었다.
동일한 TJMP에 대한 60 분 처리는 15 분 처리 보다 투과율이 상당히 더 높은 정도를 보였다. 놀랍게도 PN161, PN127, 및 PN228은 PN159(약 7.5 %)에 해당하는 투과 레벨을 보였다. TJMP PN250, PN283, PN202, PN58은 세포와의 60 분 배양 후에 약 5 % 투과율을 달성하였는데, 이는 PN161, PN127, PN228 및 PN159가 달성한 투과율에 못 미치는 것이다. 이러한 데이터는 시험된 모든 TJMP들은 FITC-덱스트란 MW4000의 투과를 향상시킬 수 있으며 이러한 향상은 펩티드가 얼마나 오랫동안 상피 세포층과 접촉하느냐에 의존한다는 것을 보여준다.
앞선 실험들은 시험된 TJMP들이 상피 세포 단일막의 생체 외 투과를 향상시킬 수 있다는 것을 실증한다.
실시예 18
밀착 연접 조절 펩티드에 의한 생체 외 향상된 투과는 생체 내에서 관찰된 향상된 투과와 강하게 관련되어 있다
생체 내 EpiAirway 상피 세포 모델 시스템에서 관찰된 TJMP 투과 반응속도론이 동일한 TJMP에 대하여 관찰된 생체 내 약동학 데이터와 관련되어 있는지의 여부를 결정하기 위하여 선형 회귀 분석을 실시하였다. 생체 외 투과 데이터가 생체 내에서 우수한 표시자로서 기능하는지의 여부를 결정하기 위하여, PYY 및 TJMP들에 대해 실시된 생체 내 약동학 연구들로부터 도출된 곡선-최종 값(AUC-last) 아래의 면적은 PYY 및 TJMP들에 대해 실시된 생체 외 상피 세포 단일막 투과 연구에 대하여 플롯되었다. 생체 외 투과는 퍼센티지로 표현되었고 AUC-last는 Min*pg/ml로 표현되었다. 10 개의 다른 TJMP들에 대한 생체 외 및 생체 내 연구들을 그래프로 그렸고 선형 회귀를 실시하였다. 0.82의 R2 값(82 % 상관) 도출은 생체 내에서 도출된 AUC 값들과 생체 외에서 관찰된 퍼센트 투과율에 대하여 강한 상관관계가 존재함을 나타낸다. 놀랍게도, 정간(inter-assay) 변이도를 배제하였을 시에, 0.996의 R2 값(본질적으로 100 %)이 도출되어 생체 외 투과율과 생체 내 결과(success) 사이에 직접적인 상관이 존재함을 보여준다. 따라서, 생체 내 결과를 예측하는 데 생체 외 투과율을 사용할 수 있다.
실시예 19
펩티드 호르몬 치료제에 대한 TJMP 에 의한 생체 내 투과성의 향상은 작은 분자 투과 향상제들의 투과성과 동등하거나 초과한다
3 내지 6 개월된 체중 2.1 내지 3.0 kg 나가는 20 마리의 뉴질랜드 백색 토끼들을 임의로 그룹 당 4 마리의 동물로 된 5 개의 처리 그룹들 중 하나에 할당하였다. 시험 동물들에게 피펫을 통하여 15 μl/㎏이 비강내로 투여되었다. 하기 표 19는 5 개의 다른 투여 그룹들의 구성을 나타낸다.
투여 그룹 1에 대하여(표 16 참조) 작은 분자 투여 향상제들을 포함하는 PYY의 임상 제형을 사용하였다. 본 연구들에서의 작은 분자 향상제들은 메틸-β-시클로덱스트린, 포스파티딜콜린 디데카노일(DDPC), 및/또는 EDTA를 포함하였다. 투여 그룹 2는 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해된 PYY를 받았다. 투여 그룹 3-5에 대하여, 다양한 농도의 PN159들을 투여 그룹 2에 첨가하였고, 투여 그룹 3 내지 5의 각각은 PYY, PN159, 및 PBS로 이루어졌다.
그룹 동물 투과 향상제들 투여 농도 (mg/ml) 투여 부피 (ml/kg) PYY 투여 (㎍/kg)
1 4 M 작은 분자 투과 향상제들 13.67 0.015 205
2 4 M 없음 13.67 0.015 205
3 4 M 25 μM PN159 13.67 0.015 205
4 4 M 50 μM PN159 13.67 0.015 205
5 4 M 100 μM PN159 13.67 0.015 205
EDTA를 항응고제로 포함하는 혈액 수집 튜브들에 말단 귀 정맥으로부터 직접 정맥천자에 의하여 계열 혈액 표본들(각각 약 2 ml)을 수집하였다. 혈액 표본들을 투여 후 0, 2.5, 5, 10, 15, 30, 45, 60 및 120 분에 수집하였다. 혈액 수집 후에, 튜브들을 항-응고를 위해 살며시 몇 회 흔들어주고, 이후 50 μl 아프로티닌 용액을 첨가하였다. 약 4 ℃에서 15 분 동안 약 1,600 x g로 원심분리하였고 혈장(plasma) 표본들을 2 벌의 분취량으로 분산시키고 약 -70 ℃에서 동결 저장하였다.
처리 그룹 내에서 4 마리 동물 모두를 평균하여 PYY의 혈장 농도를 측정하였다(표 17):
그룹 1 그룹 2 그룹 3 그룹 4 그룹 5
시간 분 작은 분자 투과 향상제들 투과 향상제 없음 25 μM PN159 50 μM PN159 100 μM PN159
0 183.825 257.3 228.675 424.4 294.225
2.5 1280.7 242.8 526.375 749.975 1748.225
5 1449.425 273.675 1430.15 1293.4 3088.2
10 8251.8 372.05 6521.7 12517.2 14486.6
15 13731.2 398.225 12563.075 34455.3 20882.725
30 19537.55 476.475 15222.6 35294.375 25470.475
45 13036.075 340.7 9081.125 21582.225 16499.55
60 7080.875 283.825 4843.15 9461.925 10676.625
120 1671.9 192.575 1224.2 2337.775 1891.275
상기 데이터로부터 계산된 약동학 데이터는 하기 표 18에 도시되어 있다:
변수 그룹 평균 SD SE
Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 19832.18 32.5 991732.1 1357132 23.69 516.725 26.25 36475.72 60847.41 84.5919 15533.95 22.5 748104.1 796354.7 24.8467 40995.53 26.25 1692499 1787348 25.5355 27974.4 33.75 1384241 1518949 20.4628 17737.21 20.6155 930296.3 928368.5 1.713 196.492 14.3614 9926.104 17688.31 26.8859 13225.88 8.6603 661213.8 721017.8 4.3108 32112.71 7.5 1339896 1395185 8.6139 17584.31 18.8746 817758.8 1030623 6.5069 8868.605 10.3078 465148.1 535993.8 0.989 98.246 7.1807 4963.052 8844.156 13.4429 6612.941 4.3301 330606.9 360508.9 2.1554 16056.35 3.75 669947.8 697592.4 4.3069 8792.154 9.4373 408879.4 595030.3 3.7568
그룹 2(향상제 없음) 제형과 비교하여, 하기 상대 향상 비율들을 결정하였다(표 19):
그룹 제형 상대 Cmax 상대 AUClast
1 작은 분자 투과 향상제들 38x 27x
3 PN159, 25 ㎛ 30x 21x
4 PN159, 50 ㎛ 79x 46x
5 PN159, 100 ㎛ 54x 38x
앞선 데이터는 TJMP가 작은 분자 투과 향상제들과 비교하여 인간 호르몬 펩티드 치료제의 생체 내 비강내 투과를 동일 또는 그 이상으로 향상시킨다는 것을 실증한다. 펩티드의 가장 큰 효과는 50 μM 농도에서 관찰된다. 비록 50 μM 및 100 μM 농도 모두가 작은 분자 투과 향상제들보다 더 높은 투과를 보였지만, 100 μM 농도가 다소간 더 낮은 투과를 나타내었다.
실시예 20
올리고펩티드 치료제에 대한 TJMP에 의한 투과 향상
본 예는 본 발명의 대표적인 펩티드인 PN159의 포유류 세포 수용체에 대한 모델 올리고펩티드 작용제(agonist)인 멜라노코르틴-4 수용체 작용제(MC-4RA)의 사이클릭 펜타펩티드에 대한 상피 투과를 향상시키는 효능을 실증한다. 본 예에서, MC-4RA와 하나 이상의 투과화 펩티드들과의 결합이 설명된다. 본 맥락의 유용한 제형들은 올리고펩티드 치료제, 투과화 펩티드, 및 하나 이상의 다른 투과 향상제들의 결합을 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 완충제, 긴장제, pH 조절제, 및 아미노산, 설탕 또는 폴리올, 고분자 및 염과 같은 펩티드/단백질 안정화제를 포함할 수 있다.
MC-4RA의 투과에 미치는 PN159의 효과를 본 연구에 평가하였다. MC-4RA는 MC-4 수용체의 활성을 조절하는 약 1,100 Da의 분자량을 지닌 메탄설포네이트염이었다. 평가된 PN159의 농도들은 5, 25, 50, 및 100 μM이다. 45 mg/ml M-β-CD를 모든 제형들이 10 mg/ml 펩티드 농도를 이룰 수 있도록 용해도제로 사용되었다. PN159의 효과는 그 자체 또는 EDTA(1, 2.5, 5, 또는 10 mg/ml) 결합에 의하여 평가되었다. 제형 pH는 4로 고정되었고 삼투몰농도는 220 mOsm/kg이었다.
HPLC 방법
기저측부 배지 내에서의 MC-4RA의 농도들은 1 mL/minute의 유량 속도와 25 ℃의 칼럼 온도로 C18 RP 크로마토그래피를 이용하여 RP-HPLC에 의하여 분석되었다.
용매 A: 물 속의 0.1 % TFA; 용매 B: ACN에서의 0.1 % TFA
주입 부피: 50 μL
검출: 220 nm
런 타임: 15 분
MC-4RA는 5, 25, 50, 및 100 μM PN159, pH 4 및 삼투몰농도~220 mOsm/kg으로 결합되었다. 상기 결합은 생체 외 상피 조직 모델을 이용하여 시험되어 PTH 투과, 경상피 전기 저항(TER), 및 MTT 및 LDH 시험들에 의한 제형의 세포독성을 모니터하였다.
MC-4RA의 투과 연구 결과들은 펩티드 호르몬 치료제들에 대한 점막 투과 향상에 더하여 TJMP는 올리고펩티드 치료제에 대한 상피 투과를 상당히 향상시켰다는 것을 밝혀 내었다.
실시예 21
작은 분자 약물에 대한 TJMP 에 의한 투과 향상
본 예는 본 발명의 대표적인 펩티드인 PN159의 아세틸콜린에스테라제(ACE) 억제제 갈란타민에 의해 예시된 작은 분자 약물에 대한 상피 투과를 향상시키는 효능을 실증한다. 본 예에서, 작은 분자 약물과 하나 이상의 투과 펩티드들의 결합을 설명한다. 본 맥락에서의 유용한 제형들은 작은 분자 약물, 투과화 펩티드, 및 하나 이상의 다른 투과 향상제들의 결합을 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 완충제, 긴장제, pH 조절제, 안정화제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다.
본 발명은 갈란타민을 PN159와 결합시켜 갈란타민의 비강 점막을 가로질러 투과를 향상시킨다. 약물 투과에서의 이러한 증가는 갈란타민이 비강 상피막을 독립적으로 투과할 수 있는 작은 분자이기 때문에 예측되지 않은 것이다. 그러므로 펩티드들의 투과를 향상시키는 부형제들의 첨가로 매개되는 상피를 가로질러 갈란타민 투과의 상당한 향상은 그러한 부형제들이 통상적으로 상피 조직막을 가로질러 갈란타민의 투과를 상당히 증가시키리라고 기대되지 않는다는 근거에서 놀랄만하다. 그러므로 본 발명은 갈란타민과 다른 작은 분자 약물들의 생물이용도를 증가시켜 이들의 비강 전달을 용이하게 할 것이다.
본 연구에서, 젖산염 형태의 40 mg/ml 갈란타민을 25, 50, 및 100 μM PN159와 용액으로, pH 5.0, 및 삼투몰농도 ~270 mOsm과 결합되었다. 상기 설명된 바와 같이 상기 결합은 생체 외 상피 조직 모델을 이용하여 시험되어 갈란타민 투과, 경상피 전기 저항(TER), 및 LDH 및 MIT 분석들에 의한 제형의 세포독성을 모니터하였다. 갈란타민에 대한 투과 측정은 하기와 같이 표준 HPLC 분석에 의해 실시되었다.
HPLC 분석
제형 및 기저측부 배지(투과 표본들) 내의 갈란타민 농도는 UV 검출이 되는 등용리 LC(Waters Alliance) 방법을 이용하여 측정되었다.
칼럼: Waters Symmetry Shield, C18, 5um, 25 x 0.46cm
이동상: 50 mM 포름산 암모늄에 5 % ACN, pH 3.0
유량: 1 ml/min
칼럼 온도: 30 ℃
보정 곡선: 0-400 ㎍/ml 갈란타민 HBr
검출: 285 nm의 자외선
연구들에 근거하여, PN159는 작은 분자들의 경상피 전달을 개선한다. 갈란타민은 모델 저분자량 약제로서 선정되었고, 이 분자에 대한 결과들은 다른 작은 분자 약제들에 대한 투과화 펩티드 활성의 예측으로 고려된다. 본 맥락에서 투과화 활성을 평가하기 위하여, 젖산염 형태의 40 mg/ml 갈란타민은 25, 50, 및 100 μM PN159 용액, pH 5.0 및 삼투 몰 농도 ~270 mOsm과 결합되었다. 상기 결합을 LDH 및 MTT 시험법에 의한 제형의 갈란타민 투과, 경상피 전기 저항(TER), 및 세포독성을 모니터하기 위하여 생체 외 상피 조직 모델을 이용하여 시험하였다.
생체 외 조직 모델에서, PN159를 첨가하면 세포 장벽을 가로질러 약물 투과에 극적인 증가를 일으켰다. 특정하게는, 40 mg/ml 갈란타민의 Papp에서 2.5 - 3.5 배 증가가 있었다.
PN159는 이전 예들에서 설명된 바와 같이 갈란타민이 존재시에 TER을 감소시켰다.
시험된 모든 농도들에서 갈란타민 락테이트(galantamine lactate) 및 PN159가 존재하면 세포 생존도는 높은 상태(> 80 %)를 유지하였다. 역으로, LDH에 의해 측정된 바와 같이 PN159 및 갈란타민 락테이트가 존재하면 세포독성은 낮았다. 이러한 시험법들 양쪽 모두는 PN159가 상피막에 독성이 있지 않다는 것을 의미한다.
PN159의 부재시에, 갈란타민에 대한 Papp는 약 2.1 x 10-6 cm/s이었다. 25, 50 및 100 mM PN159가 존재시에, Papp는 각각 5.1 x 10-6, 6.2 x 10-6, 및 7.2 x 10-6cm/s이었다. 그래서, 상기 PN159는 이러한 모델 저분자량 약물의 Papp에서의 2.5- 내지 3.4 배 증가 시켰다.
TJMP는 갈란타민의 상피 투과를 모델 저분자량 약물로서 놀라우리만큼 증가시켰다. PN159를 용액으로 갈란타민에 첨가시키면 상피 단일층을 가로질러 갈란타민 투과를 상당히 향상시켰다. 높은 세포 생존도 및 낮은 세포독성에 의해 측정된 바와 같이, PN159는 막의 세포들에 손상을 주지 않고 상피막을 가로질러 TER를 일시적으로 감소시켰음이 증거로 보인다. TJMP는 여기에 생체 외 모델들을 이용한 동일한 매커니즘을 통하여 갈란타민 및 생체 내 기타 작은 분자 약물들의 생체 이용도를 향상시켰다. TJMP는 더 높은 농도들에서도 갈란타민의 투과를 향상시킬 것이다.
실시예 22
단백질들에 대한 TJMP에 의한 투과 향상
저분자량 화합물들의 경점막 제형들에 대한 PN159의 효용을 입증하기 위하여, 이러한 관찰들이 더 큰 분자들, 예컨대, 치료 펩티드들 및 단백질들로 확장될 수 있는지의 여부를 판별하는 것이 중요하였다. 본 목적을 위하여, 25, 50, 및 100 mM PN159의 존재, 비존재 시에 모델 치료 펩티드로서 연어 칼시토닌에 대하여 생체 외 조직 연구들을 수행하였다. PN159가 부재시에, 칼시토닌에 대한 Papp는 약 1 x 10-7 ㎝/s 였으며, 이는 추측컨대 분자량에서의 차이로 인하여 갈란타민에 대한 것보다 크기에서 약 몇 차수 정도가 낮은 값이었다. 상기 데이터는 PN159가 존재시에 칼시토닌 단독의 경우와 비교해서 칼시토닌 투과의 극적인 증가를 보이는데, 이는 Papp에서의 최대 23 내지 47배 정도 증가한 것이다(표 20).
생체 외 조직 모델을 이용하여 측정된 Papp
약제 제형 [PN159] (μM) Papp (cm/s) 상대 Papp
갈란타민 40 mg/mL, pH5.0 0 2.1x10-6 1.0
25 5.1x10-6 2.4
50 6.2x10-6 3.0
100 7.2x10-6 3.4
칼시토닌 1 mg/mL, pH3.5 0 9.7x10-8 1.0
25 2.2x10-6 23.
50 3.3x10-6 34.
100 4.6x10-6 47.
PTH1 -34 1 mg/mL, pH4.5 0 1.1x10-7 1.0
25 3.4x10-7 3.0
50 4.9x10-7 4.5
100 4.3x10-7 3.9
PYY3 -36 1 mg/mL, pH7.0 0a 1.3x10-7 1.0
25 1.6x10-6 12.
100 2.2x10-6 17.
apH 는 5.0 이었다.
이렇게 발견한 것들의 일반화를 모색하기 위하여, 2 개의 추가적인 펩티드들, 즉 인간 부갑상선 호르몬 1-34(PTH1-34) 및 인간 펩티드 YY 3-36(PYY3-36)을 PN159(표 20에 제시된 Papp 데이터)가 존재시 및 부재시에 생체 외 모델에서 시험하였다. PN159가 부재시에, 이러한 두가지 펩티드들의 Papp는 칼시토닌에 대한 것과 일치하였다. PTH1-34의 경우에, PN159의 존재는 Papp에서 약 3-5 배 증가를 부여하였다. PYY3-36이 PN159의 존재시에 제형되면, Papp는 약 12- 내지 17-배 증가되었다. 이러한 데이터는 TJMP가 저분자물질들 및 단백질들에 대한 경상피 약물 전달을 향상시켰다는 우리의 발견을 일반화시킨것을 확인한 것이다.
실시예 23
TJMP 의 화학적 안정도
PN159의 화학적 안정도를 치료적으로 적합한 저장 조건 하에서 결정하였다. HPLC 방법을 채용하였다는 것을 나타내는 안정도이다. 용액들(50 mM)을 다양한 pH(4.0, 7.3 및 9.0) 및 온도(5 ℃, 25 ℃, 35 ℃, 40 ℃, 및 50 ℃) 조건들에서 저장하였다. pH 4에서의 표본들은 10 mM 시트르산 완충제를 포함하였다. pH 7.3 및 9.0에서의 표본들은 10 mM 인산염 완충를 포함하였다. 저장 안정도 결과들(아레니우스 플롯 포함)은 PN159가 낮은 온도 및 pH에서 화학적으로 가장 안정하였다는 것을 보인다. 예를 들어, 5 ℃ 및 pH 4.0 또는 7.3에서 6 개월 저장하는 동안 PN159가 실질적으로 100 % 회복되었다. 저장 온도가 25 ℃로 올라가면, 6 개월 후에 pH 4 또는 pH 7에서의 표본들에 대한 천연 PN159가 7 % 및 26 % 손실이 각각 있었다. pH 9 및/또는 상승된 온도, 예컨대, 40 내지 50 ℃에서는 PN159의 급속한 열화(deterioration)이 잇따랐다. 4.0 내지 7.3의 pH 범위 및 동결 내지 주변의 온도 범위는 비강내 제형들에 대한 가장 적절한 것이다. 그러므로, 이러한 데이터는 TJMP는 IN 제형들에 적절한 저장 조건 하에서 화학적 일체성을 유지할 수 있음을 지지하는 것이다.
실시예 24
비강내 투여에 의한 토끼들에서의 밀착 연접 조절 펩티드들의 생체 내 평가
토끼들에서의 약동학(PK) 연구를 실시하여 비강내(IN) 전달을 통해 투여되는 다양한 밀착 연접 조절 펩티드들(TJMPs)과 펩티드 YY(PYY)의 혈장 약동학적 특성(plasma pharmacokinetic properties)을 평가하였다.
동물 모델
본 연구에서, 뉴질랜드 백색 토끼들(Hra: (NZW) SPF)을 시험 피검자들로 사용하여 비강내 투여 및 정맥 내 주입에 의한 MC-4RA의 혈장 약동학(plasma Pharmacokinetics)을 평가하였다. 동물들의 처리는 USDA Animal Welfare 법(9 CFR Parts 1, 2, 및 3)에 약술된 규정들 및 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(ILAR publication, 1966, National Academy Press)에 규정된 조건들을 준수하였다.
토끼를 본 연구에 대한 동물 피검자로 선정하였는데, 이는 토끼에게 투여된 약물로부터 유도된 약동학 프로파일이 인간에게서의 동일한 약물에 대한 PK 프로파일과 밀접하게 유사하다는 점에서 그러하다.
투여
시험된 9 개의 TJMP들에 대한 실험 설계 및 투여 방법은 표 21에 요약하였다. 모든 실험 그룹들에게 개별 TJMP 또는 인산염 완충 식염수(PBS; 음성 대조군)와 결합시킨 205 ㎍/㎏ PYY(3-36)를 비강내(IN) 투여에 의하여 투여하였다. 각각의 제형을 피펫과 일회용 플라스틱 팁을 이용하여 좌측 비강속으로 일 회 투여하였다. 상기 동물의 머리를 뒤쪽으로 기울여 모세관 현상으로 용액을 비강속으로 빨아들이도록 하기 위하여 동물에 의해 흡입시에 투여하였다. IN 투여 후에, 투여량의 손실을 방지하기 위하여 상기 동물의 머리를 약 15 초 동안 뒤로 젖혀 둔 위치에 놓아두었다. 상기 절차가 진행되는 동안, 잠재적으로 비강내 점막과의 접촉으로 인해 임의의 조직 손상을 방지하기 위하여 극도의 주의를 다하였다.
그룹 동물들의 수 경로 밀착 연접 조절자 (농도) PYY3 (㎍/kg)
1 5M 비강내 PBS 205
2 5M 비강내 PN159(50μM) 205
3 5M 비강내 PN161(100μM) 205
4 5M 비강내 PN202(100μM) 205
5 5M 비강내 PN27(250μM) 205
6 5M 비강내 PN58(500μM) 205
7 5M 비강내 PN73(500μM) 205
8 5M 비강내 PN228(500μM) 205
9 5M 비강내 PN183(1000μM) 205
10 5M 비강내 PN556(1000μM) 205
PN556은 PN283과 동일한 제 1 서열을 가지지만, 펩티드의 N-말단에서 말레이미드의 변형이 있다.
혈액 및 혈장 표본 수집
IN에 의한 투여 후에, 계열 혈액 표본들을 말단 귀 정맥의 직접 정맥 천자에 의하여 각각의 동물로부터 채취하였다. 혈액 표본들을 주입전, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120 및 180 분 후에 수집하였다. 디포타슘(dipotassium) EDTA를 항응고제로 포함하는 튜브들 속에 표본들을 수집하였다. 원심분리할 때까지 상기 튜브들을 냉각시켰다. 수집한지 한 시간 이내에 모든 표본들을 원심분리하였다. 혈장을 수거하여 사전에 라벨이 붙은 플라스틱 바이알들에 옮겨넣어 건조한 얼음/아세톤 베스에 동결시켜 약동학 분석을 실시할 때까지 약 -70 ℃에서 저장하였다.
각각의 혈액 채취 시간에 임상 관찰들을 실시하였고 IN 투여 시험 그룹들에서의 모든 동물들에 대한 양쪽 비강의 검사를 5 분 및 1 시간 후-비강내 투여 직전에 실시하였다.
분석 방법
모든 연구 그룹들에서의 각각의 동물로부터 채취한 표본들을 ELISA를 이용하여 PYY(3-36) 레벨들에 대하여 분석하였다. 투여 전후에 시험 물품들(test articles)을 품질 통제를 위하여 HPLC 상에서 가동하였다. 혈장 분취량들(0.1 mL)은 생체-분석 내부 표준을 첨가한 후에 아세토니트릴로 침전된 단백질이었다. 상청액을 질소로 건조시키고, HPLC 완충제로 액상화하고 HPLC 시스템에 주입하였다. 유출액은 양이온 전기분무 이온화 탠덤 삼중 사중극 질량 분광계에 의하여 검출된다. 약동학 데이터를 WinNonlin(Pharsight Corp., Mountain View)에 의하여 분석하였다.
결과
각각의 시험 그룹에 대한 평균 혈장 약동학 변수(mean plasma PK parameters)를 표 22에 요약하였다. 임의의 제형들을 투여한 후에 어떠한 나쁜 임상적 징조들이 관찰되지 않았다. IN을 통한 동물 투여 제형들의 양쪽 비강의 후-비강내(post-intranasal) 검사에서 임의의 조홍(redness) 이나 팽윤(swelling)도 드러나지 않았다. PK 연구는 Cmax(최대 관찰 농도), tmax(최대 농도 시간) 및 AUC (곡선 아래 면적)last와 무한(inf)을 평가하였다. 생체 내 투과율이 가장 높은 레벨인 TJMP들을 포함하는 Tier I 및 생체 내 투과율이 점진적으로 낮아지는 레벨을 지닌 TJMP들을 포함하는 각각의 후속 Tier를 지닌 생체 내 투여의 레벨에 따라 8개의 TJMP들의 순위를 매겨 4 개의 다른 수행 타이어들(performance tiers)로 분류하였다.
그룹 생체 내 Tier 랭킹 T1 /2 Tmax (min) Cmax (pg/mL) AUClast (min*pg/mL) AUCinf (min*pg/mL)
PBS 86.0 22.0 806 4.5x104 6.81x104
PN159 I I I 30.2 17.0 30200 1.52x106 1.55x106
PN161 34.3 24.0 32100 1.62x106 1.65x106
PN27 29.9 33.0 29300 1.67x106 1.71x106
PN228 II 30.4 31.0 21200 1.06x106 1.08x106
PN202 II III 34.1 32.0 12700 7.35x105 7.63x105
PN58 29.5 43.0 12800 8.3x105 8.71x105
PN73 IV IV IV 53.8 37.0 8220 3.46x105 3.55x105
PN183 33.7 22.0 5440 2.58x105 2.75x105
PN556 51.2 22.0 4620 2.47x105 2.80x105
이러한 데이터는 PN161 및 PN27에 대하여 관찰된 생체 내 투과는 PN159에 필적하며; 나머지 TJMP들은 시험된 농도들에서 PN159의 생체 내 투과율 미만의 생체 내 투과 레벨을 달성하였다는 것을 보여준다.
실시예 25
생체 외 상피 세포층 투과를 향상시키는 밀착 연접 조절 펩티드들
본 예는 본 발명의 대표적인 펩티드들인 PN679 및 PN745(표 23에 도시) 및 상피 세포 단일층 투과 향상을 위한 각각의 펩티드의 효과적인 농도 범위를 결정하기 위해 가려진 각각의 펩티드에 대한 시험 제형(표 24에 도시)을 설명하고 있다.
밀착 연접 조절 펩티드들
펩티드 # 아미노산 서열 분자량 로트 # 순도 (%)
PN679 CNGRCGGKKKLKLLLKLL (서열번호 32) 1984.78 05-1882-758 94.01
PN745 LRKLRKRLLRLRKLRKRLLR-amide (서열번호 33) 2684.53 05-1882-761 99.29
하기 표 24는 본 발명의 대표적인 펩티드(표 24의 "활성제" 칼럼) 및 TER, LDH (세포독성) 및 표본 투과 향상 분석들에 의해 시험되었던 양성 및 음성 시험 제형 대조군들로서 작용했던 시험 제형들을 포함하는 개별 시험 제형들을 설명하고 있다. 각각의 펩티드는 25 μM, 100 μM, 250 μM, 500 μM 및 1000 μM 농도에서 시험되었다. PN159(시험 제형 #11)는 여기서 TJMP 양성 대조군으로 작용하였고 TER을 효과적으로 감소시키고 25 μM에서 표본 투과를 향상시키는 능력을 앞서 실증했었다. 일 퍼센트 Triton X-100TM(시험 제형 #14)는 세포독성(LDH) 분석 및 TER 감소 분석 양쪽에 대하여 양성 대조군으로 작용하였다. "특수 소스" (special sauce: SS)는 여기서 작은 분자 투과 향상제로 작용하였다. DPBS++는 음성 대조군으로 작용하였다. 각각의 시험 제형은 300 μl의 최종 부피와 5의 목표 pH를 가진 시험 제형 #12를 제외한 7의 목표 pH를 가졌다. 일 퍼센트 Triton X-100TM(시험 제형 #14)은 세포독성(LDH) 분석에 대한 양성 대조군으로 작용하였다.
각각의 시험 제형에 대한 총 300 μl 부피 중에, 각각의 시험 제형이 TER, LDH 및 표본 투과에 대해 가지는 효과를 평가하기 위하여 하나의 20 μl 표본만이 인간-유도 기관/기관지 상피 세포들(EpiAirwayTM 조직 모델 시스템)에 적용되었다.
시험 제형들
시험 제형 # 활성제 처리 농도 물 1x DPBS++ (pH7.5) 활성제 스톡 (Active Agent Stock) 10x FD3
1 PN679 1000 μM 15 ㎕ 225 ㎕ 30 ㎕ 30 ㎕
2 500 μM 30 ㎕ 225 ㎕ 15 ㎕ 30 ㎕
3 250 μM 37.5 ㎕ 225 ㎕ 7.5 ㎕ 30 ㎕
4 100 μM 42 ㎕ 225 ㎕ 3 ㎕ 30 ㎕
5 25 μM 44.3 ㎕ 225 ㎕ 0.75 ㎕ 30 ㎕
6 PN745 1000 μM 15 ㎕ 225 ㎕ 30 ㎕ 30 ㎕
7 500 μM 30 ㎕ 225 ㎕ 15 ㎕ 30 ㎕
8 250 μM 44.9 ㎕ 225 ㎕ 0.075 ㎕ 30 ㎕
9 100 μM 44.97 ㎕ 225 ㎕ 0.03 ㎕ 30 ㎕
10 25 μM 44.3 ㎕ 225 ㎕ 0.75 ㎕ 30 ㎕
11 PN159(펩티드 대조군) 25 μM 43.9 ㎕ 225 ㎕ 1.1 ㎕ 30 ㎕
12 SS 1X 120 ㎕ 0 ㎕ 150 ㎕ 30 ㎕
13 DPBS++ 0.75X 45 ㎕ 225 ㎕ 0 ㎕ 30 ㎕
14 Triton X-100TM 1% 41.7 ㎕ 225 ㎕ 33.33 ㎕ 0 ㎕
SS = "특수 소스(special source)"
실시예 26
PN679 및 PN745는 생체 외 밀착 연접 단백질들을 조절한다
본 예는 대표적인 펩티드들인 PN679 및 PN745는 TER을 효과적으로 감소시키고 상당한 세포 독성을 발생시키지 않고 투여-의존성 방식으로 표본 투과를 상당히 향상시켰다는 것을 실증하는데 이는 이러한 펩티드들이 효과적인 TJMP들이라는 것을 나타낸다. 표 25는 실시예 25의 표 24에 설명된 시험 제형들에 대하여 TER, LDH 및 표본 투과(FD3) 데이터를 요약한 것이다. PN679에 대한 시험 제형 #1과 PN745에 대한 시험 제형 #6을 2 회 분석하였다. TER, LDH 및 표본 투과에 대한 추가적인 분석 결과들은 괄호안에 도시되었다.
TER. LDH 및 표본 투과율 향상 데이터의 요약
시험 제형 # 활성제 % T0 TER % Triton-X LDH 방출 % FD3 투과
1 PN679 -2% (-2%) 51% (32%) 10% (10%)
2 -2% 50% 10%
3 2% 38% 8%
4 7% 23% 7%
5 70% 1% 0%
6 PN745 -3% (-1%) 45% (32%) 7% (5%)
7 1% 45% 7%
8 1% 45% 8%
9 7% 28% 6%
10 24% 11% 2%
11 PN159 (펩티드 대조군) 7% 31% 8%
12 SS -2% 27% 18%
13 DPBS++ 91% 0% 0%
14 Triton X-100TM 100%
SS = "특수 소스(special source)"
본 발명의 대표적인 펩티드들인 PN679(시험 제형들 #1, #2, #3 및 #4) 또는 PN745(시험 제형들 #6, #7, #8 및 #9) 중 어느 하나의 100 μM, 250 μM, 500 μM 및 1000 μM를 포함하는 시험 제형들은 TER을 상기 "특수 소스"와 동등한 정도 및 기존 TJMP 대조군 PN159의 것과는 상당히 못 미치는 정도로 감소시켰다. 예상한 바와 같이, DPBS++ 음성 대조군은 TER을 상당히 감소시키지 않았다. 이러한 양쪽 펩티드들이 TER을 감소시키는 능력은 FD3 분자의 투과를 향상시키는 능력과 강하게 연관되었다. PN679(시험 제형 #4) 및 PN745(시험 제형 #9) 양쪽 모두에 대한 100 μM 투여는 PN159 TJMP와 유사하지만 더 낮은 세포독성(더 낮은 % LDH 방출)을 지닌 퍼센트 투과율을 보였다. 양쪽 중 어느 펩티드에서나 높은 농도들은 PN159의 투과율을 초과한 FD3 투과의 증가된 레벨로 나타났지만 또한 DLH 방출 레벨도 증가시켰는데 이는 세포독성의 증가를 나타내고 있다. 예상한 바와 같이, DPBS++ 대조군은 측정할만한 LDH 방출을 유도하지 않았다. 관찰된 TER 감소, 표본 투과 및 세포독성(LDH 방출)에 기초하여, 대표적인 펩티드 PN679 및 PN745의 어느 하나에 대한 100 μM 투여는 이러한 두 TJMP들에 대한 다른 분석들에 최적인 듯하다.
앞선 데이터는 대표적인 펩티드 PN679 및 PN745가 TER을 감소시키고 생체 외 인간 상피 세포 단일막의 상당한 세포독성 없이도 작은 분자 투과를 향상시킨다는 예상하지 못한 발견을 보여준다. 이러한 데이터는 이러한 밀착 연접 조절 펩티드들(TMJP)이 예를 들어, 비강내(IN) 약물 전달과 같은 점막 표면을 가로지르는 약물 전달에의 이용을 위한 뛰어난 후보군이라는 것을 나타낸다.
실시예 27
밀착 연접 조절 펩티드에 의한 생체 외 향상된 투과는 생체 내에서 관찰된 향상된 투과와 강하게 관련되어 있다
생체 내 EpiAirway 상피 세포 모델 시스템에서 관찰된 TJMP 투과 반응속도론이 동일한 TJMP에 대하여 관찰된 생체 내 약동학 데이터와 관련되어 있는지의 여부를 결정하기 위하여 선형 회귀 분석을 실시하였다. 생체 외 투과 데이터가 생체 내에서 우수한 표시자로서 기능하는지의 여부를 결정하기 위하여, PYY 및 TJMP들에 대해 실시된 생체 내 약동학 연구들로부터 도출된 곡선-최종 값(AUC-last) 아래의 면적은 PYY 및 TJMP들에 대해 실시된 생체 외 상피 세포 단일막 투과 연구에 대하여 플롯되었다. 생체 외 투과는 퍼센티지로 표현되었고 AUC-last는 Min*pg/ml로 표현되었다. 10 개의 다른 TJMP들에 대한 생체 외 및 생체 내 연구들을 그래프로 그렸고 선형 회귀를 실시하였다. 0.82의 R2 값(82 % 상관) 도출은 생체 내에서 도출된 AUC 값들과 생체 외에서 관찰된 퍼센트 투과율에 대하여 강한 상관관계가 존재함을 나타낸다. 놀랍게도, 정간 변이도를 배제하였을 시에, 0.996의 R2 값(본질적으로 100 %)이 도출되어 생체 외 투과율과 생체 내 결과(success) 사이에 직접적인 상관이 존재함을 보여준다. 따라서, 생체 내 결과를 예측하는 데 생체 외 투과율을 사용할 수 있다.
실시예 28
펩티드 호르몬 치료제에 대한 TJMP 에 의한 생체 내 투과성 향상은 작은 분자 투과 향상제들의 투과성과 동등하거나 초과한다
3 내지 6 개월된 체중 2.1 내지 3.0 kg 나가는 20 마리의 뉴질랜드 백색 토끼들을 임의로 그룹 당 4 마리의 동물로 된 5 개의 처리 그룹들 중 하나에 할당하였다. 시험 동물들에게 피펫을 통하여 15 μl/㎏이 비강내로 투여되었다. 하기 표 26은 5 개의 다른 투여 그룹들의 구성을 나타낸다.
투여 그룹 1에 대하여(표 26 참조) 작은 분자 투여 향상제들을 포함하는 PYY의 임상 제형을 사용하였다. 본 연구들에서의 작은 분자 향상제들은 메틸-β-시클로덱스트린, 포스파티딜콜린 디데카노일(DDPC), 및/또는 EDTA를 포함하였다. 투여 그룹 2는 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해된 PYY를 받았다. 투여 그룹 3-5에 대하여, 다양한 농도의 PN159들을 투여 그룹 2에 첨가하였고, 투여 그룹 3 내지 5의 각각은 PYY, PN159, 및 PBS로 이루어졌다.
투여 그룹들
그룹 동물들 투과 향상제들 투여 농도 (mg/ml) 투여 부피 (ml/kg) PYY 투여 (㎍/kg)
1 4M 작은 분자 투과 향상제들 13.67 0.015 205
2 4M 없음 13.67 0.015 205
3 4M 25 μM PN159 13.67 0.015 205
4 4M 50 μM PN159 13.67 0.015 205
5 4M 100 μM PN159 13.67 0.015 205
EDTA를 항응고제로 포함하는 혈액 수집 튜브들에 말단 귀 정맥으로부터 직접 정맥천자에 의하여 계열 혈액 표본들(각각 약 2 ml)을 수집하였다. 혈액 표본들을 투여 후 0, 2.5, 5, 10, 15, 30, 45, 60 및 120 분에 수집하였다. 혈액 수집 후에, 튜브들을 항-응고를 위해 살며시 몇 회 흔들어주고, 이후 50 μl 아프로티닌 용액을 첨가하였다. 약 4 ℃에서 15 분 동안 약 1,600 x g로 원심분리하였고 혈장 표본들을 2 벌의 분취량으로 분산시키고 약 -70 ℃에서 동결 저장하였다.
처리 그룹 내에서 4 마리 동물 모두를 평균하여 다음과 같은 PYY의 혈장 농도를 측정하였다(표 27):
시험 그룹들에 대한 PYY 혈장 농도들의 요약
그룹 1 그룹 2 그룹 3 그룹 4 그룹 5
시간, 분 작은 분자 투과 향상제들 투과 향상제 없음 25 μM PN159 50 μM PN159 100 μM PN159
0 183.825 257.3 228.675 424.4 294.225
2.5 1280.7 242.8 526.375 749.975 1748.225
5 1449.425 273.675 1430.15 1293.4 3088.2
10 8251.8 372.05 6521.7 12517.2 14486.6
15 13731.2 398.225 12563.075 34455.3 20882.725
30 19537.55 476.475 15222.6 35294.375 25470.475
45 13036.075 340.7 9081.125 21582.225 16499.55
60 7080.875 283.825 4843.15 9461.925 10676.625
120 1671.9 192.575 1224.2 2337.775 1891.275
약동학적 데이터의 요약
변수 그룹 평균 SD SE
Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) Cmax (pg/mL) Tmax (min) AUClast (min*pg/mL) AUCINF (min*pg/mL) t1/2 (min) 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 19832.18 32.5 991732.1 1357132 23.69 516.725 26.25 36475.72 60847.41 84.5919 15533.95 22.5 748104.1 796354.7 24.8467 40995.53 26.25 1692499 1787348 25.5355 27974.4 33.75 1384241 1518949 20.4628 17737.21 20.6155 930296.3 928368.5 1.713 196.492 14.3614 9926.104 17688.31 26.8859 13225.88 8.6603 661213.8 721017.8 4.3108 32112.71 7.5 1339896 1395185 8.6139 17584.31 18.8746 817758.8 1030623 6.5069 8868.605 10.3078 465148.1 535993.8 0.989 98.246 7.1807 4963.052 8844.156 13.4429 6612.941 4.3301 330606.9 360508.9 2.1554 16056.35 3.75 669947.8 697592.4 4.3069 8792.154 9.4373 408879.4 595030.3 3.7568
그룹 2(향상제 없음) 제형과 비교하여, 하기 상대 향상 비율들을 결정하였다(표 29):
상대 향상 비율들
그룹 제형 상대 Cmax 상대 AUClast
1 작은 분자 투과 향상제들 38x 27x
3 PN159, 25 ㎛ 30x 21x
4 PN159, 50 ㎛ 79x 46x
5 PN159, 100 ㎛ 54x 38x
앞선 데이터는 TJMP가 작은 분자 투과 향상제들과 비교하여 인간 호르몬 펩티드 치료제의 생체 내 비강내 투과를 동일 또는 그 이상으로 향상시킨다는 것을 실증한다. 펩티드의 가장 큰 효과는 50 μM 농도에서 관찰된다. 비록 50 μM 및 100 μM 농도 모두가 작은 분자 투과 향상제들보다 더 높은 투과를 보였지만, 100 μM 농도가 다소간 더 낮은 투과를 나타내었다.
실시예 29
올리고펩티드 치료제에 대한 TJMP 에 의한 투과 향상
본 예는 본 발명의 대표적인 펩티드인 PN159의 포유류 세포 수용체에 대한 모델 올리고펩티드 작용제인 멜라노코르틴-4 수용체 작용제(MC-4RA)의 사이클릭 펜타펩티드에 대한 상피 투과를 향상시키는 효능을 실증한다. 본 예에서, MC-4RA와 하나 이상의 투과화 펩티드들과의 결합이 설명된다. 본 맥락의 유용한 제형들은 올리고펩티드 치료제, 투과화 펩티드, 및 하나 이상의 다른 투과 향상제들의 결합을 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 완충제, 긴장제, pH 조절제, 및 아미노산, 설탕 또는 폴리올, 고분자 및 염과 같은 펩티드/단백질 안정화제를 포함할 수 있다.
MC-4RA의 투과에 미치는 PN159의 효과를 본 연구에 평가하였다. MC-4RA는 MC-4 수용체의 활성을 조절하는 약 1,100 Da의 분자량을 지닌 메탄설포네이트염이었다. 평가된 PN159의 농도들은 5, 25, 50, 및 100 μM이다. 45 mg/ml M-β-CD를 모든 제형들이 10 mg/ml 펩티드 농도를 이룰 수 있도록 용해도제로 사용되었다. PN159의 효과는 그 자체 또는 EDTA(1, 2.5, 5, 또는 10 mg/ml) 결합에 의하여 평가되었다. 제형 pH는 4로 고정되었고 삼투몰농도는 220 mOsm/kg이었다.
HPLC 방법
기저측부 배지 내에서의 MC-4RA의 농도들은 1 mL/minute의 유량 속도와 25 ℃의 칼럼 온도로 C18 RP 크로마토그래피를 이용하여 RP-HPLC에 의하여 분석되었다.
용매 A: 물 속의 0.1 % TFA; 용매 B: ACN에서의 0.1 % TFA
주입 부피: 50 μL
검출: 220 nm
런 타임: 15 분
MC-4RA는 5, 25, 50, 및 100 μM PN159, pH 4 및 삼투몰농도~220 mOsm/kg으로 결합되었다. 상기 결합은 생체 외 상피 조직 모델을 이용하여 시험되어 PTH 투과, 경상피 전기 저항(TER), 및 MTT 및 LDH 시험들에 의한 제형의 세포독성을 모니터하였다.
MC-4RA의 투과 연구 결과들은 펩티드 호르몬 치료제들에 대한 점막 투과 향상에 더하여 TJMP는 올리고펩티드 치료제에 대한 상피 투과를 상당히 향상시켰다는 것을 밝혀 내었다.
실시예 30
작은 분자 약물에 대한 TJMP 에 의한 투과 향상
본 예는 본 발명의 대표적인 펩티드인 PN159의 아세틸콜린에스테라제(ACE) 억제제 갈란타민에 의해 예시된 작은 분자 약물에 대한 상피 투과를 향상시키는 효능을 실증한다. 본 예에서, 작은 분자 약물과 하나 이상의 투과 펩티드들의 결합을 설명한다. 본 맥락에서의 유용한 제형들은 작은 분자 약물, 투과화 펩티드, 및 하나 이상의 다른 투과 향상제들의 결합을 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 완충제, 긴장제, pH 조절제, 안정화제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다.
본 발명은 갈란타민을 PN159와 결합시켜 갈란타민의 비강 점막을 가로질러 투과를 향상시킨다. 약물 투과에서의 이러한 증가는 갈란타민이 비강 상피막을 독립적으로 투과할 수 있는 작은 분자이기 때문에 예측되지 않은 것이다. 그러므로 펩티드들의 투과를 향상시키는 부형제들의 첨가로 매개되는 상피를 가로질러 갈란타민 투과의 상당한 향상은 그러한 부형제들이 통상적으로 상피 조직막을 가로질러 갈란타민의 투과를 상당히 증가시키리라고 기대되지 않는다는 근거에서 놀랄만하다. 그러므로 본 발명은 갈란타민과 다른 작은 분자 약물들의 생물이용도를 증가시켜 이들의 비강 전달을 용이하게 할 것이다.
본 연구에서, 젖산염 형태의 40 mg/ml 갈란타민을 25, 50, 및 100 μM PN159와 용액으로, pH 5.0, 및 삼투몰농도 ~270 mOsm과 결합되었다. 상기 설명된 바와 같이 상기 결합은 생체 외 상피 조직 모델을 이용하여 시험되어 갈란타민 투과, 경상피 전기 저항(TER), 및 LDH 및 MIT 분석들에 의한 제형의 세포독성을 모니터하였다. 갈란타민에 대한 투과 측정은 하기와 같이 표준 HPLC 분석에 의해 실시되었다.
HPLC 분석
제형 및 기저측부 배지(투과 표본들) 내의 갈란타민 농도는 UV 검출이 되는 등용리 LC(Waters Alliance) 방법을 이용하여 측정되었다.
칼럼: Waters Symmetry Shield, C18, 5um, 25 x 0.46cm
이동상: 50 mM 포름산 암모늄에 5 % ACN, pH 3.0
유량: 1 ml/min
칼럼 온도: 30 ℃
보정 곡선: 0-400 ㎍/ml 갈란타민 HBr
검출: 285 nm의 자외선
연구들에 근거하여, PN159는 작은 분자들의 경상피 전달을 개선한다. 갈란타민은 모델 저분자량 약제로서 선정되었고, 이 분자에 대한 결과들은 다른 작은 분자 약제들에 대한 투과화 펩티드 활성의 예측으로 고려된다. 본 맥락에서 투과화 활성을 평가하기 위하여, 젖산염 형태의 40 mg/ml 갈란타민은 25, 50, 및 100 μM PN159 용액, pH 5.0 및 삼투 몰 농도 ~270 mOsm과 결합되었다. 상기 결합을 LDH 및 MTT 시험법에 의한 제형의 갈란타민 투과, 경상피 전기 저항(TER), 및 세포독성을 모니터하기 위하여 생체 외 상피 조직 모델을 이용하여 시험하였다.
생체 외 조직 모델에서, PN159를 첨가하면 세포 장벽을 가로질러 약물 투과에 극적인 증가를 일으켰다. 특정하게는, 40 mg/ml 갈란타민의 Papp에서 2.5 - 3.5 배 증가가 있었다.
PN159는 이전 예들에서 설명된 바와 같이 갈란타민이 존재시에 TER을 감소시켰다.
시험된 모든 농도들에서 갈란타민 락테이트(galantamine lactate) 및 PN159가 존재하면 세포 생존도는 높은 상태(> 80 %)를 유지하였다. 역으로, LDH에 의해 측정된 바와 같이 PN159 및 갈란타민 락테이트가 존재하면 세포독성은 낮았다. 이러한 시험법들 양쪽 모두는 PN159가 상피막에 독성이 있지 않다는 것을 의미한다.
PN159의 부재시에, 갈란타민에 대한 Papp는 약 2.1 x 10-6 cm/s이었다. 25, 50 및 100 mM PN159가 존재시에, Papp는 각각 5.1 x 10-6, 6.2 x 10-6, 및 7.2 x 10-6cm/s이었다. 그래서, 상기 PN159는 이러한 모델 저분자량 약물의 Papp에서의 2.5- 내지 3.4 배 증가 시켰다.
TJMP는 갈란타민의 상피 투과를 모델 저분자량 약물로서 놀라우리만큼 증가시켰다. PN159를 용액으로 갈란타민에 첨가시키면 상피 단일층을 가로질러 갈란타민 투과를 상당히 향상시켰다. 높은 세포 생존도 및 낮은 세포독성에 의해 측정된 바와 같이, PN159는 막의 세포들에 손상을 주지 않고 상피막을 가로질러 TER를 일시적으로 감소시켰음이 증거로 보인다. TJMP는 여기에 생체 외 모델들을 이용한 동일한 매커니즘을 통하여 갈란타민 및 생체 내 기타 작은 분자 약물들의 생체 이용도를 향상시켰다. TJMP는 더 높은 농도들에서도 갈란타민의 투과를 향상시킬 것이다.
실시예 31
단백질들에 대한 TJMP 에 의한 투과 향상
저분자량 화합물들의 경점막 제형들에 대한 PN159의 효용을 입증하기 위하여, 이러한 관찰들이 더 큰 분자들, 예컨대, 치료 펩티드들 및 단백질들로 확장될 수 있는지의 여부를 판별하는 것이 중요하였다. 본 목적을 위하여, 25, 50, 및 100 mM PN159의 존재, 비존재 시에 모델 치료 펩티드로서 연어 칼시토닌에 대하여 생체 외 조직 연구들을 수행하였다. PN159가 부재시에, 칼시토닌에 대한 Papp는 약 1 x 10-7 ㎝/s 였으며, 이는 추측컨대 분자량에서의 차이로 인하여 갈란타민에 대한 것보다 크기에서 약 몇 차수 정도가 낮은 값이었다. 상기 데이터는 PN159가 존재시에 칼시토닌 단독의 경우와 비교해서 칼시토닌 투과의 극적인 증가를 보이는데, 이는 Papp에서의 최대 23- 내지 47-배 정도 증가한 것이다(표 30).
생체 외 조직 모델을 이용하여 측정된 Papp
약제 제형 [PN159] (μM) Papp (cm/s) 상대 Papp
갈란타민 40 mg/mL, pH5.0 0 2.1x10-6 1.0
25 5.1x10-6 2.4
50 6.2x10-6 3.0
100 7.2x10-6 3.4
칼시토닌 1 mg/mL, pH3.5 0 9.7x10-8 1.0
25 2.2x10-6 23.
50 3.3x10-6 34.
100 4.6x10-6 47.
PTH1 -34 1 mg/mL, pH4.5 0 1.1x10-7 1.0
25 3.4x10-7 3.0
50 4.9x10-7 4.5
100 4.3x10-7 3.9
PYY3 -36 1 mg/mL, pH7.0 0a 1.3x10-7 1.0
25 1.6x10-6 12.
100 2.2x10-6 17.
apH 는 5.0 이었다.
이렇게 발견한 것들의 일반화를 모색하기 위하여, 2 개의 추가적인 펩티드들, 즉 인간 부갑상선 호르몬 1-34(PTH1-34) 및 인간 펩티드 YY 3-36(PYY3 -36)을 PN159(표 20에 제시된 Papp 데이터)가 존재시 및 부재시에 생체 외 모델에서 시험하였다. PN159가 부재시에, 이러한 두가지 펩티드들의 Papp는 칼시토닌에 대한 것과 일치하였다. PTH1 -34의 경우에, PN159의 존재는 Papp에서 약 3-5 배 증가를 부여하였다. PYY3-36이 PN159의 존재시에 제형되면, Papp는 약 12- 내지 17-배 증가되었다. 이러한 데이터는 TJMP가 저분자물질들 및 단백질들에 대한 경상피 약물 전달을 향상시켰다는 우리의 발견을 일반화시킨것을 확인한 것이다.
실시예 32
TJMP 의 화학적 안정도
PN159의 화학적 안정도를 치료적으로 적합한 저장 조건 하에서 결정하였다. HPLC 방법을 채용하였다는 것을 나타내는 안정도이다. 용액들(50 mM)을 다양한 pH(4.0, 7.3 및 9.0) 및 온도(5 ℃, 25 ℃, 35 ℃, 40 ℃, 및 50 ℃) 조건들에서 저장하였다. pH 4에서의 표본들은 10 mM 시트르산 완충제를 포함하였다. pH 7.3 및 9.0에서의 표본들은 10 mM 인산염 완충를 포함하였다. 저장 안정도 결과들(아레니우스 플롯 포함)은 PN159가 낮은 온도 및 pH에서 화학적으로 가장 안정하였다는 것을 보인다. 예를 들어, 5 ℃ 및 pH 4.0 또는 7.3에서 6 개월 저장하는 동안 PN159가 실질적으로 100 % 회복되었다. 저장 온도가 25 ℃로 올라가면, 6 개월 후에 pH 4 또는 pH 7에서의 표본들에 대한 천연 PN159가 7 % 및 26 % 손실이 각각 있었다. pH 9 및/또는 상승된 온도, 예컨대, 40 내지 50 ℃에서는 PN159의 급속한 열화(deterioration)이 잇따랐다. 4.0 내지 7.3의 pH 범위 및 동결 내지 주변의 온도 범위는 비강내 제형들에 대한 가장 적절한 것이다. 그러므로, 이러한 데이터는 TJMP는 IN 제형들에 적절한 저장 조건 하에서 화학적 일체성을 유지할 수 있음을 지지하는 것이다.
실시예 33
비강내 투여에 의한 토끼들에서의 밀착 연접 조절 펩티드들의 생체 내 평가
토끼들에서의 약동학(PK) 연구를 실시하여 비강내(IN) 전달을 통해 투여되는 다양한 밀착 연접 조절 펩티드들(TJMPs)과 펩티드 YY(PYY)의 혈장 약동학적 특성을 평가하였다.
동물 모델
본 연구에서, 뉴질랜드 백색 토끼들(Hra: (NZW) SPF)을 시험 피검자들로 사용하여 비강내 투여 및 정맥 내 주입에 의한 MC-4RA의 혈장 약동학을 평가하였다. 동물들의 처리는 USDA Anmal Welfare 법(9 CFR Parts 1, 2, 및 3)에 약술된 규정들 및 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(ILAR publication, 1966, National Academy Press)에 규정된 조건들을 준수하였다.
토끼를 본 연구에 대한 동물 피검자로 선정하였는데, 이는 토끼에게 투여된 약물로부터 유도된 약동학 프로파일이 인간에게서의 동일한 약물에 대한 PK 프로파일과 밀접하게 유사하다는 점에서 그러하다.
투여
시험된 9 개의 TJMP들에 대한 실험 설계 및 투여 방법은 표 31에 요약하였다. 모든 실험 그룹들에게 개별 TJMP 또는 인산염 완충 식염수(PBS; 음성 대조군)와 결합시킨 205 ㎍/㎏ PYY(3-36)를 비강내(IN) 투여에 의하여 투여하였다. 각각의 제형을 피펫과 일회용 플라스틱 팁을 이용하여 좌측 비강속으로 일 회 투여하였다. 상기 동물의 머리를 뒤쪽으로 기울여 모세관 현상으로 용액을 비강속으로 빨아들이도록 하기 위하여 동물에 의해 흡입시에 투여하였다. IN 투여 후에, 투여량의 손실을 방지하기 위하여 상기 동물의 머리를 약 15 초 동안 뒤로 젖혀 둔 위치에 놓아두었다. 상기 절차가 진행되는 동안, 잠재적으로 비강내 점막과의 접촉으로 인해 임의의 조직 손상을 방지하기 위하여 극도의 주의를 다하였다.
시험 그룹들의 요약
그룹 동물들의 수 경로 밀착 연접 조절자 (농도) PYY3 (㎍/kg)
1 5M 비강내 PBS 205
2 5M 비강내 PN159(50μM) 205
3 5M 비강내 PN161(100μM) 205
4 5M 비강내 PN202(100μM) 205
5 5M 비강내 PN27(250μM) 205
6 5M 비강내 PN58(500μM) 205
7 5M 비강내 PN73(500μM) 205
8 5M 비강내 PN228(500μM) 205
9 5M 비강내 PN183(1000μM) 205
10 5M 비강내 PN556(1000μM) 205
PN556은 PN283과 동일한 제 1 서열을 가지지만, 펩티드의 N-말단에서 말레이미드의 변형이 있다.
혈액 및 혈장 표본 수집
IN에 의한 투여 후에, 계열 혈액 표본들을 말단 귀 정맥의 직접 정맥 천자에 의하여 각각의 동물로부터 채취하였다. 혈액 표본들을 주입전, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120 및 180 분 후에 수집하였다. 디포타슘(dipotassium) EDTA를 항응고제로 포함하는 튜브들 속에 표본들을 수집하였다. 원심분리할 때까지 상기 튜브들을 냉각시켰다. 수집한지 한 시간 이내에 모든 표본들을 원심분리하였다. 혈장을 수거하여 사전에 라벨이 붙은 플라스틱 바이알들에 옮겨넣어 건조한 얼음/아세톤 베스에 동결시켜 약동학 분석을 실시할 때까지 약 -70 ℃에서 저장하였다.
각각의 혈액 채취 시간에 임상 관찰들을 실시하였고 IN 투여 시험 그룹들에서의 모든 동물들에 대한 양쪽 비강의 검사를 5 분 및 1 시간 후-비강내 투여 직전에 실시하였다.
분석 방법
모든 연구 그룹들에서의 각각의 동물로부터 채취한 표본들을 ELISA를 이용하여 PYY(3-36) 레벨들에 대하여 분석하였다. 투여 전후에 시험 물품들(test articles)을 품질 통제를 위하여 HPLC 상에서 가동하였다. 혈장 분취량들(0.1 mL)은 생체-분석 내부 표준을 첨가한 후에 아세토니트릴로 침전된 단백질이었다. 상청액을 질소로 건조시키고, HPLC 완충제로 액상화하고 HPLC 시스템에 주입하였다. 유출액은 양이온 전기분무 이온화 탠덤 삼중 사중극 질량 분광계에 의하여 검출된다. 약동학 데이터를 WinNonlin(Pharsight Corp., Mountain View)에 의하여 분석하였다.
결과
각각의 시험 그룹에 대한 평균 혈장 약동학 변수들을 표 32에 요약하였다. 임의의 제형들을 투여한 후에 어떠한 나쁜 임상적 징조들이 관찰되지 않았다. IN을 통한 동물 투여 제형들의 양쪽 비강의 후-비강내(post-intranasal) 검사에서 임의의 조홍(redness) 이나 팽윤(swelling)도 드러나지 않았다. PK 연구는 Cmax(최대 관찰 농도), tmax(최대 농도 시간) 및 AUC (곡선 아래 면적)last와 무한(inf)을 평가하였다. 생체 내 투과율이 가장 높은 레벨인 TJMP들을 포함하는 Tier I 및 생체 내 투과율이 점진적으로 낮아지는 레벨을 지닌 TJMP들을 포함하는 각각의 후속 Tier를 지닌 생체 내 투여의 레벨에 따라 8개의 TJMP들의 순위를 매겨 4 개의 다른 성과층들로 분류하였다.
표 32
약동학 데이터의 요약
그룹 생체 내 Tier 랭킹 T1 /2 Tmax (min) Cmax (pg/mL) AUClast (min*pg/mL) AUCinf (min*pg/mL)
PBS 86.0 22.0 806 4.5x104 6.81x104
PN159 I 30.2 17.0 30200 1.52x106 1.55x106
PN161 I 34.3 24.0 32100 1.62x106 1.65x106
PN202 I 29.9 33.0 29300 1.67x106 1.71x106
PN27 II 30.4 31.0 21200 1.06x106 1.08x106
PN58 II 34.1 32.0 12700 7.35x105 7.63x105
PN73 III 29.5 43.0 12800 8.3x105 8.71x105
PN228 IV 53.8 37.0 8220 3.46x105 3.55x105
PN183 IV 33.7 22.0 5440 2.58x105 2.75x105
PN556 IV 51.2 22.0 4620 2.47x105 2.80x105
실시예 34
정제
하기 PEG화된 PN159 펩티드들은 합성되었다(표 33):
합성된 PEG화된 PN159 펩티드들의 목록
PN526 (서열번호 58) PEG-KLALKLALKALKAALKLA-amide
PN537 (서열번호 59) PEG(5000Da)-KLALKLALKALKAALKLA-amide
PN570 (서열번호 60) NH2-KLALKLALKALKAALKLA-PEG1-amide
PN571 (서열번호 61) PEG1-KLALKLALKALKAALKLA-PEG1-amide
PN572 (서열번호 62) PEG3-KLALKLALKALKAALKLA-amide
0.1 % TFA와 3 mL 아세트산을 포함하는 물 15 mL에 정제되지 않은 펩티드 150 mg을 녹인다. 교반 및 초음파처리 후에, 혼합물을 1.5 mL 에펜도르프 튜브들에 이송하고 13000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 Millex GV 0.22 um 주사기 필터를 통해 여과시켰다. 본 용액을 5 mL/min의 유속으로 5 mL 주입 루프(injection loop)를 통해 Zorbx 300SB C18 칼럼(21.2 mm ID x 250 mm, 7 um 입자 크기)으로 옮겨 넣는다. 용매 A가 물속의 0.1 % TFA이고 용매 B가 아세토나이트릴 속의 0.1 % TFA인 0.2 % B/min의 선형 AB 구배(gradient)를 작동시켜 정제를 실시하였다. 이러한 조건 하에서 펩티드는 15-17 % B의 범위에 걸쳐서 용출되었다.
실시예 35
세포들
인간 기관/기관지 조직 모델인 EpiAirwayTM 세포들(96 웰 포맷(Air-196-HTS) 내 또는 개별 24 웰 삽입물(Air-100))을 MatTek Corporation(Ashland, MA)로부터 구입하여 경상피 전기 저항(TER) 및 투과성에 미치는 효과에 기초하여 밀착 연접 조절 펩티드들(TJMPs)에 대한 스크리닝을 실시하였다. 배양된 조직은 단일 증여자로부터 온 것이며 HIV, B형 간염, C형 간염, 마이코플라즈마, 박테리아, 효모 및 진균에 대하여 음성으로 스크린되었다.
EpiAirway 조직들은 배지-보충된 아가로스 젤 상에 냉각된 채로 선적되었다. 제조자가 공급한 배지와 함께 24 시간 동안 37 ℃에서 상기 EpiAirway 조직들을 회복하였다. EpiAirway 모델들에 대한 완전한 배지(Epi-CM)는 DMEM, EFG 및 기타 요소들, 젠타마이신(5 ug/ml), 암포테리신 B(0.25 ug/ml) 및 pH 표시자로서 페닐 레드를 포함하였다.
실시예 36
TER 측정
자동화된 조직 저항 시스템(REMS)(World Precession Instrument(WPI), Inc. (Sarasota, Florida))을 이용하여 Air-196-HTS에 대한 TER 측정을 실시하였다. 96 웰 HTS 포맷에서의 TER 모니터링에 대하여, 오염을 방지하기 위하여 조직 배양 후드 내에서 Endhom-Multi(STX)를 사용하였다. 하룻밤 회복된 삽입물에 대하여, 100 ul 배지를 첨부 측면에 사용하였고 250 ul을 기저측부 챔버에 사용하였다. 배경 TER을 블랭크 삽입물(Millipore)로 측정하였고 조직 삽입물로부터 차감하였다. 삽입물을 페이퍼 타월쪽으로 거꾸로 돌려서 배지를 따라 내었다. 이후 삽입물을 페이퍼 타월 상에서 가볍게 두드려서 첨부 배지가 최대로 제거되도록 한다. 다른 TER 측정 시간 지점들에 대하여, 처리 이후 즉시, 삽입물들을 150 ul Epi-CM으로 3 회 천천히 헹궈 내고 TER 측정 전에 완전히 물을 빼낸다.
결과들(도 8)은 단일막 상피 세포 상에 본 발명의 밀착 연접 조절 펩티드 PN159와 PN159의 PEG화된 버젼 양쪽 모두가 상피 투과성 향상에 대하여 강하고, 가역적인 효과를 가진다는 것을 실증한다. 양쪽에 대하여 관찰된 효과는 예상할 수 있는 방식으로 발생한다. 또한, 결과는 PEG-159가 PN159 단독으로 있을 때보다 이온성 투과율을 상당히 향상시킨다(TER 감소)는 것을 보여준다. PEG-PN159와 159 사이에서 TER의 최대 차이는 50 uM PEG-PN159에서이다.
실시예 37
투과성 분석
플루오세인 이소티오사이아네이트(FITC)가 표지된 덱스트린(MW 3,000)을 0.1-1 mg/ml의 처리 혼합물에 첨가하였다. 처리 혼합물을 첨부벽 측면에 첨가하였고, 플레이트들을 100 rpm으로 지정된 시간 동안 오비탈 쉐이커(New Brunswick Scientific, Edison, NJ) 내에서 37 ℃로 배양하였다. 배양이 종료될 무렵에, 3 벌의 200 ul 염기성 배지를 암-벽 형광 판독 플레이트로 이송한다. 470 nm에서의 형광 세기를 마이크로플레이트 형광 판독기 FLx800(BIO-TEK INSTRUMENTS, INC, Winoosik, VT)에 의해 측정하였다. 표준의 계열 희석(serial dilutions of standard)을 이용하여 표준 곡선을 구하였고 농도를 계산하였다. 투과성을 증여자 질량(첨부 챔버)의 비율로서 또는 수용자 질량(기저 챔버)의 비율로서 퍼센티지로 표현되는 2 가지 방식으로 측정하였다.
PTH 투과의 상당한 증가를 본 발명의 PN159 및 PEG-PN159가 양쪽 모두 존재시에 관찰되었다. 양쪽 모두가 있을 때 관찰된 효과는 10 uM 및 100 uM 사이에서 의존하는 농도이다. 또한, 결과는 PEG-PN159가 PN159보다 분자 투과를 상당히 더 향상시킨다는 것을 보여준다.
PEG-PN159의 투과성 증가를 PN159(도 10에서 양쪽 값들 사이에 비율로 플롯됨)와 비교하였을 때, 투과 증가의 최대 차이는 50 uM 농도에서이다.
실시예 38
세포독성 분석
LDH 시험을 이용하여 처리물의 세포독성을 평가하였다. 제조자의 프로토콜을 따라 CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxic Assay(Promega, Madison, WI)에 의하여 LDH 레벨을 결정하였다. 기저-측부 LDH 레벨들에 대하여, 3 벌의 50 ul 염기성 배지를 사용하여 LDH 레벨을 결정하였다. 첨부 LDH 레벨에 대하여, 희석된 첨부 표본 150 ul을 첨부 챔버에 Epi-CM 150 ul을 첨가하여 제거하였고, 배지는 피펫팅하여 혼합하였고, 150 ul 배지를 제거하였고 3 벌의 50 ul에서 분석을 위해 2x 희석(최종 8-배 희석) 하였다. 전체 LDH 레벨을 0.9 % Triton-X100의 최종 농도에서 세포들을 용균시켜 결정하였다. 각각의 표본에서의 LDH 레벨은 Triton-X100 세포 용균의 퍼센티지로 표현되었다. 결과(도 11)는 PEG-PN159가 PN159보다 낮은 독성을 가지는 것을 보여준다.
실시예 39
토끼들에서의 약동학 데이터
약 3 개월된 25 마리의 뉴질랜드 백색 토끼들을 본 연구에 사용하였다. 토끼들은 밀착 연접(TJ) 펩티드 및 PYY3-36 그룹의 일 투여를 한쪽 비강으로 피펫과 일회용 플라스틱 팁을 이용하여 단일 비강내 투여를 받았다. 토끼들은 TJ 펩티드 및 대조군들에 따라 투여되고 표 34에 보여진다. TJ 펩티드들(PN407, PN408, PN526(PEG-PN159), 및 PN159)은 모두 칼슘과 마그네슘이 있는 0.75x DPBS내에 있다. 음성 대조군은 칼슘과 마그네슘만 포함하는 0.75x DPBS이다. 시트르산 완충제 내에서 DDPC, EDTA, 및 MbCD를 포함하는 TJ 펩티드가 없는 양성 PYY3-36 대조군 제형을 비교를 위해 사용하였다(PDF).
투여가 전달됨에 따라 동물의 머리를 뒤로 살며시 젖혔다. 투여 후에, 동물의 머리를 약 15 초 정도 뒤로 젖혀진 채로 두었다. EDTA를 항응고제로 포함하는 혈액 수집 튜브들에 말단 귀 정맥으로부터 직접 정맥천자에 의하여 계열 혈액 표본들(각각 약 1.5 mL)을 수집하였다. 혈액 표본들은 비강내 그룹들에 대하여 투여후 0(투여전), 5, 10, 15, 30, 45, 60, 120 및 240 분에 혈액 표본들을 수집하였다. 수집후에 항응고를 위하여 튜브들을 몇 회 기울였다. 이후 50 μL의 아프로티닌을 수집 튜브들에 첨가하고 천천히 그렇지만 완전히 혼합하였다. 혼합된 표본들을 약 4 ℃에서 15 분 동안 약 1,600 X g로 원심분리할 때까지 냉각 팩 상에 두었다. 혈장을 두벌의 분취량(각각 약 0.35 mL)으로 나누었고 약 -70 ℃에서 저장하였다.
토끼의 약동학 연구에 대한 투여 그룹들
그룹 펩티드 제형 및 투약 경로 PYY3 -36 투여 (mg/mL) 투여 부피 (mL/kg) 투여 수준 (㎍/kg) pH
1 PN407 비강내 13.67 0.015 205 4.0
2 PN408 비강내 13.67 0.015 205 4.0
3 PN526 (PEG-PN159) 비강내 13.67 0.015 205 4.0
4 PN159 비강내 13.67 0.015 205 4.0
5 인산염 완충 용액(PBS) 비강내 13.67 0.015 205 4.0
6 양성 대조군(PDF) 비강내 13.67 0.015 205 4.0
토끼 혈장에서의 PYY3-36의 생체 분석 시험을 상업적인 ELISA kit("활성 총 펩티드 YY(PYY) ELISA", Cat. No. DSL-10-33600, Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX)로 실시하였다. 상기 시험은 효소적으로 증폭된 "일-단계" 샌드위치-형 면역시험이다. 상기 시험에서, 측정기(calibrator), 대조군(control) 및 미지의 표본을 다른 항-PYY 항체로 코팅된 마이크로타이트레이션(microtitration) 웰들에서의 항-PYY 항체로 배양하였다. 배양 및 세척 후에 상기 웰들을 색소 생산성 기질, 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)으로 배양한다. 이후 산성 정지 용액을 첨가하고 기질의 효소적 회전(enzymatic turnover) 정도를 450 및 620 nm에서 이중 파장 흡광 측정에 의하여 결정한다.
5개 파라미터 로지스틱 데이터 리덕션(five-parameter logistic data reduction) 방법을 측정기 결과에 적용하여 각각의 시험에 대한 보정 곡선을 생성한다. 보정 곡선을 사용하여 흡광 결과로부터 미지의 표본들의 PYY 농도 값들을 내삽한다(interpolate). 키트 구성요소들을 하기의 예외들로 한 시험의 모든 단계들에 이용하였다; 측정기(calibrator)과 대조군은 희석제로서 스트립된(C18 고체상 추출 칼럼) 풀 토끼 혈장과 함께 제조하며; 그리고 미지의 표본들을 필요하면 스트립된 풀 토끼 혈장에 희석시킨다. 본 키트 내의 항체 결합을 최적화시켜 손상되지 않은 인간 PYY1-36를 검출하고 쥐 PYY1 -36 및 인간 PYY3 -36과 완전히 교차 반응성이 있다.
대조군(PBS 및 PDF) 및 TJ 펩티드들(PN159, PN407, PN408, 및 PN526) 제형들에 대한 평균 약동학(PK) 데이터 및 표준 편차들(SD)이 표 35에 제시되어 있다. 각각의 밀착 연접 조절자 및 대조군에 대한 상대적 생체 이용도(%BA)는 표 36에 제시되어 있다. 약동학 변수들에 대한 변화의 퍼센트 계수는 표 37에 제시되어 있다.
토끼들에게서 PYY3 -36에 대한 평균 PK 변수들 및 표준 편차들(SD)
제형 Tmax (min) Cmax (pg/mL) AUClast (min*pg/mL) AUCinf (min*pg/mL) t1/2 (min) Kel (1/min)
PBS 33.75 2646.25 118438.13 147625.18 83.12 0.009
SD 18.87 1381.06 23611.86 42331.68 22.53 0.003
PDF 30.00 19004.40 1289219.50 1319034.73 38.56 0.019
SD 10.61 8174.32 589127.80 612688.59 11.12 0.005
PN159 27.00 18346.60 973038.80 985572.89 34.43 0.021
SD 19.56 9671.72 549668.76 546060.77 7.20 0.005
PN407 21.00 13980.20 725950.50 753080.86 47.46 0.016
SD 8.22 7124.99 388368.38 397975.49 14.51 0.004
PN408 15.00 15420.00 721601.50 758951.24 44.23 0.016
SD 0.00 7644.40 361013.89 360247.20 8.23 0.003
PN526 27.00 36066.20 1786973.50 1819888.30 41.04 0.018
SD 6.71 22447.13 1065867.60 1084222.74 9.66 0.005
밀착 연접 조절자들의 % 생체이용도
제형 AUClast (min*pg/mL) %F
PBS 118438.13 9.19
PDF 1289219.50
PN159 973038.80 75.48
PN407 725950.50 56.31
PN408 721601.50 55.97
PN526 1786973.50 138.61
약동학 변수들에 대한 변화의 % 계수
제형 Tmax (min) Cmax (pg/mL) AUClast (min*pg/mL) AUCinf (min*pg/mL)
PBS 55.9 52.2 19.9 28.7
PDF 35.4 43.0 45.7 46.4
PN159 72.4 52.7 56.5 55.4
PN407 39.1 51.0 53.5 52.8
PN408 0.0 49.6 50.0 47.5
PN526 24.8 62.2 59.6 59.6
수량화의 하한(Lower Limit of Quantification, LLOQ)은 15.8 pg/mL인 것으로 생각되었다. <숫자인 임의의 원 데이터 값은 분석을 위해 7.9 pg/mL로 설정되었다. 비강 투여 후에 평균 PYY3 -36 혈장 농도는 도 12에서 선형 플롯으로 도시되고, 도 13에서 로그-선형 플롯으로 도시된다. 비강 투여된 동물에 대한 PYY3-36의 평균 혈청 농도는 모든 그룹들에 대하여 투여 후 15-34 분 사이의 피크 농도들(Tmax)를 나타내었다. 205 μg/kg의 투여 레벨에서 비강 PBS; PDF; PN159; PN407; PN408 및 PN526에 대한 평균 Cmax는 각각 2,646.25; 19,004.40; 18,345.60; 13,980.20; 15,420.00 및 36,066.20 pg/mL이었다. 비강 PBS; PDF; PN159; PN407; PN408 및 PN526에 대한 평균 AUClast는 각각 118,438.13; 1,289,219.50; 973,038.80; 725,950.50; 721,601.50 및 1,786,973.50 min*pg/mL이었다. 비강 PBS; PDF; PN159; PN407; PN408 및 PN526에 대한 평균 AUCinf는 각각 147,625.18; 1,319,034.73; 985,572.89; 753,080.86; 758,951.24 및 1,819,888.30 min*pg/mL이었다. 모든 비강 제형들에 대한 t1/2은 약 35-48 분이었다; 하지만, PBS는 83 분이었다. 표준 편차들을 포함하는 모든 약동학 변수들의 완전한 목록을 알려면 표 35를 참조하라. PDF 제형 대 밀착 연접 조절자에 대한 AUClast에 기초한 % BA는 PN159, PN407, PN408 및 PN526에 대하여 각각 75, 56, 56 및 139 %이었다. PBS % 생체이용도는 PDF에 비하여 겨우 9 %이었다. 변화의 계수도 비교하였다(표 37). 모든 밀착 연접 조절자들은 제형들간에 Cmax 및 AUC에 대하여 약동학 변수들을 비교하면 유사한 변이를 가졌다. 5개 모든 제형 그룹들에 대한 약동학 변수를 변이 모델의 일방(one-way) 분석을 이용하여 분석하였고 PBS 제형이 Cmax, AUClast 및 AUCinf에 대하여 PN526보다 상당히 더 낮은 것을 알게 되었다(Tmax: p=0.27; Cmax: p=0.009; AUClast: p=0.008; AUCinf: p=0.0097).
Cmax를 비교하면, PEG화된 밀착 연접 조절 PN526은 1.9 배 더 높고 PBS, PN407, 및 PN408과는 각각 13.6, 2.6 및 2.3 배 더 크다. AUClast를 비교하면, PEG화된 밀착 연접 조절 PN526은 PDF보다 1.4 배 더 높고 PBS, PN407 및 PN408보다는 각각 15.1, 2.5 및 2.5 배 더 크다. t1/2는 PBS의 80 분을 제외하고는 모든 그룹들에 대하여 40 분 정도 정도였다.
약동학 변수들 Cmax와 AUC를 비교하면 PN526과 PBS사이의 상당한 차이가 있었다; 그러나, 밀착 연접 조절자들 사이에는 의미가 없었다.
다른 모든 밀착 연접 조절자들과 비교하여 PN526에 대해 생체이용도가 증가 되었고 약동학 변수들은 PBS 대조군 제형과 비교하여 통계적으로 의미가 있었다. 이러한 데이터는 PEG화된 펩티드 제형 PN526이 PEG화된 펩티드, PN159, PN407, PN408, 및 PBS 없이 제형들보다 %BA를 증가시켰다는 것을 보여준다. 또한 PN526에 대한 %BA는 PEG화된 펩티드 PDF 없는 양성 대조군보다 더 컸었다.
여기에 주어진 예들은 예시의 목적으로만 위한 것이며 청구항들에 설명된 바와 같이 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다. 비록 특정한 용어와 값들을 여기에 채용하였음에도, 그러한 용어와 값들은 대표적인 것으로 이해해야지 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 개시에 인용된 모든 발행물들과 참고 문헌들은 모든 목적을 위해 그대로 참조로 포함된다.
도 1은 추가적인 향상제들(Me-β-CD, DDPC, EDTA)과 함께 PN159를 이용한 PTH1-34의 투과에 미치는 PN159의 효과를 도시한다.
도 2는 추가적인 향상제들이 없이 PN159를 이용한 PTH1 -34의 투과에 미치는 PN159의 효과를 도시한다.
도 3은 펩티드 PYY의 생체 내 투과에 미치는 PN159의 효과를 도시한다.
도 4는 MC-4 수용체 작용제(agonist)의 투과에 미치는 PN159의 효과를 도시한다.
도 5는 상피 단일층의 40 mg/ml 갈란타민 락테이트(galantamine lactate) 생체 외 투과에 미치는 25 - 100 μM PN159의 효과를 도시한다.
도 6은 TJM 펩티드의 (A) 5 ℃, (B) 25 ℃, 및 (C) 40 ℃에서의 TJM 펩티드의 화학적 안정성을 도시한다. pH4.0, pH7.3 및 pH9.0에 대한 데이터는 각각 속이 채워진 다이아몬드(-◆-), 열린 사각형(-□-), 및 속이 채워진 삼각형(-▲-)으로 제시된다.
도 7은 각각의 밀착 연접 조절 펩티드(TJMP)의 존재시에 FITC-덱스트란 MW4000의 투과 반응 속도론(kinetics)을 도시한다. PYY 제형은 양성 대조군으로서 작용하였고 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline: PBS)는 음성 대조군이었다. 세포를 상기 TJMP 및 FITC-덱스트란 MW4000과 함께 15 분 처리 후에 세포 투과를 시험하였고, 또한 60 분 처리 후의 세포 투과도 시험하였다. 그래프는 투과가 상기 TJMP와 상피 세포가 접촉하는 시간에 의존하고 시험된 모든 TJMP들은 FITC-덱스트란 MW4000의 투과를 향상시킨다는 것을 보여준다.
도 8은 PN159 및 PEG-PN159의 1-시간 처리 후에 경상피 전기 저항(transepithelial electric resistance: TER)이 감소한 것을 도시한다.
도 9는 PN159 및 PEG-PN159와의 처리 후에 FITC 덱스트란 3000의 투과율이 증가한 것을 도시한다.
도 10은 PN159 및 PEG-PN159의 투과 비율을 도시한다.
도 11은 PN159의 페질화로 독성을 감소시킨다는 것을 도시한다(LDH 시험).
도 12는 PEG화된 펩티드 PN529(PEG-PN159)와의 비강 투여 후에 향상된 평균 혈장 PYY3-36 농도를 도시한다.
도 13은 PEG화된 펩티드 PN529(PEG-PN159)와의 비강 투여 후에 향상된 평균 혈장 PYY3-36 농도를 도시한다(로그-직선 도표).

Claims (78)

  1. 포유류의 점막에 활성을 가지는 펩티드-포함 화합물로서, 상기 점막의 투과성을 조절하여 활성제 또는 그 약학적으로-수용가능한 염의 점막 상피 수송을 향상시키는 것을 특징으로 하는 펩티드-포함 화합물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩티드는 10 킬로달톤 미만의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩티드는 밀착 연접 조절 펩티드(tight junction modulating peptide)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물은 단백질 전달 영역(protein transduction domain), DNA-결합 영역(DNA-binding domain), 또는 융합생성 영역(fusogenic domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물은 징크 핑거(zinc finger) 영역을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물은 60 % 이상의 라이신, 류신, 및/또는 알라닌 잔기들을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물은 알파-나선(alpha-helix)을 형성하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 투과성은 생체 외 또는 생체 내인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 투과성은 가역적으로 향상되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 투과성은 실질적으로 약 90 분 미만의 기간인 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 투과성은 약 60 분 미만의 기간 동안 실질적으로 향상되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 투과성은 상기 점막 내에서 실질적인 세포용해(cytolysis)를 일으키지 않고 향상되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 투과성은 상기 점막 내에서 세포 생존(viability)을 유지하면서 향상되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 투과성은 점막 지질 유동성을 증가시킴으로써 향상되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물은 펩티드 PN159인 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물은 PN159의 유사체(analog), 접합체(conjugate), 유도체(derivative), 변이체(variant), 단편(fragment), 모방체(mimetic), 융합 분자(fusion molecule), 또는 복합체(complex)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩티드는 서열번호 1 내지 72로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩티드는 서열번호 32 내지 35, 38, 46 내지 49 및 55로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물은 수용성 사슬에 공유적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 화합물은 약 300 킬로달톤 미만의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  21. 청구항 19에 있어서,
    상기 화합물은 약 200 킬로달톤 미만의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물은 폴리(알킬렌 옥사이드) 사슬에 공유적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 폴리(알킬렌 옥사이드) 사슬은 측쇄형(branched) 또는 비측쇄형(unbranched)을 특징으로 화합물.
  24. 청구항 22에 있어서,
    상기 폴리(알킬렌 옥사이드) 사슬은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬인 것을 특징으로 하는 화합물.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 PEG는 약 0.2 내지 약 200 킬로달톤(kDa) 사이의 분자 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  26. 청구항 24에 있어서,
    상기 PEG는 40 킬로달톤 미만의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  27. 청구항 24에 있어서,
    상기 PEG는 20 킬로달톤 미만의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  28. 청구항 24에 있어서,
    상기 PEG는 10 킬로달톤 미만의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  29. 청구항 24에 있어서,
    상기 PEG는 5 킬로달톤 미만의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  30. 청구항 24에 있어서,
    상기 PEG는 2 킬로달톤 미만의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  31. 청구항 22에 있어서,
    상기 폴리(알킬렌 옥사이드)는 2.00 미만의 다분산도(polydispersity) 값(Mw/Mn)을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  32. 청구항 22에 있어서,
    상기 폴리(알킬렌 옥사이드)는 1.20 미만의 다분산도 값(Mw/Mn)을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  33. 청구항 22에 있어서,
    상기 화합물과 상기 폴리(알킬렌 옥사이드)는 스페이서 모이어티(spacer moiety)를 통하여 결합되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  34. 청구항 1 내지 33중 어느 한 항에 따른 화합물의 점막 상피 수송-향상 효과적인 양 및 활성제의 치료적으로-효과적인 양을 포함하는 약학적 제형.
  35. 청구항 34에 있어서,
    상기 제형은 점막 조직 장벽을 가로질러 전기 저항을 감소시키는 것을 특징으로 하는 제형.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 전기적 저항의 감소는 80 % 이상인 것을 특징으로 하는 제형.
  37. 청구항 34에 있어서,
    상기 제형은 청구항 1-33 중의 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하지 않는 유사한 제형에 대하여 점막 조직 장벽을 가로질러 활성제의 투과성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 제형.
  38. 청구항 37에 있어서,
    상기 투과성의 증가는 2 배 이상인 것을 특징으로 하는 제형.
  39. 청구항 37에 있어서,
    상기 투과성은 세포주위성(paracellular)인 것을 특징으로 하는 제형.
  40. 청구항 37에 있어서,
    상기 증가된 투과성은 밀착 연접의 조절로부터 기인하는 것을 특징으로 하는 제형.
  41. 청구항 37에 있어서,
    상기 투과성은 세포횡단성(transcellular), 또는 세포횡단성 및 세포주위성의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제형.
  42. 청구항 37에 있어서,
    상기 점막 조직 장벽은 상피 세포층인 것을 특징으로 하는 제형.
  43. 청구항 42에 있어서,
    상기 상피 세포는 기관(tracheal), 기관지(bronchial), 폐포(alveolar), 비강(nasal), 폐(pulmonary), 위장관(gastrointestinal), 표피(epidermal), 및 구강(buccal)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제형.
  44. 청구항 42에 있어서,
    상기 상피 세포는 비강인 것을 특징으로 하는 제형.
  45. 청구항 34에 있어서,
    상기 활성제는 펩티드, 단백질 또는 핵산인 것을 특징으로 하는 제형.
  46. 청구항 45에 있어서,
    상기 펩티드 또는 단백질은 2 내지 1000 개의 아미노산들로 구성되는 것을 특징으로 하는 제형.
  47. 청구항 45에 있어서,
    상기 펩티드 또는 단백질은 2 내지 50 개의 아미노산들 사이로 구성되는 것을 특징으로 하는 제형.
  48. 청구항 45에 있어서,
    상기 펩티드 또는 단백질은 고리형(cyclic)인 것을 특징으로 하는 제형.
  49. 청구항 45에 있어서,
    상기 펩티드 또는 단백질은 다이머 또는 올리고머인 것을 특징으로 하는 제형.
  50. 청구항 45에 있어서,
    상기 펩티드 또는 단백질은 GLP-1, PYY3-36, PTH1-34 및 Exendin-4로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제형.
  51. 청구항 45에 있어서,
    상기 단백질은 베타-인터페론, 알파-인터페론, 인슐린, 적혈구생성소(erythropoietin), G-CSF, GM-CSF, 성장 호르몬, 및 그 유사체들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제형.
  52. 청구항 34 내지 51 중 어느 한 항에 따른 제형을 포함하는 투여 형태(dosage form)로, 그 투여형태는 액체인 것을 특징으로 하는 투여 형태.
  53. 청구항 52에 있어서,
    상기 액체는 방울(droplet) 형태인 것을 특징으로 하는 투여 형태.
  54. 청구항 52에 있어서,
    상기 액체는 에어로졸 형태인 것을 특징으로 하는 투여 형태.
  55. 청구항 34 내지 51 중 어느 한 항에 따른 제형을 포함하는 투여 형태로, 그 투여형태는 고체인 것을 특징으로 하는 투여 형태.
  56. 청구항 55에 있어서,
    상기 고체는 투여 전에 액체에서 액상화되는 것을 특징으로 하는 투여 형태.
  57. 청구항 55에 있어서,
    상기 고체는 분말로 투여되는 것을 특징으로 하는 투여 형태.
  58. 청구항 55에 있어서,
    상기 고체는 캡슐, 정제(tablet) 또는 겔 형태인 것을 특징으로 하는 투여 형태.
  59. 청구항 34 내지 58 중 어느 한 항에 따른 제형의 제공, 및 동물의 점막 표면과 상기 제형의 접촉을 포함하는 상기 동물에 분자를 투여하는 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, 상기 점막 표면은 비강내(intranasal)인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 청구항 34 내지 58 중 어느 한 항에 따른 제형의 제공, 및 포유류에 상기 제형의 투여를 포함하는 상기 포유류에 비강내로-투여되는 활성제의 생체 이용도를 증가시키는 방법.
  62. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 siRNA인 것을 특징으로 하는 화합물.
  63. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 dsDNA인 것을 특징으로 하는 화합물.
  64. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 조혈제(hematopoietic), 항감염제(antiinfective); 항치매제(antidementia); 항바이러스제(antiviral), 항종양제(antitumoral), 해열제(antipyretic), 진통제(analgesic), 항염증제(anti-inflammatory), 항궤양제(antiulcerative), 항알레르기제(antiallergenic), 항우울제(antidepressant), 향정신성제(psychotropic), 강심제(cardiotonics), 항부정맥제(antiarrythmic), 혈관확장제(vasodilator), 혈압강하제(antihypertensive), 저혈압 이뇨제(hypotensive diuretic), 항당뇨병제(antidiabetic), 항응고 제(anticoagulants), 콜레스테롤 저하제(cholesterol lowering agent), 골다공증 치료제(therapeutic for osteoporosis), 호르몬, 항생제, 또는 백신인 것을 특징으로 하는 화합물.
  65. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 사이토카인(cytokines), 펩티드 호르몬, 성장 인자, 심혈관계 상에 작용하는 인자(cardiovascular factor), 세포 접착 유착 인자(cell adhesion factor), 중추 또는 말초 신경계 상에 작용하는 인자, 체액성 전해질(humoral electrolytes) 인자, 혈액 유기 물질(hemal organic substances), 뼈 성장 인자, 위장계에 작용하는 인자, 신장에 작용하는 인자, 결합 조직에 작용하는 인자; 감각기관에 작용하는 인자, 면역계에 작용하는 인자, 호흡계에 작용하는 인자, 또는 생식기관에 작용하는 인자인 것을 특징으로 하는 화합물.
  66. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 안드로겐, 에스트로겐, 프로스타글란딘(prostaglandin), 소마토트로핀, 생식선자극호르몬(gonadotropin), 인터루킨(interleukins), 스테로이드 또는 사이토카인인 것을 특징으로 하는 화합물.
  67. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 간염, 인플루엔자, 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 파라인플루 엔자 바이러스(PIV), 결핵, 카나리아 발진증(canary pox), 수두, 홍역, 유행성 이하선염(mumps), 풍진(rubella), 폐렴, 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 백신인 것을 특징으로 하는 화합물.
  68. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 디프테리아, 파상풍(tetanus), 슈도모나스(pseudomonas), 또는 결핵균(mycobacterium tuberculosis)에 대한 세균성 톡소이드(bacterial toxoid)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  69. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 히루젠(hirugen), 히루로스(hirulos), 또는 히루딘(hirudine)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  70. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간화된 항체(humanized antibody), 항체 단편, 또는 면역글로빈인 것을 특징으로 하는 화합물.
  71. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 몰핀, 하이드로몰폰(hydromorphone), 옥시몰폰(oxymorphone), 로보르파놀(lovorphanol), 레발로판(levallorphan), 코데인(codeine), 날메 펜(nalmefene), 날로르핀(nalorphine), 날로존(nalozone), 날트렉손(naltrexone), 부프레노르핀(buprenorphine), 부토르파놀(butorphanol), 또는 날부핀(nalbufine)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  72. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 코르티손(cortisone), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 플루드로코르티손(fludrocortisone), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 트라이암시놀론(triamcinolone), 덱사메토아손(dexamethoasone), 베타메토아손(betamethoasone), 파라메토아손(paramethoasone), 또는 플루오시놀론(fluocinolone)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  73. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 콜히친(colchicine), 아세트아미노펜(acetaminophen), 아스피린, 이부프로펜(ibuprofen), 케토프로펜(ketoprofen), 인도메타신(indomethacin), 나프록센(naproxen), 멜록시캄(meloxicam) 또는 피록시캄(piroxicam)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  74. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 아시클로버(acyclovir), 리바바린(ribavarin), 트리플루오로 시리딘(trifluorothyridine), Ara-A(아라비노퓨라노실아데닌)(Arabinofuranosyladenine)), 아실구아노신(acylguanosine), 노르데옥시구아노신(nordeoxyguanosine), 아지도티미딘(azidothymidine), 디데옥시아데노신(dideoxyadenosine), 또는 디데옥시시티딘(dideoxycytidine)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  75. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 스파이로놀락톤(spironolactone), 테스토스테론, 에스트라디올(estradiol), 프로제스틴(progestins), 생식선자극호르몬, 에스트로겐, 또는 프로게스테론인 것을 특징으로 하는 화합물.
  76. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 파파베린(papaverine), 니트로글리세린(nitroglycerin), 혈관활성 장 펩티드(vasoactive intestinal peptide), 칼시토닌 관련 유전자 펩티드(calcitonin related gene peptide), 시프로헵타딘(cyproheptadine), 독세핀(doxepin), 이미프라민(imipramine), 시메티딘(cimetidine), 덱스트로메토르판(dextromethorphan), 클로자릴(clozaril), 수퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase), 뉴로엔케팔리나제(neuroenkephalinase), 암포테리신 B(amphotericin B), 그리세오풀빈(griseofulvin), 미코나졸(miconazole), 케토코나졸(ketoconazole), 티오코나졸(tioconazol), 이트라코나졸(itraconazole), 플루코 나졸(fluconazole), 세팔로스포린(cephalosporin), 테트라사이클린(tetracyclines), 아미노글루코시드(aminoglucosides), 에리스로마이신(erythromicin), 겐타마이신(gentamicin), 폴리믹신 B(polymyxin B), 5-플루오로우라실(5-fhiorouracil), 블레오마이신(bleomycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 히드록시우레아(hydroxyurea), 디데옥시이노신(dideoxyinosine), 플록수리딘(floxuridine), 6-메르캅토퓨린(6-mercaptopurine), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), I-다루비신(I-darubicin), 택솔(taxol), 파클리탁셀(paclitaxel), 토코페롤(tocopherol), 퀴니딘(quinidine), 프라조신(prazosin), 베라파밀(verapamil), 니페디핀(nifedipine), 또는 딜티아젬(diltiazem)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  77. 청구항 1에 있어서,
    상기 활성제는 조직 플라스미노겐 활성제(TPA), 상피세포 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF) (FGF-산성 또는 염기성), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 전환 성장 인자(TGF) (TGF-알파 또는 베타), 혈관활성 장 펩티드, 종양 괴사 인자(TNF), 시상하부 유리 인자(hypothalamic releasing factor), 프로락틴(prolactin), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 부신피질자극 호르몬(ACTH), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone: PTH), 여포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 엔돌핀(endorphin), 글루카곤(glucagon), 칼시토닌(calcitonin), 옥시토신(oxytocin), 카르베토신(carbetocin), 알도에테콘(aldoetecone), 엔카팔 린(enkaphalins), 소마토스틴(somatostin), 소마토트로핀(somatotropin), 성장촉진제(somatomedin), 알파-멜라닌세포 자극 호르몬(alpha-melanocyte stimulating hormone), 리도카인(lidocaine), 수펜타이닐(sufentainil), 터부탈린(terbutaline), 드로페리돌(droperidol), 스코폴라민(scopolamine), 고나도렐린(gonadorelin), 시클로피록스(ciclopirox), 부스피론(buspirone), 칼시토닌, 크로몰린 나트륨 또는 미다졸람(cromolyn sodium or midazolam), 사이클로스포린(cyclosporin), 리시노프릴(lisinopril), 캅토프릴(captopril), 델라프릴(delapril), 라니티딘(ranitidine), 파모티딘(famotidine), 수퍼옥시드 디스무타아제, 아스파라기나아제(asparaginase), 아르기나제(arginase), 아르기닌 데아미네아제(arginine deaminease), 아데노신 데아미나제 리보뉴클레아제(adenosine deaminase ribonuclease), 트립신(trypsin), 케모트립신(chemotrypsin), 파파인 (papain), 봄베신(bombesin), 물질 P(substance P), 바소프레신(vasopressin), 알파-글로불린(alpha-globulins), 트랜스페린(transferrin), 피브리노겐(fibrinogen), 베타-리포프로테인(beta-lipoprotein), 베타-글로불린(beta-globulin), 프로트롬빈(prothrombin), 세룰로플라스민(ceruloplasmin), 알파2-글리코프로테인(alpha2-glycoprotein), 알파2-글로불린(alpha2-globulin), 페투인(fetuin), 알파1-리포프로테인(alpha1-lipoprotein), 알파1-글로불린(alpha1-globulin), 알부민(albumin), 또는 프레알부민(prealbumin)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  78. 청구항 1의 화합물을 포함하는 용액, 및 점막, 비강내 또는 폐 스프레이를 위한 작동기(actuator)를 포함하는 약학적 제품.
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