KR20080033501A - 증식성 질환 또는 염증의 치료를 위한3,11ｂ-시스-디히드로테트라베나진 - Google Patents

Abstract

본 발명은 증식성 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 화합물의 용도, 3,11b-시스-디히드로테트라베나진인 상기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.

3,11b-시스-디히드로테트라베나진, 증식성 질환, 시그마 수용체, 테트라베나진

Description

증식성 질환 또는 염증의 치료를 위한 3,11Ｂ-시스-디히드로테트라베나진{3,11B-CIS-DIHYDROTETRABENAZINE FOR THE TREATMENT OF A PROLIFERATIVE DISEASE OR AN INFLAMMATION}

본 발명은 염증성 질환 및 암의 예방 또는 치료를 위한 디히드로테트라베나진의 용도에 관한것이다.

암은 비정상적이고 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 질환들의 군을 총칭하는 용어이다. 정상적으로는, 세포는 신체가 그것들을 필요로 하는 경우에만 성장하고 새로운 세포를 형성하도록 분열한다. 세포가 성장하여 사멸하는 경우 새로운 세포가 그 자리를 대신한다. 세포 내 유전자 돌연변이는 때때로 신체가 필요로 하지 않는 때에 새로운 세포를 형성하고, 늙은 세포가 죽어야 할 때 죽지 않게 하는 방식으로 상기 과정을 교란시킨다. 이러한 여분의 세포들은 병적 증식, 신생물 또는 종양이라 일컫는 다량의 조직을 형성한다. 종양은 양성(암적이지 않은) 또는 악성(암적인)이다. 악성 종양은 확장될(전이될) 수 있고 치명적인 데 반해, 양성 종양은 신체의 다른 부위로 확장되지 않고, 그다지 치명적이지 못하다. 암은 하나의 세포 내에서 기원하며 따라서 그것이 기원하는 세포의 유형 및 세포의 위치에 따라 분류될 수 있다. 따라서, 선종은 선 조직으로부터 기원하고, 암종은 상피 세포로부터 기원하며, 백혈병은 골수 줄기 세포에서 시작하고, 림프종은 림프액 분비 조직으로부터 기원하고, 흑색종은 멜라닌 세포로부터 발생하고, 육종은 뼈 또는 힘줄의 결합조직에서 시작하고, 기형종은 생식 세포 내에서 시작한다.

암을 치료하기 위한 다양한 방법이 존재하며, 가장 흔하게는 수술, 화학요법 및 방사선요법이다. 일반적으로 치료법의 선택은 종양의 위치와 등급 및 질환의 정도에 좌우된다. 만일 종양이 국부적인 경우, 종종 수술이 바람직한 치료법이 다. 일반적인 수술 과정의 예로는 전립선 암에 대한 전립선절제술 및 유방 암에 대한 유방절제술을 들 수 있다. 수술의 목적은 종양만을 또는 전체 기관을 제거하는 것이다. 하나의 암 세포가 상당한 크기의 종양으로 성장할 수 있기 때문에, 종양만을 제거하는 것은 재발 확률이 높다. 화학요법은 암 세포를 파괴하거나 그의 성장을 방지할 수 있는 약물로 암을 치료하는 것과 관련된다. 암 화학요법에 의해 개발된 대체 메카니즘은 종양에 공급하는 혈관을 파괴하는 작용을 하는 항혈관형성제 및 종양 조직에 대한 숙주 면역 반응을 강화시키는 작용을 하는 면역치료제(immunotherapeutic agent)를 포함한다. 정상 세포는 조절된 방식으로 성장하고 사멸한다. 암이 발생할 경우, 신체의 비정상적인 세포는 조절되지 않고 더 많은 세포의 분열 및 형성을 유지시킨다. 항암 약물 중 일종은 분열세포를 죽이거나 성장 또는 증식을 멈추게함으로써 작용한다. 건강한 세포, 특히 그 중 분열이 빠른 세포 역시 피해를 받으며, 이는 부작용으로 이어진다. 방사선요법은 암 세포를 죽이고 종양을 줄이기 위한 전리 방사선의 사용과 관련된다. 방사선요법은 치료대상 영역의 세포("표적 조직")의 유전형질에 손상을 가함으로써 그 세포를 손상시키거 나 파괴시켜서 그들 세포의 성장 및 분열의 지속을 불가능하게 하는 것이다. 방사선이 암 세포 및 정상 세포 양측에 손상을 준다 하더라도, 대부분의 정상 세포는 방사선의 영향으로부터 회복하여 적절하게 기능할 수 있다. 방사선요법의 목적은, 근처의 건강한 조직에는 제한적인 위해를 가하되 가능한한 많은 암 세포를 손상시키는 것이다. 방사선요법은 뇌, 유방, 경부, 후두, 폐, 췌장, 전립선, 피부, 척추, 위, 자궁 또는 연조직 육종(soft tissue sarcomas)의 암을 포함한 거의 모든 유형의 고체 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한 방사선은 백혈병 및 림프종 (각각 조혈 세포 및 림프계의 암)을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

시그마 (σ) 수용체의 리간드는 종양 세포의 성장을 억제하는 능력이 있다고 보고되어 왔다(참조: Berthois et al., British Journal of Cancer, (2003), 88, 438-446). 보우리(Bourrie) 등 역시 시그마 수용체의 두 하부유형 및 그들과 관련된 두 단백질 또한 종양 세포에 발현된다고 보고하였다(참조: Current Opinion in Investigational Drugs, (2004) 5(11):1158-63).

시그마 수용체는, 한때 아편수용체의 하부유형으로 간주되었던 세포 표면 수용체이나, 수용체의 분석 및 수용체에 대한 특정 리간드의 발견 후 현재는 아편수용체와는 별개인 것으로 설명되고 있다(참조: Bourrie et al., (2004)).

시그마 수용체는 시그마-1 (σ-1) 및 시그마-2 (σ-2) 하부유형으로 분류될 수 있다. 223 개의 아미노산을 함유하는 것으로 믿어지는 σ-1 수용체는 복제되어왔고(참조: Hanner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1996) 93:8072-8077), 다른 어떤 수용체 부류에도 1차 서열상동성을 나타내지 않음이 밝혀졌다. 그러나, 이것은 진균성 스테롤 C8-C7 이성화효소의 서열과 30.3%의 동일성을 갖고, 상기 효소와 높은 상동성을 공유하는, 기능이 알려지지 않은 또다른 단백질 SRBP2 (SR-31747 결합단백질 2)와도 관련되었음이 밝혀졌다. σ-2 수용체는 아직 복제되지 않았다.

왕(Wang) 등은 사람의 유방암 내의 시그마-1 수용체의 발현을 조사하였고, 일부의 정상적인 및 가장 종양성인 유방 상피 세포와 세포계가 공통적으로 시그마-1 수용체를 발현한다고 결론지은 것으로부터 정상 조직에 비해 유방암에서 64%의 시그마-1 수용체 mRNA의 과도발현을 발견하였다(참조: Breast Cancer Research & Treatment, (2004), 87(3):205-14). 또한 이들은 비특이적 시그마-1 리간드인 할로페리돌(haloperidol) 고농도는 이러한 세포의 성장을 억제하고 체외에서의 화학요법의 효과를 증대시킨다는 것을 발견하였다.

베토이스(Berthois) 등은 사람의 상피 유방 및 전립선 암 세포계의 증식에 대한 시그마 수용체 리간드 SR31747A의 영향을 측정한 연구를 기술하였다(2003). 이들은, 체외에서, 나노몰 단위의 SR31747A 농도로 호르몬-반응성 및 호르몬-무반응성 암 세포계 양측의 세포 증식을 현저히 억제하였음을 보고하였다. 또한 이들은 SR31747A로 처치된 마우스 내에서 종양 발달이 현저하게 저하되었음을 발견하였다.

스프루스(Spruce) 등은 수용체 길항제의 작은 분자가 발전의 성장을 억제하고 부작용 없이 면역손상 마우스 내에 호르몬-민감성 및 호르몬-비민감성 유방 암종 제노그래프, 동소(orthotopic) 전립선 종양 및 p53-null 폐 암종 제노그래프를 확립시켰다고 보고하였다(참조: Cancer Research,, (2004), 64: 4875-4886). 이들은 σ-1 길항제가 종양 세포에서의 세포자멸사(계획된 세포 사멸)를 유도하지만 대부분의 정상 세포 유형에서는 그렇지 않음을 발견하였다. 스프루스 등은 σ-1 길항제의 사용이 정상적인 조직을 남기면서 종양을 죽이는 방법을 제시할 수 있을 것이라고 결론지었다.

암 세포의 증식을 방해하는 것에 수용체 리간드를 사용한 다른 보고서는 스프루스 등(2004)의 인용문헌에서 찾을 수 있다(참조: Brent et al., Eur. J. Pharmacol., (1995), 278:151-60 및 Crawford et al., Cancer Research, (2002), 62:313-22).

그러므로 시그마 수용체 리간드가 암 세포계의 증식을 억제할 수 있고 암 세포에서의 세포자멸사를 유도할 수 있음이 매우 확고하게 확립되어 있으며, 이러한 증거에 기초하여 시그마-1 길항제와 같은 시그마 수용체 리간드가 암 치료에의 유용성이 입증될 것으로 파악된다.

또한, 시그마 수용체 리간드는 소염 활성을 갖는 것으로 보고되어 왔다. 예를 들어, 보우리 등은 사노피-신텔라보 르세르쉬(Sanofi-Synthelabo Recherche) 화합물 SSR125329A (화학명 [(Z)-3-(4-아다만탄-2-일-3,5-디클로로-페닐)-알릴]-시클로헥실-에틸아민)가 강한 소염 특성과 친화성이 높은 시그마 수용체 리간드라고 보고하였다(참조: Eur. J. Pharmacol, (2002), 456(1-3):123-31). 보우리 등은 이들의 연구의 결과가 시그마 수용체 리간드가 류마티즘성 관절염 치료법에 대한 새로운 효과적 접근법을 대표할 수 있는 실체적인 증거를 제공한다고 결론지었다.

또다른 사노피 시그마 수용체 길항제(SR31747)는 현재 류마티즘성 관절염의 치료를 위한 임상시험 중이다.

테트라베나진(화학명: 1,3,4,6,7,11b-헥사히드로-9,10-디메톡시-3-(2-메톡시프로필)-2H-벤조(a)퀴놀리진-2-온)은 1950년대 후반부터 약제학적 약물로서 사용되어 왔다. 초기에 항정신병제로서 개발된 테트라베나진은 현재 과다운동성 활동 장애, 예컨대 헌팅톤 병(Huntington's disease), 편무도병, 노인성 무도병, 틱 경련, 지연성 운동장애 및 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome) 등의 대증요법에서 사용된다(참조: Jankovic et al., Am. J. Psychiatry. (1999) Aug; 156(8):1279-81 및 Jankovic et al., Neurology (1997) Feb; 48(2):358-62).

테트라베나진의 화학 구조는 하기 그림 1에 나타낸 바와 같다.

상기 화합물은 키랄 중심이 3 및 11b 위치의 탄소 원자에 있으며 그에 따라 이론적으로는 하기 그림 2에 나타낸 바와 같이 전체 4 개의 이성질체 형태가 존재할 수 있다.

상기 그림 2에는, 각 이성질체의 입체화학 형태가 칸, 인골드 및 프레로그(Cahn, Ingold and Prelog)에 의해 "R과 S" 용어를 사용하여 정의된다(참조: Advanced Organic Chemistry by Jerry March, 4^th Edition, John Wiley & Sons, New York, 1992, pages 109-114). 상기 그림 2에서 및 본 특허 출원의 다른 곳에서 "R" 또는 "S" 지정은 탄소 원자의 위치 번호 순서대로 주어진다. 따라서, 예를 들어 RS는 3R,11bS를 약칭으로 표기한 것이다. 유사하게, 3 개의 키랄 중심이 존재하는 경우, 하기 디히드로테트라베나진에서와 같이 "R" 또는 "S" 지정은 탄소 원자 2, 3 및 11b의 순서에 따라 나열된다. 따라서, 2S,3R,11bR 이성질체는 약칭 형태인 SRR로서 언급되며 이하 동일한 방식이다.

상업적으로 입수가능한 테트라베나진은 RR 및 SS 이성질체의 라세미 혼합물이고, RR 및 SS 이성질체(3 및 11b 위치의 수소 원자가 트란스- 관계의 배향을 갖기 때문에 이하에서 개별적으로 또는 총체적으로 트란스-테트라베나진으로 언급됨)가 가장 열역학적으로 안정된 이성질체인 것으로 보인다.

테트라베나진은 생체이용률이 약간 불충분하고 변동성이 있다. 이것은 첫번째-통과 대사작용에 의해 다량 대사되고, 거의 남지 않은 불변의 테트라베나진은 소변에서 전형적으로 발견된다. 주요 대사물은 테트라베나진의 2-케토 기를 환원시킴에 의해 제조되는 디히드로테트라베나진 (화학명: 2-히드록시-3-(2-메톡시프로필)-1,3,4,6,7,11b-헥사히드로-9,10-디메톡시-벤조(a)퀴놀리진)이고, 약물의 활성을 주로 책임지는 것으로 여겨진다(참조: Mehvar et al., Drug Metab.Disp, 15, 250-255 (1987) 및 J. Pharm. Sci., 76, No.6, 461-465 (1987)).

4개의 디히드로테트라베나진 이성질체는 모두 모 테트라베나진의 더 안정적인 RR 및 SS 이성질체로부터 유래되고 3 및 11b 위치의 수소 원자가 트란스- 관계의 배향을 갖기 때문에 이들 이성질체는 사전에 확인되었고 분석되었다(참조: Kilbourn et al., Chirality, 9:59-62 (1997) 및 Brossi et al., Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, pp1793-1806 (1958)). 4 개의 이성질체는 (+)-α-디히드로테트라베나진, (-)-α-디히드로테트라베나진, (+)-β-디히드로테트라베나진 및 (-)-β-디히드로테트라베나진이다. 4 개의 공지된 디히드로테트라베나진 이성질체의 구조는 하기 그림 3에서 나타낸 바와 같다고 생각된다.

킬본(Kilbourn) 등은 의식있는 래트의 뇌 속의 개개의 방사능표지된 디히드로테트라베나진 이성질체의 특이적 결합을 조사하였다(참조: Eur. J. Pharmacol., 278:249-252 (1995) 및 Med. Chem. Res., 5:113-126 (1994)). 이들은 (+)-α-[¹¹C]디히드로테트라베나진 (2R,3R,11bR) 이성질체가, 고농도의 신경세포성 막 도파민 전달체(DAT) 및 다공질 모노아민 전달체(VMAT2)와 연관된 뇌 부위에 축적되었음을 발견하였다. 그러나, 본질적으로 비활성인 (-)-α-[¹¹C]디히드로테트라베나진 이성질체는 뇌 속에 거의 균일하게 분포되어 있어, DAT 및 VMAT2에 대한 특이적 결합이 발생하지 않음이 암시되었다. 생체내 연구는 체외 연구와 상호관련이 있어 (+)-α-[¹¹C]디히드로테트라베나진 이성질체가 [³H]메톡시테트라베나진에 대한 K_i이 (-)-α-[¹¹C]디히드로테트라베나진 이성질체에 대한 K_i보다 2000 배 초과로 나타나는 것을 설명한다.

본 출원인의 선행 국제특허출원 제PCT/GB2005/000464호에서 테트라베나진의 불안정한 RS 및 SR 이성질체(3 및 11b 위치의 수소 원자가 시스- 관계의 배향을 갖기 때문에 이하에서 개별적으로 또는 총체적으로 시스-테트라베나진으로 언급됨)로부터 유래된 디히드로테트라베나진 이성질체의 약제학적 조제 및 사용을 개시하였다. 제PCT/GB2005/00464호에는 시스-디히드로테트라베나진 이성질체가 시그마-1 및 시그마-2 수용체에 결합하는 실험 자료가 포함되어 있으나, 시그마 수용체 결합 활성을 활용하는 치료학적인 어떠한 사용도 개시되지 않았다.

발명의 요약

본 발명은 본 출원인의 선행 국제특허출원 제PCT/GB2005/000464호에서 염증성 질환 및 암의 치료법으로 기술된 시스-디히드로테트라베나진의 사용에 관한 것이다.

따라서, 첫번째 일면은, 본 발명은 증식성 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 3,11b-시스-디히드로테트라베나진을 제공한다.

한가지 양태에서, 증식성 질환은 암이다.

따라서, 본 발명은 증식성 질환 예컨대 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 3,11b-시스-디히드로테트라베나진을 제공한다.

또한 본 발명은 하기의 것을 제공한다:

ㆍ증식성 질환 예컨대 암 치료용 약제의 제조를 위한 3,11b-시스-디히드로테트라베나진의 용도.

ㆍ비정상 세포 성장으로부터 발생한 질환 상태 또는 병(예를 들어 암)의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 3,11b-시스-디히드로테트라베나진의 용도.

ㆍ포유류 내의 비정상 세포 성장을 포함하거나 이로부터 발생한 질환 또는 상태(예를 들어 암)을 치료하는 방법으로서, 시스-디히드로테트라베나진을 치료학적 유효량으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법.

ㆍ포유류 내의 비정상 세포 성장을 포함하거나 이로부터 발생한 질환 또는 상태(예를 들어 암)를 치료하는 방법으로서, 비정상 세포 성장을 억제하기에 유효한 양으로 시스-디히드로테트라베나진을 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법.

ㆍ포유류 내의 비정상 세포 성장을 포함하거나 이로부터 발생한 질환 또는 상태(예를 들어 암)의 발병률을 경감시키거나 감소시키는 방법으로서, 비정상 세포 성장을 억제하기에 유효한 양으로 시스-디히드로테트라베나진을 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법.

본 발명의 화합물은 이하로부터 선택된 1 이상의 암의 치료 또는 예방에 유효하다고 관찰된다.

선종;

암종;

백혈병;

림프종;

흑색종;

육종; 및

기형종.

억제되거나 치료될 수 있는 암의 특정한 예로서는 암종, 예를 들어 방광, 유방, 결장(결장 암종, 예컨대 결장 선암종(adenocarcinoma) 및 결장 선종), 신장, 상피, 간, 폐 등의 암종, 예를 들어 선암종, 소세포폐암 및 비소세포폐암종, 식도, 담낭, 난소, 췌장 예를 들어 외분비 췌장 암종, 위, 경부, 갑상선, 전립선, 또는 피부, 예를 들어 편평세포암종; 림프 혈통의 조혈성 종양, 예를 들어 백혈병, 급성 림프성 백혈병, B세포 림프종, T세포 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 모발상 세포 림프종 또는 버킷 림프종(Burkett's lymphoma); 골수 혈통의 조혈성 종양, 예를 들면 급성 및 만성 골수 백혈병, 골수형성이상증후군, 또는 전골수구성 백혈병; 갑상선 소포암; 중간엽 기원 종양, 예를 들어 섬유육종 또는 횡문근육종(habdomyosarcoma); 중추 또는 말초 신경계의 종양, 예를 들어 별아교세포종, 신경모세포종, 신경아교종 또는 신경집종; 흑색종; 고환종; 기형암종; 골육종; 색소성 건피증(xenoderoma pigmentosum); 각질가시세포종(keratoctanthoma); 갑상선 소포암; 또는 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 등을 들 수 있으며 여기에 제한되는 것은 아니다.

특히, 시스-디히드로테트라베나진의 사용에 의해 치료되거나 억제될 수 있는 암은 시그마 수용체 리간드, 예를 들어 σ-1 길항제에 민감한 암이다.

시스-디히드로테트라베나진의 사용에 의해 치료되거나 억제될 수 있는 암의 추가적인 예는 시그마 수용체가 과다-발현되는 암이다.

하나의 특정한 양태에서, 암은 유방 암종이다.

또다른 특정한 양태에서, 암은 전립선 종양, 예를 들어 동소 전립선 종양이다.

추가적인 특정한 양태에서, 암은 폐암이다.

또다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 염증성 질환의 치료에서의 사용을 위한 3,11b-시스-디히드로테트라베나진을 제공한다.

또한 본 발명은 하기를 제공한다:

ㆍ염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 3,11b-시스-디히드로테트라베나진의 용도.

ㆍ환자(예를 들어 사람과 같은 포유류)의 염증성 질환 또는 상태의 예방 또는 치료를 위한 방법으로서, 3,11b-시스-디히드로테트라베나진을 치료학적 유효량으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법.

염증성 질환 및 병의 예로서는 류마티즘성 관절염, 골관절염, 외상관절염, 통풍관절염, 풍진성 관절염, 건선성 관절염 및 다른 관절염성 상태; 급성 또는 만성 염증성 질환 상태, 예컨대 내독소에 의해 유발된 염증성 반응 또는 염증창자질환; 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 통풍, 류마티즘양척추염, 만성 폐 염증성 질환, 크론 병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염을 들 수 있으며 여기에 제한되는 것은 아니다.

특정 염증성 질환 및 상태는 시그마 수용체 리간드, 예를 들어, 시그마 수용체 길항제에 민감한 것이다.

하나의 특정 염증성 질환은 류마티즘성 관절염이다.

본 발명에서 사용된 시스-디히드로테트라베나진은 3,11b,시스-디히드로테트라베나진이다.

본 발명에서 사용된 3,11b-시스-디히드로테트라베나진은 실질적으로 순수한 형태, 예를 들어 이성질체 순도가 90% 초과이고, 전형적으로는 95% 초과이며, 가장 바람직하게는 98% 초과이다.

본원에서 "이성질체 순도"라는 용어는 모든 이성질체 형태의 디히드로테트라베나진의 전체 양 또는 농도에 대한 3,11b-시스-디히드로테트라베나진의 상대적인 존재량을 지시한다. 예를 들어, 조성물 중 존재하는 총 디히드로테트라베나진의 90%가 3,11b-시스-디히드로테트라베나진이라면, 이성질체 순도는 90%이다.

본 발명에서 사용된 11b-시스-디히드로테트라베나진은 조성물 중 실질적으로 3,11b-트란스-디히드로테트라베나진이 없는 형태일 수 있으며, 바람직하게는 5% 미만의 3,11b-트란스-디히드로테트라베나진, 더욱 바람직하게는 3% 미만의 3,11b-트란스-디히드로테트라베나진, 그리고 가장 바람직하게는 1% 미만의 3,11b-트란스-디히드로테트라베나진이다.

본원에서 사용된 "3,11b-시스-"라는 용어는 디히드로테트라베나진 구조의 3- 및 11b-위치의 수소 원자가 시스 관계의 배향이라는 의미이다. 따라서, 본 발명의 이성질체는 화학식 (I) 및 이의 거울상 이성질체(좌우대칭의 상)의 화합물이다.

3,11b-시스 배위를 갖는 디히드로테트라베나진의 가능한 4 개의 이성질체가 있고, 이들은 2S,3S,11bR 이성질체, 2R,3R,11bS 이성질체, 2R,3S,11bR 이성질체 및 2S,3R,11bS 이성질체이다. 상기 4 개의 이성질체는 유리되고 분석되어, 본 발명의 또다른 일면으로 개개의 3,11b-시스-디히드로테트라베나진 이성질체를 제공한다. 특히, 본 발명은 하기의 것을 제공한다:

(a) 화학식 (Ia)를 갖는 3,11b-시스-디히드로테트라베나진의 2S,3S,11bR 이성질체:

(b) 화학식 (Ib)를 갖는 3,11b-시스-디히드로테트라베나진의 2R,3R,11bS 이성질체:

(c) 화학식 (Ic)를 갖는 3,11b-시스-디히드로테트라베나진의 2R,3S,11bR 이성질체:

및

(d) 화학식 (Id)를 갖는 3,11b-시스-디히드로테트라베나진의 2S,3R,11bS 이성질체:

본 발명의 개개의 이성질체는 분광, 광학 및 크로마토그래프 특성에 의해 분석될 수 있고, X-선 결정학에 의해 측정되는 절대적 입체화학적 배위에 의해서도 분석될 수 있다.

어떠한 특정한 절대적 배위 또는 입체화학을 내포하지 않고, 상기 신규한 4 개의 이성질체를 하기와 같이 분석할 수 있다:

이성질체 A

ORD(메탄올, 21℃)로 측정된 광학적 활성 : 좌선성 (-)

실질적으로 표 1에서 기술된 바와 같은 IR 스펙트럼(KBr 고체), ¹H-NMR 스펙트럼(CDCl₃) 및 ¹³C-NMR스펙트럼 (CDCl₃).

이성질체 B

ORD(메탄올, 21℃)로 측정된 광학적 활성 : 우선성 (+)

실질적으로 표 1에서 기술된 바와 같은 IR 스펙트럼(KBr 고체), ¹H-NMR 스펙트럼(CDCl₃) 및 ¹³C-NMR 스펙트럼(CDCl₃) 그리고 실시예 4에서 기술된 바와 같은 X-선 결정학적 특성.

이성질체 C

ORD(메탄올, 21℃)로 측정된 광학적 활성 : 우선성 (+)

실질적으로 표 2에서 기술된 바와 같은 IR 스펙트럼(KBr 고체), ¹H-NMR 스펙트럼(CDCl₃) 및 ¹³C-NMR 스펙트럼(CDCl₃).

이성질체 D

ORD(메탄올, 21℃)로 측정된 광학적 활성 : 좌선성 (-)

실질적으로 표 2에서 기술된 바와 같은 IR 스펙트럼(KBr 고체), ¹H-NMR 스펙트럼(CDCl₃) 및 ¹³C-NMR 스펙트럼(CDCl₃).

각각의 이성질체에 대한 ORD 값은 하기 실시예에 주어졌으나 이러한 값들은 예로서 주어진 것이고 이성질체의 순도의 정도 및 다른 변수들 예컨대 온도 변동 및 잔기 용매 분자의 영향에 따라 변화할 수 있음을 유념해야한다.

거울상 이성질체 A, B, C 및 D는 실질적으로 각각 거울상 이성질체로 순수한 형태로 또는 본 발명의 다른 거울상 이성질체와의 혼합물로서 제출된다.

본원에서 "거울상 이성질체의 순도" 및 "거울상 이성질체적으로 순수한"이라는 용어는 모든 거울상 이성질체 및 이성질체 형태의 디히드로테트라베나진의 전체 양 또는 농도에 대한 3,11b-시스-디히드로테트라베나진의 주어진 거울상 이성질체의 상대적인 존재량을 지시한다. 예를 들어, 조성물 중 존재하는 총 디히드로테트라베나진의 90%가 단일 거울상 이성질체의 형태라면, 거울상 이성질체의 순도는 90%이다.

예로서, 본 발명의 각각의 일면과 양태에서, 이성질체 A, B, C 및 D로부터 선택된 개개의 거울상 이성질체 각각은 적어도 55%(예컨대 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%) 순도의 거울상 이성질체로 존재할 수 있다.

또한, 본 발명의 이성질체는 1 종 또는 그 이상의 이성질체 A, B, C 및 D의 혼합물의 형태로 제출될 수 있다. 이러한 혼합물은 라세미 혼합물 또는 비-라세미 혼합물일 수 있다. 라세미 혼합물의 예로서 이성질체 A와 이성질체 B의 라세미 혼합물 및 이성질체 C와 이성질체 D의 라세미 혼합물을 들 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 염

본원에 다른 요구 조건이 없다면, 본 출원에서 디히드로테트라베나진 및 이의 이성질체로 언급하는 것은 디히드로테트라베나진의 유리 염기뿐 아니라 이의 염의 범주를 포함하는 것이고 특히 산 부가염을 포함한다.

산 부가염을 제조하는 특정한 산은 3.5 미만, 더욱 일반적으로는 3 미만의 pKa 값을 갖는 산을 포함한다. 예를 들어, 산 부가염은 +3.5 내지 -3.5 범위의 pKa 값을 갖는 산으로부터 제조할 수 있다.

바람직한 산 부가염은 술폰산, 예를 들어 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠 술폰산, 톨루엔 술폰산, 장뇌 술폰산 및 나프탈렌 술폰산으로 제조된 것을 포함한다.

산 부가염을 제조하는 특정한 하나의 산은 메탄술폰산이다.

산 부가염은 이하의 방법 또는 종래의 화학적 방법, 예컨대 문헌[Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002]에 기술된 방법으로 제조할 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은, 물 또는 유기 용매 내에서 또는 이 둘의 혼합물 내에서, 화합물의 유리 염기 형태를 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로서 제조할 수 있고; 일반적으로는, 비-수성 매체 예컨대 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니 트릴이 사용된다.

상기 염기는 전형적으로 약제학적으로 허용가능한 염이다. 그러나, 약제학적으로 허용불가능한 염들도 이후 약제학적으로 허용가능한 염으로 전환될 수 있는 중간체 형태로서 제조될 수 있다. 이러한 비-약제학적으로 허용가능한 염의 형태 또한 본 발명의 부분을 형성한다.

디히드로테트라베나진 이성질체의 제조 방법

본 발명의 디히드로테트라베나진은 화학식 (II)의 화합물과 화학식 (II)의 화합물 내의 2,3-이중 결합을 수화시키는데 적합한 시약(들)과의 반응을 포함하는 공정에 의해 제조될 수 있고:

이후에 바람직한 디히드로테트라베나진 이성질체 형태를 분리하고 유리하는 것이 필요하다.

2,3-이중결합의 수화는, 붕산 시약 예컨대 디보란 또는 보란-에테르(예를 들어 보란-테트라히드로푸란(THF))을 사용하여 붕수소화시켜 중간체 알킬 보란 부가물을 수득한 다음, 알킬 보란 부가물을 산화시키고 염기의 존재하에서 가수분해함으로써 수행될 수 있다. 붕수소화는, 일반적으로 비-상승된 온도, 예를 들어 실온 에서 건조된 극성 비-양성자성 용매 예컨대 에테르(예를 들어 THF) 내에서 전형적으로 수행된다. 보란-알켄 부가물은, 수산화 이온의 근원을 제공하는 염기, 예컨대 수산화암모늄 또는 알칼리 금속 수산화물, 예를 들어 수산화칼륨 또는 수산화나트륨의 존재하에서 산화제, 예컨대 과산화수소로 전형적으로 산화된다. 공정 A 반응의 붕수소화-산화-가수분해 순서는 2- 및 3-위치의 수소 원자가 트란스 관계의 배향을 갖는 디히드로테트라베나진 이성질체를 전형적으로 제공한다.

화학식 (II)의 화합물은 테트라베나진을 환원시켜 디히드로테트라베나진을 수득한 다음, 디히드로테트라베나진을 수화시켜 제조할 수 있다. 테트라베나진의 환원은 알루미늄 하이드라이드 시약 예컨대 리튬 알루미늄 하이드라이드 또는 보로하이드라이드 시약 예컨대 나트륨 보로하이드라이드, 칼륨 보로하이드라이드 또는 보로하이드라이드 유도체, 예를 들어 알킬 보로하이드라이드 예컨대 리튬 트리-sec-부틸 보로하이드라이드를 사용하여 수행할 수 있다. 또는, 환원 단계에 접촉수소화, 예를 들어 라니(Raney) 니켈 또는 백금 산화물 촉매를 사용하여 영향을 줄 수 있다. 환원 단계를 수행하는 적당한 조건은 이하에 상세히 기술되어 있거나, 미국 특허 제2,843,591호 (Hoffmann-La Roche) 및 문헌[Brossi et al., Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, pp1793-1806 (1958)]에서 발견할 수 있다.

환원 반응을 위한 시작 물질로서 사용된 테트라베나진이 전형적인 RR 및 SS 이성질체 (즉, 트란스-테트라베나진)의 혼합물이기 때문에, 환원 단계에 의해 제조된 디히드로테트라베나진은 3- 및 11b 위치의 근처에서 동일한 트란스 배위를 가질 것이고, 상기 그림 3에서 나타낸 하나 또는 그 이상 공지된 디히드로테트라베나진 이성질체의 형태를 취할 것이다. 따라서 공정 A는 디히드로테트라베나진의 공지된 이성질체를 취하여, 이를 탈수하여 알켄 (II)을 제조하고, 이후 본 발명에 필수인 신규한 시스 디히드로테트라베나진 이성질체를 수득하는 조건을 사용하여 알켄 (II)을 "재수화(rehydrating)"하는 것을 수반한다.

디히드로테트라베나진을 알켄 (II)으로 탈수하는 것은 알코올을 탈수하여 알켄을 제조하기 위한 다양한 표준 조건을 사용하여 수행할 수 있다(참조: J. March (idem) pages 389-390 및 이의 참고문헌). 이러한 조건들의 예로는 인계 탈수제, 예컨대 인 할로겐화물 또는 인 옥시할로겐화물, 예를 들어 POCl₃ 및 PCl₅를 들 수 있다. 직접 탈수하는 것에 대한 대안으로서, 디히드로테트라베나진의 히드록실기를 이탈기 L 예컨대 할로겐(예를 들어 염소 또는 브롬)으로 전환하고 이후에 H-L을 제거하기 위한 조건(예를 들어 염기의 존재)에 적용할 수 있다. 히드록실기를 할로겐화물로 전환하는 것은 숙련된 화학자에게 익히 공지된 방법, 예를 들어 트리알킬 또는 트리아릴 포스핀 예컨대 트리페닐 포스핀 또는 트리부틸 포스핀의 존재하에서 사염화탄소 또는 사브롬화탄소와 반응시키는 방법을 사용하여 달성할 수 있다.

디히드로테트라베나진을 수득하기 위한 환원을 위해 출발 물질로 사용된 테트라베나진을 상업적으로 얻을 수 있거나, 미국 특허 제2,830,993호 (Hoffmann-La Roche)에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다.

본 발명의 디히드로테트라베나진을 제조하기 위한 또다른 공정 (공정 B)은 화학식 (III)의 화합물을 화학식 (III)의 화합물 내에 2,3-에폭시드기의 개환을 위한 조건에 적용하는 것을 포함하고:

이후에 바람직한 디히드로테트라베나진 이성질체 형태를 분리하고 유리하는 것이 필요하다.

상기 개환은 에폭시드 개환을 위해 공지된 방법에 따라 영향받는다. 그러나, 현재 에폭시드를 개환하는 바람직한 방법은, 환원제 예컨대 보란-THF를 사용하여 달성될 수 있는 환원 개환 방법이다. 보란-THF와의 반응은, 일반적으로 주변 온도에서 극성 비-양자성 용매, 예컨대 에테르(예를 들어 테트라히드로푸란) 내에서 수행할 수 있고, 그렇게 제조된 보란 착물이 용매의 환류 온도에서 물과 염기의 존재하에서 가열됨에 따라 가수분해되었다. 공정 B는 2- 및 3-위치의 수소 원자가 시스 관계의 배향을 갖는 디히드로테트라베나진 이성질체를 전형적으로 발생시킨다.

화학식 (III)의 엑폭시드 화합물은 상기 화학식 (II)의 알켄의 에폭시화함으로써 제조할 수 있다. 에폭시화 반응은, 숙련된 화학자에게 익히 공지된 조건 및 시약을 사용하여 수행할 수 있다(참조: J. March (idem), pages 826-829 및 이의 참고문헌). 전형적으로, 과산 예컨대 메타-클로로퍼벤조산 (MCPBA) 또는 과산 및 추가적인 산화제 예컨대 과염소산과의 혼합물이 에폭시화를 일으키는데 사용될 수 있다.

상기 공정 A 및 B를 위한 출발 물질이 거울상 이성질체의 혼합물인 경우, 이후 상기 공정들의 생성물은, 발생될 수도 있는 편좌우이성질체 불순물과 함께 전형적으로 거울상 이성질체, 예를 들어 라세미 혼합물의 쌍이다. 바람직하지 않은 편좌우이성질체는 크로마토그래피 (예를 들어 HPLC)와 같은 기법에 의해 제거될 수 있고, 개개의 거울상 이성질체는 숙련된 화학자에게 공지된 다양한 방법으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 이들을 하기의 방법으로 분리할 수 있다:

(i) 키랄 크로마토그래피(키랄 지지체 상의 크로마토그래피); 또는

(ii) 광학적으로 순수한 키랄 산으로 염을 제조하고, 두 편좌우이성질체의 염을 분별결정에 의해 분리하고, 이후 염으로부터 디히드로테트라베나진을 방출한다; 또는

(iii) 광학적으로 순수한 키랄 유도제(derivatising agent)(예를 들어 에스테르화제)로 유도체(예컨대 에스테르)를 제조하고, 생성된 에피머(epimer)를 분리하고(예를 들어 크로마토그래피에 의해), 이후 유도체를 디히드로테트라베나진으로 전환한다.

각각의 공정 A 및 B로부터 수득한 거울상 이성질체의 쌍을 분리하는 한가지 방법으로서 특히 효율적인 것으로 밝혀진 것은 디히드로테트라베나진의 히드록실기를 모셔 산(Mosher's acid; α-메톡시트리플루오로페닐아세트산)의 광학적 활성 형태 예컨대 하기 R (+) 이성질체 또는 이의 활성 형태로 에스테르화하는 것이다:

이후 디히드로베나진의 두 거울상 이성질체의 생성된 에스테르는 크로마토그래피 (예를 들어 HPLC)에 의해 분리될 수 있고, 분리된 에스테르를 가수분해하여, 극성 용매 예컨대 메탄올 중에서 염기 예컨대 알칼리 금속 수산화물(예를 들어 NaOH)을 사용하여 개개의 디히드로베나진 이성질체를 수득하였다.

거울상 이성질체의 혼합물을 공정 A 및 B의 출발 물질로서 사용하고, 이후 이어서 거울상 이성질체의 분리를 수행하는 대안으로서, 공정 A 및 B는 각각 단일 거울상 이성질체 출발 물질에 수행되어 단일 거울상 이성질체가 두드러진 생성물로 이르게한다. 알켄 (II)의 단일 거울상 이성질체는, RR/SS 테트라베나진을 리튬 트리-sec-부틸 보로하이드라이드를 사용하여 입체선택적 환원(stereoselective reduction)에 적용시킴으로써 제조하여 디히드로테트라베나진의 SRR 및 RSS 거울상 이성질체 혼합물을 수득하고, 거울상 이성질체(예를 들어 분별결정에 의해)를 분리하며, 이후 디히드로테트라베나진의 분리된 단일 거울상 이성질체를 탈수시켜 화학식 (II)의 화합물의 단일 거울상 이성질체를 현저하게 또는 배타적으로 수득한다.

공정 A 및 B는 각각 반응식 1 및 2로 하기에 더욱 상세히 나타내었다.

반응식 1에는 2- 및 3- 위치에 부착된 수소 원자가 트란스 관계의 배향으로 정렬된 2S,3S,11bR 및 2R,3R,11bS 배위를 갖는 개개의 디히드로테트라베나진 이성질체의 제조를 나타낸다. 상기 반응식은 상기에서 정의된 공정 A를 포함한다.

반응식 1의 반응 연속의 출발점은 테트라베나진의 RR 및 SS 광학 이성질체의 라세미 혼합물인 상업적으로 입수가능한 테트라베나진 (IV)이다. RR 및 SS 이성질체의 각각에는 3- 및 11b- 위치의 수소 원자가 트란스 관계의 배향으로 정렬된다. 상업적으로 입수가능한 화합물의 사용에 대한 대안으로서, 테트라베나진은 미국 특허 제2,830,993호에 기술된 공정에 따라 합성될 수 있다(특히 실시예 11 참고).

RR 및 SS 테트라베나진의 라세미 혼합물은 보로하이드라이드 환원제인 리튬 트리-sec-부틸 보로하이드라이드("L-셀렉트라이드")를 사용하여 환원시켜서 디히드로테트라베나진의 공지된 2S,3R,11bR 및 2R,3S,11bS 이성질체 (V)의 혼합물을 수득하며, 이중 간략하게 2S,3R,11bR 이성질체만 나타낸다. 보로하이드라이드 환원제로서 나트륨 보로하이드라이드보다 더욱 입체구조적으로 엄격한 L-셀렉트라이드를 사용함으로써, 디히드로테트라베나진의 RRR 및 SSS 이성질체의 제조가 최소화되거나 억제된다.

디히드로테트라베나진 이성질체 (V)를 비-양성자성 용매 예컨대 염소화 탄화수소 중의 탈수제 예컨대 인 펜타클로라이드(예를 들어 클로로포름 또는 디클로로메탄, 바람직하게는 디클로로메탄)와 반응시켜 거울상 이성질체 쌍으로서 불포화 화합물 (II)를 제조하며, 이중 R-거울상 이성질체만을 반응식에 나타낸다. 탈수 반응은 실온보다 낮은 온도 예를 들어 0-5 ℃에서 전형적으로 수행된다.

이후 상기 불포화 화합물 (II)을 입체선택적 재-수화에 적용시켜, 3- 및 11b-위치의 수소 원자가 시스 관계의 배향으로 정렬되고 2- 및 3-위치의 수소 원자가 트란스 관계의 배향으로 정렬된 디히드로테트라베나진 (VI)과 이의 거울상 이미지 즉 거울상 이성질체(나타내지 않음)를 생성시킨다. 입체선택적 재수화는 테트라히드로푸란(THF) 중 보란-THF를 사용한 붕소수화 공정에 의해 완수되어, 이후 염기 예컨대 수산화나트륨의 존재하에 과산화수소로 산화시킨 중간체 보란 착물(나타내지 않음)을 제조한다.

이후 초기 정화 단계를 수행하여(예를 들어 HPLC에 의해), 2S,3S,11bR 및 2R,3R,11bS 이성질체의 혼합물로서 재수화 반응 연속의 생성물 (V)를 수득하며, 반응식에는 2S,3S,11bR 이성질체만을 나타낸다. 이성질체를 분리하기 위해, 상기 혼합물을 디클로로메탄 중의 염화옥살릴 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재하에 R (+) 모셔 산으로 처리하여, 이후에 HPLC를 사용하여 분리할 수 있는 편좌우이성질체 에스테르 (VII) 쌍(하나의 부분입체 이성질체만 나타내었음)을 수득한다. 개개의 에스테르를 이후에 알칼리 금속 수산화물 예컨대 수산화나트륨을 사용하여 가수분해하여 단일한 이성질체 (VI)를 수득한다.

반응식 1에 나타낸 연속 단계의 변형에는, RR/SS 테트라베나진의 환원 후, 디히드로테트라베나진 (V)의 거울상 이성질체의 생성된 혼합물을 분리하여 개개의 거울상 이성질체를 수득할 수 있다. 키랄 산 예컨대 (+) 또는 (-) 장뇌황산(camphorsulphonic acid)으로 염을 제조하고, 분별결정에 의해 생성된 부분입체 이성질체를 분리하여 단일한 거울상 이성질체의 염을 수득하고, 이후 염으로부터 유리 염기를 방출함으로써 분리를 수행할 수 있다.

분리된 디히드로테트라베나진 거울상 이성질체을 탈수화시켜 알켄 (II)의 단일한 거울상 이성질체를 수득할 수 있다. 이어지는 알켄 (II)의 재수화로 이후 시스-디히드로테트라베나진 (VI)의 단일한 거울상 이성질체를 현저하게 또는 배타적으로 수득한다. 이러한 변형의 장점은 모셔 산 에스테르의 제조와 결부되지 않으므로 모셔 산 에스테르를 분리하기 위해 전형적으로 사용되는 크로마토그래프 분리를 회피할 수 있다는 것이다.

반응식 2에는, 2- 및 3-위치에 부착된 수소 원자가 시스 관계의 배향으로 정 렬된 2R,3S,11bR 및 2S,3R,11bS 배위를 갖는 개개의 디히드로테트라베나진 이성질체의 제조를 설명한다. 본 반응식은 상기에서 정의된 공정 B를 포함한다.

반응식 2에는, 테트라베나진을 환원시켜 디히드로테트라베나진의 2S,3R,11bR 및 2R,3S,11bS 이성질체 (V)를 수득하고, 상기 반응식 1에서 기술된 방식으로 PCl₅ 를 탈수시킴으로써 불포화 화합물 (II)를 생성시킨다. 그러나, 화합물 (II)를 붕수소화에 적용시키는 대신에, 2,3-이중 결합을 메타-클로로퍼벤조산(MCPBA) 및 과염소산으로 반응시킴에 의해 에폭시드로 전환시킨다. 에폭시드화 반응은 전형적으 로 실온 부근의 알코올 용매 예컨대 메탄올에서 편리하게 수행된다.

이후 보란-THF를 전자친화적 환원제로서 사용하여 에폭시드 (VII)를 환원성 개환에 적용시켜 중간체 보란 착물(나타내지 않음)을 수득하고, 이후 알칼리, 예컨대 수산화나트륨의 존재하에서 과산화수소로 산화되고 갈라져서 디히드로테트라베나진 (VIII)을 2R,3S,11bR 및 2S,3R,11bS 이성질체 혼합물로서 수득하며, 이중 간략하게 2R,3S,11bR만 나타낸다. 이성질체 (VIII) 혼합물을 디클로로메탄 중 염화옥살릴 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)의 존재하에 R (+) 모셔 산으로 처리하여 에피머 에스테르 (IX)(이중 하나의 에피머만 나타냈음) 쌍을 수득하고, 이후 반응식 1에 관련된 상기에 기술된 방식으로 크로마토그래피로 분리하고 메탄올 중 수산화나트륨으로 가수분해한다.

생물학적 활성

본 발명의 시스-디히드로테트라베나진 화합물은 하기 실시예에서 설명하는 대로 시그마-1 및 시그마-2 수용체 양측과 결합한다. 시스-디히드로테트라베나진의 4 개의 이성질체는 시그마-2를 위한 리간드와 대략적으로 효력이 동등하나 이성질체 B 및 D는 이성질체 A 및 C에 비해 시그마-1 수용체에 더 강하게 결합한다.

이들의 시그마 수용체 결합 활성에 기초하여, 본 발명의 시스-디히드로테트라베나진 화합물이 종양 세포의 증식을 억제하거나 예방하는 데에 유용할 것임이 관찰된다.

종양 세포의 증식을 억제하거나 예방하는 화합물의 능력은, 예를 들어 하기 실시예 6 또는 문헌[Spruce et al., Cancer Research, (2004), 64: 4875-4886]에 기술된 방법을 사용하여 다양한 종양 세포계에 대항하여 화합물을 시험함으로써 측정할 수 있다.

세포계에 대한 체외에서의 연구에 더불어, 본 발명의 화합물을 또한 면역손상된 마우스 내에서, 예를 들어 문헌[Spruce et al., (2004), page 487]에서 기술된 바와 같은, 사람 종양의 제노그래프의 생체내 시험을 하였다.

또한 본 발명의 화합물이 소염제로서 활성이 있음이 관찰된다. 화합물의 소염 활성을 숙련된 자에게 익히 공지된 다양한 방법을 사용하여 시험할 수 있다.

관절염을 치료하는 본 발명의 화합물의 능력을 이하의 하나 이상의 분석 및 모형 시험에 의해 설명할 수 있다:

(i) 문헌[Kakimoto et al., Cell Immunol. 142: 326-337, 1992]에서 기술된 쥣과의 콜라겐-유도된 관절염 모형.

(ii) 문헌[Knoerzer et al., Toxicol. Pathol. 25:13-19, 1997]에서 기술된 래트 콜라겐-유도된 관절염 모형.

(iii) 문헌[Halloran et al., Arthritis Rheum. 39: 810-819, 1996]에서 기술된 래트 보조제 관절염 모형.

(iv) 문헌[Schimmer, et al., J. Immunol. 160: 1466-1477, 1998]에서 기술된 래트 연쇄상구균 세포벽-유도된 관절염 모형.

(v) 문헌[Oppenheimer-Marks et al., J. Clin. Invest. 101: 1261-1272, 1998]에서 기술된 SCID-마우스 사람 류마티즘성 관절염 모형.

염증성 폐 손상을 치료하기 위한 본 발명의 화합물의 능력을 이하의 분석 및 모형 시험에 의해 설명할 수 있다:

(vi) 문헌[Wegner et al., Lung 170:267-279, 1992]에서 기술된 쥣과의 산소-유도된 폐 손상 모형.

(vii) 문헌[Mulligan et al., J. Immunol. 154:1350-1363, 1995]에서 기술된 쥣과의 면역 착물-유도된 폐 손상 모형.

(viii) 문헌[Nagase et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154:504-510, 1996]에서 기술된 쥣과의 산 -유도된 폐 손상 모형.

염증성 창자 질환을 치료하기 위한 본 발명의 화합물의 능력을 문헌[Bennet et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 280:988-1000, 1997]에서 기술된 래빗 화학-유도된 결장염 모형으로 설명할 수 있다.

염증성 간 손상을 치료하기 위한 본 발명의 화합물의 능력을 문헌[Tanaka et al., J. Immunol. 151:5088-5095, 1993]에서 기술된 쥣과의 간 손상 모형으로 설명할 수 있다.

염증성 사구체 손상을 치료하기 위한 본 발명의 화합물의 능력을 문헌[Kawasaki, et al., J. Immunol. 150:1074-1083, 1993]에서 기술된 래트 신독성 혈청 신장염(nephrotoxic serum nephritis) 모형으로 설명할 수 있다.

본 발명의 화합물의 소염 활성은, 이하의 실시예에서 기술된 바와 같이 친-염증성(pro-inflammatory) 시토카인의 생성을 감소시키고 T-세포 증식을 억제하는 이들의 능력에 의해 또한 나타난다.

약제학적 제형

디히드로테트라베나진 화합물을 약제학적 조성물의 형태로 전형적으로 투여한다.

약제학적 조성물을 경구적, 비경구적, 국소성의, 비강내의, 기관지내의, 눈의, 귀의, 직장의, 질내부의 또는 경피 투여 등에 적합한 어떠한 형태로 할 수 있다. 조성물을 비경구적 투여로 의도할 경우, 조성물은 정맥내, 근육내, 복막내, 피하 투여를 위해 또는 주사, 주입 또는 기타 다른 전달 방법에 의해 목표 기관 또는 조직 속으로 직접 전달하는 것에 의해 제형화될 수 있다.

경구 투여에 적합한 약제학적 투약 형태는 정제, 캡슐, 캐플릿(caplet), 환, 로젠지(lozenge), 시럽, 용액, 분무액, 분말, 과립, 엘릭시르(elixir) 및 현탁액, 혀밑 정제, 분무액, 박판 또는 패치 및 구강 패치를 포함한다.

본 발명의 디히드로테트라베나진 화합물을 함유하는 약제학적 조성물을 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA).

따라서, 정제 조성물은, 불활성인 희석제 또는 담체 예컨대 설탕 또는 설탕 알코올 예를 들어 락토오스, 수크로스, 소르비톨 또는 마니톨; 및/또는 무-설탕 유래된 희석제 예컨대 탄산나트륨, 인산칼슘, 활석, 탄산칼슘 또는 셀룰로오스 또는 이들의 유도체 예컨대 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 및 전분 예컨대 옥수수 전분 등과 함께 활성 화합물의 한 단위 투약량을 함유할 수 있다 정제는, 결합제 및 과립화제 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 붕괴제(예를 들어 팽윤가능성 가교결합 중합체 예컨대 가교결합 카르복시메틸셀룰로오스 ), 광택제(예를 들어 스테아르산염), 방부제(예를 들어 파라벤), 산화방지제(예를 들어 BHT), 완충제(예를 들어 인산염 또는 구연산 완충용액) 및 비등제(effervescent agent) 예컨대 구연산/중탄산염 혼합물과 같은 표준적인 성분을 또한 포함할 수 있다. 이러한 부형제들은 익히 공지되었고 본원에서 상세히 논할 필요는 없다.

캡슐 제형은 경질 젤라틴 또는 연질 젤라틴 변종이 있으며, 고체, 반-고체 또는 액체 형태인 활성 성분을 함유할 수 있다. 젤라틴 캡슐은 동물성 젤라틴 또는 합성 또는 식물 유래된 이의 등가물로부터 제조될 수 있다.

고체 투약 형태(예를 들어 정제, 캡슐 등)는 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있지만, 전형적으로는 코팅, 예를 들어 보호 필름 코팅(예를 들어 왁스 또는 바니시) 또는 방출 조절 코팅을 한다. 활성 성분이 위장관(gastro-intestinal tract) 내의 원하는 위치에 방출하도록 코팅(예를 들어 유드라짓(Eudragit)™ 유형 중합체)을 설계할 수 있다. 따라서, 위장관 내의 특정 pH하에서 분해되도록 코팅을 선택할 수 있고, 그로써 위에서 또는 회장 또는 십이지장에서 선택적으로 화합물을 방출할 수 있다.

코팅 대신에 또는 코팅에 더불어, 방출 조절제 예를 들어 위장관 내의 다양한 산성 또는 알칼리성 조건하에서 선택적으로 화합물을 방출시키도록 적응될 수 있는 방출 지연제를 포함하는 고체 기질로 약물을 나타낼 수 있다. 대신에, 기질 물질 또는 방출 지연 코팅은, 투약 형태가 위장관을 통과함에 따라 실질적으로 지속적으로 붕괴되는 붕괴성 중합체(예를 들어 말레산무수물 중합체)의 형태를 취할 수 있다.

국소성 사용을 위한 조성물은 연고, 크림, 분무액, 패치, 겔, 액체 방울 및 삽입(예를 들어 안(眼)내 삽입)을 포함한다. 이러한 조성물은 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다.

비경구적 투여용 조성물은 무균 수성 또는 유성 용액 또는 미세 현탁액으로서 전형적으로 나타내거나, 주사용 무균수로 즉석에서 제조하기 위해 미세하게 분할된 무균 분말 형태로 제공될 수 있다.

직장 또는 질내 투여용 제형의 예로는 질좌제 및 좌약을 들 수 있고, 이는 예를 들어 활성 화합물을 포함한, 형상을 만들 수 있는 물질 또는 왁스성 물질로부터 제조될 수 있다.

흡입에 의한 투여용 조성물은 흡입가능한 분말 조성물 또는, 액체 또는 분말 분무의 형태를 취할 수 있고, 분말 흡입 기구 또는 에어로졸 투여 기구를 사용한 표준적인 형태로 투여시킬 수 있다. 이러한 기구들은 익히 알려져 있다. 흡입에 의한 투여를 위해, 분말 제형은 활성 화합물을, 분말화된 희석제 예컨대 락토오스와 같은 불활성 고형물과 함께 전형적으로 포함한다.

본 발명의 화합물은 일반적으로 단위 투약량 형태로 나타나며, 예컨대 바람직한 수준의 생물학적 활성을 제공하는데 충분한 화합물을 전형적으로 포함한다. 예를 들어, 경구 투여용으로 의도된 제형은 활성 성분 2 mg 내지 200 mg, 더욱 일반적으로는 10 mg 내지 100 mg, 예를 들어 12.5 mg, 25 mg 및 50 mg을 함유할 수 있다.

상기 활성 화합물을 이를 필요로하는 환자(예를 들어 사람 또는 동물 환자)에게 바람직한 치료적 효과를 달성하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.

전형적으로, 이러한 투여를 필요로 하는 대상은 상기에서 정의된 증식성 질환 예컨대 암 또는 염증성 질환으로부터 고통을 받거나 고통을 받을 위험에 처한 환자이다.

상기 화합물은, 치료적으로 또는 예방적으로 유용하고 일반적으로 무독성인 양으로 전형적으로 투여된다. 그러나, 특정한 상황, 특히 암 치료법의 경우에서, 본 발명의 디히드로테트라베나진 화합물을 투여하는 이익은 어떠한 독성작용 또는 부작용의 불이익을 능가할 수 있고, 그러한 경우에는 독성의 정도에 관련된 양으로 화합물을 투여하는 것이 바람직하다고 간주될 수도 있다.

본 화합물의 전형적인 일일 투약량은 필요로 하는 곳에 더 많은 또는 더 적은 투약량이 투여될 수 있지만, 하루에 1000 mg 까지, 예를 들어 체중 1 kg당 0.01 mg 내지 10 mg의 범위, 더욱 일반적으로는 체중 1 kg당 0.025 mg 내지 5 mg, 예를 들어 체중 1 kg당 3 mg 까지, 그리고 더욱 전형적으로는 체중 1 kg당 0.15 mg 내지 5 mg까지 가능하다.

암을 치료하기 위해, 화학식 (I)의 화합물을 단독의 치료적 약품으로서 투여할 수 있거나, 특정한 질환 상태, 예를 들어 상기에서 정의한 암의 치료를 위해 하나 이상의 기타 화합물과의 배합 치료로 투여할 수 있다. 화학식 (I)의 화합물과 함께(동시에 또는 시간 간격을 두고) 사용하거나 투여할 수 있는 기타 치료적 약품 및 치료 방법의 예로는 하기의 것을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다:

ㆍ국소이성화효소 I 억제제 (예를 들어 캄프토테신[camptothecin] 화합물 예컨대 토포테칸[topotecan] (히캄틴[Hycamtin]), 이리노테칸[irinotecan] 및 CPT11 (캄토사르[Camptosar])).

ㆍ항대사물질 (예를 들어, 항-종양 뉴클레오시드 예컨대 5-플루오로우라실, 젬시타빈[gemcitabine] (젬자르[Gemzar]), 랄티트렉스드[raltitrexed] (토무덱스[Tomudex]), 카페시타빈[capecitabine] (젤로다[Xeloda]), 페메트렉스드[pemetrexed] (알림타[Alimta]), 시타라빈[cytarabine] 또는 시토신 아라비노시드[arabinoside] 또는 아라비노실시토신[arabinosylcytosine] [AraC] (시토사르[Cytosar]®, 메토트렉세이트[methotrexate] (마트렉스[Matrex]), 플루다라빈[fludarabine] (플루다라[Fludara]) 및 테가푸르[tegafur]).

ㆍ튜불린 표적 약품 (예를 들어, 빙카 알칼로이드[vinca alkaloids], 빈블라스틴[vinblastine] 및 탁산[taxane] 화합물 예컨대 빈크리스틴[vincristine] (온코빈[Oncovin]), 비노렐빈[vinorelbine] (나벨바인[Navelbine]), 빈블라스틴 (벨베[Velbe]), 파클리탁셀[paclitaxel] (탁솔[Taxol]) 및 도세탁셀[docetaxel] (탁소테레[Taxotere])).

ㆍDNA 결합 및 국소 II 억제제 (예를 들어, 포도필로[podophyllo]-독소 유도체 및 안트라시클린[anthracycline] 유도체 예컨대 에토포시드[etoposide] (에포신[Eposin], 에토포스[Etophos], 베페시드[Vepesid], VP-16), 테니포시드[teniposide] (부몬[Vumon]), 다우노루비신[daunorubicin] (세루비딘[Cerubidine], 다우노좀[DaunoXome]), 에피루비신[epirubicin] (파모루비 신[Pharmorubicin]), 독소루비신[doxorubicin] (아드리아마이신[Adriamycin]; 독실[Doxil]; 루벡스[Rubex]), 이다루비신[idarubicin] (자베도스[Zavedos]), 페길화된[pegylated] 리포솜의 독소루비신 염산염 (캐일렉스[Caeylx]), 리포솜 캡슐화된 독소루비신 구연산염 (미오세트[Myocet]), 미톡산트론[mitoxantrone] (노바트론[Novatrone], 온코트론[Onkotrone])).

ㆍ알킬화제 (예를 들어, 질소 머스타드 또는 니트로소우레아[nitrosourea] 알킬화제 및 아지리딘[aziridines] 예컨대 시클로포스파미드[cyclophosphamide] (엔독사나[Endoxana]), 멜팔란[melphalan] (알케란[Alkeran]), 클로람부실[chlorambucil] (루케란[Leukeran]), 부설판[busulphan] (밀레란[Myleran]), 카르무스틴[carmustine] (BiCNU), 로무스틴[lomustine] (CCNU), 이포스파미드[ifosfamide] (미톡사나[Mitoxana]), 미토마이신[mitomycin] (미토마이신 C 쿄마[Mitomycin C Kyoma])).

ㆍ알킬화제 (예를 들어, 백금 화합물 예컨대 시스플라틴[cisplatin], 카르보플라틴[carboplatin] (파라플라틴[Paraplatin]) 및 옥살리플라틴[oxaliplatin] (엘록사틴[Eloxatin])).

ㆍ단일클론의 항생제 (예를 들어, EGF 계 및 이의 수용체 및 VEGF 계 및 이의 수용체, 특히 트라스투주맙[trastuzumab] (헤르셉틴[Herceptin]), 세툭시맙[cetuximab] (에르비툭스[Erbitux]), 리툭시맙[rituximab] (맙테라[Mabthera]), 토시투모맙[tositumomab] (벡사르[Bexxar]), 젬투주맙 오조가미신[gemtuzumab ozogamicin] (밀로타그[Mylotarg]) 및 베바시주맙[bevacizumab] (아바스 틴[Avastin])).

ㆍ항-호르몬제 (예를 들어 항에스트로겐제 (예를 들어 아로마타아제[aromatase] 억제제) 예컨대 타목시펜[tamoxifen] (놀바덱스 D[Nolvadex D], 솔타목스[Soltamox], 타모펜[Tamofen]), 풀베스트런트[fulvestrant] (파슬로덱스[Faslodex]), 랄록시펜[raloxifene] (에비스타[Evista]), 토레미펜[toremifene] (파레스톤[Fareston]), 드롤록시펜[droloxifene], 레트라졸[letrazole] (페마라[Femara]), 아나스트라졸[anastrazole] (아리미덱스[Arimidex]), 엑세메스탄[exemestane] (아로마신[Aromasin]), 보로졸[vorozole] (리비조르[Rivizor]), 비칼루타미드[bicalutamide] (카소덱스[Casodex], 코수덱스[Cosudex]), 루프롤리드[luprolide] (졸라덱스[Zoladex]), 메게스트롤 아세테이트[megestrol acetate] (메가세[Megace]), 아미노글루테티미드[aminoglutethimide] (시타드렌[Cytadren]) 및 벡사로텐[bexarotene] (타그레틴[Targretin])을 포함하는 항-안드로겐).

ㆍ신호 형질도입 억제제 (예컨대 제피티닙[gefitinib] (이레사[Iressa]), 이마티닙[imatinib] (글리벡[Gleevec]), 엘로티닙[erlotinib] (타세바[Tarceva]) 및 셀레콕십[celecoxib] (셀레브렉스[Celebrex])).

ㆍ프로테아솜(Proteasome) 억제제 예컨대 보르테지밉(bortezimib) (벨카드[Velcade]).

ㆍDNA 메틸트랜스퍼라제 예컨대 테모졸로미드(temozolomide) (테모달[Temodar]).

ㆍ시토카인 및 레티노이드(retinoid) 예컨대 인터페론 알파 (인트론 A[IntronA], 로페론-A[Roferon-A]), 인터루킨(interleukin) 2 (알데스루킨[Aldesleukin], 프로루킨[Proleukin]) 및 모든 트란스-레티노산 [ATRA] 또는 트레티노인(tretinoin) (베사노이드[Vesanoid]).

ㆍ방사선요법.

본 발명의 화합물이 배합 치료로 기타 치료적 약품 또는 치료적 방법으로 함께 투여되는 경우, 둘 이상의 치료가 개개의 다양한 투약 계획 및 개별적인 경로를 통해서 행해질 수 있다.

본 발명의 화합물이 하나 이상의 기타 치료적 약품과의 배합 치료로 투여되는 경우, 화합물을 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 순차적으로 투여하는 경우, 정확한 투약 요법으로 치료적 약품의 특성에 적합하도록 밀접한 공간적 간격으로(예를 들어 5-10분의 기간에 걸쳐) 또는 더 긴 간격으로(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 시간 또는 필요한 경우 더 긴 기간 차이로) 투여할 수 있다.

또한 본 발명의 화합물을 비-화학요법적 치료 예컨대 방사선요법, 광역학적 치료요법, 유전자 치료요법; 수술 및 식단 조절과 결합하여 투여할 수 있다.

또다른 화학요법적 약품과의 배합 치료에 사용하기 위해, 본 발명의 화합물 및 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 기타 치료적 약품은, 예를 들어 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 치료적 약품을 포함하는 투약 형태로 함께 제형화될 수 있다. 또는, 개개의 치료적 약품을 분리하여 제형화할 수 있고, 임의적으로 이들의 사용설명서를 포함하는 키트의 형태로 나타날 수 있다.

도 1에는 단핵세포에 의한 TNFα의 제조에 있어 본 발명의 화합물, 이성질체 B (RU350) 및 이성질체 D (RU346)의 효력을 도시한다.

도 2에는 단핵세포에 의한 IL-4의 제조에 있어 본 발명의 화합물, 이성질체 B (RU350) 및 이성질체 D (RU346)의 효력을 도시한다.

도 3에는 사람의 단핵세포에 의한 IL-2의 제조에 있어 본 발명의 화합물, 이성질체 B (RU350) 및 이성질체 D (RU346)의 효력을 도시한다.

도 4에는 사람의 단핵세포에 의한 IL-5의 제조에 있어 본 발명의 화합물, 이성질체 B (RU350) 및 이성질체 D (RU346)의 효력을 도시한다.

도 5에는 사람의 단핵세포에 의한 IL-10의 제조에 있어 본 발명의 화합물, 이성질체 B (RU350) 및 이성질체 D (RU346)의 효력을 도시한다.

도 6에는 사람의 단핵세포에 의한 IL-12의 제조에 있어 본 발명의 화합물, 이성질체 B (RU350) 및 이성질체 D (RU346)의 효력을 도시한다.

하기 비-제한적인 실시예에는 본 발명의 디히드로테트라베나진 화합물의 합성 및 특성을 설명한다.

실시예 1

2 S ,3 S ,11b R 및 2 R ,3 R ,11b S 디히드로테트라베나진 이성질체의 제조

1A. RR/SS 테트라베나진의 환원

테트라히드로푸란 중 1M L-셀렉트라이드^®(135 ml, 135 mmol, 2.87 당량)를 0 ℃에서 30 분 동안 에탄올(75 ml) 및 테트라히드로푸란(75 ml) 중 테트라베나진 RR/SS 라세미체(15 g, 47 mmol)의 교반된 용액에 서서히 첨가하였다. 첨가한 후 혼합물을 0 ℃에서 30 분 동안 완전히 교반한 후 실온까지 승온시켰다.

혼합물을 분쇄된 얼음(300 g) 위로 붓고, 물(100 ml)을 첨가하였다. 상기 용액을 디에틸 에테르(2 x 200 ml)로 추출하고, 합한 에테르 추출물을 물(100 ml)로 세척하고, 무수 탄산칼륨으로 부분 건조시켰다. 건조는 무수 황산마그네슘을 사용하여 완성하고, 추출 후 용매를 감압 상태에서(차광, 욕조 온도 <20 ℃) 제거하여 연한 황색 고체를 수득하였다.

상기 고체를 석유 에테르 (30-40 ℃)로 슬러리로 만들고 여과하여 백색 분말형 고체를 수득하였다(12 g, 80%).

1B. 환원된 테트라베나진의 탈수

오염화인(32.8 g, 157.5 mmol, 2.5 당량)을 30 분 동안 몇 부분으로 나누어 0 ℃에서 디클로로메탄(200 ml) 중 실시예 1A(20 g, 62.7 mmol)로부터의 환원된 테트라베나진 생성물의 교반된 용액에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 반응 혼합물을 0 ℃에서 추가적으로 30 분 동안 교반하고, 분쇄된 얼음을 포함하는 2M 수성 탄산나트륨 용액(0 ℃) 속으로 상기 용액을 서서히 부었다. 초기 산가스방출이 멈추고 나면 혼합물을 고체 탄산나트륨을 사용하여 염기화하였다(계산값 pH 12).

알칼리성 용액을 에틸 아세테이트 (800 ml)를 사용하여 추출하고, 합한 유기 추출물을 무수 황산마그네슘으로 건조시켰다. 여과한 후 용매를 감압 상태에서 제거하여 갈색 기름을 수득하고, 이를 칼럼 크로마토그래피 (이산화규소, 에틸 아세테이트)로 정제하여 반순수 알켄을 황색 고체로서 수득하였다(10.87 g, 58%).

1C. 실시예 1B로부터의 조질 알켄의 수화

건조한 THF(52 ml) 중 실시예 1B로부터의 조질 알켄(10.87 g, 36.11 mmol) 용액을 실온에서 1M 보란-THF(155.6 ml, 155.6 mmol, 4.30 당량)를 적가방식으로 첨가하면서 처리하였다. 반응을 2 시간 동안 교반하고, 물(20 ml)을 첨가하고, 용액을 30% 수성 수산화나트륨 용액으로 pH 12로 염기화하였다..

수성 30% 과산화수소 용액(30 ml)을 교반된 알칼리성 반응 혼합물에 첨가하고, 용액을 환류로 1시간 동안 가열한 후 방치하여 냉각시켰다. 물(100 ml)을 첨가하고 혼합물을 에틸 아세테이트(3 x 250 ml)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 용매를 감암 상태에서 제거하여 황색 기름을 수득하였다(9 g).

상기 기름을 분취용 HPLC(칼럼: Lichrospher Si60, 5 ㎛, 250 x 21.20 mm, 이동상: 헥산 : 에탄올 : 디클로로메탄 (85:15:5); UV 254 nm, 유속: 10 ml min^-1)을 사용하여 350 mg 씩 주입하여 정제한 다음 진공하에서 원하는 분획물을 농축시켰다. 이후 생성된 기름을 에테르에 용해시키고, 진공하에서 한번 더 농축시켜 상 기에 나타낸 디히드로테트라베나진 라세미체를 황색 포말로서 수득하였다(5.76 g, 50%).

1D. 모셔 에스테르 유도체의 제조

R-(+)-α-메톡시-α-트리플루오로메틸페닐 아세트산(5 g, 21.35 mmol), 염화옥살릴(2.02 ml) 및 DMF(0.16 ml)를 무수 디클로로메탄(50 ml)에 첨가하고 용액을 실온에서 45 분 동안 교반하였다. 용액을 감압하에서 농축시키고 잔기를 무수 디클로로메탄(50 ml)으로 한번 더 흡수시켰다. 생성된 용액을 얼음-물 욕조를 사용하여 냉각시키고 디메틸아미노피리딘(3.83 g, 31.34 mmol)을 첨가한 다음 실시예 1C(5 g, 15.6 mmol)의 고체 생성물의 무수 디클로로메탄 내의 건조전(pre-dried) 용액(4Å 체로 걸러)을 첨가한다. 실온에서 45 분 동안 교반한 후, 물(234 ml)을 첨가하고 혼합물을 에테르(2 x 200 ml)로 추출하였다. 에테르 추출물을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 이산화규소 패드를 통과시키고, 에테르를 사용하여 생성물을 용출시켰다.

수집된 에테르 용출액을 감압하에서 농축시켜 기름을 수득하고, 이를 칼럼 크로마토그래피(이산화규소, 헥산 : 에테르 (10:1))를 사용하여 정제하였다. 수집 된 원하는 칼럼 분획물을 증발시키고 감압 상태의 용매를 제거하여 고체를 수득하였으며 이는 추가적으로 칼럼 크로마토그래피(이산화규소, 헥산 : 에틸 아세테이트 (1:1))를 사용해서 정제하여, 모셔 에스테르의 피크 1 및 2 내로 부분적으로 용해되는 3 개의 주성분을 수득하였다.

부하 300 mg의 상기 3 개 성분의 분취용 HPLC(칼럼: 2 x Lichrospher Si60, 5 ㎛, 250 x 21.20 mm, 이동상: 헥산 : 이소프로판올 (97:3), UV 254 nm; 유속: 10 ml min^-1) 정제한 다음 진공하에서 원하는 분획물을 농축시켜 순수한 모셔 에스테르 유도체를 수득하였다.

피크 1 (3.89 g, 46.5%)

피크 2 (2.78 g, 33%)

2 개의 피크에 상응하는 일부를 가수분해에 적용하여 이성질체 A 및 B로 확인되고 분석된 개개의 디히드로테트라베나진 이성질체를 유리시켰다. 이성질체 A 및 B는 각각 하기 구조 중 하나를 갖는 것으로 여겨진다.

더욱 엄밀하게는, 이성질체 B는 하기 실시예 4에서 기술된 X-선 결정학 실험을 근거로 하여 순수한 2S, 3S, 11bR 배위를 갖는 것으로 여겨졌다.

1E. 이성질체 A를 수득하기 위한 피크 1의 가수분해

수성 20% 수산화나트륨 용액(87.5 ml)을 메탄올(260 ml) 중 모셔 에스테르 피크 1 (3.89 g, 7.27 mmol)의 혼합물에 첨가하고 혼합물을 교반하고 환류로 150 분 동안 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 물(200 ml)을 첨가하고 용액을 에테르(600 ml)로 추출하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후, 감압하에서 농축시켰다.

잔기를 에틸 아세테이트(200 ml)를 사용하여 용해시키고, 용액을 물(2 x 50 ml)로 세척하고, 유기상을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후, 감압하에서 농축시켜서 황색 포말을 수득하였다. 상기 물질을 칼럼 크로마토그래피(이산화규소, 에틸 아세테이트 : 헥산 (1:1)에서 에틸 아세테이트로 경사 용리)에 의해 정제하였다. 원하는 분획물을 합하고 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔기를 에테르로 흡수시키고 용매를 감압하에서 한번 더 제거하여 이성질체 A를 회색빛이 감도는 백색 포말로서 수득하였다(1.1 g, 47%).

2R,3R,11bS 배위를 갖는 것으로 여겨지는(절대적 입체화학 구조는 미결정됨) 이성질체 A는 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, IR, 질량 분석계, 키랄 HPLC 및 ORD에 의해 분석되었다. 이성질체 A에 대한 IR, NMR 및 MS 데이타를 표 1에 나열하고 키랄 HPLC 및 ORD 데이타는 표 3에 나열하였다.

1F. 이성질체 B를 수득하기 위한 피크 2의 가수분해

수성 20% 수산화나트륨 용액(62.5 ml)을 메탄올(185 ml) 중 모셔 에스테르 피크 2 (2.78 g, 5.19 mmol)의 용액에 첨가하고 혼합물을 교반하여 150 분 동안 환류로 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 물(142 ml)을 첨가하고 용액을 에테르(440 ml)로 추출하고 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후, 감압하에서 농축시켰다.

잔기를 에틸 아세테이트(200 ml)를 사용하여 용해하고, 용액을 물(2 x 50 ml)로 세척하고, 유기상을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후, 감압하에서 농축시켰다. 석유 에테르(30-40 ℃)를 잔기에 첨가하고 용액을 진공하에서 한번 더 농축시켜 이성질체 B를 백색의 포말로서 수득하였다(1.34 g, 81%).

2S,3S,11bR 배위를 갖는 것으로 여겨지는 이성질체 B는 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, IR, 질량 분석계, 키랄 HPLC, ORD 및 X-선 결정학에 의해 분석되었다. 이성질체 B에 대한 IR, NMR 및 MS 데이타를 표 1에 나열하고 키랄 HPLC 및 ORD 데이타를 표 3에 나열하였다. X-선 결정학 데이타는 표 4에 나열하였다.

실시예 2

2 R ,3 S ,11b R 및 2 S ,3 R ,11b S 디히드로테트라베나진 이성질체의 제조

2A. 2,3-데히드로테트라베나진의 제조

테트라히드로푸란 중 RR 및 SS 테트라베나진 거울상 이성질체의 라세미 혼합물(15 g, 47 mmol)을 포함하는 용액을 실시예 1A의 방법에 의해 L-셀렉트라이드^®로 환원시켜 2S,3R,11bR 및 2R,3S,11bS 디히드로테트라베나진 거울상 이성질체의 혼합물을 백색의 분말성 고체로서 수득하였다(12 g, 80%). 이후 부분 정제된 디히드로 테트라베나진을 실시예 1B의 방법에 따라 PCl₅를 사용해서 탈수하여 11bR 및 11bS 2,3-데히드로테트라베나진 이성질체의 반-순수 혼합물(이중 11bR 거울상 이성질체는 하기에 나타내었다)을 황색 고체로서 수득하였다(12.92 g, 68%).

2B. 실시예 2A로부터 제조된 조질 알켄의 에폭시화

메탄올(215 ml) 중 실시예 2A로부터 제조된 조질 알켄의 교반된 용액(12,92 g, 42.9 mmol)에 메탄올(215 ml) 중 70% 과염소산(3.70 ml, 43 mmol) 용액을 첨가하였다. 77% 3-클로로페록시벤조산(15.50 g, 65 mmol)을 반응에 첨가하고 생성된 혼합물을 차광 상태로 실온에서 18 시간 동안 교반하였다.

반응 혼합물을 포화 수성 아황산나트륨 용액(200 ml)에 붓고, 물(200 ml)을 첨가하였다. 클로로포름(300 ml)을 생성된 에멀젼에 첨가하고 혼합물을 포화 수성 중탄산나트륨(400 ml)으로 염기화하였다.

유기층을 수집하고 수성층을 추가의 클로로포름(2 x 150 ml)으로 세척하였 다. 합한 클로로포름 층을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후 용매를 감압 상태에서 제거하여 갈색 기름을 수득하였다(14.35 g, 수율 > 100% - 생성물 내에 용매가 잔존할 개연성이 높음). 상기 물질을 추가적인 정제없이 사용하였다.

2C. 2B로부터 제조된 에폭시드의 환원성 개환

건조한 THF(80 ml) 중 실시예 2B로부터 제조된 조질 에폭시드(14.35 g, 42.9 mmol, 100% 수율로 가정)의 교반된 용액을 1M 보란/THF(184.6 ml, 184.6 mmol)로 서서히 15 분 동안 처리하였다. 상기 반응을 2 시간 동안 교반하고, 물(65 ml)을 첨가하고, 용액을 30 분 동안 환류로 교반하면서 가열하였다.

냉각 후, 30% 수산화나트륨 용액(97 ml)을 반응 혼합물에 첨가한 다음 30% 과산화수소 용액(48.6 ml)을 첨가하고, 반응을 교반하고 추가적으로 1 시간 동안 환류로 가열하였다.

냉각된 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(500 ml)로 추출하고 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후 용매를 감압 상태에서 제거하여 기름을 수득하였다. 헥산(230 ml)을 기름에 첨가하고 용액을 감압하에서 재-농축시켰다.

유성 잔기를 칼럼 크로마토그래피(이산화규소, 에틸 아세테이트)로 정제하였다. 원하는 분획물을 합하고 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔기를 칼럼 크로마토그래피 (이산화규소, 헥산에서 에테르로 경사)를 사용하여 한번 더 정제하였다. 원하는 분획물을 합하고 용매를 감압하에서 증발시켜서 연한 황색 고체를 수득하였다(5.18 g, 38%).

2D. 2 R ,3 S ,11b R 및 2 S ,3 R ,11b S 디히드로테트라베나진 이성질체의 모셔 에스테르 유도체의 제조

R-(+)-α-메톡시-α-트리플루오로메틸페닐 아세트산(4.68 g, 19.98 mmol), 염화옥살릴(1.90 ml) 및 DMF(0.13 ml)를 무수 디클로로메탄(46 ml)에 첨가하고 용액을 실온에서 45 분 동안 교반하였다. 용액을 감압하에서 농축시키고 잔기를 무수 디클로로메탄(40 ml)으로 한번 더 흡수시켰다. 생성된 용액을 얼음-물 욕조를 사용하여 냉각시키고 디메틸아미노피리딘(3.65 g, 29.87 mmol)을 첨가한 다음 실시예 2C의 고체 생성물(4.68 g, 14.6 mmol)의 무수 디클로로메탄(20 ml) 중 건조전 용액(4Å 체로 걸러)을 첨가하였다. 실온에서 45 분 동안 교반한 후, 물(234 ml)을 첨가하고 혼합물을 에테르(2 x 200 ml)로 추출하였다. 에테르 추출물을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 이산화규소 패드를 통과시키고, 생성물을 에테르를 사용하여 용출시켰다.

수집된 에테르 용출액을 감압하에서 농축시켜 기름을 수득하였고, 이를 칼럼 크로마토그래피(이산화규소, 헥산 : 에테르 (1:1))를 사용하여 정제하였다. 수집된 원하는 칼럼 분획물을 증발시키고 감압 상태에서 용매를 제거하여 핑크색 고체를 수득하였다(6.53 g).

부하 100 mg으로 상기 고체의 분취용 HPLC(칼럼: 2 x Lichrospher Si60, 5 ㎛, 250 x 21.20 mm; 이동상 헥산 : 이소프로판올 (97:3); UV 254 nm; 유속: 10 ml min^-1)로 정제한 다음 진공하에서 원하는 분획물을 농축시켜 고체를 수득하고, 이를 석유 에테르(30-40 ℃)로 슬러리로 만들고 여과를 통해 수집하여 순수한 모셔 에스테르 유도체를 수득하였다.

피크 1 (2.37 g, 30%)

피크 2 (2.42 g, 30%)

상기 2 개의 피크에 상응하는 일부를 가수분해에 적용하여 이성질체 C 및 D로서 확인되고 분석된 개개의 디히드로테트라베나진 이성질체를 유리시켰다. 이성질체 C 및 D는 각각 하기 구조 중 하나를 갖는 것으로 여겨진다.

2F. 이성질체 C를 수득하기 위한 피크 1의 가수분해

20% 수성 수산화나트륨 용액(53 ml)을 메탄올(158 ml) 중 모셔 에스테르 피크 1 (2.37 g, 4.43 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고 혼합물을 환류에서 150 분 동안 교반하였다. 냉각한 후 물(88 ml)을 반응 혼합물에 첨가하고 생성된 용액을 에테르(576 ml)로 추출하였다. 유기 추출물을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 용매를 감압 상태에서 제거하였다. 에틸 아세테이트(200 ml)를 잔기에 첨가하고 용액을 물(2 x 50 ml)로 세척하였다. 유기 용액을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 여과한 후 용매를 감압 상태에서 제거하였다.

상기 잔기를 석유 에테르(30-40 ℃)로 처리하고 생성된 현탁 고체를 여과를 통해 수집하였다. 여과액을 감압 상태에서 농축시키고, 현탁 고체의 두번째 일단을 여과를 통해 수집하였다. 수집된 고체 모두를 합하고 감압하에서 건조시켜 이성질체 C를 수득하였다(1.0 g, 70%).

2R,3S,11bR 또는 2S,3R,11bS 배위 (절대적 입체화학 구조는 미결정됨)를 갖는 것으로 여겨지는 이성질체 C를 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, IR, 질량 분석계, 키랄 HPLC 및 ORD에 의해 분석하였다. 이성질체 C에 대한 IR, NMR 및 MS 데이타를 표 2에 나열하였고, 키랄 HPLC 및 ORD 데이타를 표 4에 나열하였다.

2G. 이성질체 D를 수득하기 위한 피크 2의 가수분해

20% 수성 수산화나트륨 용액(53 ml)을 메탄올(158 ml) 중 모셔 에스테르 피크 2 (2.42 g, 4.52 mmol)의 교반된 용액에 첨가하고, 혼합물을 환류에서 150 분 동안 교반하였다. 냉각 후, 물(88 ml)을 반응 혼합물에 첨가하고, 생성된 용액을 에테르(576 ml)로 추출하였다. 유기 추출물을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 용매를 감압 상태에서 제거하였다. 에틸 아세테이트(200 ml)를 잔기에 첨가하고, 용액을 물(2 x 50 ml)로 세척하였다. 유기 용액을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 용매를 감압 상태에서 제거하였다.

상기 잔기를 석유 에테르(30-40 ℃)로 처리하고, 생성된 오렌지색 현탁 고체를 여과를 통해 수집하였다. 상기 고체를 에틸 아세테이트 : 헥산 (15:85) 중에 용해시키고, 칼럼 크로마토그래피(이산화규소, 에틸 아세테이트 : 헥산 (15:85)에서 에틸 아세테이트로 경사 용리)에 의해 정제하였다. 원하는 분획물을 합하고, 용매를 감압 상태에서 제거하였다. 잔기를 석유 에테르(30-40 ℃)로 슬러리로 만들고 생성된 현탁액을 여과를 통해 수집하였다. 수집된 고체를 감압하에서 건조시켜 이성질체 D를 백색 고체로서 수득하였다(0.93 g, 64%).

2R,3S,11bR 또는 2S,3R,11bS 배위(절대적 입체화학 구조는 미결정됨)를 갖는 것으로 여겨지는 이성질체 D를 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, IR, 질량 분석계, 키랄 HPLC 및 ORD에 의해 분석하였다. 이성질체 D에 대한 IR, NMR 및 MS 데이타를 표 2에 나열하였고, 키랄 HPLC 및 ORD 데이타를 표 4에 나열하였다.

표 1 및 2에서, 적외선 스펙트럼을 KBr 디스크 방법을 사용하여 측정하였다. Varian Gemini NMR 분광계 (200 MHz.)를 사용하여 중수소화된 클로로포름 중 용액에 ¹H NMR 스펙트럼을 수행하였다. Varian Gemini NMR 분광계(50MHz)를 사용하여 중수소화된 클로로포름 중 용액에 ¹³C NMR 스펙트럼을 수행하였다. Micromass Platform II (ES⁺ 조건) 분광계를 사용햐여 질량 스펙트럼를 수득하였다. 표 3 및 4에서, Optical Activity PolAAr 2001 계기를 사용하여 24 ℃에서 메탄올 용액 중 광회전 분산도를 수득하였다. HP1050 HPLC 크로마토그래프를 사용하여 HPLC 잔류 시간 측정을 UV 검출로 수행하였다.

실시예 3

이성질체 B의 제조 및 메실레이트 염의 제조의 대체 방법

3A. RR/SS 테트라베나진의 환원

테트라히드로푸란(52 ml, 52 mmol, 1.1 당량) 중 1M L-셀렉트라이드^®를 테트라히드로푸란(56 ml) 중 테트라베나진 라세미체(15 g, 47 mmol)의 냉각된(얼음 욕조), 교반된 용액에 30 분 동안 서서히 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 혼합물을 방치하여 실온까지 승온시키고 추가적으로 6 시간 동안 교반하였다. TLC 분석(이산화규소, 에틸 아세테이트)에는 매우 적은 양의 출발 물질만 남아있는 것으로 나타났다.

혼합물을 분쇄된 얼음(112 g), 물(56 ml) 및 냉각된 아세트산(12.2 g)의 교반된 혼합물에 부었다. 생성된 황색 용액을 에테르(2 x 50 ml)로 세척하고, 고체 탄산나트륨(계산값 13 g)을 서서히 첨가함으로써 염기화하였다. 석유-에테르(30-40 ℃)(56 ml)를 교반하면서 혼합물에 첨가하고, 여과함으로써 조질 β-DHTBZ를 백색 고체로서 수집하였다.

상기 조질 고체를 디클로로메탄(계산값 150 ml) 중에 용해하고, 생성된 용액을 물(40 ml)로 세척하고, 무수 황산마그네슘을 사용하여 건조시키고, 여과하고, 감압 상태에서 계산값 40 ml로 농축시켰다. 백색 고체의 짙은 현탁액이 제조되었다. 석유-에테르(30-40 ℃)(56 ml)를 첨가하고, 현탁액을 15 분 동안 실험실 온도에서 교반하였다. 생성물을 여과함으로써 수집하고, 여과기 상에서 순백색이 될 때까지 석유-에테르(30-40 ℃)(40 내지 60 ml)를 사용하여 세척하고, 실온에서 공기 건조하여 β-DHTBZ(10.1 g, 67%)를 백색 고체로서 수득하였다. TLC 분석(이산화규소, 에틸 아세테이트)에는 하나의 성분만 나타났다.

3B. 라세미 β-DHTBZ의 장뇌술폰산 염의 제조 및 분별결정

실시예 3A의 생성물 및 1 당량의 (S)-(+)-장뇌-10-술폰산을 최소량의 메탄올 중에 가열하면서 용해하였다. 생성된 용액을 방치하여 냉각시킨 후 생성된 고체 침전물의 형성이 완료될 때까지 에테르로 서서히 희석시켰다. 생성된 백색 결정 고체를 여과함으로써 수집하였고, 에테르로 세척하고 건조시켰다.

(10 g)의 장뇌술폰산 염을 뜨거운 순수한 에탄올(170 ml) 및 메탄올(30 ml) 혼합물 중에 용해하였다. 생성된 용액을 교반하고, 방치하여 냉각시켰다. 2 시간 후, 형성된 침전물을 여과에 의해 백색 결정 고체(2.9 g)로서 수집하였다. 결정체 물질의 견본을 과잉 포화된 수성 탄산나트륨 및 디클로로메탄으로 분리 깔때기 내에서 진탕시켰다. 유기상을 분리하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 감압 상태에서 농축시켰다. 잔기를 석유-에테르(30-40 ℃)를 사용하여 저작하고, 유기 용액을 한번 더 농축시켰다. Chirex (S)-VAL 및 (R)-NEA 250 x 4.6 mm 칼럼을 사용한, 염 및 유속 1 ml/분인 헥산 : 에탄올 (98:2) 용리액의 키랄 HPLC 분석에는 유리된 β-DHTBZ가 하나의 거울상 이성질체로 농축되었음이 나타났다(e.e. 계산값 80%).

농축된 장뇌술폰산 염(14 g)을 뜨거운 순수한 에탄올(140 ml) 중에 용해하고, 프로판-2-올(420 ml)을 첨가하였다. 생성된 용액을 교반하고, 1 분 내에 침전물이 형성되기 시작했다. 혼합물을 방치하여 실온으로 냉각하고, 1 시간 동안 교반하였다. 형성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 에테르로 세척하고, 건조시켜 백색 결정 고체를 수득하였다(12 g).

결정체 물질을 과잉 포화 수성 탄산나트륨 및 디클로로메탄으로 분리 깔때기 내에서 진탕시켰다. 유기상을 분리하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 감압 상태에서 농축시켰다. 잔기를 석유-에테르(30-40 ℃)를 사용하여 저작하고, 유기 용액을 한번 더 농축시켜 (+)-β-DHTBZ(6.6 g, ORD +107.8°를 수득(진공에서 건조시킨 후) 하였다. 유리된 거울상 이성질체는 e.e. >97%이다.

3C. 이성질체 B의 제조

디클로로메탄(55 ml) 중 오염화인(4.5 g, 21.6 mmol, 1.05 당량) 용액을 디클로로메탄(90 ml) 중 실시예 3B(6.6 g, 20.6 mmol) 생성물의 교반된, 냉각된(얼음-물 욕조) 용액에 10 분 동안 서서히 첨가하였다. 첨가가 완료된 때, 생성된 황색 용액을 추가적인 10 분 동안 교반하고, 물(90 ml) 및 분쇄된 얼음(90 g) 중 탄산나트륨(15 g)의 급속히 교반된 혼합물에 부었다. 혼합물을 추가적으로 10 분 동안 교반하고 분리 깔때기로 옮겼다.

일단 상이 분리되면, 갈색 디클로로메탄 층을 제거하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 감압 상태에서 농축시켜 조질 알켄 중간체를 갈색 기름으로서 수득하였다(계산값 6.7 g). TLC 분석(이산화규소, 에틸 아세테이트)에는 (+)-β-DHTBZ이 조질 생성물에 남지 않았음이 나타났다.

무수 테트라히드로푸란(40 ml) 중에 조질 알켄을 흡수시키고 (건조한 질소 분위기) THF 중 붕산염의 용액(1 M 용액, 2.5 당량, 52 ml)을 15 분 동안 교반하면서 첨가하였다. 이후 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. TLC 분석(이산화규소, 에틸 아세테이트)에는 알켄 중간체가 반응 혼합물에 남지 않았음이 나타났다.

물(10 ml) 중 수산화나트륨(3.7 g)의 용액을 교반중 반응 혼합물에 첨가한 다음, 과산화수소의 수성 용액(50%, 계산값 7 ml)을 첨가하고, 제조된 2상 혼합물을 1 시간 동안 환류에서 교반하였다. 본 유기상의 TLC 분석(이산화규소, 에틸 아세테이트)에는 이성질체 B로 기대되는 생성물의 출현이 Rf로 나타났다.

반응 혼합물을 방치하여 실온으로 냉각시키고, 분리 깔때기 내로 부었다. 상부 유기층을 제거하고, 감압하에서 농축시켜 THF의 다수를 제거하였다. 잔기를 에테르(안정된 (BHT), 75 ml)에 흡수시키고, 물(40 ml)로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 감압하에서 농축시켜 연한 황색 기름을 수득하였다(8.1 g).

상기 황색 기름을 칼럼 크로마토그래피(이산화규소, 에틸 아세테이트 : 헥산 (80:20), 100% 에틸 아세테이트까지 증가)를 사용하여 정제하고, 바람직한 칼럼 분획물을 수집하고, 합하고, 감압 상태에서 농축시켜 연한 기름을 수득하였고, 이를 에테르(안정된, 18 ml)로 처리하고, 감압 상태에서 농축시켜 이성질체 B를 연한 황색 고체 포말로서 수득하였다(2.2 g).

실시예 3B에서 나열한 조건을 사용한 키랄 HPLC로 이성질체 B가 97% 초과의 거울상 이성질체 과잉률(e.e.)로 생성되었음이 확인되었다.

광회전을 Bellingham Stanley ADP220 편광계를 사용하여 측정하고 +123.5°의[α_D]를 수득하였다.

3D. 이성질체 B의 메실레이트 염의 제조

이성질체 B의 메탄술폰산염을 최소량의 에탄올 중 실시예 3C로부터의 이성질체 B의 1 당량 및 메탄 술폰산 1 당량의 혼합물을 용해함으로써 제조하고, 이후 디에틸 에테르를 첨가하였다. 생성된 백색 침전물을 여과함으로써 수집하고, 진공 속에서 건조시켜 수율 계산값 85% 및 순도(HPLC에 의해) 계산값 96%의 메실레이트 염으로 수득하였다.

실시예 4

이성질체 B에 대한 X-선 결정학적 연구

이성질체 B의 (S)-(+)-장뇌-10-술폰산 염을 제조하고, 단일 결정을 하기 조건하에서 X-선 결정학적 연구에 적용시켰다:

회절계: Nonius KappaCCD 영역 검출기 (비대칭 단위를 충전시키기 위한 t/i 스캔 및 OJ 스캔).

세포 측정: DirAx (참조: Duisenberg, A.J.M.(1992). J. Appl. Cryst. 25, 92-96.).

데이타 수집: 수집 (참조: Collect: Data collection software, R. Hooft, Nonius B. V, 1998).

데이타 정리 및 세포 정제: 데모 (참조: Z. Otwinowski & W. Minor, Methods in Enzymology (1997) Vol. 276: Macromolecular Crystallography, part A, pp. 307-326; C. W. Carter, Jr & R. M. Sweet, Eds., Academic Press).

흡수 보정: Sheldrick, G. M. SADABS - Bruker Nonius 영역 검출기 스케일링 및 흡수 보정 - V2.＼ 0.

구조 용액(Structure solution): SHELXS97 (참조: G. M. Sheldrick, Acta Cryst. (1990) A46 467-473).

구조 정제(Structure refinement): SHELXL97 (참조: G. M. Sheldrick (1997), University of Gottingen, Germany).

그래픽: Cameron - A Molecular Graphics Package (참조: D. M. Watkin, L. Pearce and C. K. Prout, Chemical Crystallography Laboratory, University of Oxford,1993).

특이한 세부사항: 상이한 지도 내에 위치시키고 제한을 가하여 정제한 NH 및 OH의 수소를 제외한 모든 수소 원자를 이상적인 위치에 두고, 라이딩 모형(riding model)을 사용하여 정제하였다. 키랄성: NI=R, CI2=S, CI3=S, CI5=R, C21=S, C24=R

상기 연구 결과가 하기 표 A, B, C, D 및 E에 나열되었다.

표에서 RUS0350 표기는 이성질체 B를 지시한다.

상기에 나열된 데이타를 근거로, 이성질체 B는 화학식 (Ia)에 상응하는 2S,3S,11bR 배위를 갖는 것으로 여겨진다:

[화학식 Ia]

실시예 5

시그마 수용체 결합 연구

4 개의 디히드로테트라베나진 이성질체 A, B, C 및 D를 시그마-1 및 시그마-2 수용체에 결합하는 능력을 시험하기 위한 특정 결합 시험에 적용하였다. 결과를 표 5에 나열하였다.

(a) 시그마 σ ₁ 수용체:

참조: Ganapathy et al., Pharmacol. Exp. Ther., 289:251-260, (1999)

근원: 사람의 주르카트(jurkat) 세포

리간드: 8 nM [3H] 할로페리돌

비이클(vehicle): 1% DMSO

배양 시간/온도: 25 ℃에서 4 시간

배양 완충액: 5 mM K2HPO4/KH2PO4 완충액 pH 7.5

불특정 리간드: 10 μM 할로페리돌

Kd: 5.8 nM

Bmax: 0.71 pmole/mg 단백질

특정 결합: 80%

정량 방법: 방사리간드 결합

중요성 판단 기준: 최대 자극 또는 억제의 50% 이상

(b) 시그마 σ ₂ 수용체:

참조: Hashimoto et al., Eur. J. Pharmacol., 236:159-163, (1993)

근원: 위스타 래트(wistar rat)의 뇌

리간드: 3 nM [3H] 이펜프로딜(Ifenprodil)

비이클: 1% DMSO

배양 시간/온도: 37 ℃에서 60 분

배양 완충액: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4

불특정 리간드: 10 μM 이펜프로딜

Kd: 4.8 nM

Bmax: 1.3 pmole/mg 단백질

특정 결합: 85%

정량 방법: 방사리간드 결합

중요성 판단 기준: 최대 자극 또는 억제의 50% 이상

시그마-1 및 시그마-2 수용체에서의 특정 결합의 디히드로테트라베나진 이성질체의 10μM 용액에 의한 억제율
수용체/단백질	이성질체 A	이성질체 B	이성질체 C	이성질체 D
(a) σ1 수용체	48	82	59	82
(b) σ2 수용체	64	64	61	69

상기 데이타에는 4 개의 모든 이성질체가 시그마-1 및 시그마-2 수용체 양 쪽에 결합함을 나타낸다. 4 개의 이성질체는 시그마-2 수용체 결합 연구에서는 대략적으로 능력이 동등하나 이성질체 B 및 D는 시그마-1 수용체에 더 강하게 결합됨을 나타낸다.

실시예 6

항-증식성 활성

본 발명의 화합물의 항-증식성 활성은, 다수의 세포계에서의 세포 성장을 억제하는 화합물의 활성을 측정함에 의해 결정될 수 있다. 세포 성장의 억제는 Alamar Blue 검사 (참조: Nociari, M. M, Shalev, A., Benias, P., Russo, C. Journal of Immunological Methods 1998, 213, 157-167)를 사용하여 측정되었다. 본 방법은 리새주린(resazurin)을 이의 형광성 생성물인 리소루핀(resorufin)으로 환원시키는, 생존가능한 세포의 활성에 기초하였다. 각각의 증식 검사에 대하여, 세포를 96 웰 플레이트(well plate) 상에 놓아두고, 방치하여 16 시간 동안 회복시킨 후 추가로 72 시간 동안 화합물의 억제제를 첨가하였다. 배양 기간의 종료 시점에 10% (부피/부피) Alamar Blue를 첨가하고, 추가로 16 시간 동안 배양한 후 535nM ex / 590nM em에서 형광성 생성물을 측정하였다. 비-증식성 세포 검사의 경우에, 세포를 합류점에서 96 시간 동안 유지한 후 추가로 72 시간 동안 화합물의 억제제를 첨가하였다. 생존가능한 세포의 수를 상기와 같이 Alamar Blue 검사로 측정하였다. 모든 세포계를 ECACC(세포 배양의 유럽 컬렉션[European Collection of cell Cultures])로부터 수득하였다. 이러한 세포계의 예로는 사람의 SK-N-SH 신경모세포종 및 래트의 C6 신경아교종 세포계가 있다.

실시예 7

사람의 단핵세포에 의해 시토카인의 LPS/IFN 자극받은 생성에 대한 본 발명의 화합물의 효과의 측정

본 발명의 화합물이 사람의 단핵세포에 의해 시토카인의 생성을 변조시킬 수 있는 정도를 측정하기 위해 화합물을 시험하였다. 단핵세포는 대식세포의 전구체이고 폭넓은 범위의 질환 상태 내에서 염증성 시토카인의 핵심적인 근원이었다. 따라서, 단핵세포 생성에 대항하는 본 발명의 화합물의 활성은 소염 활성을 갖는 화합물의 가망성에 대한 양호한 척도를 제공하였다.

하기에는 치료 군을 나열하였다.

군	치료
A	비자극된 단핵세포 조절
F	비자극된 단핵세포 + 나빌론 (100μM/10μM/1μM/100nM/10nM/1nM/100pM/10pM)
G	비자극된 단핵세포 + 이성질체 D (100μM/10μM/1μM/100nM/10nM/1nM/100pM/10pM)
H	비자극된 단핵세포 + 이성질체 B (100μM/10μM/1μM/100nM/10nM/1nM/100pM/10pM)
I	LPS/IFNγ 자극된 단핵세포 단독
N	자극된 단핵세포 + 나빌론 (100μM/10μM/1μM/100nM/10nM/1nM/100pM/10pM)
O	자극된 단핵세포 + 이성질체 D (100μM/10μM/1μM/100nM/10nM/1nM/100pM/10pM)
P	자극된 단핵세포 + 이성질체 B (100μM/10μM/1μM/100nM/10nM/1nM/100pM/10pM)

절차

사람의 단핵세포 시토카인 생성의 변조

재료

MACS 완충액: 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (시그마), 5% 사람의 AB 혈청

배지: 500 ml RPMI 1640 (인비트로겐[Invitrogen]), 5 ml Penstrep (시그마), 5 ml L-글루타민 (인비트로겐), 10 ml HEPES (시그마), 5% 자가조직의 혈장.

화합물: 순수 에탄올 중의 저장물 10 mM .

LPS: 살모넬라 어볼티스(Salmonella abortis) 1 mg/ml (시그마, Cat # L1887).

IFNγ: 재조합체 사람(Recombinant human) 10 ㎍/ml (BD Pharmacia, Cat # 554617).

MACS CD14 양성 선택 비즈(positive selection beads) 및 LS 칼럼 (Miltenyi Biotech).

CD14:FITC 항생제 (Miltenyi Biotech)

브리스톨 내쇼널 블러드 서비스(Bristol National Blood Services)로부터 수득한 백혈구연층.

7 x 10⁶ 개의 세포를 제공하는 혈액 1 ml.

자가조직 혈장의 제조

10 분 동안 3500 rpm으로 백혈구연층을 회전시킨다.

상부의 혈장층을 제거하고, 30 분 동안 56 ℃에서 열-비활성화시킨다.

10 분 동안 3500 rpm으로 회전시켜서 열-비활성화된 보체 단백질 등을 제거한다.

말초 혈액 단핵세포(PBMC) 유리

1. RPMI 1640 배지와 동일한 부피의 잔여 백혈구연층을 재부유시키고, 역위에 의하여 혼합한다.

2. 히스토파크(histopaque) (시그마)를 실온(RT)으로 예열하고, 10 ml를 범용품(universal)에 첨가한다.

3. 15 ml 혈액/배지 혼합물로 서서히 덧씌운다.

4. 실온에서 25 분 동안 1600 rpm으로 (무제동) 회전시킨다.

5. PBMC를 배지와 히스토파크 사이의 계면층으로 분리하고, 세포를 50 ml 팔콘(Falcon)으로 옮기고, 배지를 10 ml 첨가한다.

6. 실온에서 10 분 동안 1800 rpm으로 회전시킨다.

7. 40 ml RPMI 배지로 3회 세척하고, 배지 내에서 재부유시킨다.

CD14 ⁺ 마이크로비즈로 양성 선택함에 의해 CD14 ⁺ 세포를 유리시킨다

얼음 상에서, 선행-냉각된 용액으로 실시한다.

1. 세포 수를 결정한다(313 x 10 x 5 x 10⁴ =1.565 x 10⁸ 전체 세포).

2. 형광-활성된 세포-분류 (FACS) 검사 (선행-선택 표본)를 위해 세포 표본 100 ml를 옮긴다.

3. 4 ℃에서 10 분 동안 1800 rpm으로 회전시킨다. 상청액을 제거한다.

4. 전체 세포 1 x 10⁷당 완충액 80 ㎕ 중에 펠릿을 재부유시킨다(2400 ㎕/전체 세포).

5. 전체 세포 1 x 10⁷당 CD14 마이크로비즈 20 ㎕를 첨가한다(400 ㎕/전체 세포).

6. 골고루 혼합하고, 4-8 ℃에서 15 분 동안 배양한다.

7. 완충액 1-2 ml로 세포를 세척하고, 4 ℃에서 10 분 동안 300 x g의 속도로 회전시킨다.

8. 완충액 500 ㎕ 중에 세포 1 x 10⁸ 개까지 재부유시킨다(1 ml/전체 세포).

LS 칼럼으로 자기 분리

1. MACS^®분리기의 자기장 내에 칼럼을 배치한다. MACS 완충액 3 ml로 칼럼을 헹군다.

2. 칼럼에 세포 현탁액을 첨가한다.

3. 통과한 미식별된 세포를 수집한다. 완충액 3x 3 ml로 칼럼을 세척하고, 칼럼 저장기를 각각의 세척 사이에 비우도록 한다. 전체 폐기물(미식별된 세포 분획물)을 수집한다.

4. 분리기로부터 칼럼을 옮기고 수집관 위에 배치한다.

5. 완충액 5 ml를 칼럼에 첨가하고 , 칼럼 플런저를 적용함에 의해 자기로 식별된 세포로 일부를 즉각적으로 쏟아내린다.

6. MACS 완충액 중의 세포를 회전시키고, 배지 내의 세포 펠릿을 재부유시킨다.

7. 양성 선택 세포의 세포 수을 헤아린다.

71 x 20 x 5 x 104 = 7.1 x 10⁷ 세포/ml. 1.75ml의 부피이므로 1.24 x 10⁸의 전체 세포 수.

8. FACS에 의해 순도를 조사하기 위해 표본을 채취한다 - CD14-FITC 항생제 10 ㎕를 첨가하고, 4-8 ℃에서 5 분 동안 배양한다.

화합물 제조

순수 에탄올 중 화합물 10 mM를 제조한다. 요구되는 농도로 배지에서 배양하기에 앞서 희석시킨다.

세포 배양

유리된 CD14⁺ 단핵세포를 1 x 10⁶ 세포/ml/웰로 24-웰 플레이트 중에서 배양하였다. 단핵세포를 시험 화합물의 존재 중에 배양하고, 하기 표에 나열된 다양한 희석도에서 조절하였다. 밤새 배양한 후, LPS(10 ㎍/ml) 및 IFNγ(100 ng/ml)를 첨가하여 단핵세포 활성을 자극시키고, CB2 발현을 상승시켰다. 48 시간 후, CBA 시토카인 검사를 위해 상청액을 제거하였다.

CBA 시토카인 검사(BenderMedSystems 사람의 Th1/Th2 키트 [Cat # BMS716FF])

모든 완충액을 사용전에 실온 및 와류로 가져온다.

1. 증류된 H₂O 450 ml에 첨가함에 의해 검사 완충액을 제조하고, 서서히 혼합시킨다. 4 ℃로 저장한다.

2. 각각의 비오틴-접합 600 ㎕를 범용품(universal) 내로 첨가함에 의해 비오틴-접합 혼합물을 제조한다.

3. 각각의 비드 세트 300 ㎕를 첨가함에 의해 비드 혼합물을 제조한다.

4. 바이알 표지로 추천된 증류된 물로 각각의 표준을 재구성한다. 검사 완충액 100 ㎕를 표준 1로 표지된 관에 첨가한다. 각각의 재구성된 표준 10 ㎕를 첨가하고 혼합한다. 일련의 희석된 표준 혼합물 (검사 완충액 100 ㎕를 관 2-7로, 표준 1 50 ㎕를 관 2로 첨가하고, 혼합하고, 50 ㎕를 관 3으로 이전한다 등).

5. FACS 관을 표지하고, 표준 1~7의 25 ㎕를 지정된 관에 첨가한다. 검사 완충액 25 ㎕를 빈 관에 첨가한다.

6. 표본 25 ㎕를 지정된 표본관에 첨가한다.

7. 비드 혼합물 25 ㎕를 모든 관에 첨가한다.

8. 비오틴-접합 50 ㎕를 모든 관에 첨가한다.

9. 와류에 의해 혼합한 후, 포일(foil)로 씌우고, 실온에서 2 시간 동안 배양한다.

10. 검사 완충액 5324 ㎕ 중에 176 ㎕를 혼합함에 의해 스트레파비딘-PE 용액을 제조한다. 검사 완충액 1 ml를 모든 관에 첨가하고, 5 분 동안 200 x g의 속도로 회적시킨다. 상청액을 비워버린다. 세척 단계를 반복하고 상청액을 비워버린다.

11. 스트레파비딘-PE 50 ㎕를 모든 관에 첨가한다. 와류에 의해 혼합한 후, 포일로 씌우고, 실온에서 1 시간 동안 배앙한다.

12. 세척 단계를 반복한다 x2.

13. 검사 완충액 500 ㎕를 모든 관에 첨가한다.

유동 세포계산기 설정

양성 및 음성 비즈(키트로 제공)를 작동하여 설정을 최적화하고, 보정 등을 결정한다. 제어된 개체군에 대해 3000 사건을 헤아리며, 표본에 앞서 표준 곡선을 작동한다(300 사건/분석물).

결과

결과를 도 1 내지 6에 나타낸다. 도면에서, RU348 표지는 이성질체 D를 지시한다.

도 1 내지 6으로부터 보여진 바와 같이, 2 개의 시스-디히드로테트라베나진 이성질체 B 및 D 양쪽은 LPS/IFN에 의해 자극받은 단핵세포 내의 별개의 시토카인의 생성 범위를 감소시켰다.

따라서, 이성질체 B는 시토카인 IL-2 및 IL-12의 생성을 시험하는 모든 농도에서 감소시키고, 시토카인 IL-4, IL-5 및 IL-10의 생성을 시험하는 대다수의 농도에서 감소시켰다.

이성질체 D는 시토카인 IL-2, IL-4, IL-5 및 IL-12의 생성을 시험하는 모든 농도에서 감소시키고, 시토카인 TNFa, IL-4, IL-5 및 IL-10의 생성을 시험하는 대다수의 농도에서 감소시켰다.

실시예 8

T 세포 증식에 대한 본 발명의 화합물의 효과 결정

본 발명의 화합물이 T 세포 증식을 억제시킬 수 있는 정도를 측정하기 위해 화합물을 시험하였다. T 세포는 적응성 면역 반응을 조정하는 책임이 있고, 폭넓은 범위의 질환 상태 내에서 염증을 일으켰다. 따라서 T 세포 증식에 대항하는 본 발명의 화합물의 활성은 소염 활성을 갖는 화합물의 가망성에 대한 양호한 척도를 제공하였다.

재료

HBSS + 2% HEPES 완충액 (500 ml+10 ml), 알파 MEM(500 ml) + 2% HEPES(10 ml) + 1% Pen/strep(5 ml) + 2% L-글루타민(10ml) + 50μM 2-ME(500 ㎕) 및 평범한 마우스 혈청(NMS)

방법

1. 3 x 96 웰 플레이트 열 1-8, 행 A-H를 PBS 중 100 ㎍/ml의 항-마우스 CD3 100 ㎕로 코팅하였다. 따라서, 전체 192 웰을 1.44 mg/ml의 저장물 17 ㎕를 첨가함에 의해 PBS 중 24 ml를 제조하였다. 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다.

2. NMS의 제조를 위한 심장 천공 후 2 balb/c 마우스로부터 혈액을 울혈시키고, HBSS + Hepes로 비장을 제거하였다.

3. 혈액을 응혈하도록 37 ℃에서 30 분 동안 배치하고, 칠스핀(chilspin) 내에서 10 분 동안 3,000 rpm으로 회전시켰다. 혈청을 제거하고, 여과기를 무균처리하고, 사용할 때까지 냉장고에 보관하였다.

4. 10 ml HBSS를 함유하는 페트리 접시(petri dishe)로 비장을 이동시키고, 비장 너머에 배치된 깨끗한 무균 철망을 사용하여 유리막대를 써서 세포를 풀어놓았다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 그물로부터 세포를 세척하고, 15 ml 관으로 이동시켰다. 실온(RT)에서 10 분 동안 1000 rpm으로 회전시켰다.

5. 세포를 재부유시키고, 0.5ml 무균 DW를 첨가하여 RBC를 분해하고, 혼합하고, 즉각적으로 HBSS로 희석시키고, 세포 여과기를 통과시켜 50 ml 관으로 이동시켜(70 μM) 파편을 제거하고, 상기와 같이 회전시키고, HBSS 내에서 한번 더 세척하고, 마지막으로 부형제(상기와 같은)를 포함하는 알파 MEM 2 ml에 재부유시켰다.

6. 세포 갯수 - 252 세포 x 2 x 5 x 10⁴ = 4ml 중 2.52 x 10⁷ 세포/ml = 전체 10⁸ 세포. 2mls를 25mls로 희석시켜 2 x 10⁶ 세포/ml의 세포 농도를 수득하였다.

7. 250 ㎕의 NMS를 세포에 첨가하여 1%의 농도를 수득하였다.

8. 항-CD3 코팅된 플레이트를 3 x PBS로 세척하였다.

9. 세포의 부분표본 100 ㎕를 코팅된 웰인 3 x 96-웰 플레이트의 행 A-H 열 1-8로 이동시켰다. 동일한 부피의 희석된 화합물을 하기에서 나타낸 96 웰 플레이트에 첨가하였다.

화합물

10 mM의 화합물 3.5 ㎕를 배지 346.5 ㎕에 이동시키고(1/100), 1/100 희석물 35 ㎕를 배지 315 ㎕에 이동시키는(1/10) 등 플레이트 아래쪽에 같은 방법으로 화합물의 일련의 1/10 희석물을 수득하였다. 별개의 희석된 화합물의 부분표본 100 ㎕를 T 세포를 함유하는 삼중 플레이트의 웰에 이동시켰다.

Nab*	이성질체 D	이성질체 B	배지
1/100	100μM	100μM	100μM
1/10	10μM	10μM	10μM
1/10	1μM	1μM	1μM
1/10	100nM	100nM	100nM
1/10	10nM	10nM	10nM
1/10	1nM	1nM	1nM
1/10	100pM	100pM	100pM
1/10	10pM	10pM	10pM

* Nab = 나빌론(nabilone)

48 시간 동안 배양한 후, ³H-티미딘 한방울(16 ㎕)을 각각의 웰에 첨가하고, 37 ℃의 5% CO₂에서 밤새 배양하였다. 수확하였다. ³H-티미딘 결합을 측정하였다.

결과

³H-티미딘 결합의 수준에 의해 설명된 T 세포 증식의 정도는 하기 표에 나타낸 데이타에 의해 설명된다.

표에서, "Nab"는 나빌론을 지시하고, "RU346"은 이성질체 D를 지시하고, "RU350"은이성질체 B를 지시한다.

상기 결과는 극고농도에서 각각의 시험된 화합물이 T 세포의 증식을 억제하는 것을 설명한다.

실시예 9

약제학적 조성물

(i) 정제 제형 - I

본 발명의 디히드로테트라베나진을 함유하는 정제 조성물을 50mg의 디히드로테트라베나진을 희석제로서의 락토오스(BP) 197mg 및 윤활제로서의 스테아린산 마그네슘 3mg과 혼합하고, 공지된 방식으로 정제를 형성하여 압착함으로써 제조하였다.

(ii) 정제 제형 - II

본 발명의 디히드로테트라베나진을 함유하는 정제 조성물을 화합물(25 mg)을 산화철, 락토오스, 스테아린산 마그네슘, 백색의 옥수수 전분 및 활석과 혼합하고, 공지된 방식으로 정제를 형성하여 압착함으로써 제조하였다.

(iii) 캡슐 제형

캡슐 제형을 본 발명의 디히드로테트라베나진 100mg을 100mg의 락토오스와 혼합하고, 생성된 혼합물을 표준 불투명 경질 젤라틴 캡슐에 충전함으로써 제조하였다.

등가물

본 발명의 근원을 이루는 원칙에서 이탈하지 않으면서 수많은 변형 및 대안을 상기된 본 발명의 특정한 양태에 가할 수 있다는 것은 당연히 명백하다. 이러한 모든 변형 및 대안은 본 출원에 의해 포함된다.

Claims (11)

1. 증식성 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 3,11b-시스-디히드로테트라베나진 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염인 화합물의 용도.
2. 제1항에 있어서,

   약제가 염증성 질환의 예방 또는 치료용인 용도.
3. 제2항에 있어서,

   염증성 질환이, 류마티즘성 관절염, 골관절염, 외상관절염, 통풍관절염, 풍진성 관절염, 건선성 관절염 및 다른 관절염성 상태; 급성 또는 만성 염증성 질환 상태, 예를 들어 내독소에 의해 유발된 염증성 반응 또는 염증창자질환; 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 통풍, 류마티즘양척추염, 만성 폐 염증성 질환, 크론 병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염으로부터 선택된 것인 용도.
4. 제3항에 있어서,

   염증성 질환이 류마티즘성 관절염인 용도.
5. 염증성 질환, 예를 들어 제3항 또는 제4항에서 정의된 염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 화합물로서, 3,11b-시스-디히드로테트라베나진인 화합물.
6. 환자(예를 들어 사람과 같은 포유류)의 염증성 질환 또는 상태(예를 들어 제3항 또는 제4항에서 정의된 염증성 질환)을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 3,11b-시스-디히드로테트라베나진을 치료학적 유효량으로 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

   3,11b-시스-디히드로테트라베나진이 본원에서 정의된 이성질체 B 또는 이성질체 D인 용도, 용도를 위한 화합물 또는 방법.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

   3,11b-시스-디히드로테트라베나진이 하기 화학식 Ia를 가지는 용도, 용도를 위한 화합물 또는 방법:

   [화학식 Ia]

   
9. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,

   3,11b-시스-디히드로테트라베나진이 산 부가염의 형태인 용도, 용도를 위한 화합물 또는 방법.
10. 제9항에 있어서,

    염이 메탄술폰산염인 용도, 용도를 위한 화합물 또는 방법.
11. 실질적으로 본원의 실시예와 관련하여 기술된 용도, 용도를 위한 화합물 또는 방법.

Images