KR20080028981A - Ｇｌｐ-1 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 글루카곤계 펩티드-1의 펩티드 유사체, 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 포유류를 치료하기 위한 상기 유사체의 이용 방법, 및 상기 유사체를 포함하는 포유류 치료에 이용가능한 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
본 출원은 2006년 6월 30일자 미국 가출원번호 60/696,142를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 글루카곤계 펩티드-1의 펩티드 유사체, 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 포유류를 치료하기 위한 상기 유사체의 이용 방법, 및 상기 유사체를 포함하는 포유류 치료에 이용가능한 약학 조성물에 관한 것이다.
글루카곤계 펩티드-1(7-36) 아미드(GLP-1)는 글루카곤의 전구체인 프리프로글루카곤의 조직 특이적인 번역 후 프로세싱에 의하여 장의 L-세포 내에서 합성되며(Varndell, J.M., et al., J. Histochem Cytochem, 1985:33:1080-6), 식이에 대한 반응으로서 순환계로 분비된다. GLP-1의 혈장 농도는 공복 시 대략 15 pmol/ℓ의 수준이고 식후에는 40 pmol/ℓ의 수준으로 높아진다. 혈당의 상승에 있어서, 글루코스를 정맥내 투여하는 경우에 비해 경구 투여하는 경우, 혈장 인슐린이 대략 3배 증가되는 것이 제시되어 있다(Kreymann, B., et al., Lancet 1987:2, 1300-4). 인크레틴 효과(incretin effect)로 알려진 음식물에 의한 인슐린 분비 증가는 주로 체액성이며, GLP-1은 인체에서 가장 유력한 생리학적 인크레틴인 것으로 여겨지고 있다. 인슐린성 효과 외에도, GLP-1은 글루카곤 분비를 억제시키고, 공복화를 지 연시키며(Wettergren A, et al., Dig Dis Sci 1993:38:665-73), 글루코스의 말초 분포를 증강시킬 수 있다(D'Alessio, D.A. et al., J. Clin Invest 1994:93:2293-6).
1994년에, GLP-1의 1회 피하(s/c) 투약이 인슐린 비의존성 당뇨증(NIDDM) 환자에게서 식후 글루코스 수준을 완전하게 정상화시킬 수 있다는 사실이 밝혀진 후, GLP-1의 치료 가능성이 제안되었다(Gutniak, M.K., et al., Diabetes Care 1994:17:1039-44). 이러한 효과는 인슐린 분비 증가 및 글루카곤 분비 감소 모두에 의해 매개되는 것으로 여겨졌다. 또한, GLP-1의 정맥내 주입으로, NIDDM 환자에게서 식후 공복화가 지연되는 것으로 확인되었다(Williams, B., et al., J. Clin Endo Metab 1996:81:327-32). 설포닐우레아와는 다르게, GLP-1의 인슐린성 작용은 혈당 농도에 의존적이다(Holz, G.G. 4th, et al., Nature 1993:361:362-5). 따라서, 저혈당 농도에서의 GLP-1 매개성 인슐린 분비 감소는 심각한 저혈당증을 예방한다. 이러한 작용을 종합해 보면 현재 NIDDM 치료에 사용되는 다른 제제들을 능가하는 GLP-1만의 독특하고 유력한 치료 효과가 얻어진다.
여러 가지 연구에서, 건강한 개체에서 GLP-1은 혈당 수준뿐 아니라 인슐린 및 글루카곤 농도에도 강력한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌으며(Orskov, C, Diabetologia 35:701-711, 1992; Holst, J.J., et al., Potential of GLP -1 in diabetes management in Glucagon Ⅲ, Handbook of Experimental Pharmacology, Lefevbre PJ, Ed. Berlin, Springer Verlag, 1996, p. 311-326), 이들 효과는 글루 코스 의존적인 것으로 밝혀졌다(Kreymann, B., et al., Lancet ⅱ; 1300-1304, 1987; Weir, G.C., et al., Diabetes 38:338-342, 1989). 게다가, GLP-1은 당뇨병 환자들에게도 효과적이며(Gutniak, M., N. Engl J Med 226:1316-1322, 1992; Nathan, D.M., et al., Diabetes Care 15:270-276, 1992), 보다 구체적으로는 2형 당뇨병을 가지는 환자의 혈당 수준을 정상화시키며(Nauck, M.A., et al., Diagbetologia 36:741-744, 1993), 1형 당뇨병 환자의 경우에는 혈당 조절을 개선시키며(Creutzfeldt, W.O., et al., Diabetes Care 19:580-586, 1996), 그중에서도 GLP-1의 인슐린 민감성 증가/인슐린 내성 감소 능력이 입증되었다. GLP-1 및 그 유사체는 인슐린 비의존성 당뇨병 발병 위험성이 있는 개체에서의 사용(WO 00/07617)과 임신성 당뇨병의 치료제(미국 특허 공개공보 20040266670)로서 제안되었다.
이외에도, GLP-1 및 그 유사체는 포유류, 예컨대 인간에서의 수많은 치료적 용도를 가지며, 그 예로는 학습 향상, 신경 보호 강화 및/또는 예컨대 신경발생 조절을 통한 중추 신경계 질환 또는 장애, 예컨대 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, ALS, 발작, ADD 및 신경정신학적 증후군의 증상 완화(미국 특허 공개공보 20050009742 및 20020115605); 간 줄기/전구체 세포를 기능적 췌장 세포로 변환(WO03/033697); 베타 세포의 퇴화 방지(미국 특허 공개공보 20040053819 및 20030220251) 및 베타 세포의 증식 자극(미국 특허 공개공보 20030224983); 비만 치료(미국 특허 공개공보 20040018975; WO98/19698); 식욕 억제 및 만복감 유발(미국 특허 공개공보 20030232754); 과민성 장 증후군 치료(WO 99/64060); 심근 경색 으로 인한 질병율 및/또는 사망율 감소(미국 특허 공개공보 20040162241, WO98/08531) 및 발작(WO 00/16797); Q-웨이브 심근 경색이 형성되지 않는 특징을 가진 급성 관상 증후군의 치료(미국 특허 공개공보 20040002454); 수술 후 이화 작용 변화 약화(attenuating)(미국 특허 6,006,753); 휴면 심근(hibernating myocardium) 또는 당뇨병성 심근증 치료(미국 특허 공개공보 20050096276); 노르에피네페린의 혈중 농도 억제(미국 특허 공개공보 20050096276); 뇨를 통한 나트륨 배설 증가, 뇨의 칼륨 농축 감소(미국 특허 공개공보 20050037958); 유해한 혈량과다, 예컨대 신부전, 울혈성 심장 질환, 신증후군, 경화증, 폐부종 및 고혈합과 관련된 상태 또는 장애의 치료(미국 특허 공개공보 20050037958); 근수축성 반응 유도 및 심장 수축성 증가(미국 특허 공개공보 20050037958); 다낭성 난소 증후군 치료(미국 특허 공개공보 20040266678 & 20040029784); 호흡 곤란 치료(미국 특허 공개공보 20040235726); 비-소화기 경로, 즉 정맥내, 피하, 근육내, 복막, 또는 그외 주사나 주입을 통한 영양 공급 개선(미국 특허 공개공보 20040209814); 신장병 치료(미국 특허 공개공보 20040209803); 예컨대 비정상적인 좌심실 구혈률을 보이는 좌심실 수축 부전 치료(미국 특허 공개공보 20040097411); 예컨대 설사, 수술후 급속 덤핑 증후군 및 과민성 장 증후군과 같은 위장 장애의 치료 또는 예방을 위한, 유문-십이지장 운동성 저해, 및 내시경을 통한 수술에서 예비 마취제로(미국 특허 공개공보 20030216292); 중대질환에서의 다발성 신경병증(CIPN; critical illness polyneuropathy) 및 전신성 염증 반응 증후군(SIRS;systemic inflammatory response syndrome) 치료(미국 특허 공개공보 20030199445); 트리글리세라이드 수 준 조절 및 지질대사 이상 치료(미국 특허 공개공보 20030036504 및 20030143183); 허혈증에 따른 혈류 재관류로 인한 장기 조직 손상의 치료(미국 특허 공개공보 20020147131); 관상동맥 심질환의 위험인자(CHDRF; coronary heart disease risk factor) 증후군의 치료(미국 특허 공개공보 20020045636) 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
그러나, GLP-1은 생체내에서 혈장 반감기(t1 /2)가 겨우 1-2분에 불과하여 대사적으로 불안정하다. 외부에서 투여된 GLP-1 또한 신속하게 분해된다(Deacon, C. F., et al., Diabetes 44:1126-1131, 1995). 이러한 대사 불안정성은 천연적인 GLP-1의 치료학적 가능성을 제한하고 있다. 제형 형태로의 개선을 통해 GLP-1 및 그 유사체의 치료적 가능성을 개선시키고자 하는 많은 시도가 있었다. 예를 들면, 국제 특허 공개공보 WO 01/57084에는, 결정과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 주사용 약물과 같은 약학 조성물의 제조에 이용가능한 것으로 일컫어지는 GLP-1 유사체의 결정을 제조하는 과정이 언급되어 있다. GLP-1(7- 37)OH의 불균일한 마이크로 결정체 클러스터는 식염수로부터 생성되었으며, 결정의 아연 및/또는 m-크레졸 침지 처리를 수행한 후 조사되었다(Kim and Haren, Pharma. Res. Vol. 12 No. 11 (1995)). 바늘형의 결정과 무정형 침전물이 함유된 GLP(7-36)NH2의 조결정 현탁액은 아연 또는 프로타민을 포함하는 포스페이트 용액으로부터 제조되었다(Pridal, et. al., International Journal of Pharmaceutics Vol. 136, pp. 53-59 (1996)). 유럽 특허 공개공보 EP 0619322A2에는, 염과 저분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 특정 조합을 pH 7-8.5의 완충액에서 단백질 용액과 혼합하는 단계를 포함하는 GLP-1(7-37)OH의 마이크로-결정형의 제조 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 6,566,490에는, 정제된 펩티드 산물 제조를 돕는 GLP-1의 마이크로결정 시딩(seeding) 방법이 개시되어 있다. 6,555,521(US '521)에는, 순도가 향상되었으며 생체내 활성 증가를 보이는, 사각형의 납작한 막대 또는 플레이트형의 모양을 갖는 GLP-1 결정이 개시되어 있다. US '521에서는, 상기한 결정이 비교적 균일하며, 신속하게 응집하거나 또는 함께 덩어리를 이루어 시린지 바늘을 막아 일반적으로 정해진 투약을 수행할 수 없게 한다는, 이전의 결정체 클러스터와 무정형의 결정체 현탁액 보다 오랜기간동안 현탁 상태를 유지하는 것으로 나타내고 있다.
생분해성 트리블록 공중합체인 폴리[(dl-락티드-코-글리콜리드)-β-에틸렌 글리콜-β-(-락티드-코-글리콜리드)]는, GLP-1의 조절성 방출 제형에 사용하기 위한 것으로 제시되었다. 그러나, 다른 폴리머 시스템과 마찬가지로, 트리블록 공중합체의 제조 방법의 프로토콜은 복잡하며, 균일한 입자를 제조하기 어렵다.
이와 유사한, 생분해성 폴리머, 예컨대 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)도 펩티드의 서방성 전달 제형에 사용하기 위한 것으로 제시되었다. 그러나, 이러한 생분해성 폴리머는 대개 수용성이 불량하며 수-비혼합성 유기 용매, 예컨대 메틸렌 클로라이드가 요구되며, 제조 과정 중에 엄격한 제조 조건이 필요하여, 당업계에서는 꺼리고 있다. 상기 유기 용매 및/또는 엄격한 제조 조건은 대상 펩티드 또는 단백질의 구조 변화를 유도시킬 위험성이 높아져, 구조적 완전성을 감소시키고 생물학적 활성에 해를 주는 것으로 여겨지고 있다(Choi et al., Pharm. Research, Vol. 21 , No. 5, (2004)) 폴록사머도 그와 같은 문제가 있다(Id.)
전술한 GLP-1 조성물은 불순물을 함유하거나/함유하며 재생산 및 투여가 어려운 경향이 있어, 상기 GLP-1 조성물은 GLP의 약학 제형 제조에 이상적이지는 않다. 또한, GLP 유사체는 증가된 농도에서 구역질을 유도하는 것으로 알려져 있어, 초기 혈장 농도가 감소된 서방형 약물 작용을 제공하는 것이 요구되고 있다. 따라서, 보다 쉽고 확실하게 제조할 수 있으며, 보다 간단하고 재현가능하게 환자에게 투여가능하며, 원하지 않는 부작용을 감소시키거나 없애기 위해 초기 혈장 농도를 낮게 제공할 수 있는, GLP-1 제형이 필요한 실정이다.
발명의 개요
본 발명은 하기 단락과 청구항에 요약될 수 있다. 따라서, 본 발명의 제1 목적은 식 (I)에 따른 GLP-1 유사체 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것으로, 상기 조성물의 제형은 우수한 제조, 투여, 약물 동태학 및 약력학적 특성 뿐만 아니라 부정적인 부작용의 약화를 제공한다.
식 (I)
[Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2
바람직하기로는, 본 발명의 약학 조성물은 4 mg/㎖의 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2 및 0.5 mg/㎖의 ZnCl2이 존재하는, pH4의 맑은 ZnCl2 수용액으로 구성되지 않는다.
본 발명의 제1 목적에 대한 제1 측면으로, 약물 방출 프로파일이 향상된, 바람직하기로는 초기 분출(initial burst)이 감소된 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 제1 목적에 대한 제2 측면으로, 작용기간이 연장된 식 (I)의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면으로, 식 (I)의 화합물이나 그의 약제학적으로 허용가능한 염과, 약제학적으로 허용가능한 담체나 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 바람직하기로는, 상기 담체 또는 희석제는 물이다.
본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제1 구현예로, 상기 약학 조성물은 아연을 더 포함한다. 더 바람직하기로는, 상기 약학 조성물내 아연 농도는 약 0.0005 mg/㎖ 내지 약 50 mg/m이다. 보다 더 바람직하기로는, 상기 약학 조성물내 아연 농도는 약 0.01 mg/㎖ 내지 약 0.50 mg/㎖이다. 더욱 바람직하기로는, 상기 약학 조성물은 희석제를 포함하며, 상기 희석제는 약제학적으로 허용가능한 수용액이다. 상기 희석제는 멸균수이다.
더 바람직하기로는, 상기 약학 조성물은 수성 혼합액, 현탁액 또는 용액을 포함하며, 상기 식 (I)의 화합물의 농도는 약 0.5% - 30% (w/w)이다. 더 바람직하기로는, 수성 혼합액, 현탁액 또는 용액내 상기 식 (I)의 화합물의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 또는 30% (w/w)이다. 더 바람직하기로는, 상기 수성 용액내 식 (I)의 화합물의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 14%, 15%, 16%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 29%, 또는 30% (w/w)이다. 더 바람직하기로는, 상기 수성 용액내 식 (I)의 화합물의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 9%, 10%, 11%, 22%, 23%, 24%, 25%, 또는 26% (w/w)이다. 더더 바람직하기로는, 상기 수성 용액내 식 (I)의 화합물의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 10%, 22%, 23%, 24%, 25%, 또는 26% (w/w)이다. 더 더욱 바람직하기로는, 상기 수성 용액내 식 (I)의 화합물의 농도는 약 1%, 2%, 5%, 10%, 23% 또는 25% (w/w)이다. "약"은 다음과 같은 의미이다: 약 0.5% 내지 약 4%의 농도에서는, 목표값에 ±0.5%이 바람직한 범위이며(예, 0.5% 내지 1.5%는 약 1%임); 약 5% 및 그 이상의 목표 농도의 경우에는 목표값의 20%가 바람직한 범위이다(예, 8% 내지 12%는 약 10%임).
본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제2 구현예로, 상기 약학 조성물은 아연을 더 포함하며, 상기 약학 조성물내 식 (I)의 화합물 대 아연의 몰비는 약 6:1 내지 약 1 :1이다. 더 바람직하기로는, 상기 비는 약 5.5:1 내지 약 1:1이다. 더 바람직하기로는, 상기 비는 약 5.4:1 내지 약 1.5:1이다. 더더욱 바람직하기로는, 상기 비는 약 5.4:1, 4.0:1 또는 1.5:1이다. 가장 바람직하기로는, 상기 비는 약 1.5:1이다. 본 발명의 본 측면에서 약은, 각 목표값의 1.5:1 ± 10% 비므로, 예상되는 비는 예컨대 1.35-1.65 : 0.85- 1.15를 포함하는 비이다.
바람직하기로는, 본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제2 구현예에서, 상기 약학 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 1% (중량/부피)이고, [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2 대 아연의 몰비는 약 1.5:1이다. 또한, 바람직하기로는, 본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제2 구현예에서, 상기 약학 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 2% (중량/부피)이고, [Aib8,35]hGLP-1(7-36)NH2 대 아연의 몰비는 약 1.5:1이다. 더 바람직하기로는, 본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제2 구현예에서, 상기 약학 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 10% (중량/부피)이고, [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2 대 아연의 몰비는 약 1.5:1이다. 더 바람직하기로는, 본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제2 구현예에서, 상기 약학 조성물내 [Aib8,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 23% 또는 약 25% (중량/부피)이고, [Aib8,35]hGLP-1(7-36)NH2 대 아연의 몰비는 약 1.5:1이다.
바람직하기로는, 본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제2 구현예에서, 상기 약학 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 5% (중량/부피)이고, 상기 몰비는 약 5.4:1이다. 또한, 바람직하기로는, 본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제2 구현예에서, 상기 약학 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 5% (중량/부피)이고, 상기 몰비는 약 4.0:1이다. 또한, 바람직하기로는, 본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제2 구현예에서, 상기 약학 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 10% (중량/부피)이고, 상기 몰비는 약 5.4:1이다. 또한 더 바람직하기로는, 본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제2 구현예에서, 상기 약학 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 10% (중량/부피)이고, 상기 몰비는 약 4.0:1이다.
바람직하기로는, 본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제2 구현예에서, 상기 아연은 아연 클로라이드 또는 아연 아세테이트로 제공된다. 더 바람직하기로는, 상기 아연 아세테이트는 ZnAc2·2H2O로 제공된다.
바람직하기로는, 본 발명의 제1 목적에 대한 제3 측면의 바람직한 제1 및 제2 구현예에서, 상기 약학 조성물의 pH는 염기를 이용하여 상향 조절된다. 더 바람직하기로는 상기 pH 조절은 NaOH를 이용하여 수행된다. 더 바람직하기로는, 상기 약학 조성물의 pH는 0.9% NaCl을 이용하여 약 1/2 최초 농도로 희석하였을때 직접 전위차계 측정시 pH가 약 5.0 - 5.5이 되도록, NaOH로 조절한다.
약학 제형 분야의 당업자에게 주지된 바와 같이, 본 발명의 조성물의 pH는 약제학적으로 허용가능한 적정 산 및 염기를 이용하여 상기에서 언급한 범위 보다 광범위하게 조절할 수 있다. 최종 조성물의 추가적인 pH 조절은 예컨대 펩티드 농도, 아연 농도 및 생체내 방출 프로파일과 같은 파라미터 조절을 가능하게 한다.
본 발명의 제1 목적에 대한 제2 측면의 바람직한 제1 구현예로, 본 발명은 에서, 본 발명은 각 경우에 독립적으로 상기 제3 측면의 각각의 바람직한 구현예를 포함하여, 상기 제3 측면에 따른 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 식 (I)에 따른 화합물이 이를 필요로 하는 개체, 예컨대 포유류, 바람직하기로는 인간에서 오랜 기간동안 방출되도록 제형화된다. 바람직하기로는, 상기 화합물의 방출은 적어도 1시간 동안, 더 바람직하기로는 적어도 4, 6, 12 또는 24시간 동안 계속된다. 또한, 더 바람직하기로는, 상기 조성물은 식 (I)에 따른 화합물이 적어도 36, 48, 60, 72, 84 또는 96시간 동안 개체내에서 방출되도록 제형화된다. 또한, 더 바람직하기로는, 상기 조성물은 식 (I)에 따른 화합물이 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일간 개체내에서 방출되도록 제형화된다. 더 바람직하기로는, 상기 조성물은 식 (I)에 따른 화합물이 적어도 약 2, 3 또는 4주간 개체내에서 방출되도록 제형화된다. 더 더욱 바람직하기로는, 상기 조성물은 식 (I)에 따른 화합물이 적어도 약 1, 1.5, 2 또는 3달간, 또는 그 이상동안 방출되도록 제형화된다.
본 발명의 제2 목적은, GLP-1(7-36)NH2 리간드의 리셉터를 식 (I)에 따른 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 GLP-1의 작용제 효과를 없애는 방법을 제공하며, 상기 방법에서 식 (I)에 따른 화합물은 상기 리셉터에 직접적으로 또는 각 경우에 독립적으로 상기 제3 측면의 각 바람직한 구현예 각각을 포함하는 상기 제3 측면에 따른 조성물을 통해 간접적으로 제공된다.
본 발명의 제2 목적에 대한 바람직한 제1 구현예에 있어서, 상기 GLP-1(7-36)NH2 리간드의 리셉터는 동물 개체, 바람직하기로는 영장류, 더 바람직하기로는 인간에게서 존재한다. 따라서, 이 구현예에서, 본 발명은 식 (I)에 다른 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효량으로 포함하는 본 발명의 조성물을, 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에게서 GLP-1 리셉터로부터 작용제 효과를 소거하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 목적에 대한 더 바람직한 구현예에 있어서, 상기 개체는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 비만, 식욕 과다, 불충분한 포만감, 대사성 장애로부터 선택되는 질환 또는 상태이거나 발병할 위험이 있는 인간이다.
본 발명의 제2 목적에 대한 더 바람직한 다른 구현예에 있어서, 상기 개체는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 비만, 글루카곤증(glucagonomas), 기도의 분비 장애, 관절염, 골다공증, 중추신경 질환, 재협착증, 신경변성 질환, 신부전, 울혈성 심장부전, 신증후군, 경화증, 폐 부종, 고혈압 및 음식물 섭취 감소가 바람직한 질환, 중추 신경계 질환 또는 장애(예, 신경발생 조절을 통한, 예컨대 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, ALS, 발작, ADD 및 신경 정신학적 증후군), 과민성 장 증후군, 심근경색(예, 이와 관련된 질병율 및/또는 사망율 감소), 발작, 급성 관상 증후군(예, Q-웨이브 부재가 특징임), 심근 경색, 수술 후 이화 작용 변화, 휴면 심근(hibernating myocardium) 또는 당뇨병성 심근증, 뇨를 통한 나트륨 배출 부족, 뇨내 칼륨 농축 과다, 유해한 과다혈량과 관련있는 상태 또는 장애(예, 신부전, 울혈성 심장부전, 신증후군, 경화증, 폐 부종 및 고혈압), 다낭성 난소 증후군, 호흡 곤란, 신장병, 좌심실 수축 부전(예, 비정상적인 좌심실 구혈률), 설사, 수술 후 덤핑 증후군 및 과민성 장 증후군(즉, 유문-십이지장 운동성 저해를 통한)과 같은 위장 장애, 중대질환에서의 다발성 신경병증(CIPN; critical illness polyneuropathy), 전신성 염증 반응 증후군(SIRS;systemic inflammatory response syndrome), 지질대사 이상, 허혈증에 따른 혈류 재관류로 인한 장기 조직 손상, 및 관상동맥 심질환의 위험인자(CHDRF; coronary heart disease risk factor) 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환에 걸리거나 질환이 발병할 위험이 있는 인간이다.
상기 제2 목적의 다른 측면으로, 본 발명은 간 줄기/전구체 세포를 기능적인 췌장 세포로 변환시키는 방법, 베타 세포의 퇴화를 방지하는 방법, 베타 세포의 증식을 자극하는 단계, 노르에피네페린의 혈중 농도를 억제하는 방법, 근수축 반응 유도 방법, 심장 수축력을 증가시키는 방법, 비-소화기 경로를 통한(예, 정맥내, 피하, 근육내, 복막 또는 그외 주입 또는 주사 경로를 통한) 영양 공급을 개선시키는 방법, 내시경 시술을 수행하기 위해 개체를 전처리하는 방법 및 필요로 하는 개체에서 트리글리세라이드 농도를 조절하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의 식 (I)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 본 발명의 제형을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하기로는, 상기 개체는 포유류 동물이며, 더 바람직하기로는 영장류이며, 더 바람직하기로는 인간이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 펩티드는 첫번째 어구 사이에 위치한 천연 서열이 치환된 [Aib8,35]hGLP-1(7-36)NH2의 포맷으로 표시된다(예, Aib8 ,35에서, Aib는 hGLP-1에서 Ala8 및 Gly35를 치환함). Aib는 알파-아미노이소부티르산의 약어이다. 약어 GLP-1은 글루카곤계 펩티드-1을 의미하며, hGLP-1은 인간 글루카곤계 펩티드-1을 의미한다. 상기 어구에서 두번째 세트 사이의 숫자는 펩티드에 존재하는 아미노산의 번호이다(예, hGLP-1(7-36)은 인간 GLP-1의 펩티드 서열에서 아미노산 7번부터 36번을 의미함). hGLP-1(7-37) 서열은 Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein Res,. 40, 1992, pp. 333-342에 개시되어 있다. hGLP-1(7-36)NH2에서 "NH2"는 펩티드의 C-말단이 아미드화된 것을 의미한다. hGLP-1(7-36)은 C-말단이 유리 산임을 의미한다. hGLP-1(7-38)에서 37번 및 38번의 잔기는 별도의 언급이 없다면 각각 Gly 및 Arg이다.
본 발명에 사용되는 펩티드는 유익하게는 약제학적으로 허용가능한 염의 형태로 제공될 수 있다. 이러한 염의 예로는, 유기 산(예, 아세트산, 락트산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산 또는 파모산), 무기 산(예, 염산, 황산 또는 인산) 및 폴리머 산(예, 탄닌산, 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 폴리락트산-글리콜산의 공중합체)와 형성된 염이 있으나, 이로 한정되는 것을 아니다. 본 발명에 따른 펩티드의 염을 제조하는 전형적인 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 표준적인 염 치환 방법에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 펩티드의 TFA 염(제조용 HPLC를 이용하고 TFA 함유성 완충액으로 용출시켜 펩티드를 정제함으로써 TFA 염 제조)을 소량의 0.25N 아세트산 수용액에 펩티드를 용해시킴으로써 아세테이트 염과 같은 다른 염으로 변환시킬 수 있다. 제조되는 용액을 세미-제조용 HPLC 컬럼(Zorbax, 300 SB, C-8)에 가한다. 컬럼은, (1) 0.5 시간 동안 0.1N 암모늄 아세테이트 수용액으로, (2) 0.5시간 동안 0.25N 아세테이트 수용액으로, 그리고 (3) 유속 4 ㎖/min으로 선형 농도 구배(30분간 용액 B를 20%에서 100%로)(용액 A는 0.25N 아세트산 수용액이고; 용액 B는 아세토니트릴/물, 80:20 중의 0.25N 아세트산임)로 용출시킨다. 펩티드가 함유된 분획을 모아 동결건조하여 건조시킨다.
당업자들에게 주지된 바와 같이, GLP-1의 공지된 및 가능한 용도는 다양하며, 다채롭다(Todd, J. F., et al., Clinical Science, 1998, 95, pp. 325- 329; and Todd, J.F. et al., European Journal of Clinical Investigation, 1997, 27, pp.533- 536). 따라서, 작용제 효과를 소거하기 위한 목적으로의 본 발명의 화합물 투여는 GLP-1 그 자체와 동일한 효과 및 용도를 가질 수 있다. GLP-1의 다양한 용도는 하기와 같이 치료에 대한 것으로 요약될 수 있다: 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 비만, 글루카곤증, 기도의 분비 장애, 대사 장애, 관절염, 골다공증, 중추 신경계 질환, 재협착증, 신경변성 질환, 신부전, 울혈성 심부전, 신증후군, 경화증, 폐 부종, 고혈압, 음식물 섭취 감소가 바람직한 질환, 그외 본 명세서에 개시된 다양한 상태 및 장애. 따라서, 본 발명은 활성 성분으로서 식 (I)의 화합물을 포함하는 본원의 약학 조성물을 포함한다.
본 발명의 제형에서 활성 성분의 투여량은 변경될 수 있지만, 활성 성분의 양은 반드시 적정 투여량이 수득되는 양이다. 선택된 투여량은 원하는 치료 효과, 투여 경로 및 치료 기간에 의존되며, 정상적으로 담당 의사에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 본 발명의 활성을 위한 유효량은 1 x 10-7 내지 200 mg/kg/day이고, 바람직하기로는 1 x 10-4 내지 100 mg/kg/day이며, 이는 단회 투약 또는 다중 투약으로 분할하여 투여될 수 있다.
본 발명의 제형은 바람직하기로는 비경구로, 예컨대 근육내, 복막내, 정맥내, 피하 등으로 투여된다.
본 발명에 따른 비경구 투약 제제는 원하는 생체내 방출 프로파일이 이루어지는, 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 겔 또는 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매 또는 비히클의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유 및 옥수수유와 같은 식물성 오일, 젤라틴 및 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스테르가 있다. 이러한 투약 형태는 또한 보존제, 습윤제, 유화제, 분산제와 같은 보강제를 포함할 수 있다. 이는, 예컨대 세균 체류 필터를 통한 여과에 의해, 멸균제를 조성물에 혼합함으로써, 조성물에 방사능을 조사함으로써, 또는 조성물을 열처리함으로써 멸균화할 수 있다. 또한, 이는 사용 직전에 멸균수나 그외 주사용 멸균 매질에 용해시킬 수 있는 멸균된 고형 조성물의 형태로 제조될 수 있다.
펩티드의 합성
본 발명의 실시에 이용가능한 펩티드는 표준적인 고상 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있으며, 제조하였다. 예로, Stewart, J. M., et al., Solid Phase Synthesis(Pierce Chemical Co., 2d ed. 1984)를 참조한다.
하기 구현예는, 본 발명을 이롭게 실시할 수 있는 펩티드 제조에 이용될 수 있으며 이용한, 당업자들에게 잘 알려져 있는 합성 방법을 나타낸다. 또한, 당업자들에게 다른 방법들도 공지되어 있다. 구현예는 예시하기 위한 것일 뿐 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
Boc-βAla-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH 및 Boc-D-Asp(OcHex)를 Nova Biochem, San Diego, California에서 구입하였다. Boc-Aun-OH는 Bachem, King of Prussia, PA에서 구입하였다. Boc-Ava-OH 및 Boc-Ado-OH는 Chem-lmpex International, Wood Dale, IL에서 구입하였다. Boc-2Nal-OH는 Synthetech, Inc. Albany, OR에서 구입하였다.
본원에 사용된 다른 약어의 완전한 명칭은 다음과 같다: Boc는 t-부틸옥시카보닐을 의미하고, HF는 플루오르화수소를 의미하고, Fm은 포르밀을 의미하고, Xan은 크산틸을 의미하고, Bzl은 벤질을 의미하고, Tos는 토실을 의미하고, DNP는 2,4-디니트로페닐을 의미하고, DMF는 디메틸포름아미드를 의미하고, DCM은 디클로로메탄을 의미하고, HBTU는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우로늄 헥사플루오로포스페이트를 의미하고, DIEA는 디이소프로필에틸아민을 의미하고, HOAc는 아세트산을 의미하고, TFA는 트리플루오로아세트산을 의미하고, 2ClZ는 2-클로로벤질옥시카보닐을 의미하고, 2BrZ는 2-브로모벤질옥시카보닐을 의미하고, OcHex는 O-사이클로헥실을 의미하고, Fmoc는 9-플루오레닐메톡시카보닐을 의미하고, HOBt는 N-하이드록시벤조트리아졸을 의미하며, PAM 수지는 4-하이드록시메틸페닐아세트아미도메틸 수지를 의미하며; Tris는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄을 의미하며; Bis-Tris는 비스(2-하이드록시에틸)아미노-트리스(하이드록시메틸)메탄(즉, 2-비스(2-하이드록시에틸)아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올)을 의미한다. "할로" 또는 "할로겐"이란 용어는 플로오로, 클로로, 브로모 및 요오드를 포함한다.
특별히 한정하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자들이 보편적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 또한, 본 명세서에 참고로 인용된 모든 공보, 특허출원, 특허 및 기타 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
도 1은 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2를 약 1 mg으로 개에 1회 피하 투여한 후 수득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 각 경우에서, 펩티드는 약 1% (wt/vol) 펩티드를 포함하며 펩티드:Zn의 몰비가 약 1.5인 수성 아연 조성물로서 투여하였다. ■ 및 □는 본원에 개시된 바와 같이 NaOH로 pH를 조절한 조성물을 나타내며, ▲은 NaOH로 pH를 조절하지 않은 조성물이며; ●은 AcOH/AcO-로 완충화한 조성물이다.
도 2는 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2를 약 15 mg으로 개에 1회 피하 투여한 후 수득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 각 경우에서, 펩티드는 약 10% (wt/vol) 펩티드를 포함하며 펩티드:Zn의 몰비가 약 1.5인 수성 아연 조성물로서 투여하였다. ■ 및 □는 본원에 개시된 바와 같이 NaOH로 pH를 조절한 조성물을 나타내며, ▲은 NaOH로 pH를 조절하지 않은 조성물이며; ●은 AcOH/AcO-로 완충화한 조성물이다.
도 3은 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2를 약 1 mg으로 개에 1회 피하 투여한 후 수득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 각 경우에서, 펩티드는 다음과 같이 반고형 수성 아연 조성물로서 투여하였다: ●는 약 5% (wt/vol) 펩티드, 펩티드:Zn 몰비는 약 5.4:1이고, pH를 조절하지 않은 것이고; ○은 약 10% (wt/vol) 펩티드, 펩티드:Zn 몰비는 약 5.4:1이고, pH를 조절하지 않은 것이고; □는 약 10% (wt/vol) 펩티드, 펩티드:Zn 몰비는 약 5.4:1이고, NaOH로 pH 조절한 것이고; ■는 약 10% (wt/vol) 펩티드, 펩티드:Zn 몰비는 약 4:1이고, NaOH로 pH 조절한 것이다.
도 4는 본 발명의 특정 조성물 제조에 이용되는 다양한 기구를 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2를 약 1 mg으로 개에 1회 피하 투여한 후 수득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 펩티드는 약 2% (wt/vol) 농도로 펩티드를 포함하며 펩티드:Zn의 몰비가 약 1.5:1인 수성 아연 조성물로서 투여하였다.
도 6은 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2를 약 15 mg으로 개에 1회 피하 투여한 후 수득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 펩티드는 약 25% (wt/vol) 농도로 펩티드를 포함하며 펩티드:Zn의 몰비가 약 4:1인, 반고형의 아연 조성물로서 투여하였다.
도 7은 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2를 약 15 mg으로 개에 1회 피하 투여한 후 수 득한 혈장 프로파일(중앙값)이다. 펩티드는 약 23% (wt/vol) 농도로 펩티드를 포함하며 펩티드:Zn의 몰비가 약 1.5:1인, 반고형의 아연 조성물로서 투여하였다.
실시예
1
[Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2
[Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 구체적인 합성 방법은 국제 특허 공개공보 WO 00/34331(PCT/EP99/09660)에 개시되어 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 간략하게는, 상기 화합물은 Boc-화학적 고상 펩티드 합성을 가속화하도록 변형된 Applied Biosystems사(Foster City, CA)의 모델 430A 펩티드 합성기 상에서 합성하였다. Schnolzer 등의 Int. J. Peptide Protein Res., 90:180(1992)을 참조한다. 0.91 mmol/g의 치환을 가지는 4-메틸벤질하이드릴아민(MBHA) 수지(Peninsula, Beltmont, CA)가 사용되었다. Boc 아미노산으로는 Boc-Ala-OH, Boc-D-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Tyr(2BrZ)-OH, Boc-His(DNP)-OH, Boc-Val-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Lys(2ClZ)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Aib-OH, Boc-Glu(OcHex)-OH 및 Boc-Trp(Fm)-OH와 같은 측쇄 보호기를 가지는 아미노산(Bachem, CA, Torrance, CA; Nova Biochem., LaJolla, CA)이 사용되었다. 2 x 1분 동안 100% TFA로 처리하여 Boc기를 제거하였다. 4 ㎖의 DMF 중의 HBTU(2.0 mmol) 및 DIEA(1.0 ㎖)를 사 용하여 Boc 아미노산(2.5 mmol)을 미리 활성화시키고, 펩티드-수지 TFA 염의 사전 중화 없이 커플링시켰다. Boc-Aib-OH 잔기 및 다음 잔기인 Boc-Lys(2ClZ)-OH 및 Boc-His(DNP)-OH의 커플링에 소요된 시간은 2시간이었고, 이들을 제외한 나머지 잔기들에 대한 커플링 시간은 5분이었다.
펩티드 사슬 조립의 마지막 단계에서, 2 x 30분 동안 DMF 중의 20% 머켑토에탄올/10% DIEA 용액으로 수지를 처리하여, His 측쇄 상의 DNP기를 제거하였다. 그런 다음, 100% TFA로 2 x 2분 동안 처리하여 N-말단의 Boc기를 제거하였다. 10% DMF(1 x 1분) 중의 10% DIEA를 사용하여 펩티드-수지를 중화한 후, 15% 에타올아민/15% 물/70% DMF 용액으로 2 x 30분 동안 처리하여 Trp 측쇄 상의 포르밀기를 제거하였다. DMF 및 DCM을 사용하여 펩티드-수지를 세척하고 감압 하에서 건조하였다. 펩티드 수지를 0℃ 하에 1 ㎖의 아니솔 및 디티오트레이톨(24 mg)을 함유하는 10 ㎖ HF 중에서 75분간 교반하여 최종 절단(cleavage)을 수행하였다. 질소를 환류시켜 HF를 제거하였다. 에테르(6 x 10 ㎖)를 사용하여 잔류물을 세척하고, 4N HOAc(6 x 10 ㎖)를 사용하여 상기 잔류물을 추출하였다.
역상 VYDAC® C18 칼럼(Nest Group, Southborough, MA)을 사용하여 제조용 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 상에서 수계 추출물 내의 펩티드 혼합물을 정제하였다. 직선 농도 구배(105분동안 20% -> 50%로 B 용액)를 사용하여 10 ㎖/분의 유속으로 칼럼을 용리시켰다(A 용액 = 0.1%의 TFA를 함유하는 물; B 용액 = 0.1%의 TFA를 함유하는 아세토니트릴). 분획을 수집하여 분석용 HPLC 상에서 확인 하였다. 순수한 산물이 함유된 것을 모아 동결 건조하였다. 본 화합물의 합성 예로, 135 mg의 백색 고체가 수득되었다. 이는 분석용 HPLC 분석을 기준으로 순도가 98.6%이었다. 전기 분무 질량 분광계(MS(ES))S 분석에 의한 분자량은 3339.7였다(이는 계산 분자량인 3339.7 g과 일치한다).
실시예
2
제형화 공정I
재료,
스톡
용액, 계산
A) 재료: ZnCl2, NaOH 펠렛과 염산 35%은 Panreac Quimica, Barcelona, Spain에서 구입하였다. WFI(sterile water for injection/irrigation)은 B. Braun Medical, Barcelona, Spain에서 구입하였다.
B)
스톡
용액
(i)
ZnCl
2
,
pH
=3:
1. 교반하면서 35% HCl을 WFI에 넣어 pH=3으로 조절한다.
2. 용량 측정 플라스크에, 칭량한 ZnCl2을 옮긴다. 교반하면서 pH=3 HCl을 투입하여, 최종 농도를 약 1-4 mg ZnCl2/㎖로 만든다.
(
ii
)
ZnCl
2
,
pH
=2:
1. 교반하면서 35% HCl을 WFI에 넣어 pH=2로 조절한다.
2. 용량 측정 플라스크에, 칭량한 ZnCl2을 옮긴다. 교반하면서 pH=2 HCl을 투입하여, 최종 농도를 약 4-12 mg ZnCl2/㎖로 만든다.
(
iii
)
NaOH
, 0.1 - 10
mg
/
㎖
:
1. 용량 측정 플라스크에, 칭량한 NaOH를 옮긴다. 교반하면서 WFII를 최종 농도 약 0.1-10 mg NaOH/㎖로 첨가한다.
(
iv
) 냉동-
건조시킨
20
mg
의
분주물
[
Aib
8
,35
]HGLP-1(7-36)NH
2
/
바이얼
:
1. 0.04% (v/v)의 초산 희석물과 WFI을 준비한다.
2. 용량 측정 플라스크에, 칭량한 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2(아세테이트 염)을 넣는다. 교반하면서 0.04% 초산을 최종 농도 20 mg [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2/㎖이 되도록 첨가한다. 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과 멸균한 다음, 용액 1 ㎖을 동결건조 바이얼에 넣어 냉동 건조한 다음 건조 산물을 -22℃에 저장하였다.
(v) 냉동-건조한 50
mg
의
분주물
[
Aib
8
,35
]HGLP-1(7-36)NH
2
/
바이얼
:
1. 0.1% (v/v)의 초산 희석물과 WFI을 준비한다.
2. 용량 측정 플라스크에, 칭량한 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2(아세테이트 염)을 넣는다. 교반하면서 0.1% 초산을 최종 농도 50 mg [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2/㎖이 되도록 첨가한다. 여과 멸균한 다음, 용액 1 ㎖을 동결건조 바이얼에 넣어 냉동 건조시킨다.
C) 계산
(i) 조성물에서 부형제(E)의 총 중량/부피는 하기 식으로 결정한다:
E = (A x 100/T) - (A/P)
상기에서,
E = mg의 부형제
A = 순수 펩티드의 양(mg);
T = 조성물의 목표 농도; 예, 목표가 2%이면 2; 및
P = 순수 펩티드의 농도(mg 펩티드/100 mg 제형)
부형제의 총 부피에서, 1 ㎖ = 1 g으로 가정한다.
(ii) 조성물 용액의 각 ㎖ 또는 g에 첨가되는 ZnCl2의 부피/중량(W)을 결정하기 위하여:
a) pH 조절 하지 않은 조성물의 경우 W=100% E;
b) 펩티드가 약 1%, 약 2% 또는 약 최대 10%이며 염기로 pH를 조절한 액체 제형인 경우 W=80% E;
c) 펩티드가 약 1%, 약 2% 또는 약 최대 10%이며 염기로 pH를 조절한 반고형 또는 젤 제형인 경우 W=50% E;
d) 펩티드가 약 25%이며 염기로 pH를 조절한 반고형 또는 젤 제형인 경우 W=66.66% E;
e) 동결-건조된 제제로부터 펩티드가 재구성되며 염기로 pH가 조절된 제형의 경우 W=90% E.
(iii) 조성물 용액의 각 ㎖ 또는 g에 첨가되는 NaOH의 부피/중량(W)을 결정하기 위하여:
a) 펩티드가 약 1%, 약 2% 또는 약 최대 10%이며 염기로 pH를 조절한 제형인 경우 W=20% E;
b) 펩티드가 약 1%, 약 2% 또는 약 최대 10%이며 염기로 pH를 조절한 반고형 또는 젤 제형인 경우 W=50% E;
c) 펩티드가 약 25%이며 염기로 pH를 조절한 반고형 또는 젤 제형인 경우 W=33.33% E;
d) 동결-건조된 제제로부터 펩티드가 재구성되며 염기로 pH가 조절된 제형의 경우 W=10% E.
(iv). 각 조성물에 사용되는 ZnCl2의 농도(mg/㎖ 또는 mg/g)을 결정하기 위하여:
[ZnCl2] = (136.29 X A)/(W x 3339.76 x R)
상기에서,
A = 순수 펩티드의 양(mg).
R = 펩티드/Zn의 몰비
R=1.5: 펩티드가 약 1%, 약 2% 또는 약 10%이거나, 또는 최대 약 23%인 제형;
R=4.0: 펩티드가 약 25%인 제형; 및
W = 조성물 용액의 각 ㎖ 또는 g에 첨가되는 ZnCl2의 중량(g) 또는 부피(㎖).
2.2 1-10% 동결-건조한 펩티드 및
ZnCl
2
가 함유된
pH
를 조절하지 않은 조성물의 제조
본원에서, 펩티드 백분율로 기재된 제형은 조성물의 총 중량 당 펩티드 중량의 제형이다. 예컨대 1% 펩티드는 총 조성물 100 g 당 펩티드 1 g을 포함하는 제형을 의미한다.
약 1%, 약 2%, 또는 최대 10% 펩티드를 포함하는 제형은 다음과 같이 제조하였다. 상기와 같이 제조한 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2의 냉동 건조한 샘플을 pH3의 ZnCl2 스톡 용액과 총 부형제 부피의 100%로 그리고 펩티드:Zn를 1.5:1로 완전하게 혼합하였다.
A) 1 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2 20 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl2 용액(0.272 mg/㎖; 상기 2.1 B (i) 참조) 2 ㎖과 혼합하여 제조한다.
B) 2 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2 20 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl2 용액(0.544 mg/㎖; 상기 2.1 B (i) 참조) 1 ㎖과 혼합하여 제조한다.
C) 10 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2 50 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl2 용액(3.023 mg/㎖; 상기 2.1 B (i) 참조) 0.45 ㎖과 혼합하여 제조한다.
냉동-건조한 펩티드와 용액은 실온으로 평형화하였다. 명시된 용량의 ZnCl2 용액을 상기 냉동 건조한 펩티드가 있는 바이얼에 주입하고, 1% 또는 2% 펩티드 조성물의 경우 약 2분간, 10% 펩티드 조성물의 경우 약 60분간, 또는 냉동-건조한 펩티드 모두가 전부 수화될때까지, 수화를 진행시켰고, 용액에는 펩티드 덩어리가 없었다. 수화를 실시한 후, 재구성된 펩티드는 약 1분간 교반하였다.
투여량으로, 용해시킨 펩티드를 적량 취하였으며, 예컨대 상기 A로서 제조된 1% 펩티드 100 ul은 1 mg 투여량과 동일하며, 상기 B로서 제조된 2% 펩티드 50 ul은 1 mg 투여량과 동일하며, 상기 C로서 제조된 10% 펩티드 150 ul은 15 mg 투여량과 동일하다.
본 발명의 내용으로, 당업자는 펩티드 및 ZnCl2의 양을 변경시켜 하기에 상세하게 나타낸 1%, 2% 및 10% 조성물 이외의 조성물 뿐만 아니라 원하는 투여량을 수득할 수 있다.
2.3 1-10% 동결-건조한 펩티드 및
ZnCl
2
가 함유된
pH
를 조절한 조성물의 제조
하기와 같이 약 1%, 약 2%, 또는 약 10% 펩티드를 포함하는 제형을 제조하였다. 기재된 바와 같이 제조한 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2의 냉동 건조한 샘플을 pH3의 ZnCl2 스톡 용액과 총 부형제 부피의 90%로 완전하게 혼합하였다. 상기 용액의 원하는 pH는 NaOH 희석액을 첨가하여 적정하였다.
A) 1 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2 20 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl2 용액(상기 2.1 B (i) 참조) 1.8 ㎖과 혼합하여 제조한다.
B) 2 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2 20 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl2 용액(상기 2.1 B (i) 참조) 0.9 ㎖과 혼합하여 제조한다.
C) 10 % 조성물은 냉동 건조한 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2 50 mg(상기 2.1 B (iv) 참조)을 ZnCl2 용액(상기 2.1 B (i) 참조) 0.40 ㎖과 혼합하여 제조한다.
상기 용액에, 필수량의 NaOH 희석 용액(부형제 총 부피의 10%)을 첨가하여, 목표 농도 및 pH를 만든다. 예컨대, 각각의 경우:
1% 조성물: 적절 농도의 NaOH 용액 0.2 ㎖ 첨가
2% 조성물: 적절 농도의 NaOH 용액 0.1 ㎖ 첨가
10% 조성물: 적절 농도의 NaOH 용액 0.05 ㎖ 첨가
본 발명의 내용으로, 당업자는 펩티드 및 ZnCl2의 양을 변경시켜 하기에 상 세하게 나타낸 1%, 2% 및 10% 조성물 이외의 조성물을 수득할 수 있다.
2.4 1-10% 동결-건조한 펩티드 및
ZnCl
2
가 함유된
pH
를 조절하지 않은 액체 조성물의 제조
약 1%, 또는 약 2%, 또는 최대 약 10% 펩티드를 포함하는 액체 제형을 하기와 같이 제조하였다. 샘플 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2을 칭량하여, pH3의 ZnCl2 스톡 용액과 혼합하여, 목표 농도 1%, 2%, 또는 최대 10%의 펩티드를 만들었다. 혼합한 후, 조성물을 여과 멸균하고, 사용전까지 저장하였다.
2.5 1-10% 동결-건조한 펩티드 및
ZnCl
2
가 함유된
pH
를 조절한 액체 조성물의 제조
약 1%, 또는 약 2%, 또는 최대 약 10% 펩티드를 포함하는 액체 제형을 하기와 같이 제조하였다. 샘플 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2을 칭량하여, pH3의 ZnCl2 스톡 용액과 총 부형제 부피의 80%로 완전하게 혼합하였다. 아연 용액은 ZnCl2 또는 ZnAc2.2H20일 수 있다. 용액의 원하는 pH는 NaOH 희석 용액을 첨가하여 적정하였다. 제제 C5 내지 C13은 이러한 방법으로 제조하였다.
본 발명의 내용으로, 당업자는 펩티드 및 ZnCl2의 양을 변경시켜 본원에 나타낸 1%, 2% 및 10% 조성물 이외의 조성물을 수득할 수 있다.
2.6 25% 펩티드 및
ZnCl
2
가 함유된
pH
를 조절하지 않은
반고형
/젤 조성물의 제조
약 25% 펩티드를 포함하는 반고형 또는 젤 제형을 하기와 같이 제조하였다. 샘플 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2을 칭량하여, pH2의 ZnCl2 스톡 용액과 총 부형제 부피의 66.66%로 완전하게 혼합하였다. 아연 용액은 ZnCl2 또는 ZnAc2·2H20일 수 있다. 제제 C1 및 C2를 이 방법으로 제조하였다.
보다 상세하게는, 반고형 또는 젤 조성물은 "푸시-풀(push- pull)" 혼합 방법으로 제조하였다:
a) 원하는 양의 펩티드를 특수 2원식 핸드 밸브 HV(I. D. =0.5 mm)가 미리 장착된 일회용 시린지 S1 통에 측정하여 넣고, 시린지 Luer 홀 내부에 관을 설치한다;
b) 시린지 플런지를 스테인레스 스틸 로드 SR로 고정한다;
c) S1에서 HV를 진공원과 연결시키고, HV를 연다. 10분 후에 HV를 닫는다;
d) 아연 용액을 두번째 일회용 시린지 S2에 정확하게 측정하여 넣는다;
e) S2를 HV의 연결되지 않은 부분과 연결한다;
f) HV를 열고, 진공으로 펩티드 분말이 있는 통 S1으로 용매가 들어가게 한다;
g) HV를 닫고, 용매 시린지 S2를 제거하여, 따라서 S1내 펩티드 분말을 수화시킨다;
h) SR을 제거하여 시린저 플런지를 자유롭게 한다;
i) HV를 열지 않고 시린지 플런지를 이동(밀고 당김)시켜, 분말이 용매으로 완전히 젖게 한다;
j) 시린지 Luer 홀 내부에 관이 있는 2원식 스테인레스 연결기 SC(I.D.=1.0 mm)를 시린지 S에 장착시키고, 그 플런지를 끝쪽으로 민다;
k) S1에서 HV를 열어 진공을 가한 다음 HV를 제거한다. 시린지 플런지를 밀어 시린지 통내 공기를 최소화시킨다; 및
l) S1 및 S2를 SC에 의해 연결시키고, 조성물을 S1에서 S2로 SC를 통해 혼합한다.
본 발명의 내용으로, 당업자는 펩티드 및 ZnCl2의 양을 변경시켜 본원에 나타낸 25% 조성물 이외의 조성물을 수득할 수 있다.
2.7 25% 펩티드 및
ZnCl
2
가 함유된
pH
를 조절한
반고형
/젤 조성물의 제조
약 25% 펩티드를 포함하는 반고형 또는 젤 제형을 하기와 같이 제조하였다. 샘플 [Aib8 ,35]HGLP-1(7-36)NH2을 칭량하여, pH2의 ZnCl2 스톡 용액과 총 부형제 부피의 66.66%로 완전하게 혼합하였다. 아연 용액은 ZnCl2 또는 ZnAc2·2H20일 수 있다. 용액의 원하는 pH는 NaOH 희석 용액을 첨가하여 적정한다. 본 실시예에서, 분말에 첨가되는 액체의 총 부피는 아연 및 NaOH 용액으로 분할되어야 한다. 따라서, 아연 용액의 농도를 조절하여, 필요한 아연 용액의 총 부피를 펩티드 분말에 첨가된 총 액체 부피의 50%로 감소시켰다(단계 d). 펩티드 분말에 첨가되는 총 액체 부피의 나머지 50%를 하기와 같이 NaOh 용액으로서 첨가하였다. 제제 C3 및 C4를 본 방법으로 제조하였다.
pH 조절한 반고형 또는 젤 조성물을 "푸쉬-풀" 혼합 방법으로 제조하였다:
a) 원하는 양의 펩티드를 특수 2원식 핸드 밸브 HV(I. D. =0.5 mm)가 미리 장착된 일회용 시린지 S1 통에 측정하여 넣고, 시린지 Luer 홀 내부에 관을 설치한다;
b) 시린지 플런지를 스테인레스 스틸 로드 SR로 고정한다;
c) S1에서 HV를 진공원과 연결시키고, HV를 연다. 10분 후에 HV를 닫는다;
d) 아연 용액을 두번째 일회용 시린지 S2에 정확하게 측정하여 넣는다;
e) S2를 HV의 연결되지 않은 부분과 연결한다;
f) HV를 열고, 진공으로 펩티드 분말이 있는 통 S1으로 용매가 들어가게 한다;
g) HV를 닫고, 용매 시린지 S2를 제거하여, 따라서 S1내 펩티드 분말 수화시킨다;
h) SR를 제거하여 시린저 플런지를 자유롭게 한다;
i) HV를 열지 않고 시린지 플런지를 이동(밀고 당김)시켜, 분말이 용매로 완전히 젖게 한다;
j) 시린지 Luer 홀 내부에 관이 있는 2원식 스테인레스 연결기 SC(I.D.=1.0 mm)를 시린지 S에 장착시키고, 그 플런지를 끝쪽으로 민다;
k) S1에서 HV를 열어 진공을 가한 다음 HV를 제거한다. 시린지 플런지를 움직여 시린지 통내 공기를 최소화시킨다;
l) S1 및 S2를 SC에 의해 연결시키고, 조성물을 S1에서 S2로 SC를 통해 혼합 한다;
m) 균질화(homogenization)를 수행한 후, 혼성 산물의 분액을 취하여 펩티드 농도를 결정한다;
n) 나머지 중간 벌크 산물을 정확하게 칭량하고, 원하는 pH를 적정하는데 필요한 NaOH 용액의 양을 계산한다;
o) NaOH 용액을 정확하게 측정하여 세번째 일회용 시린지 S3에 넣는다; 및
p) 시린지 플런지를 천천히 압축하여 시린지 챔버내 공기를 최소화한다. 시린지 둘다를 SC로 연결시키고, 조성물을 SC를 통해 혼합한다.
본 발명의 내용으로, 당업자는 펩티드 및 ZnCl2의 양을 변경시켜 본원에 나타낸 25% 조성물 이외의 조성물을 수득할 수 있다.
표 1
| 실시예 | *펩티드 % | 용액 | **펩티드:아연 비 | 펩티드 투여량 | |
| C1 | 10 | ZnCl2 0.846 mg/ml | 5.4:1 | 1 mg | |
| C2 | 5 | 0.40 mg ZnCl2/ml | 5.4:1 | 1 mg | |
| C3 | 10 | 50% ZnCl2 1.69 mg/ml, 50% NaOH 1 mg/ml | 5.4:1 | 1 mg | |
| C4 | 10 | 50% ZnCl2 2.28 mg/ml, 50% NaOH 1 mg/ml | 4:1 | 1 mg | |
| C5 | 5 | 80% ZnCl2 0.674 mg/ml, 20% NaOH 3.81 mg/ml | 4:1 | 1 mg | |
| C6 | 2 | 80% ZnCl2 0.26 mg/ml, 20% NaOH 2.15 mg/ml | 5.4:1 | 1 mg | |
| C7 | 10 | 80% ZnCl2 3.81 mg/ml, 20% NaOH 4.47 mg/ml | 1.5:1 | 1 mg | |
| C8 | 10 | 80% ZnAc2.2H20 2.3 mg/ml, 20% NaOH 6.1 mg/ml | 4:1 | 1 mg | |
| C9 | 2 | 80% ZnCl2 0.695 mg/ml, 20% NaOH 1.75 mg/ml | 1.5:1 | 1 mg | |
| C10 | 2 | 80% ZnAc2.2H20 1.12 mg/ml, 20% NaOH 1.44 mg/ml | 1.5:1 | 1 mg | |
| C11 | 2 | 80% ZnCl2 0.695 mg/ml, 20% NaOH 1.75 mg/ml | 1.5:1 | 1 mg | |
| C12 | 1 | 80% ZnCl2 0.384 mg/ml, 20% NaOH 0.875 mg/ml | 1.5:1 | 1 mg | |
| C13 | 10 | 80% ZnCl2 3.85 mg/ml, 20% NaOH 4.47 mg/ml | 1.5:1 | 15 mg | |
*: 목표 값을 나타낸다. 실제 값은 모든 경우에서 목표의 5% 내외이다.
**: 목표 값을 나타낸다. 실제 값은 모든 경우에서 목표의 10% 내외이다.
3.0
GLP
-1
리셉터의
친화성 결정
본 발명의 실시에 사용가능한 화합물을 하기 방법으로 GLP-1 리셉터에 결합하는 능력에 대해 테스트할 수 있다.
세포 배양:
GLP-1 리셉터를 발현하는 RIN 5F 랫 인슐리노마 세포(ATCC-# CRL-2058, American Type Culture Collection, Manassas, VA)를 10% 소 태아 혈청이 첨가된 둘베코의 변형된 이글스 배지(DMEM)에서 배양하였고, 약 37 ℃의 습윤한 5% CO2/95% 공기하에서 유지시켰다.
방사능
표지된
리간드(Radioligand)에
대한 결합성:
빙냉한 50 mM Tris-HCl 20 ㎖ 중에 RNI 세포를 Brinkman Polytron (Westbury, NY)(6으로 설정, 15초)으로 균질화하여, 방사능 표지된 리간드에 대한 결합성 연구를 위한 막을 준비하였다. 균질물은 원심분리(39,000 g / 10 min)에 의해 2번 세척하고, 최종 펠렛을 2.5 mM MgCl2, 0.1 mg/㎖ 박시트라신(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 및 0.1% BSA가 함유된 50 mM Tris-HCl에 재현탁하였다. 분석을 위해, 분주물(0.4 ㎖)을 0.05 nM (125I)GLP-1(7-36)(-2200 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA)과, 비표지된 경쟁 테스트용 펩티드 0.05 ㎖이 첨가 및 무첨가한 상태로 인큐베이션하였다. 100분간 인큐베이션(25 ℃)한 다음, 결합된 (125I)GLP-1(7-36)은 미리 0.5% 폴리에틸렌이민으로 젖셔 둔 GF/C 필터(Brandel, Gaithersburg, MD)로 신속하게 여과하여, 비결합물로부터 분리하였다. 이후, 필터를 빙냉한 50 mM Tris-HCl 5 ㎖로 3번 세정한 다음 필터에 포착된 결합된 방사능을 감마 측정기(Wallac LKB, Gaithersburg, MD)로 계측하였다. 특이적인 결합성은 (125I)GLP-1(7-36)의 총 결합에서 1000 nM GLP-1(7-36)(Bachem, Torrence, CA)의 존재하에서의 결합을 제한 것으로 정의되었다.
4. 가용성 대
pH
결정
4.1 완충 식염수
에서의
화합물의 가용성 대
pH
의 결정
본 발명의 실시에 유용하게 사용될 수 있는 화합물을 하기 방법으로 테스트하여 여러가지 pH 및 온도에서의 PBS 가용성을 결정할 수 있다.
프리-믹스 분말 한 묶음(SIGMA, Product No.: P-3813)을 탈이온수 1 L에 용해시켜, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl이 함유된 pH 7.4의 10 mM 포스페이트 완충염수를 제조함으로써, PBS 스톡 완충액을 제조하였다. 이 스톡 용액의 pH를 인산 및/또는 수산화나트륨으로 조절하여, 다양한 pH의 PBS 완충액을 제조할 수 있다.
테스트할 화합물 2 mg, 예컨대 실시예 1의 화합물 2 mg을 측정하여 유리 바이얼에 넣었다. 각 바이얼에 특정 pH의 PBS 완충액 50 ㎕을 첨가하였다. 이 용액을 혼합하고, 필요에 따라 맑아질때까지 초음파처리한다. 테스트하는 각 pH에서, 화합물 2 mg을 용해시키는데 필요한 완충액의 총 부피를 기록하였고, 가용성을 계 산하였다.
실온(20-25 ℃)에서 맑은 펩티드 용액을 밤새 냉장고(4 ℃)에 두었고, 이후 4 ℃에서의 가용성을 평가하였다.
4.2 염수에서의 화합물의 가용성 대
pH
결정
본 발명의 실시에 유용하게 사용될 수 있는 화합물을 하기 방법으로 테스트하여 여러가지 pH 및 온도에서의 PBS 가용성을 결정할 수 있다.
탈이온수 1 L에 NaCL 9 g을 용해시켜, 스톡 식염수를 제조한다. 이 스톡 용액의 pH를 HCl 및/또는 NaOH로 조절하여, 다양한 pH의 식염수를 제조한다.
테스트할 화합물 2 mg, 예컨대 실시예 1의 화합물 2 mg을 측정하여 유리 바이얼에 넣었다. 각 바이얼에 특정 pH의 식염수 50 ㎕을 첨가하였다. 이 용액을 혼합하고, 필요에 따라 맑아질때까지 초음파처리한다. 테스트하는 각 pH에서, 화합물 2 mg을 용해시키는데 필요한 식염수의 총 부피를 기록하였고, 가용성을 계산하였다.
실온(20-25 ℃)에서 맑은 펩티드 용액을 밤새 냉장고(4 ℃)에 두었고, 이후 4 ℃에서의 가용성을 평가하였다.
4.3
pH
7.0의 염수에서의 화합물의 가용성 결정
본 발명의 실시에 유용하게 사용될 수 있는 화합물을 하기 방법으로 테스트하여 실온에서의 다양한 pH를 갖는 식염수에 대한 가용성을 결정할 수 있다.
탈이온수 1 L에 NaCL 9 g을 용해시켜, 스톡 식염수를 제조한다. 테스트할 화합물 2 mg, 예컨대 실시예 1의 화합물을 측정하여 유리 바이얼에 넣고, 염수 1 ㎖을 첨가하여 혼합하고 맑아질때까지 초음파처리한다. 화합물 2 mg을 용해시키는데 필요한 염수의 총 부피를 기록하였고, 가용성을 계산한다.
4.4 다양한
pH
의 염수에 대한 화합물의 가용성 결정
본 발명의 실시에 유용하게 사용될 수 있는 화합물을 하기 방법으로 테스트하여 실온에서의 다양한 pH의 식염수에 대한 가용성을 결정할 수 있다.
탈이온수 1 L에 NaCL 9 g을 용해시켜, 스톡 식염수를 제조한다. 이 스톡 용액의 분획에 HCl 및 NaOH를 처리하여, 다양한 pH의 식염수를 제조한다.
테스트할 화합물 2 mg, 예컨대 실시예 1의 화합물을 측정하여 유리 바이얼에 넣는다. 특정 pH의 염수 완충액 50 ㎕을 첨가한다. 이 용액을 혼합하고 맑아질때까지 초음파처리한다. 화합물 2 mg을 용해시키는데 필요한 완충액의 총 부피를 기록하였고, 가용성을 계산한다.
5. 화합물의 가용성 대 아연 농도 결정
본 발명의 실시에 유용하게 사용될 수 있는 화합물을 하기 방법으로 테스트하여 다양한 아연 농도에서의 pH 7의 물에서의 가용성을 결정할 수 있다.
탈이온수에 ZnCl2를 100 mg/㎖ 농도로 용해시키고, HCl로 pH를 2.7로 조절하여, 아연 스톡 용액을 제조한다. 이 스톡 용액의 적절하게 희석하여, ZnCl2 농도가 다양한 용액("Zn 테스트 용액")을 제조한다.
테스트할 화합물 1 mg, 예컨대 실시예 1의 화합물 1 mg을 각각의 Zn 테스트 용액 250 ㎕에 용해시켜, 화합물 4 mg/㎖이 포함된 용액을 만든다. 그런 후, 이 용액에 백색 침전물 형성이 관찰될때까지 0.2 N NaOH를 이용하여 pH를 조절한다. 침전된 용액은 원심분리하였고, HPLC를 이용하여 모 용액(mother liquor)을 분석하였다. 테스트 화합물 피크의 UV 흡광 면적을 계산하고, 상기 모 용액에서의 테스트 화합물의 농도를 보정 곡선(calibration curve)과 비교하여 결정한다.
본 발명의 실시에 이용될 수 있는 대표적인 화합물로서, 실시예 1의 화합물을 상기 분석 방법으로 조사하여, 다음과 같은 결과를 수득하였다(수성 염수, pH 7.0, 실온):
표 2
| ZnCl2 농도(㎍/㎖) | 수용성(mg/㎖) |
| 0 | 5.788 |
| 80 | 0.0770 |
| 500 | 0.0579 |
| 1000 | 0.0487 |
| 1500 | 0.0668 |
| 2500 | 0.1131 |
6.
IEF
겔을
이용한
pI
결정
인비트로겐사의 Novex IEF pH3-10 겔을 이용하여, GLP-1 펩티드의 pI를 측정할 수 있다. 테스트할 펩티드 화합물을 0.5 mg/㎖ 농도로 물에 용해시킨다. 각 화합물에서, 제조되는 용액 5 ㎕을 Novex® 샘플 완충액 2X(20 mM 아르기닌 프리 염기, 20 mM 라이신 프리 염기 및 15% 글리세롤로 구성됨) 5 ㎕과 혼합하고, 제조되는 10 ㎕의 샘플 용액을 겔에 단백질 표준 샘플과 함께 로딩한다.
전개 완충액 또한 인비트로겐사에서 구입하였고, 제조사의 설명서에 따라 일반적으로 하기와 같이 겔을 전개시켰다: 1시간 동안 100 V로 일정하게 한 다음 1시 간 동안 200 V를 유지하고, 다시 30분 동안 500 V로 유지.
이후, 겔은 3.5% 설포살리사이클산이 함유된 12% TCA에 30분간 고정한 다음, Novex® 콜로이달 블루 키트에 있는 설명서에 따라 콜로이달 코마시 블루로 2시간 동안 염색한 다음, 밤새 물로 탈염색하였다.
겔을 스캐닝하여 단편 분석 1.2 프로그램으로 분석하였다. 알지 못하는 펩티드들의 pI를 pI 값이 10.7, 9.5, 8.3, 8.0, 7.8, 7.4, 6.9, 6.0, 5.3, 5.2, 4.5, 4.2 및 3.5인 표준 화합물의 pI와 비교하여 계산하였다.
7.
랫에서의
생체내
분석
본 발명의 화합물은 하기 분석 방법으로 생체내 효과를 촉진 및 강화시키는 능력을 결정하기 위해 테스트할 수 있다.
7.1 실험 과정:
실험하기 전날에, 체중 약 300-35O g의 Sprague-Dawley 수컷 성체 랫(Taconic, Germantown, NY)에, 클로로하이드레이트로 마취한 상태에서 우측 심방 경정맥에 캐뉼러를 이식하였다. 이후, 랫은 적절한 테스트 화합물 또는 비히클 대조군을 시간 0에서 주사하기 전에 18시간 동안 절식시켰다. 랫은 전체 실험을 수행하는 동안 계속적으로 절식시켰다.
pH 2.7의 HCl 수용액 중의 ZnCl2 100 mg/㎖ 용액을 물로 희석하여, 0.5 mg/㎖의 ZnCl2 용액을 제조하였다. 이 용액의 250 ㎕에 식 (I)의 화합물 [Aib8,35]hGLP- 1(7-36)NH2) 1 mg을 용해시켜, 상기 화합물의 농도가 4 mg/㎖이고 아연이 0.5 mg/㎖인 pH 4의 맑은 용액을 수득하였다.
시간 0에, 랫에 (a) 상기 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2) 용액 또는 비히클 대조군을 피하(sc) 주사하였다. 둘 다, 주사 부피는 최소량(4-6 ㎕)이며, 개체에 투여되는 GLP-1 화합물의 투여량은 75 ㎍/kg이었다. sc 주사한 후 적당한 시간에, 혈액 500 ㎕을 정맥내(iv) 캐뉼러를 통해 취하고, 랫에 인슐린 분비 강화 발생을 테스트하기 위하여 iv로 글루코스를 주입하였다. 글루코스를 주입한 시간은 화합물 주사 후 0.25, 1, 6, 12 및 24시간 이후이다. 최초 혈액 샘플을 취한 후, 글루코스(1 g/kg)를 정맥내로 주사하고, 500 ㎕의 헤파린 처리한 염수(10 U/㎖)를 흘려주었다(flushed). 그 후, 혈액 샘플 500 ㎕을 글루코스 주사 후 2.5, 5, 10 및 20분 후에 채혈하였다. 이들 각각 이후에, 바로 캐뉼러를 통해 500 ㎕의 헤파린 처리한 염수(10 U/㎖)를 iv 주사하였다. 혈액 샘플은 원심분리하여, 각 샘플에서 혈장을 채집하고, 인슐린 함량에 대해 분석하기 전까지 샘플을 -2O ℃에 보관하였다. 각 샘플에서의 인슐린 함량은 랫의 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 키트(American Laboratory Products Co., Windham, NH)을 이용하여 결정하였다.
7.1.1. 결과:
장기간의 인슐린-강화 활성은 전체 24시간의 실험을 수행하는 동안 글루코스 주사에 의해 유도가능한 것으로 관찰되었다.
8. 개에서의
생체내
분석
활성 화합물의 생체내에서의 장기 분비를 촉진시키는 조성물의 능력을 결정하기 위하여, 당업자가 실시할 수 있는 당업계에 공지된 생체내 분석 방법은 다수개 있다.
8.1 1% 펩티드 조성물:
예로, 식 (I)의 화합물 1% (w/w)를 ZnCl2 완충액(펩티드:Zn 비는 1.5:1.0임)을 포함하는 테스트 수성 제형을 준비하였다.
42-78개월 되었으며 체중이 14-21 kg인 6마리의 수컷 비글종의 개를 자유롭게 물에 접근가능하게 두었으며 하루에 한번 식사(표준적인 건조 음식물(SAFE 125) 약 400 g)를 제공하였다. 개는 테스트 조성물을 투여하기 전에 18시간 동안 절식시켰다.
테스트 화합물은 견갑골 사이 영역에 피하 경로로 투여하였다. 투여 용량(동물 1 마리당 약 20 ㎕)은 0.33-12 mm (BS=30M2913)가 장착된 0.3 ㎖의 Terumo 시린지로 투여하였다. 즉, 이론적인 투여량으로 약 0.2 mg의 펩티드를 사용하였다.
투여한 후 혈액 샘플을 약 0, 8, 15, 30 및 45분, 1, 2, 4, 8 및 12시간, 및 1, 2, 3, 4, 5 및 6일 후에 주기적으로 채혈하였다. 혈액은 원심분리할 때까지 샘플링한 후 신속하게 냉각시키고, 혈장을 이동시켜 급속 동결 펜딩 분석을 수행하였다. 펩티드 혈장 농도는, 오프라인의 고상 추출, LC-MS/MS와 커플링된 온-라인 상 추출 이후에 결정하였고, 수득되는 데이타는 Analyst v1.2 소프트웨어로 관리하였 다.
조성물은 적어도 2일 동안 활성 펩티드를 장기 방출하는 것으로 확인되었다.
8.2 1% [
Aib
8
,35
]
hGLP
-1(7-36)NH
2
) 용액:
상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하여, 장기간동안 대상 펩티드를 방출시키는 능력에 대해 하기 조성물을 조사하였다. 하기 4개의 조성물 각각에서, 펩티드 농도는 약 1%(wt/wt)이고, 펩티드 대 아연의 비는 약 1.5:1이고, 투여되는 펩티드의 투여량은 약 1 mg이다.
용액 8.2.A: (i) 90% ZnCl2(0.298 mg/㎖) 및 (ii) 10% NaOH(0.975 mg/㎖)를 포함하는 용액 중의 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2
용액 8.2.B: ZnCl2(0.286 mg/㎖) 용액 중의 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2
용액 8.2.C: 용액 8.2. B와 실질적으로 유사하며, AcOH/AcO-로 완충화됨
용액 8.2. D: 용액 8.2.A와 실질적으로 유사함.
도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 조성물들은 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 장기간의 방출을 보였다.
8.3. 1% [
Aib
8
,35
]
hGLP
-1(7-36)NH
2
용액:
상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하 여, 장기간동안 대상 펩티드를 방출시키는 능력에 대해 하기 조성물을 조사하였다. 하기 조성물에서, 펩티드 농도는 약 2%(wt/wt)이고, 펩티드 대 아연의 비는 약 1.5:1이고, 투여되는 펩티드의 투여량은 약 1 mg이다.
용액 8.3.: (i) 80% ZnCl2(0.695 mg/㎖) 및 (ii) 20% NaOH(1.78 mg/㎖)를 포함하는 용액 중의 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2
도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 조성물은 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 장기간의 방출을 보였다.
8.4. 10% 펩티드 용액:
상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하여, 장기간동안 대상 펩티드를 방출시키는 능력에 대해 하기 조성물을 조사하였다. 하기 4개의 조성물 각각에서, 펩티드 농도는 약 10%(wt/wt)이고, 펩티드 대 아연의 비는 약 1.5:1이고, 투여되는 펩티드의 투여량은 약 15 mg이다.
용액 8.4.A: (i) 90% ZnCl2(3.367 mg/㎖) 및 (ii) 10% NaOH(5.01 mg/㎖)를 포함하는 용액 중의 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2
용액 8.4.B: ZnCl2(2.993 mg/㎖) 용액 중의 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2
용액 8.4.C: 용액 8.4.B와 실질적으로 유사하며, AcOH/AcO-로 완충화됨
용액 8.4. D: 용액 8.4.A와 실질적으로 유사함.
도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 조성물들은 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 장기간의 방출을 보였다.
8.5.
반고형
조성물:
상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하여, 장기간동안 대상 펩티드를 방출시키는 능력에 대해 하기 반고형 조성물을 조사하였다. 조성물 8.5.A.의 펩티드 농도는 약 5%이지만, 조성물 8.5.B., 8.5.C. 및 8.5.D.의 펩티드 농도는 약 10%(wt/wt)이다. 8.5.A., 8.5.B. 및 8.5.C. 조성물에서 펩티드 대 아연의 비는 약 5.4:1이고, 8.5.D. 조성물에서의 비는 약 4.0:1이다. 4개의 조성물 모두, 투여되는 펩티드의 투여량은 약 1 mg이다.
조성물 8.5.A: WFI 중에 ZnCl2(0.40 mg/㎖)를 포함하는 용액 중의 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2
조성물 8.5.B: 실질적으로 조성물 8.5.A.와 동일하며, ZnCl2의 농도는 펩티드 대 아연의 비를 약 5.4:1로 유지시키기 위해 상향 조절되었음.
조성물 8.5.C: (i) 50% ZnCl2(1.69 mg/㎖) 및 (ii) 50% NaOH(1 mg/㎖)를 포함하는 반고형 형태의 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2
조성물 8.5. D: (i) 50% ZnCl2(2.28 mg/㎖) 및 (ii) 50% NaOH(1 mg/㎖)를 포 함하는 반고형 형태의 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2
도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 조성물들은 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 장기간의 방출을 보였다.
8.6.
반고형
조성물:
상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하여, 장기간동안 대상 펩티드를 방출시키는 능력에 대해 하기 반고형 조성물을 조사하였다. 조성물은 pH 2.0의 5.22 mg/㎖ ZnCl2 용액을 이용하여 제형화하였다. 충분한 양의 펩티드를 사용하여, 펩티드:아연 비가 약 4:1인 25% 펩티드 반고형 조성물을 제조하였다. 상기 조성물의 pH를 10 mg/㎖의 NaOH를 이용하여 상기와 같이 조절하였다. 투여되는 펩티드의 투여량은 약 15 mg이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 8.6 조성물은 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 장기간의 방출을 보였다.
8.7.
반고형
조성물:
상기 섹션 8.1에 나타낸 바와 실질적으로 동일한 생체내 분석 방법을 이용하여, 장기간동안 대상 펩티드를 방출시키는 능력에 대해 하기 반고형 조성물을 조사하였다. 조성물은 pH 2.0의 8.5 mg/㎖ ZnCl2 용액을 이용하여 제형화하였다. 충분한 양의 펩티드를 사용하여, 펩티드:아연 비가 약 1.51인 23% 펩티드 반고형 조성 물을 제조하였다. 조성물은 상기 섹션 2.6에 자세히 나타낸 방법에 따라 제형화하였다. 투여되는 펩티드의 투여량은 약 15 mg이다(이는 조성물 약 65 ㎕에 해당됨).
도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 8.7 조성물은 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 장기간의 방출을 보였다.
개시된 제형의 다양한 치환에 대한 추가적인 분석들이 생체내 분석으로 수행하였으며, 본 발명의 조성물들은 식 (I)의 화합물에 대한 유용한 약물 전달 플랫폼을 제공하는 것으로 확인되었다. 본 발명의 내용을 이용하여, 당업자는 펩티드와 ZnCl2의 양 및 pH를 변경하여, 본원에 개시된 바와 같이 본 발명의 조성물을 제조할 수 있다.
Claims (63)
- 식 (I): [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 유사체, 아연 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석을 포함하며,4 mg/㎖의 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2 및 0.5 mg/㎖의 ZnCl2이 존재하는 pH4의 맑은 ZnCl2 수용액으로 구성되지 않은, 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 아연은 0.0005 mg/㎖ 내지 50 mg/㎖의 농도로 존재되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 아연은 0.01 mg/㎖ 내지 0.50 mg/㎖의 농도로 존재되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 희석제는 약제학적으로 허용가능한 수용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 4항에 있어서, 상기 희석제는 멸균수 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 수성 혼합물, 현탁액 또는 용액을 포함하며, 상기 식 (I)의 화합물은 약 0.5% - 30% (w/w)의 농도로 존재되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 수성 혼합물, 현탁액 또는 용액내 상기 식 (I)의 화합물의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 또는 30% (w/w)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 7항에 있어서, 상기 수성 용액내 상기 식 (I)의 화합물의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 14%, 15%, 16%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 29%, 또는 30% (w/w)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 8항에 있어서, 상기 수성 용액내 상기 식 (I)의 화합물의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 9%, 10%, 11%, 22%, 23%, 24%, 25%, 또는 26% (w/w)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 9항에 있어서, 상기 수성 용액내 상기 식 (I)의 화합물의 농도는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 10%, 22%, 23%, 24%, 25%, 또는 26% (w/w)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 10항에 있어서, 상기 수성 용액내 상기 식 (I)의 화합물의 농도는 약 1%, 2%, 5%, 10%, 23% 또는 25% (w/w)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 약학 조성물내 상기 식 (I)의 화합물 대 아연의 몰 비는 약 6:1 내지 약 1:1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 12항에 있어서, 상기 몰 비는 약 5.5:1 내지 약 1:1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 13항에 있어서, 상기 몰비는 약 5.4:1 내지 약 1.5:1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 14항에 있어서, 상기 몰비는 약 5.4:1, 4.0:1 또는 1.5:1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 15항에 있어서, 상기 몰비는 약 1.5:1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 아연은 아연 클로라이드 또는 아연 아세테이트로 제공되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 아연 아세테이트는 ZnAc2.2H20로 제공되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 약학 조성물의 pH는 염기를 이용하여 조절되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 19항에 있어서, 상기 pH 조절은 NaOH를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 20항에 있어서, 상기 약학 조성물의 pH는 0.9% NaCl을 이용하여 초기 농도의 약 1/2로 희석하였을때 약 5.0 - 5.5의 pH가 되도록 NaOH로 조절되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 약학 조성물의 pH는 염기를 이용하여 조절되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 22항에 있어서, 상기 pH 조절은 NaOH를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 23항에 있어서, 상기 약학 조성물의 pH는 0.9% NaCl을 이용하여 초기 농도의 약 1/2로 희석하였을때 약 5.0 - 5.5의 pH가 되도록 NaOH로 조절되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 식 (I)의 화합물은 이를 필요로 하는 개체내에서 장기간동안 방출되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 25항에 있어서, 상기 화합물의 방출은 적어도 약 1시간 내지 약 12시간 동안 지속되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 26항에 있어서, 상기 화합물의 방출은 적어도 약 24시간 동안 지속되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 27항에 있어서, 상기 식 (I)의 화합물은 적어도 약 48시간, 더 바람직하기로는 적어도 약 72시간, 더욱 더 바람직하기로는 적어도 약 96시간 동안 방출되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 28항에 있어서, 상기 식 (I)의 화합물은 적어도 약 5 내지 약 7일간, 더 바람직하기로는 적어도 약 14일간, 더 바람직하기로는 적어도 약 2주간, 더욱 더 바람직하기로는 적어도 약 4주간 방출되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 식 (I)의 화합물은 이를 필요로 하는 개체내에서 장기간 방출되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 30항에 있어서, 상기 화합물의 방출은 적어도 약 1시간 내지 약 12시간 동안 지속되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 31항에 있어서, 상기 화합물의 방출은 적어도 약 24시간 동안 지속되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 32항에 있어서, 상기 식 (I)의 화합물은 적어도 약 48시간 동안, 더 바람직하기로는 적어도 약 72시간 동안, 더 더욱 바람직하기로는 적어도 약 96시간 동안 방출되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 33항에 있어서, 상기 식 (I)의 화합물은 개체내에서 적어도 약 5 내지 7일간, 더 바람직하기로는 적어도 약 14일간, 더 바람직하기로는 적어도 약 2주간, 더 더욱 바람직하기로는 적어도 약 4주간 방출되는 것을 특징으로 하는 약학 조성 물.
- 제 25항 내지 제 29항중 어느 한항에 있어서, 상기 개체는 포유류, 바람직하기로는 인간인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 30항 내지 제 34항중 어느 한항에 있어서, 상기 개체는 포유류, 바람직하기로는 인간인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- GLP-1 작용제 효과를 소거시키는 방법으로서,상기 방법은 GLP-1(7-36)NH2 리간드의 리셉터를 식 (I)에 따른 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하며;상기 식 (I)에 따른 화합물은 상기 리셉터에 제 1항에 따른 조성물을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 이를 필요로 하는 개체에게 제 1항에 따른 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 GLP-1 리셉터로부터 작용제 효과를 소거시키는 방법.
- 제 38항에 있어서, 상기 GLP-1(7-36)NH2 리간드의 리셉터는 동물 개체에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 39항에 있어서, 상기 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 40항에 있어서, 상기 인간 개체는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 비만, 식욕 과다, 불충분한 포만감, 대사성 장애로부터 선택되는 질환 또는 상태이거나 발병할 위험이 있는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 41항에 있어서, 상기 질환은 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 40항에 있어서, 상기 인간은 글루카곤증(glucagonomas), 기도의 분비 장애, 관절염, 골다공증, 중추신경 질환, 재협착증, 신경변성 질환, 신부전, 울혈성 심장부전, 신증후군, 경화증, 폐 부종, 고혈압 및 음식물 섭취 감소가 바람직한 질환, 중추 신경계 질환 또는 장애, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, ALS, 발작, ADD 및 신경 정신학적 증후군, 과민성 장 증후군, 심근경색, 발작, 급성 관상 증후군, 수술 후 이화 작용 변화, 휴면 심근(hibernating myocardium) 또는 당뇨병성 심근증, 뇨를 통한 나트륨 배출 부족, 뇨의 칼륨 농축 과다, 유해한 과다혈량과 관련있는 상태 또는 장애(예, 신부전, 울혈성 심장부전, 신증후군, 경화증, 폐 부종 및 고혈압), 다낭성 난소 증후군, 호흡 곤란, 신장병, 좌심실 수축 부전; 설사, 수술 후 덤핑 증후군 및 과민성 장 증후군과 같은 위장 장애; 중대질환에서의 다발성 신경병증(CIPN; critical illness polyneuropathy), 전신성 염증 반응 증후군(SIRS;systemic inflammatory response syndrome), 지질대사 이상, 허혈증에 따른 혈류 재관류로 인한 장기 조직 손상, 및 관상동맥 심질환의 위험인자(CHDRF; coronary heart disease risk factor) 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 상태를 앓고 있거나 앓을 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 따른 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 간 줄기/전구체 세포를 기능적인 췌장 세포로 변환시키는 방법, 베타 세포의 퇴화를 방지하는 방법, 베타 세포의 증식을 자극하는 단계, 노르에피네페린의 혈중 농도를 억제시키는 방법, 근수축 반응을 유도하는 방법, 심장 수축력을 증가시키는 방법, 비-소화기 경로를 통한 영양 공급을 개선시키는 방법, 내시경 시술을 수행하기 위해 개체를 전처리하는 방법 및 트리글리세라이드의 농도를 조절하는 방법.
- 제 44항에 있어서, 상기 개체는 포유류, 더 바람직하기로는 영장류, 더 더욱 바람직하기로는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- GLP-1 작용제 효과를 소거시키는 방법으로서,상기 방법은 GLP-1(7-36)NH2 리간드의 리셉터를 식 (I)에 따른 화합물과 접 촉시키는 단계를 포함하며,상기 식 (I)에 다른 화합물은 상기 리셉터에 제 6항에 따른 조성물을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 필요로 하는 개체에게 제 6항에 따른 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 GLP-1 리셉터로부터 작용제 효과를 소거시키는 방법.
- 제 47항에 있어서, 상기 GLP-1(7-36)NH2 리간드의 리셉터는 동물 개체에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 48항에 있어서, 상기 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 49항에 있어서, 상기 개체는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 비만, 식욕 과다, 불충분한 포만감, 및 대사성 장애로부터 선택되는 질환 또는 상태이거나 발병할 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 50항에 있어서, 상기 질환은 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 50항에 있어서, 상기 인간은 글루카곤증(glucagonomas), 기도의 분비 장애, 관절염, 골다공증, 중추신경 질환, 재협착증, 신경변성 질환, 신부전, 울혈성 심장부전, 신증후군, 경화증, 폐 부종, 고혈압 및 음식물 섭취 감소가 바람직한 질환, 중추 신경계 질환 또는 장애, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, ALS, 발작, ADD 및 신경 정신학적 증후군, 과민성 장 증후군, 심근경색, 발작, 급성 관상 증후군, 수술 후 이화 작용 변화, 휴면 심근(hibernating myocardium) 또는 당뇨병성 심근증, 뇨를 통한 나트륨 배출 부족, 뇨의 칼륨 농축 과다, 유해한 과다혈량과 관련있는 상태 또는 장애(예, 신부전, 울혈성 심장부전, 신증후군, 경화증, 폐 부종 및 고혈압), 다낭성 난소 증후군, 호흡 곤란, 신장병, 좌심실 수축 부전; 설사, 수술 후 덤핑 증후군 및 과민성 장 증후군과 같은 위장 장애; 중대질환에서의 다발성 신경병증(CIPN; critical illness polyneuropathy), 전신성 염증 반응 증후군(SIRS;systemic inflammatory response syndrome), 지질대사 이상, 허혈증에 따른 혈류 재관류로 인한 장기 조직 손상, 및 관상동맥 심질환의 위험인자(CHDRF; coronary heart disease risk factor) 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 상태를 앓고 있거나 앓을 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6항에 따른 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 간 줄기/전구체 세포를 기능적인 췌장 세포로 변환시키는 방법, 베타 세포의 퇴화를 방지하는 방법, 베타 세포의 증식을 자극하는 단계, 노르에피네페린의 혈중 농도를 억제시키는 방법, 근수축 반응을 유도하는 방법, 심장 수축력을 증가 시키는 방법, 비-소화기 경로를 통한 영양 공급을 개선시키는 방법, 내시경 시술을 수행하기 위해 개체를 전처리하는 방법 및 트리글리세라이드의 농도를 조절하는 방법.
- 제 53항에 있어서, 상기 개체는 포유류, 더 바람직하기로는 영장류, 더 더욱 바람직하기로는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 1%(중량/부피)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 16항에 있어서, 상기 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 2%(중량/부피)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 16항에 있어서, 상기 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 10%(중량/부피)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 16항에 있어서, 상기 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 25%(중량/부피)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 5%(중량/부피)이고, 상기 몰 비는 약 5.4:1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 5%(중량/부피)이고, 상기 몰 비는 약 4.0:1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 10%(중량/부피)이고, 상기 몰 비는 약 5.4:1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 10%(중량/부피)이고, 상기 몰 비는 약 4.0:1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 16항에 있어서, 상기 조성물내 [Aib8 ,35]hGLP-1(7-36)NH2의 농도는 약 23%(중량/부피)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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