KR20080005931A

KR20080005931A - 유전자 발현카세트 및 형질전환체, 및 이 형질전환체를사용하는 2-디옥시실로이노소스의 제조방법 및2-디옥시실로이노소스의 정제방법

Info

Publication number: KR20080005931A
Application number: KR1020077024620A
Authority: KR
Inventors: 마사미치 타카기; 타카히사 코구레; 나오키 와키사카; 히로아키 타카쿠; 카츠미 아지사카; 타츠오 미야자키; 마사오 히라야마
Original assignee: 니가타 바이오리서치 파크 가부시키가이샤
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2006-03-23
Publication date: 2008-01-15
Anticipated expiration: 2026-03-23
Also published as: DE602006019835D1; WO2006112000A1; US20100015672A1; BRPI0607623A2; US8758741B2; WO2006109479A1; JPWO2006109479A1; CN101151368A; CN101151368B; EP1865056A1; US20140256960A1; BRPI0607623B1; EP1865056A4; JP4598826B2; EP1865056B1; KR101019759B1

Abstract

숙주세포로서의 대장균에 2-디옥시실로이노소스의 합성에 관여하는 유전자로부터 이루어지는 유전자 발현카세트를 적어도 1종류 도입해서 형질전환체를 조제하고, 이 형질전환체를 사용해서, D-글루코오스, 올리고당, 다당, 녹말 또는 미강으로부터 2-디옥시실로이노소스를 합성한다. 이 2-디옥시실로이노소스를 함유하는 배양액을 수소 이온형 강산성 양이온교환수지와 유기산 이온형 염기성 음이온교환수지로 이루어지는 혼상식 또는 이상식 컬럼으로 처리한다. 이 정제된 2-디옥시실로이노소스를 트리메톡시메탄과 반응시켜, 2-디옥시실로이노소스디메틸케탈로 변환해서 결정화·정제한 후, 산의 존재하에서 가수분해하여 고도로 정제한다.

2-디옥시실로이노소스, 형질전환체, 양이온교환수지, 음이온교환수지

Description

유전자 발현카세트 및 형질전환체, 및 이 형질전환체를 사용하는 2-디옥시실로이노소스의 제조방법 및 2-디옥시실로이노소스의 정제방법{GENE EXPRESSION CASSETTE AND TRANSFORMANT, AND PROCESS FOR PRODUCTION OF 2-DEOXY-SCYLLO-INOSOSE AND PROCESS FOR PURIFICATION OF 2-DEOXY-SCYLLO-INOSOSE USING THE TRANSFORMANT}

본 발명은, 유전자 발현카세트 및 형질전환체, 및 이 형질전환체를 사용한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법 및 2-디옥시실로이노소스의 정제방법에 관한 것이다.

탄소 6원환 화합물은, 종래 석유 화학의 분야에 있어서, 석유를 원료로 하여 생산되어 왔다. 한편, 부티로신 생산균 바실러스·서큘란스(Bacillus circulans)에 있어서, 글루코오스-6-인산(G-6-P)을 기질로 하여, 탄소 6원환 화합물인 2-디옥시실로이노소스(2-deoxy-scyllo-inosose)(이하, DOI라고도 한다)를 합성하는 반응을 촉매하는, 2-디옥시실로이노소스합성효소(DOI 합성효소)가 발견되었다(도 1, 특허문헌 1).

DOI 합성효소는, 2-디옥시스트렙타민을 아글리콘으로 하여 함유하는 아미노글리코시드 항생물질의 생합성에 관여하는 효소이며, 그 생성물인 DOI는 의약원료 나 화학공업자원으로서 유용한 물질이다. DOI를 화학적으로 합성하는 방법은, 다단계의 반응과 유해 또는 고가인 금속을 사용하는 것에 반하여, DOI 합성효소를 사용하면, 효율적으로 단공정에서 DOI를 생산할 수 있다. 지금까지는 DOI 합성효소를 대장균에 발현시키므로써 얻어지는 재조합 DOI 합성효소를 사용하고, 글루코오스-6-인산에서 단공정으로 DOI를 생산하는 방법이 확립되어 있다(특허문헌1). 또한, DOI는 글루코오스에 헥소키나아제와 DOI 합성효소를 작용시키는 2단계의 효소반응이나, 글루코오스-6-인산에 DOI 합성효소를 작용시키는 1단계의 효소반응으로 합성할 수 있는 것이 알려져 있다(특허문헌1, 비특허문헌1). 또한, 효소반응액을 농축해서 아세트산 용액으로 하여 요오드화 수소를 작용시킴에 따라, DOI를 정제하지 않고 카테콜로 변환시킬 수 있는 것도 보고되어 있다(특허문헌1).

그러나, DOI 합성효소를 조합한 대장균을 사용한 비이오매스 유래의 D-글루코오스를 원료로 하는 발효에 의한 DOI의 합성 방법은, 과제로 제기되어 있지 않았다.

또한, 현재까지, 효소반응에 의해 DOI를 합성하고, 반응 조성물 자체의 DOI를 변환하는 것은 보고되어 있지만, DOI 그 자체를 정제·단리 하는 방법은 아직 보고되어 있지 않다. 또한, 효소반응액 중에서 다종다량의 배지성분, 탄소원인 글루코오스 외에 펩톤 등에 유래하는 아미노산류나, 각종의 금속 이온류가 포함되어 있는 미생물 배양액 중에서 DOI를 정제하는 것에 관한 정보는 전혀 없다. 즉, 효소반응액 및 미생물배양액 등의 불순물 존재하에서 DOI를 정제하는 보고는 없고, 더군다나 공업적으로 응용가능한 정제방법에 있어서는 전혀 확립되지 않은 것이 현상 태이다.

미생물 배양액 등의 불순물 존재하에서 DOI를 정제하기 위해서는, 실험실적으로는 HPLC에 의한 분취 혹은 활성탄 컬럼 크로마토그래피에 의한 방법이 알려져 있다. 그러나, HPLC에 의한 분취가 공업적 생산에는 적합하지 않다는 것은 말할 필요도 없다. 또한, 활성탄 컬럼에 의한 방법에서는, 배지 중의 유기 화합물을 한차례 활성탄에 흡착시킨 후, 알코올 등의 유기용매의 농도를 변화시켜가면서, 흡착력의 차이를 사용해서 순차적으로 용출시키게 된다. 따라서, 대량의 DOI를 생산하는 경우, 배지 중의 대부분의 유기 화합물을 흡착시킬 만큼의 양의 활성탄을 필요로 하고, 이 방법도 대량정제에는 부적합하다. 그러한 것 때문에, 지금까지는 공업적 방법으로 DOI를 정제하는 적절한 방법은 확립되어 있지 않았다.

특허문헌1: 일본국 특개2000-236881호 공보(일본국 특허 제3122762호)

비특허문헌1: K.Kakinuma, E.Nango, F. Kudo, Y. Matsushima, 및 T. Eguchi 저, Tetrahedron Letters, 2000년, 41권, p. 1935-1938

비특허문헌2: 0ta, Y. 등 저, J.Antibiot., 2000년, 53권, 1p. 158 -1167

비특허문헌3: Kudo, F. 등 저, J. Antibiot., 1999년, 52권, p. 559-571

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명은, 상술한 문제에 비추어 보아서 된 것이며, DOI를 공업적 규모로 제조가능한 계를 실현할 수 있는 유전자 발현카세트, 이 유전자 발현카세트를 갖는 형질전환체 및 2-디옥시실로이노소스의 제조방법 및 2-디옥시실로이노소스의 정제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명에 의한 유전자 발현카세트는, 2-디옥시실로이노소스의 합성에 관여하는 유전자로부터 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 관한 유전자 발현카세트에 있어서, 상기의 2-디옥시실로이노소스의 합성에 관여하는 유전자는 2-디옥시실로이노소스 합성효소인 것을 특징으로 한다. 이것들에 의해, DOI를 공업적으로 제조가능한 형질전환체가 취득 가능해진다

또한, 본 발명에 의한 형질전환체는, 숙주세포에 상술한 유전자 발현카세트를 도입하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 형질전환체에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균종, 및 GILSP유전자 재조합 미생물 리스트에 기재되어 있는 숙주세포(2006년 3월 현재의 것)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주세포인 것을 특징으로 한다. 이것들에 의해 DOI를 공업적으로 제조가능한 방법을 실시하는 것이 가능해진다.

본 발명에 의한 형질전환체에 있어서, 상기 숙주세포는 포스포글루코오스 이소머라제를 코드하는 pgi유전자, 글루코오스-6-인산 1-디히드로게나아제를 코드하는 zwf유전자, 포스포글루코뮤타아제를 코드하는 pgm유전자 및 정지상(定常期:stationary phase)에 있어서의 단백질 합성의 수식을 담당하는 리보솜 수식 인자 단백질을 코드하는 rmf유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 유전자가 파괴되는 숙주세포인 것을 특징으로 한다. 이것에 의해 상술한 것에 추가하여, 보다 효율적으로 DOI를 공업적으로 제조가능한 방법을 실시하는 것이 가능해진다.

한편, 본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법은, 상술한 형질전환체와 탄소원을 접촉시키는 공정을 갖는 것을 특징으로 한다. 이것에 의해, DOI를 공업적으로 제조하는 것이 가능해진다.

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법에 있어서, 상기 탄소원은 D-글루코오스, 올리고당, 다당, 녹말, 셀룰로오스, 미강 및 폐당밀 및 D-글루코오스를 얻는 것이 가능한 비이오매스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종류의 탄소원인 것을 특징으로 한다. 이것에 의해 상술한 것에 추가하여, DOI를 범용적으로 제조하는 것이 가능해진다.

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스는, 상술한 2-데옥시실로이노스의 제조방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 형질전환체를 사용한 제조방법의 특질을 살린 2-디옥시실로이노소스를 얻는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법은, 상술한 형질전환체와 탄소원을 접촉시켜서 2-디옥시실로이노소스를 갖는 조성물을 얻는 공정과, 해당 조성물을 수소 이온형 강산성 양이온교환수지와 유기산 이온형 염기성 음이온교환수지를 갖는 혼상식(混床式) 또는 이상식(二床式) 컬럼으로 처리하는 공정을 갖는 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 순도 높은 DOI가 공업적으로 취득 가능해진다.

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법에 있어서, 상기 유기산 이온형 염기성 음이온교환수지는, 아세트산 이온형 음이온교환수지인 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 아세트산을 농축 조작에 의해 제거할 수 있으므로, 실용적으로 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스는, 상술한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법에 의해 얻는 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 순도가 높고, 형질전환체를 이용한 특질을 살린 2-디옥시실로이노소스를 얻는 것이 가능해진다.

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법은, 상술한 2-디옥시실로이노소스를 트리알콕시메탄과 반응시켜서, 2-디옥시실로이노소스디알킬케탈을 얻는 공정과, 2-디옥시실로이노소스디알킬케탈을 산의 존재하에서 가수분해하는 공정을 갖는 것을 특징으로 한다. 이것에 의해 상술한 것에 추가하여, 불순물이 효율적으로 분리 가능해진다.

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법에 있어서, 상기 트리알콕시메탄은 트리메톡시메탄인 것을 특징으로 한다. 이것에 의해, 후속의 가수분해공정에서 생성하는 메탄올을 농축 조작에 의해 용이하게 제거할 수 있으므로, 실용적으로 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스는 상술한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 한다. 이것에 의해, 순도 등의 점에서 실용적으로도 우수한 2-디옥시실로이노소스를 얻을 수 있다.

발명의 효과

의약품 원료나 화학공업 원료로서 중요한 탄소 6원환 화합물은, 지금까지, 석유를 원료로 하는 석유 화학에 의해 제조되어 왔다. 그렇지만, 본 발명의 기술을 사용하므로써, 재생가능한 식물자원(바이오매스) 유래의 D-글루코오스를 원료로 하여 탄소 6원환 화합물인 2-디옥시실로이노소스(DOI)를 세균에 의해 합성하는 것이 가능해졌다. 또한, 배양액을 처리하고, 정제된 DOI를 회수하는 것이 가능하다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

DOI 합성효소의 특성을 고려하면, 해당 효소를 다른 미생물에 도입하므로써 풍부하게 존재하는 비이오매스 유래의 D-글루코오스를 원료로 유용자원인 DOI를 효율적으로 단공정에서 생산할 수 있는 가능성이 있다.

거기에서 본 발명자들은 DOI의 신규의 합성 방법으로서, 대장균을 숙주세포로 하여 DOI를 발효법에 의해 간편 저렴한 방법으로 생산하는 방법을 개발하기 위해서 예의 검토를 행하고, 본 발명을 달성하기에 이르렀다.

또한, 공업적 방법으로 DOI를 정제하는 계를 고려했을 경우, 바람직한 방법으로서, 예를 들면, 배양액을 컬럼의 상부에서 흘리면, 하부에서 정제된 DOI가 유출되어 나오도록 하는 원리에 근거하는 방법, 및 DOI 또는 그 유도체를 결정화시켜서 분리하는 방법, 및 이들을 조합시킨 방법이 예시된다. 이러한 관점에서 DOI이외의 물질을 흡착하고, 또한 DOI는 흡착되지 않고 최초에 유출하도록 하는 컬럼 기재를 탐색함으로써, 또한 결정화·분리후에 효율적으로 DOI를 취득할 수 있는 DOI유도체를 탐색함으로써, 본 발명을 달성하기에 이르렀다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해서 설명한다.

<본 발명에 의한 유전자 발현카세트>

본 발명에 의한 유전자 발현카세트는, 2-디옥시실로이노소스의 합성에 관여하는 유전자로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 의한 유전자 발현카세트는 2-디옥시실로이노소스의 합성에 관여하는 유전자와, 이 유전자가 발현시킬 수 있는, 예를 들면, 벡터 등의 유전자로부터 이루어지는 것이면, 특별히 제한되지 않는다.

(2-디옥시실로이노소스의 합성에 관여하는 유전자)

본 발명에 의한 유전자 발현카세트에 있어서, 2-디옥시실로이노소스의 합성에 관여하는 유전자로서는, 2-디옥시실로이노소스를 합성할 수 있는 공지의 단백질을 코드하는 유전자이면 좋다. 이 예로서는, D-글루코오스로부터 DOI를 합성하는 바실러스·서큘란스( Bacillus circulans ) 유래의 DOI 합성효소의 42kDa 서브유닛(subunit)을 코드하는 btrC유전자가 예시된다(특허문헌1, 비특허문헌1 및 젠뱅크(Genbank) ABO66276 등 참조.). 물론, DOI 합성효소활성을 갖는 효소를 코드하는 유전자라면, 바실러스·서큘란스 이외의 생물에 유래하는 유전자도 사용할 수 있다. 또한, 상기 유전자의 염기서열은 본 발명의 DOI의 합성효소활성을 갖는 효소를 합성하는 유전자라면, 그 유전자의 염기서열에 결실, 치환, 삽입 등의 이변이 생겨있어도 좋다.

(본 발명에 의한 유전자 발현카세트의 구축)

본 발명에 의한 유전자 발현카세트의 구축에는, 상술한 2-디옥시실로이노소스의 합성에 관여하는 유전자를, 아래의 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있는 유전자를 사용하면 좋다. 유전자 발현카세트의 유전자구성으로서는, 프로모터, 전사 활성화에 관여하는 서열, RBS(리보솜 결합 부위), 터미네이터 등이 예시된다. 예를 들면, 대장균을 숙주세포로 하는 단백질의 대량 발현계에 있어서는, 해당 유전자의 5' 상류에 프로모터, 전사 활성화에 관여하는 서열, RBS(리보솜 결합 부위) 등의 DNA 서열의 연결, 해당 유전자의 3’하류에 터미네이터 등의 DNA서열을 연결하면 좋다. 이들의 DNA서열은 대장균 내에서 기능하는 서열이면 어떤 서열이여도 좋다. 프로모터에는 구성적으로 발현을 하는 것이나 유도적으로 발현을 하는 것이 있지만, 어느 쪽의 프로모터를 사용해도 좋고, 바람직하게는 발현의 제어가 가능한 것이다. 또한, 대장균을 숙주로 하는 유전자발현에 있어서는, 보통 IPTG(이소프로필티오갈락토피라노시드;isopropyl-thio-galactopyranoside)를 비롯한 비교적 고비용의 유도 물질을 일반적으로 사용할 수 있다.

본 발명에서는, IPTG와 같은 고가의 유도 물질을 사용하지 않고, 목적 유전자의 높은 발현을 초래하는 발현계를 사용하는 것이 바람직하다. 그 때문에 숙주·벡터계로서는, 예를 들면, P_L Expression System(Invitogen), GAP프로모터나 GAD프로모터를 사용한 발현 시스템 등을 사용할 수 있다.

P_L Expression System계에 있어서, 벡터(pLEX, 암피실린 내성 마커) 상에 조합한 유전자의 발현은, λ파지 유래의 구성적으로 강력한 발현을 초래하는 프로모터인 P_L 프로모터에 의한 제어를 받는다. 또한, P_L Expression System은 배지 중의 트립토판 농도에 의해 발현제어를 받고, 트립토판 농도가 높은 배지에서 발현이 유도되는 구조로 이루어져 있다.

한편, gapA(글리세르알데히드-3-인산 디히드로게나아제A를 코드하는 유전자) 프로모터나 gadA(글루타메이트디카르복실라아제A를 코드하는 유전자) 프로모터를 단독 또는 양쪽을 사용하는 발현계에 있어서, 벡터(pUC유래, 암피실린 내성마커) 상에 조합한 유전자의 발현은 영양증식기 또는 정지상에 구성적으로 강력한 발현을 초래한다. 이러한 gapA 프로모터나 gadA 프로모터 등을 사용한 발현계에서는 특수한 시약이나 조작을 필요로 하지 않고, 보통 배양시에 발현이 유도되는 구조로 되어 있다.

한편, P_L Expression System계에서는, 대장균의 배양에 통상 사용하는 완전배지에서는 프로모터 활성을 유도하는 데에 충분한 양의 트립토판이 있어서, 유도 발현 때문에 트립토판을 별도로 가할 필요는 없다. 또한, gapA 프로모터나 gadA 프로모터를 사용하는 발현계도 같은 유형의 유도 발현 때문에 유도 물질을 가할 필요는 없다. 즉, 고가의 유도 물질을 사용하지 않고, 목적 유전자의 높은 발현이 가능하다.

<본 발명에 의한 형질전환체>

본 발명에 의한 형질전환체는, 숙주세포에, 상술한 유전자 발현카세트를 도입하여 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이하, 본 발명에 있어서의 숙주세포에 대해서 설명한다.

(숙주세포)

본 발명에 의한 형질전환체에 사용할 수 있는 숙주세포로서는, 특별히 제한은 없고, 균주의 기탁 기관(예를 들면, IFO, ATCC 등)에 기탁되어 있는 균을 사용할 수 있다. 이와 같은 예로서는, 예를 들면, 대장균을 들 수 있다. 또한, 대장균이외의 숙주세포로서, GILSP(Good Industrial Large-Scale Practice(우량공업규범)) 유전자 재조합 미생물 리스트에 기재되어 있는 숙주세포(2006년 3월 현재의 것, 바실러스·아밀로리케파시엔스, 바실러스·브레비스 HPD31, 바실러스·브레비스 HPD31-M3, 바실러스·리센포르미스 DN2461, 바실러스·리센포르미스 DN2717, 바실러스·사티리스 K2A1, 바실러스·사티리스 M168 유래주, 코리네박테리움·글루타미캄, 에셰리키아·코리 K12유래주, 게오바실러스·스테아로써모필러스)를 사용해도 좋다.

(본 발명에 있어서의 유전자 파괴주)

본 발명에 의한 형질전환체에 있어서, 상술한 숙주세포는 2-디옥시실로이노소스의 합성을 고려하고, 각종의 염색체/플라스미드 유전자를 파괴한 주를 사용해도 좋다. 본 발명의 바람직한 태양으로는, 숙주세포가 보유하는, 글루코오스-6-인산의 대사에 관계하는 효소인, 포스포글루코오스 이소머라제, 글루코오스-6-인산 1-디히드로게나아제 및 포스포글루코뮤타아제를 코드하는 유전자(각각, pgi유전자, zwf유전자 및 pgm유전자)가 각각 단독으로 유전자 파괴가 되어 있거나, 또는 2개가 동시에 유전자 파괴되어 있거나(pgi유전자와 zwf유전자 및 pgi유전자와 pgm유전자), 또는 3개가 동시에 유전자 파괴되어 있다. 또한, 정지상에 있어서의 단백 합성의 제어에 관계하는 RMF단백질을 코드하는 유전자(rmf유전자)가 단독으로 유전자 파괴되어 있거나, 또는 상기의 글루코오스-6-인산의 대사에 관계하는 효소를 코드하는 유전자가 파괴되어 있는 각종 유전자 파괴주에 대하여 rmf유전자 파괴가 되어 있다. 상기의 것에 의해, DOI 생산을 위한 직접적인 기질이 되는 글루코오스-6-인산의 균에 의한 분해 대사가 억제되거나, 또는 정지상에 있어서의 단백질 합성에 의해 DOI생산능력이 비약적으로 높아졌다.

[글루코오스-6-인산의 분해에 관여하는 유전자의 파괴주]

DOI를 가능한 한 고수율로 합성하기 위해서는, 균체에 의한 D-글루코오스의 이화대사를 가능한 한 억제할 필요가 있다고 생각된다. 대장균에 있어서, D-글루코오스의 이화대사에 관계하는 효소를 코드하는 유전자로서는, 해당계에 있어서 글루코오스-6-인산으로부터 프럭토오스-6-인산으로의 변환에 관계하는 포스포글루코오스·이소머라제(phosphoglucose isomerase)를 코드하는 (pgi)유전자와, 펜토오스 인산경로에 있어서, 글루코오스-6-인산으로부터 포스포글루코노락톤으로의 변환에 관여하는 효소인 글루코오스-6-인산 디히드로게나아제(Gluxose-6-phosphatedehydrogenase)를 코드하는 zwf유전자나 글루코오스-6-인산으로부터 글루코오스―1-인산으로의 변환에 관계하는 효소인 포스포글루코뮤타아제(phosphoglucomutase)를 코드하는 pgm유전자의 3종이 존재한다. 이들 유전자를 파괴함으로써, DOI 합성효소의 기질이 되는 글루코오스-6-인산의 균체의 증식에 따르는 이화분해를 억제하는 것이 가능하다고 사료된다.

[정지상에 있어서의 단백질 합성에 관여하는 유전자의 파괴주]

정지상에 있어서의 BtrC 단백질 합성의 억제를 해제하기 위해서는, 이에 관여하는 RMF 단백질의 생산을 억제할 필요가 있다고 생각된다. 따라서, RMF단백질을 코드하는 rmf유전자를 파괴함으로써, 정지상 이후에도 BtrC 단백질의 합성이 계속되고, DOI합성 또한 계속되는 것이라고 생각된다.

(본 발명에 있어서의 유전자 파괴주의 제작)

본 발명에 있어서, 숙주세포의 특정한 유전자를 파괴한 유전자 파괴주를 제작하는 방법으로서는, 본 기술분야 공지의 방법을 사용하면 좋다. 예를 들면, 돌연 변이를 유발시키는 방법(자연육종에 의한 방법, 변이제 첨가, 자외선 조사, 방사선 조사 등), 랜덤한 돌연 변이에 의한 방법(lnsertion Sequence(IS), 트랜스포존(Tn) 등에 의한 방법), 부위 특이적인 유전자 파괴법(싱글 및 더블 크로스 오버코트법에 의한 것) 등이 예시된다. 그 중에서도, 파괴 대상의 유전자에 약제내성을 나타내는 유전자를 포함하는 단편을 삽입할 수 있는 부위 특이적인 유전자 파괴법은, 소망하는 유전자 파괴주의 스크리닝의 점에서 있어서 바람직하다. 또한, 하술하는 바와 같이, 본 발명에 의한 형질전환체에 사용하는 유전자 파괴를 행하는 숙주세포는, Gene Bridges사의 Quick and Easy BAC Modification Kit를 사용해서 제작했지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

(본 발명에 있어서의 형질전환체의 제작방법)

본 발명에 의한 형질전환체는, 상술한 유전자 발현카세트를 상술한 숙주세포에 도입해서 제작하면 좋다. 이 도입 방법으로서는, 컨피텐스법이나 수용체를 통한 엔도사이토시스를 사용한 방법 등을 들 수 있다.

<본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법>

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법은, 상술하는 형질전환체와 탄소원을 형질전환체의 성장 등에 적당한 매체 중에서 접촉시키는 것을 특징으로 한다.

탄소원으로서는, D-글루코오스나 D-글루코사민, D-갈락토사민 등의 함질소 단백질, 이들의 단당류로 이루어지는 2당 이상의 당류 또는 올리고당류 또는 탄수화물(녹말, 미강, 폐당밀 등)의 다당류에 유래되는 단당류를 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법을 행하는 매체로서는, 숙주세포를 증식/성장 등 시킬 수 있는 공지의 배지이면, 고형, 액체 등, 매체의 형태는 한정되지 않는다. 이러한 예로서는, 한천배지, RMG배지, 2×YT배지, LB배지, M9 최소배지나 SOB 배지 등이 예시된다. 이들의 매체는 탄소원, 질소원, 무기염류,그 외 유기영양원을 가져도 좋다. 이 탄소원은, 상술한 것 외에 만니톨 등의 표 1에 나타내는 것 등이어도 좋다. 이 질소원으로서, 예를 들면, 염화암모늄, 카자미노산(casamino acid), 펩톤, 효모 엑기스를 들 수 있다. 이 무기염류로서는, 예를 들면, 인산수소나트륨, 인산이수소칼륨, 염화마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 전술한 바와 같이, 숙주·벡터계로서 GAP-GAD 발현시스템이나 P_L Expression System(lnvitrogen)을 사용하면, 고가의 유도물질을 사용하지 않아도 좋다.

한편, 매체는, 숙주의 성장 등에 따라, 적당한 첨가제를 또한 가져도 좋다.매체는, 상술한 유전자 발현카세트에 도입한 2-디옥시실로이노소스의 합성에 관여하는 유전자를 발현시키기 위해서, 예를 들면, IPTG나 트립토판 등의, 프로모터 활성을 상승시키는 화합물을 가져도 좋다. 특히, 프로모터에 의한 유전자의 발현이 유도형일 경우에는, 적시에 유도물질을 첨가하면 좋다.

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법에 있어서, 상술한 형질전환체와 탄소원을 접촉시키는 온도, 시간, 분위기 등은, 형질전환체의 성장 등에 적합한 환경이면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 그 온도로서는, 20℃ 내지 37℃가 보다 바람직하다. 또한, 그 시간으로서는, 특별히 제한은 없으나, 1일 내지 7일 정도이어도 좋다.

예를 들면, 본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법은, 우선, 상술한 형질전환체에, 탄소원으로서, 대장균이 자화(資化)할 수 있는 것(예를 들면, D-글루코오스 등)을 배지 중에서 접촉시킨다. 그 후, 얻어지는 배양 상등액으로부터 DOI를 회수한다. 이렇게 하여, 형질전환체를 사용한 본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법에 의해 공업적으로 DOI를 얻는 것이 가능해진다.

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법은, 상술한 바와 같은 구성으로 이루어지므로, D-글루코오스로부터 헥소키나아제(hexokinase)와 DOI 합성효소를 통하는 것으로 DOI를 고수율로 합성할 수 있다. 또한, 상술한 플라스미드pGAP-btrC, pGAD-btrC, pGAP-btrC/pGAD-btrC나 pLEX-btrC를 갖는 GI724Δrmf형질전환주, GI724ΔpgiΔrmf형질전환주, GI724Δpgi형질전환주, GI724ΔpgiΔzwf형질전환주나 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm형질전환주 등을 제작하고, 배양하는 방법에 의해, 도 1에서 도시한 바와 같이, D-글루코오스로부터 글루코오스-6-인산을 거치고, 또한 DOI 합성효소가 촉매하는 5단계의 반응을 거쳐서, DOI가 생산된다.

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법에 있어서, 상술한 대로, 형질전환체와 탄소원을 접촉시키면, 2-디옥시실로이노소스를 갖는 조성물(예를 들면, 2-디옥시실로이노소스를 포함하는 배지, 숙주세포 등)을 얻을 수 있다. 예를 들면, 2-디옥시실로이노소스를 포함하는 배지를 2-디옥시실로이노소스의 원료로 할 경우, 배양 상청(上淸)으로부터, DOI를 채취하면 좋다. 본 발명에 있어서, DOI의 배양액으로부터의 회수법으로서는, 2-디옥시실로이노소스의 물리적/화학적 성질이나, 배지의 조성 등을 고려하고, 공지의 추출법에 의해, 2-디옥시실로이노소스를 회수하면 좋다. 예를 들면, 다음과 같은 방법을 사용할 수 있다. 즉, 우선, 배양 종료후, 배양액을 원심분리기나 여과장치 등으로 균체를 제거하고, 배양 상등액을 얻는다.그 후, 이 배양 상등액을 또한 여과 처리하고, 균체 등의 고형물을 제거하고, 그 여액을 이온교환수지에 첨가하고, 증류수에서 용출을 행한다. 굴절율, pH, 전도율을 측정하면서 불순물을 포함하지 않는 프랙션(fraction)을 분취하고, 그 수용액의 용매를 제거해서 DOI를 회수할 수 있다. 얻어진 DOI의 분석은, 예를 들면, 고속 액체 크로마토그래피나 핵자기공명법 등에 의해 행한다.

<본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법의 제1의 태양>

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법은, 상술한 형질전환체와 탄소원을 접촉시켜서 2-디옥시실로이노소스를 갖는 조성물을 얻는 공정과, 해당 조성물을 수소 이온형 강산성 양이온교환수지와 유기산 이온형 염기성 음이온교환수지를 갖는 혼상식 또는 이상식 컬럼으로 처리하는 공정을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법에 있어서, 형질전환체와 탄소원을 접촉시키는 스텝은, 상술한 본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 제조방법에 준하여 행한다. 이 스텝에 의해, 2-디옥시실로이노소스를 포함하는 조성물을 얻을 수 있다. 이 조성물은 상술한 매체로 이루어지는 것이지만, 이하, 매체로서 배지를 사용했을 경우에 대해서 서술한다.

탄소원을 갖는 배지 중에서의 형질전환체의 배양이 종료한 배양액 중에는, 잔존하고 있는 탄소원으로서의 글루코오스 외, 배지의 각종 성분이 포함된다. 이들의 각종 성분으로서는, 각종 아미노산 혹은 펩티드류, 및 각종의 금속 이온류 등을 들 수 있다. DOI를 얻기 위해서는, 이들 각종 성분을 제거하는 것이 필요하므로 본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법에서는, 이것을 해결하는 방법을 제공한다.

배지에 포함되는 제거해야 할 불순물로서는, 상술한 대로, 잔존하고 있는 탄소원으로서의 D-글루코오스, 각종 아미노산 혹은 펩티드류, 및 각종의 금속 이온류가 있다. 이 중, 배양 조건의 검토에 따라, D-글루코오스가 완전히 소비될 때까지 배양을 계속하는 것이 가능한 것을 알았다. 이렇게 하여 얻은 배지에는, 잔존하는 불순물로서, 각종 아미노산 혹은 펩티드류, 및 각종의 금속 이온류가 되었다. 아미노산류 중에는, 리진이나 히스티딘, 트립토판과 같이 아미노기가 복수개 있는 염기성 아미노산도 있다면, 글루탐산이나 아스파라긴산과 같이 카르복실기를 복수개 가지고 있는 산성 아미노산도 존재한다. 또한, 금속 이온은 당연히 양이온이지만, 동시에 그 카운터 이온으로서의 염소 이온이나 황산 이온 등도 배지 중에는 존재하고 있다. 따라서, 그러한 불순물을 전부 흡착시키고, 또한, DOI를 흡착시키지 않는 기재를 탐색하면 좋게 된다.

본 발명자들은, 그러한 생각에 근거해서 기재의 탐색과 용출조건을 검토한 결과, 범용되는 이온교환수지, 예를 들면, 나트륨 이온형 또는 수소 이온형 강산성 양이온교환수지 및 염소 이온형 또는 수산 이온형 염기성 음이온교환수지를 사용하는 방법으로는 DOI를 수율 좋게 정제하는 것은 불가능하였다. 즉, 각각을 연결한 이상식 컬럼, 또는 양자를 혼합한 혼상식 컬럼을 사용해도, 그 목적을 달성할 수는 없는 결과가 되었다. 아미노산은 2종류의 이온교환수지의 어느 쪽인가에 결합한다. 또한, 금속 이온은 양이온교환수지에 결합하는 것에 대하여, DOI는 이온성의 관능기를 가지지 않기 때문에, 어느 쪽의 이온교환수지에도 결합하지 않는 특성을 가지고 있다. 따라서, 아미노산류 및 금속염류는, 이온교환수지에 결합하고, DOI 만이 흡착되지 않고 용리한다고 추찰되지만, 결과는 달랐다. DOI의 회수율은 50% 이하가 되고, 또한, 이온교환수지의 사용조건에 의해 크게 변동하였다. 대량처리하는 공업적 방법에 적합하기 위해서는, 회수율을 보다 높게 증가시켜서 안정된 성적이 필요하게 된다.

본 발명자들은 기재와 정제 조건을 더욱 확대해서 예의 검토한 결과, 음이온교환수지의 카운터 이온으로서 유기산 이온을 사용하는 방법, 즉 유기산 이온형 음이온교환수지와 수소 이온형 양이온교환수지를 사용한 혼상식 또는 이상식 컬럼을 사용하므로써, DOI를 효율적으로 정제할 수 있는 것을 발견하였다. 유기산으로서는, 아세트산, 프로피온산, 옥살산 등을 들 수 있지만, 그 중에서도 아세트산이 바람직하게 사용할 수 있다. 유기산으로서 아세트산을 사용하면, DOI가 pH8 이상의 알카리성 영역으로 극히 분해하기 쉽고, pH3~5의 약산성 조건하에서만 안정한 점에서 바람직하다. 즉, DOI가 산성과 알카리성의 양쪽영역에서 완전히 안정하면, 범용되고 있는 음이온교환수지와 양이온교환수지를 별도인 컬럼에 충전한 이상식 컬럼에 배양액을 흘리는 방법으로도 상기의 불순물을 제거할 수 있다. 또한, 양쪽영역에서 프럭토오스(fructose)와 동등한 안정성을 갖고 있으면, 혼합 베드형 컬럼으로 정제가 가능하다. DOI가 이상식 컬럼은 물론, 혼합식 컬럼을 사용해도 분해가 일어날 만큼 알칼리 영역에서 불안정하다는 것을 발견한 것은 본 발명자들이 처음이다.

이 문제를 해결하기 위해서, 사용하는 이온교환수지에 결합하는 카운터 이온의 선택을 검토한 결과, 본 발명자들은, 음이온교환수지의 카운터 이온으로서 유기산 이온을 사용하는 방법을 발견하였다. 이것에 의해, 용리액 중에는 유기산이 잔존하고, DOI의 용리분획에도 혼입하지만, 이것은 용리액을 pH4 전후로 유지하는데도 유효하다. 유기산 중에서도, 아세트산은 농축에 의해 제거할 수 있는 장점을 가지고 있다.

이것에 의해, 수소 이온형의 양이온교환수지와 유기산 이온형의 음이온교환수지를 혼합해서 작성한 이온교환 컬럼에, 배양액을 통과시키므로써, DOI를 정제할 수 있는 것이 밝혀지게 되어 본 발명이 완성되어졌다. 이것은 공업적 대량생산에서도 충분히 가능한 방법이다.

혼상식 또는 이상식 이온교환수지 컬럼을 사용하는 정제방법에 있어서는, 글루코오스를 완전히 소비시킨 배양액 중에 남겨진 원료유래의 하전(荷電)성 불순물, 각종 아미노산 혹은 펩티드류, 및 각종의 금속 이온류를 흡착 제거할 수 있다. 이어서 흡착되지 않은 중성물질인 DOI를 용출함으로써 정제할 수 있었다. 다만, 배양의 조건에 따라서는, 이 DOI에 미량의 중성물질이 혼입하는 가능성이 있어서, 이온교환수지 컬럼으로부터 용출한 DOI를 더욱 고도(高度)로 정제하는 방법에 관해서도 더 검토하였다. NMR 등의 측정으로부터, DOI는 케톤형과 하이드레이트형이 혼재하는 구조로 존재한다고 추정할 수 있고, DOI의 결정화는 어려운 것으로 생각되어졌다. 현재까지, DOI는 물론 그 유도체의 결정화도 아직 보고되지 않고 있는 것이 실정이다. 이하, DOI를 더욱 고도로 정제하는 방법에 대해서 설명한다.

<본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법의 제2의 태양>

본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법은, 상술한 2-디옥시실로이노소스를 트리알콕시메탄과 반응시켜서, 2-디옥시실로이노소스디알킬케탈을 얻는 공정과, 이 2-디옥시실로이노소스디알킬케탈을 산의 존재하에서 가수분해하는 공정을 갖는 것을 특징으로 한다. 이 태양에 있어서 사용할 수 있는 2-디옥시실로이노소스로서는, 2-디옥시실로이노소스를 포함하는 상술한 조성물 외에, 제1의 태양에서 얻은 2-디옥시실로이노소스 등을 들 수 있다. 이하, 이 태양에 대해서 설명한다.

본 발명자들은 용출한 DOI를 결정성의 물질로 유도 변환해서 결정화하고, 분리·정제한 후, 효율적으로 DOI로 복원하는 원리에 근거하여, 이 원리로 가능한 물질의 탐색과 정제방법의 검토를 시행하였다. 이 원리의 개략을 나타낸 것이 도 14이다. 도 14는 본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법의 제2의 태양의 원리를 나타내는 개략도이다.

이 요건을 충족시키기 위해서는, DOI를 변환하는 반응 조건 및 복원하는 반응 조건이 DOI를 분해하지 않는 산성조건하에서 실시할 수 있을 것, 및 유도 변환된 물질을 용이하게 결정화함과 동시에 DOI로 복원할 것, 또한 이들의 실시가 공업적 규모에서 실시할 수 있을 것이 필요요건이 된다. 이들의 요건에 합치하는 방법을 여러가지 검토하였다. 그 결과, DOI를 안정한 산성조건화에서, 트리알콕시메탄과 반응시켜서, 2-디옥시실로이노소스디알킬케탈(DOI-dak)로 변환해서 결정화·정제하는 방법을 발견하였다.

이 트리알콕시메탄((RO)₃CH)에 있어서, R로서는 탄소수가 1~4의 알칸류이면 특별히 제약이 없고, 예를 들면, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 이 알콕시메탄으로서는, 후속의 가수분해공정에서 생성하는 알코올이 용이하게 제거될 수 있는 점에서 트리메틸메탄이 가장 바람직하다. 또한, 트리메틸메탄을 사용해서 행한 경우, 디옥시실로이노소스디메틸케탈(DOI-dmk)을 얻을 수 있게 된다.

2-디옥시실로이노소스알킬케탈의 결정화는, 2-디옥시실로이노소스알킬케탈을 적당한 용매(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 물 등)에 용해한 후, 액상의 친수성을 저하시키는 매체(예를 들면, 클로로포름, 헥산, 에테류 등)을 사용해서 행하면 좋다. 이렇게 하여, 2-디옥시실로이노소스알킬케탈의 결정을 얻을 수 있다.

이렇게 하여 얻은 2-디옥시실로이노소스알킬케탈은, 산의 존재하에서 가수분해하여, 2-디옥시실로이노소스가 된다. 이 가수분해반응에는 토실산, 염산, 황산 등 적당한 촉매의 존재하에서 행하여도 좋다. 가수분해 후, 2-디옥시실로이노소스를 얻을 수 있다.

이것으로, 본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법은 공업적 대량생산에도 충분히 가능한 방법이다.

[도1] D-글루코오스로부터 DOI를 생성하는 반응 경로 및 DOI 합성효소가 촉매하는 반응을 나타내는 도면이다.

[도2A] pLEX-btrC의 구조를 나타내는 도면이다.

[도2B] pGAP-btrC의 구조를 나타내는 도면이다.

[도2C] pGAD-btrC의 구조를 나타내는 도면이다.

[도2D] pGAP-btrC/pGAD-btrC의 구조를 나타내는 도면이다.

[도3A] pLEX-btrC를 포함하는 대장균GI724Δpgi주(株)를 2×YT배지 또는 미강배지에서 각 시간 배양했을 때의 균체 추출물의 SDS-PAGE 패턴을 나타내는 도면이다.

[도3B] pGAP-btrC/pGAD-btrC를 포함하는 대장균GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주를 2×YT배지에서 각 시간 배양했을 때의 균체 추출물의 SDS-PAGE 패턴을 나타내는 도면이다.

[도4A] pLEX-btrC를 포함하는 대장균GI724Δpgi주의 배양(2×YT 3L, 30℃, pH7.5, 5% D-글루코오스, 배양 24시간) 상청의 옥심화 반응물의 HPLC 차트이다.

[도4B] pLEX-btrC를 포함하는 대장균GYI724Δrmf주의 배양(2×YT, 10mL, 30℃, pH7, 3% D-글루코오스, 배양 48시간) 상청의 옥심화 반응물의 HPLC 차트(왼쪽의 차트는 배양 0시간)이다.

[도5] pLEX-btrC를 포함하는 대장균GI724Δpgi주의 배양(2×YT+2% 글루코오스(◆), 또는 2×YT+5% D-글루코오스(■), 3L, 30℃,pH7.5)에 따른 (A) 배지의 탁도, (B) D-글루코오스 농도, 및 (C) DOI 생산량의 타임 코스(가로축은 글루코오스 첨가 후의 경과시간)을 나타내는 도면이다.

[도6] pLEX-btrC를 포함하는 대장균GI724ΔpgiΔzwf주의 배양(2×YT+3%만니톨+5% D-글루코오스, 3L, 30℃,pH7.5)에 따른 (A) 배지의 탁도, (B) D-글루코오스 농도, 및 (C) DOI 생산량의 타임 코스(가로축은 글루코오스 첨가 후의 경과시간)를 나타내는 도면이다.

[도7] pLEX-btrC를 포함하는 대장균GI724(ΔpgiΔzwfΔpgm주의 배양(2×YT+5% D-글루코오스+0.5% 만니톨, 3L, 25℃, pH7)에 따른 (좌)균체 탁도, (중)배지 중의 D-글루코오스 농도, (우)DOI생산량의 타임 코스(가로축은 D-글루코오스 첨가 후의 경과시간)를 나타내는 도면이다.

[도8] pLEX-btrC를 포함하는 대장균GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(◆)와 pGAP-btrC/pGAD-btrC를 포함하는 대장균GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주(■)의 배양(2×YT+5% D-글루코오스+0.5% 만니톨, 3L, 25℃, pH6~7)에 따른 (좌)균체탁도, (중)배지중의 D-글루코오스 농도, (우)DOI생산량의 타임 코스(가로축은 D-글루코오스 첨가 후의 경과시간)를 나타내는 도면이다.

[도9] pLEX-btrC를 포함하는 대장균GI724 야생형주(◆)와 pLEX-btrC를 포함하는 대장균GI724Δrmf주(■)의 배양(2×YT+3% D-글루코오스, 10mL, 30℃, pH7)에 따른 (좌)균체탁도, (중)배지 중의 D-글루코오스 농도, (우)DOI생산량의 타임 코 스(가로축은 D-글루코오스 첨가 후의 경과시간)를 나타내는 도면이다.

[도10] 실시예 8의 방법으로 배양액을 이온교환수지에 흘려서 얻어지는 프랙션의 pH, 전도도, DOI농도를 플롯한 도면이다.

[도11] 실시예 8의 방법으로 정제하여 얻어지는 DOI의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

[도12] 실시예 9의 방법으로 배양액을 이온교환수지에 흘려서 얻어지는 프랙션의 pH, 전도도, DOI농도를 플롯한 도면이다.

[도13] 실시예 9의 방법으로 정제하여 얻어지는 DOI의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

[도14] 본 발명에 의한 2-디옥시실로이노소스의 정제방법의 제2의 태양원리를 나타내는 개략도이다.

[도15] 실시예 10의 방법으로 정제하여 얻어지는 DOI의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

[도16] 실시예 11의 방법으로 정제하여 얻어지는 DOI의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

[도17] 실시예 12의 방법으로 정제하여 얻어지는 DOI의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 다만, 본 발명은 이들 실시예에 그 기술범위가 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

<<DOI 합성효소유전자>>

당질환화효소(糖質環化酵素)유전자로는, 바실러스·서큘란스( Bacillus circulans)유래의 2-디옥시실로이노소스(DOI)합성효소의 42kDa 서브유닛을 코드하는 btrC유전자(특허문헌1, Genbank AB066276, 비특허문헌2 등 참조)를 사용하였다.

(실시예 2)

<<재조합 플라스미드 및 재조합주의 구축>>

<btrC유전자 및 pLEX-btrC>

btrC 유전자 전체 길이를 포함하는 플라스미드pDS4(비특허문헌3)을 주형으로 하여 서열번호1에 나타내는 프라이머1과 서열번호2에 나타내는 프라이머2를 사용하고, btrC 유전자의 PCR증폭에는, KOD폴리머라제(TOYOBO)를 사용하고, PCR의 반응 조건은 94℃×30초, 52℃×30초, 68℃×1분을 1사이클로 30사이클 행하였다. 이렇게 PCR증폭한 DNA단편을 Ndel과 XbaI로 소화하고, 이것을 벡터pLEX(lnvitrogen)의 멀티 클로닝사이트의 Ndel-XbaI부위에 삽입함으로써, pLEX-btrC를 구축하였다(도2A).

<pGAP-btrC/p-GAD-btrC>

gapA 프로모터 유전자는, 대장균의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호17에 나타내는 프라이머와 서열번호18에 나타내는 프라이머를 사용하고, PCR 증폭에 의해 합성하였다. 이 gapA 프로모터 유전자의 PCR증폭에는, KOD 폴리머라제를 사용하고, 이하의 반응 조건에서 행하고, gapA 프로모터 단편을 얻었다.

94℃×30초

50℃×30초

68℃×1분을 1사이클로 30사이클

gadA 프로모터 유전자는 대장균의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호19에 나타내는 프라이머와 서열번호20에 나타내는 프라이머를 사용하고, PCR 증폭에 의해 합성하였다. 이 gadA 프로모터 유전자의 PCR증폭은 KOD 폴리머라제를 사용하고, 이하의 반응 조건에서 행하여, gadA 프로모터 단편을 얻었다.

94℃×30초

52℃×30초

68℃×1분을 1사이클로 30사이클

aspA터미네이터 유전자는, aspA터미네이터 유전자를 포함하는 플라스미드pLEX(lnvitrogen)를 주형으로 서열번호21에 나타내는 프라이머와 서열번호22에 나타내는 프라이머를 사용하고, PCR 증폭에 의해 합성하였다. 이 aspA터미네이터 유전자의 PCR증폭은 KOD 폴리머라제(TOYOBO)를 사용하고, 이하의 반응 조건에서 행하여, aspA 터미네이터 단편을 얻었다.

94℃×30초

55℃×30초

68℃×1분을 1사이클로 30사이클

PCR 증폭한 gadA 프로모터 단편과, 상술한 btrC단편을 2×Ligation mix(TAKARA)를 사용하여, 16℃, 30분으로 반응시켰다. 이렇게 하여 얻은 Ligation산물을 주형으로 하여, 서열번호2에 나타내는 프라이머와 서열번호5에 나타내는 프라이머를 사용하고, KOD 폴리머라제를 사용한 이하의 조건의 PCR증폭을 행하여, 2개의 단편을 1개로 한 단편gadA-btrC단편을 얻었다.

94℃×30초

52℃×30초

68℃×1분을 1사이클로 30사이클

이 단편을 XbaI으로 소화한 것을 벡터pLEX(lnvitrogen)의 멀티 클로닝사이트의 XbaI부위에 삽입하였다.

이어서, 상기에서 증폭시킨 gapA 프로모터 단편과, btrC단편과, aspA터미네이터 단편을 2×Ligation mix를 사용하여, 16℃, 30분으로 반응시켰다. 이렇게 하여 얻은 Ligation산물을 주형으로 하여, 서열번호3에 나타내는 프라이머와 서열번호8에 나타내는 프라이머를 사용하고, KOD 폴리머라제를 사용한 이하의 조건의 PCR증폭을 행하여, 3개의 단편을 1개로 한 단편 gapA 프로모터-btrC-aspA터미네이터 단편을 얻었다.

94℃×30초

50℃×30초

68℃×1분을 1사이클로 30사이클

이 단편을 BamHI으로 소화한 것을, gadA-btrC를 삽입한 벡터 pLEX(lnvitrogen)의 멀티 클로닝사이트의 BamHI부위에 삽입함으로써, pGAP-btrC/pGAD-btrC를 구축하였다(도5).

(실시예 3)

<<숙주세포의 조제>>

유전자 파괴는 Gene Bridges사의 Quick and Easy BAC Modification Kit를 사용하고, 그 첨부 설명서의 방법에 근거하여 행하였다. pgi유전자의 단독파괴에 사용하는 카세트의 제작을 위하여 사용한 PCR프라이머 세트의 서열을 서열번호3과 서열번호4에 나타낸다. zwf유전자의 단독파괴에 사용하는 카세트의 증폭에 사용한 PCR프라이머 세트의 서열을 서열번호5와 서열번호6에 나타낸다. pgm유전자의 단독파괴에 사용하는 카세트의 제작을 위한 PCR프라이머 세트의 서열을 서열번호7, 서열번호8, 서열번호9 및 서열번호10에 나타낸다. pgi유전자와 zwf유전자의 2중 파괴주를 얻기 위해서, zwf유전자의 단독파괴주에 대하여, pgi유전자를 파괴하기 위한 카세트를 증폭하기 위해서 사용한 PCR프라이머 세트의 서열을 서열번호11과 서열번호12에 나타낸다. pgi유전자와 pgm유전자의 2중 파괴주를 얻기 위해서, pgi유전자의 단독파괴주에 대하여, pgm유전자를 파괴하기 위한 카세트를 증폭하기 위해서 사용한 PCR프라이머 세트의 서열을 서열번호7, 서열번호8, 서열번호9 및 서열번호10에 나타낸다. 또한, pgi유전자와 zwf유전자와 pgm유전자의 3중파괴주를 얻기 위해서, pgi유전자와 pgm유전자의 2중 파괴주에 대하여, zwf유전자를 파괴하기 위한 카세트를 증폭하기 위해서 사용한 PCR프라이머 세트의 서열을 서열번호5와 서열번호6에 나타낸다. 또한, rmf유전자의 파괴 카세트에 사용한 프라이머는 서열번호13, 서 열번호14, 서열번호15 및 서열번호16에 나타낸다.

Kit에 첨부되어 있는 대장균 내에서의 상동 재조합를 촉진하는 효소군을 코드하는 벡터, pSC101-BAD-gbaA-tetra를 숙주세포인 대장균주(GI724)에 도입하였다. 그 주를 3㎍/mL의 테트라싸이클린을 첨가한 LB배지에서 하룻밤 동안 배양을 행하였다. 전 배양균체를 3㎍/mL를 첨가한 LB배지에 1%농도로 식균(植菌)하고, 30℃에서 O.D.=0.2까지 배양하였다. 그 시점에서, 아라비노스를 마지막 농도 0.2%첨가하고, 또한 37℃에서 1시간 배양함으로써, 상동재조합의 촉진에 관여하는 효소군을 유도 발현하였다.

또한, 유전자 파괴용 카세트를 각각 형질전환하고, 타겟 유전자의 유전자 파괴를 유도하였다. 형질전환체를 클로르암페니콜, 네오마이신(가나마이신) 혹은 스트렙토마이신 혹은 그 2개 또는 3개를 함유하는 37℃의 LB배지에서 선택하므로써, 목적하는 유전자 파괴주(pgi유전자 파괴주(Δpgi주), zwf유전자 파괴주(Δzwf주), pgm유전자 파괴주(Δpgm주), pgi/zwf 2중 유전자 파괴주(ΔpgiΔzwf주), pgi/pgm2중 유전자 파괴주(ΔpgiΔpgm주) 및 pgi/zwf/pgm 3중 유전자 파괴주(ΔpgiΔzwfΔpgm주))를 얻었다. rmf 유전자 파괴주(Δrmf주)에 있어서는, 상기의 각종 파괴주에 대하여 rmf파괴주를 상기와 동일한 수법을 사용해서 얻었다. 이렇게 하여 얻은 야생형주 및 각 유전자 파괴주의 각종 단일탄소원에서의 생육 레벨을 표1에 나타낸다.

Δpgi주, Δzwf주 및 Δpgm주는 D-글루코오스를 탄소원으로서 사용할 수 있지만, D-글루코오스에 의한 생육 속도는 야생형주보다도 현저하게 늦어지게 되어, 균체에 의한 D-글루코오스의 소비가 억제되어진다고 생각되었다. 또한, ΔpgiΔzwf주, ΔpgiΔpgm주 및 ΔpgiΔzwfΔpgm주는 D-글루코오스를 단일탄소원으로 하여 생육하는 것이 대단히 곤란하기 때문에, 글루코오스-6-인산의 분해는 거의 완전히 억제되어 있는 것으로 생각되었다. 이 때문에 이들의 파괴주를 사용함으로써 야생형주보다도 DOI생산량 및 DOI변환 효율이 높아지는 것을 기대할 수 있다. 또한, 각 2중 유전자 파괴주 및 3중 유전자 파괴주는, 만니톨이나 글루코네이트 등의 비발효성 탄소원을 보조적으로 가함으로써 생육을 개선시키는 것이 가능하다(표 1). 또한, rmf유전자 파괴주에서의 탄소원에 대해서는, 글루코오스-6-인산 대사효소유전자를 파괴시키는 각종 파괴주와 동일한 생육 레벨을 나타냈다.

표 1

(식중, 「++」는 뛰어나게 잘 생육한 것을 나타내고,

「+」는 잘 생육한 것을 나타내고,

「+/-」는 조금 생육한 것을 나타내고,

「-」는 거의 생육하지 않을 것을 나타낸다.)

(실시예 4)

<<형질전환체>>

Gene Bridges사의 Kit의 첨부 설명서에 기재되어 있는 프로토콜에 따라, 상술한 바대로 얻은 pLEX-btrC에 의해 숙주대장균주(GI724)를 형질전환하고, 암피실 린을 포함하는 배지에서 선택하므로써 GI724/pLEX-btrC주를 얻었다. 또한, 동일하게 pGAP-btrC/pGAD-btrC를 숙주대장균주(GI724)로 형질전환하고, 암피실린을 포함하는 배지에서 선택하므로써, GI724/pGAP-btrC/pGAD-btrC주를 얻었다. 또한, GI724Δrmf, GI724Δpgi, GI724Δzwf, GI724Δpgm, GI724ΔpgiΔrmf, GI724ΔpgiΔzwf, GI724ΔpgiΔpgm 및 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm의 각 유전자 파괴주에 대해서도 동일하게 pGAP-btrC/pGAD-btrC를 형질전환하고, GI724Δrmf/pGAP-btrC/pGAD-btrC주, GI724Δpgi/pGAP-btrC/pGAD-btrC주, GI724Δzwf/pGAP-btrC/pGAD-btrC주, GI724Δpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC주, GI724ΔpgiΔrmf/pGAP-btrC/pGAD-btrC주, GI724ΔpgiΔzwf/pGAP-btrC/pGAD-btrC주, GI724ΔpgiΔpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC주나 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC주를 각각 얻었다.

(실시예 5)

<<DOI 합성효소의 발현의 확인>>

<GI724ΔPgi/pLEX-btrC주>

GI724Δpgi/pLEx-btrc주를 유도배지(6%인산수소나트륨, 3%인산이수소칼륨, 0.5%염화나트륨, 1%염화암모늄, 0.2%카자미노산, 0.5% D-글루코오스, 1mM염화마그네슘)에서, 30℃에서 0.D.600nm=0.7까지 배양한 후, 2×YT배지(대장균용 완전배지, 1.6%트립토판, 1%효모 엑기스, 0.5%염화나트륨)에 옮기고, 37℃에서 6시간 더 배양한 후, 균체를 회수하고, BtrC 단백질의 발현을 12%SDS폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 확인하였다. 그 결과를 도3A에 나타낸다. 2×YT배지에서 6시간 배양하므로써 BtrC가 대량발현하는 것이 확인되었다. 또한, 도3A의 각 레인은 이하와 같다.

레인M:

분자량 마커(상품명: 프레디션Plus프로테인 스탠다드(BIO-RAD사제, 카탈로그 번호:161-0374), 이하 동일함)

레인 1:

pLEX-btrC를 포함하는 GI724주를 최소영양배지(M9최소배지: 0.6%인산수소나트륨, 0.3%인산이수소칼륨, 0.05%염화나트륨, 0.1%염화암모늄)에서 6시간 배양해서 얻은 균체의 추출물(1×SDS Loding Buffer: 50mM Tris-HCl(pH6.8); 2%SDS; 0.1%Bromophenolblue; 10%Glycerol; 100mMDithiothreitol용액에서 추출, 이하 동일함)

레인2:

pLEX-btrC를 포함하는 GI724주를 트립토판을 첨가한 유도배지에서 6시간 배양한 균체의 추출물

레인3:

pLEX-btrC를 포함하는 GI724주를 트립토판을 첨가하지 않는 유도배지에서 6시간 배양한 균체의 추출물

레인4:

미강배지(조성: 20% 미강효소처리액)에서 2시간 배양한 균체의 추출물

레인5:

트립토판을 첨가한 2×YT배지에서 미강배지(조성:20%미강효소처리액)에서 6시간 배양한 균체의 추출물

2×YT배지를 사용했을 경우, 트립토판을 첨가하지 않아도 BtrC가 고발현하였다. 또한, 미강배지를 사용해서 배양한 균체에 있어서도, BtrC가 고발현하였다. 이것들로부터, 이들의 발현계를 사용하므로써 고가인 유도물질을 쓰지 않고 DOI 합성효소유전자의 고발현이 가능한 것이 나타내졌다.

<GI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC주>

GI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC주를 전배양배지(0.6%인산수소이나트륨, 0.3%인산이수소칼륨, 0.05%염화나트륨, 0.1%염화암모늄, 2%카자미노산, 1%글리세린, 1mM염화마그네슘)에서, 30℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 전(前)배양액을 본배양배지로 하여 2×YT배지(대장균용 완전배지; 1.6%트립톤, 1%효모 엑기스, 0.5%염화나트륨)에 1%식균하고, 또한 30℃에서 0.D.600nm=0.7까지 배양한 후, 균체를 회수하고, BtrC 단백질의 발현을 12%SDS폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 확인하였다. 그 결과를 도3B에 나타낸다. 또한, 도3B의 각레인은 이하와 같다.

레인1: 분자량 마커

레인2: 본배양 0시간 후에 채취한 균체 추출물

레인3: 본배양 12시간 후에 채취한 균체 추출물

레인4: 본배양 36시간 후에 채취한 균체 추출물

레인5: 본배양 72시간 후에 채취한 균체 추출물

도3B로부터, 2×YT배지에서 6시간 배양하는 것에 의해, BtrC가 대량발현하는 것이 확인되었다. 이 결과로부터, 이 발현계를 사용하므로써 고가인 유도 물질을 첨가하지 않고도 DOI 합성효소유전자의 고발현이 가능한 것이 나타났다.

(실시예 6)

<<DOI의 합성>>

<pLEX-btrC를 포함하는 GI24Δpgi주를 사용한 DOI의 합성>

GI724Δpgi/pLEX-btrC주를 300mL 삼각 플라스크에 넣은 35mL 전배양액(RMG배지, 0.6%인산수소나트륨, 0.3%인산이수소칼륨, 0.05%염화나트륨, 0.1%염화암모늄, 2%카자미노산, 1%글리세린, 1mM염화마그네슘)에 접종하고, 15시간 배양하였다. 이어서, 3리터의 2×YT배지를 넣은 10리터 배양조에 1%의 농도로 균체를 식균하였다. 이것을 배양 온도 30℃, 교반속도 300rpm, 공기 10L/분, pH7.7의 조건에서, 600nm의 0.D.가 0.7이 된 시점에서 D-글루코오스를 2% 또는 5% 농도로 첨가하고, 또한 48시간 배양을 행하였다. 소정의 시간에 있어서의 배양액으로부터 원심분리해서 균체를 제거하고, 배양 상등액 1을 회수하였다.

<pLEX-btrC를 포함하는 GI724ΔpgiΔzwf주를 사용한 DOI의 합성>

GI724ΔpgiΔzwf/pLEX-btrC주를 35mL의 1%만니톨을 포함하는 RMG배지(0.6%인산수소나트륨, 0.3%인산이수소칼륨, 0.05%염화나트륨, 0.1%염화암모늄, 2%카자미노산, 1%글리세린, 1mM염화마그네슘)에 식균하고, 하룻밤 전배양을 행하였다. 이어서, 3리터의 3%만니톨을 포함하는 2×YT배지(10리터 배양조내)에 1%의 농도로 균체를 식균하고, 30℃, 교반속도 300rpm, 공기10L/분, pH7.7의 조건에서, 배양하고, 600nm의 0.D.가 0.7이 된 시점에서 글루코오스를 3%농도로 첨가하고, 배양을 더 계속하였다. 소정시간에 배양액으로부터 원심분리에 의해 균체를 제거하고, 배양 상등액2를 회수하였다.

<pLEX-btrC를 포함하는 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주를 사용한 DOI의 합성>

pLEX-btrC를 포함하는 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주를 300mL삼각 플라스크에 50mL 전배양액(0.6%인산수소이나트륨, 0.3%인산이수소칼륨, 0.05%염화나트륨, 0.1%염화암모늄, 2%카자미노산, 1%글리세롤, 1mM염화마그네슘)에 접종하고, 15시간 배양하였다. 이 전배양액을 3L의 2×YT배지를 넣은 10L 배양조(마루비시바이오엔지사:MDL-6C형)에 1%식균하였다. 이것을 배양온도 25℃, 교반속도 300rpm, 유입공기 10L/분, pH7.0의 조건에서 배양을 행하고, O.D.600nm=0.7이 된 시점에서 D-글루코오스를 5%농도가 되도록 첨가하고, 72시간 더 배양을 행하였다. 소정의 시간에 있어서 배양액을 원심분리해서 균체를 제거하고, 배양 상등액3을 회수하였다.

<pGAP-btrC/pGAD-btrC를 포함하는 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주를 사용한 DOI의 합성>

pGAP-btrC/pGAD-btrC를 포함하는 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주를 300mL 삼각 플라스크에 50mL의 전배양액(0.6%인산수소이나트륨, 0.3%인산이수소칼륨, 0.05%염화나트륨, 0.1%염화암모늄, 2%카자미노산, 1%글리세롤, 1mM염화마그네슘)에 접종하고, 15시간 배양하였다. 이 전배양액을 3L의 2×YT배지를 넣은 10L 배양조에 1%식균하였다. 이것을 배양 온도 25℃, 교반속도 300rpm, 유입공기 10L/분, pH6.0의 조건에서 배양을 하고, O.D.600nm=0.7이 된 시점에서 D-글루코오스를 5%농도가 되도록 첨가하고, 또한 72시간 배양을 행하였다. 소정 시간에 배양액으로부터 원심분리해서 균체를 제거하고, 배양 상등액4를 회수하였다.

<pLEX-btrC를 포함하는 GI724Δrmf주를 사용한 DOI의 합성>

pLEX-btrC를 포함하는 GI724Δrmf주를 시험관에 3mL 전배양액(0.6%인산수소이나트륨, 0.3%인산이수소칼륨, 0.05%염화나트륨, 0.1%염화암모늄, 2%카자미노산, 1%글리세롤, 1mM염화마그네슘)에 접종하고, 15시간 배양하였다. 이 전배양액을 10mL의 2×YT배지를 넣은 L형 시험관에 1%식균하였다. 이것을 배양온도 30℃, 진탕 속도 160rpm, pH7.0의 조건에서 배양을 행하고, O.D.600nm=0.7이 된 시점에서 D-글루코오스를 3%농도가 되도록 첨가하고, 72시간 더 배양을 행하였다. 소정시간에 있어서의 배양액으로부터 원심분리해서 균체를 제거하고, 배양 상등액5를 회수하였다.

(실시예 7)

<<DOI생산량의 측정>>

<DOI의 옥심화>

배양 상청 중에 축적하는 DOI의 정량을 이하에 나타내는 순서대로 행하였다. 배양 상등액1 및 2에 대해서는, 각 시간에 있어서, 배양액을 채취하고, 상등액과 등량의 물, 상등액의 2배량의 메탄올 및 마지막 농도 1.5mg/mL의 o-(4-니트로벤질)히드록실아민(NBHA)을 가해 혼합하고, 60℃에서 1시간 인큐베이터하므로써 DOI의 옥심화를 유도하였다.

또한, 배양 상등액3, 4 및 5에 대해서는, 9배량의 멸균 증류수를 혼합하고, 또한 이 용액과 등량의 메탄올을 가한 후, 30mg/mL의 o-(4-니트로벤질)히드록실아민염산염(NBHA)을 가해 혼합하고, 60℃에서 1시간 인큐베이터하므로써 DOI의 옥심체를 유도하였다.

<DOI의 검출>

이렇게 하여 얻은 DOI옥심체에 대해서, Speep Vac System(Thermo사ISS110)으로 용매를 증발시킨 후, 옥심화 DOI를 적당량의 메탄올에 용해하고, 그 일부를 HPLC(고속액체 크로마토그래피)분석법으로 분석하고, DOI의 검출 및 정량을 행하였다. 고속액체 크로마토그래피로는 SHIMADZU사 LC-10AT, 컬럼은 Phrnomenex사 Luna 5u C18(컬럼길이 150mm, 컬럼내경 4.6mm)을 사용하고, 용리액으로서 20%메탄올을 사용하였다. 262nm에 있어서의 자외선흡수를 측정하였다. DOI의 0-(4-니트로벤질)옥심 유도체의 양을 표준 곡선법에 의해 정량하였다. 또한, 글루코오스의 정량은 Glucose assay procedure kit(Megazyme사 제조)를 사용하여 행하였다.

도4A 및 4B 도시한 바와 같이, HPLC분석에 있어서는, DOI의 옥심체에 상당하는 피크가 확인되었다. 또한, 도5 내지 7에 DOI생산량, 배지의 탁도 및 D-글루코오스 농도의 타임 코스를 나타낸다.

(참고예 1)

<pLEX-btrC를 포함하는 GI724Δpgi주를 사용한 DOI의 합성>

GI724Δpgi/pLEX-btrC주를 300mL 삼각 플라스크에 넣은 35mL의 전배양액(RMG배지: 0.6%인산수소나트륨, 0.3%인산이수소칼륨, 0.05%염화나트륨, 0.1%염화암모늄, 2%카자미노산, 1%글리세린, 1mM염화 마그네슘)에 접종하고, 15시간 배양하였다. 이어서, 3리터의 2×YT배지를 넣은 10리터 배양조에 1%의 농도로 균체를 식균하였다. 이것을 배양 온도 30℃, 교반속도 300rpm, 공기 10L/분, pH7.7의 조건에서, 600nm의 0.D.가 0.7이 된 시점에서 D-글루코오스를 2% 또는 5% 농도 첨가하고, 24시간 더 배양을 행하였다. 소정시간에 있어서의 배양액으로부터 원심분리해서 균체를 제거하고, 배양 상등액11을 회수하였다.

(참고예 2)

<pLEX-btrC를 포함하는 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주를 사용한 DOI의 합성>

pLEX-btrC를 포함하는 GI724ΔpgiΔzwfΔpgm주를 300mL 삼각 플라스크에 50mL의 전배양액(0.6%인산수소이나트륨, 0.3%인산이수소칼륨, 0.05%염화나트륨, 0.1%염화암모늄, 2%카자미노산, 1%글리세롤, 1mM염화마그네슘)에 접종하고, 15시간 배양하였다. 이 전배양액을 3L의 2×YT배지를 넣은 10L 배양조(마루비시바이오엔지사MDL-6C형)에 1%식균하였다. 이것을 배양 온도 25℃, 교반속도 300rpm, 유입공기 10L/분, pH7.0의 조건에서 배양을 행하고, O.D.600nm=0.7이 된 시점에서 D-글루코오스를 5%농도가 되도록 첨가하고, 72시간 더 배양을 행하였다. D-글루코오스 첨가 및 D-글루코오스 첨가 후의 배양액을 각각 회수하고, 이 배양액을 원심분리해서 균체를 제거하고, 각각 배양 상등액12 및 13을 회수하였다.

(참고예 3)

<pLEX-btrC를 포함하는 GI724야생형주를 사용한 DOI의 합성>

pLEX-btrC를 포함하는 GI724야생형주를, 3mL의 전배양액(0.6%인산수소이나트륨, 0.3%인산이수소칼륨, 0.05%염화나트륨, 0.1%염화암모늄, 2%카자미노산, 1%글리세롤, 1mM염화마그네슘)을 갖는 시험관에 접종하고, 15시간 배양하였다. 이 전배양액을 10mL의 2×YT배지를 넣은 L형시험관에 1%식균하였다. 이것을 배양 온도 30℃,진탕속도 160rpm, pH7.0의 조건에서 배양을 행하고, O.D.600nm=0.7이 된 시점에서 D-글루코오스를 3%농도가 되도록 첨가하고, 72시간 더 배양을 행하였다. 소정시간에 있어서 배양액으로부터 원심분리해서 균체를 제거하고, 배양 상등액14를 회수하였다.

(참고예 4)

상술한 바대로 얻은 배양 상등액11 내지 14 중에 축적하는 DOI의 정량을 이하에 나타내는 순서에 따라 행하였다.

배양 상등액11에 있어서는, 이 상등액과 등량의 물, 상등액의 2배량의 메탄올 및 마지막 농도 1.5mg/mL의 0-(4-2니트로벤질)히드록실아민(NBHA)을 가해 혼합하고, 60℃ 에서 1시간 인큐베이터하므로써 DOI의 옥심화를 유도하였다.

배양 상등액12, 13 및 14에 대해서는 이들 상등액에 대하여 9배량의 멸균 증류수를 섞고, 또한 이 용액과 등량의 메탄올을 가한 후, 30mg/mL의 o-(4-니트로벤질)히드록실아민염산염(NBHA)을 가해 혼합하고, 60℃에서 1시간 인큐베이터하므로써 DOI의 옥심체를 유도하였다.

상술한 바와 같이 유도체화한 배양 상등액11 내지 14에 유래하는 액을 Speep Vac System(Thermo사ISS110)에서 용매를 증발시킨 후, 옥심화 DOI를 적당량의 메탄올에 용해하고, 그 일부를 HPLC(고속액체 크로마토그래피)분석법으로 분석하고, DOI의 검출 및 정량을 행하였다. 고속액체 크로마토그래피에서는 SHIMADZU사 LC-9A, 컬럼은 Phrnomenex사 Luna 5u C18(컬럼길이 150mm, 컬럼내경 4.6mm)을 사용하고, 용리액으로서 20%메탄올을 사용하였다. 262nm에 있어서의 자외선흡수를 측정하 였다. DOI의 O-(4-니트로벤질)옥심 유도체의 양을 표준곡선법에 의해 정량하였다.

(실시예 8)

<앰버라이트IR120과 앰버라이트IRA410의 혼상식 컬럼을 사용하는 방법>

수소 이온형의 앰버라이트IR120과 아세트산 이온형의 앰버라이트IRA410을 각200mL씩 혼합한 후, 컬럼(φ5cm×25cm)에 충전하고, 컬럼을 pH2.96으로 조정한 참고예 1의 배양액 100mL(1.4g의 DOI를 포함한다)를 첨가한 후, 증류수를 유속 2mL/분에서 흘림으로써 용리를 행하였다. 6mL씩의 프랙션을 모으고, 얻어진 프랙션에 대해서 1개 마다 pH 및 전도도를 측정하였다. 또한, 3개 마다 DOI의 정량도 행하였다. DOI의 정량은 O-(4-니트로벤질)옥심으로 유도한 후, HPLC로 면적을 측정한 후, 검량선으로부터 계산하였다. 이 때의 결과를 도10에 나타낸다. 또한, 프랙션을 4개의 블럭으로 나누어 모아서 동결 건조한 후, 각각의 블록 중의 DOI의 순도 및 양을 측정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 얻어진 정제 DOI의 ¹³C-NMR스펙트럼을 도 11에 나타낸다. ¹³C-NMR스펙트럼은 중수(重水)에 용해한 시료를 Bruker사의 DPX-250NMR장치(¹³C핵은 67.5MHz에서 공명)를 사용해서 측정하였다.

(실시예 9)

<앰버라이트IR200과 앰버라이트IRA410의 혼상식 컬럼을 사용하는 방법>

수소 이온형의 앰버라이트IR200과 아세트산 이온형의 앰버라이트IRA410을 각200mL씩 혼합한 후, 컬럼(φ5cm×25cm)에 충전하였다. 이것에 pH2.97로 조정한 참고예 1의 배양액 50mL(562mg의 DOI를 포함한다)를 첨가한 후, 증류수를 유속 2mL/ 분으로 흘림으로써 용출을 행하였다. 6mL씩의 프랙션을 모으고, 얻어진 프랙션에 대해서 1개 마다 pH 및 전도도를 측정하였다. 또한, 3개 마다 DOI의 정량도 행하였다. 이 때의 결과를 도12에 나타낸다. 또한, 프랙션을 4개의 블럭으로 나누고 모아서 동결 건조한 후, 각각의 블록 중의 DOI의 순도 및 양을 측정하였다. 결과를 표 3에 나타낸다. 얻어진 정제 DOI의 ¹³C-NMR스펙트럼을 도 13에 나타낸다. DOI의 정량방법 및 ¹³C-NMR스펙트럼의 측정 방법은 실시예 8과 동일하게 행하였다.

표 2

표 3

(실시예 10)

<앰버라이트200CT와 앰버라이트IRA 96SB의 이상식 컬럼을 사용하는 방법>

DOI함유 배양액(DOI함유량: 22.1g/850mL)을 양이온교환수지 컬럼(앰버라이트200CT, 수소 이온형, 400mL)에 부하하고, 물로 용출시켰다. 용출액의 TLC분석에 의해 DOI가 포함되어 있는 분획을 음이온교환수지 컬럼(앰버라이트IRA96SB, 아세트산 이온형, 600mL)에 통액(通液)하고, 계속해서 물로 용출시켰다. 용출액의 TLC분석에 의해 DOI가 포함되어 있는 프랙션을 감압 농축하여, 도15의 ¹H-NMR에 나타내는 순도의 DOI가 20.8g 얻어졌다. 그 순도는 혼상식 컬럼에 의한 정제법의 경우와 거의 같은 정도였다. ¹H-NMR은 중수에 용해한 시료를 Bruker사의 DPX-250NMR장치를 사용해서 측정하였다.

(실시예 11)

<디메틸케탈 유도체로 변환해서 결정화·정제한 후, 2-디옥시실로이노소스를 복원하는 방법>

실시예 10의 정제 DOI(17.8g)를 메탄올(835mL)에 용해하고, 트리메톡시메탄(310mL), 토실산일수화물(2.12g)을 가해 3시간 교반한 후, 중조(30.6g)에 의해 반응액을 중화하고, 여과 후에 감압 농축을 행하였다. 잔사를 메탄올에 용해하고, 그 3배량의 실리카겔(C-200, 60g)을 가해서 감압 농축함으로써 DOI를 실리카겔 표면상에 흡착시켰다. 그 DOI를 흡착시킨 실리카겔을 아세트산에틸:메탄올=5:1로 작성한 실리카겔 컬럼에 충전하였다. 그 후, 아세트산 에틸:메탄올=5:1의 혼합 용매를 사용해 DOI를 용출시켰다. DOI가 포함되어 있는 용출액을 모아서 감압 농축하여, 디메틸케탈유도체(20.7g)를 얻었다. 계속해서, 메탄올을 25mL 가해서 녹인 용액에 클로로포름 100mL와 헥산 7.5mL를 가열하면서 가해서 냉각하여 석출하는 백색결정을 분리하여, 2-디옥시실로이노소스디메틸케탈 결정 9.1g을 얻었다. 도16에 나타내는 ¹H-NMR에 있어서, 불순물의 시그널은 검출되지 않았다.

디메틸케탈체의 결정(995mg)을 아세톤(22mL)에 녹이고, 토실산일수화 물(280mg)과 증류수(6mL)를 가해 5시간 교반하였다. TLC에 의해 원료의 소실을 확인 후, 감압 농축하였다. 물에 용해한 잔사를 음이온교환수지 컬럼(IRA96SB, 아세트산 이온형, 10mL)에 통액하고, 함유 분획을 농축하는 것에 의해 고도로 정제한 DOI(770mg)를 정량적으로 얻었다. 도17에 나타내는 ¹H-NMR에 있어서, 불순물의 시그널은 검출되지 않았다.

[기탁 미생물의 표시]

본 발명에 있어서, 사용되는 기탁 미생물의 표시는 이하와 같다.

Escherichia coli

GI724ΔpgiΔzwfΔpgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC

FERM AP-20809

1. 수령기관명: 일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁 센터

2. 수령일: 2006년 2월 24일

3. 수령번호: FERM AP-20809

Escherichia coli

GI724ΔrmfΔpgi/pLEX-btrC

FERM AP-20808

2. 수령일: 2006년 2월 24일

3. 수령번호: FERM AP-20808

[산업상사용가능성]

본 발명에 의해, 종래의 석유유래의 화학물질을 대신하고, 재생가능한 자원인 녹말 등의 바이오매스 유래의 원료를 사용하고, 발효에 의해 여러 가지 탄소 6원환 화합물의 제조를 위한 출발 원료가 되는 고순도 DOI를 제조하는 것이 가능해졌다.

이상, 본 발명의 적합한 실시형태에 따라 본 발명을 설명하였다. 여기에서는 특정한 구체예를 개시하여 본 발명을 설명했지만, 특허청구의 범위에 정의된 본 발명의 광범한 취지 및 범위로부터 일탈하는 일없이, 이들 구체예에 여러 가지 수정 및 변경을 가할 수 있는 것은 분명하다. 즉, 구체예의 상세 및 첨부의 도면에 의해 본 발명이 한정되는 것으로 해석하는 것은 아니다.

Claims

2-디옥시실로이노소스의 합성에 관여하는 유전자로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 발현카세트.
제1항에 있어서, 상기의 2-디옥시실로이노소스의 합성에 관여하는 유전자는 2-디옥시실로이노소스 합성효소인 것을 특징으로 하는 유전자 발현카세트.
제1항 또는 제2항에 기재된 유전자 발현카세트를 숙주세포에 도입해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제3항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균종 및 GILSP 유전자 재조합 미생물 리스트에 기재되어 있는 숙주세포(2006년 3월 현재의 것)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 숙주세포는 포스포글루코오스 이소머라제를 코드하는 pgi유전자, 글루코오스-6-인산 1-디히드로게나아제를 코드하는 zwf유전자, 포스포글루코뮤타아제를 코드하는 pgm유전자 및 정지상에 있어서의 단백질 합성의 수식을 담당하는 리보솜 수식 인자 단백질을 코드하는 rmf유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 유전자가 파괴된 숙주세포인 것을 특징으 로 하는 형질전환체.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체와, 탄소원을 접촉시키는 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 2-디옥시실로이노소스의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 탄소원은 D-글루코오스, 올리고당, 다당, 녹말, 셀룰로오즈, 미강 및 폐당밀 및 D-글루코오스를 얻는 것이 가능한 바이오매스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종류의 탄소원인 것을 특징으로 하는 2-디옥시실로이노소스의 제조방법.
제6항 또는 제7항에 기재된 2-디옥시실로이노소스의 제조방법에 의해 얻어진 것을 특징으로 하는 2-디옥시실로이노소스.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체와, 탄소원을 접촉시켜서 2-디옥시실로이노소스를 갖는 조성물을 얻는 공정과,

해당 조성물을 수소 이온형 강산성 양이온교환수지와 유기산 이온형 염기성음이온교환수지를 갖는 혼상식 또는 이상식 컬럼으로 처리하는 공정

을 갖는 것을 특징으로 하는 2-디옥시실로이노소스의 정제방법.
제9항에 있어서, 상기 유기산 이온형 염기성 음이온교환수지는 아세트산 이 온형 음이온교환수지인 것을 특징으로 하는 2-디옥시실로이노소스의 정제방법.
제9항 또는 제10항에 기재된 2-디옥시실로이노소스의 정제방법에 의해 얻은 것을 특징으로 하는 2-디옥시실로이노소스.
제11항에 기재된 2-디옥시실로이노소스를, 트리알콕시메탄과 반응시켜서 2-디옥시실로이노소스디알킬케탈을 얻는 공정과,

2-디옥시실로이노소스디알킬케탈을 산의 존재하에서 가수분해하는 공정

을 갖는 것을 특징으로 하는 2-디옥시실로이노소스의 정제방법.
제12항에 있어서, 상기 트리알콕시메탄은 트리메톡시메탄인 것을 특징으로 하는 2-디옥시실로이노소스의 정제방법.
제12항 또는 제13항에 기재된 2-디옥시실로이노소스의 정제방법에 의해 얻는 것을 특징으로 하는 2-디옥시실로이노소스.