KR20070121217A

KR20070121217A - 자가세포 파괴에 의해 야기되는 자가면역질환의 치료를위한 세포치료제 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20070121217A
Application number: KR1020060055991A
Authority: KR
Inventors: 남상윤; 도정수; 이상목; 하종천
Original assignee: 남상윤; 이상목
Priority date: 2006-06-21
Filing date: 2006-06-21
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2026-06-21
Also published as: KR100850416B1

Abstract

본 발명은 자기의 면역세포인 B세포를 사용하여 자기의 신체를 손상시키는 T세포의 분화를 조정함으로써 자가면역질환을 치료할 수 있는 세포치료제 제조 방법으로서,

(A) 자가면역질환 개체에서 B세포를 분리하는 B세포 분리단계; (B) 상기 분리된 자기의 B세포를 B세포의 증식을 유도하는 물질이 첨가된 배양액에 부유시킨 후 상기 자가면역질환을 유발하는 항원으로 자극하여 1차 배양하는 전배양단계; 및 (C) 상기 1차 배양된 B세포를 수거하여 B세포 증식인자가 첨가된 배양액에 부유시킨 후 상기 자가면역질환을 유발하는 항원으로 다시 자극하여 2차 배양하는 후배양단계;에 의해 배양된 B세포를 유효성분으로 함유하는, 자가면역질환의 치료를 위한 세포치료제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하여, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 류마치스관절염, 하시모토 갑상선염 등 자가면역성 질병에 대한, 부작용이 전혀 없고 장기간 지속되는 치료제를 제조할 수 있다

면역, 자기면역, 자기면역질환, B세포, T세포, 세포치료제

Description

자가세포 파괴에 의해 야기되는 자가면역질환의 치료를 위한 세포치료제 및 그 제조 방법 {Method for preparation of therapeutic B cells against autoimmune diseases which are induced by autoimmune cytotoxicity}

도 1 내지 도 3은 본 발명에 의하여 제조된 세포치료제를 처치하였을 때 EAE 증상이 나타나지 않음을 보여주는 도표이다.

도 4는 본 발명에 의해 제조된 세포치료제를 처치하였을 때 이미 발생된 EAE 증상이 사라짐(치료됨)을 보여주는 도표이다.

도 5는 본 발명에 의한 세포치료제를 처치하는 경우 T세포에 의한 Th1 형 사이토카인의 생성량이 대조구에 비해 현저히 저하되고 반대로 Th2형 사이토카인 생성량이 현저히 높아짐을 보여주는 도표이다.

도 6은 본 발명에 의한 B세포치료제를 처치하는 경우 질병의 유발에 직접적으로 관여하는 T세포의 기능이 변화되었음을 보여주는 도표이다.

도 7은 본 발명에 의한 세포치료제의 처치와 T세포의 기능 변화의 관련성을 보여주는 도표이다.

본 발명은 자기의 면역세포인 B세포를 사용하여 자기의 신체를 손상시키는 T세포의 분화를 조정함으로써 자가면역질환을 치료할 수 있는 세포치료제 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

(1) 면역계 및 B세포의 일반적 특성

면역(免疫; Immunity)은 생체 조직으로 침입하거나 주입되는 모든 외부 고분자물질(항원)에 대한 생체의 자기보호체계의 하나이다. 면역체계의 주요한 구성성분으로 림프구가 있는데, 이는 골수에서 만들어져서 혈액을 따라 림프 조직이나 기관, 주로 림프절·비장·편도 등으로 순환하는 백혈구다. B세포는 적절한 항원에 의해 자극되면 빠르게 증식하여, 그 항원을 중화시킬 특별한 항체(면역글로불린)를 만들어내는 클론을 형성한다. B세포가 생성하는 항체는 체액에서 순환하면서 체액성면역을 수행한다. T세포는 흉선에서 만들어져 림프 조직으로 이동하는데, 항원을 직접 공격하는 세포매개성면역을 담당한다.

(2) 면역계의 이상 및 자가면역 질환의 발생

모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있 다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다.

이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하면서 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병, 류마치스 관절염, 하시모토 갑상선염 등의 자가면역질환(自家免疫疾患)이 생긴다.

(3) 기존 자가면역 질환의 치료 방법

자가면역질환은 자기 세포에 대한 이상 반응으로 나타나는 질병이므로 치료는 주로 자기면역 기능을 억제하는 약물이 사용되고 있다. 그러나 부작용이 많아 지속적으로 사용하기 곤란하고 재발을 충분히 막지 못하여 치료에 한계가 있다. 다발성경화증의 경우 베타인터페론이 사용되고 있으나 부작용이 덜한 대신 치료비가 비싸고 평생동안 주사를 맞아야 하는 불편함이 있고 재발을 막는 효과가 미미 하다. 또한 CD40 리간드에 항체 투여 등으로 세포간의 상호작용을 억제하는 방법이 사용되었으나 그다지 성공적이지 않다. 기타 여러 가지 면역요법들이 있으나 아직 확실한 치료효능을 보이는 방법으로 인정된 사례는 없다.

(4) 면역계의 이상에 의한 자가면역 질환의 발생 기전: Th1/2 세포 아군의 기능

대식세포(macrophages), 수지상세포(dendritic cell), 랑게르한스 세 포(Langerhans' cell) 및 B세포 등과 같은 항원제시세포(antigen presenting cell: APC)로부터 항원을 제공받으면, 조력 T세포(helper T cell; Th)가 Th1세포(1 type helper T cell; 이하 약칭으로 "Th1") 또는 Th2세포(2 type helper T cell; 이하 약칭으로 "Th2")로 분화된다(1). 이때 분화의 방향은 항원의 양, 사이토카인 및 APC가 전달하는 신호 등 다양한 요인에 영향받는 것으로 판단되지만 아직도 그 기작이 완전히 밝혀지지 않고 있다(5, 6). Th1은 세포성 면역반응을 촉진하는 역할을, Th2는 체액성 면역반응을 촉진하는 역할을 한다(표 1 참조).

<표 1> T세포의 기능성 분류

세포의 종류	주요 기능
Th1세포	IFNγ 생산, 세포성면역 증진, 암세포 및 바이러스 감염세포 파괴
Th2세포	IL-4 생산, 체액성면역 증진, 항체 생산, 세포외 이물질 제거

일부 자가면역 질환은, 아직 해명되지 않은 어떤 이유로, 세포성 면역기능을 강화시키는 Th1세포로의 과도한 분화 또는 Th1세포 기능의 과도한 증진에 기인하는 것으로 밝혀졌다(4). 즉, 과도한 Th1의 반응에 따라 자기세포 파괴현상이 나타나고, 그 결과로 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염 등의 자가면역질환이 발병하게 되는 것이다. 한편, 과도한 Th2의 분화는 IgE 과잉 생산을 유발하여 과민 반응이나 천식 등의 질병을 일으키는 것으로 알려졌다(2, 3).

(5) Th1/2 세포 아군의 기능의 조절에 의한 자가면역 질환의 치료

이렇듯 Th1/Th2가 균형있게 분화되지 않을 때 많은 질병이 발생된다. 따라 서 이러한 자가면역질환의 치료를 위해서는 T세포가 Th1로 과분화되는 것을 억제함으로써 적절한 Th1/Th2 분화비율이 유지되도록 하는 것(T세포의 분화조절)이 필요하다. 이를 위하여 입수가 용이하고 효과적으로 T세포의 분화를 유도/제어할 수 있는 APC의 선발이 중요하다.

(6) 수지상 세포를 이용한 Th1/2 세포 기능의 조절

수지상세포(dendritic cell)는 T세포 분화반응을 유발하는 뛰어난 APC로 알려져 있다. 그러나 수지상세포는 말초혈액 중에 1% 미만으로 존재하기 때문에 이를 세포치료제의 제조에 필요한 정도의 양을 얻기 어려워 임상에 응용하기 매우 곤란하다. 또한 수지상 세포는 모든 항원을 T세포에 제시하므로 자기 항원에 대한 반응을 유도하는 등 부작용을 나타낼 가능성이 있다.

(7) B 세포를 이용한 Th1/2 세포 기능의 조절

한편, B세포는 항체 생산의 기능 외에도 수지상세포처럼 T세포에 대한 항원제시와 T세포의 분화를 조절하는 기능을 가지고 있음이 밝혀졌다(7~11). 자가면역질환에서 B세포가 질병 완화 효과를 나타낸다는 사실도 밝혀지고 있다. 즉, 관절염 모델에서 B세포는 IL-10 생산을 통하여 증상을 완화시키며(12), 다발성경화증 모델인 자가면역성 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis: EAE) 모델과(13) 자가면역성 당뇨병 모델에서도 B세포의 투여가 증상을 완화시킬 수 있음이 보고되었다(14).

(8) Th1/2 세포 기능의 조절을 위한 기존의 B세포의 응용 시도의 한계점

상기한 바와 같이 B세포가 Th1/2 세포의 기능을 조절할 수 있는 기능이 있다는 것이 이미 보고되어 있으나 B세포처리제의 임상 응용은 아직 현실화되지 않고 있는데, 그 이유는 다음과 같다.

① B세포처리제의 획득 방법의 용이성: 임상응용을 위해서는 많은 수의 세포를 얻는 것이 필요하므로 세포를 얻는 방법이 용이해야 한다. 일부 보고에서는 B세포를 T세포 존재 하에서 배양함으로써 얻을 수 있다고(11) 제시되어 있으나 T세포 존재 하에 T세포 분화를 조절할 수 있는 B세포를 얻는 것은 혼합배양 후 T세포를 제거해야 하는데 그 과정이 매우 까다롭고 B세포를 유실할 수 있다. 또한 T세포가 완전히 제거되지 않을 경우 혼입된 T세포가 증상을 더욱 악화시킬 가능성도 배제할 수 없다. 따라서 상기와 같은 방법을 임상에 응용하는 것은 매우 위험하다.

② B세포처리제의 대량 획득 방법: 임상응용을 위해서는 많은 수의 세포를 얻는 것이 중요하나 상기 보고들에서는 임상적으로 유효한 양의 B세포를 대량으로 획득하는 방법이 제시되지 않고 있다. 즉, 단순히 B세포의 효능만을 보고(12)하거나, B세포를 T세포 존재 하에서 배양함으로써 얻을 수 있는 것(11)으로 단순한 획득 방법만을 보고하고 있다. LPS를 사용하여 비특이적으로 활성화한 B림프구를 사용한 경우에는 체내의 모든 항원에 대한 반응에 영향을 줌으로써 부작용을 야기할 가능성이 있을 뿐만 아니라 그 효능도 매우 낮았다 (1천만개를 6회에 걸쳐 투여하였으나 증상 발현을 지연시킬 수 있을 뿐 완전히 억제하지는 못함)(14). 본 연구에 서는 배양 과정에서 다른 T세포 등 다른 세포를 사용하지 않으며 2회의 배양을 통하여 T세포의 Th1 반응 억제 기능이 증가할 뿐만 아니라 세포의 수를 1.5배씩 총 2.2배 이상으로 증식시킬 수 있다.

③ B세포처리제의 효능: B세포처리제의 임상응용을 위해서는 B세포처리제의 효능이 강력해야 하나 타 연구에서는 증세를 유발한 마우스에 B세포를 얻어 다른 마우스에 투여함으로써 증상을 치료하고자 한 경우에는 그 치료 효능이 매우 낮았다(13). 즉, 그 연구자들은 1천만개를 투여하였으나 증세가 대조군과 거의 비슷하게 유도된 후에 10일 이상 지속되었으며 본 발명의 방법으로 제조된 B세포는 5백만 개를 투여하여 증상을 완전히 억제할 수 있었다. 또한 반복 실험에 의해서도 4일간 1회 배양한 B세포들은 그 효능을 거의 관찰할 수 없었다 (도 1 참조). 또한 LPS를 사용하여 배양한 B림프구를 당뇨병 모델에서 치료를 이용한 경우에도 1천만개를 6회에 걸쳐 투여하였으나 증상 발현을 지연시킬 수 있을 뿐 완전히 억제하지는 못하였다(14).

상기한 바와 같이, B세포를 이용하여 자가면역 질환에 대한 치료 효능은 최근의 연구에서 확인되고 있으나 아직 임상에 응용할 만한 방법이 보고된 바는 없다. 본 발명이 기존 연구 보고 내용과 다르며 새로운 점은 다음 <표 2>와 같이 요약할 수 있다.

<표 2> 기존 연구 보고와 본 발명의 특징 비교

방법 내용	기존 연구 보고 내용 (문제점)	해당 참고문헌	본 발명 내용	차이점
세포치료제획득 방법	T세포와의 혼합배양	11	B세포 단독 배양	기존 방법은 임상 응용이 거의 불가능
세포치료제획득 방법	LPS를 사용한 비특이적 활성화	14	항원특이적 활성화	효능이 현저히 약하며 비특이적 T림프구 활성 조절 및 LPS 사용으로 인한 부작용 발생 가능
세포치료제 대량 획득방법	없음 (T세포와의 혼합배양으로는 대량 획득 곤란)	11, 12, 13	있음	B세포만을 2차 배양함으로서 가능)
세포치료제 효능	약함 (1천만개를 투여하였으나 증세가 대조군과 거의 비슷하게 유도된 후에 10일 이상 지속)	13	강함 (5백만 개로 완전 억제: 전혀 발생하지 않음)	1차 배양만으로는 효능이 미약하며 2차 배양에 의하여 효능을 극대화시킴

본 발명의 목적은 자기의 신체를 손상시키는 T세포 때문에 야기되는 자가면역질환을 자기의 면역세포인 B세포를 사용하여 T세포 기능을 조절함으로써 증상을 치료할 수 있는 세포치료제를 제조함과 임상 응용이 가능한 제조 방법을 발명함에 있다.

좀 더 상세하게는 세포파괴성 면역반응의 과잉에 의하여 야기되는 자가면역질환을 자기의 B세포로 치료하기 위하여 자가면역질환을 야기하는 항원에 대한 세포성 면역반응, 즉 Th1 세포의 기능을 억제할 수 있는 B세포를 함유하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 자기의 T세포가 자기 세포를 공격 하여 파괴함으로써 발생하는 자가면역질환에 대해, 자기의 또 다른 면역세포인 B세포를 사용하여 자가반응성 T세포의 분화를 조정함으로써 증상을 치료할 수 있는 세포치료제 및 그 제조 방법으로서, (A) B세포 분리단계, (B) 1차 배양인 전 배양 단계 및 (C) 2차 배양인 후 배양 단계로 이루어져 있다.

(A)단계인 B세포 분리단계는 자가면역질환이 나타난 개체에서 B세포를 분리하는 과정으로서 일반적으로 널리 알려진 방법을 이용한다. 즉, 플라스틱 배양접시에 37℃에서 30분 이상 정치한 후 37℃ 배양액으로 헹굼으로써 비부착성 세포 (T세포)를 부분적으로 제거하고, 다시 37℃ 배양액을 가한 후 피펫팅하여 약한 부착성세포를 떼어냄으로써 남아 있는, 강한 부착성을 가진 대식세포와 과립구를 제거한다. 피펫팅하여 얻은 세포부유액을 모아 다시 B세포 이외의 T세포, NK세포, 과립구의 항원에 결합하는 항체를 작용시키고 그 항체와 결합하는 자성미세구슬 (magnetic microbead)를 작용시킨 후 자석 속에서 자유롭게 부유되는 B세포만을 추출하는 과정이다.

(B)단계인 1차 배양(전배양) 단계는 상기 분리된 자기의 B세포를 항원으로 자극하여 배양하는 단계이다. 이때 항원과 함께 B세포의 증식을 유도하는 물질이 첨가되어야 하며 항원은 자가면역질환에 따라 그 질환을 유발하는 항원을 사용하여 3일 이상 배양한다.

(C)단계인 2차 배양(후배양) 단계는 상기 1차 배양된 B세포를 수거하여 항원으로 다시 자극하여 배양하는 단계이다. 이때에는 자가면역질환을 유발하는 항원과 함께 B세포 증식인자가 첨가되어야 하며 2일 이상 배양한다. 이 과정은 본 발명의 핵심으로써 2차 배양을 통하여 자가세포 파괴성 T세포의 기능을 완화시키는 B세포의 기능이 강력하게 유도되는 과정이다. 이와 같은 B세포의 기능은 본 발명의 방법으로 제조된 B세포가 세포 파괴성 T세포의 기능을 완화시키는 사이토카인 생산을 크게 증가시키며 (IL-10의 경우 16배 증가), 반면에 세포 파괴성 T세포의 기능을 증강시키는 사이토카인 생산은 크게 감소시키기 (IFNγ의 경우 50배 감소) 때문으로 판단된다.

본 발명에서 상기 B세포의 증식을 유도하는 물질은 자가면역질환을 유도하는 특이 항원 외에 B세포의 비특이적인 활성화물질을 의미하는 것으로서 B세포 마이토젠이라고도 한다. 이들의 예로는, anti-CD40, LPS(lipopolysaccharide), PWM(pokweed mitogen), 항 인간 immunoglobuline 항체 등이 있다. 어떤 마이토젠을 사용할 것인가는 개체의 종류(species) 및 질환에 따라 적절하게 정할 수 있다.

본 발명에서 상기 B세포 증식인자는 IL-2 및 IL-4 등을 혼합하여 사용한다.

본 발명에 의한 세포치료제는, 하기 실시예에서 확인되는 바와 같이, 유효성분인 두 단계로 배양된 B세포가 Th1형 T세포의 기능을 Th2형으로 전환시킴(Th1 기능이 억제되고 Th2 기능이 활성화)으로써 자가면역질환을 치료하는 기능을 가진다.

본 발명에 의하면, B세포를 자가면역질환 개체(환자)로부터 추출하여 B세포의 증식인자인 IL-2와 IL-4를 가하고 표적이 되는 항원을 가하여 2단계로 배양함으로써 B세포 스스로 1형 T림프구의 기능을 2형으로 전환시키는 기능을 가진 B세포(B2)로 분화될 수 있다. 일반적으로 활성화 되지 않은 B림프구와 1차 전배양된 B세포(B1)는 T세포의 1형(Th1) 반응과 2형(Th2) 반응을 모두 유도하는, 단순한 항원제시세포(APC)로서의 역할을 수행한다 (표 1 참조). 그러나 2차 후배양을 거친 B세포(B2)는 T세포의 1형(Th1) 반응을 현저히 억제하고 2형(Th2) 반응을 강하게 증진시키는 T세포 반응 조절 기능을 발휘함이 본 출원의 발명자들에 의해 새롭게 발견되었다 (표 1 참조). 본 발명은 이러한 사실에 근거하고 있다. (도 5 참조) 본 발명의 방법으로 후배양을 거친 B세포가 Th2 반응만을 강하게 증진시키는 이유는 T세포의 Th1 반응을 억제하고 Th2 반응을 촉진하는 사이토카인 (IL-4, IL-6, IL-10)을 대량으로 생산하는 반면에 Th1 반응을 촉진하는 사이토카인(IFNγ) 생산은 억제되기 때문인 것으로 확인되고 있다 (표 3 참조).

<표 3> 2차 후배양에 의한 B세포 사이토카인 생산의 변화

B세포 활성화 방법	사이토카인 생산 (pg/ml)
B세포 활성화 방법	IL-4	IL-6	IL-10	IFNγ
1차 전배양	검출 안됨	420	337	161
1차 전배양 + 2차 후배양	1532	1072	1963	56

본 발명의 세포치료제의 적용대상이 되는 자가면역질환은 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병, 류마치스 관절염 또는 하시모토 갑상선염 등이 있는데, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, Th1 기능의 항진에 의한 자기세포가 파괴됨으로써 발생하는 모든 자가면역질환에 활용될 수 있을 것이다.

본 발명에서 상기 (A) B세포분리단계는, 자가면역질환을 가진 개체의 비장세 포 또는 혈액에서 분리된 단핵 백혈구를 배양액에 부유시키고 37℃에서 1시간 정치하여 부착성 세포(대식세포)를 제거하는 소단계와, 항 T세포 및 항 NK세포 항체를 부착시킨 자성 구슬-자성이용 세포분리법(Miltenyi, S.; Muller, W.; Weichel, W.Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 1990, 11 (2), 231-238.)으로 T세포 및 NK세포를 제거하는 소단계로 이루어질 수 있다.

비장세포 또는 단핵 백혈구에는 B세포 이외의 다양한 혈구가 존재하므로 이들을 제거할 필요가 있다. 예를 들면, 부착성을 가지는 대식세포는 세포부유액을 정치하여 분리하고, T세포나 NK세포는 이들과 특이적으로 결합하는 항체를 활용하여 제거한다. 이들 소단계는 다른 분리방법을 선택하거나, 그 순서가 바뀌어도 문제되지 않는다.

자가면역질환은 그 질환이 일어나는 조직 세포의 고분자(예컨데, 펩타이드나 당단백질 등)를 외래 항원으로 인식하는 면역체계의 발현에 의한다. 따라서 본 발명의 상기 (B) 전배양단계 및 (C) 후배양단계에서 말하는 "자가면역질환을 유발하는 항원"이란 자가면역질환의 대상조직 세포 유래의 항원으로서 증상 유발에 직접적인 원인이 되는 항원을 말한다.

본 발명은, 예컨대, 상기 (B) 전배양단계(1단계 배양)에서, 항원의 농도는 1~100 μg/ml, B세포의 농도는 0.5~5.0×10⁶ cells/ml, anti-CD40의 농도는 0.01~1.0 μg/ml, IL-2의 농도는 0.1-10 ng/ml, IL-4의 농도는 0.1-10 ng/ml이며, 배양온도는 37±2℃, 배양기간은 60~90시간이며, 바람직하게는 항원의 농도는 40~60 μg/ml(부착을 위한 incubation 농도), B세포의 농도는 0.8~1.2×10⁶ cells/ml, anti-CD40의 농도는 0.1~1.0 μg/ml, IL-2의 농도는 4~6 ng/ml, IL-4의 농도는 4~6 ng/ml, 배양온도는 37℃, 배양기간은 60~84시간이다. 또한 상기 (C) 후배양단계(2단계 배양)에서, 항원의 농도는 1~100 μg/ml, B세포의 농도는 1~10×10⁵ cells/ml, IL-2의 농도는 0.1-10 ng/ml, IL-4의 농도는 0.1-10 ng/ml이며, 배양온도는 37±2℃, 배양기간은 24~90시간이며, 바람직하게는 항원의 농도는 40~60 μg/ml, B세포의 농도는 4~6×10⁵ cells/ml, IL-2의 농도는 4~6 ng/ml, IL-4의 농도는 4~6 ng/ml, 배양온도는 37℃, 배양기간은 38~58시간인 것이다.

그러나 본 발명에서 상기 전배양단계 및 후배양단계는 B세포를 활성화시키는 단계이므로, 상기 배양조건이 필수적인 것은 아니며 대상 개체의 특성, 대상 질환의 종류, 분리된 B세포의 건강도나 양 등에 따라 적절한 조건에서 배양하는 것도 가능할 것이다.

본 발명에서 사용되는 배지는, B세포가 자랄 수 있는 통상의 기본배양액이나 사람 혈청, 우혈청 또는 무혈청 배양액일 수 있다.

본 발명에 의한 B세포를 유효성분으로 함유하는 자가면역질환의 치료를 위한 세포치료제에서, 상기 B세포는 필요에 따라 적절한 성분을 함유하는 수용액(예를 들면, 인산염 완충액, 통상의 주사제용 수용액 등)에 적절한 농도로 현탁될 수 있다. 또한 본 발명에 의한 세포치료제는 자가면역질환 개체의 종류 및 특성(체중, 나이, 건강도), 질환의 종류 및 특성(질환의 진행도 등) 등에 따라 적절하게 선택된 용량을 예컨데, 혈관주사 형태로 질환 개체에 투입할 수 있다.

자가면역질환 모델 마우스를 대상으로 한 하기 실시예에서 확인된 바와 같이, 본 발명에 의한 세포처리제를 처치한 경우 자가면역성 질병의 증상이 완전 억제될 뿐만 아니라, 이미 발병된 증상도 치료가 가능하게 된다.

이하 실시예를 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예에서는 자가면역성 뇌척수염이 유발된 마우스를 모델로 하여 실험을 진행하였으나, 본 발명의 기술적 사상과 실시예를 참조하면 다른 자가면역성질환에 대해서도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 당업자에게 당연할 것이다. 즉, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 설명하고자 하는 의도일 뿐이므로 이에 의해 본 발명이 "자가면역성 뇌척수염"에 대한 세포치료제에 한정되는 것이 아니다.

<실시예>

1. 본 발명에 의한 세포치료제의 제조

(1) 마우스의 면역 유도

올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)는 신경계를 구성하는 세포의 일종으로서 중추신경계와 말초신경계에서 신경섬유축색을 감싸는 뉴런의 수초(myelin sheath) 생산에 중요한 역할을 하는 세포이다. 자가면역성 뇌척수염은 상기 올리고덴드로사이트의 당단백질(MOG_35-55: myelin oligodendrocyte glycoprotein)이 외래 항원으로 인식되는 결과로 발생한다.

MOG_35-55와 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 면역보조제로서 CFA(complete Freund's adjuvant)를 동량으로 혼합한 혼합물 100 μg을 C57BL/6 암컷 마우스 복강에 주사하여 MOG_35-55 를 인식하는 B세포의 활성화와 증식을 유도하였다.

(2) B세포의 준비 및 B2세포의 활성화를 위한 2회 반복 배양

이하에서 "B2세포"란 "2회 반복 배양된 B세포"를 의미한다.

① B세포의 분리

면역 10일 " 후에 마우스 비장세포를 분리하여 세포 배양액에 부유시킨 후 37℃에서 1시간 정치하여 부착성 세포(대식세포)를 배양기면에 부착시키고 부유액을 분리하였다(대식세포 제거). 분리된 부유액을 다시 항T세포-항체 및 항NK세포-항체가 부착된 자성구슬(magnetic bead)(MAC®microbeads, Miltenyi Biotec GmbH, Germany)과 혼합하여 잔류하는 T세포와 NK세포가 자성구슬에 결합되게 한 다음 자 성을 이용한 세포분리 장치(MACS, 위와 동일회사 제품)를 사용하여 T세포 및 NK세포를 제거함으로써 항MOG_35-55 B세포를 순수 분리하였다.(Miltenyi, S.; Muller, W.; Weichel, W.Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 1990, 11 (2), 231-238.)

② B세포의 전배양

50μg/ml 농도의 항원 MOG₃₅ _-55를 48 well plate의 well에 부착시킨 후 1×10⁶ cells/ml의 농도로 부유시킨 B세포를 가하고 3일간 배양한다. 이때 anti-CD40 (0.5 μg/ml) 및 IL-2 (5 ng/ml)및 IL-4 (5 ng/ml)를 첨가한다.

③ B세포의 후배양(반복배양)

전배양한 B세포를 수거하여 세포배양액으로 2회 세척한 후, 위와 같은 방법으로 50 μg/ml 농도의 항원 MOG₃₅ _-55가 부착된 microplate에 5×10⁵ cells/ml의 농도로 가하고 2일 동안 추가로 배양한다. 이때 IL-2 (5 ng/ml) 및 IL-4 (5 ng/ml)를 배양액에 첨가한다.

활성이 유도된 B세포를 수거하여 인산염완충액(PBS)으로 2회 원심세척한 후 5×10⁵ cells/ml의 농도로 PBS에 현탁하여 보관하면서 본 발명에 의한 "세포치료제"로 사용하였다.

2. 질환 모델 마우스의 제작(마우스의 EAE 유도)

마우스에 자가면역성 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis: EAE)을 유발시켜 모델 마우스를 제작하였다.

자가면역성 뇌척수염의 항원인 MOG₃₅ _-55(1.5 mg/ml)과 결핵균(4 mg/ml)을 CFA와 혼합하여 항원액으로 하였다. 별도로 백일해균 독소액(4 μg/ml)을 준비하였다. 용매는 PBS로 하였다.

1일차 및 2일차에 각각 항원액 100 μl씩을 C57BL/6 암컷 마우스의 양쪽 옆구리에 피하주사, 백일해균 독소액 0.1ml를 복강주사하여 EAE를 유도하였다.

3. 본 발명에 의한 세포치료제의 효과 확인

EAE 유도 개시 1시간 또는 제14일 경과 후 본발명에 의한 치료제 소정량을 EAE 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 주입하였다(B2세포의 양자 도입).

EAE 마우스를 매일 표 4에 의한 판정기준에 따라 육안관찰하여 질병의 증상을 분석하는 방법으로 본 발명에 의한 세포치료제를 처치하여 치료효과를 확인하였다.

<표 4>

판정	증상
0	증상 없음 (no abnormality)
1	꼬리가 쇠약해지거나 축 늘어짐 (flaccid tail)
2	뒷다리가 약해짐 (hind limb weakness)
3	뒷다리가 마비됨 (complete hind limb paralysis)
4	앞다리와 뒷다리가 마비됨 (quadriplegia, moribund state)
5	시험동물의 사망 (death)

이하의 실험에서 각각의 실험구의 데이터는 6마리의 마우스의 평균값이다.

(1) EAE 유도와 동시 세포처리제 처치의 효과

마우스에 EAE를 유도 개시한 1시간 후에 하기 표 5에 의한 B세포를 각각 7.5×10⁶ 처치하고, 시간경과에 따른 질병의 증상을 확인하였다(도 1).

<표 5>

실험구	처치된 B세포의 종류
Control	처치 안함
Fresh B	비장에서 분리된 B세포
B1	전배양까지만 거친 B세포
B2	본 발명에 의한 세포처리제

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의한 세포처리제를 처치(B2세포 양자 도입)한 B2구는 EAE의 유발이 완전 억제되었다. 그러나 비장에서 분리된 B세포 처치구(Fresh B) 및 전배양만 거친 B세포 처치구(B1)은 EAE 억제효과가 거의 없이 무처리구와 동일한 결과를 나타내었다.

(2) 적정 처치량(dosage)의 확인

본 발명에 의한 세포처리제에서 적절한 B2세포 처치농도를 조사하였다. 마우스에 EAE를 유도 개시한 1시간 후에 소정의 B세포를 각각 2.5×10⁶, 5.0×10⁶ 및 7.5×10⁶ 처치하고, 시간경과에 따른 질병의 증상을 확인하였다(도 2).

그 결과, 5.0×10⁶ 이상의 B2세포 처치로 EAE의 억제가 충분한 것으로 확인되었다. 따라서 이하의 실험에서는 B2세포를 5.0×10⁶ 씩 처치하는 것으로 하였다.

그러나 이 처치량은 마우스 EAE 모델에만 해당하는 것이므로 자가면역질환의 종류 및 특성(질환의 진행도 등), 질환 개체의 종류 및 특성(체중, 나이, 건강도) 등에 따라 달라질 것이다.

(3) 치료 후 항원 재투여시 본 발명에 의한 세포처리제의 효과 확인

본 발명에 의한 B2세포 함유 세포처리제를 처리하여 증상을 완화시킨 후에 시간을 두고 항원에 다시 노출되었을 때 효과가 나타나는지를 확인하여 도 3에 나타내었다.

도시된 바와 같이, 양자도입에 의해 증상 유발이 억제된 마우스에 제50일 경과후에 항원을 재면역시킨 경우에도 재발이 현저히 억제되었다. 즉, B2세포에 의한 증상 억제 효과가 매우 장시간 지속될 수 있음을 확인하였다. 도 3은 1차 처리한 대조구(Control)와 처리구(B2-tx)를 제 50일에 모두 다시 항원으로 면역하여 증상을 재 유도한 결과를 보여준다.

(4) 기 발병 EAE 치료효과의 확인

본 발명에 의한 세포치료제의 처치(B2세포의 양자도입)하는 것에 의해 이미 EAE가 발병된 마우스를 치료할 수 있는가를 확인하였다.

마우스에 EAE를 유도하면 도 1 및 도 2에서 볼 수 있듯이 유도(항원처리) 후 10일 정도가 경과하면 EAE 증상이 나타나기 시작한다. 따라서 항원처리 14일이 경과하여 EAE 증상이 확실하게 나타난 질환 마우스에 본 발명에 의한 세포처리제를 처치하였다(도 4).

도시되었듯이, EAE 증상이 개시된 이후에 본 발명에 의한 세포처리제를 처치한 경우, 약 10일 경과되면서 증상의 억제(치료)효과가 명확하게 나타남을 알 수 있다.

4. 본 발명에 의한 세포치료제의 작용기전 분석

(1) B2세포에 의한 T세포의 Th2 편향화(polarization) 확인; in vitro

본 발명에 의한 세포처리제가 어떠한 기전으로 EAE 증상을 완화/치료하는지를 in vitro 실험으로 확인하였다.

EAE 유도 및 B2세포 동시처리 10일(도 5) 및 50일(도 6) 경과 후에 마우스의 비장세포를 채취하여 in vitro에서 동일항원(MOG_35-55)으로 3일간 자극 배양한 결과 Th2형 사이토카인인 IL-4, IL-6, IL-10의 생성량이 Th1 형 사이토카인인 IFNγ의 생성량에 비해 현저히 높음을 확인하였다(도 5 및 도 6).

이는 본 발명에 의한 세포처리제(B2세포)가 처치되면 T세포가 Th2 쪽으로 편향분화된다는 사실 즉, B2세포의 양자도입은 질환 개체의 T세포 분화를 조절하여 Th2 반응으로 유도함으로써 자기면역질환에 대한 치료효과를 나타냄을 보여주는 것이다. 또한 이러한 편향분화 효과는 B2세포 주입 후 50일 이상 지속될 수 있음을 알 수 있다.

(2) B2세포에 의한 T세포의 Th2 편향화(polarization) 확인; in vivo

전술한 편향분화에 의한 질환치료 효과가 생체 내(in vivo)에서도 나타나는지를 확인하였다.

EAE 유도 및 B2세포 동시처리 50일 후에 대조구(질병이 발현된 무처리구)과 B2세포를 양자 도입시킨 실험구(증상 없음)에서 T세포만을 각각 분리하였다(양자도입된 B2세포는 제거됨). 분리된 T세포를 각각 정상 마우스에 투여하고 동시에 항원면역(EAE 유도)시키고 시간경과에 따른 증상을 분석하였다(도 7). 대조구와 실험구의 정보는 하기 표 6과 같다.

<표 6>

	T세포의 출처	T세포 처치 대상	T세포 처리량
Control T (2.5×10⁶)	50일 전에 EAE 유도된 (∴질병 발현된) 대조구	막 EAE 유도된 마우스	2.5×10⁶
B2-tx T (2.5×10⁶)	50일 전에 EAE 유도와 동시에 B2세포 처리된 (∴증상 없는) 실험구	위와 같음	2.5×10⁶
B2-tx T (5.0×10⁶)	위와 같음	위와 같음	(5.0×10⁶)

도에서 확인되듯이, 대조군 마우스의 T세포를 양자 도입시킨 경우(Control T) 급격히 증상이 나타나 21일 후에 모두 사망하였으나 B2세포를 주입하여 증상이 나타나지 않은 마우스의 T세포를 양자 도입시킨 경우(B2-tx T)에는 증상이 미미하였다. 이는 본 발명에 의한 세포처리제의 처치(B2세포의 양자도입) 결과 생체 내에서 T세포가 Th2로 편향화되며, B2세포의 양자도입에 따른 자가면역질환의 치료효과는 T세포의 기능 변화에 의존함을 직접적으로 보여주는 증거이다.

(참고문헌)

1. Mosmann, T.R.; Coffman, R.L. TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol. 1989, 7 145-173.

2. Spellberg, B.; Edwards, J.E., Jr. Type1/Type 2 immunity in infectious diseases. Clin Infect Dis. 2001, 32, 76-102.

3. Romagnani, S. Th1 and Th2 in human diseases. Clin Immunol Immunopathol. 1996, 80 (3 Pt 1), 225-235.

4. Moss, R.B.; Moll, T.; El-Kalay, M.; Kohne, C.; Soo Hoo, W.; Encinas, J.Carlo, D.J. Th1/Th2 cells in inflammatory disease states: therapeutic implications. Expert Opin Biol Ther. 2004, 4, 1887-1896.

5. Del Prete, G.; Maggi, E.; Romagnani, S. Human Th1 and Th2 cells: functional properties, mechanisms of regulation, and role in disease. Lab Invest. 1994, 70, 299-306.

6. Szabo, S.J.; Sullivan, B.M.; Peng, S.L.; Glimcher, L.H. Molecular mechanisms regulating Th1 immune responses. Annu Rev Immunol. 2003, 21, 713-758.

7. Maldonado-Lopez, R.; Moser, M. Dendritic cell subsets and the regulation of Th1/Th2 responses. Semin Immunol. 2001, 13, 275-282.

8. Moser, M.; Murphy, K.M. Dendritic cell regulation of TH1-TH2 development. Nat Immunol. 2000, 1, 199-205.

9. Ron, Y., Sprent, J. T cell priming in vivo: a major role for B cells in presenting antigen to T cells in lymph nodes. J. Immunol. 1987, 138 2848-2856.

10. Yang, X., Brunham, R. C. Gene knockout B cell-deficient mice demonstrate that B cells play an important role in the initiation of T cell responses to Chlamydia trachomatis (mouse pneumonitis) lung infection. J Immunol. 1998, 161, 1439-1446.

11. Harris, D.P.; Haynes, L.; Sayles, P.C.; Duso, D.K.; Eaton, S.M.; Lepak, N.M.; Johnson, L.L.; Swain, S.L.; Lund, F.E. Reciprocal regulation of polarized cytokine production by effector B and T cells. Nat Immunol. 2000, 1, 475-482.

12. Mauri, C.; Gray, D.; Mushtaq, N.; Londei, M. Prevention of arthritis by interleukin 10-producing B cells. J Exp Med. 2003, 197, 489-501.

13. Fillatreau, S.; Sweenie, C.H.; McGeachy, M.J.; Gray, D.Anderton, S.M. B cells regulate autoimmunity by provision of IL-10. Nat Immunol. 2002, 3, 944-950.

14. Tian, J.; Zekzer, D.; Hanssen, L.; Lu, Y.; Olcott, A.; Kaufman, D.L. Lipopolysaccharide-activated B cells down-regulate Th1 immunity and prevent autoimmune diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 2001, 167, 1081-1089

본 발명에 의하여, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 류마치스관절염, 하시모토 갑상선염 등 자기의 T세포에 의해 야기되는 자가면역성 질병에 대하여, 부작용이 전혀 없고 장기간 지속되는 치료효과를 얻을 수 있게 된다. 본 발명에 의한 세포처리제는 다른 항원에 대한 면역반응에는 전혀 영향을 주지 않으며 자기의 세포를 이용하므로 부작용이 전혀 없는 치료제로 활용될 수 있다.

Claims

(A) 자가면역질환 개체에서 B세포를 분리하는 B세포 분리단계; (B) 상기 분리된 자기의 B세포를 B세포의 증식을 유도하는 물질이 첨가된 배양액에 부유시킨 후 자가면역질환을 유발하는 항원으로 자극하여 1차 배양하는 전배양단계; 및 (C) 상기 1차 배양된 B세포를 수거하여 B세포 증식인자가 첨가된 배양액에 부유시킨 후 상기 자가면역질환을 유발하는 항원으로 다시 자극하여 2차 배양하는 후배양단계;에 의해 배양된 B세포를 유효성분으로 함유하는, 자가면역질환의 치료를 위한 세포치료제의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 자가면역질환은 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 류마치스 관절염 또는 하시모토 갑상선염인 것을 특징으로 하는 자가면역질환의 치료를 위한 세포치료제의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (B) 1차 배양인 전배양 단계에는, 항원과 함께 anti-CD40, IL-2, IL-4를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 자가면역질환의 치료를 위한 세포치료제의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (C) 2차 배양인 후배양단계에는, 항원과 함께 IL-2, IL-4를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 자가면역질환의 치료를 위한 세포치료제의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (B) 1단계 배양에서, 항원의 농도는 1~100 μg/ml, B세포의 농도는 0.5~5.0×10⁶ cells/ml, anti-CD40의 농도는 0.01~1.0 μg/ml, IL-2의 농도는 0.1-10 ng/ml, IL-4의 농도는 0.1-10 ng/ml이며, 배양온도는 37±2℃, 배양기간은 60~90시간이며,

상기 (C) 2단계 배양에서, 항원의 농도는 1~100 μg/ml, B세포의 농도는 1~10×10⁵ cells/ml, IL-2의 농도는 0.1-10 ng/ml, IL-4의 농도는 0.1-10 ng/ml이며, 배양온도는 37±2℃, 배양기간은 24~90시간인 것을 특징으로 하는, 자가면역질환의 치료를 위한 세포치료제의 제조방법.
제 1항 내지 제 5항에 따라 제조된 B세포를 유효성분으로 함유하는, 자가면역질환의 치료를 위한 세포치료제.