KR20070116900A - 라이아노딘 수용체 (ｒｙｒ２)에서의 누출을 표적화하는신규한 항부정맥 및 심부전 약물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 1,4-벤조티아제핀 중간체 및 유도체, 이의 합성 방법, 및 이의 분석방법을 제공한다. 또한 본 발명은 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 방지; 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방; 및 대상에서 심부전, 심방 세동, 또는 운동-유발성 심장 부정맥을 치료 또는 예방하기 위해 이러한 신규 화합물을 사용하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 RyR2와 FKBP12.6의 결합을 증강시키는 약제를 확인하는 방법, 및 이 방법으로 확인되는 약제들을 제공한다. 부가적으로, 본 발명은 심부전, 심방 세동, 또는 운동-유발성 심장 부정맥을 치료 또는 예방하는 방법, 및 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는 방법에서 사용하기 위한 약제를 확인하는 방법을 제공한다. 또한 이러한 방법으로 확인되는 약제를 제공한다.

JTV-519, 1,4-벤조티아제핀 유도체, RyR2-결합 FKBP12.6, 심장 부정맥, 심부전, 운동-유발성의 심장성 돌연사

Description

라이아노딘 수용체 (ＲＹＲ２)에서의 누출을 표적화하는 신규한 항부정맥 및 심부전 약물{NOVEL ANTI-ARRYTHMIC AND HEART FAILURE DRUGS THAT TARGET THE LEAK IN THE RYANODINE RECEPTOR (RYR2)}

관련 출원과의 상호 참조

본 발명은 2005년 3월 23일자로 출원된 미국 분할 출원 연속 번호 (아직 부여받지 않음)의 이득을 청구하는데; 상기 특허 출원은 2004년 1월 22일자로 출원된 미국 일부 계속 출원 제10/763,498호의 이득을 청구하고; 상기 특허 출원은 2003년 10월 7일자로 출원된 미국 일부 계속 출원 제10/680,988호의 이득을 청구하고; 상기 특허 출원은 2003년 6월 26일자로 출원된 미국 일부 계속 출원 제10/608,723호의 이득을 청구하고; 상기 특허 출원은 2002년 11월 5일자로 출원된 미국 일부 계속 출원 제10/288,606호의 이득을 청구하고; 상기 특허 출원은 2000년 5월 10일자로 출원되고 현재 2002년 12월 3일자로 허여된 미국 특허 제6,489, 125 B1호인 미국 일부 계속 출원 제09/568,474호의 이득을 청구하며; 이들의 내용은 본원에 참고로 포함된다.

정부의 권리에 대한 진술

본 발명은 NIH 승인 번호 PO1 HL 67849-01 하에 정부 지원으로 행해졌다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에서 소정 권리를 갖는다.

치료법에서의 진보에도 불구하고, 울혈성 심부전은 서방 국가에서 중요한 사망 원인으로 남아있다. 심부전은 미국에서만 500만의 개인에게 영향을 주며, ~50%의 5년 사망률을 그 특징으로 한다 (문헌[Levy et al., Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure. N. Engl.J.Med., 347: 1397-402,2002]). 심부전의 중요한 특질은 심근 수축성의 감소이다 (문헌[Gwathmey et al., Abnormal intracellular calcium handling in myocardium from patients with end-stage heart failure. Circ.Res., 61: 70-76, 1987]).

건강한 심근과, 다른 횡문근에 있어서, 라이아노딘 수용체 (ryanodine receptor, RyR)를 포함하는 근소포체 (sarcoplasmic reticulum, SR) 상의 칼슘 방출 통로는 근육 세포의 수축에의 활동 전위의 커플링 (즉, 흥분-수축 (excitation-contraction, EC) 커플링)을 용이하게 한다. 수축은 칼슘 (Ca^{2 +})이 SR로부터 주위 세포질 내로 방출될 때 시작된다. 심부전에서, 수축 이상은 부분적으로는 심장 활동 전위 (action potential, AP)가 수축의 유발을 허용하는 신호 전달계 (signaling cascade)에서의 변경으로부터 생긴다. 특히, 심부전에서, 전세포 Ca^{2 +} 과도 전류의 크기가 감소되며 (문헌[Beuckelmann et al., Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.Circ., 85: 1046-55, 1992]; 문헌[Gomez et al., Defective excitation-contraction coupling in experimental cardiac hypertrophy and heart failure. Science, 276: 800-06, 1997]), 그 지속 기간은 연장된다 (문헌[Beuckelmann et al., Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circ., 85: 1046-55, 1992]).

심부전의 일반적인 특징인 심장 부정맥은 질병과 연관된 대부분의 사망 원인이다. 인간에 있어서 가장 일반적인 심장 부정맥은 심방 세동 (atrial fibrillation, AF)으로, 이는 질병 및 사망의 주요 원인을 나타낸다 (문헌[Chugh et al., Epidemiology and natural history of atrial fibrillation: clinical implications. J. Am. Coll. Cardio., 37: 371-78,2001]; 문헌[Falk, R. H., Atrial fibrillation. N. Engl. J. Med., 344: 1067-78, 2001]). 그러나, 임상적 중요성에도 불구하고, AF의 치료상의 선택 사항은 부분적으로 이의 근본적인 분자적 기작이 불충분하게 알려져 있다는 사실로 인하여 제한되었다.

현재까지, 구조적인 리모델링 및 전기적인 리모델링은 지속성 빈맥을 수반하며 (문헌[Rensma et al., Length of excitation wave and susceptibility to reentrant atrial arrhythmias in normal conscious dogs. Circ. Res., 62: 395- 410, 1988]), 구조적인 리모델링 및 전기적인 리모델링은 심방 불응성의 단축, 불응성의 맥박수 관련 적응성의 상실 (문헌[Wijffels et al., atrial fibrillation begets atrial fibrillation: a study in awake chronically instrumented goats. Circulation, 92: 1954-68, 1995]; 문헌[Morillo et al., Chronic rapid atrial pacing: structural, functional, and electrophysiological characteristics of a new model of sustained atrial fibrillation. Circulation, 91: 1588-95, 1995]; 문헌[Elvan et al., Pacing-induced chronic atrial fibrillation impairs sinus node function in dogs: electrophysiological remodeling. Circulation, 94: 2953-60, 1996]; 및 문헌[Gaspo et al., Functional mechanisms underlying tachycardia-induced sustained atrial fibrillation in a chronic dog model. Circulation, 96: 4027-35, 1997]), 및 재진입 파소 (wavelet) 파장의 단축을 포함한다. 이러한 리모델링은 아마도 심방 세동의 발생, 유지 및 진행에서 중요하다.

이전의 연구들은 칼슘 처리가 심방 세동에서 전기적인 리모델링에서 역할을 하는 것으로 제안하고 있다 (문헌[Sun et al., Cellular mechanisms of atrial contractile dysfunction caused by sustained atrial tachycardia, Circulation, 98: 719-27, 1998]; 문헌[ Goette et al., Electrical remodeling in atrial fibrillation: time course and mechanisms. Circulation, 94: 2968-74, 1996]; 문헌[Daoud et al., Effect of verapamil and procainamide on atrial fibrillation-induced electrical remodeling in humans. Circulation, 96: 1542-50, 1997]; Yu et al., Tachycardia-induced change of atrial refractory period in humans: rate dependency and effects of antiarrhythmic drugs. Circulation, 97: 2331-37, 1998]; 문헌[Leistad et al., Atrial contractile dysfunction after short-term atrial fibrillation is reduced by verapamil but increased by BAY K8644. Circulation, 93: 1747-54, 1996]; 및 문헌[Tieleman et al., Verapamil reduces tachycardia-induced electrical remodeling of the atria. Circulation, 95: 1945-53, 1997]).

심장 질환이 있는 모든 환자 중 대략 50%는 치명적인 심장 부정맥으로 사망한다. 이러한 치명적 심장 부정맥은 흔히 사실상 심실 부정맥이다. 일부의 경우, 심장에서의 심실 부정맥은 급속하게 치명적일 수도 있으며, 이러한 현상은 "심장성 돌연사 (sudden cardiac death, SCD)"로 칭해진다. 치명적 심실 부정맥 (및 SCD)은 구조적 심장 질환이 있는 것으로 알려져 있지 않은, 그렇지 않을 경우 건강한 젊은 대상에서 또한 발병할 수도 있다. 실제로, 심실 부정맥은 그렇지 않을 경우 건강한 대상에서 돌연사의 가장 일반적인 원인이다.

카테콜아민성 다형 심실 빈맥 (catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, CPVT)은 구조적으로 정상인 심장을 갖는 대상에서의 유전성 장애이다. 이는 스트레스-유발성 심실 빈맥을 그 특징으로 하는데, 상기 심실 빈맥은 SCD를 야기할 수도 있는 치사성 부정맥이다. CPVT가 있는 대상에서, 육체적 활동 및/또는 스트레스는 양방향 및/또는 다형성 심실 빈맥을 유발하며 이는 탐지가능한 구조적 심장 질환의 부재 하에 SCD에 이른다 (문헌[Laitinen et al., Mutations of the cardiac ryanodine receptor (RyR2) gene in familial polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103: 485-90,2001]; 문헌[Leenhardt et al., Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children: a 7-year follow-up of 21 patients. Circulation, 91: 1512-19, 1995]; 문헌[Priori et al., Clinical and molecular characterization of patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 106: 69-74, 2002]; 문헌[Priori et al., Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103: 196-200,2001]; 문헌[Swan et al., Arrhythmic disorder mapped to chromosome 1q42-q43 causes malignant polymorphic ventricular tachycardia in structurally normal hearts.J. Am. Coll. Cardiol., 34: 2035-42, 1999]).

CPVT는 상염색체 우성인 방식으로 주로 유전된다. CPVT가 있는 대상은 운동을 할 때에는 심실 부정맥을 갖지만, 휴식하면 부정맥이 발병되지 않는다. 연관성 연구 및 직접적 서열 결정에 의해 CPVT가 있는 대상에서 염색체 1q42-q43 상의 인간 RyR2 유전자에서 돌연변이가 확인되었다 (문헌[Laitinen et al., Mutations of the cardiac ryanodine receptor (RyR2) gene in familial polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103: 485-90,2001]; 문헌[Priori et al., Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation, 103: 196-200,2001]; 문헌[Swan et al., Arrhythmic disorder mapped to chromosome 1q42-q43 causes malignant polymorphic ventricular tachycardia in structurally normal hearts. J. Am. Coll. Cardiol., 34: 2035-42, 1999]).

세 가지 유형의 라이아노딘 수용체가 존재하며, 이들 모두는 고도로 관련이 있는 Ca^{2 +} 통로이다. RyR1은 골격근에서 발견되며, RyR2는 심장에서 발견되고, RyR3은 뇌에 위치한다. 제2형 라이아노딘 수용체 (RyR2)가 심장 횡문근에서의 근육 수축과 EC 커플링에 필요한 주요 Ca^{2 +}-방출 통로이다.

RyR2 통로는 세포내 Ca^{2 +} 저장체를 방출하고, 그럼으로써 근육 수축을 유발하는 SR의 특수 영역 내의 밀집한 배열체 내로 패킹된다(packed) (문헌[Marx et al., Coupled gating between individual skeletal muscle Ca^{2 +} release channels (ryanodine receptors). Science, 281: 818-21, 1998]). EC 커플링 동안, 영위상 (phase zero)의 AP에서 심장 근육 세포 막의 탈분극은 전압 개폐형 (voltage gated) Ca^{2 +} 통로를 활성화시킨다. 다음에는, 상기 통로를 통한 Ca^{2 +} 유입에 의해, Ca²⁺-유도된 Ca^{2 +} 방출로 공지된 과정에서 RyR2를 통하여 SR로부터의 Ca^{2 +} 방출이 시작된다 (문헌[Fabiato, A., Calcium-induced release of calcium from the cardiac sarcoplasmic reticulum. Am. J. Physiol, 245: C1-C14, 1983]; 문헌[Nabauer et al., Regulation of calcium release is gated by calcium current, not gating charge, in cardiac myocytes. Science, 244: 800-03, 1989]). 이어서 RyR2-매개된, Ca^{2 +}-매개된 Ca^{2 +} 방출은 심장 근육 수축에 책임이 있는 수축성 단백질을 활성화시킨다.

RyR2는 4개의 12,000달톤의 FK506 결합 단백질 (FKBP), 구체적으로는 FKBP12.6 (칼스타빈 (calstabin))과 결부된 4개의 565,000달톤의 RyR2 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체이다. FKBP는 널리 발현되는 시스-트랜스 펩티딜-프롤릴 이소머라아제이며, 다양한 세포 기능의 역할을 한다 (문헌[Marks, A. R. , Cellular functions of immunophilins. Physiol.Rev., 76: 631-49, 1996]). FKBP12 단백질은 골격 라이아노딘 수용체인 RyR1 (문헌[Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77: 513-23, 1994]; 문헌[Jayaraman et al., FK506 binding protein associated with the calcium release channel (ryanodine receptor).J. Biol.Chem., 267: 9474-77, 1992]); 심장 라이아노딘 수용체인 RyR2 (문헌[Kaftan et al., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca (2+)- release channels from cardiac muscle. Circ. Res., 78: 990-97, 1996]); 제1형 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 수용체 (IP3R1)로 공지된 관련된 세포내 Ca^{2 +}-방출 통로 (문헌[Cameronet al., FKBP 12 binds the inositol 1,4, 5-trisphosphate receptor at leucine-proline (1400-1401) and anchors calcineurin to this FK506-like domain. J. Biol.Chem., 272: 27582-88, 1997]); 및 제I형 형질전환 성장 인자 베타 (transforming growth factor β, TGFβ) 수용체 (TβRI) (문헌[Chen et al., Mechanism of TGFbeta receptor inhibition by FKBP12. EMBO J., 16: 3866-76, 1997])에 단단하게 결합하여 이들의 기능을 조절한다. FKBP12.6은 RyR2 통로에 결합하며 (RyR2 서브유닛 당 1개의 분자), RyR2-통로 기능을 안정화시키며 (문헌[Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77: 513-23, 1994]), 이웃하는 RyR2 통로들 사이의 커플링된 개폐 (gating)를 용이하게 하며 (문헌[Marx et al., Coupled gating between individual skeletal muscle Ca^{2 +} release channels (ryanodine receptors). Science, 281: 818-21, 1998]), 그럼으로써 심장 주기의 휴식기 동안 이 통로의 이상 활성화를 방지한다.

단백질 키나아제 (PKA)에 의한 심장 RyR2의 인산화는 "대항 (fight) 또는 도주 (flight)" 응답의 중요한 부분이며, 상기 인산화는 주어진 트리거에 있어서 방출되는 Ca^{2 +}의 양을 증대시킴으로써 심장 EC-커플링 증진 (gain)을 증가시킨다 (문헌[Marks, A. R., Cardiac intracellular calcium release channels: role in heart failure. Circ. Res., 87: 8-11, 2000]). 이러한 신호 전달 경로는 스트레스에 응답하는 교감 신경계의 활성화가 스트레스 응답의 신진대사적 요구를 충족시키는 데 필요한 심박출량 증가로 이어지는 기작을 제공한다. 카테콜아민의 결합시, β1- 및 β2-아드레날린성 수용체가 자극성 G 단백질, Gα_S를 통하여 아데닐릴 사이클라아제를 활성화시킨다. 아데닐릴 사이클라아제는 세포내 사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP)의 수준을 증가시키며, 이는 cAMP-의존성 PKA를 활성화시킨다. RyR2의 PKA 인산화는 통로 복합체로부터의 칼스타빈2 (FKBP12.6)의 해리에 의해 통로의 개방 확률을 증가시킨다. 이는 다시 Ca^{2 +}-의존성 활성화에 대한 RyR2의 민감성을 증가시킨다 (문헌[Hain et al., Phosphorylation modulates the function of the calcium release channel of sarcoplasmic reticulum from cardiac muscle. J. Biol. Chem., 270: 2074-81, 1995]; 문헌[Valdivia et al., Rapid adaptation of cardiac ryanodine receptors: modulation by Mg^{2 +} and phosphorylation. Science, 267: 1997-2000, 1995]; 문헌[Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000]).

심부전 심장 (예를 들어, 심부전이 있는 환자 및 심부전의 동물 모델에서)은 만성적 교감 신경계 과항진 자극 (chronic hyperadrenergic stimulation)을 포함하는 비적응 응답 (maladaptive response)을 그 특징으로 한다 (문헌[Bristow et al., Decreased catecholamine sensitivity and beta-adrenergic-receptor density in failing human hearts. N. Engl. J. Med., 307: 205-11, 1982]). 심부전에서의 이러한 자극의 병원성에 대한 중대성은 베타-아드레날린 자극 및 좌심실 심근벽 긴장도 (myocardial wall stress)를 감소시키며, 심실 리모델링을 강력하게 반대가 되게 하는 치료 전략에 의해 지지된다 (문헌[Barbone et al., Comparison of right and left ventricular responses to left ventricular assist device support in patients with severe heart failure: a primary role of mechanical unloading underlying reverse remodeling. Circulation, 104: 670- 75, 2001]; 문헌[Eichhorn and Bristow, Medical therapy can improve the biological properties of the chronically failing heart. A new era in the treatment of heart failure. Circulation, 94: 2285-96, 1996]). 심부전에서, 만성 베타-아드레날린 자극은 심장에서 베타-아드레날린성 수용체의 활성화와 결부되며, 이는 G-단백질과의 커플링을 통하여 아데닐릴 사이클라아제를 활성화시키고 그럼으로써 세포내 cAMP의 농도를 증가시킨다. cAMP는 cAMP-의존성 PKA를 활성화시키며, 이는 RyR2의 과인산화를 유발하는 것으로 밝혀졌다. 이와 같이, 만성 심부전은 만성 교감 신경계 과항진 상태이며 (문헌[Chidsey et al., Augmentation of plasma norepinephrine response to exercise in patients with congestive heart failure. N. Engl. J. Med., 267: 650, 1962]) 이는 RyR2의 PKA 인산화를 포함하여 여러 병리학적 결과로 이어진다 (문헌[Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000]).

RyR2의 PKA 과인산화는 심부전에서 억제된 수축 기능 및 부정맥에 기여하는 요인으로 제안되었다 (문헌[Marks et al., Progression of heart failure: is protein kinase a hyperphosphorylation of the ryanodine receptor a contributing factor Circulation, 105: 272-75,2002]; 문헌[Marx et al., PKA phosphorylation dissociatesFKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000). 이러한 가설과 일관되게, 심부전에서의 RyR2의 PKA 과인산화가 심장 이식을 받은 심부전이 있는 환자 및 동물 모델 둘 모두에서 생체 내에서 입증되었다 (문헌[Antos et al., Dilated cardiomyopathy and sudden death resulting from constitutive activation of protein kinase A. Circ. Res., 89: 997-1004, 2001]; 문헌[Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000]; 문헌[Ono et al., Altered interaction of FKBP12.6 with ryanodine receptor as a cause of abnormal Ca^{2 +} release in heart failure. Cardiovasc. Res., 48: 323-31, 2000]; 문헌[Reiken et al., Beta-adrenergic receptor blockers restore cardiac calcium release channel (ryanodine receptor) structure and function in heart failure. Circulation, 104: 2843-48, 2001]; 문헌[Semsarian et al., The L-type calcium channel inhibitor diltiazem prevents cardiomyopathy in a mouse model. J. Clin. Invest., 109: 1013-20, 2002]; 문헌[Yano et al., Altered stoichiometry of FKBP12.6 versus ryanodine receptor as a cause of abnormal Ca^{2 +} leak through ryanodine receptor in heart failure. Circulation, 102: 2131-36, 2000]).

심부전 심장에서, PKA에 의한 RyR2의 과인산화는 RyR2 통로로부터의 조절 FKBP12.6 서브유닛의 해리를 유발한다 (문헌[Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000]). 이는 RyR2 통로의 생물물리학적 특성을 두드러지게 변화시킨다. 그러한 변화는 Ca^{2 +}-의존성 활성화에 대한 민감성 증가로 인한 개방 확률 (Po)의 증가 (문헌[Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77: 513-23, 1994]; 문헌[Kaftan et al., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca^{2 +}-release channels from cardiac muscle. Circ. Res., 78: 990-97, 1996]); 서브컨덕턴스 상태로 이어지는 통로의 불안정화; 및 결함성 EC 커플링 및 심장 기능 장애로 이어지는 통로의 커플링된 개폐의 손상 (문헌[Marx et al., Coupled gating between individual skeletal muscle Ca^{2 +} release channels (ryanodine receptors). Science, 281: 818-21, 1998])에 의해 입증된다. 이와 같이, PKA-과인산화 RyR2는 저수준의 Ca^{2 +}의 자극에 대하여 매우 민감하며, 이는 그 자신을 과인산화된 통로를 통한 SR Ca^{2 +} 누출로서 분명하게 보여주는 것이다.

심부전에서의 스트레스에 대한 비적응성 응답은 통로의 거대분자 복합체로부터의 FKBP12.6의 고갈로 이어진다. 이는 Ca^{2 +}-유도된 Ca^{2 +} 방출에 대한 RyR2의 민감성에 있어서 좌측으로 이동되게 하며, 이는 낮은 내지는 온화한 [Ca^{2 +}]에서 보다 큰 활성을 갖는 통로로 이어진다 (문헌[Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000]; 문헌[Yamamoto et al., Abnormal Ca^{2 +} release from cardiac sarcoplasmic reticulum in tachycardia-induced heart failure. Cardiovasc. Res., 44: 146-55, 1999]; 문헌[Yano et al., Altered stoichiometry of FKBP12.6 versus ryanodine receptor as a cause of abnormal Ca2+ leak through ryanodine receptor in heart failure. Circulation, 102: 2131-36, 2000]). 시간이 지남에 따라, RyR2를 통한 "누출"의 증가는 SR Ca^{2 +} 함량의 보다 낮은 수준으로의 재설정으로 이어지며, 이는 다시 EC 커플링 증진을 감소시키고 심장 수축성 손상에 기여한다 (문헌[Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000]).

특히 "누출성"인 RyR2 통로의 부차 집단은 심장 주기의 휴식기인 심장 이완기 동안 SR Ca^{2 +}를 방출할 수 있다. 이는 지연성 후탈분극 (delayed after-depolarization, DAD)으로 공지된 심근세포 막의 탈분극으로 이어지며, 이는 치명적 심실 부정맥을 일으키는 것으로 공지되어 있다 (문헌[Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise- induced sudden cardiac death. Cell, 113: 829-40, 2003]).

구조적으로 정상인 심장에 있어서, 유사한 현상이 연구 중일 수 있다. 구체적으로는, 운동 및 스트레스는 심장에서 베타-아드레날린성 수용체를 활성화시키는 카테콜아민의 방출을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 베타-아드레날린성 수용체의 활성화는 RyR2 통로의 과인산화에 이른다. 증거는 베타-아드레날린성 수용체의 활성화에 의해 생기는 RyR2의 과인산화가 심장 주기의 이완기에서 돌연변이 RyR2 통로가 개방될 가능성을 더 커지게 하여, 부정맥 가능성을 증가시킨다는 것을 또한 시사하고 있다.

심부전의 일반적인 특징인 심장 부정맥은 구조적으로 정상인 심장에서의 SR Ca²⁺ 누출과 결부된 것으로 공지되어 있다. 이러한 경우, 심실 빈맥의 유발 및 유지에 있어서의 가장 일반적인 기작은 비정상적 자율성이다. 유발성 부정맥으로 공지되어 있는 비정상적 자율성의 하나의 형태는 SR Ca^{2 +}의 비정상적인 방출과 결부되어 있으며, 이는 지연된 후탈분극 (delayed after-depolarization) 또는 DAD를 시작한다 (문헌[Fozzard, H. A. , Afterdepolarizations and triggered activity. Basic Res. Cardiol., 87: 105-13, 1992]; 문헌[Wit and Rosen, Pathophysiologic mechanisms of cardiac arrhythmias. Am.Heart. 1., 106: 798-811, 1983]). DAD는 심장 활동 전위의 재분극 후에 일어나는 심근세포에서의 비정상적 탈분극이다. DAD로 이어지는 비정상적 SR Ca^{2 +} 방출에 대한 분자적 근거는 충분히 설명되지 않았다. 그러나, DAD는 라이아노딘에 의해 차단되는 것으로 공지되어 있으며, 이는 RyR2가 상기의 비정상적인 Ca^{2 +} 방출의 병인에서 중요한 역할을 할 수도 있다는 증거를 제공하는 것이다 (문헌[Marban et al., Mechanisms of arrhythmogenic delayed and early afterdepolarizations in ferret ventricular muscle. J. Clin. Invest., 78: 1185- 92, 1986]; 문헌[Song and Belardinelli, ATP promotes development of afterdepolarizations and triggered activity in cardiac myocytes. Am. J. Physiol., 267: H2005-11, 1994]).

전술한 측면에서, RyR2 통로에서의 누출이 질환에 걸린 심장 및 구조적으로 정상인 심장 둘 모두에서 다수의 병적 상태와 결부되는 것이 명백하다. 따라서, RyR2에서의 누출을 복구하는 방법이 수백만의 환자에서의 심부전, 심장 부정맥 및 심장성 돌연사를 치료 또는 예방할 수 있다.

1,4-벤조티아제핀 유도체, JTV-519, 또는 4-[3-(4-벤질피페리딘-1-일)프로피오닐]-7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 일염산염 (k201 또는 ICP-칼스탄 (Calstan) 100으로도 공지되어 있음)은 칼슘-이온 통로의 새로운 조정제이다. 심근 세포에서 Ca^{2 +} 수준을 조절하는 것 외에도, JTV-519는 또한 기니아 피그 심실 세포에서 Na⁺ 전류 및 내향 정류성 (inward-rectifier) K⁺ 전류를 조정하며, 기니아 피그 심방 세포에서 지연된-정류성 K⁺ 전류를 저해한다. 연구에 의하면, JTV-519는 카테콜아민-유발성 심근 손상, 심근 손상-유발성 근미소섬유 (myofibrillar) 과다수축, 및 허혈/재관류 손상에 대하여 강한 심장 보호 효과를 갖는다는 것이 밝혀졌다. 실험용의 근미소섬유 과다수축 모델에서, JTV-519는 프로프라놀롤, 베라파밀 및 딜티아젬보다 큰 심장 보호 효과를 보여주었다. 실험 데이터는, JTV-519가 동물 모델에서 세포내 Ca^{2 +} 과부하의 수준을 감소시킴으로써 심실 허혈/재관류를 효과적으로 예방한다는 것도 시사하고 있다.

발명의 개요

본 발명은 RyR2가 심방 세동, 심실 부정맥 및 운동-유발성 심장 부정맥을 포 함하는 심부전 및 심장 부정맥의 치료 및 예방에 있어서의 표적이라는 놀라운 발견에 기초한다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명자들은 7개의 상이한 CPVT 돌연변이를 갖는 돌연변이 RyR2 통로를 만들고 그 기능을 연구하였다. 모든 7개의 돌연변이체는 운동 동안 자극될 때 누출성으로 되는 (칼슘 누출성) 통로로 이어지는 기능적 결함을 갖는다. 본 발명자들의 연구는 먼저 SR 칼슘 누출이 DAD를 야기하는 기작을 확인하는 것이다. 주목할 만하게도, 돌연변이 CPVT 통로에서의 결함은 높은 이환율의 치명적 심장 부정맥을 그 특징으로 하는 질병인 말기 심부전이 있는 환자의 심장에서 이 통로가 누출성 통로처럼 보이게 하였다. 따라서, 본 발명자들은 CPVT에서의 VT에 있어서의 기작이 심부전에서의 VT에 있어서의 기작과 동일하다는 것을 밝혀내었다.

또한 본 발명자들에 의해 JTV-519 (k201 또는 ICP-칼스탄 100), 및 기타 신규한 1,4-벤조티아제핀 유도체는 RyR2 통로에서의 누출을 복구시킨다는 것이 본원에 개시되어 있다. 본 발명자들이 밝혀낸 바와 같이, JTV-519 및 관련 유도체는 FKBP12.6이 PKA-인산화 RyR2, 및 돌연변이 RyR2에 결합하는 것을 증강시키는데, 상기 돌연변이 RyR2는 그렇지 않을 경우 FKBP12.6에 대하여 감소된 친화도를 갖거나, 그에 결합하지 않는다. 이러한 작용은 치명적 심장 부정맥 (심장성 돌연사 (SCD))을 일으키고 심부전에서 심장 근육 기능 장애 및 심방/심실 세동에 기여하는 RyR2에서의 누출을 수선한다.

따라서, 일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 신규한 1,4-벤조티아제핀 중간체 및 유도체를 제공하며, 또한 이를 합성하는 방법, 및 이를 분석하기 위한 방법을 제공한다. 소정의 실시 형태에서,이러한 신규한 1,4-벤조티아제핀 중간체 및 유도체는:

(a)

(식 중, R은 아릴, 알케닐, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임);

(b)

(식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임);

(c)

(식 중, R은 CO(CH₂)_nXR'₂, SO₂(CH₂)_nXR'₂, 또는 S0₂NH(CH₂)_nXR'₂이며, X는 N 또는 S이며, n은 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며, m은 1 또는 2임)

(d)

(식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; X는 NH 또는 O임); 및

(e)

(식 중, R₁은 페닐 고리 상의 2, 3, 4 또는 5 위치의 OR', SR', NR', 알킬, 또는 할라이드이며, R'은 알킬, 아릴, 또는 H이며; R₂는 H, 알킬, 또는 아릴이며; R₃은 H, 알킬, 또는 아릴임)를 포함한다.

추가적인 실시 형태들은 다음의 화합물들: S7, S-20, S-27, 및 S36을 포함한다 (도 8에서 나열함).

또한 본 발명은 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 방지하기 위한 방법; 대상에서 심부전, 심방 세동 또는 운동-유발성의 심장 부정맥의 치료 또는 예방하기 위한 방법; 및 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사의 예방을 위한 방법에서 신규한 1,4-벤조티아제핀 화합물의 용도를 제공한다.

추가의 일면에서, 본 발명은 RyR2와 FKBP12.6의 결합을 향상시키는 약제의 확인 방법을 제공하는 것으로서, (a) RyR2의 소스를 수득하거나 생성하는 단계; (b) 후보 약제의 존재 하에 상기 RyR2를 FKBP12.6에 노출시키는 단계; (c) 약제가 RyR2와 FKBP12.6의 결합을 향상시키는지 결정하는 단계를 포함한다. 소정의 실시 형태에 있어서, RyR2는 비인산화, PKA-인산화, 또는 PKA-과인산화될 수 있다. 또한 제공되는 것은 이 방법으로 확인되는 약제, 및 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 예방하기 위한 방법; 대상에서 심부전, 심방 세동 또는 운동-유발성의 심장 부정맥의 치료 또는 예방하기 위한 방법; 및 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사의 예방을 위한 방법에 있어서의 이 약제의 용도이다.

또 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 RyR2와 FKBP12.6의 결합을 향상시키는 약제의 확인 방법을 제공하는 것으로서, (a) FKBP12.6의 소스를 수득하거나 생성하는 단계; (b) 후보 약제의 존재 하에 상기 FKBP12.6를 RyR2에 노출시키는 단계; (c) 약제가 RyR2와 FKBP12.6의 결합을 향상시키는지 결정하는 단계를 포함한다. 소정의 실시 형태에 있어서, RyR2는 비인산화, PKA-인산화, 또는 PKA-과인산화될 수 있다. 또한 제공되는 것은 이 방법으로 확인되는 약제, 및 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 예방하기 위한 방법; 대상에서 심부전, 심방 세동 또는 운동-유발성의 심장 부정맥의 치료 또는 예방하기 위한 방법; 및 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사의 예방을 위한 방법에 있어서의 이 약제의 용도이다.

본 발명의 추가의 일면은 하기의 설명에 비추어서 자명해질 것이다.

도 1은 FKBP12.6^+/- 생쥐에서 JVT-519가 운동-유발성 심실 부정맥을 예방한다는 것을 보여준다. (A) 미처리 FKBP12.6^+/- 생쥐, JTV-519로 처리된 FKBP12.6^+/- 생쥐, 및 JTV-519로 처리된 FKBP12.6^-/- 생쥐의 대표적인 보행 심전도. 심박동수, 또 는 임의의 측정되는 ECG 파라미터에서의 유의한 차이는 전혀 없었다. (B) 상부의 추적 (tracing): 지속성 다형 심실 빈맥의 예를, 운동 시험 및 1.0 mg/kg의 에피네프린을 이용한 주사에 처해진 미처리 FKBP12.6^+/- 생쥐에서 기록하였다. 중간의 추적: 동일한 프로토콜에 따른 JTV-519-처리 FKBP12.6^+/- 생쥐의 심전도; 부정맥이 전혀 탐지되지 않았다. 하부의 추적: JTV-519로 처리된 FKBP12.6^-/- 생쥐에서의 운동-유발성 심실 빈맥 (ventricualr tachycardia, VT). 점선은 도면에 도시되어 있지 않은 16.31초의 VT를 나타낸다. 'P'는 P파를 나타내며, 이는 심실 빈맥 이후의 정상 동율동 (sinus rhythm)을 나타내는 것이다. (C) 각각 JTV-519로 처리하거나 처리하지 않은 FKBP12.6^+/- 및 FKBP12.6^-/- 생쥐에서, 심장성 돌연사 (좌측), 지속성 심실 빈맥 (> 10회의 심박동수, 중간), 및 비지속성 심실 빈맥 (3-10회의 비정상적 심박동수, 우측)의 정량화를 도시하는 막대 그래프. 미처리 FKBP12.6^+/- 생쥐 (n = 10) 또는 JTV-519-처리 FKBP12.6^-/- 생쥐 (n = 5)에 비하여, JTV-519로 처리한 FKBP12.6^+/- 생쥐 (n = 9)에서 JTV-519를 이용한 처리에 의해 운동-유발성 및 에피네프린 유발성 부정맥이 완전히 예방된다는 것을 알아야 하는데, 이는 JTV-519가 FKBP12.6을 RyR2에 재결합시킴으로써 FKBP12.6^+/- 생쥐에서 부정맥 및 돌연사를 예방한다는 것을 시사하는 것이다.

도 2에는 FKBP12.6^+/- 생쥐에서 RyR2에 대한 FKBP12.6의 친화도를 증가시킴으로써 JTV-519가 운동-유발성의 심장성 돌연사 (SCD)를 예방한다는 것이 도시되어 있다. (A-B) 심장 라이아노딘 수용체 (RyR2)를 RyR2-5029 항체를 사용하여 면역침전시켰다. 각각 JTV-519의 부재 또는 존재 하에서, 휴식 상태 하에서, 그리고 운동 이후에 야생형 (FKBP12.6^+/+) 생쥐, FKBP12.6^+/- 생쥐, 및 FKBP12.6^-/- 생쥐에서 RyR2, PKA-인산화 RyR2 (RyR2-pSer²⁸⁰⁹ 항체), 및 FKBP12.6의 정량화된 양을 나타내는 면역블롯 (A) 및 막대 그래프 (B)가 도시되어 있다. 휴식 상태 하에서는 FKBP12.6^+/- 생쥐에서 ~70%의 FKBP12.6이 RyR2와 결부되어 있다. 운동 시험 이후에는, RyR2 복합체와 결부된 FKBP12.6의 양이 FKBP12.6^+/- 생쥐에서 극적으로 감소되었지만, 이는 JTV-519를 이용한 처리에 의해 구조될 수 있다. (C) RyR2 단일 통로는 운동 시험 및 에피네프린 주사 이후 수득되는 심장으로부터 단리하였다. JTV-519로 사전 처리하거나 사전 처리하지 않은 FKBP12.6^+/- 생쥐 유래의 통로와, JTV-519 사전 처리 이후의 FKBP12.6^-/- 생쥐 유래의 통로가 도시되어 있다. RyR2-통로의 기능은 JTV-519로 처리한 운동시킨 FKBP12.6^+/- 생쥐에서 정상화하였다는 것을 알아야 한다. JTV-519 처리 후 운동시킨 FKBP12.6^-/- 생쥐 유래의 대표적인 단일 통로는 심장에서의 FKBP12.6이 JTV-519의 작용에 필요하다는 것을 나타낸다. 점선은 불완전한 통로 개방 또는 '서브컨덕턴스 (subconductance)' 개방을 나타내며, 이는 FKBP12.6-고갈 RyR2 통로를 나타내는 것이다. 좌측의 추적은 5.0초를 나타내는 반면, 우측의 추적은 500 msec를 나타낸다. 이 도면에서, Po는 개방 확률이며; To는 평균 개방 시간이며; Tc는 평균 폐쇄 시간이며; c는 폐쇄 상태의 통로이다. (D) 단일 RyR2 통로의 평균 개방 확률을 도시하는 개략적인 막대 그래프 (상기 참조). JTV-519는 심장 이완기의 칼슘 농도 (150 nM)에서 운동 시험 이후 FKBP12.6^+/- 생쥐 유래의 RyR2의 개방 확률을 극적으로 감소시킨다.

도 3에는 PKA-인산화 RyR2 통로에 대한 FKBP12.6의 결합 친화도의 증가에 의해 JTV-519가 RyR2-통로 개폐를 정상화하는 것이 도시되어 있다. (A, B) 개 SR 막 (A) 및 재조합적으로 발현시킨 RyR2 통로 (B)를 전술한 바와 같이 준비하였다 (문헌[Kaftan et al., Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca (2+)-release channels from cardiac muscle. Circ. Res., 78: 990-97, 1996]). (A) 라이아노딘 수용체 (RyR2)는 인산화 완충제 (8 mM MgCl₂, 10 mM EGTA, 및 50 mM 트리스/PIPES; pH 6.8) 중 PKA 저해제, PKI_{5 -24}의 존재 또는 부재 하에서 PKA 촉매 서브유닛 (40 U; Sigma Chemical Co., 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)으로 인산화하였다. 샘플을 100,000x g에서 10분 동안 원심분리하고, 이미다졸 완충제 (10 mM의 이미다졸; pH 7)에서 3회 세척하였다. 재조합적으로 발현시킨 FKBP12.6 (최종 농도 = 250 nM)은 상이한 농도의 JTV-519의 부재 또는 존재 하에 이 샘플에 첨가하였다. 60분간의 인큐베이션 후, 샘플을 100,000x g에서 10분 동안 원심분리하고 이 미다졸 완충제에서 2회 세척하였다. 샘플을 95℃로 가열하고, SDS-PAGE를 사용하여 크기별로 분획화하였다. 전술한 바와 같이 (문헌[Jayaraman et al., FK506 binding protein associated with the calcium release channel (ryanodine receptor). J. Biol. Chem., 267: 9474-77, 1992]), 항-FKBP12.6 항체 (1:1,000) 및 항-RyR2-5029 항체 (1:3,000)를 이용하여 SR 마이크로좀 (microsome) 의 면역블로팅을 수행하였다. 이 도면에는 JTV-519가 FKBP12.6의 (A) PKA-인산화 RyR2 (부분적 결합:100nM ; 완전한 결합: 1000 nM) 또는 (B) RyR2-S2809D 돌연변이 통로 - 이는 항시적 PKA-인산화 RyR2 통로임 - 에의 결합을 가능하게 한다는 것이 도시되어 있다. (C-E) 특정 PKA 저해제, PKI_{5 -24}의 존재 하에서의 PKA 인산화 (C)에 비하여, PKA 인산화 이후의 RyR2의 개방 확률 증가 (D)를 나타내는 단일-통로 연구. 단일-통로 기능은 JTV-519의 존재 하에 FKBP12.6과 함께 인큐베이션된 PKA-인산화 RyR2에서 정상화하였다 (E). 통로 개방은 위쪽에 있으며, 대쉬 (dash)는 완전 개방의 수준 (4 pA)을 나타내며, 문자 'c'는 폐쇄된 상태를 나타낸다. 통로는 압축된 (5초, 상부의 추적) 시간 규모 및 확장된 (500 msec, 하부의 추적) 시간 규모에서 도시되며, 기록치는 0 mV에서의 것이다. 크기 도수 분포도 (amplitude histograms) (우측)에 의하면 PKA-인산화 RyR2에서 증가된 활성 및 서브컨덕턴스 개방이 나타났지만, JTV-519 및 FKBP12.6를 이용한 처리 이후에는 그러하지 않았다. (F) 세포질 [Ca^{2 +}]의 함수로서의 개방 확률의 정상화된 도면. JTV-519의 존재 하에 PKA-인산화 RyR2를 FKBP12.6과 함께 인큐베이션하면 RyR2 활성화의 Ca^{2 +}-의존성이 우측으로 이동하는데, 이는 비인산화 통로의 Ca^{2 +}-의존성과 유사하게 된다.

도 4는 hERG-통로 전류에 대한 본 발명자들의 신규한 JTV-519-연관 화합물 (본원에서 개시함)의 효과를 시험하는데 사용한 실험적인 프로토콜을 보여준다. 전세포 패치 클램프 실험은 hREG 통로로 감염된 CHO 세포에서, 실온에서 생리 용액으로 수행하였다. 전압 클램프 프로토콜은 하부 패널에 도시되어 있다. 비히클에서, 상부 패널에 도시한 동일한 시간-프로토콜로 외부 용액 중 0.1% DMSO를 적용하였다.

도 5는 80-mV 탈분극에 의해 도출된 hERG-통로 전류에 대한 JTV-519 및 본 발명자의 신규한 JTV-519- 연관 화합물, S36 (본원에서 개시함)의 효과가 도시되어있다. 대표적인 hERG-통로 전류들은 (1(Kr)) 1 [mu]M JTV-519 (좌측 패널) 또는 1 μM JTV-S36 (우측 패널)의 적용 전 (개방 원형)과 후 (폐쇄 원형)를 CHO 세포로부터 기록하였다. 전압-클램프 프로토콜은 전류 추적 아래쪽에 도시되어 있다. -90 mV의 기본 전위로부터 +80 mV로 400-msec 탈분극 동안 전류를 도출하였다. 400-msec 탈분극 (인간의 활동 전위 시간 (APD)을 모방함) 시, hERG 통로들은 그것들이 빠르게 비활성화하기 때문에 매우 적은 외향성 전류를 통과시킨다는 것에 주목해야한다. 전류 추적에서 원으로 표시된 꼬리 전류들은 개방 상태를 통한 비활성화로부터의 회복에서 막 전위 -40 mV로의 회귀에 의해 도출되었다. 꼬리 전류가 APD의 조절에 주된 공헌자이기 때문에, 약물의 효과는 -40 mV: JTV-519 = 83% 차단; JTV- S36 = 39% 차단에서 꼬리 전류에 의해 평가하였다.

도 6에서는 hREG-통로 전류들 (추적들)에 대한 JTV-519, E4031, 및 본 발명자들의 신규한 JTV-519-연관 화합물, S36 (본원에서 개시함)의 효과가 도시되어 있다. 대표적인 hERG-통로 I-V 관계는 0.1% DMSO (비히클; 상부 중앙 패널), 1 μM JTV-519 (중간 중앙 패널), 및 1 μM JTV-S36 (하부 중앙 패널)의 적용 전 (콘트롤, 좌측 패널)과 후 (중앙 패널)를 보여준다. 우측 패널은 5 μM E4031 (hERG 통로를 차단한다고 알려진 유형 III 항부정맥 약물)가 hREG-통로 전류를 완전하게 차단했다는 것을 나타낸다. (-40 mV에서 꼬리 전류 주목). 전압-클램프 프로토콜은 I-V 관계로서 도 4에서 설명한다.

도 7은 hERG-통로 전류의 활성화에 대한 JTV-519 및 본 발명자들의 신규한JTV-519-연관 화합물, S36 (본원에서 개시함)의 효과를 보여준다. hERG-통로 I-V 관계는 0.1% DMSO (비히클; 상부 패널, 1 μM JTV-519 (하부 좌측 패널), 및 1 μM JTV-S36 (하부 우측 패널)의 적용 전 (개방 사각형)과 후 (폐쇄 사각형) 피크 꼬리 전류 (활성화)를 나타낸다. 약물의 워시아웃 (washout)은 개방 삼각형으로 표현하였다. 전압-클램프 프로토콜은 I-V 관계로서 도 4에서 설명한다. JTV-S36가 I(Kr)의 전압의존성 차단을 나타내는 음 전위 (0 mV; 20 mV 탈분극)에서 hREG 전류를 차단하지 않았다는 것을 주목해야 한다.

도 8에는 본 유도체의 구조가 도시되어 있다.

상기에 논의되어 있는 바와 같이, 카테콜아민성 다형 심실 빈맥 (CPVT)은 구조적으로 정상인 심장을 갖는 대상에서의 유전성 장애이다. 이는, 심장성 돌연사 (SCD)를 야기할 수 있는 치사적 부정맥인 스트레스 유발성 심실 빈맥을 그 특징으로 한다. 근소포체 (SR) 상에 위치하는 RyR2 통로에서의 돌연변이가 CPVT와 연관되어 있다. CPVT에서 치명적 심장 부정맥에 대한 근본적인 분자적 기작을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 CPVT-결부된 돌연변이 RyR2 통로 (예를 들어, S2246L, R2474S, N4104K, R4497C)를 연구하였다.

CPVT가 있는 모든 대상은 운동-유발성 심장 부정맥을 갖는다. 본 발명자들은 이전에 운동-유발성 부정맥 및 돌연사 (CPVT가 있는 환자에서)가 RyR2에 대한 FKBP12.6의 친화성 감소에 의해 생기는 것임을 보여주었다. 본원에서, 본 발명자들은 아데노신-3',5'-모노포스페이트(cAMP)-의존성 단백질 키나아제 (PKA)에 의한 인산화의 결과로서 운동이 RyR2를 활성화시킨다는 것을 입증하였다. 기초적인 조건 하에서 평면형 지질 이중막에 있어서 정상적인 기능을 갖는 돌연변이 RyR2 통로는 야생형 통로에 비하여 PKA 인산화에 의한 활성화에 보다 민감하여, 증가된 활성 (개방 확률) 및 연장된 개방 상태를 나타내었다. 또한, PKA-인산화 돌연변이 RyR2 통로는 RyR2 통로의 생리학적 저해제인 Mg^{2 +}에 의한 저해에 대하여 내성을 가지며, (폐쇄 상태의 통로를 안정화하는) FKBP12.6에의 결합 감소를 나타내었다. 이러한 발견은, 운동 동안, RyR2 통로가 PKA-인산화될 때, 돌연변이 CPVT 통로가 심장 주기의 이완기 (심장 이완기)에서 개방될 가능성이 더 커서, SR Ca^{2 +} 누출에 의해 유발되는 부정맥의 발병 가능성이 증가된다는 것을 나타낸다. 심부전은 전세계적으로 주요한 사망 원인이기 때문에, RyR2에서의 누출을 복구하는 방법은 수백만의 환자에 있어서 치명적 부정맥을 예방할 수 있다.

본 발명자들은 또한 본원에서 1,4-벤조티아제핀 유도체인, JTV-519가 FKBP12.6 유전자에 대하여 이형 접합성인 생쥐에서 치사적 심실 부정맥을 예방한다는 것을 입증하였다. JTV-519는 PKA-인산화 RyR2에 대한 FKBP12.6의 친화도를 증가시킴으로써, 운동에 처해진 FKBP12.6^+/- 생쥐 유래의 RyR2의 개방 확률을 감소시켰다. 또한, JTV-519는 FKBP12.6 결합 친화도를 증가시킴으로써 CPTV-연관 돌연변이 RyR2 통로들의 통문(gating)을 정상화하였다. 이러한 데이터들은 JTV-519가 FKBP12.6-RyR2 결합 친화도를 증가시킴으로써 치명적 심실 부정맥을 예방할 수 있다는 것을 시사한다.

신규한 치료 및 예방 방법

상기에 논의되어 있는 바와 같이, 본 발명은 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한하거나 방지하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "FKBP12.6"란 용어는 "FKBP12.6 단백질" 및 "FKBP12.6 유사체" 둘 모두를 포함한다. 본원에서 달리 언급하지 않는 한, "단백질"이란 용어는 단백질, 단백질 도메인, 폴리펩티드 또는 펩티드, 및 이의 임의의 단편을 포함해야 한다. "FKBP12.6 유사체"란 용어는 상기 FKBP12.6 단백질의 기능적 변이체로, FKBP12.6 생물 활성을 가지며 상기 FKBP12.6 단백질과 60% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 본원에서 또한 사용된 바와 같이, "FKBP12.6 생물 활성"이란 용어는, 비록 친화도가 FKBP12.6과는 다를지라도 본원에서 기술된 분석 조건하에서 미인산화되거나 비인산화된 RyR2와 물리적으로 결부되거나 결합하는 능력 (즉, 음성 대조의 배경 결합보다 약 2배의 결합, 또는 더욱 바람직하게는 약 5배의 결합)을 보여주는 단백질 또는 펩티드의 활성을 지칭한다.

또한, 본원에서 사용된 바와 같이, "RyR2"는 "RyR2 단백질" (예를 들어, 심방 RyR2 단백질 또는 심실 RyR2 단백질) 및 "RyR2 유사체" 둘 모두를 포함한다. "RyR2 유사체"는 RyR2 단백질의 기능적 변이체로, RyR2 생물 활성을 가지며 RyR2 단백질과 60% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, "RyR2 유사체"란 용어는 RyR2의 골결근 이소폼 (isoform)인 RyR1 및 RyR3을 포함한다. 본 발명의 RyR2는 미인산화되거나, 인산화되거나 (예를 들어, PKA에 의한 인산화), 또는 과인산화될 수 있으며 (예를 들어, PKA에 의한 과인산화); 바람직하게는, RyR2는 인산화되거나 과인산화된다. 본원에서 또한 사용된 바와 같이, "RyR2 생물 활성"이란 용어는 비록 친화도가 RyR2와는 상이할 지라도 본원에서 기술된 분석 조건하에서 FKBP12.6과 물리적으로 결부되거나 결합하는 능력 (즉, 음성 대조의 배경 결합보다 약 2배의 결합, 또는 더욱 바람직하게는 약 5배의 결합)을 보여주는 단백질 또는 펩티드의 활성을 지칭한다.

상기에 기술되어 있는 바와 같이, 상기 심장 라이아노딘 수용체인 RyR2는 12,000-달톤의 FKBP12.6 단백질 4개와 결부된 565,000-달톤의 RyR2 단백질 4개를 포함하는 단백질 복합체이다. FK506 결합 단백질 (FKBP)은 광범위하게 발현되는 시스-트란스 펩디딜-프롤릴 이소머라아제 (isomerase)이고, 다양한 세포 기능을 수행한다. FKBP12.6 단백질은 RyR2에 견고하게 결합되어 있으며 RyR2의 기능을 조절한다. FKBP12.6은 RyR2 서브유닛 당 하나의 분자로 상기 RyR2 통로에 결합하고, RyR2-통로 기능을 안정화시키며, 이웃하는 RyR2 통로 사이의 커플링된 개폐를 용이하게 하여, 심장 주기 중 휴식기 동안에 상기 통로의 이상 활성화를 방지한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "RyR2-결합 FKBP12.6"이란 용어는 RyR2 사량체와 결부되어 있는 FKBP12.6의 사량체 또는 RyR2 단백질 서브유닛에 결합되어 있는 FKBP12.6 단백질 분자를 포함한다.

본 발명의 방법에 따르면, 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 "감소"는 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 검출 가능한 감소, 축소 또는 저하를 지칭한다. 이 같은 감소가 JTV-519의 투여에 의해 임의의 방식으로 멈추거나, 방해되거나, 방해를 받거나, 막히거나 감소하게 되었을 때 상기 감소가 대상에서 제한되거나 방지되어 (하기에 기술된 바와 같음), 대상에서의 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준은 그렇지 않는 경우에 JTV-519의 부재하에서의 수준보다 높다.

대상에서의 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준은 본원에 개시된 분석법 및 검출 방법뿐만 아니라, 공지된 선행기술 (예를 들어, 면역학적 기술, 혼성화 분석, 면역침전, 웨스턴블롯 분석, 형광-이미지화 기술, 및/또는 방사선 검출법 등)로부터 용이하게 결정되는 방법을 비롯한 표준 분석법 및 기술에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 당업계에 공지된 표준 방법을 이용하여 대상의 세포로부터 단리 및 정제될 수 있으며, 상기 공지된 방법은 세포로부터의 추출 (예를 들어, 상기 단백질을 가용화시키는 세제에 의한 추출) 이후에 필요한 경우 친화도에 의한 컬럼 상에서의 정제, 크로마토그래피 (예를 들어, FTLC 및 HPLC), 면역침전 (항체에 의한 면역침전), 및 침전 (예를 들어, 이소프로판올, 및 트리졸과 같은 시약에 의한 침전)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 단백질의 단리 및 정제 후에 전기영동 (예를 들어, SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기영동)을 할 수 있다. 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소, 또는 이의 제한 및 방지는, 치료제/방지제 (예를 들어, 하기에 기술된 방법에 따른 JTV-519 또는 다른 1,4-벤조티아제핀 유도체)의 투여 이전에 검출되는 RyR2-결합 FKBP12.6의 양을 상기 치료제/방지제의 투여 이후의 적절한 시점에 검출되는 양과 비교함으로써 결정될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 대상 (예를 들어, 대상의 세포)에서 RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소는, 예를 들어 대상에서의 FKBP12.6과 RyR2의 해리를 저해하거나, 상기 대상에서 FKBP12.6과 RyR2의 결합을 증가시키거나, 또는 상기 대상에서 RyR2-FKBP12.6 복합체를 안정화시킴으로써 제한되거나 방지될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "해리를 저해하기"란 용어는 대상에서 RyR2 분자로부터 FKBP12.6 서브유닛의 물리적인 해리 또는 분리를 차단하거나, 감소시키거나, 저해하거나, 제한하거나, 또는 방지하는 것을 포함하며, 상기 대상에서 FKBP12.6 서브유닛으로부터 RyR2 분자의 물리적인 해리 또는 분리를 차단하거나, 감소시키거나, 저해하거나, 제한하거나, 또는 방지하는 것을 포함한다. 본원에서 또한 사용된 바와 같이, "결합을 증가시키기"란 용어는 상기 대상에서 FKBP12.6과 물리적으로 결부되는 인산화된 RyR2의 능력 (예를 들어, 음성 대조의 배경 결합보다 약 2배의 결합, 또는 더욱 바람직하게는 약 5배의 결합)을 증강시키거나, 증가시키거나 또는 개선시키는 것을 포함하며, 상기 대상에서 인산화된 RyR2와 물리적으로 결부되는 FKBP12.6의 능력 (예를 들어, 음성 대조의 배경 결합보다 약 2배의 결합, 또는 더욱 바람직하게는 약 5배의 결합)을 증강시키거나, 증가시키거나 또는 개선시키는 것을 포함한다. 부가적으로, 본 발명의 방법에서, 대상의 세포에서 RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소는, 상기 대상에서 인산화된 RyR2의 수준을 직접적으로 감소시키거나, 상기 대상에서 인산화된 RyR2의 수준을 간접적으로 감소시킴으로써 (예를 들어, 효소 (예를 들어, PKA), 또는 상기 세포에서 인산화된 RyR2의 기능 및 수준을 조절하거나 조정하는 다른 내인성 분자를 표적으로 설정함으로써) 제한되거나 방지될 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상에서의 인산화된 RyR2의 수준은 본 발명의 방법에서는 적어도 10% 정도 감소한다. 더욱 바람직하게는, 상기 인산화된 RyR2의 수준은 적어도 20% 정도 감소한다.

본 발명의 방법에 따르면, RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소는 대상 (예를 들어, 대상의 세포)에서 제한되거나 방지된다. 본 발명의 대상은 양서류, 조류, 어류, 포유류 및 유대류를 비롯한 임의의 동물일 수 있지만, 포유류 (예를 들어, 인간; 고양이, 개, 원숭이, 생쥐 또는 쥐와 같은 가축; 또는 소와 돼지와 같은 시판용 동물)가 바람직하다. 부가적으로, 본 발명의 대상은 운동-유발성 심장 부정맥의 후보이다. 운동-유발성 심장 부정맥은 대상이 육체 운동을 하는 동안 및 운동을 한 후에 발병하는 심장 질병 (예를 들어, 심장성 돌연사로 이어지는 임의의 질병을 비롯한 심실 세동 또는 심실 빈맥)이다. 운동-유발성 심장 부정맥의 "후보"는 육체 운동을 하는 도중 및 운동 이후에 심장 부정맥에 걸릴 위험이 있는 것으로 알려져 있거나, 간주되거나 또는 의심되는 대상이다. 운동-유발성 심장 부정맥의 후보 인자의 예로는 카테콜아민 다형 심실 빈맥 (CPVT)을 앓고 있는 것으로 알려진 동물/인간; CPVT를 앓고 있는 것으로 의심되는 동물/사람; 및 육체 운동을 하는 도중 및 운동 이후에 심장 부정맥에 걸릴 위험이 있는 것으로 알려져 있거나, 간주되거나 또는 의심되며, 운동을 할려고 하거나 현재 운동 중이거나 또는 운동을 막 끝낸 동물/인간을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 상기에 논의되어 있는 바와 같이, CPVT는 구조적으로 정상인 심장을 갖는 개인에서의 유전 질환이다. 이는 스트레스-유발성 심실 빈맥, 즉 심장성 돌연사를 일으킬 수 있는 치명적인 부정맥을 그 특징으로 한다. CPVT를 앓고 있는 대상에서, 육체 운동 및/또는 스트레스는 검출 가능한 구조적인 심장 질환없이 심장성 돌연사 (SCD)로 이어지는 양방향성 및/또는 다형 심실 빈맥을 유도한다. CPVT를 앓고 있는 개인들은 운동을 하는 경우에는 심실 부정맥을 앓게 되지만, 휴식을 취하는 경우에는 부정맥이 발병하지 않는다.

본 발명의 방법에서, 대상의 세포는 바람직하게는 횡문근 세포이다. 횡문근은, 수축성 근섬유의 반복단위 (근절)이 세포 전역에서 일정하게 배열되어 있어 광학 현미경 수준에서 관찰될 수 있는 가로 또는 세로 줄무늬를 생성하는 근육이다. 횡문근 세포의 예로는 수의 (골격)근 세포 및 심근세포를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 방법에 사용된 세포는 인간 심근 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "심근세포"란 용어는 심장의 심근에서 발견되는 것과 같은 심근섬유를 들 수 있다. 심근 섬유는 사이원반 (intercalated disk)에서 끝과 끝이 연결된 연속적인 심근세포 또는 심근세포 (cardiomyocyte)의 쇄로 이루어져 있다. 이러한 원반은 2종류의 세포 연접부 (cell junction), 즉 이들의 가로부분을 따라 확장된 확장 데스모좀 (expanded desmosome) 및 이의 가장 큰 부분이 이들의 세로 부분을 따라 놓여 있는 갭 연접부 (gap junction)를 갖는다.

본 발명의 방법에서, RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소는 대상에 JTV-519를 투여함으로써 대상의 세포에서 제한되거나 방지되지만, 이어 이는 상기 대상의 세포와 JTV-519 사이의 접촉을 허용할 수 있다. k201으로도 공지된 JTV-519 (4-[3-(4-벤질피페리딘-1-일)프로필]-7-메톡시-2,3,4,5-테트라하이드로-1,4-벤조티아제핀 모노하이드로클로라이드)는 1,4-벤조티아제핀의 유도체이고, 칼슘-이온 통로의 조정제이다. 심근세포에서 Ca^{2 +} 수준을 조절하는 것 이외에, JTV-519는 기니아 피그의 심실 세포에서 Na⁺ 전류 및 내향성 정류형 K⁺ 전류를 조정하고, 기니아 피그의 심방 세포에서의 지연성 정류형 K⁺ 전류를 저해한다. FK506 및 라파마이신은 본 발명의 대상에서 상기 RyR2-FKBP12.6 복합체를 안정화시키는 기타 화합물을 고안하는데 사용될 수 있다. FK506 및 라파마이신 둘 모두는 RyR2로부터 FKBP12.6을 해리시킨다. 이들 약제와 구조적으로 관련이 있는 화합물를 고안하고/하거나 스크리닝하는 것이 가능하지만, 역효과를 갖는다.

본 발명의 방법에서, JTV-519는 JTV-519 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 치료 조성물에 의해 대상에 투여될 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 상기 조성물의 다른 성분들과 상용성일 수 있다는 견지에서 "허용 가능"해야하지만, 이의 수령인에게 해롭지 않아야 한다. 본원에서 이용되는 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약학 제형용 물질로서 사용되는 다양한 유기물 또는 무기물로부터 선택되며, 이들 물질들은 진통제, 완충제, 결합제, 분산제, 희석제, 유화제, 부형제, 증량제, 글리단트, 가용제, 안정제, 현탁제, 긴장제 (tonicity agent), 비히클 (vehicle) 및 증점제로서 혼입될 수 있다. 필요한 경우, 산화방지제, 방향제, 착색제, 착향 개량제, 방부제 및 감미제와 같은 약학 첨가제가 또한 첨가될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예로는 카르복실메틸 셀룰로즈, 결정성 셀룰로즈, 글리세린, 아라비아 고무, 락토즈, 마그네슘 스테아레이트, 메틸 셀룰로즈, 분말, 생리식염수, 알긴산나트륨, 수크로즈, 전분, 활석 및 물 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학 제형은 약학 분야에서 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 JTV-519는 담체, 또는 현탁액 또는 용액과 같은 희석제와 함께 사용될 수 있다. 선택적으로는, 하나 이상의 필수 성분 (예를 들어, 완충제, 방향제, 계면 활성제 등)이 또한 첨가될 수 있다. 담체의 선택은 투여 경로에 따라 결정된다.

JTV-519는 상기 대상에서의 표적 세포 (예를 들어, 심근세포)를 상기 JTV-519와 생체내에서 접촉시킴으로써 대상에 투여될 수 있다. JTV-519는 단백질, 핵산 및 기타 약제의 도입 및 투여용으로 이용되는 공지된 방법을 이용하여 대상의 세포와 접촉 (세포에 도입)될 수 있다. 세포를 JTV-519와 접촉시키는 방법 (JTV-519로 세포를 치료하는 방법)의 예로는 흡착, 전기 천공 (electroporation), 침지 (immersion), 주사, 삽입, 리포좀 전달 (liposome delivery), 형질감염 (transfection), 수혈 (transfusion), 벡터 및 기타 약제 전달 비히클 및 방법을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 표적 세포가 대상의 특정 부위에 위치하였을 때, 주사 또는 몇몇 다른 수단 (예를 들어, 상기 JTV-519를 혈액 또는 다른 체액에 도입함으로써)에 의해 상기 세포에 상기 JTV-519를 직접 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 표적 세포는 대상의 심장 조직에 포함될 수 있으며, 공지된 기술분야로부터 용이하게 선택된 표준 검출 방법에 의해 대상의 심장 조직에서 검출될 수 있으며, 상기 표준 검출 방법의 예로는 면역학적 기술 (예를 들어, 면역조직화학적 염색(Immunohistochemical staining)), 형광-이미지화 기술, 및 현미경법을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

부가적으로, 본 발명의 JTV-519는 공지된 과정에 의해 인간 또는 동물 대상에 투여될 수 있으며, 상기 공지된 과정으로는 경구 투여, 비경구 투여 및 경피 투여를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 JTV-519는 근막외 (epifascial), 관절낭내 (intracapsular), 두개내 (intracranial), 피내 (intracutaneous), 경막내 (intrathecal), 근육내, 안와내 (Intraorbital), 복강내, 척추내, 줄기세포내 (intrastemal), 혈관내 (intravascular), 정맥내, 실질내 (parenchymatous), 피하, 또는 설하 (sublingual) 주사에 의해 또는 카테터 (catheter)에 의해 비경구 투여된다. 일 실시 형태에 있어서, 상기 약제는 대상의 심장으로 삽입된 카테터를 통해 심근세포로의 표적 전달에 의해 대상에 투여된다.

경구 투여의 경우, JTV-519 제형은 캡슐제, 정제, 분말제, 과립제 또는 현탁제로 조제될 수 있다. 상기 제형은 락토즈, 만니톨, 옥수수 전분, 또는 감자 전분과 같은 통상적인 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 결정성 셀룰로즈, 셀룰로즈 유도체, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제로 조제될 수 있다. 부가적으로는, 상기 제형은 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 소듐 카르복시메틸셀룰로즈와 같은 붕해제로 조제될 수 있다. 상기 제형은 또한 이염기성 인산칼슘 무수물 또는 소듐 전분 글리콜레이트로 조제될 수 있다. 최종적으로, 상기 제형은 활성 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제로 조제될 수 있다.

비경구 투여 (즉, 소화관 (alimentary canal) 이외의 경로를 통한 주사에 의한 투여)의 경우, JTV-519는 멸균 수용액과 결합될 수 있으며, 상기 멸균 수용액은 대상의 혈액과 등장성인 것이 바람직하다. 이 같은 제형은 염화나트륨, 글리신 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 물질을 포함하고 수용액을 제조하기 위해 생리 조건과 상응하는 완충 pH를 갖는 물에 고체 활성 성분을 용해한 후에 상기 용액을 멸균함으로써 제조할 수 있다. 상기 제형은 임의의 주사형태로 전달될 수 있으며, 상기 주사형태로는 근막외, 관절낭내, 두개내, 피내, 경막내, 근육내, 안와내, 복강내, 척추내, 줄기세포내, 혈관내, 정맥내, 실질내, 피하, 또는 설하 주사 또는 카테터에 의한 투여를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

경피 투여의 경우, JTV-519는 상기 JTV-519에 대한 피부의 투과성을 증가시키고 피부를 통해 혈류 내로 상기 JTV-519가 투과하도록 하는, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 이소프로판올, 에탄올, 올레익산, N-메틸피롤리돈 등과 같은 피부 투과 증진제와 결합될 수 있다. 상기 JTV-519/증진제 조성물은 에틸셀룰로즈, 하이드록시 셀룰로즈, 에틸렌/비닐아세테이트, 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 중합체 물질과 추가로 조합되어 겔 형태의 조성물을 제공하며, 상기 겔 형태의 조성물은 염화메틸렌과 같은 용매에 용해되고, 목적하는 점도가 되도록 증발시킨 후, 소성물질에 도포하여 패치 (patch)를 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, JTV-519는 대상, 특히 대상의 세포에 RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소를 제한하거나 방지하는데 효과적인 양으로 상기 대상에 투여될 수 있다 (그리고, JTV-519는 대상의 세포와 접촉될 수 있음). 이러한 양은 공지된 과정에 기초하여 당업계의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 상기 과정으로는 시험관내에서 확립된 정량곡선분석, 및 본원에 개시된 방법 및 분석법을 들 수 있다. 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소를 제한하거나 방지하기에 유효한 JTV-519의 적합한 양은 일일 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 범위일 수 있고/있거나, 약 300 ng/ml 내지 약 1000 ng/ml 범위의 혈장 중 수준을 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 바람직하게는, 상기 JTV-519 양은 일일 약 10 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 범위이다.

본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 상기 대상은 운동-유발성 심장 부정맥을 을 앓지 않는다. 이러한 경우, 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소를 제한하거나 방지하는데 유효한 양은 대상에서 심장 질병 운동-유발성 심장 부정맥을 예방하기에 유효한 JTV-519의 양일 수 있다. 심장성 부정맥은 심박동수 또는 심박동 리듬에서의 이상으로서 나타나는 심장의 전기적 활성의 장애이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "운동-유발성 심장 부정맥을 예방하기에 유효한" JTV-519의 양은 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥의 임상적인 손상 또는 증상들 (예를 들어, 두근거림, 현기증, 심실 세동, 심실 빈맥 및 심장성 돌연사)을 예방하기에 유효한 JTV-519의 양을 포함한다. 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 예방하는데 유효한 JTV-519의 양은 각각의 경우의 특정 요인에 따라 변할 것이며, 상기 특정 요인으로는 운동-유발성 심장 부정맥의 유형, 대상의 체중, 대상의 질환 중증도, 및 JTV-519의 투여 양식을 들 수 있다. 이러한 양은 공지된 과정에 기초하여 당업계의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 상기 과정으로는 임상실험, 및 본원에 개시된 방법을 들 수 있다. 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 운동-유발성 심장 부정맥을 예방하는데 유효한 JTV-519의 양은 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는데 유효한 JTV-519의 양이다. 다른 실시 형태에 있어서, JTV-519는 상기 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥 및 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방한다.

RyR2-결합 FKBP12.6을 안정화시키고 RyR2의 역동적인 PKA 인산화 및 탈인산화의 전후 관계에서 균형을 유지하고 회복하는 JTV-519의 능력으로 인해, 상기 JTV-519는 또한 심장 질환의 임상적인 증상을 이미 경험하기 시작한 대상을 치료하는데 유용할 수 있다. 심장 질환의 증상이 대상에서 조기에 충분히 관찰되는 경우, JTV-519는 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 추가적인 감소를 제한하고 방지하는데 효과적일 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 상기 대상은 운동을 해오고 있으며, 현재 운동을 하고 있으며, 운동-유발성 심장 부정맥을 앓고 있다. 이 같은 경우, 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소를 제한하고 방지하기에 효과적인 JTV-519의 양은 상기 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 치료하기에 유효한 JTV-519의 양일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "운동-유발성 심장 부정맥을 치료하는데 유효한" JTV-519의 양은 상기 운동-유발성 심장 부정맥의 임상적인 손상 또는 증상 (예를 들어, 두근거림, 현기증, 심실 세동, 심실 빈맥 및 심장성 돌연사)을 완화하거나 개질시키는데 효과적인 JTV-519의 양일 수 있다. 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 치료하는데 유효한 JTV-519의 양은 각각의 경우의 특정 요인들, 운동-유발성 심장 부정맥의 유형, 대상의 체중, 대상의 질병 중증도, 및 JTV-519의 투여 양식에 따라 달라질 것이다. 이러한 양은 공지된 과정에 기초하여 당업계의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 상기 과정으로는 임상실험, 및 본원에 개시된 방법을 들 수 있다. 바람직한 일 실시 형태에 있어서, JTV-519는 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 치료한다.

본 발명은 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 방법은 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 치료하기에 유효한 양으로 대상에게 JTV-519를 투여하는 단계를 포함한다. 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 치료하는데 유효한 JTV-519의 적합한 양은 약 5 mg/kg/일 내지 약 20 mg/kg/일의 범위, 및/또는 약 300 ng/ml 내지 약 1000 ng/ml 범위의 혈청 수준을 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 본 발명은 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 예방하는 방법을 추가로 제공한다. 본 방법은 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 예방하기에 유효한 양으로 대상에게 JTV-519를 투여하는 단계를 포함한다. 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 예방하는데 효과적인 JTV-519의 적합한 양은 약 5mg/kg/일 내지 약 20mg/kg/일의 범위, 및/또는 약 300ng/ml 내지 약 1000ng/ml 범위의 혈청 수준을 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 부가적으로, 본 발명은 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하기에 유효한 양으로 대상에게 JTV-519를 투여하는 단계를 포함한다. 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는데 효과적인 JTV-519의 적합한 양은 5mg/kg/일 내지 약 20mg/kg/일의 범위, 및/또는 약 300ng/ml 내지 약 1000ng/ml 범위의 혈청 수준을 달성하기에 충분한 양일 수 있다.

상술한 방법의 다양한 실시 형태에 있어서, 상기 대상에서의 운동-유발성 심장 부정맥은 VT와 결부되어 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 상기 VT는 CPVT이다. 이러한 방법의 다른 실시 형태에 있어서, 상기 대상은 운동-유발성의 심장성 돌연사에 대한 후보를 포함하는 운동-유발성 심장 부정맥의 후보이다.

상기 방법의 견지에서, 본 발명은 운동-유발성 심장 부정맥의 후보인 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한하거나 방지하는 방법에서의 JTV-519의 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 또한 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 치료하거나 예방하기 위한 방법에서의 JTV-519의 용도를 또한 제공한다. 또한, 본 발명은 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하기 위한 방법에서의 JTV-519의 용도를 제공한다.

상기에서 논의되고 본원에서 제시된 바와 같이, 본 발명자들에 의한 데이터에서는 세린2809에 대한 심장 라이아노딘 수용체인 RyR2의 단백질 키나아제 A (PKA) 인산화는 FK506 결합 단백질인 FKBP12.6을 방출함으로써 상기 통로를 활성화시키는 것으로 나타났다. 심부전 심장 (인간의 심장 및 심부전의 동물 모델을 포함함)에서, RyR2는 PKA-과인산화되어, 결합된 FKBP12.6의 양을 감소시키고 칼슘-유도 활성화에 대한 민감도를 증가시키는 결함성 통로로 이어진다. 이들 변화의 최종 결과는 상기 RyR2 통로가 "누출성"으로 된다는 것이다. 이러한 통로 누출은 근육 수축을 위한 강력한 자극을 제공하기 위해 근소포체 (SR)에서 더 이상 충분한 양의 칼슘이 존재하지 않은 정도로 세포내 칼슘 저장체의 고갈을 초래할 수 있다. 이는 심근의 약한 수축을 초래한다. 통로 누출의 두 번째 결과로서, RyR2 통로는 "심장 이완기"로서 알려진 심장 주기의 휴식기 동안에 칼슘을 방출한다. 심장 이완기 도중의 이러한 칼슘의 방출은 심장성 돌연사 (SCD)를 일으키는 치명적인 심장 부정맥 (예를 들어, 심실 빈맥 및 심실 세동)을 시작할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 좌심실 보조 장치 (left ventricular assist device)로 지칭되는 기계적 펌핑 장치 (mechanical pumping device)를 이용한 심부전 치료는 심장을 휴식기 상태로 하고 정상화된 기능을 회복시키는 것으로, RyR2의 PKA 과인산화의 감소 및 상기 통로의 정상화된 기능과 결부되어 있다는 것을 제시하였다. 또한, 본 발명자들은 β-아드레날린성 차단제 (β-차단제)를 이용한 개 (조율-유도성 심부전을 앓고 있는 개)의 치료는 상기 RyR2의 PKA 과인산화를 반대로 한다는 것을 제시하였다. β-차단제는 PKA를 활성화시키는 경로를 저해한다. 본 발명자들의 연구 결과로부터 안출될 수 있는 결론은, RyR2의 PKA 인산화가 상기 통로의 활성을 증가시켜, 통로의 소정의 자극 (활성화제)을 위해 상기 세포내로 더욱 많은 칼슘의 방출을 초래한다는 것이다.

본원에서 추가로 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 운동-유발성의 심장성 돌연사가 RyR2 단백질들 (특히, CPVT-결부 RyR2 돌연변이 단백질들)의 인산화의 증가, 및 RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소와 결부되어 있다는 것을 입증하였다. 이러한 기작을 이용하여 그러한 심장 질병을 치료하거나 예방하기 위한 효과적인 약제를 고안하는 것이 가능하다. RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소를 제한하거나 방지하는 능력을 갖는 후보 약제는 이러한 제한 및 방지 활성의 결과로서 RyR2-결부된 생물학적 사건에 대하여 영향을 미치며, 그럼으로써 운동-유발성의 심장 돌연사를 예방할 수 있다.

따라서, 본 발명은 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는데 사용하기 위한 약제를 확인하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) RyR2를 포함하는 세포 배양물을 수득하거나 생성하는 단계; (b) 이 세포를 후보 약제와 접촉시키는 단계; (c) 세포에서 RyR2의 인산화를 증가시키는 것으로 공지된 하나 이상의 조건에 세포를 노출시키는 단계; 및 (d) 약제가 세포에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 방지하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약제"란 용어는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산 (DNA 또는 RNA를 포함함), 항체, Fab 단편, F (ab')₂ 단편, 분자, 화합물, 항생제, 약물, 및 이들의 임의의 조합 (들)을 포함한다. RyR2-결합 FKBP12.6 수준의 감소를 제한 또는 방지하는 약제는 천연 또는 합성 약제일 수 있으며, RyR2 및/또는 FKBP12.6과 반응성인 약제 (즉, RyR2 및/또는FKBP12.6에 대해 친화도를 갖거나, 이들과 결합하거나 또는 이들에 대한 약제)일 수 있다. 본원에서 추가로 사용된 바와 같이, "RyR2 포함" 세포는 RyR2, 이의 유도체 또는 동족체가 자연적으로 발현되거나 자연적으로 발생되는 세포 (바람직하게는, 심근세포)이다. 세포에서 RyR2의 인산화를 증가시키는 것으로 알려진 조건으로는 PKA를 들 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에 있어서, 세포는 본원에 기술된 임의의 도입 및 투여 방식을 포함하여 약물/약제와 세포 사이의 접촉을 가져오는 임의의 표준 방법으로 후보 약제와 접촉시킬 수 있다. 세포에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준은 당업계의 숙련자에게 공지되거나 본원에 기술되어 있는 임의의 방법, 분자적 절차 및 분석법을 포함하여 공지된 절차로 측정 또는 탐지할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 본 약제는 세포에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한하거나 방지한다.

본원에 개시되어 있는 바와 같이, RyR2는 횡문근 세포에 있어서 다수의 생물학적 사건에 연루되어 있다. 예를 들어, RyR2 통로는 심장 근육 세포에서 EC 커플링 및 수축성에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 세포에서, 특히 심장 근육 세포에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 방지하도록 고안된 치료용 또는 예방용 약물은 EC 커플링 및 수축성을 포함하여 다수의 RyR2-결부된 생물학적 사건의 조절에 유용할 수 있음이 명백하다. 따라서, 일단 본 발명의 후보 약제가 스크리닝되고, RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소에 대하여 적합한 제한 효과 또는 방지 효과를 미치는 것으로 결정되면, 세포, 특히 심장 근육 세포에서 EC 커플링 및 수축성에 대한 이의 영향에 대하여 평가할 수 있다. 본 발명의 예방제는 운동-유발성의 심장성 돌연사의 예방에 유용할 것으로 기대된다.

따라서, 본 발명의 방법은 (e) 후보 약제를 RyR2를 포함하는 세포 배양물과 접촉시키는 단계; 및 (f) 약제가 세포에서 RyR2-결부된 생물학적 사건에 대하여 영향을 미치는지를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "RyR2-결부된 생물학적 사건"은 RyR2의 수준 또는 활성이 연루된 생화학적 또는 생리학적 과정을 포함한다. 본원에 개시되어 있는 바와 같이, RyR2-결부된 생물학적 사건의 예는 제한됨이 없이 심장 근육 세포에서의 EC 커플링 및 수축성을 포함한다. 본 발명의 방법에 따르면, 후보 약제는 시험관 내에서 하나 이상의 세포 (바람직하게는 심장 근육 세포)와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 세포의 배양물을 후보 약제를 함유하는 제제와 함께 인큐베이션시킬 수 있다. 이어서, RyR2-결부된 생물학적 사건에 대한 후보 약제의 영향을 면역블로팅, 단일-통로 기록 및 본원에 개시된 임의의 기타의 것을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 생물학적 분석법 또는 방법으로 평가할 수 있다.

본 발명은 또한 상기의 확인 방법으로 확인되는 약제와, 이 약제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 약제는 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는 데에 유용하며, 다른 RyR2-결부 질병을 치료 또는 예방하는 데에 유용할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "RyR2-결부 질병"은 RyR2의 수준 또는 활성이 연루된 질병, 질환 또는 장애이며, RyR2-결부된 생물학적 사건을 포함한다. RyR2-결부된 질병은 대상에서 RyR2-결부된 질병을 치료 또는 예방하기에 유효한 양의 약제를 대상에게 투여함으로써 대상에서 치료 또는 예방될 수 있다. 이 양은 당업계의 숙련자에 의해 손쉽게 결정될 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 약제를 대상에서 운동-유발성의 심장 돌연사를 예방하기에 유효한 양으로 대상에게 투여함으로써 대상에서 운동-유발성 심장 돌연사를 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는 데에 사용하기 위한 약제의 생체 내 확인 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) RyR2를 포함하는 동물을 수득하거나 생성하는 단계; (b) 후보 약제를 동물에게 투여하는 단계; (c) 세포에서 RyR2의 인산화를 증가시키는 것으로 공지된 하나 이상의 조건에 동물을 노출시키는 단계; 및 (d) 약제가 동물에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 방지하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 본 방법은 (e) 약제를 RyR2를 포함하는 동물에게 투여하는 단계; 및 (f) 약제가 동물에서 RyR2-결부된 생물학적 사건에 영향을 미치는지를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한 제공되는 것은 이 방법으로 확인되는 약제; 이 약제를 함유하는 약학 조성물; 및 이 약제를 대상에서 운동-유발성의 심장 돌연사를 예방하기에 유효한 양으로 대상에게 투여함으로써 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는 방법이다.

본 발명자들의 연구에 의하면, PKA 활성화를 차단하는 화합물이 RyR2 통로의 활성화를 감소시켜, 칼슘이 세포 내로 덜 방출되게 할 것이라 기대된다는 것이 입증되었다. FKBP12.6 결합 부위에서 RyR2 통로에 결합하지만, 이 통로가 PKA에 의해 인산화될 경우 이 통로로부터 떨어지지 않는 화합물은 PKA 활성화 또는 RyR2 통로를 활성화하는 기타 트리거 (trigger)에 응답하여 이 통로의 활성을 감소시킬 것으로 또한 기대된다. 그러한 화합물은 또한 세포 내로 칼슘을 덜 방출시킨다. 이러한 발견에 비추어 보면, 본 발명은 RyR2의 활성화를 차단 또는 저해한다는 점에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는 데에 유용할 수 있는 약제의 확인을 위한 추가의 분석법을 또한 제공한다.

예로서, 본 발명의 진단 분석에서는, 칼슘-민감성 형광 염료 (예를 들어, Fluo-3, Fura-2 등)를 사용하여, RyR2 통로를 통한 세포 내로의 칼슘의 방출을 스크리닝할 수 있다. 세포에 선택된 형광 염료를 로딩하고, 이어서 세포를 RyR2 활성제로 자극하여 세포에 첨가된 화합물이 칼슘-의존성 형광 신호를 감소시키는지의 여부를 결정할 수 있다 (문헌[Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77: 513-23, 1994]; 문헌[Gillo et al., Calcium entry during induced differentiation in murine erythroleukemia cells. Blood, 81: 783-92, 1993; 문헌[Jayaraman et al., Regulation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor by tyrosine phosphorylation. Science, 272: 1492-94, 1996]). 칼슘-의존성 형광 신호는 광전자증배관으로 모니터링하고, 이전에 기술된 바와 같이 적절한 소프트웨어를 이용하여 분석할 수 있다 (문헌[Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77: 513-23, 1994]; 문헌[Gillo et al., Calcium entry during induced differentiation in murine erythroleukemia cells. Blood, 81: 783-92, 1993]; 문헌[Jayaraman et al., Regulation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor by tyrosine phosphorylation. Science, 272: 1492-94, 1996]). 이 분석법은 용이하게 자동화하여 다중웰 디쉬를 사용하여 다수의 화합물을 스크리닝할 수 있다.

RyR2-매개 세포내 칼슘 방출의 PKA-의존성 활성화를 저해하는 화합물의 확인을 위하여, 분석법은 이종성 발현 시스템, 예를 들어 Sf9, HEK293, 또는 CHO 세포에서의 재조합 RyR2 통로의 발현을 포함할 수 있다 (문헌[Brillantes et al., Stabilization of calcium release channel (ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell, 77: 513-23, 1994]). RyR2는 또한 베타-아드레날린성 수용체와 함께 동시-발현될 수 있다. 이는 베타-아드레날린성 수용체 작동제의 첨가에 응답하는 RyR2 활성화에 대한 화합물의 영향의 평가를 허용한다.

심부전 정도와 상관 관계가 있는 RyR2의 PKA 인산화 수준이 또한 분석될 수 있으며, 이어서 이를 사용하여 RyR2 통로의 PKA 인산화를 차단하도록 고안된 화합물의 효능을 측정할 수 있다. 그러한 분석법은 RyR2 단백질에 특이적인 항체의 사용에 기초할 수 있다. 예를 들어, RyR2-통로 단백질은 면역침전시킬 수 있고, 이어서 PKA 및 [감마³²P]-ATP로 역-인산화시킬 수 있다. 이어서 RyR2 단백질로 전해지는 방사성 [³²P] 표지체의 양을 포스포르이미저 (phosphorimager)를 사용하여 측정할 수 있다 (문헌[Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000]).

본 발명의 다른 분석법은 Ser 2809 상에서 PKA 인산화되는 RyR2를 탐지하는 포스포에피토프-특이성 항체의 사용을 포함한다. 그러한 항체를 이용한 면역블로팅을 사용하여 심부전 및 심장 부정맥에 대한 치료법의 효능을 평가할 수 있다. 추가로, RyR2 S2809A 및 RyR2 S2809D 넉-인 (knock-in) 생쥐를 사용하여 심부전 및 심장 부정맥에 있어서의 치료법의 효능을 평가할 수도 있다. 그러한 생쥐는, RyR2 S2809A 돌연변이가 심부전 및 부정맥을 저해하며, RyR2 S2809D 돌연변이가 심부전 및 부정맥을 악화시킨다는 것을 보여줌으로써 RyR2의 PKA 과인산화가 심부전 및 심장 부정맥에 있어서 기여 요인이라는 증거를 또한 제공한다.

신규 화합물, 이의 합성 방법, 및 이의 용도

1,4-벤조티아제핀 유도체, 특히 2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 유도체는 JTV-519를 포함하는 생물학적 활성 분자의 제조에서 중요한 빌딩 블록 (building block)이다. 본 발명자들은 1,4-벤조티아제핀 중간체 화합물, 예를 들어 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀의 신규한 제조 방법을 개발하였다. 본 발명자들의 방법에서는 손쉽게 입수가능하며 값싼 출발 재료가 이용되며, 본 방법은 고수율의 주요 1,4-벤조티아제핀 중간체를 제공한다.

1990년대 초에, Kaneko 등 (미국 특허 제5,416,066호; WO 92/12148; JP4230681)은 JTV-519가 7-메톡시-2,3,4,5- 테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 (1,4-벤조티아제핀 중간체)을 아크릴로일 클로라이드와 반응시키고, 이어서 생성된 생성물을 4-벤질 피페리딘과 반응시킴으로써 제조될 수 있다는 것을 개시하였다.

7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 및 유사 화합물을 제조하는 두 가지 방법이 문헌에 이전에 보고되었었다. Kaneko 등 (미국 특허 제5,416,066호)에 의해 개시된 첫번째 방법은 2,5-디히드록시벤조산으로 출발하는 6 단계의 합성 경로를 포함한다. 상기 방법에서, 2,5-디히드록시벤조산은 디메틸 술페이트로 선택적으로 메틸화되었다. 이어서 생성된 화합물은 디메틸티오카르바모일 클로라이드와 20시간 반응시키고, 이어서 고온 (270℃)에 9시간 동안 처리하였다. 이 단계의 생성물을 메탄올 중 소듐 메톡시드를 이용하여 20시간 동안 환류시켰다. 이어서 환류 단계의 생성물을 염기성 조건 하에서 그리고 고온에서 2-클로로에틸아민과 반응시켜 환화(cyclized) 아미드를 생성하였다. 환화 아미드를 LiAlH₄로 환원시켜 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 (1,4-벤조티아제핀 중간체)를 생성하였다.

7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀의 두번째 제조 방법은 Hitoshi에 의해 일본 특허 (JP 10045706)에 개시되어 있다. 상기 방법은 2-브로모-5-메톡시 벤즈알데히드로 출발하였다. 브로마이드를 NaSMe로 치환하고 생성된 생성물을 염소로 산화시키고, 이어서 물에서 환류시켜 디술피드 디알데히드를 생성하였다. 이 디알데히드를 2-클로로에틸아민으로 처리하고, 생성된 생성물을 환원제, 예를 들어 NaBH₄로 환원시켰다. 생성된 화합물을 환화시켜 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀을 생성하였다.

처음에, 본 발명자들은 상기에 기술된 방법을 사용하여 1,4-벤조티아제핀 중간체, 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀을 제조하려고 시도하였다. 그러나, Kaneko 등 (미국 특허 제5,416,066호)이 기술한 첫번째 방법은 고온 및 오랜 반응 시간의 합성 단계를 포함한다는 것이 발견되었다. 추가로, 본 발명자들은 제3 티올화 중간체 중 티오기가 공기에 의해 디술피드 화합물로 산화되어, 후속 환화 생성물을 합성하는 것이 불가능해진다는 것을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 Hitoshi (JP 10045706)가 기술한 방법이 Cl₂를 포함하며, 브로마이드의 NaSMe를 이용한 치환 이외에도 제1 중간체의 다른 특허된 제조 방법이 사용되어야만 한다고 단정하였다.

상기 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 손쉽게 입수가능하며 값싼 출발 재료로부터 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀을 제조하는 신규한 방법을 개발하였다. 본 발명자들의 방법은 단리 및 정제 단계를 단순화하며, 하기에 예시된 일반 구조를 갖는, 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 및 기타 화합물을 포함하는 다양한 1,4-벤조티아제핀 중간체의 제조에 사용될 수 있다:

R₁ = n-MeO, n-MeS, n-알킬, n = 6,7,8,9

R₂ = 알킬

R₃ = 알킬

본 방법은 또한 JTV-519의 제조에 사용될 수 있다.

따라서, 전술한 사항에 비추어 보면, 본 발명은 하기 식:

(식 중, R은 OR', SR', NR', 알킬, 또는 할라이드이며, R'은 알킬, 아릴, 또는 H이며, R은 2, 3, 4, 또는 5위치일 수 있음)을 갖는 화합물의 합성 방법을 제공하며, 본 방법은

(a) 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을, 선택적 촉매의 존재 하에 환원제로 처리하여 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 형성된 화합물을 디아조화제 및 디술피드로 처리하여 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계;

(c) 단계 (b)에서 형성된 화합물을 활성제 및 클로로에틸아민으로 처리하여 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계;

(d) 단계 (c)에서 형성된 화합물을 환원제 및 염기로 처리하여 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계; 및

(e) 단계 (d)에서 형성된 화합물을 환원제로 처리하여 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법에 따르면, 단계 (a)에서의 환원제는 H₂일 수 있다. 추가로, 단계 (b)에서의 디아조화제는 NaN0₂일 수 있으며, 단계 (b)에서의 디술피드는 Na₂S₂일 수 있다. 또한, 단계 (c)에서의 클로라이드는 SOCl₂일 수 있다. 단계 (d)에서의 환원제는 트리메틸포스핀 (PMe₃)일 수 있으며, 반면, 단계 (d)에서의 염기는 트리에틸 아민이다. 다른 실시 형태에 있어서, 단계 (e)에서의 환원제는 LiAlH₄이다.

본 발명은 또한 하기 식:

(식 중, R은 OR', SR', NR', 알킬, 또는 할라이드이며, R'은 알킬, 아릴, 또는 H이며, R은 2, 3, 4, 또는 5 위치일 수 있음)을 갖는 화합물의 합성 방법을 제공하며, 본 방법은

(a) 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 3-브로모프로피온산 클로라이드 및 하기 식:

을 갖는 화합물로 처리하여 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계를 포함한다.

예로서, 하기 식:

(식 중, R은 OR', SR', NR', 알킬, 또는 할라이드이며, R'은 알킬, 아릴, 또는 H이며, R은 2, 3, 4, 또는 5 위치일 수 있음)을 갖는 화합물은 하기와 같이 합성될 수 있다:

예로서, 그리고 하기 실시예 7 및 반응식 1에 예시되어 있는 바와 같이, 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀은 하기와 같이 2-니트로-5-메톡시벤조산으로부터 제조될 수 있다. 2-니트로-5-메톡시벤조산의 니트로기는 H₂를 사용하여 Pd/C를 촉매로 이용하여 환원시켜 2-아미노-5-메톡시벤조산을 생성한다. 2-아미노-5-메톡시벤조산은 NaNO₂로 디아조화하고, 이어서 Na₂S₂로 처리하여 안정한 디술피드 화합물을 제공할 수 있다. 추가의 정제 없이, 안정한 디술피드 화합물을 SOCl₂로 처리하고, 이어서 Et₃N의 존재 하에 2-클로로에틸아민과 반응시켜 아미드를 생성할 수 있다. 이어서 이 아미드 화합물은 하기와 같이 단일-포트 (one-pot) 절차를 통하여 환화 화합물로 전환시킬 수 있다. 환원제 (예를 들어 트리메틸포스핀 또는 트리페닐포스핀) 및 염기 (예를 들어 트리에틸아민)을 THF (테트라히드로푸란) 중 아미드 화합물의 용액에 첨가할 수 있다. 이어서 생성된 반응 혼합물을 3시간 동안 환류시킬 수 있다. 환원제 (트리메틸포스핀 또는 트리페닐핀)는 디술피드 (S-S)를 이의 일술피드 (-S)로 절단하며, 이는 원위치에서 클로라이드를 이용하여 분자내 환화를 받아 환화 아미드를 생성한다. 이어서 환화 아미드는 LiAlH₄로 환원시켜 1,4-벤조티아제핀 중간체, 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀을 생성할 수 있다. 이어서 JTV-519는 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀을 3-브로모프로피온산 클로라이드와 반응시키고 이어서 생성된 화합물을 4-벤질 피페리딘과 반응시킴으로써 7-메톡시- 2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀으로부터 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 방사성 표지화된 JTV-519를 함유하는 조성물을 제공한다. JTV-519의 표지는 당업계에 공지된 다양한 상이한 방사능 표지체 중 하나를 사용하여 달성할 수 있다. 본 발명의 방사성 표지체는 예를 들어 방사성 동위원소일 수 있다. 방사성 동위원소는 제한됨이 없이 ³⁵S, ¹²⁵I, ³H 또는 ¹⁴C를 포함하는 검출가능한 방사선을 방사하는 임의의 동위원소일 수 있다. 방사성(동위원소)에 의해 방사되는 방사능은 당업계에 잘 알려진 기술로 검출할 수 있다. 예를 들어, 방사성 동위원소로부터의 감마선 방사는 감마선 영상화 기술, 특히, 섬광 계수적 영상화법을 사용하여 검출할 수 있다.

예로서, 그리고 하기 실시예 8 및 반응식 2에 예시되어 있는 바와 같이, 방사성 표지화된 JTV-519는 하기와 같이 제조할 수 있다. JTV-519는 BBr₃을 사용하여 페닐 고리에서 탈메틸화할 수 있다. 이어서 생성된 페놀 화합물은 염기 (예를 들어 NaH)의 존재 하에 방사성 표지화된 메틸화제 (예를 들어 ³H-디메틸 술페이트)로 재메틸화시켜 ³H-표지화된 JTV-519를 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 JTV-519와 유사한 2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제펜을 포함하는 신규한 1,4-벤조티아제핀 중간체 및 유도체를 제공한다. 예로서, 본 발명은 하기 식들을 갖는 화합물을 제공한다:

(식 중, R은 아릴, 알케닐, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임);

(식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임);

(식 중, R은 CO(CH₂)_nXR'₂, SO₂(CH₂)_nXR'₂, 또는 S0₂NH(CH₂)_nXR'₂이며, X는 N 또는 S이며, n은 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; m은 1 또는 2임); 및

(식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; X는 NH 또는 O임). 또한 제공되는 것은 하기 식을 갖는 추가의 2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 화합물이다:

(식 중, R₁은 페닐 고리 상의 2, 3, 4, 또는 5 위치의 OR', SR', NR', 알킬, 또는 할라이드이며, R'은 알킬, 아릴, 또는 H이며; R₂는 H, 알킬, 또는 아릴이며; R₃은 H, 알킬, 또는 아릴임).

본 발명자들의 신규한 1,4-벤조티아제핀 화합물의 예는 제한됨이 없이 S7, S-20, S-25, S-27, 및 S36을 포함한다. 바람직하게는 본 화합물은 S36이다. S7, S-20, S-25, S-27, 및 S36의 구조는 본 출원의 도 8에서 발견할 수 있다. 본 발명의 이러한 화합물 및 임의의 기타 신규한 화합물은 약학 조성물의 형성을 위하여 상기한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체와 결부될 수 있다.

본 발명자들의 신규한 1,4-벤조티아제핀 화합물은 기능적 특성을 JTV-519와 공유한다. 예를 들어, JTV-519 (mwt = 423)와 같이, 화합물 S36 (mwt= 267)은 칼슘 통로를 조절한다. 실제로, S36 (카르복실산)은 칼슘 통로의 조절에 있어서 JTV-519보다 대략 10배 더 강력하다 (데이터는 예시되어 있지 않음). 그러나, JTV-519와는 달리, 본 발명자들의 신규한 화합물은 hERG의 약한 차단 활성을 나타낸다.

신속한 지연된 정류 (I (Kr)) 통로 - 칼륨 통로 - 가 심장 활동 전위의 재분극에 중요하다. hERG는 I (Kr) 통로의 세공 (pore) 형성 서브유닛이다. I (Kr) 기능의 억제 - 약물의 부작용 및/또는 hERG에서의 유전자 결함의 결과로서 - 는 QT 간격 연장 증후군 (long-QT (LQT) syndrome)에 이를 수 있으며, 이는 생명을 위협하는 부정맥 (life-threatening arrhythmias)의 위험성 증가를 수반한다. 그 다음, hERG는 차단될 경우 심장 부정맥 및 심장성 돌연사를 야기할 수 있는 칼륨 통로 서브유닛이다.

본 발명자들의 화합물은 JTV-519와 비교할 때 hERG (I (Kr)) 통로의 차단을 유의하게 감소시켰다. 도 4-7에 도시되어 있는 바와 같이, 예를 들어 본 발명자들의 화합물 중 하나인 S36은 JTV-519의 hERG 차단 활성보다 대략 5 내지 10배 더 낮은 hERG 차단 활성을 갖는다. 본 발명자들의 화합물은 약한 hERG 차단 활성을 갖기 때문에, 본 화합물은 JTV-519보다 독성이 덜할 것으로 기대된다.

전술한 사항에 기초하면, 본 발명자들의 신규한 `1,4-벤조티아제핀 화합물은 JTV-519보다 강력하며 감소된 독성을 갖는다. 따라서, 본 발명자들의 신규한 화합물은 심부전, 심장 부정맥, 또는 운동-유발성의 심장성 돌연사의 후보인 대상을 포함하는 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 감소를 제한 또는 방지하는 상기에 기술한 방법들 중 임의의 방법에서 특히 유용할 것이라 생각된다. 또한, 본 발명자들의 신규한 화합물은 대상에서 심부전, 심방 세동, 및 운동-유발성의 심장 돌연사를 치료 또는 예방하는 방법, 및 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는 방법에서 특히 유용할 것이라 생각된다.

따라서, 본 발명은 또한 약제를 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 방지하기에 유효한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 방지하는 방법을 제공하며, 상기 약제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다:

(a)

(식 중, R은 아릴, 알케닐, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임);

(b)

(식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임);

(c)

(식 중, R은 CO(CH₂)_nXR'₂, SO₂(CH₂)_nXR'₂, 또는 S0₂NH(CH₂)_nXR'₂이며, X는 N 또는 S이며, n은 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며, m은 1 또는 2임)

(d)

(식 중, R = 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; X는 NH 또는 O임);

(e)

(식 중, R₁은 페닐 고리 상의 2, 3, 4 또는 5 위치의 OR', SR', NR', 알킬, 또는 할라이드이며, R'은 알킬, 아릴, 또는 H이며; R₂는 H, 알킬, 또는 아릴이며; R₃은 H, 알킬, 또는 아릴임). 상기한 바와 같이, 대상은 임의의 동물일 수 있지만, 바람직하게는 인간이다. 일 실시 형태에 있어서, 대상은 카테콜아민성 다형 심실 빈맥 (CPVT)을 갖는다. 다른 실시 형태에 있어서, 대상은 심부전, 심방 세동, 또는 운동-유발성의 심장성 돌연사의 후보이다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 본 약제는 S4, S7, S-20, S-24, S-25, S-26, S-27, 및 S36으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 약제의 구조는 도 8에서 발견할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소는 대상에서 인산화 RyR2의 수준을 감소시킴으로써 대상에서 제한 또는 방지할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 방지하기에 유효한 약제의 양은 대상에서 심부전, 심방 세동, 및/또는 운동-유발성의 심장성 돌연사를 치료 또는 예방하기에 유효한 약제의 양이다. 다른 실시 형태에 있어서, 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 방지하기에 유효한 약제의 양은 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하기에 유효한 약제의 양이다.

전술한 사항에 비추어 보면, 또한 본 발명은 본원에서 기재한 바와 같이 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 치료 또는 예방하기에 유효한 양의 신규한 1,4-벤조티아제핀 화합물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 운동-유발성 심장 부정맥을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 마찬가지로, 본 발명은 본원에서 기재한 바와 같이 대상에서 운동-유발성의 심장 돌연사를 예방하기에 유효한 양의 신규한 1,4-벤조티아제핀 화합물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는 방법을 제공한다. 부가적으로, 본 발명은 본원에서 기재한 바와 같이 대상에서 심방 세동 또는 심부전을 치료 또는 예방하기에 유효한 양의 신규한 1,4-벤조티아제핀 화합물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 심방 세동 또는 심부전을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 각각의 방법에서, 신규한 1,4-벤조티아제핀 화합물은 하기 식들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:

(a)

(식 중, R은 아릴, 알케닐, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임);

(b)

(식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임);

(c)

(식 중, R은 CO(CH₂)_nXR'₂, SO₂(CH₂)_nXR'₂, 또는 S0₂NH(CH₂)_nXR'₂이며, X는 N 또는 S이며, n은 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며, m은 1 또는 2임)

(d)

(식 중, R = 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; X는 NH 또는 O임); 및

(e)

(식 중, R₁은 페닐 고리 상의 2, 3, 4 또는 5 위치의 OR', SR', NR', 알킬, 또는 할라이드이며, R'은 알킬, 아릴, 또는 H이며; R₂는 H, 알킬, 또는 아릴이며; R₃은 H, 알킬, 또는 아릴임).

또한 본 발명은 본원에서 기술한 신규한 1,4-벤조티아제핀 화합물의 합성 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 하기 식을 갖는 화합물의 합성 방법을 제공하고,

(식 중, R은 아릴, 알케닐, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임)

상기 방법은

(a) 하기 식:

을 갖는 화합물을 술포닐 클로라이드 화합물 (임의의 술포닐 클로라이드 유도체를 포함) 및 염기로 처리하여 하기 식:

을 갖는 화합물을 형성하는 단계;

(b) 선택적으로, 단계 (a)에서 형성된 화합물을 일차 또는 이차 아민으로 처리하여 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의한 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에 있어서, 단계 (a)에서 술포닐 클로라이드 화합물은 알킬술포닐 클로라이드 및 아릴술포닐 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시 형태에 있어서, 단계 (a)에서 염기는 Et₃N이다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 단계 (b)에서 일차 또는 이차 아민은 4-벤질피페리딘이다.

본 발명은 또한 하기 식:

(식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임)을 갖는 화합물을 산화제로 산화시켜 하기 화학식:

(식 중, R은 상기에 정의한 바와 같고, m은 1 또는 2임)을 갖는 화합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 산화제는 과산화수소이다.

예로서, 그리고 실시예 9 및 반응식 3에 예시되어 있는 바와 같이, 본 발명자들은 하기 일반 구조를 갖는 화합물의 합성 방법을 개발하였다:

여기서, R은 아릴, 알케닐, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이다. 이러한 일반 구조의 신규한 화합물은 염기, 예를 들어 Et₃N의 존재 하에 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀을 알킬술포닐 클로라이드 또는 아릴술포닐 클로라이드와 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 추가의 반응 (예를 들어, 4-벤질 피페리딘의 첨가)을 수반하여 필요에 따라 측쇄를 연장시킬 수 있다. 반응식 3이 보여주는 바와 같이, 2-클로로에탄술포닐 클로라이드 (예를 들어, 180 mg; 1.1 mM) 및 Et₃N (예를 들어, 140 mg; 1.1 mM)은 0℃에서 CH₂Cl_{2 (}예를 들어, 20 ml) 중 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 (1) (예를 들어, 194 mg; 1 mM)에 첨가될 수 있다. 이어서 이 혼합물을 교반시키고 (예를 들어, 0℃에서 2시간 동안), 세척하였다 (예를 들어, H₂0 및 포화 NaHC0₃ 용액을 이용). 용매의 제거에 의해 미정제 생성물을 생성하고, 이를 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 구조는 NMR로 확인할 수 있다. 반응식 3에는 생성된 화합물의 측쇄가 이 화합물 (예를 들어 28 mg; 0.1 mM)을 CH₂Cl₂ 중 4-벤질 피페리딘 (예를 들어, 21 mg; 0.13 mM)과 반응시킴으로써 연장될 수 있음이 또한 예시되어 있다. 반응이 완료된 후, 여분의 아민은 염기 제거제(scavenger) (예를 들어, 3-(2-숙신산 무수물)프로필작용화 실리카 겔, 0.5 g)로 제거할 수 있다.

본 발명은 또한 하기 식:

(식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임)의 화합물의 합성 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 식:

을 갖는 화합물을 염기의 존재 하에 염화술퍼릴 및 일차 또는 이차 아민으로 처리하여 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 실시 형태에 있어서, 염기는 Et₃N이다. 다른 실시 형태에 있어서, 일차 또는 이차 아민은 1-피페로닐피페라진이다.

본 발명의 방법은 하기 식:

(식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임)을 갖는 화합물을 산화시켜 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같으며, m은 1 또는 2임)을 갖는 화합물을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, 산화제는 과산화수소이다.

예로서, 그리고 실시예 9 및 반응식 4에 예시되어 있는 바와 같이, 본 발명자들은 하기 일반 구조를 갖는 화합물의 합성 방법을 개발하였다:

여기서, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이다. 이러한 일반 구조의 신규한 화합물은 염기 (예를 들어, Et₃N)의 존재 하에서의 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀의 염화술퍼릴, 이어서 일차 또는 이차 아민과의 단일-포트 반응에 의해 제조할 수 있다. 반응식 4가 보여주는 바와 같이, 염화술퍼릴 (예를 들어, 15.0 mg; 0.111 mM) 및 Et₃N (예를 들어, 28.0 mg; 0.22 mM)을 0℃에서 CH₂Cl_{2 (}예를 들어, 20 ml) 중 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 (예를 들어, 19.4 mg; 0.1 mM)에 첨가할 수 있다. 이 혼합물의 교반 (예를 들어, 0℃에서 2시간 동안) 후, 1-피페로닐피페라진 (예를 들어, 27 mg; 0.12 mM)을 첨가할 수 있다. 이 혼합물을 추가로 2시간 동안 교반시키고, 이어서 (예를 들어, H₂0 및 포화 NaHC0₃ 용액으로) 세척할 수 있다. 여분의 아민은 염기 제거제 (예를 들어, 3-(2-숙신산 무수물)프로필작용화 실리카 겔, 0.2 g)를 첨가하여 제거할 수 있다.

본 발명은 또한 하기 식:

(식 중, R은 CO(CH₂)_nXR'₂, SO₂(CH₂)_nXR'₂, 또는 S0₂NH(CH₂)_nXR'₂이며, X는 N 또는 S이며, n은 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; m은 1 또는 2임)을 갖는 화합물의 합성 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 식:

(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 산화제로 처리하여 하기 식:

(식 중, R 및 m은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에 있어서, 산화제는 과산화수소이다. 또한 이 방법을 사용하여 JTV-519를 산화시킬 수 있다.

본 발명은 또한 하기 식:

(식 중, R은 CO(CH₂)_nXR'₂, SO₂(CH₂)_nXR'₂, 또는 S0₂NH(CH₂)_nXR'₂이며, X는 N 또는 S이며, n은 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; m은 1 또는 2임)을 갖는 화합물의 합성 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 식:

을 갖는 화합물을 산화제로 처리하여 하기 식:

(식 중, R 및 m은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에 있어서, 산화제는 과산화수소이다. 또한 이 방법을 사용하여 JTV-519를 산화시킬 수 있다.

예로서, 실시예 9 및 반응식 5에 예시되어 있는 바와 같이, 본 발명자들은 하기 일반 구조를 갖는 화합물의 합성 방법을 개발하였다:

여기서, R은 CO(CH₂)_nXR'₂, SO₂(CH₂)_nXR'₂, 또는 S0₂NH(CH₂)_nXR'₂이며, X는 N 또는 S이며, n은 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; m은 1 또는 2이다. 이러한 일반 구조의 신규한 화합물은 JTV-519, 또는 본원에 개시된 신규한 1,4-벤조티아제핀 유도체 중 하나를 과산화수소로 산화시킴으로써 제조할 수 있다. 반응식 5에 예시되어 있는 바와 같이, MeOH (예를 들어, 5 ml) 중의 목적하는 1,4-벤조티아제핀 화합물 (예를 들어, 21 mg; 0.05 mM)이 H₂0₂ (예를 들어, 0.1 ml, 과량)에 첨가될 수 있다. 이 혼합물을 교반시킬 수 있으며 (예를 들어, 2일 동안), 생성된 생성물을 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (예를 들어, CH₂Cl₂:MeOH = 10:1)로 정제할 수 있다.

추가로, 본 발명은 하기 식:

(식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; X는 NH 또는 O임)을 갖는 화합물의 합성 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 식:

을 갖는 화합물을 염기의 존재 하에 카르보닐 클로라이드 화합물과, 그리고 일차 또는 이차 아민 또는 알코올로 처리하여 하기 식:

(식 중, R 및 X는 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에 있어서, 카르보닐 클로라이드 화합물은 트리포스겐이다. 다른 실시 형태에 있어서, 염기는 Et₃N이다. 또 다른 실시 형태에 있어서, 일차 또는 이차 아민은 4-벤질피페리딘이다.

예로서, 그리고 실시예 9 및 반응식 6에 예시되어 있는 바와 같이, 본 발명자들은 하기 일반 구조를 갖는 화합물의 합성 방법을 개발하였다:

여기서, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; X는 NH 또는 O이다. 이러한 일반 구조의 신규한 화합물은 염기 (예를 들어, Et₃N)의 존재 하에 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀을 트리포스겐과 반응시키고, 이어서 일차 또는 이차 아민 또는 알코올을 첨가함으로써 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 하기 식:

(식 중, R₁은 페닐 고리 상의 2, 3, 4, 또는 5 위치의 OR', SR', NR', 알킬, 또는 할라이드이며, R'은 알킬, 아릴, 또는 H이며; R₂는 H, 알킬, 또는 아릴이며; R₃은 H, 알킬, 또는 아릴임)을 갖는 2,3,4,5- 테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 화합물의 합성 방법을 제공하며, 본 방법은

(a) 하기 식:

(식 중, R₁은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 선택적 촉매의 존재 하에 환원제로 처리하여 하기 식:

(식 중, R₁은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 형성된 화합물을 디아조화제 및 디술피드로 처리하여 하기 식:

(식 중, R₁은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계;

(c) 단계 (b)에서 형성된 화합물을 활성제 및 클로로에틸아민으로 처리하여 하기 식:

(식 중, R₁, R₂, 및 R₃은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계;

(d) 단계 (c)에서 형성된 화합물을 환원제 및 염기로 처리하여 하기 식:

(식 중, R₁, R₂, 및 R₃은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계; 및

(e) 단계 (d)에서 형성된 화합물을 환원제로 처리하여 하기 식:

(식 중, R₁, R₂, 및 R₃은 상기에 정의된 바와 같음)을 갖는 화합물을 형성하는 단계를 포함한다.

또한 본 발명은 FKBP12.6 및 RyR2의 재결합을 기초로 하는, 작은 생물학적 활성 분자의 정기적이거나 많은 처리량의 스크리닝을 위한 신규한 분석법을 제공한다. 특히, 본 발명은 RyR2 및 FKBP12.6의 결합을 증가시키는 약제의 확인 방법으로서, (a) RyR2의 공급원을 수득하거나 생성하는 단계; (b) 후보 약제의 존재 하에 RyR2를 FKBP12.6에 노출시키는 단계; 및 (c) 약제가 RyR2와 FKBP12.6의 결합을 증강시키는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, RyR2는 PKA-인산화된다. 다른 실시 형태에 있어서, RyR2는 PKA-과인산화된다. 또 다른 실시 형태에 있어서, RyR2는 비인산화된다.

본 발명의 방법에 있어서, RyR2는 고체상, 예를 들어, 플레이트 또는 비드에 고정시킨다. RyR2-FKBP12.6 결합의 탐지를 용이하게 하기 위하여, FKBP12.6을 (예를 들어 ³²S로) 방사성(동위원소)으로 표지할 수 있다. 또한, RyR2와 FKBP12.6의 결합의 증강은 FKBP12.6-결합제를 사용하여 탐지할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, FKBP12.6-결합제는 항-FKBP12.6 항체이다. 또한 본 발명은 이 방법으로 확인되는 약제와, 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 방지하는 방법; 대상에서 심부전, 심방 세동, 또는 운동-유발성 심장 부정맥을 치료 또는 예방하는 방법; 및 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는 방법에 있어서의 이 약제의 용도를 제공한다.

추가로, 본 발명은 RyR2와 FKBP12.6의 결합을 증강시키는 약제를 확인하는 방법으로서, (a) FKBP12.6의 공급원을 수득하거나 생성하는 단계; (b) 후보 약제의 존재 하에 FKBP12.6을 RyR2에 노출시키는 단계; 및 (c) 약제가 RyR2와 FKBP12.6의 결합을 증강시키는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에 있어서, RyR2는 PKA-인산화된다. 다른 실시 형태에 있어서, RyR2는 PKA-과인산화된다. 또 다른 실시 형태에 있어서, RyR2는 비인산화된다.

본 발명의 방법에 있어서, FKBP12.6은 고체상, 예를 들어, 플레이트 또는 비드에 고정시킨다. RyR2-FKBP12.6 결합의 탐지를 용이하게 하기 위하여, RyR2를 (예를 들어 ³²P로) 방사성(동위원소)으로 표지할 수 있다. 또한, RyR2와 FKBP12.6의 결합의 증강은 RyR2-결합제를 사용하여 탐지할 수 있다. 일 실시 형태에 있어서, RyR2-결합제는 항-RyR2 항체이다. 또한 본 발명은 이 방법으로 확인되는 약제와, 대상에서 RyR2-결합 FKBP12.6의 수준의 감소를 제한 또는 방지하는 방법; 대상에서 심부전, 심방 세동, 또는 운동-유발성 심장 부정맥을 치료 또는 예방하는 방법; 및 대상에서 운동-유발성의 심장성 돌연사를 예방하는 방법에 있어서의 이 약제의 용도를 제공한다.

예로서, 그리고 하기 실시예 10에 예시되어 있는 바와 같이, 작은 분자용의 많은 처리량의 스크리닝을 위한 고도로 효율적인 분석법을, 표준 절차를 사용하여 글루타티온으로 코팅된 96웰 플레이트 상으로 FKBP12.6 (예를 들어, 야생형 FKBP12.6 또는 융합 단백질, 예를 들어 GST-FKBP12.6)을 고정시킴으로써 개발할 수 있다. PKA-인산화된 제2형 라이아노딘 수용체 (RyR2)를 FKBP12.6-코팅된 플레이트 상으로 로딩하고, 다양한 농도 (10-100 nM)의 JTV-519 유사체 및 기타 1,4-벤조티아제펜 유도체와 함께 30분 동안 인큐베이션할 수 있다. 그 후, 플레이트를 세척하여 미결합 RyR2를 제거하고, 이어서 항-RyR2 항체와 함께 (예를 들어, 30분 동안) 인큐베이션할 수 있다. 플레이트를 다시 세척하여 미결합 항-RyR2 항체를 제거하고, 이어서 형광-표지 이차 항체로 처리할 수 있다. 플레이트는 결합 활성에 대하여 자동 형광 플레이트 판독기로 판독될 수 있다.

대안적으로는, RyR2는 ³²P-ATP의 존재 하에 PKA-인산화될 수 있다. 방사성 PAK-인산화된 RyR2는 다양한 농도 (10-100 nM)의 JTV-519 유사체 및 기타 1,4-벤조티아제펜 유도체의 존재 하에 30분 동안 FKBP12.6-코팅된 96웰 플레이트 상으로 로딩할 수 있다. 플레이트를 세척하여 미결합 방사성(동위원소) 표지화된 RyR2를 제거하고, 이어서 자동 플레이트 판독기로 판독할 수 있다. PKA-인산화 RyR2를 또한 플레이트에 코팅하고, 이 유사체 및 유도체의 존재 하에 ³²S-표지된 FKBP12.6과 함께 인큐베이션시킬 수 있다.

본 발명을 하기 실시예에서 설명하는데, 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 나타낸 것이며, 하기에 이어지는 청구의 범위에 정의되어 있는 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 파악되어서는 아니된다.

실시예 1 - FKBP12 .6-결함 생쥐

이전에 기술한 바와 같이, FKBP12.6-결함 생쥐를 생성하였다 (문헌[Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113: 829-40, 2003]). 간략하게는, 인간 FK506 결합 단백질 12.6 (FKBP12.6)의 쥣과 오르토로그 (orthologue)에 대한 생쥐 게놈 λ-파지 클론을, 전장 쥣과 cDNA 프로브를 사용하여 DBA/llacJ 라이브러리로부터 단리하였다. 표적화 벡터는, 3.5 kb의 쥣과 게놈 DNA를 선발가능한 PGK-neo 마커로 대체함으로써 엑손 3 및 4가 결실되도록 고안하였는데, 상기 엑손은 쥣과 FKBP12.6의 전체 코딩 서열을 포함한다 (문헌[Bennett et al., Identification and characterization of the murine FK506 binding protein (FKBP) 12.6 gene. Mamm. Genome, 9: 1069-71, 1998]). 5.0-kb의 5' 단편 및 1.9-kb의 3' 단편은 PGK-neo 및 PGK-TK 카세트를 포함하는 골격 벡터인 pJNS2 내로 클로닝하였다. 확립된 프로토콜을 사용하여 DBA/lacJ 배아 줄기 (embryonic stem, ES) 세포를 배양하고 트랜스펙션시켰다. 표적화 ES 세포는 먼저 서던 (Southern) 분석으로 스크리닝하고, 5개의 양성 ES 세포주를 PCR로 분석하여 상동 재조합을 확인하였다. 수컷 키메라를 DBA/llacJ 암컷에 대하여 번식시키고, 생식 세포 자손을 갈색의 털 색상으로 확인하였다. 생식 세포 자손은 5' 서던 분석 법을 사용하여 유전자형을 결정하였다. 양성 FKBP12.6^+/- 수컷 및 암컷을 상호 교배하였으며, 자손은 대략 25%의 빈도로 FKBP12.6^-/- 생쥐로 되었다. FKBP12.6^-/- 생쥐는 수정 능력을 갖는 것이었다.

FKBP12.6^-/- 생쥐를 이용하여 수행한 모든 연구에서는 연령- 및 성별-매치되는 FKBP12.6^+/+ 생쥐를 대조로 사용하였다. 하기의 배경에 대하여 증대된 (raised) FKBP12.6^-/- 생쥐들 사이에는 차이가 전혀 관찰되지 않았다: DBA/C57BL6 혼합, 순수 DBA, 및 순수 C57BL6.

실시예 2 - 생쥐에서의 원격 측정 기록 및 운동 시험

FKBP12.6^+/+ 및 FKBP12.6^-/- 생쥐는 Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University에 의해 승인된 프로토콜에 따라 유지 및 연구하였다. 생쥐를 2.5%의 이소플루란 흡입 마취법을 사용하여 마취시켰다. 보행 동물의 ECG 방사성 원격 측정 기록은 복강내 이식한지 >7일 후에 수득하였다 (Data Sciences International, 미국 미네소타주 세인트 폴 소재) (문헌[Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113: 829-40, 2003]). 스트레스 시험에 있어서, 생쥐를 피로해질 때까지 경사진 트레드밀 (treadmill) 상에서 운동을 하게 하고, 이어서 에피네프린을 복강내로 주사 하였다 (0.5-2.0 mg/kg) (문헌[Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113: 829-40, 2003]). 보행 동물의 휴식 심박동수를 4시간에 걸쳐 평균하였다.

실시예 3 - 야생형 및 RyR2 - S2809D 돌연변이체의 발현

이전에 기술한 바와 같이, RyR2 상의 PKA 표적 부위의 돌연변이 유발 (RyR2-S2809D)을 수행하였다 (문헌[Wehrens et al., FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113: 829-40, 2003]). HEK293 세포는, Ca^{2 +} 포스페이트 침전법을 사용하여, 20 ㎍의 RyR2 야생형 (WT) 또는 돌연변이체의 cDNA, 및 5 ㎍의 FKBP12.6의 cDNA로 동시 트랜스펙션시켰다. 이전에 기술한 바와 같이 RyR2 통로를 포함하는 소포 (vesicle)를 제조하였다 (문헌[Wehrens et al.,FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell, 113: 829-40, 2003]).

실시예 4 - RyR2 의 PKA 인산화 및 FKBP12 .6의 결합

이전에 기술한 바와 같이 심장 SR 막을 준비하였다 (문헌[Marx et al., PKA phosphorylation dissociatesFKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365- 76, 2000]; 문헌[Kaftan et al., Effects of rapamycin on ryanodinereceptor/Ca^{2 +}-release channels from cardiac muscle. Circ. Res., 78: 990-97, 1996]). ³⁵S-표지된 FKBP12.6을 Promega (미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터의 TNT^TM Quick Coupled Transcription/Translation 시스템을 사용하여 생성하였다. [³H]라이아노딘 결합을 이용하여 RyR2의 수준을 정량화하였다. 100 ㎍의 마이크로좀을 100 ㎕의 10-mM 이미다졸 완충제 (pH 6.8)에 희석시키고 250-nM (최종 농도)의 [³⁵S]-FKBP12.6과 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 500 ㎕의 빙냉 이미다졸 완충제로 켄칭하였다 (quenched). 샘플을 100,000 g에서 10분 동안 원심분리하고 이미다졸 완충제에서 3회 세척하였다. 결합된 [³⁵S]-FKBP12.6의 양을 펠렛의 액체 섬광 계수법으로 측정하였다.

실시예 5 - 면역블롯

실온에서 1시간 동안 항-FKBP12/12.6 (1:1,000), 항-RyR-5029 (1: 3,000) (문헌[Jayaraman et al., FK506 binding protein associated with the calcium release channel (ryanodine receptor). J. Biol. Chem., 267: 9474-77, 1992]), 또는 항-포스포RyR2-P2809 (1:5,000) (문헌[Reiken et al., Beta-blockers restore calcium release channel function and improve cardiac muscle performance in human heart failure. Circulation, 107: 2459-66, 2003])를 이용하여 상기한 바와 같이 마이크로좀 (50 ㎍)의 면역블로팅을 수행하였다. P2809-포스포에피토프-특이성 항-RyR2 항체는, Ser²⁸⁰⁹에서 PKA-인산화된 RyR2에 상응하는, 펩티드 CRTRRI-(pS)-QTSQ를 사용하여 Zymed Laboratories (미국 캘리포니아주 샌 프란시스코 소재)가 주문 생산한 친화성-정제 다중클론 토끼 항체이다. HRP-표지된 항-토끼 IgG (1:5,000의 희석물; Transduction Laboratories, 미국 켄터키주 렉싱턴 소재)와 함께 인큐베이션한 후, 블롯을 ECL (Amersham Pharmacia, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하여 발색시켰다.

실시예 6 - 단일-통로 기록

이전에 기술된 바와 같이, 설치류 (생쥐 또는 쥐) 심장 유래의 천연 RyR2 또는 재조합 RyR2의 단일-통로 기록은 0 mV에서의 전압-클램프 (clamp) 조건 하에서 획득하였다 (문헌[Marx et al., PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell, 101: 365-76, 2000]). 통로 기록에 사용되는 대칭 용액 (symmetric solution)은 트랜스 (trans) 구획용은 HEPES, 250 mmol/L; Ba (OH)₂, 53 mmol/L (몇몇 실험에서, Ba (OH)₂는 Ca (OH)₂로 대체함); pH 7.35였으며; 시스 (cis) 구획용은 HEPES, 250 mmol/L; 트리스-염기, 125 mmol/L; EGTA, 1.0 mmol/L; 및 CaCl₂, 0.5 mmol/L; pH 7.35였다. 달리 나타내지 않는 한, 단일-구획 기록은 시스 구획에서 150-nM의 [Ca^{2 +}] 및 1.0-mM의 [Mg^{2 +}]의 존재 하에 행하였다. 라이아노딘 (5 mM)을 시스 구획에 가하여 모든 통로의 신원을 확인하였다. 데이터는 Fetchan 소프트웨어 (Axon Instruments, 미국 캘리포니아주 유니온 시티 소재)를 사용하여 디지털화 전류 기록으로부터 분석하였다. 모든 데이터는 평균 ± SE로 표현한다. 실험들간의 평균 값의 통계학적 비교에 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-검정 (unpaired Student's t-test)을 이용하였다. p<0.05의 값을 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

RyR2 통로에 대한 JTV-519의 영향을 도 1-3 및 표 1 (하기)에 나타낸다. 도 3에서 입증되는 바와 같이, 단일-통로 연구에 의하면 특정 PKA 저해제, PKI_{5 -24} (C)의 존재 하에서의 PKA 인산화에 비하여, PKA 인산화 (D) 이후 RyR2의 개방 확률이 증가됨이 밝혀졌다. 단일-통로 기능은 JTV-519의 존재 하에 FKBP12.6과 함께 인큐베이션한 PKA-인산화 RyR2에서 정상화하였다 (E). 크기 도수 분포도 (우측)에 의하면 PKA-인산화 RyR2에서는 증가된 활성 및 서브컨덕턴스 개방이 나타났지만, JTV-519 및 FKBP12.6을 이용한 처리 이후에는 그러하지 않았다. 도 3F에는 JTV-519의 존재 하에 PKA-인산화 RyR2를 FKBP12.6RHK 함께 인큐베이션하면 RyR2 활성화의 Ca^{2 +}-의존성이 우측으로 이동하여, 이것이 비인산화 통로의 Ca^{2 +}-의존성과 유사해진다는 것이 도시되어 있다.

실시예 7 - 1,4- 벤조티아제핀 유도체 및 JTV -519의 합성

생체 내 실험에 있어서, 본 발명자들은 그램 단위의 양의 JTV-519가 필요하였다. 그러나, 이 화합물을 보고된 1,4-벤조티아제핀 중간체, 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 (하기 반응식 1에서의 화합물 6)를 통하여 제조하려는 처음의 시도는 성공적이지 못하였다. 이 중간체의 티오기는 공기에 의해 디술피드 화합물로 용이하게 산화되며, 이는 환화 생성물 (5)의 합성을 불가능하게 한다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 손쉽게 입수가능하며 값싼 2-니트로-5-메톡시벤조산 (1)으로 출발하는 신규한 공정을 개발하였다. 이 공정이 하기 반응식 1에 나타내어져 있다.

촉매로서 Pd/C를 이용하여 H₂를 사용하여 화합물 (1)의 니트로기를 환원시켜 2-아미노-5-메톡시벤조산 (2)을 정량적 수율로 생성하였다. 화합물 (2)를 NaN0₂로 디아조화하고, 이어서 Na₂S₂로 처리하여 안정한 디술피드 화합물 (3)을 80% 수율로 제공하였다. 추가의 정제 없이, 안정한 디술피드 (3)를 SOCl₂로 처리하고, 이어서 Et₃N의 존재 하에 2-클로로에틸아민과 반응시켜 아미드 (4)를 90% 수율로 생성하였다. 화합물 (4)를 THF 중 Et₃N 및 트리메틸포스핀을 이용하여 환류에 의해 단일-포트 절차를 통하여 환화 화합물 (5)로 전환시켰다. 이어서 환화 아미드 (5)를 LiAlH₄로 환원시켜 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 (6)을 생성하였다.

JTV-519는 화합물 (6)을 3-브로모프로피온산 클로라이드와 반응시키고 이어서 생성된 생성물을 4-벤질 피페리딘과 반응시킴으로써 제조하였다. JTV-519의 구조는 ¹H NMR로 확립하였다.

실시예 8 - 방사성(동위원소) 표지화된 JTV -519의 합성

방사성(동위원소) 표지화된 JTV-519의 합성에 있어서의 본 발명자들의 신규한 공정이 하기 반응식 2에 예시되어 있다. 방사성(동위원소) 표지화된 JTV-519의 제조를 위하여, JTV-519를 BBr₃을 사용하여 페닐 고리에서 탈메틸화하여 페놀 화합물 (21)을 생성하였다. 페놀 화합물 (21)을 염기 (NaH)의 존재 하에 방사성(동위원소) 표지화된 메틸화제 (³H-디메틸 술페이트)로 재메틸화하여 ³H-표지 JTV-519를 제공하였다 (반응식 2).

실시예 9 - 신규한 1,4- 벤조티아제핀 유도체 및 이의 합성 방법

본 발명자들은 또한 심장 부정맥의 치료 및 예방에 사용하기 위한 신규한 1,4-벤조티아제핀 유도체를 개발하였다. 특히, 본 발명자들은 하기의 일반 구조를 갖는 화합물을 제조하였다:

여기서, R은 아릴, 알케닐, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며; R'은 알킬 또는 시클로알킬이다. 이러한 일반 구조의 신규한 화합물은 염기, 예를 들어 Et₃N의 존재 하에 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀을 알킬술포닐 클로라이드 또는 아릴술포닐 클로라이드와 반응시킴으로써 제조하였다. 추가의 반응 (예를 들어, 4-벤질 피페리딘의 첨가)을 수반하여 필요에 따라 측쇄를 연장시킬 수 있다. 이러한 일반적인 공정의 대표적인 합성법이 하기 반응식 3에 예시되어 있다.

반응식 3이 보여주는 바와 같이, 2-클로로에탄술포닐 클로라이드 (180 mg; 1.1 mM) 및 Et₃N (140 mg;1.1 mM)은 0℃에서 CH₂Cl₂ (20 ml) 중 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 (1) (194 mg; 1 mM)에 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반시키고, H₂0 및 포화 NaHC0₃ 용액으로 세척하였다. 용매를 제거하여 조 생성물 (Ia)를 생성하고, 이를 실리카 겔 상에서 크로마토그래피로 (석유 에테르:에틸 아세테이트 = 3:1) 정제하였다. 이 합성법으로부터의 수율은 280 mg, 또는 95%였다. 구조는 NMR로 확인하였다.

반응식 3에는 또한 화합물 (Ia)의 측쇄를, 화합물 (Ia) (28 mg; 0.1 mM)을 CH₂Cl₂ 중 4-벤질 피페리딘 (21 mg; 0.13 mM)과 반응시킴으로써 연장시킨다는 것이 예시되어 있다. 반응의 완료 후 (TLC에 의한 것임), 여분의 아민을 염기 제거제 (3-(2-숙신산 무수물)프로필작용화 실리카 겔, 0.5g)로 제거하였다. ¹H NMR 및 HPLC에 의하면, 생성물 (Ib)의 순도는 >98%라는 것이 밝혀졌다.

추가로, 본 발명자들은 하기 일반 구조를 갖는 화합물을 제조하였다:

여기서, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며; R'은 알킬 또는 시클로알킬이다. 이러한 일반 구조의 신규한 화합물은 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 (1)을 염기 (Et₃N)의 존재 하에 술퍼릴 클로라이드와, 이어서 일차 또는 이차 아민과 단일-포트 반응시킴으로써 제조하였다. 이러한 일반 공정의 대표적인 합성법이 하기 반응식 4에 예시되어 있다.

반응식 4가 보여주는 바와 같이, 술퍼릴 클로라이드 (15.0 mg; 0.111 mM) 및 Et₃N (28.0 mg; 0.22 mM)을 0℃에서 CH₂Cl_{2 (}20 ml) 중 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 (1) (19.4 mg; 0.1 mM)에 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반시킨 후, 1-피페로닐피페라진 (27 mg; 0.12 mM)을 첨가하였다. 이 혼합물을 추가로 2시간 동안 교반시키고, 이어서 H₂0 및 포화 NaHC0₃ 용액으로 세척하였다. 여분의 아민을 염기 제거제 (3-(2-숙신산 무수물)프로필작용화 실리카 겔, 0.2 g)의 첨가로 제거하였다. 이 합성법으로부터의 수율은 36 mg, 또는 77%였다.

본 발명자들은 하기 일반 구조를 갖는 화합물도 제조하였다:

여기서, R"은 CO(CH₂)_nXR'''₂, SO₂(CH₂)_nXR'''₂, 또는 SO₂NH(CH₂)_nXR'''₂이며, X는 N 또는 S이며, n은 1, 2, 또는 3이다. 이러한 일반 구조의 신규한 화합물은 과산화수소를 이용하여 상기의 신규한 1,4-벤조티아제핀 유도체 중 하나를 산화시키거나 JTV-519를 산화시켜 제조하였다. 이러한 일반 공정의 대표적인 합성법이 하기 반응식 5에 예시되어 있다.

반응식 5가 보여주는 바와 같이, MeOH(5 ml) 중 화합물 (Ib) (21 mg; 0.05 mM)를 H₂0₂ (0.1 ml, 과량)에 첨가하였다. 이 혼합물을 2일 동안 교반시키고, 생성물 III을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피로 (CH₂Cl₂:MeOH = 10:1) 정제하였다. 이 합성법으로부터의 수율은 19 mg, 또는 91%였다.

마지막으로, 본 발명자들은 하기 일반 구조를 갖는 화합물을 제조하였다:

여기서, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬, 시클로알킬이며, X는 NH 또는 O이다. 이러한 일반 구조의 신규한 화합물은 7-메톡시-2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 (1)을 염기 (Et₃N)의 존재 하에 트리포스겐과 반응시키고, 이어서 일차 또는 이차 아민 또는 알코올을 첨가함으로써 제조하였다. 이러한 일반 공정의 대표적인 합성법이 하기 반응식 6에 예시되어 있다.

실시예 10 - 많은 처리량의 스크리닝을 위한 분석

본 발명자들은 작은 생물학적 활성 분자의 스크리닝을 위한 분석법을 개발하였다. 이러한 분석법은 FKBP12 단백질의 RyR에의 재결합에 기초한다.

작은 분자에 대한 많은 처리량의 스크리닝을 위한 고도로 효율적인 분석법은 글루타티온으로 코팅된 96웰 플레이트 상으로 FKBP12.6 (GST-융합 단백질)을 고정시킴으로써 개발할 수 있다. PKA-인산화 제2형 라이아노딘 수용체 (RyR2)를 FKBP 12.6-코팅된 플레이트 상으로 로딩하고, 다양한 농도 (10-100 nM)의 JTV-519 유사체와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 세척하여 미결합 RyR2를 제거하고, 이어서 항-RyR2 항체와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하여 미결합 항-RyR2 항체를 제거하고, 이어서 형광-표지 이차 항체로 처리하였다. 플레이트를 결합 활성에 대하여 자동 형광 플레이트 판독기로 판독한다.

대안적인 분석법에 있어서, RyR2를 ³²P-ATP의 존재 하에 PKA-인산화시킨다. 방사성 PKA-인산화 RyR2를 다양한 농도 (10-100 nM)의 JTV-519 유사체의 존재 하에 30분 동안 FKBP12.6-코팅된 96웰 플레이트 상으로 로딩한다. 플레이트를 세척하여 미결합 방사성 동위원소 표지 RyR2를 제거하고, 이어서 자동 플레이트 판독기로 판독한다.

전술한 발명을 명료함 및 이해를 위해 일부 상세하게 기술하였지만, 당업계의 숙련자라면 본 개시 내용을 읽음으로써 첨부되는 청구의 범위에서의 본 발명의 실제 범주로부터 벗어남이 없이 형태 및 상세한 사항을 다양하게 변화시킬 수 있음을 인식할 것이다.

Claims (22)

1. 하기 화학식의 화합물:

   

   상기 식 중, R은 아릴, 알케닐, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이다.
2. 하기 화학식의 화합물:

   

   상기 식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이다.
3. 하기 화학식의 화합물:

   

   상기 식 중, R은 CO(CH₂)_nXR'₂, SO₂(CH₂)_nXR'₂, 또는 S0₂NH(CH₂)_nXR'₂이며, X는 N 또는 S이며, n은 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며, m은 1 또는 2이다.
4. 하기 화학식의 화합물:

   

   상기 식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; X는 NH 또는 O이다.
5. S7, S20, S25, S27 및 S36으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
6. 화학식

   

   (식 중, R은 아릴, 알케닐, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임)의 화합물의 합성 방법으로서,

   (a) 화학식

   

   의 화합물을 술포닐 클로라이드 화합물 및 염기로 처 리하여 화학식

   

   의 화합물을 형성하는 단계; 및

   (b) 선택적으로, 단계 (a)에서 형성된 화합물을 일차 또는 이차 아민으로 처리하여 화학식

   

   (식 중, R은 상기 정의한 바와 같음)의 화합물을 형성하는 단계

   를 포함하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 단계 (a)의 술포닐 클로라이드 화합물은 알킬술포닐 클로라이드 및 아릴술포닐 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 단계 (a)의 염기는 Et₃N인 방법.
9. 제6항에 있어서, 단계 (b)의 일차 아민 또는 이차 아민은 4-벤질피페리딘인 방법.
10. 제6항에 있어서,

    화학식

    

    (식 중, R은 아릴, 알케닐, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임)의 화합물을 산화제로 산화시켜 화학식

    

    (식 중, R은 상기 정의한 바와 같으며, m은 1 또는 2임)의 화합물을 형성하는 단계

    를 더 포함하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 산화제가 과산화수소인 방법.
12. 화학식

    

    (식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임)의 화합물의 합성 방법으로서,

    화학식

    

    의 화합물을 염기의 존재 하에 술퍼릴 클로라이드 및 일차 또는 이차 아민으로 처리하여 화학식

    

    (식 중, R은 상기 정의한 바와 같음)의 화합물을 형성하는 단계

    를 포함하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 염기가 Et₃N인 방법.
14. 제12항에 있어서, 일차 또는 이차 아민이 1-피페로닐피페라진인 방법.
15. 제12항에 있어서,

    화학식

    

    (식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬임)의 화합물을 산화시켜 화학식

    

    (식 중, R은 상기 정의한 바와 같으며, m은 1 또는 2임)이 화합물을 형성하는 단계

    를 더 포함하는 방법.
16. 화학식

    

    (식 중, R은 CO(CH₂)_nXR'₂, SO₂(CH₂)_nXR'₂, 또는 S0₂NH(CH₂)_nXR'₂이며, X는 N 또는 S이며, n은 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; m은 1 또는 2임)의 화합물의 합성 방법으로서,

    화학식

    

    (식 중, R은 상기에 정의된 바와 같음)의 화합물을 산화 제로 처리하여 화학식

    

    (식 중, R 및 m은 상기 정의한 바와 같음)의 화합물을 형성하는 단계

    를 포함하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 산화제가 과산화수소인 방법.
18. 화학식

    

    (식 중, R은 아릴, 알킬, -(CH₂)_nNR'₂, 또는 -(CH₂)_nSR'이며, n은 0, 1, 2, 또는 3이며, R'은 알킬 또는 시클로알킬이며; X는 NH 또는 O임)의 화합물의 합성 방법으로서,

    화학식

    

    의 화합물을 염기의 존재 하에 카르보닐 클로라이드 화합물과, 일차 또는 이차 아민 또는 알코올로 처리하여 화학식

    

    (식 중, R 및 X는 상기 정의한 바와 같음)의 화합물을 형성하는 단계

    를 포함하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 카르보닐 클로라이드 화합물이 트리포스겐인 방법.
20. 제18항에 있어서, 염기가 Et₃N인 방법.
21. 제18항에 있어서, 일차 또는 이차 아민이 4-벤질피페리딘인 방법.
22. 화학식

    

    (식 중, R₁은 페닐 고리 상의 2, 3, 4, 또는 5 위치의 OR', SR', NR', 알킬, 또는 할라이드이며, R'은 알킬, 아릴, 또는 H이며; R₂는 H, 알킬, 또는 아릴이며; R₃은 H, 알킬, 또는 아릴임)의 2,3,4,5-테트라히드로-1,4-벤조티아제핀 화합물의 합성 방법으로서,

    (a) 화학식

    

    (식 중, R₁은 상기 정의한 바와 같음)의 화합물을 선택적 촉매의 존재 하에 환원제로 처리하여 화학식

    

    (식 중, R₁은 상기 정의한 바와 같음)의 화합물을 형성하는 단계;

    (b) 단계 (a)에서 형성된 화합물을 디아조화제 및 디술피드로 처리하여 화학식

    

    (식 중, R₁은 상기 정의한 바와 같음)의 화합물을 형성하는 단계;

    (c) 단계 (b)에서 형성된 화합물을 활성제 및 클로로에틸아민으로 처리하여 화학식

    

    (식 중, R₁, R₂, 및 R₃은 상기에 정의한 바와 같음)의 화합물을 형성하는 단계;

    (d) 단계 (c)에서 형성된 화합물을 환원제 및 염기로 처리하여 화학식

    

    (식 중, R₁, R₂, 및 R₃은 상기 정의한 바와 같음)의 화합물을 형성하는 단계; 및

    (e) 단계 (d)에서 형성된 화합물을 환원제로 처리하여 화학식

    

    (식 중, R₁, R₂, 및 R₃은 상기 정의한 바와 같음)의 화합물을 형성하는 단계

    를 포함하는 방법.

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