KR20070116631A - 비타민 ｃ의 생체이용률을 조절하기 위한 영양 조성물 - Google Patents
비타민 ｃ의 생체이용률을 조절하기 위한 영양 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 개체 중 비타민 C 생체이용률을 조절할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 비타민 C 전달체의 발현을 조절할 수 있는 화합물의 식별 방법, 식품 또는 식료품 중 상기 화합물의 용도 및 질환 또는 스트레스 조직의 치료 또는 예방을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 개체 중 비타민 C의 생체이용률을 조절하는 영양 및 약학 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 비타민 C 전달체의 발현을 조절할 수 있는 화합물을 식별하기 위한 방법, 영양 및 약학 조성물 중 상기 화합물의 용도 및 질환 또는 스트레스 조직의 치료 또는 예방을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
비타민은 신체의 대사 기능에 다양한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다.
예를 들어, 지용성 비타민 A (레티날)는 대사되어 야맹증의 치료 또는 예방에 유용한, 레티노이드로 불리는 각종 유도체를 생성하는 것으로 공지되어 있다. 또한, 레티노이드 또는 비타민 A는 각각 햇빛에 손상된 피부의 외관을 개선하기 위한 치료제로서 사용된다.
크게 주목을 받는 또다른 비타민은, 신체에서 일어나는 생물학적 과정에 있어서 다인자성 성분인 것으로 보이는 비타민 C (아스코르브산, 2,3-디데히드로-L-트레오헥사노-1,4-락톤)이다.
비타민 C는 결합 조직 성분, 예컨대 엘라스틴, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 골 기질 및 엘라스틴 결합 피브릴린의 생합성에 수반되는 다수의 효소 반응에 요구 된다. 더욱이, 이는 콜라겐 유전자 발현 및 세포 프로콜라겐 배출의 역할을 하는 것으로 보인다. 아스코르브산은 카르니틴 생합성 경로에 보조인자이기도 하고, 철 흡수, 운반 및 저장의 조절에 수반된다. 이는 산화제이철을 산화제일철로 환원시킴으로서 철의 장 흡수를 보조하고, 페리틴 합성을 자극하여 세포 내의 철 저장을 촉진할 수 있다. 또한, 이는 코르티코스테로이드, 알도스테론의 생합성, 콜레스테롤의 담즙산으로의 전환에 수반된다.
무엇보다도, 비타민 C는 이의 산화방지 특성으로 공지되어 있다. 연구 결과 혈청 항산화 물질이 부족한 상태는 다수의 질환, 예컨대 관상동맥성 심질환, 암, 및 종종 중추신경계 내의 산화 스트레스에 의해 야기되는 신경변성 질환의 진행의 원인이 되는 것으로 밝혀졌다.
명백하게, 비타민 C는 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 식도, 폐, 췌장, 전립선, 침샘, 위, 백혈병 및 비호지킨 림프종을 비롯한 수많은 각종 유형의 암의 발병의 예방에 효과적인 것으로 보인다. 또한, 비타민 C는 피부에 대한 해로운 효과에 의해 유발된 영향의 치료 또는 예방에 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다.
비타민은 신체 내에서 합성되지 않고, 외인성 공급원으로부터, 일반적으로는 식이로 공급되어야 한다. 그러나, 서구형 음식은 일반적으로 너무 다량의 지방을 함유하는 반면, 비타민은 부족한 것이 특징이고, 따라서, 대부분의 경우에 수많은 비타민을 공급하는 것이 차선책이다. 이러한 상황에서, 비타민을 보조제의 형태로 공급하는 것이 관행이다.
상기 보조제는 하나의 비타민만을, 또는 다수의 비타민을 포함할 수 있고, 후자의 경우 제품은 소위 멀티-비타민 제제로 불린다. 또한, 비타민은 질환의 치료 또는 예방을 위하여 신체의 특정 부위에, 예컨대 스킨 케어 제품을 통해 공급될 수 있다.
현재 모든 비타민 투여 형태의 문제점은 비타민을 생체 이용가능한 형태, 즉 신체/세포가 쉽게 흡수할 수 있는 형태로 제공하는 것에 있다. 예로서, 개인은, 예를 들어 화학적 수단에 의해 제조된 아스코르브산의 일정량을 공급받을 수 있는 반면, 이의 제한된 양만을 흡수할 것이고, 따라서 이러한 목적을 극대화하기 위하여 아주반트 성분이 명백하게 필요할 것으로 보인다. 구체적으로, 이는 장애의 치료를 위하여 과량의 투여량, 즉 과잉 투여량의 비타민을 이용하여, 상기 과량의 투여량이 치료에 유용한 약역학적 작용을 할 수 있도록 하는 경우에 관심을 갖는 것이다.
따라서, 본 발명의 문제점은 비타민을 개체에게 생체 이용가능한 형태로 전달하는 수단을 제공하는 데 있다.
상기 문제점은 표적 세포 중 비타민 C의 섭취가 증가되고 비타민 C의 섭취가 활발하게 촉진되고 조절될 수 있거나, 표적 세포 중 비타민 C의 섭취가 감소되도록 세포 중 비타민 C 전달체의 전사를 조절할 수 있는 화합물 및/또는 영양 및 약학 조성물을 제공함으로써 해결된다.
본 발명에 이르는 광범위한 실험적 연구에서, 저명한 발명자들은 세포 배양 실험에서 특정 화합물이 비타민 C의 세포내 수준을 조절한다는 점에 주목했다. 상기 발견 이후, 세포를 더 조사하여, 예를 들어 세포내 비타민 C를 낮추는 것이 비타민 C 전달체 mRNA의 수준을 낮추는 것과 동반된다는 점을 입증하였다. 어떤 이론에 국한되고자 하는 것은 아니지만, 세포 중 비타민 C 전달체의 전사를 조절할 수 있는 상기 화합물은 비타민 C 전달체 유전자의 유전자 전사에 작용하여, 표적 세포에 의한 비타민 C 섭취가 증가되거나 세포에 의한 비타민 C 섭취가 감소되거나 심지어는 무력해지게 하는 효과를 각각 가져서 상기 단백질의 증가되거나 감소된 수준을 야기하는 것으로 현재 믿고 있다.
최근의 연구는 인간을 비롯한 포유동물 중 2개의 나트륨 의존적 비타민 C 전달체 (SVCT 1 및 SCVT 2, 유전자 기호: SLC23A1 및 SLC23A2)의 존재를 증명하였다. 래트 조직 상의 제자리 하이브리드화는 상피 표면, 예컨대 장, 신장 및 간에 대한 SVCT 1 발현을 제한한 반면, SVCT 2는 뇌, 눈, 신장 및 뇌하수체, 폐, 위 및 고환에서 광범위하게 발현된다. SVCT 1은 벌크 수송 상피에 크게 한정된 반면, 이는 전신 항상성의 역할을 한다는 점이 입증되었다. 현재까지, 피부에서의 SVCT의 발현은 보고되지 않았다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 SVCT 유전자 발현의 시험관내 시험에 대한 실험 설비를 나타내는 차트이다. 융합 1차 케라티노사이트 (NHEK)를 시험 화합물 또는 대조군으로 처리하고, 37℃ 에서 4 시간, 8 시간, 16 시간 또는 24 시간 항온배양하였다. 총 세포질 RNA 를 단리하고, 이어서 SVCT 1 및 SVCT 2의 역전사 및 실시간 PCR 분석에 사용하였다. 18S-rRNA 및 GAPDH mRNA 분석은 내인성 대조군 (하우스키핑 유전 자)으로서 작용하였다.
도 2는 2.5% 로즈메리 추출물로 처리된 1차 케라티노사이트의 실시간 PCR 분석을 보여준다. 대조군 세포와 비교시 로즈메리 추출물로 처리된 1차 케라티노사이트 (NHEK)의 상대적 발현의 GAPDH에 대한 폴드(fold) 변화가 보여진다. 점은, 각각 기술적 3회 반복의 4개의 생물학적 샘플의 평균을 나타낸다. 4시간 째의 세포를 1 폴드로 설정하고 이를 그레이디드 라인(graded line)으로 나타낸다. ANOVA를 사용하여 신뢰 구간을 계산하였다. 화살 막대가 1 폴드 라인에 닿지 않는 한 데이타는 통계적으로 유의한 것이다.
도 3은 아스코르브산 섭취의 시험관내 시험에 대한 실험 설비를 나타내는 차트이다. 융합 HaCaT 세포를 시험 화합물 또는 대조군으로 18 ∼ 24시간 동안 처리하고, 2가지 상이한 농도 (5 μM 및 250 μM)의 14C-표지된 아스코르브산과 함께 5분, 10분, 30분, 60분, 90분 및 120분 동안 항온배양하였다. 세포를 용해시키고, 상청액 및 세포 용해물 중 방사성 동위원소를 섬광 계수에 의해 측량하였다.
도 4는 2.5% 로즈메리 추출물의 유무하에 처리된 1차 케라티노사이트 중 아스코르브산 섭취를 나타낸다. NHEK를 2.5% 로즈메리 추출물 (색칠된 원) 또는 대조군 (비어있는 원)으로 24시간 동안 처리하고, 14C-표지된 아스코르브산의 섭취를 상이한 시점 이후에 측정하고, 웰당 nmol로서 표시하였다 (A: 5 μM 아스코르브산, B: 250 μM 아스코르브산). 데이타는 2회 반복 측정의 평균치를 나타내고, 독립적 실험 세트에서 재생하였다 (데이타는 도시되지 않음).
도 5는 산화 스트레스의 모델에서의 아스코르브산 섭취의 시험관내 시험을 보여준다. 융합 HaCaT 세포를 50 μM 메나디온 (menadione, 검정색 마름모), 500 μM H2O2 (삼각형), UV-조사된 HaCaT 세포로부터 얻은 상태조절된 배지 (사각형) 또는 대조군 (회색 마름모)으로 2시간 동안 처리하고, 이어서 50 μM의 14C-표지된 아스코르브산과 함께 5분, 10분, 30분, 60분, 90분 및 120분 동안 항온배양하였다. 세포를 용해하고, 상청액 및 세포 용해물 중 방사성 동위원소를 섬광 계수에 의해 측량하였다. 실험 스케줄을 보여주는 차트는 A에 도시되어 있다. B에 표시된 데이타는 각각 2회의 기술적 반복의 3회의 독립적 실험의 해당 표준 편차를 갖는 평균치를 나타낸다.
도 6은 산화 스트레스의 모델에 있어서 아스코르브산 섭취의 시험관내 시험을 보여준다. 융합 HaCaT 세포를 50 μM FeCl3 (삼각형) 또는 대조군 (회색 마름모)으로 24시간 동안 처리하고, 50 μM 메나디온 (색칠된 기호) 또는 대조군 (비어있는 기호)으로 추가의 2시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 50 μM의 14C-표지된 아스코르브산과 함께 5분, 10분, 30분, 60분, 90분 및 120분 동안 항온배양하고, 세포를 용해하며, 상청액 및 세포 용해물 중 방사성 동위원소를 섬광 계수에 의해 측량하였다. 실험 스케줄을 보여주는 차트는 A에 도시되어 있다. B에 도시된 데이타는 각각 2회의 기술적 반복의 2회의 독립적 실험의 해당 표준 편차를 갖는 평균치를 나타낸다.
구체예에 따르면, 본 발명은 비타민 C의 세포내 수준을 조절할 수 있는 화합물을 제공한다. 화합물은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다: (a) 세포 배양물을 제조하는 단계; (b) 상기 세포 배양물을 식별될 화합물의 적절한 양 및 비타민 C의 적절한 양에 노출시키는 단계; (c) 조직 세포 중 비타민 C의 수준 또는 비타민 C 전달체의 발현 속도를 측정하는 단계; 및 (d) 비타민 C 전달체의 발현 속도를 대조군과 비교하는 단계.
일반적으로, 상기 약술된 방법을 수행하기 위하여, 세포 배양은 임의의 종류의 생물체, 예를 들어, 인간을 비롯한 동물 유래의 세포주 또는 조직으로부터의 세포를 사용함으로써 수행하여 1차 세포 배양물을 제공할 수 있다. 구체예에 따르면, 세포는, 본 발명에 따르면 세포 배양의 편의를 위하여 고정될 수 있는 멜라노사이트 및/또는 케라티노사이트인 상피 세포이다.
세포는 통상의 조건 하에, 예를 들어, RPMI 배지, KGM 배지 또는 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle medium) 중에서 특정 수로 증식되고, 이는 토마 챔버 (Thoma Chamber) 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다.
이어서, 시험 화합물을 배지에 첨가하고, 동시에 또는 일정 시간 후에 소정량의 비타민 C를 첨가한다. 세포 배양물에 첨가할 비타민 C의 양은 바람직하게는 0.1 μM ∼ 10 mM의 범위이고, 더 바람직하게는 0.1 μM ∼ 0.5 mM의 범위인 반면, 시험 화합물의 양은 순수 화합물의 경우 0.1 μM ∼ 100 μM의 범위이고, 천연-제품 추출물의 경우 0.001% (w/v) ∼ 0.5% (w/v)의 범위이며, 더 바람직하게는 순수 화합물의 경우 1 μM ∼ 100 μM의 범위이고, 천연-제품 추출물의 경우 0.01% (w/v) ∼ 0.5% (w/v)이다. 추출물의 제조는 당업자에게 공지되어 있다. 추출물은 예를 들어 임의의 종류의 수성 추출물 또는 가수분해되거나 가수분해되지 않은 에틸 아세테이트를 갖는 추출물일 수 있다. 시험 화합물 및 비타민 C는 분말로서 또는 용해된 형태로 첨가될 수 있다.
다음 단계에서, 시험 물질이 비타민 C 전달체의 발현에 미치는 효과를 측정한다. 이는 비타민 C 전달체의 mRNA 또는 단백질 수준, 또는 배양 상청액에 흡수되거나 잔류하는 비타민 C의 양을 측정함으로써 달성할 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 시험 물질의 효과는 비타민 C 전달체, 바람직하게는 비타민 C 전달체 SVCT 1 및 SVCT 2 (유전자 기호: SLC23A1 및 SLC23A2)의 전사를 평가함으로써 결정한다.
짧은 항온배양 기간 이후, 원심분리에 의해 세포를 배지로부터 분리한다. 비타민 C 전달체의 mRNA의 발현을 실시간 PCR 및/또는 노던 블롯 (nothern blot)을 통해 시각화하고 또한 측량할 수 있다.
실시간 PCR에서, 주형의 초기량을 특이적으로, 민감하게 그리고 재생가능하게 측량하고, 여기서 말기에서의 최종 증폭된 생성물의 양을 검출한다. 실시간 PCR은 반응 동안 방출된 형광을, 말기 검출과 대조시 각 PCR 사이클 동안의 증폭 산물 생성의 지표로서 모니터링한다. 일부 시스템에서는 실시간 반응 진행을 관측할 수 있다. 실시간 PCR 이 증폭의 크기를 검출하지 않으나, SYBR Green 또는 기타 적절한 형광 염료를 사용하지 않는 한 비특이적 증폭에 의한 영향을 받지 않는다. 측량은 PCR 생성물의 후-PCR 처리를 고려하지 않는다 (이는 경쟁적 RT-PCR에서는 필요함). 이는 처리량을 증가시키고, 이동시 오염의 가능성을 감소시킨다. 통상의 PCR과 비교시, 실시간 PCR은 또한 훨씬 광범위한 동적 범위를 제공한다. 임의의 분석의 동적 범위는 표적 농도가 얼마나 다양할 수 있으며 여전히 측량가능한지를 결정한다. 실시간 PCR은 바람직하게는 96 웰 포맷으로 수행하여 샘플의 고 처리량을 달성할 수 있다.
노던 블롯은 mRNA의 분자량의 측정, 이의 구별 및 또한 존재하는 mRNA의 상대적 양을 측정하는 것을 가능하게 한다. 전령 RNA (m RNA)를 먼저 겔 전기영동, 보통은 아가로스 겔에 의해 분리한다. 그 후 RNA를 블로팅 페이퍼, 바람직하게는 니트로셀룰로오스의 시트로 옮기나, 여기서 다른 종류의 페이퍼, 또는 막을 사용할 수 있다. RNA 분자는 이들이 겔 상에서 갖는 동일한 분리 패턴을 보유한다. 블롯을 단일 가닥 DNA인 프로브와 함께 항온배양한다. 상기 프로브는 상보적 RNA 서열과 염기쌍을 형성하고 그에 결합되어 2중 가닥 RNA-DNA 하이브리드를 형성할 것이다. 프로브는 볼 수 없으나, 이는 방사성 표지되어 있거나 이에 결합된 효소 (예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 호스래디시(horseradish) 퍼옥시다제, 또는 녹색 형광 단백질과 같은 형광 효소)를 갖는다. 그러면 프로브의 위치는, 결합된 효소가 이를 가시적 착색 산물로 전환시키거나 또는 X-선 필름에 노출될 광을 방출하는, 해당 기질과 함께 항온배양함으로써 밝힌다. 프로브가 방사성 표지된 경우, 이는 X-선 필름에 직접 노출시킬 수 있다. 그 후 얻어진 밴드를 건강한 조직 및 질환 또는 스트레스 조직 세포로부터의 대조군 샘플과 비교한다. 특히, 밴드의 크기 및 강도에 관심을 가지며, 이는 포토-이미징 장치를 통해 시각적으로 비교하거나 측량할 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 상기 비타민 C 전달체 단백질은 인간 나트륨 의존적 비타민 C 전달체 SVCT 1 및/또는 SVCT 2이다.
비타민 C 전달체 전사의 증가는 시험 물질이 세포에 의한 비타민 C 섭취를 증가시키는 능력을 나타내는 것인 반면, 비타민 C 전달체의 전사의 감소는 시험 물질이 세포에 의한 비타민 C 섭취를 감소시키는 능력을 나타내는 것이다.
대안으로, 세포에 의해 흡수된 비타민 C의 양은, 예를 들어, 14C-표지된 비타민 C를 사용하여 직접 측정할 수 있거나, 또는 세포가 특정 기간 동안 여분의 비타민을 저장할 수 있기 때문에 비타민 C의 환원성을 통해 측정할 수 있다. 세포는 적절한 방법, 예컨대 기계적 및 화학적 방법에 의해 분해된다. 이어서, 14C-표지된 비타민 C의 경우 섬광 계수에 의해, 또는 나트륨 2,6-디클로로페놀인도페놀 (DCPIP, Tillmans 시약), 페링 용액, 베네딕트 용액, 루골 용액의 환원 또는 요오드화칼륨에 의한 적정에 의해 검출을 수행할 수 있다. 고성능/고압 액체 크로마토그래프 (HPLC)를 통한 측정은 265 nm 파장에서의 UV-VIS 검출, 탈수소아스코르브산과 o-페닐디아민의 형광 생성물로의 유도체화 및, 예를 들어, 흑연 전극을 사용한 전기화학적 검출을 포함할 수 있다. 유리 라디칼도 전자 상자성 공명 (EPR)에 의해 직접 검출할 수 있다. 기타 방법으로서 질량 분석법 (MS) 또는 기체 크로마토그래피 (GC)를 들 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다. 각각의 결과를 음성 대조군과 비교하는 것이 바람직할 것이다.
조사할 화합물은 전달체 단백질의 발현에 영향을 미치고/조절할 수 있는 임의의 화학적 물질을 포함한다. 상기 화합물은 바람직하게는 천연-제품 추출물, 파이토케미칼 (phytochemical), 아미노산, 지방산 콜레스테롤, 무기물 및 당 유래일 수 있다.
구체예에 따르면, 상이한 유래의 로즈메리 추출물 (수성 유래 및 에틸 아세테이트 추출물 (가수분해된 것 및 가수분해되지 않은 것))은 SVCT 1 mRNA의 전사가 감소되고 세포에 의한 비타민 C 섭취가 감소된다는 점에서 비타민 C 전달체의 전사를 변형한다. SVCT 1 mRNA의 전사를 하향 조절할 수 있는 기타 화합물은 일부 파이토케미칼, 예컨대 설포라판, 모두 트란스인 레틴산(retinoic acid) 및 아연 또는 이의 염이고, 각각의 용도에 따라, 영양적, 약학적 또는 피부과적 허용 염, 예컨대 ZnCl2 이다. 상기 화합물은 시간 의존적 방식으로 이의 효과를 나타낸다. 상기 발견은 시험 화합물의 세포 독성 효과로 인한 것이 아니라, SVCT 1 mRNA 수준의 감소에서의 실제 포텐셜을 지시한다는 점이 밝혀졌다.
또다른 구체예에 따르면, 철 또는 이의 염, 각 용도에 따른 영양적, 약학적 또는 피부과적 허용염, 예컨대 FeCl3는, 비타민 C 전달체의 전사가 증가되고 세포에 의한 비타민 C 섭취가 증대된다는 관점에서 비타민 C 전달체의 전사를 변형한다. 상기 특징을 나타내는 기타 화합물은 글루타티온, N-아세틸-시스테인 및 라이신이다. 이는, 상이한 유래의 식품 화합물도 조직에 대한 아스코르브산의 생체 이용률을 증가시킬 수 있다는 점을 지시하는 것이다. 놀랍게도, 비타민 C 전달체의 전사를 증가시킬 수 있는 상기 언급한 화합물의 효과는 상기 화합물, 예컨대 FeCl3 및 글루타티온 중 2종 이상을 조합함으로써 더 증대되고/강화될 수 있다는 점이 발견되었다.
대안적 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 비타민 C 전달체의 전사가 증가되거나 감소된다는 점에서 상기 약술한 특징을 갖는 화합물, 및 임의로 비타민 C를 함유하는 조성물을 제공한다.
대체로, 화합물은 임의의 영양 조성물, 예컨대 음료, 예를 들어, 차가운 음료 또는 따뜻한 음료, 예컨대 소프트 드링크 또는 차, 또는 식료품, 예를 들어, 소스에 포함될 수 있고, 향신료 등에 포함될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 화합물을 음료 중에 제공하거나 음료와 혼합할 수 있고, 또는 반-고체 식품, 예컨대 푸딩, 토핑, 소스, 퓨레, 조리된 시리얼, 또는 샐러드 드레싱에 섞을 수 있으며, 또는 음식에 첨가할 수 있다. 화합물은 특히 음식물에 첨가되는 칼로리의 양을 제한하는 것이 바람직한 경우, 하나 이상의 비활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의해 식별된 화합물은 또한 선택적 성분, 예컨대 허브, 아스코르베이트 이외의 기타 비타민, 무기물, 강화제, 착색제, 감미제, 향미제, 비활성 성분 등을 함유할 수 있다. 상기 선택적 성분은 천연적인 것 또는 농축 형태일 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 발명에 의해 고려되는 조성물은 영양 조성물, 예컨대 우유, 요구르트, 응유, 치즈, 발효유, 발효 유제품, 아이스크림, 발효 시리얼 제품, 우유 분말, 유아식 또는 애완동물 사료이다.
마찬가지로, 화합물은 약학 및/또는 화장료 조성물, 예를 들어, 멀티-비타민 정제와 같은 정제, 사체(sachet), 액체 현탁액, 건식 경구 보조제, 습식 경구 보조제, 건식 관 급식, 습식 관 급식, 크림, 로션, 연고 등으로 제형화될 수 있다. 각 형태의 약학 및/또는 화장료 조성물이 적절한 부형제 및/또는 담체, 예를 들어, 말토덱스트린, 탄산칼슘, 인산2칼슘, 인산3칼슘, 미정질 셀룰로오스, 덱스트로스, 쌀 분말, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 크로스카멜로스 나트륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스포비돈, 슈크로오스, 식물성 검, 락토오스, 메틸셀룰로오스, 포비돈, 카르복시메틸셀룰로오스, 옥수수 전분 등 (이의 혼합물을 포함함)을 필요로 하는 것이 바람직할 것이다. 바람직한 담체로서 탄산칼슘, 스테아르산마그네슘, 말토덱스트린 및 이의 혼합물을 들 수 있다.
각종 성분 및 부형제 및/또는 담체를 혼합하고 통상의 기술을 사용하여 목적하는 형태로 형성한다. 본 발명의 정제 또는 캡슐은 약 6.0 ∼ 7.0의 pH에서 용해되는 장용 코팅제로 코팅될 수 있다. 소장에서는 용해되나 위에서는 용해되지 않는 적절한 장용 코팅제는 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트이다. 기타 구체예에서, 보조제는 소비자에 의해 식품 또는 음료에 첨가하기에 적절한 분말 또는 액체로서 제공된다.
모든 영양 및 약학/화장료 조성물은, 비타민 C 전달체의 발현을 증가시킬 수 있는 화합물 이외에, 비타민 C 자체도 함유할 수 있다.
또다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 조성물에 포함되는 화합물은 천연-제품 추출물, 파이토케미칼, 아미노산, 지방산, 콜레스테롤, 무기물, 당 또는 이의 혼합물 중에서 선택된다.
일반적으로, 경구 보조제의 구체예에 의해 나타내어질 수 있는 0.001 ∼ 100의 양, 바람직하게는 0.05 ∼ 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 ∼ 50 중량% 의 시험 화합물이 조성물의 총 중량을 기준으로 관찰된다.
대안적 구체예에 따르면, 본 화합물 및/또는 조성물은 장, 눈, 간, 뼈, 관절, 피부 및 뇌와 같은 조직 중 비타민 C의 생체이용률을 개선하는 데 사용할 수 있다. 비타민 C는 물에 매우 가용성이므로, 세포에 의해 섭취되는 유효량은 소화되는 양에 비하여 적다. 일반적으로, 생체이용률이라는 용어는 활성 성분 또는 활성 부분이 조성물의 생성물로부터 흡수되어 활성 부위에 이용가능하게 되는 속도 및 정도를 말한다 (= FDA 기재 사항). 경구 소화된 약물의 생체이용률은 분자의 특성, 이의 안정성, 및 투여된 제제 - 및 환자에 있어서 - 산통 또는 장 절제의 결과로 인한 감소된 장 표면적 및 약물이 식사로서 섭취되었는지의 여부를 비롯한 인자에 의해 결정된다. 생체이용률에 영향을 미치는 인자의 비제한적인 예로서 위장관으로부터의 불량한 흡수, 간 1차 통과 결과 및 대사, 및 체순환에 도달하기 이전의 약물의 분해를 들 수 있다. 현재 비타민 C의 영양권장량 (RDA)은 또한 이의 생체이용률과도 관련된 것이고 성인의 경우 60 ㎎/일 에 해당한다.
본 발명의 구체예에 따르면, 조성물은 개체 중 낮은 환원 전위에 수반되는 질환, 예컨대 관상동맥성 심질환, 암, 신경변성 질환, 및 노화의 치료 또는 예방에 사용된다. 생물체의 가장 큰 기관인 피부가 유해한 환경적 영향에 노출되므로, 본 발명은 특히 피부에 가해지는 스트레스에 의해 야기되는 상태의 치료 및/또는 예방을 위한 본 화합물의 용도에 관한 것이다. 스트레스는 물리적 스트레스, 예를 들어, 피부에 대한 자외선 조사, 화학적 스트레스, 예컨대 화학적 제제, 오염물, 또는 알레르기 물질에 대한 노출, 또는 생물학적 스트레스, 예컨대 알레르기 반응을 포함하거나, 미생물, 예컨대 병원성 박테리아, 바이러스, 진균류 등에 노출되거나 이에 감염되는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
대체로, 상기 상태는 임의의 종류의 병리학적 과정, 예컨대 피부 질환을 포함하거나 일반적으로 유리 라디칼을 포함한다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 조성물은 질환 과정에 의해 직접적으로 야기되는 것으로 생각되는 조직의 물리적 변화인 1차 병변, 및 가려움, 외상, 또는 치유에 의해 야기되는 변화와 같은 외부 인자로부터 발생되는 2차 피부 병변을 포함하는 특정 조직의 질환 또는 스트레스의 치료 및/또는 예방에 사용된다. 예를 들어 피부에 있어서, 1차 피부 병변은 아토피성 피부염, 건선, 세균성 피부염 및 바이러스 감염에 의해 야기된 피부 병변을 포함할 수 있다.
또다른 구체예에 따르면, 본 발명은 또한 비타민 C 전달체의 발현이 증가되거나 감소되는 방식으로 비타민 C 전달체의 발현을 조절하는 능력을 갖는 화합물을 식별하는 방법을 제공한다. 용어 "증가"는 일반적으로 증가된 발현을 지칭하고, 용어 "감소"는 저하된 발현을 말하며, 여기서 시험될 화합물의 첨가는 비타민 C 전달체의 발현 속도 및/또는 조직 세포 중 비타민 C 함량의 검출가능한 변화를 야기한다.
하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않고 예시하는 것이다.
유전자 발현 조절을
모니터링하기
위한 실시간
PCR
에 기초한
시험관내
시험
Cambrex Company (USA, 배열 번호: CC-2501)의 1차 성인 상피 케라티노사이트 (NHEK)를 본 연구에 사용하였다. 이를 37℃ 및 5% CO2에서 피브로넥틴 및 제 I형 콜라겐으로 코팅된 플라스틱 접시 (6 또는 12 웰 플레이트) 상의 KGM 배지 (Cambrex Company, USA, 배열 번호: CC-3101 및 CC-4131) 중 성장시키고 4번째 계대배양 때까지 팽창시키고 이를 추가의 실험에 사용하였다.
4번째 계대배양시의 NHEK 세포를 5000 세포/㎠의 밀도로 6 웰 플레이트에 놓고, 광 현미경 하에 토마 챔버에 의해 측정하였다. 배지를 2일마다 교환하면서 세포를 5 ∼ 6일 이내에 100% 융합시까지 성장시키고 도 1에 도식적으로 도시된 바와 같이 유전자 발현에 대한 시험관내 시험에 더 사용하였다.
의도된 밀도에 도달한 후, 시험 화합물 (로즈메리 추출물 (상이한 유래의 수성 추출물로서 또는 가수분해되거나 가수분해되지 않은 에틸아세테이트 추출물로서의 0.1% (w/v) 및 0.25% (w/v), 10 μM의 징코 빌로바 (gingko biloba) 추출물, 10 μM의 에피갈로카테킨갈레이트 (EGCg), 10 μM의 (R,S)-에쿠올 (equol), 10 μM의 헤스페레틴 (hesperetin), 10 μM의 커큐민 (curcumin) 또는 10 μM의 제니스테인 (genistein)) 또는 음성 대조군으로서 작용하는, 시험 화합물을 용해시키는 데 사용되는 동일량의 용매를 가하였다. 시험 화합물 또는 음성 대조군이 가해진 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 추가의 4시간, 8시간, 16시간 또는 24시간 동안 항온배양하였다. 상청액의 제거 후, 세포를 둘베코 인산염 완충 식염수 (PBS, Sigma, 독일)로 2회 세정하고, 세포를 1% β-메르캅토에탄올 (Sigma, USA)을 함유하는 용해 완충제 (Buffer RL, Qiagen AG, Basel, 스위스) 350 ㎕로 용해시키고, 세포 용해물로부터의 총 RNA를 QIAshredder 칼럼 및 RNeasy® Mini Kit (Qiagen AG, Basel, 스위스)를 사용하여 추출하였다. 96 웰 플레이트 상의 Ribogreen® RNA 측량 키트 (Molecular Probes, USA) 및 형광 마이크로플레이트 판독기 (Spectra fluor plus F 129005, Tecan)를 사용하여 수행하였다. 측정을 2회 수행하였다. 샘플을 100 ㎕ 1 x TE 완충제의 최종 부피로 1:680 또는 1:3400으로 희석하였다. 1, 0.5, 0.1, 0.02, 0 ㎍/㎖의 농도의 리보솜 RNA의 희석액을 표준으로서 사용하고, 485 nm 및 538 nm에서 형광계에 의해 측정을 수행하였다. 그 후, RNA 측량을 표준 곡선과 비교하여 계산하였다. 아가로스 겔 전기영동 (TBE 중 1% 아가로스: 90 mM 트리스/HCl pH 8.0, 80 mM 붕산, ddH2O 중 3 mM EDTA)을 사용하여 RNA의 완전성을 조절하였다.
역전사를 위하여, 2 ㎕의 pd(N)6 랜덤 헥사머 (Amersham Biosciences, Art. n°272080, 영국) 및 1 ㎕의 dNTP (10 mM, Amersham Biosciences, Art. n°272050, -60, -70, -80, 영국)를 뉴클레아제가 없는 물 (Ambion, USA) 중 2 ㎍의 RNA에 최종 부피 12 ㎕로 첨가하였다. 65℃에서 5분 동안 항온배양한 후, 샘플을 즉시 얼음 위에 위치시키고 신속히 원심분리하였다. 그 후, 4 ㎕의 5X 제1 스트랜드 완충제 (250 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1% (v/v) NP-40, 50% (v/v) 글리세롤), 2 ㎕의 디티오트레이톨, 1 ㎕의 RNase 억제제 및 1 ㎕의 역전사효소 SuperScript II RNase H- (SUPERase-In, 20 U/㎕, Ambion, Art. n°2694, USA)를 첨가하였다 (최종 농도 20 ㎕). 역전사 반응은 하기 온도 프로그램을 사용한 PCR 순환장치 (PCT-100TM, Programmable Thermal Controller, MJ Research Inc., USA) 에서 수행되었다: 효소의 활성화: 25℃에서 10분; 역전사 반응: 42℃에서 60분; 효소의 억제: 70℃에서 20분. 그 후, 샘플을 추가 사용시까지 -20℃의 냉동실에 정치시켰다.
어세이-온-디맨드 (assay-on-demand) 프라이머 및 프로브 (SVCT 1: Hs00195277_ml, SVCT 2: Hs00192765_ml, 18S-rRNA: 4310893E, GAPDH: 4310884E, Applied Biosystems, USA)를 사용하여 96 웰 플레이트 (96WP) 중 TaqMan® 방법에 따라 실시간 PCR을 수행하였다. 43.7 ㎕의 TaqMan® 2x Universal PCR 마스터 믹스 (Applied Biosystem, USA), 4.4 ㎕의 어세이-온-디맨드 프라이머 및 프로브, 21.9 ㎕의 뉴클레아제가 없는 물 및 17.5 ㎕의 cDNA (87.5 ng = 반복 당 25 ng)를 함유하는 마스터 믹스 (3.5x)를 사용하여 분석을 3회 수행하였다. 3배의 25㎕ 마스터 믹스를 96 웰 ABI PRISM 반응 플레이트 (Applied Biosystems, USA) 상에 로딩하고, 투명 광학 부착 커버로 덮으며, 2000 rpm에서 1분 동안 또는 모든 기포가 제거될 때까지 3회 원심분리하였다. 그 후, 하기 온도 프로그램을 사용하여 PCR 반응을 ABI PRISM® 7000 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems, USA) 중에서 수행하였다: 효소의 활성화: 50℃에서 2분; 변성: 95℃에서 10분 및 40 주기의 표적 증폭: 95℃에서 15초 결합 (annealing) 및 60℃에서 1분 신장 (extension). 증폭 플롯의 분석을 ABI PRISM® 소프트웨어를 사용하여 수행하고, 기준선 조절을 개별적으로 수행한 반면 (SVCT 1: 17-27, SVCT 2: 6-15, 18S-rRNA: 2-12; GAPDH: 8-18), 모든 프라이머에 대하여 역치를 0.2로 수동으로 설정하였다. 유전자 발현을 GAPDH 또는 18S-rRNA로 정상화하고, ANOVA에 의해 통계적 분석을 수행하였다.
로즈메리 추출물을 사용한 처리 결과, 음성 대조군과 비교시 실시간 PCR에 있어서 SVCT 1의 발현이 유의하게 감소한 반면, SVCT 2 발현은 변화가 없었다 (도 2 참고). 흥미롭게도, 상기 화합물을 상이한 양 (일정한 분석 조건에서, 웰당0.1% (w/v) 및 0.25% (w/v))으로 첨가하는 것은 발현의 용량 의존적 감소를 유발하였다. 징코 빌로바 추출물, (-) 에피갈로카테킨 갈레이트 (EGCg), 에쿠올, 퀘시틴 (quercitin), 헤스페레틴/헤스페리딘 (hesperidin), 커큐민 및 제니스테인을 10 μM의 농도로 첨가하였으나, SVCT 1 및 SVCT 2 발현에 대한 어떠한 영향도 나타나지 않았다.
비타민 C 섭취를
모니터링하기
위한,
14
C-
표지된
비타민 C에 기초한
시험관 내
시험
인간 불멸화 케라티노사이트 (HaCaT)를 20,000 셀/㎠의 밀도로 6 웰 또는 12 웰 플라스틱 접시에 시딩하고, 4500 ㎎/ℓ의 글루코스를 함유하고, 페니실린 및 스트렙토마이신 (각각 100 U/㎖), 10% 소 태아 혈청 및 0.584 ｇ/ℓ의 글루타민이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 중에서 융합시까지 37℃, 95% 상대 습도 및 5% CO2에서 성장시켰다. 배지를 2일마다 교환하였다.
14C-표지된 아스코르브산의 50 mM 저장 용액을, 반 무균 조건 하에 1.85 MBq (Amersham Biosciences, UK)을 77 ㎕의 트랜스퍼(transfer) 완충제 (140 mM NaCl, 4.2 mM KHCO3 , 5.8 mM KCl, 1.3 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 1% 페니실린 스트렙토마이신, 0.1 mM DTT (새롭게 첨가))에 용해시킴으로써 제조하였다. 상기 저장 용액을 즉시 사용하고, 잔류하는 용액을 최대 2주의 기간 동안 -20℃에서 저장하였다.
융합 HaCaT 세포를 시험 화합물 (상이한 농도의 FeCl3 수용액)의 유무 하에 18 ∼ 24시간 동안 항온배양하고, 마지막으로 50 μM의 메나디온, 500 μM의 H2O2, UV-조사된 HaCaT로부터 얻어진 상태조절된 배지로 추가의 2시간 동안 스트레스를 가하였다. 그 후, 세포를 PBS로 2회 세정하고, 제조된 저장 용액을 적절한 양의 트랜스퍼 완충제에 희석시킴에 의한 상이한 농도 (5 μM, 50 μM 또는 250 μM)의 14C-표지된 아스코르브산 300 ㎕ 또는 400 ㎕와 함께 항온배양하였다. 37℃ 에서 상이한 기간 (5, 10, 30, 60, 90 및 120분) 동안 항온배양한 후, 세포를 즉시 얼음 상에 위치시키고, 상청액을 제거하고 동결하며, 세포를 빙냉 PBS로 2회 세정하고, 마지막으로 셀 스크레이퍼(cell scraper) 및 우레아 완충제 (9.5 M 우레아, 10 mM 트리스/HCl pH 8.0, 2 mM EDTA pH 8.0) 300 ㎕ 또는 400 ㎕로 수집하였다. 그 후 상청액 또는 세포 용해물 중 방사성 동위원소의 양을 섬광 칵테일 9 ㎖ 중 상청액 50 ㎕ 및 세포 용해물 200 ㎕의 희석액의 섬광 계수에 의해 측정하였다. 수득된 데이타를 항온배양 시간에 대한 아스코르브산 섭취율 (백분율 또는 nmol로서)을 플롯팅함으로써 분석하였다.
기타 화합물도 상기 기재한 동일한 실험 조건을 사용하는 산화 스트레스 모델에 있어서 아스코르브산 섭취를 증가시키는 것으로 관측되었다. 상기 특성을 나타내는 상기 화합물은 글루타티온, N-아세틸-시스테인 및 라이신이었다 (데이타는 도시되지 않음).
Claims (14)
- 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능한, 세포 중 비타민 C 전달체의 발현을 조절할 수 있는 화합물:(a) 세포 배양물을 제조하는 단계;(b) 상기 세포 배양물을 상당량의 식별될 화합물 및 상당량의 비타민 C에 노출시키는 단계;(c) 조직 세포 중 비타민 C 전달체의 수준을 측정하는 단계; 및(d) 비타민 C 전달체의 발현 속도를 대조군과 비교하는 단계로서, 증가된 수준은 시험 화합물이 세포로의 비타민 C의 흡수를 증가시키는 능력을 나타내는 것인 단계.
- 제 1 항에 따른 화합물 및 임의로 비타민 C를 함유하는 영양 또는 약학 조성물
- 제 2 항에 있어서, 비타민 C 전달체의 발현을 조절할 수 있는 화합물이 천연-제품 추출물, 파이토케미칼 (phytochemical), 아미노산, 지방산, 콜레스테롤, 무기물, 당 또는 이의 혼합물 중에서 선택되는 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 비타민 C 전달체의 발현을 감소시킴으로써 발현을 조절할 수 있는 화합물이 로즈메리 추출물, 설포라판, 모두 트란스인 레틴산 및 아연 또는 이의 염인 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 비타민 C 전달체의 발현을 증가시킴으로써 발현을 조절할 수 있는 화합물이 철 또는 이의 염, 글루타티온, N-아세틸-시스테인 및 라이신인 조성물.
- 제 2 항 또는 제 5 항에 있어서, 비타민 C 전달체를 조절할 수 있는 화합물이 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 ∼ 100 중량% 범위의 양으로 함유되는 조성물.
- 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 요구르트, 우유, 응유, 치즈, 발효유, 발효 유제품, 아이스크림, 발효 시리얼 제품, 우유 분말, 유아식, 정제, 액체 현탁액, 건식 경구 보조제, 습식 경구 보조제, 건식 관 급식 또는 습식 관 급식으로부터 선택되는 조성물.
- 관심을 갖는 조직 중, 바람직하게는 장, 눈, 간, 뼈, 관절, 피부 및 뇌 중 비타민 C의 생체이용률을 조절하기 위한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 조성물의 용도.
- 관심을 갖는 조직 중, 바람직하게는 장, 눈, 간, 뼈, 관절, 피부 및 뇌 중 질환 또는 스트레스의 치료 또는 예방을 위한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 조성물의 용도.
- 제 9 항에 있어서, 피부의 질환 또는 스트레스가 피부염, 건선, 세균성 피부염 및 바이러스 감염 또는 긁힘에 의해 야기된 피부 병변, 외상, 또는 치유에 의해 야기된 변화인 용도.
- 하기 단계를 포함하는, 진핵 세포 중 비타민 C 전달체의 발현을 조절하는 화합물의 식별 방법:(a) 세포 배양물을 제조하는 단계;(b) 상기 세포 배양물을 상당량의 식별될 화합물 및 상당량의 비타민 C에 노출시키는 단계;(c) 세포 중 비타민 C 전달체의 발현 속도를 측정하는 단계; 및(d) 세포 중 비타민 C 전달체의 발현 속도의 수준을 대조군과 비교하는 단계로서, 증가된 수준은 시험 화합물이 세포로의 비타민 C의 흡수를 증가시키는 능력을 나타내는 것인 단계.
- 제 11 항에 있어서, 세포 배양물의 세포가 장, 눈, 간, 뼈, 관절 및/또는 피부 유래인 방법.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 상기 비타민 C 전달체 단백질이 인간 나트륨 의존적 비타민 C 전달체 SVCT 1 (유전자 기호 SLC23A1) 및/또는 SVCT 2 (유전자 기호 SLC23A2)인 방법.
- 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 식별될 상기 화합물이 천연-제품 추출물, 파이토케미칼, 아미노산, 지방산, 콜레스테롤, 무기물 및 당 유래인 방법.
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Patent event date: 20071010 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
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| PG1501 | Laying open of application | ||
| PC1203 | Withdrawal of no request for examination | ||
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |