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KR20070107703A - 인터루킨-１７ｆ 항체 및 기타 ｉｌ-１７ｆ 신호전달안타고니스트 및 그의 용도 - Google Patents

인터루킨-１７ｆ 항체 및 기타 ｉｌ-１７ｆ 신호전달안타고니스트 및 그의 용도 Download PDF

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KR20070107703A
KR20070107703A KR1020077018688A KR20077018688A KR20070107703A KR 20070107703 A KR20070107703 A KR 20070107703A KR 1020077018688 A KR1020077018688 A KR 1020077018688A KR 20077018688 A KR20077018688 A KR 20077018688A KR 20070107703 A KR20070107703 A KR 20070107703A
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KR1020077018688A
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메리 콜린스
질 에프 라이트
네일 엠 울프만
마야 아라이
케네스 제이콥스
지지안 루
용징 궈
융창 추
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와이어쓰
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Publication date
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Abstract

본 발명은 IL-17F 신호전달 경로에 관여하는 단리되고 정제된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 IL-17F 동종이량체 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체에 대한 항체, 및 자연 공급원으로부터 IL-17A/IL-17F 이종이량체를 포함한 IL-17F 패밀리의 원을 단리하고 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 자가면역 질환 (예를 들어, 관절염 (류마티스 관절염 포함), 건선, 전신 루푸스성 홍반, 다발성 경화증), 호흡계 질환 (예를 들어, COPD, 낭성 섬유증, 천식, 알레르기), 이식 거부 (고형 기관 이식 거부 포함), 및 염증성 장 질환 또는 장애 (IBD, 예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 IL-17F 신호전달과 관련된 장애, 즉 IL-17F-관련 장애의 진단, 예후, 진행의 모니터링 및 치료 및/또는 예방을 위한 신규 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 IL-17F 신호전달과 관련된 장애의 방해 (치료) 및 예방을 위한 신규 치료제 및 치료 표적, 및 테스트 화합물의 스크리닝 및 평가 방법에 관한 것이다.
인터루킨-１７Ｆ 항체, ＩＬ-１７Ｆ 신호전달 안타고니스트

Description

인터루킨-１７Ｆ 항체 및 기타 ＩＬ-１７Ｆ 신호전달 안타고니스트 및 그의 용도 {INTERLEUKIN-17F ANTIBODIES AND OTHER IL-17F SIGNALING ANTAGONISTS AND USES THEREFOR}
본 출원은 2005 년 2 월 14 일에 출원된 미국 가특허 출원 제 60/653,260 호; 및 2005 년 4 월 1 일에 출원된 미국 가특허 출원 제 60/667,492 호를 우선권으로 주장하며, 둘 다 그 내용 전체가 참조로써 본원에 삽입되어 있다.
기술 분야
본 발명은 항체, 예를 들어, 인터루킨-17F (IL-17F) 신호전달, 특히, 인간 IL-17F 를 방해하는 본래의 항체 및 그의 항원- 결합 절편, 및 기타 IL-17F 신호전달 안타고니스트, 예를 들어, 용해성 IL-17F 수용체(들), 및 IL-17F-관련 활성을 조절하는데 있어서의 그의 것들의 용도에 관한 것이다. 본원에 개시된 항체 및 관련 IL-17F 분자는 진단, 예후, 모니터링, 예방, 및/또는 치료 IL-17F-관련 장애, 예를 들어, 염증 장애 (예를 들어, 자가면역 질환 (예를 들어, 관절염 (류마티스 관절염 포함), 건선, 전신 루푸스성 홍반 (SLE), 다발성 경화증), 호흡계 질환 (예를 들어, COPD, 낭성 섬유증, 천식, 알레르기), 이식 거부 (고형 기관 이식 거부 포함), 및 염증성 장 질환 또는 장애 (IBD, 예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병)) 의 진단, 예후, 모니터링, 예방, 및/또는 치료에 유용하다.
사이토카인은 면역 및 염증 반응에 관여하는 다면발현 활성을 가진 분비되는 용해성 단백질인데, 예를 들어, 사이토카인은 분화, 보충, 또는 기타 생리학적 반응, 예를 들어, 표적 세포에 의한 염증의 단백질 특성의 분비를 야기할 수 있다. 사이토카인은 세포 활성, 증식, 및 분화를 초래하는 신호 전달 경로를 이끄는 특이적 세포 표면 수용체에 결합한다. 하나의 그러한 사이토카인인, 원래는 CTLA-8 라고 하는, 인터루킨-17 (IL-17) 을 단리하고, 쥣과 하이브리도마로부터 클로닝하고, 이는 T 림프구성 헤르페스 바이러스 사이미리 (Herpes바이러스 saimiri) 의 열린 해독틀 13 에 동종성을 갖는 것으로 보인다 (Rouvier 등, (1993) J. Immunol. 150:5445- 56; Yao 등, (1996) 유전자168:223-25; Golstein 등에 의해 공개된 국제 특허 출원 번호 WO95/01826). 그 때부터, IL-17 에 20 - 50% 의 동종성을 공유하는 5 가지의 연관 사이토카인을 규명하였다 ([Moseley 등, (2003) 사이토카인 & 성장 인자 ReviewsH: 155-74] 를 참조). IL-17 사이토카인 패밀리의 창립 원으로서 IL-17 을 지시하기 위해, IL-17A 를 지정하고 (Moseley, 상기) ; 나머지 다른 원들을 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, 및 IL-17F 라고 지정하였다. IL-17 사이토카인 패밀리 원은 보존된 시스테인 잔기를 공유한다. 50% 동일성을 공유하는 IL-17A 및 특히 IL-17F 가 흥미로우며 ; 두 사이토카인 모두는 T 세포에 의해 공동발현되고, IL-23 에 의해 유도되며, T 세포-매개 자가면역 질환의 잠재적인 표적인 것으로 여겨진다. IL-17A 와 유사하게, IL-17F 내의 보존된 시스테인 잔기는 골형성 단백질 (BMP), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β), 신경 성장 인자 (NGF) 및 혈소판-유래 인자 BB (PDGF-BB) 에서 발견되는 전형적인 시스테인 노트 모티프 (knot 모티프) 의 특징을 보여준다 (Hymowitz 등, (2001) EMSO J. 20:5332-41; McDonald 등, (1993) 세포 73:421-24).
IL-17F 는 활성화된 인간 PBMC 라이브러리 (SST) 로부터 클로닝된 17kD 분비 단백질이다 (미국 특허 제 6,043,344 호 및 제 6,074,849 호). IL-17F 는 30-35KD 이황화 결합 동종이량체를 형성하고 (상기 Hymowitz), IL-17A 와 유사하게, 활성화된 T 세포에 의해 발현된다 (상기 Moseley). 그러나, 활성화된 단핵구, 활성화된 호염구 및 비만 세포에 의한 IL-17F 의 발현 또한 나타나 있다 (Kawaguchi 등, (2002) J. Immunol. 167:4430-35). IL-17F 는 대식세포, 내피 세포, 외피 세포, 및 섬유아세포에 의한 많은 사이토카인 및 케모카인의 발현을 유도한다 (상기 Moseley).
IL-17F 는 부분적으로 염증 사이토카인 및 호중구증가증의 생성을 유도함으로써 염증 반응에서 역할을 한다. IL-17F 는 여러 자가면역 질환, 예를 들어, 관절염 (류마티스 및 라임 관절염 포함), 전신 루푸스성 홍반 (SLE), 및 천식의 발달과 연관있다 (Bettelli and Kuchroo (2005) J. Exp. Med. 201 :169-71). 예를 들어, IL-23 이 즉, IL-17F 의 생성을 특징으로 하는 T 세포 집단의 증가에 필수적이고, 이러한 T 세포 집단으로의 수동적인 이전이 중추신경계 자가면역성과 연관된 기관-특이적 염증의 발생에 필수적이고 (Langrish 등, (2005) J. Exp. Med. 201:233-40), IL-17-결핍 마우스는 deficient mice are resistant to 실험 자가면역 뇌척수염 (EAE ; 다발성 경화증에 대한 동물 모델) 에 대해 내성이라는 것이 (Nakae 등, (2003) J. Immunol. 171:6173-77) 최근에 밝혀졌다. IL-17F 은 프로테오글리칸 와해를 증가시키고 관절 연골에 의한 프로테오글리칸 합성을 감소시키는 공지된 염증 사이토카인 중에서 독특한 것이다 (상기 Hymowitz). 추가로, IL-17F 의 증가된 발현은, 대조군으로서 천식 환자로부터 취한 BAL 에 비해, 알레르기원 시도 후에 천식으로 고통받는 환자로부터 취한 기관지폐포세척세포 (BAL) 에서 나타나 있다 (상기 Kawaguchi). 또한, IL-17F mRNA 발현은 궤양성 대장염 및 크론병 환자에서 증가된다 (Gurney 등, (2003) GTCBIO Conf: Cytokines and Beyond). 이러한 관찰은, IL-17F 신호전달의 차단이 전염증 사이토카인 생성을 감소시키고 골 침식을 감소시킬 것이라는 것을 제안한다. 결과적으로, IL-17F 신호전달 경로는 예를 들어, 보충된 중성구가 자가면역 질환 (예를 들어, 관절염 (류마티스 관절염 포함), 건선, 전신 루푸스성 홍반, 다발성 경화증), 호흡계 질환 (예를 들어, COPD, 낭성 섬유증, 천식, 알레르기), 이식 거부 (고형 기관 이식 거부 포함), 및 염증성 장 장애 또는 질환 (IBD, 예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병) 과 같은 조직 손상의 발달 동안에 조직 손상의 중요한 매개자인 염증 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 흥미로운 표적이다.
현재, IL-17 패밀리 원에 대한 수용체에 대해서는 많이 알려져 있지 않다. IL-17A 에 대한 수용체인 IL-17R 은 지금까지 실험된 모든 조직에서 발현되고, IL-17A 에 의한 IL-17R 의 결합은 일반적으로 NF-κB 의 활성화를 통한 전염증성 사이토카인의 유도를 초래한다 (상기 Moseley). IL-17R 에 부분적인 서열 동종성을 공유하는 4 가지 추가의 수용체가 규명되었다 : 1) IL-17RH1 (IL-17RB 라고도 함), 2) IL-17-수용체 유사 단백질 (IL-17RL 또는 IL-17RC 라고도 함), 3) IL-17RD (SEF 또는 IL-17RLM 라고도 함), 및 4) IL-17RE (상기 Moseley). 상기 4 가지 추가의 수용체 중에서, 단지 IL-17RHl 만이 IL-17 사이토카인, 즉 IL-17B 및 IL-17E 에 결합하는 것으로 나타났으나, IL-17B 및 IL-17E 의 IL-17RHl 에의 결합 작용은 나타나 있지 않다 (Shi 등, (2000) J. Biol. Chem. 275:19167-76; Lee 등, (2001) J. Biol. Chem. 276:1660-64). 지금까지, IL-17F 에 대한 수용체(들) 는 보고되어 있지 않다. 따라서, IL-17F 신호전달은 질환의 예방 및/또는 치료에 대한 표적이 될 수 없었고, 그렇더라도 조직 (예를 들어, 관절 조직) 의 항상성 및 다양한 질환 (예를 들어, 관절염, 천식, 알레르기, COPD, 낭성 섬유증, 궤양성 대장염, 크론병 등) 의 진행에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 본 발명은 IL-17F 단백질의 신호 전달 경로에 관여하는 중요 역할자를 규명하고 표적으로 함으로써 상기 문제점을 해결한다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 IL-17F 신호전달 경로의 성분, 예를 들어, IL-17F 및 그의 수용체를 규명하고, IL-17F 신호전달과 연관된 장애의 치료 방법에서 상기 성분을 표적으로 하는 것이다. 그러한 IL-17F-연관 장애 및 증가된 IL-17F 신호전달과 관련된 장애에는 염증 장애, 예를 들어, 자가면역 질환 (예를 들어, 관절염 (류마티스 관절염 포함), 건선, 전신 루푸스성 홍반, 다발성 경화증), 호흡계 질환 (예를 들어, COPD, 낭성 섬유증, 천식, 알레르기), 이식 거부 (고형 기관 이식 거부 포함), 및 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병) 가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
그와 같이, 본 발명을 바탕으로 한 연구는, IL-17F 가 IL-17F 의 IL-17R 및/또는 IL-17RC 에의 결합을 통한 프로테오글리칸 파괴 및 염증 반응을 매개한다는 증거를 제공한다. IL-17F 에 대한 수용체로서 IL-17R 및 IL-17RC 를 결정하는 것은 IL-17F 신호전달과 관련된 장애의 치료를 위한 표적으로서 상기 분자를 노출시킨다.
IL-17F 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 또는 그의 IL-17F-결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, IL-17RC 또는 그의 IL-17F-결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, 억제성 항-IL-17F 항체, 억제성 항-IL-17R 항체, 억제성 항-IL-17RC 항체, 및 안타고니스트성 소분자를 포함하나 이에 제한되지 않는 IL-17F 신호전달 안타고니스트가 본원에 제공된다. IL-17F 신호전달 안타고니스트의 바람직한 예에는, IL-17R 및 IL-17RC 에 대한 siRNA, IL-17R 및 IL-17RC (또는 그의 IL-17F-결합 절편) 을 포함하는 용해성 융합 단백질, 및 억제성 (즉, 안타고니스트성) IL-17F 항체가 포함된다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, IL-17R 또는 IL-17RC 에 대한 siRNA, IL-17R 또는 IL-17RC (또는 그의 IL-17F 결합 절편) 을 포함하는 용해성 융합 단백질, 또는 억제성 IL-17F 항체와 같은 IL-17F 신호전달 안타고니스트는 IL-17F 생물활성 및/또는 NF-κB 반응성 유전자를 활성화시키는 NF-κB 의 능력을 감소시킨다.
추가로, IL-17A 및 IL-17F 사이의 구조 및 서열 유사성을 바탕으로, 본 발명 자들은 신규 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 형성을 가정하고 기술하였다. IL-17A/IL-17F 이종이량체의 존재에 대해 설명할 때, 본 발명자들은, IL-21 이 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 증가된 생성을 초래한다고 설명하고, IL-21 의 활성화 IL-21R 에의 결합이 적어도 부분적으로 IL-17 신호전달에 의한 것일 수 있음을 최초로 제안하였다.
본 발명자들은 또한, 활성화된 T 세포와 같은 상기 사이토카인의 자연 공급원으로부터 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체를 단리한 최초의 사람들이다. 따라서, 본 발명은 또한, 예를 들어, IL-17A 및/또는 IL-17F 신호전달을 억제시킴으로써, IL-21 이 IL-21R 에 결합하고 그것을 활성화시키는 것과 연관된 효과를 완화시키는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 자연적인 (즉, 비재조합) IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체, 및 예를 들어, 증가된 IL-17F 신호전달과 연관된 장애 및/또는 EL-21 가 EL-21R 에 결합하고 이를 활성화시키는 것과 연관된 장애의 치료에서, 상기를 단리하고 표적화하는 방법을 제공한다. 추가로, 재조합 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체, IL-17A 동종이량체 및 IL-17F 동종이량체가 실질적으로 없는 IL-17A/IL-17F 이종이량체 (재조합 또는 자연적인 것) 를 단리하는 방법이 본원에 개시된다.
IL-17F 신호전달을 표적으로 하는 방법은 IL-17F 신호전달 안타고니스트로서 IL-17F, IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리뉴클레오티드 (안티센스, siRNA, 및 앱타머와 같은 억제성 폴리뉴클레오티드), 폴리펩티드, 및 그의 절편을 포함할 수 있다. 추가로, IL-17F 단백질 (IL-17F 동종이량체 또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체로서) 과 그의 수용체(들) 간의 상호작용을 억제시킬 수 있는 항체가 또한 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 IL-17F 신호전달 경로를 표적으로 할 수 있는 테스트 화합물을 스크리닝하고, IL-17F 신호전달과 관련된 장애의 진단, 예후, 모니터링 및/또는 치료하는 방법에서 본원에 개시된 분자를 사용하는 것에 관한 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 IL-17F 신호전달에 대항할 수 있는 테스트 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다 :
IL-17F 및 IL-17R 을 함유하는 샘플을 화합물과 접촉시킴 ; 상기 샘플 내에서의 IL-17F 와 IL-17R 과의 상호작용이 화합물과 접촉되지 않은 샘플 내에서의 IL-17F 와 IL-17R 과의 상호작용에 비해 감소되는지를 알아보고, 그로 인해 화합물과 접촉된 샘플 내에서의 IL-17F 와 IL-17R 과의 상호작용에서의 그러한 감소가 IL-17F 와 IL-17R 과의 상호작용을 억제시키고, IL-17F 신호전달에 대항할 수 있는지를 봄. 또다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17RC 에 관해 스크리닝하는 유사한 방법을 제공한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 개체에서의 증가된 IL-17F 신호전달과 관련된 장애의 진단 방법을 제공한다 : 개체로부터의 샘플 내에 있는 IL-17F 신호전달 유전자의 테스트 양을 검출함 ; 대조군 샘플 내의 동일한 IL-17F 신호전달 유전자 생성물의 정상적인 양과 테스트 양을 비교하여, 정상적인 양보다 유의하게 더 상승된 테스트 양이 증가된 IL-17F 신호전달과 관련된 장애의 진단에 있어서 양성 지시를 제공함. 또다른 구현예에서, 상기 장애는 자가면역 질환, 호흡계 질환, 및 염증성 장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, IL-17F 신호전달 유전자 생성물은 IL-17F 유전자 생성물, IL-17R 유전자 생성물, 또는 IL-17RC 유전자 생성물이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 증가된 IL-17F 신호전달과 관련된 장애의 위험성이 있거나 또는 장애를 가진 것으로 진단받은 개체에, 치료적 유효량의 IL-17F 신호전달 안타고니스트를 상기 개체에 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법을 제공한다. 또다른 구현예에서, IL-17F 신호전달 안타고니스트는 IL-17F 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드, 그의 IL-17R 또는 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, 그의 IL-17RC 또는 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, 억제성 항-IL-17F 항체, 억제성 항-IL-17R 항체, 억제성 IL-17RC 항체, 및 안타고니스트성 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, IL-17F 신호전달 안타고니스트는 IL-17R 억제성 폴리뉴클레오티드 또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드이다. 일부 추가의 구현예에서, 억제성 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 17-32 에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 siRNA 이다. 일부 구현예에서, IL-17F 신호전달 안타고니스트 그의 IL-17R 또는 IL-17F 결합 절편을 포함하거나, 또는 그의 IL-17RC 또는 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드이다. 일부 추가의 구현예에서, 용해성 폴리펩티드는 SEQ ID NO:34 또는 SEQ DD NO:35 에 나타나 있는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 다 른 구현예에서, (1) IL-17F 억제성 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 의 절편에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 거기에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 RNA 당량체를 포함하며, 여기서 세포 내에서의 억제성 폴리뉴클레오티드의 발현은 IL-17F 의 발현을 감소시키고 ; (2) IL-17R 억제성 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 의 절편에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 거기에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 RNA 당량체를 포함하며, 여기서 세포 내에서의 억제성 폴리뉴클레오티드의 발현은 IL-17R 의 발현을 감소시키고 ; (3) IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, 및 SEQ ID NO:15 에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ TD NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 13, 및 SEQ ID NO: 15 로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 RNA 당량체를 포함하며, 여기서 세포 내에서의 억제성 폴리뉴클레오티드의 발현은 IL-17RC 의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 증가된 IL-17F 신호전달과 관련된 장애는 염증 장애이다. 일부 추가의 구현예에서, 염증 장애는 자가면역 질환, 호흡계 질환, 및 염증성 장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 추가의 구현예에서, 염증 장애는 자가면역 질환이고, 자가면역 질환은 관절염 (류마티스 관절염 포함), 건선, 전신 루푸스성 홍반, 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 추가의 구현예에서, 상기 염증 장애는 호흡계 질환이고, 호흡계 질환은 낭성 섬유 증이거나 ; 또는 염증 장애는 염증성 장 질환이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 추가로 치료적 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제를 개체에 투여하는 것을 포함한다. 또다른 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 사이토카인 억제제, 성장 인자 억제제, 면역억제제, 항-염증제, 대사 억제제, 효소 억제제, 세포독성제, 및 세포증식억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 구현예에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 TNF 안타고니스트, 항-TNF 제제, IL-12 안타고니스트, IL-15 안타고니스트, IL-17 안타고니스트, IL-18 안타고니스트, IL-22 안타고니스트, T 세포-소실제, B 세포-소실제, 시클로스포린, FK-506, CCI-779, 에타네르셉트, 인플릭시마브, 리툭시마브, 아달리무마브, 프레드니솔론, 아자티오프린, 금, 술파살라진, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 미노시클린, 아나킨라, 아바타셉트, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 라파마이신, 라파마이신 유사체, Cox-2 억제제, cPLA2 억제제, NSADDs, p38 억제제, B7.1, B7.2, ICOSL, ICOS 및/또는 CD28 의 안타고니스트, 및 CTLA4 의 아고니스트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17F 신호전달 안타고니스트를 세포 집단 또는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 세포 집단 또는 개체 내에서NF-κB-반응성 프로모터를 활성화시키는 NF-κB 의 능력을 억제하는 방법을 제공한다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 세포 집단 또는 개체 내에서의 IL-17F 생물활성을 억제시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 IL-17F 신호전달 안타고니스트를 세포 집단 또는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 또다른 구현예에서, IL-17F 생물활성은 중성 구 분화, 중성구 보충 및 사이토카인 유도로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17F 신호전달 안타고니스트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17F 신호전달 안타고니스트 및 자가항원, 알레르기원, 이종항원, 및 그의 절편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원을 포함하는 백신 보조제를 제공한다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO :6, 7, 9, 11, 13, 및 15 에 나타나 있는 것들을 포함하여 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체를 제공하며 ; 일부 구현예에서, 상기 항체는 IL-17F 신호전달에 대항한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17F 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체를 제공하고, 추가의 구현예에서, IL-17F 단백질이 인간 또는 영장류로부터 유래되고 ; IL-17F 단백질이 다량체성이고 ; IL-17F 단백질이 IL-17F 동종이량체 또는 IL-17F 이종이량체이고 ; IL-17F 이종이량체가 IL-17A/IL-17F 이고 ; 항체가 IL-17F 생물활성을 억제시킨다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 상기-규명된 방법을 제공하며, 여기서 IL-17F 신호전달 및/또는 IL-17F 생물활성은 IL-17F 동종이량체, IL-17F 이종이량체, 또는 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 둘 다에 의해 매개되며, IL-17F 이종이량체가 IL-17A/IL-17F 인 것을 포함한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 상기-규명된 약학적 조성물 및/또는 상기-규명된 백신 보조제를 제공하며, 여기서 IL-17F 신호전달 안타고니스트는 IL-17F 동종이량체, IL-17F 이종이량체, 또는 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 둘 다에 대항한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17F 신호전달에 대항하는 것을 포함하는, IL-21 신호전달과 연관된 하나 이상의 활성을 억제시키는 방법을 제공한다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17F 신호전달에 대항하는 것을 포함하는, IL-23 신호전달과 연관된 하나 이상의 활성을 억제시키는 방법을 제공한다. 일부 추가의 구현예에서, IL-17F 신호전달은 IL-17F 동종이량체, IL-17F 이종이량체, 또는 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 둘 다에 의해 매개되며, 여기서 IL-17F 이종이량체가 IL-17A/IL-17F 인 것을 포함한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 자연적인 IL-17A 단백질을 정제하는 방법을 제공한다 : T 세포를 배지 중에서 활성화시킴 ; IL-17A 단백질을 상기 배지로부터 면역침전시킴. 또다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 자연적인 IL-17F 단백질을 정제하는 방법을 제공한다 : T 세포를 배지 중에서 활성화시킴 ; IL-17F 단백질을 상기 배지로부터 면역침전시킴. 일부 추가의 구현예에서, 상기 방법은 IL-17A 단백질이 IL-17A 동종이량체, IL-17A 이종이량체, 또는 IL-17A 동종이량체 및 IL-17A 이종이량체 둘 다인 경우, 및/또는 IL-17F 단백질이 IL-17F 동종이량체, IL-17F 이종이량체, 또는 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 둘 다인 경우 ; 및 IL-17A 또는 IL-17F 이종이량체가 IL-17A/IL-17F 인 경우 제공된다. 또다른 구현예에서, 상기 배지는 IL-21 및/또는 IL-23 을 포함한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 단리된 IL-17F 단백질을 제공하는데, 여기서, IL-17F 단백질은 IL-17F 동종이량체 또는 IL-17F 이종이량체이고 ; 여기서 IL-17F 단백질은 자연적인 공급원으로부터 단리되고 ; 여기서, 자연 공급원은 하나 이상의 T 세포이다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 단리된 IL-17A 단백질을 제공하는데, 여기서 IL-17A 단백질은 IL-17A 동종이량체 또는 IL-17A 이종이량체이고 ; 여기서 IL-17A 단백질은 자연적인 공급원으로부터 단리되고 ; 여기서, 자연 공급원은 하나 이상의 T 세포이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 IL-17F 안타고니스트를 투여하는 것을 포함하는, IL-17A 신호전달과 연관된 하나 이상의 활성을 억제시키는 방법을 제공한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, IL-17A 동종이량체 및 IL-17F 동종이량체가 실질적으로 없는 IL-17A/IL-17F 이종이량체를 단리하는 방법을 제공한다 :
(a) 제 1 친화성 태그에 융합된 IL-17A 융합 단백질 및 IL-17F 융합 단백질을 배지 내에서 배양된 숙주세포 내에서 발현시킴 (여기서, IL-17A 융합 단백질은 IL-17A 단백질 또는 그의 절편을 포함하고, 여기서 IL-17F 융합 단백질은 제 2 친화성 태그에 융합된 IL-17F 단백질 또는 그의 절편을 포함함) ; (b) 숙주세포가 IL-17A 융합 단백질 및 IL-17F 융합 단백질을 배지 내로 분비하게 함 ; (c) IL-17A 융합 단백질이 제 1 친화성 칼럼에 결합하도록 비환원 조건 하에 제 1 친화성 칼럼 위에 배지를 놓음 ; (d) 비환원 조건 하에 제 1 친화성 칼럼으로부터 결합된 단백질을 용출함 ; (e) IL-17F 융합 단백질이 제 2 친화성 칼럼에 결합하도록 비환원 조건 하에 제 2 친화성 칼럼 위에 단계 (d) 에서 수득된 용출액을 놓음 ; 및 (f) 비환원 조건 하에 제 2 친화성 칼럼으로부터 결합된 단백질을 용출함 (여기서, 단계 (f) 로부터 수득된 용출액은 IL-17A 융합 단백질 및 IL-17F 융합 단백질 둘 다를 L-17A/IL-17F 이종이량체의 형태로 함유함). 다른 구현예에서, 상기 방법의 변형이 제공된다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 상기 다양한 방법에 따라 단리된 IL-17A/IL-17F 이종이량체를 제공한다.
도 1 은 다양한 농도 (ng/ml) 의 IL-17A 및/또는 IL-17F 에서 배양된 (A) 1 차 인간 연골 세포 또는 (B) 1 차 돼지 연골 세포 (x-축) 에서의 NF-κB-매개 수용체 교차활성화 (상대적인 루시퍼라제 활성; y-축) 를 보여준다.
배지 (대조군 ; □) 또는 20 ng/ml IL-17F (IL-17F ; ■) 의 존재 하에 배양된 인간 섬유아세포-유사 활막 세포로부터 수합된 상청액 내의, 2 명의 환자 각각 (P1, P2 ; x-축) 으로부터의 사이토카인 (IL-6, IL-8, MCP-I 또는 GRO-α ; x-축) 의 농도 (pg/ml ; y-축) 를 도 2 에 보여준다.
도 3 은 배지 내에서 (0 ng/ml IL-17F ; □), 또는 1 ng/ml (▣), 3.3. ng/ml (▥), 10 ng/ml (▩), 또는 30 ng/ml (■) IL-17F 와 함께 배양된 1 차 쥣과 폐 섬유아세포의 배양물로부터 수합된 상청액 내의 염증 사이토카인 (IL-6, JE (CCL2), KG; x-축) 의 농도 (pg/ml; y-축) 를 보여준다.
도 4 는 ELISA 에 의해 측정된 바와 같이, 증가하는 농도의 인간 IL-17F (좌측 패널) 또는 인간 IL-17A (우측 패널) (x-축) 의 (A) IL-17R-IgG (상부 패널) 또는 (B) IL-17RC-IgG (하부 패널) 에의 결합 (OD 450nm; y-축) 을 나타낸다. 각 각의 수용체/사이토카인 상호작용에 관한 EC50 값도 나타낸다.
도 5 에서는, (A) 0.5 ng/ml IL-17A (좌측 패널) 또는 (B) 20 ng/ml IL-17F (우측 패널) 의 존재 하에, 단독으로 (배지 ; -), 또는 IL-17R-IgG 융합 단백질 (hl7R.Fc; ●), IL-17RC-IgG 융합 단백질 (hl7RH2.Fc; ■), 대조군 IgG 단백질 (MgGl; ▲), 항-IL-17R 항체 (ahIL17R; □) 또는 대조군 항체 (염소 IgG ;Δ) 의 농도 (μg/ml; x-축) 를 증가시키면서 배양된 인간 섬유아세포로부터의 상청액 내의 GRO-α 의 농도 (pg/ml; y-축) 를 나타낸다.
도 6 은 하기 6 가지의 항-IL-17F 항체 : 항-IL-17F-01 (□), 항-IL-17F-02 (-), 항-IL-17F-03 (▲), 항-IL-17F-05 (◆), 항-IL-17F-06 (●), 및 항-IL-17F-07 (Δ) 중 하나의 농도 (μg/ml; x-축) 를 증가시키면서, IL-17F 의 IL-17R 에의 결합을 억제시키는 항-인간 IL-17F 항체의 능력 (OD 450nm; y-축) 을 나타낸다.
도 7 은 하기 6 가지 항-IL-17F 항체 : 항-IL-17F-01 (□), 항-IL-17F-02 (-), 항-IL-17F-03 (▲), 항- IL-17F-05 (◆), 항-IL-17F-06 (●), 및 항-IL-17F-07 (Δ) 의 각각의 농도 (μg/ml ; x-축) 를 증가시키면서, IL-17F 의 IL-17RC 에의 결합을 억제시키는 항-인간 IL-17F 항체의 능력 (OD 450nm; y-축) 을 나타낸다.
도 8 에서는, (좌측 패널) 항-IL-17F-01 (aIL-17F- 01), 항-IL-17F-02 (aIL-17F-02), 또는 항-IL-17F-03 (aIL-17F-03) 및 (우측 패널) 항-IL-17F-05 (aIL-17F-05), 항-IL-17F-06 (aIL-17F-06), 또는 항-IL-17F-07 (aIL-17F-07), 또는 대조군 mIgGl 항체의 농도 (μg/ml; x-축) 를 증가시키면서, 20 ng/ml IL-17F 에서 배양된 인간 섬유아세포로부터 수합된 상청액 내의 GRO-α (pg/ml; y-축) 의 농도를 나타 낸다.
도 9 에서는, 배지 단독에서 (비처리), 100 ng/ml IL-17A 에서 (IL-17A(100 ng/ml)), IL-17R-IgG 융합 단백질의 존재 하에 100 ng/ml IL-17A 에서 (IL-17A + IL17R/Fc), 항-IL-17F 항체의 존재 하에 100 ng/ml IL-17A 에서 (IL17A + 항IL17F), 대조군 마우스 IgG 의 존재 하에 1OO ng/ml IL-17A 에서 (IL-17A + 마우스IgG), 500 ng/ml IL-17F 에서 (IL-17F(500 ng/ml)), IL-17R-IgG 융합 단백질의 존재 하에 500 ng/ml IL-17F 에서 (IL-17F + IL17R/Fc), 항-IL-17F 항체의 존재 하에 500 ng/ml IL-17F 에서 (IL-17F + 항IL17F), 또는 대조군 마우스 IgG 의 존재 하에 500 ng/ml IL-17F 에서 (IL-17F + 마우스 IgG) 배양된 돼지 1 차 연골 세포에서의 NF-κB-매개 수용체 교차활성화 (상대적인 루시퍼라제 활성; y-축) 를 보여준다.
도 10 에서는, 20 ng/ml IL-17F (IL-17F; □), 아이소타입 대조군 항체 (아이소타입 Ab; ▩), 항-IL-17F-01 항체 (▤), 또는 항-IL-17F-07 항체 (■) 의 존재 하에 배양된 인간 섬유아세포-유사 활막 세포로부터 수합된 상청액 내의, 2 명의 환자 각각 (P1, P2; x-축) 으로부터의 사이토카인 (EL-6, IL-8, 또는 GRO-α; x-축) 의 농도 (pg/ml; y-축) 를 보여준다.
도 11 에서는, (A) IL-17A 단백질 (IL-17A 동종이량체 및 IL-17A 이종이량체 포함) (B) IL-17F 단백질 (IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 포함), 또는 (C) IL-17A/IL-17F 이종이량체의 검출에 특이적인 ELISA 포맷을 사용한, IL-17A 동종이량체 (IL-17A/A; x-축), IL-17F 동종이량체 (IL-17F/F; x-축), 또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체 (IL-17A/F; x-축) 의 검출 (OD 450nm; y-축) 을 보여준다.
도 12 에서는, IL-21 (■) 또는 IL-23 (▩) 의 부재 (□) 또는 존재 하에, 항-CD28 항체 (항-CD28 (ng/ml); x-축) 의 농도를 증가시키면서, 비드-결합된 항-CD3 항체의 존재 하에 1 차 활성화를 수행하는 T 세포로부터 단리된 배지 중의 (A) IL-17A 또는 (B) IL-17F 의 농도 (생성된 사이토카인 (pg/ml) ; y- 축) 를 보여준다.
도 13 에서는, 하기 자극 조건 (x-축) 하에 제 2 활성화를 수행하는 T 세포로부터 단리된 배지 내의 IL-17A (■) 또는 IL-17F (□) 의 농도 (생성된 사이토카인 (pg/ml) ; y-축) 를 보여준다 : IL-23 만 (IL-23) ; IL-21 만 (IL-21); 비드-결합된 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 (CD3/CD28) ; IL-23, 비드-결합된 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 (IL-23/CD3/CD28) ; IL-21, 비드-결합된 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 (IL-21/CD3/CD28) ; 또는 배지.
도 14 는 (A) IL-17A 단백질 (IL-17A 동종이량체 및 IL-17A 이종이량체 포함), (B) IL-17F 단백질 (IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 포함), 또는 (C) IL-17A/IL-17F 이종이량체의 검출에 특이적인 ELISA 포맷을 사용하여, 개체에 1 차 활성화 (CM1) 또는 재자극 (CM2) (x-축) 시킨 T 세포로부터 수득된, 비희석된 (니트) 또는 희석된 (1:10) 배지 내의 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 검출 (OD 450nm; y-축) 을 나타낸다.
도 15 에서는, 제 2 활성화를 수행하는 T 세포로부터 수득된 조건화된 배지 500 μl 으로부터 항-인간 IL-17F-01 면역침전물을 검출하기 위해 다클론 토끼 항-인간 IL-17F 항체를 사용하여 수행된 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 대조군은 실시예 5.3 에서 기술된 바와 같이 제조된 IL-17F 동종이량체 (제 2 레인), 또는 R&D Systems (Minneapolis, MN) 에서 구입한 IL-17A 동종이량체 (제 5 레인) 로 이루어진다. 분자량 표준은 제 1 레인에 나타나 있다. IL-17A 및 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체의 위치는 화살표로 표시된다.
도 16 은 제 2 활성화를 수행하는 T 세포로부터 수득된 조건화된 배지 500 μl 로부터 항-인간 IL-17A-02 면역침전물을 검출하기 위해 비오틴-공액 염소 항-인간 IL-17A 항체를 사용하여 수행된 웨스턴 블롯 분석의 결과이다. 대조군 (레인 2) 는 실시예 5.3 에서 기술된 바와 같이 제조된 IL-17F 동종이량체로 이루어진다. 분자량 표준은 레인 1 에 나타낸다. IL-17A 및 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체의 위치는 화살표로 표시된다.
도 17A 은 항-IL-17F 항체로 면역프로브된 항-IL-17F 면역침전물 (레인 2 - 7) 또는 항-IL-17A 면역침전물 (레인 8 - 10) 을 보여준다. 면역침전물은 IL-17A (레인 2 및 8), IL-17F (레인 3 및 10), IL-17A 및 IL-17F (레인 4 및 9), 정제된 IL-17A 동종이량체 (레인 5), 또는 정제된 IL-17F 동종이량체 (레인 6 및 7) 를 과다발현하는 COS 세포의 조건화된 배지 (CM) 로부터 수득되었다. 대조군 ("A/A 정제된," 레인 5, 및 "F/F 정제된," 레인 6 - 7) 은 실시예 5.4 에서 기술된 바와 같은 정제된 재조합 IL-17A 및 IL-17F 동종이량체를 나타낸다. 분자량 표준은 레인 1 에 나타낸다. IL-17A 및 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체의 위친는 화살표로 표시된다.
도 17B 는 항-IL-17A 항체로 면역프로브된 항-IL-17A 면역침전물 (레인 2 - 4) 또는 항-IL-17F 면역침전물 (레인 5 - 7) 을 보여준다. 면역침전물은 IL-17A (레인 3 및 5), IL-17F (레인 2 및 7), 또는 IL-17A 및 IL-17F (레인 4 및 6) 를 과다발현하는 COS 세포의 조건화된 배지 (CM) 로부터 수득되었다. 분자량 표준은 레인 1 에 나타낸다. IL-17A 및 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체의 위치는 화살표로 표시된다.
도 18 은 IL-17A 및 IL-17F 동종이량체가 실질적으로 없는 재조합 IL-17F/IL-17A 이종이량체를 정제하는 방법을 보여주는 도표이다. 상기 방법은 2 가지 상이한 친화성 태그가 있는 IL-17A 및 IL-17F 를 적용하고, IL-17F/IL-17A 이종이량체를 단리하기 위해 2 가지 분리되고 연속적인 친화성 칼럼을 사용한다..
도 19A 는 IL-17A(◆) 및 IL-17F (□) 동종이량체와 유사한 재조합 정제된 IL-17F/IL-17A 이종이량체 (X) 가 BJ 세포 배양물의 배지 내에서 GRO-oc 수준 (pg/ml) 을 자극한다는 것을 보여준다. 도 19B 는 항-IL-17F 항체 (Δ) 와 함께 (그러나, IL-17F 항체 단독 (□) 과는 제외함) 항-IL-17A 항체 (■), 또는 항-IL-17A 로 BJ 배양물을 공동처리하는 것이 GRO-α 수준의 IL-17F/IL-17A 이종이량체 자극을 없앤다는 것을 보여준다. 대조군은 IL-17F 및 IL-17A 항체 (X) 둘 다가 없는 배지로 제공된 배양물로 이루어졌다.
도 20 은 IL-17F 동종이량체, IL-17A 동종이량체, 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체의 분해에 의해 제조된 트립틱 펩티드 질량에 대한 MALDI-TOF 질량분석 데이타를 요약한 표이다. 표의 제 1 행은 분석된 펩티드 절편의 기원을 보여주고, 제 2 행 (구조) 은 펩티드 절편 서열을 보여주고, 제 3 행 (MW CaI) 은 절편의 계산된 분자량을 보여주고, 제 4 행은 절편의 계산된 질량-대-전하 비율 (m/z 값) (계산값) 을 보여주고, 제 5 행은 질량분석에 의해 측정된 실제의 질량-대-전하 비율 (m/z 값) (관찰값) 을 보여준다.
도 21 은 항-인간 IL-17F 항체가 영장류 IL-17F 의 생물학적 활성을 부분적으로 억제시킬 수 있음을 보여준다. 도 21 A 및 21B 는 인간 또는 영장류 (짧은꼬리원숭이) IL-17F 로 자극된 BJ 세포가 증가하는 수준의 IL-17F 에 대해 반응하는 GRO-α 의 증가된 수준을 보여준다. 도 21A 는 항-IL-17F-01 (□) 및 항-IL-17F-07 (X) 항체가 GRO-α 수준을 자극하는 인간 IL-17F (◆) 의 능력을 감소시킨다는 것을 보여준다. 유사하게는, 도 21B 는 항-IL-17F-01 (□) 및 항-IL-17F-07 (X) 항체는, 이러한 항체가 인간 IL-17F 생물학적 활성을 감소시키는 것보다 더 적은 범위일지라도, GRO-α 수준을 자극하는 영장류 IL-17F (◆) 의 능력을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 22 는 IL-17F 처리가 인간 공여자로부터 수득된 연골 세포 내에서의 ADAMTS-4 (아그레카나제 1) 의 발현을 증가시키고, 항-IL-17F 항체를 사용한 처리가 상기 자극을 없앤다는 것을 보여준다. 배양된 연골 세포를 250 ng/ml IL-17F, 250 ng/ml IL-17F 및 25 μg/ml 항-IL-17F, 25 μg/ml 항-IL-17F, 250 ng/ml IL-17F 및 25 μg/ml 대조군 IgGl, 또는 25 μg/ml 대조군 IgGl (x-축), 및 실시간 PCR 에 의해 측정된 아그레카나제 1 의 전사체 수준 (TAQMAN® 단위로서 표현됨 ; y-축) 으로 처리하였다. GAPDH 발현 수준을 노말라이저로서 사용하였다.
도 23 은 IL-17R 및 IL-17RC 의 전사체에 대해 siRNA 가 있는 BJ 세포로 처 리하는 것이 GRO-α 수준을 증가시키는 IL-17F 및 IL-17A 의 능력을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 23A : Taqman = IL-17R 에 대한 siRNA 로 처리된 세포에서의 IL-17R 전사체 수준의 감소 % ; IL-17F = IL-17R 에 대한 siRNA 로 처리된 세포에서의 GRO-α 수준을 자극하는 IL-17F 의 능력의 감소% ; IL-17A = IL-17R 에 대한 siRNA 로 처리된 세포에서의 GRO-α 수준을 자극하는 IL-17A 의 능력의 감소%. 도 23B 는 IL-17RC 의 전사체에 대한 siRNA 를 사용하여 BJ 세포를 처리하는 것이 GRO-α 수준을 증가시키는 IL-17F 및 IL-17A 의 능력을 감소시킨다는 것을 보여준다. Taqman = IL-17RC 에 대한 siRNA 로 처리된 세포에서의 IL-17RC 전사체 수준의 감소% ; IL-17F = IL-17RC 에 대한 siRNA 로 처리된 세포에서의 GRO-α 수준을 자극하는 IL-17F 의 능력의 감소% ; IL-17A = IL-17RC 에 대한 siRNA 로 처리된 세포에서의 GRO-α 수준을 자극하는 IL-17A 의 능력의 감소%. 도 23C 은 본 발명과 관련된 mRNA 폴리뉴클레오티드 (즉, IL-17R 및 IL-17RC) 를 표적으로 하는 본 발명의 여러 siRNA 분자 (SEQ E) NO :17 - 32) 를 개시한다.
도 24 는 건선으로 고통받는 환자로부터의 조직 생검 샘플 48 쌍에서, IL-17F 및 IL-17A 전사체 발현의 평균 폴드-체인지 (병변/비병변 (비영향) 조직) 를 보여준다. IL-17A 및 IL-17F 전사체 수준 둘 다는 비영향 조직에 비해 건선 병변 조직에서 증가된다. 페어드 (paired) t-테스트로부터의 P-값은 하기와 같다 : IL-17A p= 2.8 x 10-13, IL-17F p=1.1 x 10-9.
도 25 는 궤양성 대장염 (UC) (□) (12 쌍) 또는 크론병 (CD) (■) (16 쌍) 으로 고통받는 환자로부터의 페어드 조직 생검 샘플에서의 IL-17F 및 IL-17A 전사체 발현의 평균 폴드-체인지 (연관/비연관 조직) 를 보여준다. IL-17A 및 IL-17F 전사체 수준 둘 다는 IBD 샘플의 2 세트 모두에서 비연관 조직에 비해 영향 조직에서 증가된다. 페어드 t-테스트로부터의 P-값은 하기와 같다 : IL-17A (UC), p=0.309; IL-17A (CD), p=0.069; IL-17F (UC), p=0.406; IL-17F (CD), p=0.206.
도 26 은 IL-17F 에 대한 세포내 사이토카인 염색을 보여준다. IL-17F 에 대한 염색은 완전 프로인트 보조제에서 에멀젼화된 오브알부민 100 μg 으로 면역시킨 C57BL/6 마우스로부터의 (림프절) LN 세포 상에서 수행되었다. 세포를 CD4 로 표면-염색하고, 고정시키고, 침투시키고, 항-IgG1 아이소타입 대조군 또는 래트 항-쥣과 IL-17F (클론 15-1) 로 염색시켰다. 숫자는 양성 세포의 % 를 나타낸다.
인터루킨-17F (IL-17F) 은 IL-17 패밀리의 단백질에 속하고, 염증 사이토카인 및 케모카인, 예를 들어, IL-6, IL-8, GM-CSF, G-CSF, GRO-α, MCP-I, IL-I β, TNF-α, TGF-β 등의 발현을 유도하는 사이토카인이다. IL-17F 의 발현은 호중구증가증 및 다양한 자가면역 질환과 연관있다 (상기 Bettelli 및 Kuchroo). 예를 들어, IL-17F 은 증가된 프로테오글리칸 와해, 및 관절 연골에 의한, 감소된 프로테오글리칸 합성 (상기 Hymowitz,), 중추신경계 자가면역성 (상기 Langrish), 알레르기 및 천식 반응 (상기 Kawaguchi) 및 염증성 장 질환 (상기 Gurney) 과 연관있다. 따라서, IL-17F 신호전달은 자가면역 질환 (예를 들어, 관절염 (류마티스 관절염 포함), 건선, 전신 루푸스성 홍반 (SLE), 다발성 경화증), 호흡계 질환 (예를 들어, COPD, 낭성 섬유증, 천식, 알레르기), 이식 거부 (고형 기관 이식 거부 포함), 및 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병) 과 같은 염증 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는 장애와 연관되어 있는 것으로 여겨진다.
본 발명의 부분으로서, 본 발명자들은 IL-17F 의 투여 : 예를 들어, 중성구의 복막에의 유입 (실시예 1.1) 후의 반응, 1 차 연골 세포에 의한 염증 사이토카인의 증가된 분비와 연관된 염증 사이토카인의 1 차 전사 인자의 활성화 (실시예 1.2), 폐 섬유아세포에 의한 염증 사이토카인의 증가된 분비 (실시예 1.3), 및 1 차 인간 연골 세포에서의 아그레카나제의 증가된 수준 (실시예 7) 을 나타냄으로써, 염증 장애에서 IL-17F 의 연관성을 확인하였다. 본 발명자들은 또한, IL-17F 및 IL-17A 둘 다 자가면역 관절염 (실시예 7), 건선 (실시예 9) 및 염증성 장 질환 (IBD) (실시예 9) 에 관여할 수 있다고 결정하였다. 발명자들은 또한, IL-17F 에 대한 수용체로서 IL-17R 및 IL-17RC 를 규명하고 (실시예 2), 따라서, IL-17F 신호전달 경로의 억제를 위한 신규 표적을 제공하였다. 본 발명자들은 또한, 각각의 항체의 결합 특이성, 친화성, 및 IL-17F 신호전달, 즉, IL-17F 생물활성을 억제시키는 능력 (실시예 3 및 5) 에 관해 항-IL-17F 항체를 발생시키고 특징화시켰다. 한 구현예에서, 항체는 아마도 IL-17R 및/또는 IL-17RC 인지에 필요한 IL-17F 에피토프를 특징으로 하고 ; 즉, 6 가지의 쥣과 항-인간 IL-17F 항체 중 5 가지는 IL-17F 의 IL-17R 에의 결합을 방해할 수 있고, 상기 5 가지 중 2 가는 또한 IL-17F 의 IL-17RC 에의 결합을 방해할 수 있음을 특징으로 한다. 본 발명자들은 또한, 상기 항체 중 일부가 염증 사이토카인에 대한 2 차 전사 인자의 IL-17F-매개 활성화, 및 이어서 1 차 섬유아세포-유사 활막 세포에 의한 IL-17F-매개 사이토카인 분비 (실시예 4) 와 같은 IL-17F 생물활성을 억제시키는 (즉, 저하, 한정, 차단, 또는 그렇지 않으면 감소) 능력을 언급하였다. 본원에서는 또한 IL-17R 및 IL-17RC 를 통해 IL-17A 및 IL-17F 신호전달을 감소시키는 억제성 폴리뉴클레오티드를 개시한다 (실시예 8). 발명자들은 또한, IL-21 및 IL-17F 사이의 직접적인 관계, 즉, 활성화된 T 세포에 의한 IL-17A 및 IL-17F 둘 다의 생성을 증진시키는 IL-21 의 능력을 설명하였다. 따라서, IL-17F 신호전달의 억제는 또한 IL-21 결합의 IL-21R 에의 결합 및 IL-21R 의 활성화와 연관된 하나 이상의 효과를 억제시킬 수 있는 이유를 설명하였는데, 예를 들어, IL-17F 신호전달의 억제 방법이 IL-21 의 IL-21 R 에의 결합 및 IL-21 R 의 활성화와 연관된 IL-17F-관련 장애 및/또는 장애의 치료 방법에서 사용될 수 있는 이유를 설명하였다. 본 발명자들은 또한, 처음에 사이토카인의 자연 공급원으로부터 IL-17A 및 IL-17F 를 단리할 수 있음을 설명하였다. 본 발명자들은 또한, 신규 IL-17A/IL-17F 이종이량체 (예를 들어, 각각 T 세포, 및 HEK-293 및 COS 세포에서) 를 설명하고 정제하였으며, 이종이량체가 예를 들어, GRO-α 수준의 발현을 유도함으로써 IL-17F 신호전달을 전달함을 보여주었다 (실시예 5). 따라서, 본 발명자들은 IL-21 의 IL-21R 에의 결합 및 IL-21R 의 활성화와 연관된 염증 장애 및/또는 장애의 치료에서 IL-17F- 신호전달 경로의 억제를 위한 신규 표적으로서 이종이량체를 제공하였다.
이와 같이, 본 발명은 생체 내에서 IL-17F-매개 (IL-17F 동종이량체- 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체-매개 포함) 염증 반응을 억제시키는데 사용될 수 있고, 결과적으로 증가된 IL-17F 신호전달과 관련된 장애, 즉, IL-21 의 IL-21R 에의 결합 및 IL-21R 의 활성화와 연관된 IL-17F-관련 장애 및/또는 장애의 진단, 예후, 모니터링 및/또는 치료에 사용될 수 있는 IL-17F 신호전달 안타고니스트, (예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드 ; 용해성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드(그의 절편 (예를 들어, IL-17F 결합 절편) 및/또는 융합 단백질 포함) ; 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체 ; 및/또는 안타고니스트성 소분자) 를 제공한다. 신규 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 동정 및 단리, IL-17F 신호전달과 관련된 장애가 IL-17F 동종이량체 및/또는 IL-17F 이종이량체에 의해 매개될 수 있음을 지시한다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "IL-17F" 은 적절하다면, IL-17F 동종이량체 또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체를 말한다, 예를 들어, IL-17F 신호전달 경로는 IL-17F 동종이량체 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있는 신호전달 경로를 포함한다.
따라서, 본 출원은 IL-17R 및 IL-17RC 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하여, IL-17F 신호전달-관련 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제공한다. 본 출원은 또한 항체, 즉, IL-17F 동종이량체 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체를 포함하나 이에 제한되지 않는 IL-17F, 특히, 인간 IL-17F 에 결합하는 본래의 항체 및 그의 항원-결합 절편을 제공한다. 한 구현예에서, 항-IL-17F 항체는 하나 이상의 IL-17F-관련 (예를 들어, IL-17F 동종이량체 및/또는 IL-1 IAHL- 17F 이종이량체) 활성을 억제시키거나 또는 그에 대항한다. 예를 들어, 항-IL-17F 항체는 IL-17F 에 결합하고, 예를 들어, IL-17F 및 IL-17F 수용체 복합체, 예를 들어, IL-17R 및/또는 IL-17RC 를 포함하는 복합체 사이의 상호작용을 차단할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 IL-17F 생물활성, 예를 들어, IL-17F 및 IL-17F 수용체 복합체, 또는 그의 하부단위 사이의 결합을 검출하고, 임의로 억제 (예를 들어, 저하, 한정, 차단 또는 그렇지 않다면 감소) 시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-IL-17F 항체는 IL-21 의 IL-21R 에의 결합 및 IL-21R 의 활성화와 연관된 IL-17F 신호전달 및/또는 장애와 관련된 장애를 진단, 예후, 모니터링 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
IL -17F, IL -17R, 및 IL -17 RC 의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
본 발명은 추가로 IL-17F 신호전달 경로의 특징화, 즉, IL-17F 수용체로서 IL-17R 및/또는 IL-17RC 의 결정, 억제성 분자, 예를 들어, 항체, 수용체 융합 단백질 및 siRNA 를 사용한 IL-17F 의 IL-17R 및/또는 IL-17RC 에의 결합을 방해하는 효과의 설명, IL-17A/IL-17F 이종이량체의 Hie 정제를 제공한다. 이와 같이, 본 발명은 억제성 IL-17F, IL-17R 및 IL-17RC 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하여, IL-17F, IL-17R, 및 IL-17RC 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 관한 것이다.
IL-17F 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당업자에게 공지되어 있고 제공된다. 인간 IL-17F 의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO : 1 에 나타나 있다. 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 전장 IL-17F 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 에 나타나 있다. 성숙한 IL-17F 의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 의 약 아미노산 31 에서 시작하는 단백질에 상응한다 (예를 들어, 본원에서 그 전체가 참조로써 삽입된 미국 특허 출원 제 10/102,080 호를 참조).
IL-17A 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당업자에게 공지되고 제공된다. 인간 IL-17A 의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3 에 나타나 있고, 이는 폴리(A) 꼬리를 포함한다. 상기 뉴클레오티드 서열에 상응하는 전장 IL-17A 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4 에 나타나 있다.
IL-17R 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당업자에게 공지되고 제공된다. 인간 IL-17R 의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:5 에 나타나 있고, 이는 폴리(A) 꼬리를 포함한다. 상기 뉴클레오티드 서열에 상응하는 전장 IL-17R 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:6 에 나타나 있다.
IL-17RC 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당업자에게 공지되고 제공된다. 여러 인간 IL-17RC 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 인간 IL-17RC 폴리뉴클레오티드를 포함하며, SEQ ID NO :7, 9, 11, 13, 및 15 에 나타나 있다. 상기 뉴클레오티드 서열에 상응하는 여러 전장 인간 IL-17RC 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO :8, 10, 12, 14, 및 16 에 나타나 있다.
본 발명과 관련된 핵산은 DNA 또는 RNA 를 포함할 수 있고, 전체적으로 또는 부분적으로 합성일 수 있다. 본원에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열에 대한 참조는 내용에서 달리 요구하지 않는 한, 특정화된 서열 (또는 그의 상보체) 이 있는 DNA 분자를 포함하고, U 가 T 로 치환된 특정화된 서열이 있는 RNA 분자를 포함한다.
본 발명과 관련된 단리된 폴리뉴클레오티드는 개시된 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 것들과 동일하거나 또는 이와 유사한 서열을 갖는 핵산을 동정하고 단리하기 위한 혼성화 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다. 핵산을 동정하고 단리하기 위한 혼성화 방법에는 당업자에게 잘 알려진 중합효소연쇄반응 (PCR), 서던 혼성화, 인 시츄 (in situ) 혼성화 및 노던 혼성화가 포함된다.
혼성화 반응은 상이한 엄격함의 조건 하에 수행될 수 있다. 혼성화 반응의 엄격함은 임의의 2 개의 핵산 분자가 서로 혼성화할 어려움을 포함한다. 바람직하게는, 각각의 혼성화 폴리뉴클레오티드는 감소된 엄격한 조건 하에, 더욱 바람직하게는 엄격한 조건 하에, 및 가장 바람직하게는 고도로 엄격한 조건 하에, 그의 상응하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화한다. 엄격한 조건의 예는 하기 표 1 에 나타나 있는데 : 고도로 엄격한 조건은 예를 들어, 조건 A-F 의 엄격한 정도 이상인 것들이며 ; 엄격한 조건은 예를 들어, 조건 G-L 의 엄격한 정도 이상이며 ; 감소된 엄격한 조건은 예를 들어, 조건 M-R 의 엄격한 정도 이상이다.
엄격한 조건 폴리뉴클레오티드 하이브리드 하이브리드 길이 (bp)1 혼성화 온도 및 완충제2 세척 온도 및 완충제2
A DNA:DNA > 50 65℃; 1XSSC -또는- 42℃; 1XSSC, 50% 포름아미드 65℃; 0.3XSSC
B DNA:DNA < 50 TB*;1XSSC TB*;1XSSC
C DNA:RNA > 50 67℃; 1XSSC -또는- 45℃; 1XSSC, 50% 포름아미드 67℃; 0.3XSSC
D DNA:RNA < 50 TD*;1XSSC TD*;1XSSC
E RNA:RNA > 50 70℃; 1XSSC -또는- 50℃; 1XSSC, 50% 포름아미드 70℃; 0.3XSSC
F RNA:RNA < 50 TF*;1XSSC TF*;1XSSC
G DNA:DNA > 50 65℃; 4XSSC -또는- 42℃; 4XSSC, 50% 포름아미드 65℃; 1XSSC
H DNA:DNA < 50 TH*; 1XSSC TH*;4XSSC
I DNA:RNA > 50 67℃; 4XSSC -또는- 45℃; 4XSSC, 50% 포름아미드 67℃; 1XSSC
J DNA:RNA < 50 TJ*; 4XSSC TJ*;4XSSC
K DNA:RNA > 50 70℃; 4XSSC -또는- 50℃; 4XSSC, 50% 포름아미드 67℃; 1XSSC
L RNA:RNA < 50 TL*; 2XSSC TL*;2XSSC
M DNA:DNA > 50 50℃; 4XSSC -또는- 40℃; 6XSSC, 50% 포름아미드 50℃;2XSSC
N DNA:DNA < 50 TN*; 6XSSC TN*;6XSSC
O DNA:RNA > 50 55℃; 4XSSC -또는- 42℃; 6XSSC, 50% 포름아미드 55℃;2XSSC
P DNA:RNA < 50 TP*; 6XSSC TP*;6XSSC
Q RNA:RNA > 50 60℃; 4XSSC -또는- 45℃; 6XSSC, 50% 포름아미드 60℃;2XSSC
R RNA:RNA < 50 TR*; 4XSSC TR*;4XSSC
1 : 혼성화 폴리뉴클레오티드의 혼성화되는 영역(들) 에 참여되는 하이브리드 길이. 미지의 서열의 표적 폴리뉴클레오티드에 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 경우, 하이브리드 길이는 혼성화 폴리뉴클레오티드의 길이일 것으로 가정함. 공지 서열의 폴리뉴클레오티드가 혼성화되는 경우, 하이브리드 길이는 폴리뉴클레오티드의 서열을 나열하고, 최적의 서열 상보성의 영역 또는 영역들을 동정함으로써 결정될 수 있음. 2 : SSPE (1xSSPE 는 0.15M NaCl, 1OmM NaH2PO4, 및 1.25mM EDTA, pH 7.4 임) 는 혼성화 및 세척 완충제에서 SSC (1xSSC 는 0.15M NaCl 및 15mM 나트륨 시트레이트임) 로 치환될 수 있고 ; 혼성화가 완료된 후 15 분 동안 수행됨. TB* - TR* ; 길이가 50 염기쌍 미만인 채로 참여되는 하이브리드에 대한 혼성화 온도는 하이브리드의 용융 온도 (Tm) 보다 5 ~ 10℃ 더 작아야 하고, 여기서, Tm 은 하기 식에 따라 결정됨. 길이가 18 염기쌍 미만인 하이브리드에 대해서는, Tm(℃) = 2(A + T 염기의 #) + 4(G + C 염기의 #) 임. 길이가 18 내지 49 염기쌍인 하이브리드에 대해서는, Tm(℃)= 81.5 + 16.6(log10Na+) + 0.41(%G+C) - (600/N) (여기서, N 은 하이브리드 내 염기의 수이고, Na+ 는 혼성화 완충제 내 나트륨 이온의 농도임 (1 xSSC 에 대한 Na+= 0.165M)) 임. 폴리뉴클레오티드 혼성화에 대한 엄격한 조건의 추가의 예는 참조로써 본원에 삽입된 [Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 9 and 11] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel 등, eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4] 에 제공됨.
본 발명에 관련된 단리된 폴리뉴클레오티드는 개시된 폴리뉴클레오티드의 대립 변이체를 암호화하는 서열을 갖는 DNA 를 동정하고 단리하기 위해 혼성화 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다. 대립 변이체는 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 동일하거나 또는 유의한 유사성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 개시된 폴리뉴클레오티드의 자연 발생적인 대안적인 형태이다. 바람직하게는, 대립 변이체는 개시된 폴리뉴클레오티드와 90% 이상의 서열 동일성 (더욱 바람직하게는, 95% 이상의 동일성 ; 가장 바람직하게는, 99% 이상의 동일성) 을 갖는다. 대안적인으로, 유의한 유사성은 핵산 절편이 선택적인 혼성화 조건 (예를 들어, 고도로 엄격한 혼성화 조건) 하에 개시된 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 때 존재한다.
본 발명에 관련된 단리된 폴리뉴클레오티드는 또한 개시된 폴리뉴클레오티드에 동종인 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 갖는 DNA 를 동정하고 단리하기 위한 혼성화 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다. 상기 동종체는 개시된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 것과 상이한 종, 또는 동일한 종 내의 것이나 개시된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 유의한 서열 유사성을 갖는 종으로부터 단리된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 동종체는 개시된 폴리뉴클레오티드와 50% 이상의 서열 동일성 (더욱 바람직하게는, 75% 이상의 동일성 ; 가장 바람직하게는, 90% 이상의 동일성) 을 갖는 반면, 폴리펩티드 동종체는 개시된 폴리펩티드와 30% 이상의 서열 동일성 (더욱 바람직하게는, 45% 이상의 동일성 ; 가장 바람직하게는, 60% 이상의 동일성) 을 갖는다. 바람직하게는, 개시된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 동종체는 포유류 종으로부터 단리된 것이다.
2 개의 서열 사이의 "동종성" 또는 "서열 동일성" (용어는 본원에서 상호교환적으로 사용됨) 의 계산은 하기와 같이 수행된다. 서열은 최적의 비교를 목적으로 나열된다 (예를 들어, 갭이 최적의 나열을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 중 어느 하나 또는 둘 다, 또는 핵산 서열에 갭이 도입될 수 있고, 비동종성인 서열은 비교를 위해 무시될 수 있음). 바람직한 구현예에서, 비교를 위해 나열되는 참조 서열의 길이는 참조 서열의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 60% 이상, 및 더욱 더 바람직하게는 70%, 80%, 90%, 100% 이상이다. 다음, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에 잇는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제 1 서열에 있는 위치는 제 2 서열에 있는 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 차지하고, 다음, 분자는 그 위치에서 동일하다 (본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "동일성" 은 아미노산 또는 핵산 "동종성" 임). 2 개의 서열 사이의 % 동일성은 갭의 수를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수, 및 각 갭의 길이의 함수이고, 이는 2 개의 서열의 최적의 배열에 대해 유도될 필요가 있다.
2 개의 서열 사이의 서열의 비교 및 % 서열 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 2 개의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 의 갭 길이를 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com 에서 이용가능함) 에서 GAP 프로그램에 삽입된, [Needleman and Wunsch ((1970) J. MoL Biol. 48:444-53) 알고리즘] 을 사용하여 수행된다. 더욱 또다른 바람직한 구현예에서, 2 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 % 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80 의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 의 길이 중량을 사용하여, GCG 소프트웽어 패키지 (www.gcg.com 에서 이용가능함) 에서 GAP 프로그램에서 수행된다. 특히 바람직한 세트는 변수 (및 본 발명의 서열 동일성 또는 동종성 제한 내에 분자가 있는지 알아보기 위해 변수를 적용해야 하는지에 관해 시행자가 확신하지 못한다면, 사용되어야 할 것) 는 갭 페널티가 12, 갭 확장 페널티가 4, 및 격자이동 갭 페널티가 5 인 Blossum 62 스코어링 매트릭스이다. 2 개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 % 동일성은 또한 PAMl 20 중량 잔기표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4 를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 에 삽입된 [Meyers and Miller ((1989) CABIOS 4:11-17)] 의 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 관련된 단리된 폴리뉴클레오티드는 또한, 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 발현하는 세포 및 조직을 동정하기 위해, 그것들이 발현되는 조건 하에, 혼성화 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명에 관련된 폴리펩티드의 기능은 세포 또는 개체에서 본 발명과 관련된 폴리뉴클레오티드에 상응하는 유전자의 발현을 변경 (즉, 증진, 감소, 또는 개질) 하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 직접 시험될 수 있다. 상기 "상응하는 유전자" 는 본 발명과 관련된 폴리뉴클레오티드가 유래되는 mRNA 를 생성하기 위해 전사되는 본 발명과 관련된 게놈 DNA 서열이다.
본 발명과 관련된 유전자의 변형된 발현은 안티센스 폴리뉴클레오티드, siRNAs, 및 본 발명과 관련된 유전자로부터 전사되는 mRNA 에 결합 및/또는 절단하는 리보자임과 같은 다양한 억제성 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 세포 또는 개체에서 달성될 수 있다 (예를 들어, [Galderisi 등, (1999) J. 세포 Physiol. 181:251-57] ; [Sioud (2001) Curr. MoI. Med. 1:575-88] 를 참조). 예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 에 대한 억제성 폴리뉴클레오티드는 IL-17F 신호전달 안타고니스트로서 유용할 수 있고, 이와 같이, IL-17F 신호전달과 관련된 장애의 예방 또는 치료에 유용할 수 있다. 억제성 폴리뉴클레오티드는 또한 앱타머, 즉, IL-17F, IL-17A, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 의 활성과 같은 단백질 활성에 결합하고 조절하는 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 앱타머는 문헌을 통해 기술되어 있으며, 예를 들어, [Nimjee 등, (2005) Annu. Rev. Med. 56:555-83 and Patel (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:32-46] 를 참조한다.
본 발명과 관련된 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 리보자임은 본 발명과 관련된 유전자의 전체 코딩 가닥에 상보적일 수 있거나, 또는 단지 그의 일부에만 상보적일 수 있다. 대안적으로, 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 리보자임은 본 발명과 관련된 유전자의 코딩 가닥의 비코딩 영역에 상보적일 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 리보자임은 당업계에 잘 알려진 과정을 사용하여 화학 합성 및 효소 연결 반응을 사용하여 구축될 수 있다. 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오시드 연결은 뉴클레아제-매개 분해의 영향을 받지 않고, 뿐만 아니라 그의 서열 특이성을 증가시키기 위한 그의 능력을 향상시키기 위해 개질될 수 있다. 상기 연결 개질은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로아미데이트, 보라노포스페이트, 모르폴리노, 및 펩티드 핵산 (PNA) 연결을 포함하나 이에 제한되지 않는다 (상기 Galderisi 등 ; Heasman (2002) Dev. Biol. 243:209-14 ; Micklefield (2001) Curr. Med. Chem. 8:1157-79). 대안적으로, 상기 분자는 본 발명과 관련된 폴리뉴클레오티드가 안티센스 (즉, 역) 배향에서 서브클로닝되는 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성될 수 있다.
본 발명의 억제성 폴리뉴클레오티드는 또한 2 중 DNA 의 주홈에 높은 특이성 및 친화성으로 결합하는 3 중-형성 올리고뉴클레오티드 (TFO) 를 포함한다 (Knauert and Glazer (2001) Hum. MoI. Genet. 10:2243-51). 본 발명과 관련된 유전자의 발현은 유전자의 전사를 방지하는 3 중 나선 구조를 형성하기 위해 유전자의 조절 영역 (즉, 프로모터 및/또는 인핸서 서열) 에 상보적인 TFO 를 표적으로 함으로써 억제될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 억제성 폴리뉴클레오티드는 짧은 방해 RNA (siRNA) 분자이다. 상기 siRNA 분자는 짧고 (바람직하게는 19-25 뉴클레오티드 ; 가장 바람직하게는 19 또는 21 뉴클레오티드), 표적 mRNA 의 서열-특이적 분해를 야기하는 이중-가닥 RNA 분자이다. 이러한 분해는 RNA 방해 (RNAi) 로서 알려져 있다 (예를 들어, Bass (2001) Nature 411 : 428-29). 저급 개체에서 원래 동정된 RNAi 는 포유류 세포에 효과적으로 적용되고, Fas mRNA 를 표적으로 하는 siRNA 분자로 처리된 마우스에서 전격 간염을 예방하는 것으로 최근 나타났다 (Song 등, (2003) Nature Med. 9:347-51). 또한, 지주막하강내 전달된 siRNA 가 래트에서의 2 가지 모델 (아고니스트-유도 통증 모델 및 신경병증 통증 모델) 에서 통증 반응을 차단하는 것으로 최근 보고되었다 (Dorn 등, (2004) 핵산 Res. 32(5):e49).
본 발명의 siRNA 분자는 2 개의 상보적인 단일-가닥 RNA 분자를 어닐링함으로써 (그 중 하나는 표적 mRNA 의 부위에 매치됨) (Fire 등, 미국 특허 제 6,506,559 호) 또는 필수적인 이중-가닥 부위를 생성하기 위해 그 자체 상에서 뒤로 접히는 단일 헤어핀 RNA 분자의 사용을 통해 (Yu 등, (2002) Proc. Natl. Acad. ScL USA 99:6047-52) 생성될 수 있다. siRNA 분자는 화학적으로 합성되거나 (Elbashir 등, (2001) Nature 411 :494-98) 또는 시험관 내에서 단일-가닥 DNA 주형을 사용한 전사에 의해 생성될 수 있다 (Yu 등, 상기). 대안적으로, siRNA 분자는 센스 및 안티센스 siRNA 서열을 함유하는 현 벡터(들) 를 사용하여, 생물학적으로, 일시적으로 (Yu 등, 상기; Sui 등, (2002) Proc. Natl. Acad. ScL USA 99:5515-20) 또는 안정적으로 (Paddison 등, (2002) Proc. Natl. Acad. ScL USA 99:1443-48) 생성될 수 있다. 최근, 효과적이고 서열-특이적인 방식에서 1 차 인간 세포 내 표적 mRNA 의 수준의 감소는 헤어핀 RNA 를 발현하고, 추가로 siRNA 로 가공되는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 설명되었다 (Arts 등, (2003) 게놈 Res. 13:2325-32).
본 발명과 관련된 폴리뉴클레오티드에 표적인 siRNA 분자는 당업계에 잘 알려진 기준을 바탕으로 디자인될 수 있다 (예를 들어, Elbashir 등, (2001) EMBOJ. 20:6877-88). 예를 들어, 표적 mRNA 의 표적 단편은 바람직하게는 AA (가장 바람직하게는), TA, GA, 또는 CA 로 시작되어야 하고 ; siRNA 분자의 GC 비율은 바람직하게는 45 ~ 55% 이어야 하고 ; siRNA 분자는 바람직하게는 한 줄에서 동일한 뉴클레오티드 3 개를 함유해서는 안되고 ; siRNA 분자는 바람직하게는 한 줄에서 7 개의 혼합된 GfC 를 함유해서는 안되고 ; 표적 단편은 바람직하게는 표적 mRNA 의 ORF 영역 내에 있어야 하고 바람직하게는 시작 ATG 뒤로 75 bp 이상 및 정지 코돈 앞 75 bp 이상에 있어야 할 것이다. 상기 기준, 또는 기타 공지된 기준을 바탕으로 (예를 들어, Reynolds 등, (2004) Nature Biotechnol. 22:326-30), 본 발명에 관련된 mRNA 폴리뉴클레오티드를 표적으로 하는 본 발명의 siRNA 분자가 당기술분야 중 하나에 의해 디자인될 수 있음을 설명한다. 개시된 방법에 사용되기 위한 siRNA 의 바람직한 예는 SEQ ID NO :17-32 에 나타나 있고, 표적 IL-17R (SEQ ID NO :17-24) 및 IL-17RC (SEQ ID NO :25-32) 에 유용한 siRNA 에 상응한다.
개체 내에서의 본 발명과 관련된 유전자의 변형된 발현은 또한 본 발명과 관련된 폴리뉴클레오티드를 도입한 비인간 유전자도입 동물을 만듦으로써 이루어질 수 있다. 이러한 유전자도입 동물은 본 발명의 유전자 (즉, 트랜스유전자) 의 복수의 복사본을 가진 동물을 포함한다. 조직-특이적인 조절 서열(들) 은 특정 세포 또는 특정 발달 단계에 본 발명과 관련된 폴리펩티드의 발현을 지시하는 트랜스유전자에 조작적으로 연결될 수 있다. 특히 마우스와 같은 동물의 배 증식 및 미세주사를 통한 유전자도입 동물의 발생 방법은 통상적으로 되었고 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, Bockamp 등, Physiol. 게놈s 11:115-32 (2002)).
개체 내에서의 본 발명과 관련된 유전자의 변형된 발현은 또한 본 발명과 관련된 폴리뉴클레오티드에 상응하는 내인성 유전자가 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 통해 붕괴된 동물 (즉, 녹아웃 동물) 을 만듦으로써 이루어질 수 있다. 내인성 유전자의 코딩 영역은 비기능성 단백질을 발생시킴으로써, 붕괴될 수 있다. 대안적으로는, 내인성 유전자의 업스트림 조절 영역이 붕괴되거나 또는 상이한 조절 원소로 대체되어, 여전히-기능적인 단백질의 변형된 발현을 초래할 수 있다. 녹아웃 동물의 발생 방법은 동종 재조합을 포함하고, 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, Wolfer 등, Trends Neurosci. 25:336-40 (2002)).
본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명과 관련된 폴리펩티드(including active 절편 및/또는 융합 폴리펩티드thereof) 의 재조합 생성을 위한 발현 대조군 서열에 연결되고/거나 또는 발현 벡터 내로 결합될 수 있다. 재조합 단백질을 발현하는 일반적인 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이 발현 벡터는 그것이 연결되는 또다른 핵산을 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 말하는 것으로 의도된다. 한 유형의 벡터는 플라스미드로서, 추가의 DNA 분절이 연결될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 또다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터로서, 여기서 추가의 DNA 분절은 바이러스 게놈 내로 결합될 수 있다. 일부 벡터는 그것들이 도입되는 숙주세포에서 자발적인 복제를 할 수 있다 (예를 들어, 복제 및 에피소말 포유류 벡터의 박테리아 기원을 갖는 박테리아 벡터). 기타 벡터 (예를 들어, 비에피소말 포유류 벡터) 는 숙주세포 내로의 도입 시 숙주세포의 게놈 내로 통합되어, 숙주게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 일부 벡터는 조작적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터를 본원에서는 재조합 발현 벡터 (또는 간단하게는, 발현 벡터) 라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서의 발현 벡터의 유용성은 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, 플라스미드와 상호교환적으로 사용될 수 있는 플라스미드 및 벡터는 가장 흔하게 사용되는 벡터의 형태이다. 그러나, 본 발명은 당량하는 기능을 제공하는 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 불완전한 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스) 와 같은 발현 벡터의 다른 형태를 포함하고자 한다.
한 구현예에서, 본 발명과 관련된 폴리뉴클레오티드는 재조합 IL-17F 아고니스트, 예를 들어, 하나 이상의 "IL-17F 수용체-결합 모티프" 의 존재를 기반으로 동정될 수 있는 것을 제조하는데 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "IL-17F 수용체-결합.모티프" 는 IL-17F 의 그의 필수적인 수용체에의 결합에 중요한 아미노산 서열 또는 잔기를 포함한다. IL-17F 아고니스트의 예는 IL-17F 동종이량체, IL-17A/IL-17F 이종이량체, 그의 절편, 예를 들어, IL-17R 또는 IL-17RC 결합 절편, 및/또는 소분자를 포함한다 (하기 기술된 바와 같음). 이러한 아고니스트는 조혈의 조절, 및 결과적으로 골수 또는 림프 세포 부족의 치료에 유용할 수 있다. 또다른 구현예에서, 본 발명과 관련된 폴리뉴클레오티드는 IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드 ; 용해성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (절편 (예를 들어, IL-17F 결합 절편) 및/또는 그의 융합 단백질 포함) ; IL-17F 동종이량체 및/또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 생물활성을 억제시킬 수 있는 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체 ; 및/또는 안타고니스트성 소분자 등) 를 제조하는데 사용될 수 있다.
융합 폴리펩티드, 즉, 제 2 폴리펩티드 부분과 연결된 제 1 폴리펩티드 부분의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, IL-17F 폴리펩티드 또는 IL-17F 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, IL-17R 및/또는 IL-17RC, 그의 절편 포함) 는 제 2 폴리펩티드 부분, 예를 들어, 면역글로불린 또는 그의 절편 (예를 들어, 그의 Fc 결합 절편) 에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 폴리펩티드 부분은, 예를 들어, 전장 IL-17RC 폴리펩티드를 포함한다. 대안적으로, 제 1 폴리펩티드는 전장 BL- 17RC 폴리펩티드보다 더 적게 포함한다. 추가로, 예를 들어, IL-17RC 의 용해성 형태는 아마도 면역글로불린의 Fc 부위에 "연결기" 서열을 통해 융합될 수 있다. 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), Lex-A, 티오레독신 (TRX) 또는 말토스-결합 단백질 (MBP) 이 있는 다른 융합 단백질이 또한 사용될 수 있다.
제 2 폴리펩티드 부분은 바람직하게는 용해성이다. 일부 구현예에서, 제 2 폴리펩티드 부분은 연결된 폴리펩티드의 반감기, (예를 들어, 혈청 반감기) 를 증진시킨다. 일부 구현예에서, 제 2 폴리펩티드 부분은 융합 폴리펩티드와 제 2 IL-17F 또는 IL-17R 폴리펩티드와의 결합을 유용하게 하는 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 제 2 폴리펩티드는 면역글로불린 폴리펩티드의 하나 이상의 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합 폴리펩티드는 당업계에 공지되어 있고, 모두가 참조로써 본원에 삽입된 예를 들어, 미국 특허 제 5,516,964 호 ; 제 5,225,538 호 ; 제 5,428,130 호 ; 제 5,514,582 호 ; 제 5,714,147 호 ; 제 5,455,165 호에 기술되어 있다. 융합 단백질은 제 1 폴리펩티드 부분, 예를 들어, IL-17F 또는 IL-17R (그의 절편 포함) 을 제 2 부분에 조이닝하는 연결기 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 연결기 서열의 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 예를 들어, 길이가 아미노산 약 2 내지 20 개인 펩티드 연결기, 더욱 바람직하게는 10 개 미만인 펩티드 연결기를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 펩티드 연결기는 길이가 아미노산 2 개일 수 있다.
또다른 구현예에서, 재조합 단백질은 그의 N-말단에서 이종 신호 서열 (즉, IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드 내에 존재하지 않는 폴리펩티드 서열) 을 포함한다. 예를 들어, 또다른 단백질로부터의 신호 서열은 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (그의 절편 및/또는 융합 단백질 포함) 와 융합될 수 있다. 일부 숙주세포 (예를 들어, 포유류 숙주세포) 에서, 재조합 단백질의 발현 및/또는 분비는 이종 신호 서열을 사용하여 증가될 수 있다. 융합 단백질에 포함될 수 있는 신호 펩티드는 멜티틴 신호 펩티드 MKFLVNVALVFMWYISYIYA (SEQ ID NO:33) 이다.
본 발명의 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 절편은 예를 들어, 결합을 위한 블런트-말단 또는 스태거-말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 불필요한 조이닝을 피하기 위한 알칼리 포스파타제 처리, 및 효소 연결을 적용하여, 통상의 기술에 따라 격자-내에서 함께 연결된다. 또다른 구현예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하여 통상의 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 절편의 PCR 증폭은 이어서, 키메라성 유전자서열을 생성하기 위해 어닐링되고 재증폭될 수 있는 2 개의 연속 유전자절편 사이의 상보적인 오버행을 야기하는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, [Ausubel 등, (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992] 참조). 더욱이, 많은 발현 벡터는 융합 부분 (예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역) 을 암호화하는 시판되는 것이다. IL-17F-, IL-17R- 및/또는 IL-17RC-암호화 핵산은 융합 부분이 면역글로불린 단백질에 골격-내에서 연결되도록 그러한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-17F, IL-17R 및/또는 IL-17RC 융합 폴리펩티드는 이량체 또는 삼량체와 같은 올리고머로서 존재한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 벡터의 복제 (예를 들어, 복제의 기원) 를 조절하는 서열과 같은 추가의 서열 및 선택성 마커 유전자를 이동시킬 수 있다. 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입되는 숙주세포의 선택을 유용하게 한다.
예를 들어, 전형적으로 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입되는 숙주세포에G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선택성 마커 유전자는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭이 있는 dhfr 숙주세포에서의 사용을 위해) 및 네오유전자 (G418 선택을 위해) 를 포함한다.
적합한 벡터는 프로모터 서열, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 기타 서열, 예를 들어, 적절하다면 숙주세포 (예를 들어, 복제 기원) 에서 벡터의 복제를 조절하는 서열을 포함하여 적절한 조절 서열을 함유하는 것이 선택되거나 또는 구축될 수 있다. 벡터는 적절하다면 플라스미드 또는 바이러스, 예를 들어, 파지, 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 상세한 설명을 위해서는, 예를 들어, [Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd ed., Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 를 참조한다. 핵산 구축물의 제조, 돌연변이, 서열화, DNA 의 세포에의 도입 및 유전자발현, 및 단백질의 분석과 같은 핵산의 증식을 위한 많은 공지 기술 및 프로토콜은 [Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., Ausubel 등, eds., John Wiley & Sons, 1992] 에 상세히 기술된다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 본원에 개시된 핵산을 포함하는 숙주세포를 제공한다. 더욱 추가의 측면은 상기 핵산을 숙주세포에 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 도입은 임의의 사용가능한 기술을 적용할 수 있다. 진핵 세포에 대해서는, 적합한 기술은 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 리포좀-매개 트랜스펙션, 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어, 백시나 또는, 곤출 세포에 대해서는 바큘로바이러스를 사용한 형질 도입을 포함할 수 있다. 박테리아 세포에 대해서는, 적합한 기술은 박테리오파지를 사용한 염화칼슘 형질전환, 전기천공법 및 트랜스펙션을 포함할 수 있다. 도입은 핵산으로부터의 발현을 야기 또는 허용함으로써, 예를 들어, 유전자의 발현 조건 하에 숙주세포를 배양함으로써 이어질 수 있다.
많은 세포주가 본 발명과 관련된 폴리펩티드의 재조합 발현에 적합한 숙주세포로서 작용할 수 있다. 포유류 숙주세포주는 예를 들어, COS 세포, CHO 세포, 293 세포, A431 세포, 3T3 세포, CV-I 세포, HeLa 세포, L 세포, BHK21 세포, HL-60 세포, U937 세포, HaK 세포, Jurkat 세포, 뿐만 아니라 1 차 조직 및 1 차 외식편의 시험관내 배양으로부터 유래된 세포 계통을 포함한다.
대안적으로, 효모와 같은 저급 진핵생물 또는 진핵생물에서 본 발명에 관련된 폴리펩티드를 재조합적으로 제조하는 것이 가능할 수 있다. 잠재적으로 적합한 효모 계통은 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스폼.베, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 계통, 및 칸디다 계통을 포함한다. 잠재적으로 적합한 박테리아 계통은 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 및 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 을 포함한다. 본 발명과 관련된 폴리펩티드가 효모 또는 박테리아에서 만들어진다면, 기능성을 수득하기 위해 예를 들어, 적절한 부위의 인산화 또는 글리코실화에 의해 그것들을 개질하는 것이 필요할 수 있다. 상기 공유 결합은 잘-공지된 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
박테리아 내에서의 발현은 재조합 단백질에 혼입되는 봉입체를 형성시킬 수 있다. 따라서, 재조합 단백질의 재접힘은 활성 또는 더욱 활성인 물질을 제조하는데 필요할 수 있다. 박테리아 봉입체로부터 올바르게 접힌 이종 단백질을 수득하는 다수의 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 일반적으로 봉입체로부터 단백질을 용해시키고, 그런 다음 카오트로픽제를 사용하여 단백질을 완전히 변성시키는 것을 포함한다. 시스테인 잔기가 단백질의 1 차 아미노산 서열에 존재할 때, 이황화 결합의 올바른 형성을 가능하게 하는 환경에서 재접힘을 수행하는 것이 종종 필요하다 (산화환원계). 일반적인 재접힘 방법은 [Kohno (1990) Meth. Enzymol. 185:187-95] 에 개시되어 있다. EP 0433225, 및 미국 특허 제 5,399,677 호는 다른 적절한 방법을 기술한다.
본 발명과 관련된 폴리펩티드는 또한 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 바큘로바이러스 벡터와 같은 하나 이상의 곤충 발현 벡터에서 적합한 대조군 서열에 조작적으로 연결하고, 곤충 세포 발현계를 적용함으로써 재조합적으로 제조될 수 있다. 바큘로바이러스/Sf9 발현계에 대한 물질 및 방법은 키트 형태로 시판된다 (예를 들어, MAXBAC® kit, Invitrogen, Carlsbad, CA).
적절한 숙주세포에서 재조합 발현 후에, 본 발명의 재조합 폴리펩티드는 면역침전, 겔 여과 및 이온 교환 크로마토그래피와 같은 공지된 정제 방법을 사용하여 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 용해성 형태의 IL-17F 신호전달 안타고니스트, 예를 들어, IL-17R 단백질 및/또는 IL-17RC 단백질 (그의 절편, 및/또는 융합 단백질 포함) ; 또는 IL-17F 아고니스트, 예를 들어, 용해성 IL-17F (동종이량체 또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체 형성에서) 는 조건화된 배지로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, IL-17F 신호전달 안타고니스트의 막-결합 형태는 아마도 발현 세포로부터 총 막 분획을 제조하고, Triton X-100 과 같은 비이온성 세제로 막을 추출함으로써 정제될 수 있다. 본 발명과 관련된 폴리펩티드는 시판의 단백질 농도 필터, 예를 들어, AMICON® 또는 Millipore PELLICON® 초여과 단위 (Millipore, Billerica, MA) 를 사용하여 농축될 수 있다. 농도 단계 후에, 농축물을 겔 여과 배지와 같은 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어, 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE) 또는 폴리에테닐렌이민 (PEI) 기를 가진 매트릭스 또는 기질이 사용될 수 있다. 매트리스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에 흔히 사용되는 기타 유형일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계가 적용될 수 있다. 적합한 양이온 교환기는 술포프로필 또는 카르복시메틸기를 포함하는 다양한 불용성 매트리스이다. 술포프로필기가 바람직하다 (예를 들어, S-세파로스® 행s, Sigma- Aldrich, St. Louis, MO). 배양 상청액으로부터의 재조합 단백질의 정제는 또한 콘카나발린 A-아가로스, 헤파린-TOYOPEARL® (Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., Japan) 또는 Cibacrom blue 3GA 세파로스® (Tosoh Biosciences, San Francisco, CA) 와 같은 상기 친화성 수지 ; 또는 페닐 에테르, 부틸 에테르, 또는 프로필 에테르와 같은 수지를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 ; 또는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 하나 이상의 행 단계를 포함할 수 있다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 배지, 예를 들어, 펜던트 메틸 또는 기타 지방족기를 갖는 실리카 겔을 적용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계는 재조합 단백질을 추가로 정제하는데 사용될 수 있다. 재조합 단백질에 대한 항체 (예를 들어, 본원 방법을 사용하여 기술된 것들) 를 포함하는 친화성 칼럼은 공지된 방법에 따른 정제에서 사용될 수 있다. 전술한 정제 단계 중 일부 또는 모두는 다양한 조합에서 또는 기타 공지된 방법과 함께, 실질적으로 정제된 단리된 재조합 단백질을 제공하는데 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 단리된 재조합 단백질은 기타 포유류 단백질이 실질적으로 없도록 정제된다. 추가로, 상기 정제 방법은 또한 자연 공급원을 포함하여 기타 공급원으로부터 본 발명의 폴리펩티드를 정제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자도입 동물의 생성물로서, 예를 들어,유전자도입 소, 염소, 돼지, 또는 양의 젖의 성분으로서 발현되는, 본 발명과 관련된 폴리펩티드, 예를 들어, IL-17F 아고니스트 (예를 들어, 용해성 IL-17F) 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, 용해성 IL-17R 및/또는 용해성 IL-17RC 단백질 (그의 절편 및/또는 융합 단백질 포함) 은 아마도 상기 기술된 바와 같이 정제된다.
대안적으로, 폴리펩티드는 또한 정제를 유용하게 하는 형태로 재조합적으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 말토스-결합 단백질 (MBP), 글루타티온-iS-트랜스퍼라제 (GST), 또는 티오레독신 (TRX) 과 같은 단백질과의 융합으로서 발현될 수 있다. 상기 융합 단백질의 발현 및 정제를 위한 키트는 각각 New England BioLabs (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ), 및 Invitrogen 에서 시판된다. 재조합 단백질은 또한 작은 에피토프로 태깅되고 이어서 에피토프에 특이적인 항체를 사용하여 동정되고 단리될 수 있다. 바람직한 에피토프는 Eastman Kodak (New Haven, CT) 에서 시판되는 플래그 에피토프이다.
대안적으로, 재조합 IL-17F 및 IL-17A 융합 단백질은 상이한 에피토프로 태깅되어서, IL-17A/IL-17F 이종이량체의 정제를 가능하게 한다. IL-17F 및 IL-17A 상에 상이한 태그가 존재하는 것은 IL-17A 및 IL-17F 동종이량체 둘 다가 실질적으로 없는 IL-17A/TL-17F 이종이량체의 단리를 허용한다. 예를 들어, IL-17A 는 플래그 또는 myc 에피토프와 같은 에피토프로 태깅될 수 있고, 한편 IL-17F 는 동시에 His 또는 GST 에피토프와 같은 에피토프로 태깅될 수 있으며, 두 단백질 모두는 동시에 세포에서 발현된다. 재조합 숙주세포, 또는 숙주세포가 배양되는 배지로부터의 추출물은 수득되어서 비환원 조건 하에 2-단계 친화성 크로마토그래피 정제를 받게 될 것이다. 제 1 친화성 칼럼은 2 가지 상이한 태그 중 하나, 예를 들어, IL-17A (또는 IL-17A 의 절편) 에 융합된 플래그 에피토프에 결합할 것이고, 따라서 제 1 칼럼으로부터의 세척은 (주로) IL-17F 동종이량체를 함유할 것이고, 제 1 칼럼으로부터의 용출물은 IL-17A/IL-17F 이종이량체 및 IL-17A 동종이량체 둘 다를 함유할 것이다. 그런 다음, 제 1 칼럼으로부터의 용출물은 2 가지 상이한 태그 중 나머지 다른 하나, 예를 들어, IL-17F 에 융합된 His 태그에 특이적으로 결합하는 제 2 친화성 칼럼에 놓일 것이다. 따라서, 제 2 칼럼으로부터의 세척물은 IL-17A 동종이량체를 함유할 것이고, 제 2 칼럼으로부터의 용출물은 주로 또는 배제적으로 IL-17A/IL-17F 이종이량체 (즉, IL-17A 및 IL-17F 동종이량체 둘 다가 실질적으로 없는) 를 함유할 것이다. 재조합 숙주세포 또는 숙주세포 배지로부터의 추출물은 단백질-단백질 상호작용이 방해받지 않는 비환원 조건 하에 수득되어 그런 다음, 적절한 재접힘 및 거기에 함유된 IL-17F 및 IL-17A 단량체의 상호작용을 허용하도록 처리될 수 있다. 당업자는, 숙주세포가 IL-17F 및 IL-17A 융합 단백질 둘 다를 발현할 필요가 없으며 ; 단일 트랜스펙션물, 예를 들어, IL-17A 또는 IL-17F 융합 단백질을 발현하는 숙주세포로부터의 세포 또는 배지가 수득되고 IL-17A 및 IL-17F 단량체가 이량체화하도록 하는 조건 하에 조합될 수 있음을 쉽게 알게 될 것이다.
IL-17F 신호전달 안타고니스트를 포함하여, 본 발명과 관련된 폴리펩티드는 또한 공지된 통상의 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 폴리펩티드를 화학적으로 합성하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 상기 화학적 합성 폴리펩티드는 자연적인, 정제된 폴리펩티드에 흔한 생물학적 특성을 가질 수 있고, 따라서 자연적인 폴리펩티드에 대해 생물학적으로 활성이거나 또는 면역학적인 치환체로서 적용될 수 있다.
본 발명자들은 또한 IL-17A 의 자연 형태를 포함하여 본 발명의 폴리펩티드의 "자연" 즉, 비재조합 형태를 단리할 수 있었다 (예를 들어, 실시예 5 참조). 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 자연적인 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, IL-17A/IL-17F 이종이량체 등을 포함한다.
IL-17F 신호전달 안타고니스트를 포함하여, 본 발명과 관련된 폴리펩티드는 또한 개시된 폴리펩티드와 구조적으로 상이한 (예를 들어, 약간 변형된 서열을 가짐) 분자를 포함하나, 개시된 폴리펩티드와 동일한 생화학적 특성을 실질적으로 가진다 (예를 들어, 단지 기능적으로 비필수적인 아미노산 잔기에서만 변함). 상기 분자는 자연 발생적인 대립 변이체, 및 변경, 치환, 대체, 삽입, 또는 결손을 포함하는 신중히 엔지니어링된 변이체를 포함한다. 그러한 변경, 치환, 대체, 삽입 또는 결손을 위한 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 부분은 자연 발생적인 서열 (야생형) 내에서 돌연변이를 갖는 변형 폴리펩티드로서 제공되고, 이는 단백질분해에 더욱 내성을 갖는 서열을 야기한다 (돌연변이된 서열에 상대적임).
IL-17F (IL-17F 동종이량체 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체 포함), IL-17R, IL-17RC 폴리펩티드, 절편 및/또는 이의 융합 폴리펩티드, 이의 재조합 및 자연 형태, 및/또는 자연 IL-17A 는, IL-17F 의 결합 및/또는 IL-17F 생물활성의 억제를 가능하게 하는 스크린 제제 (예를 들어, 기타 IL-17F 신호전달 안타고니스트, 예를 들어, 항-IL-17F 항체) 로 사용될 수 있다. 원하는 결합 단백질 (고정화되거나 또는 그렇지 않음) 을 이용하는 결합 검정은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 IL-17F 신호전달 안타고니스트, 예를 들어, IL-17R 및/또는 IL-17RC 를 포함하는 본 발명에 관련된 폴리펩티드와 함께 상기 목적을 위해 이용될 수 있다. 정제된 세포-기재 또는 단백질-기재 (세포-없음) 스크리닝 검정은 그러한 제제를 동정하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, IL-17F 단백질은 담체 상에서 정제된 형태로 고정화될 수 있고, 정제된 IL-17F 에 대한 잠재 리간드의 결합이 측정될 수 있다.
항체
다른 구현예에서는, 본 발명이 IL-17F 신호전달 안타고니스트를 항체, 즉, 본래의 항체 및 이의 항원 결합 절편으로서 제공하는데, 이는 IL-17F (IL-17F 동종이량체 및/또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체 포함), 바람직하게는 포유류 (예를 들어, 인간) IL-17F, 또는 IL-17F 의 수용체, 예를 들어, IL-17R 및/또는 IL-17RC 에 특이적으로 결합된다. 한 구현예에서는 항체가 억제성 항체여서, 즉, 이들은 하나 이상의 IL-17F 생물활성 (예를 들어, IL-17F 및 이의 수용체의 결합, 신호전달 성분 (예를 들어, NF-κB) 의 IL-17F-매개 활성화, 사이토카인 생산의 IL-17F-매개 유도, 아그레카나제 내 IL-17F-매개 증가 등) 을 억제하고, IL-17F 신호전달 관련 장애의 진단, 예후, 모니터링 및/또는 치료에 유용할 수 있다. IL-21 에 의한 IL-17A 및 IL-17F 생산의 상향조절 (실시예 5 참조) 은, IL-21 의 IL-21R 에의 결합 및 IL-21R 의 활성화 (예를 들어, IL-21 신호전달) 와 관련된 전염증성 효과가 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 및/또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체에 의해 매개된다는 것을 제안한다. 결과적으로, IL-17F 신호전달을 완화시키는 본 발명의 항체는 또한 IL-21 신호전달에 관련된 하나 이상의 활성 (예를 들어, 사이토카인 생산의 조정, 염증/자가면역 장애 (예컨대, 염증성 장 장애 또는 질환 (IBDs), 류마티스 관절염, 이식/이식편 거부, 및 건선) 에서의 염증 등; 미국 특허 출원 번호 60/599,086 및 60/639,176 참조) 에 억제성인 항체일 수 있고, IL-21 신호전달에 관련된 장애의 진단, 예후, 모니터링 및/또는 치료에 유용할 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 항-IL-17F 항체 (이는 특이적으로 결합되나, IL-17F 신호전달을 억제하지는 않음 (즉, 검출 항체)) 를 제공하며; 그러한 항체는, 예를 들어, IL-17F 신호전달 관련 장애의 진단, 예후, 및/또는 모니터링을 위한 키트의 일부로서 IL-17F 단백질 (예를 들어, 동종이량체 및/또는 이종이량체로서) 의 존재를 검출하는데 이용될 수 있다. 한 구현예에서, 항체는 IL-17F 에 관한 것이다. 또다른 구현예에서, 항체는 단일클론 또는 단일 특이성 항체이다. 항체는 또한 인간 IL-17F 에 대한 인간, 인간화된, 키메라성, 또는 생체외-생성 항체일 수 있다.
당업자는, 본원에서 사용되는 용어 "항체" 가 하나 이상의, 바람직하게는 두, 무거운 (H) 사슬 가변 영역 (본원에서는 VH 이라 약칭), 및 하나 이상의, 바람직하게는 두 가벼운 (L) 사슬 가변 영역 (본원에서는 VL 이라 약칭) 을 포함하는 단백질을 의미한다 것을 알 수 있다. VH 및 VL 영역은, 더 보존된 영역 ("프레임워크 영역" ("FR") 으로 정의) 이 산재된 과변이의 영역 ("상보성 결정 영역" ("CDR") 으로 정의) 으로 더 구획될 수 있다. FR 및 CDR 의 정도는 문헌 ([Kabat 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판, U.S. Department of Health 및 Human Services, NIH Publication No. 91-3242; 및 Chothia 등, (1987) J. MoI. Biol. 196:901-917] 참조, 이는 본원에 참조로서 삽입됨) 에 상세히 나타나 있다. 각각의 VH 및 VL 은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음의 순서: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 로 배열된 세 군데의 CDR 및 네 군데의 FR 로 이루어져 있다.
항체는 무거운 및 가벼운 사슬 일정 영역을 추가로 포함할 수 있어서, 각각 무거운 및 가벼운 면역글로불린 사슬을 형성한다. 한 구현예에서, 항체는 두 무거운 면역글로불린 사슬 및 두 가벼운 면역글로불린 사슬의 4량체이며, 여기서 무거운 및 가벼운 면역글로불린 사슬은, 예를 들어, 디술파이드 결합에 의해 연결된다. 무거운 사슬 일정 영역은 세 개의 도메인, CHl, CH2 및 CH3 으로 이루어진다. 가벼운 사슬 일정 영역은 하나의 도메인, CL 로 이루어진다. 무거운 및 가벼운 사슬의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 일정 영역은 전형적으로, 정규 보체 시스템의 제 1 성분 (CIq) 및 면역 시스템의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 를 포함하는, 숙주조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 매개한다.
면역글로불린은, 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 의미한다. 인지되는 인간 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파 (IgAl 및 IgA2), 감마 (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 일정 영역 유전자, 및 무수히 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 전장 면역글로불린 "가벼운 사슬" (약 25 Kd, 또는 214 아미노산) 은, COOH-말단 에서 카파 또는 람다 일정 영역 유전자에 의해 및 NH2-말단 (약 110 아미노산) 에서 가변 영역 유전자에 의해 인코딩된다. 전장 면역글로불린 "무거운 사슬" (약 50 Kd, 또는 446 아미노산) 은 유사하게 가변 영역 유전자 (약 116 아미노산) 및 기타 상기 일정 영역 유전자 중 하나, 예를 들어, 감마 (약 330 아미노산을 인코딩) 에 의해 인코딩된다. 면역글로불린 무거운 사슬 일정 영역 유전자는 항체 클래스, 즉, 아이소타입 (예를 들어, IgM 또는 IgGl) 을 인코딩한다. 본원에서 사용되는, 항체의 항원 결합 절편 (또는 간단히 "항체 부위" 또는 "절편") 은 전장 항체의 하나 이상의 절편을 의미하는데, 이는 항원 (예를 들어, CD3) 에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다. 항체의 "항원 결합 절편" 이라는 용어 내에 포함되는 결합 절편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CHl 도메인으로 이루어지는 1가 절편, Fab 절편; (ii) 힌지 영역에서 디술파이드 다리로 연결되는 두 Fab 절편을 포함하는 2가 절편, F(ab')2 절편; (iii) VH 및 CHl 도메인으로 이루어지는 Fd 절편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 절편; (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 절편; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 이 포함된다 (이에 한정되는 것은 아님). 게다가, 비록 Fv 절편의 두 도메인, VL 및 VH 가 별도의 유전자에 의해 코딩된다 할지라도, 이들은 재조합 방법이 이용되어 합성 연결기에 의해 결합될 수 있는데, 상기 합성 연결기는 그들이 단일 단백질 사슬로 만들어지는 것이 가능하게 하며, 여기서, VL 및 VH 영역은 1가 분자 (단일 사슬 Fv (scFv) 로 알려짐) 를 형성하기 위해 쌍을 이룬다. 그러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 결합 절편" 이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 절편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득하며, 상기 절편은 본래의 항체와 동일한 방식의 이용을 위해 스크리닝된다.
본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체 분자, 예를 들어, IL-17F 단백질에 대한 항체, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 공지된 방법에 따른 하이브리도마의 분리에 의해 생산할 수 있다. 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마를 이후 표준 방법, 예컨대 효소 면역 측정법 (ELISA) 을 이용하여 스크리닝하여, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하나 이상의 하이브리도마를 동정한다. 예를 들어, 본 발명의 IL-17F 단백질은 또한 동물의 면역화에 이용하여, 다클론 및 단일클론 항체를 수득할 수 있는데, 이는 IL-17F 단백질과 반응하며, IL-17F (예를 들어, IL-17F 동종이량체 및/또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체) 의 이의 수용체, 예를 들어, IL-17R 또는 IL-17RC 로의 결합을 억제할 수 있다. 이와 유사하게, IL-17R 또는 IL-17RC 단백질을 다클론 및 단일클론 항체를 수득하는데 사용할 수 있는데, 이는 각각 IL-17R 또는 IL-17RC 과 특이적으로 반응하고, 특이적으로는 이들 수용체의 IL-17F 단백질 (IL-17F 동종이량체 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체 포함) 로의 결합을 억제할 수 있고, 즉, 이들 항체는 이들 수용체 중 하나 또는 둘 다의 다른 IL-17F 패밀리 맴버, 예를 들어, IL-17A 동종이량체로의 결합을 억제한다. 펩티드 면역원은 카르복실 말단에서 시스테인 잔기를 추가적으로 포함할 수 있고, 합텐, 예컨대 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌 (KLH) 으로 컨쥬게이션될 수 있다. 추가의 펩티드 면역원은 티로신 잔기를 황산염 처리된 티로신 잔기로 교체함으로써 생성할 수 있다. 그러한 펩티드의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 전장 폴리펩티드는 면역원으로 사용될 수 있고, 또는, 대안적으로는, 폴리펩티드의 항원 펩티드 절편이 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 항원 펩티드는 7 개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하고, 펩티드에 대항하여 일어나는 항체가 폴리펩티드와 특이적 면역 착물을 형성하도록 하는 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 항원 펩티드가 10 개 이상의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 15 개 이상의 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게는 20 개 이상의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 30 개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
단일클론 항체는 재조합 DNA 기술의, 당업자에게 알려진 기타 방법에 의해 생성될 수 있다. 단일클론 항체-분비 하이브리도마를 제조하기 위한 대안으로서, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단일클론 항체를, 본 발명의 관련 폴리펩티드 (예를 들어, IL-17F, IL-17R, IL-17RC) 로 재조합 결합의 면역글로불린 라이브러리 (예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리) 를 스크리닝하여 동정 및 분리함으로써, 본 발명의 관련 폴리펩티드 (예를 들어, 각각 IL-17F, IL-17R, IL-17RC) 에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 맴버를 분리한다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성 및 스크리닝하는 시판 키트 및 기술이 당업자에게 잘 알려져 있다. 추가적으로는, 항체 디스플레이 라이브러리의 생성 및 스크리닝에서의 용도에 특히 적합한 시약 및 방법의 예를 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어, "조합 항체 디스플레이" 방법이 잘 알려져 있고, 특정 항원 특이성을 갖는 항체 절편의 동정 및 분리를 위해 개발되었고, 단일클론 항체의 생산을 위해 이용될 수 있다. 상기 면역원으로 동물을 면역시킨 후, 생성된 B-세포 풀의 항체 레퍼토리를 클로닝했다. 방법은 일반적으로 올리고머 프라이머 및 PCR 의 혼합물을 이용함으로써 면역글로불린 분자의 다양한 집단의 가변 영역의 DNA 서열을 수득하기 위해 알려져 있다. 예를 들어, 5' 리더 (신호 펩티드) 서열 및/또는 프레임워크 1 (FRl) 서열에 상응하는 혼합된 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 보존된 3' 일정 영역에 대한 프라이머가 다수의 쥣과 항체로부터 무거운 및 가벼운 사슬 가변 영역의 PCR 증폭에 사용될 수 있고; 유사한 전략이 또한 인간항체로부터 인간 무거운 및 가벼운 사슬 가변 영역을 증폭시키는데 사용되어 왔다.
다클론 혈청 및 항체는 본 발명의 폴리펩티드로 적절한 대상체를 면역시키는 것에 의해 생산될 수 있다. 면역화된 대상체 내 항체 역가가 표준 기술, 예컨대 고정화된 단백질을 이용하는 ELISA 에 의해 초과 시간 모니터링될 수 있다. 원하는 경우, 본 발명의 폴리펩티드에 대항하는 항체 분자를 대상체 또는 배양 배지로부터 분리하고, 공지된 기술, 예컨대 단백질 크로마토그래피에 의해 정제하여, IgG 분획을 수득할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체의 절편은 당업계에 공지된 방법에 따라 항체의 절단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 면역 활성 Fab 및 F(ab')2 절편은 펩신과 같은 효소로 항체를 치료함으로써 생성할 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 키메라성, 인간화, 및 단일-사슬 항체 (인간 및 비인간 부위 둘 다를 포함) 를 표준 재조합 DNA 기술 및/또는 재조합 결합 면역글로불린 라이브러리를 이용하여 생산할 수 있다. 인간화된 항체는 또한 유전자도입 마우스를 생산할 수 있는데, 이는 내인성 면역글로불린 무거운 및 가벼운 사슬 유전자는 발현시킬 수 없으나, 인간 무거운 및 가벼운 사슬 유전자는 발현시킬 수 있다. 예를 들어, IL-17F 단백질에 대항하는, 예를 들어, 인간 단일클론 항체 (mAbs) 를, 쥣과 면역글로불린 유전자보다 오히려 인간 면역글로불린 유전자를 운반하는 유전자도입 마우스를 이용하여 생성할 수 있다. 당해 항원으로 면역화된 이들 유전자도입 마우스로부터의 스플레노사이트를 이후 하이브리도마의 생산에 사용할 수 있는데, 이는 인간 단백질로부터의 에피토프에 대한 특이적 친화성을 갖는 인간 mAbs 를 분비시킨다.
키메라성 면역글로불린 사슬을 포함하는 키메라성 항체는 당업계에 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 쥣과 (또는 다른 종) 단일클론 항체 분자의 Fc 일정 영역을 인코딩하는 유전자가, 쥣과 Fc 를 인코딩하는 영역을 제거하기 위한 제한 효소로 소화되고, 인간 Fc 일정 영역을 인코딩하는 유전자 동등 부위가 치환된다.
항체 또는 면역글로불린 사슬은 당업계에 공지된 방법에 의해 인간화될 수 있다. 인간화된 면역글로불린 사슬을 포함하는 인간화된 항체를, 항원 결합에 직접 연관되지 않는 Fv 가변 영역의 서열을 인간 Fv 가변 영역으로부터의 동등 서열로 대체함으로써 생성할 수 있다. 인간화된 항체 생성의 일반적 방법이 문헌 [Morrison (1985) Science 229:1202-07; Oi 등, (1986) Biotechnology 4:214; Queen 등, U.S. 특허 번호 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762] 에 제공되며, 이들 모두의 내용이 본원에 참조로서 포함된다. 이러한 방법은, 무거운 또는 가벼운 사슬 중 하나 이상으로부터 면역글로불린 Fv 가변 영역의 일부 또는 전부를 인코딩하는 헥산 서열을 분리, 조작 및 발현시키는 것을 포함한다. 그러한 핵산 서열의 소스 (source) 는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 미리 결정된 표적에 대항하는 하이브리도마 생산 항체로부터 수득할 수 있다. 인간화된 항체, 또는 이의 절편을 인코딩하는 재조합 DNA 는 이후 적절한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
인간화된 또는 CDR-그래프트된 항체 분자 또는 면역글로불린은 CDR 그래프팅 또는 CDR 치환에 의해 생산될 수 있고, 여기서, 면역글로불린 사슬의 CDR 의 하나, 둘 또는 전부가 대체된다. 예를 들어, 문헌 [미국 특허 번호 5,225,539; Jones 등, (1986) Nature 321:552-25; Verhoeyan 등, (1988) Science 239:1534; Beidler 등, (1988) J. Immunol. 141:4053-60; Winter, 미국 특허 번호 5,225,539] 를 참조할 수 있는데, 이들 모두의 내용이 본원에 참조로서 포함된다. Winter 는, 본 발명의 인간화된 항체를 제조하는 데 사용할 수 있는 CDR-그래프팅 방법을 기술하고 있으며 (UK 특허 출원 GB 2188638A; Winter, 미국 특허 번호 5,225,539), 이 내용은 본원에 참조로써 포함된다. 특정 인간 항체의 CDR 의 모두는 일 부위 이상의 비인간 CDR 로 대체될 수 있고, 또는 CDR 의 오직 일부가 비인간 CDR 로 대체될 수 있다. 미리 결정된 항원에 대한 인간화된 항체의 결합에 요구되는 CDR 의 수를 대체하는 것만이 필요하다 .
인간 항체는 유전자도입 비인간 동물 (항원에 의한 시도에 대한 반응으로서 동물의 내인성 항체보다 오히려 인간 항체를 완전히 생산하도록 개질됨) 을 이용하여 추가적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 94/02602 를 참조할 수 있다. 비인간 숙주 내 무거운 및 가벼운 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 내인성 유전자가 무능력화 되었고, 인간 무거운 및 가벼운 사슬 면역글로불린을 인코딩하는 활성 반점이 숙주의 게놈에 삽입된다. 인간 유전자는, 예를 들어, 필수적인 인간 DNA 분절을 포함하는 효모 인공 염색체를 이용하여 삽입한다. 이후, 모든 원하는 변경을 제공하는 동물을, 변경의 보체를 전부 포함하지 않고, 이 보다 적게 포함하는 중간 유전자도입 동물의 교차번식에 의해 후손으로서 수득한다. 그러한 비인간 동물의 바람직한 구현예는 마우스이며, 이는 PCT 공개 WO 96/33735 및 WO 96/34096 에 개시된 바와 같이, XENOMOUSE™ 라 정의한다. 이 동물은 인간 면역글로불린을 충분히 분비하는 B 세포를 생산한다. 항체는, 예를 들어, 다클론 항체의 제조로서, 당해 면역원과의 면역화 이후 동물로부터 직접 수득하거나, 또는 대안적으로는 동물 유래의 무한증식 B 세포, 예컨대 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 수득할 수 있다. 추가적으로, 인간 가변 영역을 갖는 면역글로불린을 인코딩하는 유전자가 회수되고 발현되어 항체를 직접 수득할 수 있고, 또는 추가 개질되어, 예를 들어, 단일 사슬 Fv 분자와 같은 항체의 유사체를 수득할 수 있다.
예를 들어, 항체의 기타 부위, 예를 들어, 일정 영역의 삭제, 첨가 또는 치환에 의해 개질된 단일클론, 키메라성 및 인간화된 항체가 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 비제한적 예로서, 항체가 일정 영역의 삭제에 의해, 일정 영역과 또다른 일정 영역의 대체에 의해 (예를 들어, 일정 영역은 항체, 또는 또다른 종 또는 항체 클래스로부터의 일정 영역의 반감기, 안정성 또는 친화성을 증가시키는 것을 의미함), 그리고, 일정 영역내 하나 이상의 아미노산의 개질에 의해 개질되어, 예를 들어, 글리코실화 부위의 수, 효과기 세포 기능, Fc 수용체 (FcR) 결합, 보체 고정 등을 변경할 수 있다.
항체 일정 영역의 변경 방법은 당업계에 공지되어 있다. 변경된 기능 (예를 들어, 효과기 리간드, 예컨대 세포 상의 FcR, 또는 보체의 Cl 성분에 대한 변경된 친화성) 을 갖는 항체를, 항체의 일정 부위 내 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 잔기로 대체하여 생산할 수 있다 (예를 들어, EP 388,151 Al, 미국 5,624,821 및 미국 5,648,260 참조, 이들 모두의 내용이 본원에 참조로써 삽입됨). 쥣과 (또는 기타 종) 면역글로불린에 대한 유사한 유형의 변경을 상기 기능을 감소 또는 제거시키기 위해 적용할 수 있고, 이는 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어, CIq 결합에 대한, 또는 FcR (예를 들어, Fc 감마 Rl) 에 대한 Fc 영역 (예를 들어, IgG, 예컨대 인간 IgG) 의 항체의 친화성을, 특정화된 잔기(들) 를 이의 곁 사슬에 대해 적절한 관능성을 갖는 잔기(들)로 대체함으로써, 또는 하전된 관능기, 예컨대 글루타메이트 또는 아스팔테이트, 또는 방향족 비극성 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 또는 알라닌을 도입함으로써, 변경시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 미국 5,624,821 참조).
본 발명의 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 항-IL-17RC 항체는, 세포 표면 상, 또는 상청액, 세포 용균물 내의 IL-17F 단백질 (예를 들어, 단량체, 동종이량체, 또는 이종이량체 형성), IL-17R, 또는 IL-17RC 폴리펩티드를 각각 분리, 정제 및/또는 검출하는데 유용할 수 있다. 이 발명에 개시되는 항체는 또한 진단용으로 사용되어, 임상적 시험 절차의 일부로서, 예를 들어, IL-17F 단백질 수준을 모니터링하거나, 또는 항체의 항원을 포함하는 세포 또는 조직에 치료 조정자를 임상적으로 표적화할 수 있다. 예를 들어, 치료제, 예컨대 작은 분자, 또는 본 발명의 기타 치료제는 항-IL-17F, 항-IL-17R 또는 항-ILl 7RC 항체에 연결되어, IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 를 각각 발현하는 세포 또는 조직에 치료제를 표적화할 수 있다. IL-17F, IL-17R 또는 BL- 17RC 단백질에 결합되는 안타고니스트성 항체 (바람직하게는 단일클론 항체) 는 또한 IL-17F 신호전달 관련 질환(들), 및/또는 IL-21 신호전달 관련 질환(들) (예를 들어, IL-21R 로의 IL-21 결합 및 IL-21R 의 활성화) 의 치료에 유용할 수 있는데, 이는 IL-21 및 IL-17F 생산 사이의 관계에 기인한다. 따라서, 본 발명은 IL-17F (단량체 및/또는 이량체 형태로), IL-17R, 또는 IL-17RC 에 특이적으로 결합하는 억제성 항체를 포함하는 조성물을 추가로 제공하며, 이는 IL-17F 신호전달을 저하, 제한, 차단 또는 다르게는 감소시킨다. 이와 유사하게, 항-IL-17F, 항-IL-17R 또는 항-IL-17RC 항체는 IL-17F, BL- 17R, 또는 BL- 17RC 를 분리, 정제, 검출 및/또는 진단용으로 모니터링하는데 유용할 수 있고/있거나, IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 를 각각 포함하는 세포 또는 조직에 치료제 조정자를 임상적으로 표적화하는데 유용할 수 있다.
지금의 발명에서의 용도를 위한 항체에 더하여, 항체-기재 분자가 또한 IL-17F 동종이량체, IL-17 동종이량체 및/또는 IL-17F/IL-17 동종이량체의 활성을 조정하는데 이용될 수 있다. 그러한 항체-기재 분자는 소형 모듈러 면역약학적 (SMIP™) 약물 (Trubion Pharmaceuticals, Seattle, WA) 를 포함한다. SMIP 는, 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인, 및 시스테인 잔기를 하나 갖거나 갖지 않는 힌지-영역 폴리펩티드, 인지체 구조, 예컨대, 항원, 카운터수용체 등에 대한 결합 도메인으로 이루어진 단일-사슬 폴리펩티드이다 (또한 www.trubion.com 참조). SMIP 는 단일클론 항체의 활성 및 결합 특이성을 나타내지만, 통상적 치료제 단일클론 항체 크기의 대략 1/3 내지 1/2 이고, 생체내 반감기가 연장된다. SMIP 및 이들의 용도 및 적용이, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534 및 2005/0238646, 및 이의 관련 특허 패밀리 맴버에 개시되며, 이의 전문이 본원에 참조로서 삽입된다.
스크리닝 어세이
IL-17F 신호전달에 관련된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩티드를 스크리닝 어세이에 사용하여, 세포 또는 개체에서의 IL-17F 의 활성을 조정할 수 있어, 염증 반응의 잠재적인 조절제인 약동학적 제제 또는 제제에 대한 리드 화합물을 확인할 수 있다. 예를 들어, IL-17F (자연 또는 재조합) 를 함유하는 샘플을 다수의 시험 화합물 (생물학적 제제 또는 소형 유기 분자) 중 하나와 접촉시킬 수 있고, 각각의 처리 샘플 중의 IL-17F 의 생물학적 활성을 미처리 샘플 또는 상이한 시험 화합물과 접촉된 샘플 중의 IL-17F 의 생물학적 활성과 비교할 수 있다. 이러한 비교는 임의의 시험 화합물이 하기를 야기하는 지 여부를 결정할 것이다: 1) IL-17F 의 발현 수준 또는 생물학적 활성이 실질적으로 감소되어, IL-17F 의 안타고니스트를 나타내거나, 2) IL-17F 의 발현 수준 또는 생물학적 활성이 실질적으로 증가되어, IL-17F 의 아고니스트를 나타냄. 한 구현예에서, IL-17F 활성을 조절할 수 있는 시험 화합물의 확인을 고-처리량 스크리닝 어세이, 예컨대 BIACORE® (Biacore International AB, Uppsala, Sweden), BRET (생물발광 공명 에너지 전이), 및 FRET (형광 공명 에너지 전이) 어세이, 뿐 아니라 ELISA 및 세포-기재 어세이를 사용하여 수행한다.
소분자
IL-17F 신호전달 (및/또는 IL-21R 에 대한 IL-21 결합 및 IL-21R 의 활성화와 관련된 장애) 에 관련된 장애, 예를 들어, 염증성 장 질환, 류마티스 관절염, 이식 거부, 건선, 등으로 고생하는 (또는 위험이 있는) 개체 (또는 대상) 에서의 감소된 IL-17F 활성 (및/또는 IL-21R 에 대한 IL-21 결합 및 IL-21R 의 활성화와 관련된 하나 이상의 활성) 은, 또는 이러한 장애에 관련된 개체 (또는 대상) 로부터의 세포에서, IL-17F 의 활성을 상쇄하는 즉, 저해하는 소분자 (통상적으로 유기 소분자) 의 사용을 통해 달성될 수 있다. 신규 안타고니스트성 소분자가 상기 기재된 스크리닝 방법에 의해 확인될 수 있고, 본원에 기재된 본 발명의 치료 방법에 사용될 수 있다.
역으로, 면역 결핍, 예를 들어, 호중구감소증으로 고생하는 (또는 위험이 있는) 개체 (또는 대상), 또는 이러한 장애에 관련된 개체 (또는 대상) 로부터의 세포에서 증가된 IL-17F 활성 (및/또는 IL-21 관련된 활성) 을, 또한 IL-17F 의 활성을 아고나이즈시키는, 즉, 향상시키는 소분자 (통상적으로 유기 소분자) 의 사용을 통해 달성될 수 있다. 신규 아고니스트성 소분자는 상기 기재된 스크리닝 방법에 의해 확인될 수 있고, 예를 들어, U.S. 특허 제 5,707,829 호; 제 6,043,344 호; 제 6,074,849 호 및 U.S. 특허 출원 제 10/102,080 호에서 기재된 바와 같은 치료 면역 결핍의 방법에 사용될 수 있다 (모두는 전체가 참조로서 인용됨) .
용어 소형 분자는 대형분자가 아닌 화합물을 말한다 (예를 들어, Karp (2000) Bioinformatics Ontology 16:269-85; Verkman (2004) AJP - Cell Physiol. 286:465-74 참조). 그러므로, 소분자는 종종 예를 들어, 1000 달톤 미만인 화합물로 간주된다 (예를 들어, Voet and Voet, Biochemistry, 2nd ed., ed. N. Rose, Wiley and Sons, New York, 14 (1995)). 예를 들어, [Davis 등, (2005) Proc. Natl Acad. Sci USA 102:5981-86] 은 엽산, 메토트렉세이트, 및 뉴로펩티드를 지시하기 위해 소형 분자라는 구를 사용하는 반면, [Halpin and Harbury (2004) PLos Biology 2:1022-30] 은 소형 분자 유전자 생성물, 예를 들어, DNA, RNA 및 펩티드를 지시하기 위해 구를 사용한다. 자연 소분자의 예에는 콜레스테롤, 신경전달물질, 및 siRNA 가 포함되나 이에 제한되지 않고; 합성된 소분자에는 다수의 시판되는 소형 분자 데이타베이스, 예를 들어, FCD (Fine Chemicals Database), SMID (Small Molecule Interaction Database), ChEBI (Chemical Entities of 생물학적 Interest), 및 CSD (Cambridge Structural Database) (예를 들어, Alfarano 등, (2005) Nuc. Acids Res. Database Issue 33:D416-24 참조) 에 열거된 다양한 화학물질이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
IL-17F 신호전달과 관련된 장애 진행의 진단, 예후, 및 모니터링 방법
동물 모델, 특히 쥣과 모델에서 연구된 면역학적 매카니즘이, 인간 면역 시스템에 대해 번역될 수 있고 종종 변역된다는 것이 당업계에 잘 공지된다. 이와 같이, 본원에 개시된 다수의 실시예가 동물 모델에서 IL-17F 생물활성을 저해하기 위한 IL-17F 신호전달 안타고니스트의 능력을 논증함에도 불구하고, 인간 샘플에 더해, IL-17F 신호전달에 관련된 장애의 진단, 예후, 및 모니터링을 위한 개시된 방법이 인간에서의 그러한 장애의 진단, 예후, 및 모니터링에 특히 유용할 것이다.
본 발명은 IL-17F 활성의 상향조절을 검출함에 의한, 예를 들어, IL-17F 의 상향조절을 검출함에 의한, 대상에서의 IL-17F 신호전달과 관련된 장애 진행의 (예를 들어, IL-17F 의 생물활성의 증가와 직접적으로 또는 간접적으로 관여되는) 진단, 예후, 및 모니터링 방법을 제공한다 (인간 대상에서의 그러한 방법의 용도를 포함하나, 이에 제한되지 않음). IL-21 과 IL-17F 의 직접적인 관계 때문에, 또한 본 발명은 IL-17F 활성의 상향조절을 검출함에 의한, 예를 들어, IL-17F 의 상향조절을 검출함에 의한 대상에서의 IL-21R 에 대한 IL-21 결합 및 IL-21R 의 활성화와 관련되는 (예를 들어, IL-21 의 생물활성의 증가와 직접적으로 또는 간접적으로 관여되는) 장애 진행의 진단, 예후, 및 모니터링 방법을 제공한다 (인간 대상에서의 그러한 방법의 용도를 포함하나, 이에 제한되지 않음). 상기 방법은 통상적으로, 예를 들어, 임상 세팅에 사용될 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 폴리뉴클레오티드 또는 그의 절편, IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 폴리펩티드 또는 그의 절편 (그의 융합 단백질 포함), 또는 IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 폴리펩티드 또는 그의 유도체에 대한 항체, 또는 IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩티드의 조정제를 포함하는 하나 이상의 군을 포함하는 미리 포장된 진단 키트를 사용하여 수행할 수 있다. 당업자는 예컨대 면역 세포, 예를 들어, 중성구의 수를 세어, 예를 들어, IL-17F 의 상향조절을 확인하기 위해 기타 간접적인 방법을 사용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
"진단적" 또는 "진단" 은 병리학적 상태의 존재 또는 부존재의 확인을 의미한다. 진단적 방법에는 대상 (인간 또는 비인간 포유류) 으로부터의 생물학적 샘플에서의 IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 의 유전자 생성물 (예를 들어, mRNA, cDNA, 또는 폴리펩티드, 그의 절편을 포함) 의 시험 양을 측정하고, 시험 양을 정상 양 또는 범위 (즉, IL-17F 신호전달과 관련된 장애를 겪고 있지 않는 것으로 알려진 개인(들) 로부터의 양 또는 범위) 와 비교하여 IL-17F 신호전달 (및/또는 EL-21 신호전달) 의 상향조절을 검출하는 것이 포함된다. 특정 진단적 방법이 IL-17F 신호전달 관련된 장애의 결정적인 진단을 제공할 수 없을지라도, 상기 방법이 진단을 돕는 긍정적인 표시를 제공하는 것이라면 족하다.
본 발명은 또한 IL-17F 활성의 상향조절을 검출함에 의한, 예를 들어, IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 의 상향조절을 검출함에 의한 그러한 장애의 예후를 위한 방법을 제공한다. "예후적" 또는 "예후" 는 병리학적 상태의 가능한 발달 및/또는 경중도를 예상하는 것을 의미한다. 예후적 방법에는 대상으로부터의 생물학적 샘플에서의 IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 의 유전자 생성물의 시험 양을 측정하고, 시험 양과 각각 IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 의 유전자 생성물에 대해 예후적 양 또는 범위 (즉, IL-21 신호전달과 관련된 IL-17F 신호전달 및/또는 장애와 관련된 장애의 다양한 경중도를 갖는 개인으로부터의 양 또는 범위) 를 비교하는 것이 포함된다. 시험 샘플에서의 IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 유전자 생성물의 다양한 양은 IL-17F 신호전달과 관련된 장애 및/또는 IL-21 신호전달과 관련된 장애에 대한 특정 예후와 일치한다. 특정 예후 수준에서의 IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 유전자 생성물의 검출 양은 대상에 대한 예후를 제공한다.
본 발명은 또한 IL-17F 활성의 상향조절을 검출함에 의한, 예를 들어, IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 의 상향조절을 검출함에 의한 IL-17F 신호전달과 관련된 장애 (및/또는 IL-21 신호전달과 관련된 장애) 의 진행 또는 과정의 모니터링 방법을 제공한다. 모니터링 방법에는 제 1 및 제 2 시점에서 대상으로부터 채취된 생물학적 샘플에서의 IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 의 유전자 생성물의 시험 양을 측정하고, 양을 비교하는 것이 포함된다. 제 1 내지 제 2 시점 사이의 IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 유전자 생성물의 양의 변화는, 장애의 진정을 나타내는 양의 감소, 장애의 진행을 나타내는 양의 증가로서 IL-17F 신호전달-관련 장애 (및/또는 IL-21 신호전달-관련 장애) 의 과정의 변화를 나타낸다. 이러한 모니터링 어세이는 또한 자가면역 장애에 대해 치료되는 환자에서의 특정 치료적 간섭의 효율을 향상시키기 위해 유용하다.
상기 개요된 방법에서의 증가된 IL-17F 신호전달은 체액 (예를 들어, 전체 혈액, 혈장 및 소변), 세포 (예를 들어, 전체 세포, 세포 분획, 및 세포 추출물), 및 기타 조직을 포함하는 다양한 생물학적 샘플에서 측정될 수 있다. 생물학적 샘플에는 또한 조직의 섹션, 예컨대 조직학적 목적을 위해 취해진 생검 및 동결 섹션이 포함된다. 바람직한 생물학적 샘플에는 혈액, 혈장, 림프, 조직 생검, 소변, CSF (뇌척수액), 활막액, 및 BAL (기관지 폐포 세척) 이 포함된다. 생물학적 샘플의 분석은 대상으로부터의 세포 또는 조직의 제거를 반드시 필요로 하지 않는다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, IL-17F 신호전달 유전자 생성물 (예를 들어, 항체, 핵산) 에 결합하는 적절하게 표지된 제제는 대상에 투여되고 표준 이미지화 기술 (예를 들어, CAT, NMR (MRI), 및 PET) 을 사용하여 시각화 (표적에 결합하는 경우) 될 수 있다.
본 발명의 진단적 및 예후적 방법에서, IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 유전자 생성물은 검출되고 정량되어 시험 양을 산출한다. 그 다음 시험 양은 정상 양 또는 범위와 비교된다. 정상 양 또는 범위를 유의하게 초과하는 양은 IL-17F 신호전달에 관련된 장애 (및/또는 IL-21R 에 대한 IL-21 결합 및 IL-21R 의 활성화와 관련된 장애) 의 진단에 있어서 양성적 징후이다. IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 유전자 생성물의 검출 및 정량의 특정 방법은 하기 기재된다.
IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 유전자 생성물의 정상 양 또는 기저 수준은 임의의 특정 샘플 유형 및 집단에 대해 검출할 수 있다. 일반적으로, IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 단백질 또는 mRNA 의 기저 (정상) 수준은 정상 (즉, 건강한) 대상으로부터의 생물학적 샘플 유형에서의 IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 단백질 또는 mRNA 의 각각의 양을 측정하여 검출한다. 대안적으로, IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 유전자 생성물의 정상 값은 병에 걸린 (또는 가능하게는 병에 걸린) 시험 세포 또는 조직이 취해진 동일한 대상으로부터 취해진 건강한 세포 또는 조직에서 양을 측정하여 검출할 수 있다. IL-17F, IL-17R, 또는 IL-17RC 유전자 생성물의 양 (정상 양 또는 시험 양) 은 세포 당, 총 단백질 당, 또는 부피 기준 당으로 검출 또는 표현될 수 있다. 샘플의 세포 양을 검출하기 위해, 구조적으로 발현되는 유전자 생성물 또는 생물학적 샘플이 취해진 유형의 세포에서 공지된 수준으로 발현하는 기타 유전자 생성물의 수준을 측정할 수 있다.
본 발명의 어세이 방법에는 IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 유전자 생성물의 절대적 수치의 측정dl 요구되지 않는다는 것이 이해될 것인데, 이는 이러한 방법의 많은 적용에 있어서 상대적인 수치로 충분하기 때문이다. 또한 IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 유전자 생성물의 양 또는 풍부함 이외에, 변형체 또는 비정상 IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 유전자 생성물 또는 그 발현 패턴 (예, 돌연변이 전사체, 잘린 폴리펩티드) 가 정상 유전자 생성물 및 발현 패턴과 비교되어 확인될 수 있음이 이해될 것이다.
두 샘플 중 특정 유전자의 발현이 현저하게 유사 또는 현저하게 상이, 예를 들어 주어진 수준보다 현저하게 높은 또는 현저하게 낮은 것은 유전자 자체에 의존하는데, 즉, 상이한 개체 또는 상이한 샘플 사이의 발현에서의 그 차이에 의존한다. 발현 수준이 현저하게 유사 또는 상이한지는 당업자가 결정할 수 있다. 발현의 수준, 예를 들어 두 샘플 사이의 IL-17F 및/또는 IL-17A 발현 수준이 현저하게 유사 또는 현저하게 상이한지, 예를 들어 주어진 수준보다 현저하게 높은지를 결정할 때, 유전적 변이성, 예를 들어 개체, 종, 기관, 조직 또는 세포 사이의 IL-17F 및/또는 IL-17A 발현 수준과 같은 인자를 고려할 수 있다. 개체, 종, 기관, 조직 또는 세포 사이의 유전자발현에서 자연 이질성의 결과로서, "현저하게 유사" 또는 "현저하게 높음" 와 같은 표현은 정확한 백분율 또는 수치로 정의될 수 없으나, 본 발명을 실행하는 당업자에 의해 확정될 수 있다.
본 발명의 진단, 예후, 및 모니터링 어세이는 생물학적 샘플에서 IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 유전자 생성물을 검출 및 정량하는 것과 관련되어 있다. IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 유전자 생성물은 mRNA 및 폴리펩티드를 포함하고, 둘 다 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
예를 들어 mRNA 는 혼성화-바탕 어세이, 예컨대 노던 혼성화, 인 시츄 혼성화, 도트 앤드 슬롯 블롯 (dot and slot blots) 및 올리고뉴클레오티드 배열을 사용하여 직접 검출 및 정량화될 수 있다. 혼성화-바탕 어세이는 프로브 핵산이 표적 핵산에 혼성화되는 어세이를 지칭한다. 일부 포맷에서, 표적, 프로브, 또는 둘 다 고정된다. 고정된 핵산은 DNA, RNA, 또는 또 다른 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 자연 또는 비자연 발생적인 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체 또는 골격을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 핵산 프로브 서열 선택 방법은 IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 의 핵산 서열을 기초로 하고, 당업자에게 공지되어 있다.
대안적으로, mRNA 은 검출 및 정량화 이전에 증폭될 수 있다. 이러한 증폭-바탕 어세이는 당업계에 공지되어 있고, 중합효소연쇄반응 (PCR), 역-전사-PCR (RT-PCR), PCR-효소-연결 면역흡착 어세이 (PCR-ELISA) 및 리가아제 연쇄 반응 (LCR) 을 포함한다. 증폭된 IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 유전자 생성물 (예를 들어, mRNA 또는 cDNA) 을 제조 및 검출하기 위한 프라이머 및 프로브는 당업자에 의해 불필요한 실험없이 IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 의 핵산 서열을 각각 사용하여 용이하게 디자인 및 제조될 수 있다. 비제한적인 예로서, 증폭된 IL-17F 유전자 생성물은 예를 들어 젤 전기영동; 프로브 핵산에의 혼성화; 서열화; 형광 인광 또는 방사능 신호의 검출; 또는 다양한 공지된 방법으로 직접 분석될 수 있다. 표적 핵산 서열의 증폭으로 인해 만들어진 신호를 증가시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 당업자는 어떠한 증폭 방법이 사용되었는지를 인지할 수 있을 것이며, 유전자 생성물의 정량화가 요구되는 경우 공지된 다양한 정량화 방법 (정량화 PCR) 이 사용될 수 있을 것이다.
IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 폴리펩티드 (또는 그 절편) 는, 상기 기술된 바와 같이 생성될 수 있는 각각의 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 항-IL-17RC 항체를 사용하여 다양한 공지된 면역 어세이로 검출할 수 있다. 면역 어세이는, 예를 들어, an IL-17F 폴리펩티드 (또는 절편) 에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들어, 다클론, 단일클론, 키메라성, 인간화된 것, scFv 및/또는 그 절편) 를 사용하는 어세이를 지칭한다. 본 발명의 실행에 적합한 공지된 면역 어세이는 ELISA, 방사면역어세이 (RIA), 면역침전, 면역형광, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 및 웨스턴 블로팅을 포함한다. IL-17F 폴리펩티드는 표지된 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드(들) 을 사용하여 검출될 수 있다. 반대로 IL-17R 또는 IL-17RC 는 표지된 IL-17F 폴리펩티드를 사용하여 검출될 수 있다.
당업자는 상기 방법을 IL-17F 신호전달과 관련된 장애에 적용할 수 있다.
치료시 IL-17F 신호전달과 관련된 분자의 용도
본 발명자들은 특히 하기를 첫 번째로 확인하였다:
1) IL-17R 및/또는 IL-17RC 의 IL-17F 또는 IL-17F 아고니스트에 의한 결합은 증가된 중성구 침윤, 연골 파괴 등과 관련이 있다;
2) IL-17F 에 대한 항체는 IL-17F 단백질 검출에 사용될 수 있고, 하나 이상의 IL-17F 생물활성 저해에 사용될 수 있다;
3) IL-17R 및 IL-17RC 에 대한 siRNA 를 사용하여 IL-17A 및 IL-17F 생물활성을 감소시킬 수 있다;
4) IL-17F 단백질은 IL-17F 동종이량체 및 rL-17A/IL-17F 이종이량체를 형성할 수 있고, 따라서 IL-17F 에 대한 억제성 항체 또한 IL-17A/IL-17F 이종이량체에 위해 매개되는 IL-17A 생물활성을 억제할 수 있다;
5) IL-21 는 CD28 와 함께 시너지적으로 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체를 상향조정하도록 작용하고, 따라서 IL-17F 활성 (예를 들어, IL-17F 동종이량체 활성 및/또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체 활성) 을 억제하는 항체는 IL-21 신호를 조절할 수 있다;
6) 자연 및 재조합 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체는 단리 및 정제될 수 있다;
7) IL-17F 이종이량체는 IL-17F 생물활성을 지닌다;
8) 인간 IL-17F 에 대한 항체는 부분 중성화된 영장류 IL-17F 과 교차 반응한다; 및
9) IL-17F 및 IL-17A 둘 다 건선 환자의 병변 조직 및 크론병 및 궤양성 대장염 환자의 관련된 조직에서 증가된다. 상기 상호관련성의 일부를 확인하는데 일부 동물 모델이 사용되어 왔지만, 동물 모델에서 연구된 면역 기작은 인간 면역 시스템으로 전환이 가능함이 당업자에게 공지되어 있다. 아그레카나제의 IL-17F 조절 및 건선 병변 및 염증성 장 질환의 관련 조직 중 IL-17A 및 IL-17F 의 발현 수준을 프로파일링 하는 것과 관련된 실험을 인간 세포 및 조직에 수행하는 동안 추가적으로 본 발명의 항체가, 1 차 인간 T 세포로부터 그 동종이량체성 및 이종이량체성인 자연 IL-17F 을 분리하는데 사용되었다. 이러한 것으로서, IL-17F 신호전달과 관련된 장애 및/또는 IL-21 신호전달과 관련된 장애를 치료하기 위해, IL-17F 신호전달과 관련된 분자, 예를 들어, IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트를 사용하는 개시된 방법이 인간에서 이러한 장애의 치료에 특별히 유용하다.
본원에 개시된, 상기 방법을 사용하여 확인된 IL-17F, IL-17R 또는 IL-17RC 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 활성의 조정자를 포함하는 IL-17F 신호전달-관련 분자는 인 비트로(in vitro), 엑스 비보(ex vivo) 에서 사용될 수 있고, 약학적 조성물에 도입될 수 있고, 예를 들어 IL-17F 신호전달 및/또는 IL-21 신호전달 관련된 장애 치료를 위해 하기를 투여함으로써 개체 인 비보에 투여될 수 있다: IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오타이드; 용해성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드(그 절편 및/또는 융합 단백질 포함); 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 항-IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트성 소분자 등). IL-17F 신호전달-관련 분자 투여 여부를 결정할 때 고려되는 여러 약물유전자 접근법은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 유전자 전체적인 관련, 후보 유전자 접근법, 및 유전자발현 프로파일을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 의도하는 투여 경로에 적합하게 제형화 된다 (예를 들어, 경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함함). 기타 비제한적인 투여 경로의 예는 비경구 (예를 들어, 정맥내), 피부내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피적 (국소적), 점막내, 및 직장 투여를 포함한다. 각 의도되는 경로에 적합한 약학적 조성물이 당업계에 공지되어 있다.
약학적으로 허용가능한 담체와 조합될 때 IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트가 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 IL-17F 신호전달-관련 분자 (예를 들어, IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트) 및 담체 이외에 다양한 희석제, 충전제, 염, 완충액, 안정화제, 가용화제 및 당업계에 공지된 기타 재료를 함유할 수 있다. "약학적으로 허용가능한" 이라는 용어는 활성 성분(들) 의 생물학적 활성의 효능을 방해하지 않는 비독성 재료를 의미한다. 담체의 특성은 투여 경로에 의존할 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 사이토카인, 림포카인, 또는 기타 조혈 인자 예컨대 M-CSF, GM- CSF, IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, EL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, G-CSF, 줄기 세포 인자 및 에리트로포이에틴를 함유할 수도 있다. 약학적 조성물은 하기에 더 자세히 설명되는 항사이토카인 항체를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 혈전용해 또는 항혈전 인자 예컨대 플라스미노겐 활성화제 및 인자 Ⅷ 를 함유할 수 있다. 이러한 추가적 인자 및/또는 제제는 IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트와 시너지 효과를 생성하기 위해, 또는 IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트에 의해 야기되는 부작용을 최소화하기 위해 약학적 조성물에 함유될 수 있다. 반대로, IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트는 특정 사이토카인, 림포카인, 기타 조혈 인자, 혈전용해 또는 항혈전 인자의 제형에 함유될 수 있고, 또는 사이토카인, 림포카인, 기타 조혈 인자, 혈전용해 또는 항혈전 인자, 또는 항-염증제의 부작용을 최소화하기 위해 항-염증제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트가 조합되는 리포좀의 형태일 수 있고, 기타 약학적으로 허용가능한 담체이외에, 수용액 중 마이셀, 불용성 단일층, 액정, 또는 라멜라 층의 응집 형태로 존재하는 지질과 같은 양쪽친매성 제제와 조합된다. 리포좀 형성을 위해 적절한 지질은 비제한적으로, 모노글리세라이드, 다이글리세라이드, 설파타이드, 라이소레시틴, 인지질, 사포닌, 답즙산 등을 포함한다.
본원에서 사용시, 용어 "치료적 허용량"은 환자에게 중요한 이점, 예를 들어, 상기 상태의 증상의 개선, 치유, 또는 치유 속도의 증가를 보여주기에 충분한, 약학 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 총량을 말한다. 단독으로 투여되는 개별 활성 성분에 적용시, 상기 용어는 상기 성분 단독을 말한다. 병용제에 적용시, 상기 용어는, 병용 투여를 순차적으로 하든지 또는 동시에 하든지에 관계없이 치료 효과를 나타내게 하는 활성 성분의 배합량을 말한다.
본 발명의 치료 방법 또는 용도의 수행시, IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트의 치료적 유효량을 대상체, 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 투여한다. IL-17F 신호전달 관련 분자는 기타 치료제, 예컨대 사이토카인, 림포카인 또는 기타 조혈 인자를 이용하는 치료제 또는 항염증제와 병용하거나 단독으로 본 발명의 방법에 따라 투여할 수 있다. 하나 이상의 작용제와 공동투여하는 경우, IL-17F 신호전달 안타고니스트는 제 2 작용제와 동시에, 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 순차적으로 투여하는 경우, 담당 내과의가 예를 들어 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (또는 이의 융합 단백질)를 투여하고/하거나 기타 작용제와 병용하여 항체를 억제하는 적절한 순서를 결정할 것이다.
IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트의 치료적 유효량을 경구 투여하는 경우, 결합제는 정제, 캡슐, 분말, 용액 또는 엘릭시르의 형태일 것이다. 정제 형태로 투여하는 경우, 본 발명의 약학 조성물은 추가로 고체 담체, 예컨대 젤라틴 또는 아주반트를 함유할 수 있다. 정제, 캡슐 및 분말은 약 5 ∼ 95%의 결합제, 바람직하게는 약 25 ∼ 90%의 결합제를 함유한다. 액체 형태로 투여하는 경우, 액체 담체, 예컨대 물, 석유, 동물성 오일 또는 식물성 오일 (예컨대, 땅콩유, 광유, 대두유, 또는 참기름) 또는 합성 오일을 첨가할 수 있다. 액체 형태의 약학 조성물은 생리 식염수 용액, 포도당 또는 기타 당류 용액, 또는 글리콜 (예컨대, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜)을 더 함유할 수 있다. 액체 형태로 투여하는 경우, 약학 조성물은 약 0.5 ∼ 90 중량%의 결합제, 및 바람직하게는 약 1 ∼ 50 중량%의 결합제를 함유한다.
IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트의 치료적 유효량을 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여하는 경우, IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트는 발열원이 없는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 것이다. pH, 등장성, 안정성 등이 적절한, 상기 비경구적으로 허용가능한 단백질 용액의 제조는 종래 기술에 속하는 것이다. 정맥내, 피부, 또는 피하 주사를 위한 바람직한 약학 조성물은, IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트에 추가하여, 등장성 비히클 (예컨대, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 포도당, 주사액 및 염화나트륨 주사액, 젖산 링거 주사액, 또는 기타 종래 기술에 공지된 비히클)을 함유해야 한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 안정화제, 보존제, 완충제, 산화방지제, 또는 기타 당업자에게 공지된 첨가제도 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물 중 IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트의 양은 치료되는 상태의 특성 및 심각성, 및 환자가 겪었던 이전 치료의 특성에 따라 다를 것이다. 궁극적으로, 담당 내과의가 각 개별 환자를 치료할 IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트의 양을 결정할 것이다. 먼저, 담당 내과의는 IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트의 적은 투여량을 투여하여 환자의 반응을 살필 것이다. IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트의 더 많은 투여량을 환자에게 최적의 치료 효과가 나타날 때까지 투여하여, 그 시점에서 일반적으로 투여량을 더 증가시키지 않는다. 본 발명의 방법의 수행에 사용되는 각종 약학 조성물은 체중 ㎏당 약 0.1 ㎍ ∼ 약 100 ㎎의 IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트, 예를 들어, IL-17R 및/또는 IL-17RC (이의 융합 단백질을 포함함)를 함유해야 할 것으로 생각된다.
본 발명의 약학 조성물을 사용하는 정맥내 (i.v.) 치료의 지속 시간은, 치료되는 질환의 심각성 및 각 개별 환자의 잠재적 특이 반응에 따라 다양할 것이다. IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트의 각 적용의 지속 시간은 연속 정맥내 투여에서 12 ∼ 24 시간의 범위일 것으로 생각된다. 또한, 본 발명의 약학 조성물을 사용하는 피하 (s.c.) 치료제도 고려된다. 상기 치료제는 매일, 매주, 또는, 더 바람직하게는, 2주에 한번, 또는 매달 투여할 수 있다. 또한, IL-17F 아고니스트 또는 IL-17F 신호전달 안타고니스트가 소분자 (예를 들어, 경구 전달용)인 경우, 치료제는 매일, 하루 2회, 하루 3회 등으로 투여할 수 있을 것으로 생각된다. 궁극적으로, 담당 내과의가, 본 발명의 약학 조성물을 사용하는, 정맥내 또는 피하 치료제, 또는 소분자를 사용하는 치료제의 적절한 지속 시간, 및 치료제의 투여 시점을 결정할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 단백질은 하기 확인되는 하나 이상의 용도 또는 생물학적 활성 (예컨대, 본원에 언급된 어세이와 관련된 것)을 나타낼 것으로 예상된다. 본 발명의 단백질에 대하여 기재된 용도 또는 활성은 상기 단백질의 투여 또는 사용, 또는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 투여 또는 사용에 의해 제공될 수 있다 (예컨대, DNA의 도입에 적절한 유전자 치료제 또는 벡터로).
염증을 감소시키기 위한 IL-17F 신호전달 안타고니스트의 용도
하나의 측면에서, 본 발명은 예를 들어 IL-21 신호전달로 인한 염증 반응을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 세포군을, 세포 또는 세포군의 IL-17F 활성을 억제하기에 충분한 양의 IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드; 가용성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (이의 단편 및/또는 융합 단백질을 포함함); 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트 소분자 등)와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. IL-17F 신호전달 안타고니스트는 또한 IL-17F 신호전달 (및/또는 IL-21 신호전달)의 억제가 요구되는 대상체에 투여할 수 있다. 상기 상태의 비제한적인 예로서 염증성 장애, 예를 들어, 자가면역 질환 (예를 들어, 관절염 (류마티스 관절염을 포함함), 건선, 전산 홍반성 루푸스, 다발경화증), 호흡기 질환 (예를 들어, COPD, 낭성섬유증, 천식, 알레르기), 이식 거부 (고체 장기 이식 거부를 포함함), 및 염증성 장질환 (예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병))을 들 수 있다.
상기 방법은, 적어도 부분적으로는, 예를 들어, 항-IL-17F 항체를 방해함으로써 IL-17F 신호전달을 방해하는 것이 IL-17F와 관련된 염증 반응, 예를 들어, 1차 섬유모세포 유사 윤활막세포에 의한 사이토카인 생성을 감소시킨다는 발견에 기초한 것이다 (실시예 4.2). 따라서, IL-17F 신호전달 안타고니스트, 즉 IL-17F 활성을 억제하는 분자 (예를 들어, 항 IL-17F 항체)는, 예를 들어, IL-17F 신호전달과 관련된 장애 및/또는 IL-21 신호전달과 관련된 장애의 치료 또는 예방을 위한, 생체내 염증을 감소시키는 데 사용할 수 있다.
IL-17F 신호전달 안타고니스트의 사용 방법은 IL-17F 염증 활성을 억제하여, 이에 따라 각종 면역 장애를 치료하거나 예방하는 데에도 사용할 수 있다. 치료되거나 예방될 수 있는 장애의 비제한적인 예로서 이식 거부, 자가면역 질환 (예컨대, 당뇨병, 관절염 (류마티스 관절염, 소아성 류마티스 관절염, 골관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염을 포함함), 다발경화증, 뇌척수염, 중증 근무력증, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 자가면역 갑상샘염, 피부염 (아토피성 피부염 및 습진성 피부염을 포함함), 라이터 증후군, 건선, 쇼그렌 증후군, 크론병, 아프타 궤양, 홍채염, 결막염, 각막결막염, 궤양성 대장염, 척추관절병증, 강직 척추염, 내인성 천식, 알레르기성 천식, 피부 홍반성 루푸스, 공피증, 질염, 직장염, 약물 발진, 나병 역전 반응, 나성 결절 홍반, 자가면역 포도막염, 알레르기성 뇌척수염, 급성 뇌사 출혈 뇌병증, 특발성 양측 진행성 감각신경성 난청, 무형성 빈혈, 순적혈구 빈혈, 특발성 혈소판감소증, 다발연골염, 베게너 육아종, 만성 활동 간염, 스티븐 존슨 증후군, 특발성 스프루우, 편평 태선, 그레이브스병, 사코이드증, 원발성 담즙성 간경변, 후부 포도막염 및 사이질 폐 섬유증), 이식편 대 숙주병, 폐 악화 (예를 들어, 세균 감염으로 인함), 및 알레르기 (예컨대, 아토피성 알레르기)를 들 수 있다. IL-17F 신호전달 안타고니스트, 예를 들어, 억제성 IL-17F 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 사용하여 치료할 수 있는 바람직한 장애의 비제한적인 예로서 염증성 장애, 예를 들어, 자가면역 질환 (예를 들어, 관절염 (류마티스 관절염을 포함함), 건선, 전신 홍반성 루푸스, 다발경화증), 호흡기 질환 (예를 들어, COPD, 낭성 섬유증, 천식, 알레르기), 이식 거부 (고체 장기 이식 거부를 포함함), 및 염증성 장질환 (예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병)을 들 수 있다.
IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드; 가용성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (이의 단편 및/또는 융합 단백질을 포함함); 억제성 항-IL-17F, 항 IL-17R, 또는 IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트 소분자 등)를 사용하여, 면역 반응을 수많은 방식으로 조절하는 것이 가능하다. 하향조절은 이미 진행 중인 염증 반응을 억제하거나 차단하는 형태일 수 있거나, 염증 반응의 유도를 예방하는 것을 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, IL-17F 신호전달 안타고니스트 (이의 약학 조성물을 포함함)는 병용 치료제로 투여하고, 즉 기타 작용제, 예를 들어, 병리적 상태 또는 장애 (예컨대, 면역 장애 및 염증성 질환)에 유용한 치료제와 함께 병용한다. 상기 문맥에서 용어 "병용"은 작용제가 동시로든 순차적으로든, 실질적으로 동시에 제공되는 것을 의미한다. 순차적으로 제공되는 경우, 두번째 화합물의 투여 개시 시점에, 2개의 화합물 중 첫번째 것은 바람직하게는 치료 부위에 유효한 농도로 여전히 검출가능하다.
예를 들어, 병용 치료제는 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 하기 더 상세하게 기재되는 바와 같은, 하나 이상의 사이토카인 및 성장 인자 억제제, 면역억제제, 항염증제, 대사 억제제, 효소 억제제, 및/또는 세포독성제 또는 세포증식 억제제와 공동 제형화되고/되거나 공동 투여되는, 하나 이상의 IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드; 가용성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩테드 (이의 단편 및/또는 융합 단백질을 포함함); 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트 소분자 등)를 포함할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 하나 이상의 IL-17F 신호전달 안타고니스트는 본원에 기재된 2개 이상의 치료제와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 병용 치료제는 유리하게는 투여되는 치료제의 저 투여량을 사용하여, 이에 따라 각종 단일치료와 관련된 가능한 독성 또는 문제를 피한다. 더욱이, 본원에 개시된 치료제는 IL-17F 수용체 신호전달 경로와 상이한 경로에 작용하여, 이에 따라 IL-17F 신호전달 안타고니스트의 효과를 강화하고/하거나 이와 상승 작용을 할 것으로 기대된다.
IL-17F 신호전달 안타고니스트와 병용하여 사용하는 바람직한 치료제는 염증 반응의 상이한 단계를 방해하는 작용제이다. 하나의 구체예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 IL-17F 신호전달 안타고니스트는, 하나 이상의 추가의 작용제, 예컨대 다른 사이토카인 또는 성장 인자 안타고니스트 (예를 들어, 가용성 수용체, 펩티드 억제제, 소분자, 리간드 융합제); 또는 다른 표적에 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들어, 다른 사이토카인 또는 성장 인자에 결합되는 항체, 이의 수용체, 또는 기타 세포 표면 분자); 및 항염증성 사이토카인 또는 이의 아고니스트와 공동 제형화하고/하거나 공동 투여할 수 있다. 본원에 기재된 IL-17F 신호전달 안타고니스트와 병용하여 사용할 수 있는 작용제의 비제한적인 예로서, 하나 이상의 인터루킨 (IL) 또는 이의 수용체의 안타고니스트, 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21 및 IL-22의 안타고니스트; 사이토카인 또는 성장 인자 또는 이의 수용체, 예컨대 종양 괴사 인자 (TNF), LT, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF의 안타고니스트를 들 수 있다. IL-17F 신호전달 안타고니스트는 또한, 예를 들어, 세포 표면 분자, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD20 (예를 들어, CD20 억제제 리투지마브 (rituzimab, RITUXAN(등록상표))), CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, 또는 이의 리간드, 예컨대 CD154 (gp39 또는 CD40L), 또는 LFA-1/ICAM-1 및 VLA-4/VCAM-1에 대한 항체의 억제제와 병용할 수도 있다 (Yusuf-Makagiansar 등 (2002) Med . Res . Rev . 22:146-67). 본원에 기재된 IL-17F 신호전달 안타고니스트와 병용하여 사용할 수 있는 바람직한 안타고니스트는 IL-1, IL-12, TNFα, IL-15, IL-18, 및 IL-22의 안타고니스트를 포함한다.
상기 작용제의 예는 IL-12 (바람직하게는 인간 IL-12)에 결합되는 IL-12 안타고니스트, 예컨대 키메라, 인간화, 인간 또는 시험관내 생성된 항체 (또는 이의 항원 결합 단편), 예를 들어, WO 00/56772에 개시된 항체; IL-12 수용체 억제제, 예를 들어, 인간 IL-12 수용체에 대한 항체; 및 IL-12 수용체, 예를 들어, 인간 IL-12 수용체의 가용성 단편을 포함한다. IL-15 안타고니스트의 예는 IL-15 또는 이의 수용체에 대한 항체 (또는 이의 항원 결합 단편), 예를 들어, 인간 IL-15 또는 이의 수용체에 대한 키메라, 인간화, 인간 또는 시험관내 생성된 항체, IL-15 수용체의 가용성 단편, 및 IL-15 결합 단백질을 포함한다. IL-18 안타고니스트의 예는 인간 IL-18에 대한 항체, 예를 들어, 키메라, 인간화, 인간 또는 시험관내 생성된 항체 (또는 이의 항원 결합 단편), IL-18 수용체의 가용성 단편, 및 IL-18 결합 단백질 (IL-18BP)을 포함한다. IL-1 안타고니스트의 예는 인터루킨-1-전환 효소 (ICE) 억제제, 예컨대 Vx740, IL-1 안타고니스트, 예를 들어, IL-1RA (anikinra, KINERET(상표명), Amgen), sIL1RII (Immunex), 및 항-IL-1 수용체 항체 (또는 이의 항원 결합 단편)를 포함한다.
TNF 안타고니스트의 예는 TNF (예를 들어, 인간 TNFα)에 대한 키메라, 인간화, 인간 또는 시험관내 생성된 항체 (또는 이의 항원 결합 단편), 예컨대 (HUMIRA(상표명), D2E7, 인간 TNFα 항체), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (인간화 항-TNFα 항체; Celltech/Pharmacia), cA2 (키메라 항-TNFα 항체; REMICADE(등록상표), Centocor); 항-TNF 항체 단편 (예를 들어, CPD870); TNF 수용체, 예를 들어, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 이의 유도체의 가용성 단편, 예를 들어, 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, ENBREL(상표명); Immunex), p55 kdTNFR-IgG (55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질 (LENERCEPT(등록상표))); 효소 안타고니스트, 예를 들어, TNFα 전환 효소 (TACE) 억제제 (예를 들어, 알파-설포닐 히드록삼산 유도체, 및 N-히드록시포름아미드 TACE 억제제 GW 3333, -005, 또는 -022); 및 TNF-bp/s-TNFR (가용성 TNF 결합 단백질)을 포함한다. 바람직한 TNF 안타고니스트는 TNF 수용체, 예를 들어, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 이의 유도체의 가용성 단편, 예를 들어, 75 kdTNFR-IgG, 및 TNFα 전환 효소 (TACE) 억제제이다.
기타 구체예에서, 본원에 개시된 IL-17F 신호전달 안타고니스트는 하기 중 하나 이상과 병용 투여할 수 있다: IL-13 안타고니스트, 예를 들어, 가용성 IL-13 수용체 (sIL-13) 및/또는 IL-13에 대한 항체; IL-12 안타고니스트, 예를 들어, DAB 486-IL-2 및/또는 DAB 389-IL-2 (IL-2 융합 단백질, Seragen), 및/또는 IL-2R에 대한 항체, 예를 들어, 항-Tac (인간화 항-IL-2R, Protein Design Labs). 또다른 병용제로는 비소실 항-CD4 억제제 (IDEC-CE9.1/SB 210396; 비소실 영장류 항-CD-4 항체; IDEC/SmithKline)와 병용되는 IL-17F 신호전달 안타고니스 (예를 들어, IL-17F, IL-17R 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드; 가용성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (이의 단편 및/또는 융합 단백질을 포함함); 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트 소분자 등), 안타고니스트 소분자, 및/또는 억제성 항체를 들 수 있다. 기타 바람직한 병용제로는 항체, 가용성 수용체 또는 안타고니스트 리간드를 비롯한 보조자극 경로 CD80 (B7.1) 또는 CD86 (B7.2)의 안타고니스트; 뿐만 아니라 p-셀렉틴 당단백질 리간드 (PSGL), 항염증성 사이토카인, 예를 들어, IL-4 (DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; 재조합 IL-10 DNAX/Schering); IL-13 및 TGF-β, 및 이의 아고니스트 (예를 들어, 아고니스트 항체)를 들 수 있다.
기타 구체예에서, 하나 이상의 IL-17F 신호전달 안타고니스트는 하나 이상의 항염증성 약물, 면역억제제, 또는 대사 또는 효소 억제제와 공동 제형화하고/하거나 공동 투여할 수 있다. 본원에 기재된 IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드; 가용성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (이의 단편 및/또는 융합 단백질을 포함함); 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트 소분자 등)와 병용하여 사용할 수 있는 약물 또는 억제제의 비제한적인 예로서 하기 중 하나 이상을 들 수 있다: 비스테로이드성 항염증 약물(들) (NSAID), 예를 들어, 이부프로펜, 테니댑, 나프록센, 멜록시캠, 피록시캠, 디클로페낙, 및 인도메타신; 설파살라진; 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론; 사이토카인 억제성 항염증 약물(들) (CSAID); 뉴클레오티드 생합성 억제제, 예를 들어, 퓨린 생합성 억제제, 폴레이트 안타고니스트 (예를 들어, 메토트렉세이트 (N-[4-[[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸]메틸아미노]벤조일]-L-글루타민산); 및 피리미딘 생합성 억제제, 예를 들어, 디히드로오로테이트 디히드로게나제 (DHODH) 억제제. IL-17F 신호전달 안타고니스트와 병용하여 사용하기 위한 바람직한 치료제로서 NSAID, CSAID, (DHODH) 억제제 (예를 들어, 레플루노미드), 및 폴레이트 안타고니스트 (예를 들어, 메토트렉세이트)를 들 수 있다.
추가의 억제제의 예로서 하기 중 하나 이상을 들 수 있다: 코르티코스테로이드 (경구, 흡입 및 국소 주사액); 면역억제제, 예를 들어, 시클로스포린, 타클로리무스 (FK-506); 및 mTOR 억제제, 예를 들어, 시로리무스 (라파마이신 - RAPAMUNE(상표명) 또는 라파마이신 유도체, 예를 들어, 가용성 라파마이신 유도체 (예를 들어, 에스테르 라파마이신 유도체, 예를 들어, CCI-779)); 전염증성 사이토카인, 예컨대 TNFα 또는 IL-1에 의한 신호전달을 방해하는 작용제 (예를 들어, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제); COX2 억제제, 예를 들어, 셀레코시브, 로페코시브, 및 이의 변이체; 포스포디에스테라제 억제제, 예를 들어, R973401 (포스포디에스테라제 타입 IV 억제제); 포스포리파제 억제제, 예를 들어, 세포질 포스포리파제 2 (cPLA2)의 억제제 (예를 들어, 트리플루오로메틸 케톤 유사체); 혈관 내피 세포 성장 인자 또는 성장 인자 수용체의 억제제, 예를 들어, VEGF 억제제 및/또는 VEGF-R 억제제; 및 혈관신생 억제제. IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드; 가용성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (이의 단편 및/또는 융합 단백질을 포함함); 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트 소분자 등)와 병용하여 사용하기 위한 바람직한 치료제는 면역억제제, 예를 들어, 시클로스포린, 타크로리무스 (FK-506); mTOR 억제제, 예를 들어, 시로리무스 (라파마이신) 또는 라파마이신 유도체, 예를 들어, 가용성 라파마이신 유도체 (예를 들어, 에스테르 라파마이신 유도체, 예를 들어, CCI-779); COX2 억제제, 예를 들어, 셀레코시브 및 이의 변이체; 및 포스포리파제 억제제 예를 들어, 세포질 포스포리파제 2 (cPLA2)의 억제제, 예를 들어, 트리플루오로메틸 케톤 유사체이다.
IL-17F 신호전달 안타고니스트와 병용하여 사용할 수 있는 치료제의 추가의 예로서 하기 중 하나 이상을 들 수 있다: 6-메르캅토퓨린 (6-MP); 아자티오프린 설파살라진; 메살라진; 올살라진; 클로로퀸/히드록시클로로퀸 (PLAQUENIL(등록상표)); 펜실라민; 아우로티오르날레이트 (근육내 및 경구); 아자티오프린; 콜치신; 베타-2 아드레날린 수용체 아고니스트 (살부타몰, 터부탈린, 살메테랄); 크산틴 (테오필린, 아르니노필린); 크로모글리케이트; 네도크로밀; 케토티펜; 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸; 미코페놀레이트 모페틸; 아데노신 아고니스트; 항혈전제; 보체 억제제; 및 아드레날린제.
IL-17F 신호전달과 관련된 특정 장애를 치료하거나 예방하기 위하여 본원에 개시된 IL-17F 신호전달 안타고니스트를 기타 치료제와 병용하는 용도는 하기 더 상세하게 설명되어 있다.
IL-17F 신호전달 안타고니스트와 병용될 수 있는, 관절염성 장애 (예를 들어, 류마티스 관절염, 염증성 관절염, 류마티스 관절염, 소아성 류마티스 관절염, 골관절염 및 건선 관절염)를 치료하거나 예방하기 위한 작용제의 비제한적인 예로서 하기 중 하나 이상을 들 수 있다: 본원에 기재된 IL-12 안타고니스트; NSAID; CSAID; TNF, 예를 들어, TNFα, 본원에 기재된 안타고니스트; 본원에 기재된 비소실 항-CD4 항체; 본원에 기재된 IL-2 안타고니스트; 항염증성 사이토카인, 예를 들어, IL-4, IL-10, IL-13 및 TNFα, 또는 이의 아고니스트; 본원에 기재된 IL-1 또는 IL-1 수용체 안타고니스트; 본원에 기재된 포스포디에스테라제 억제제; 본원에 기재된 Cox-2 억제제; 메토트렉세이트; 탈리도미드 및 탈리도미드-관련 약물 (예를 들어, Celgen); 레플루노미드; 플라스미노겐 활성의 억제제, 예를 들어, 트라넥삼산; 사이토카인 억제제, 예를 들어, T-614; 프로스타글란딘 E1; 아자티오프린; 인터루킨-1 전환 효소 (ICE)의 억제제; zap-70 및/또는 lck 억제제 (티로신 키나제 zap-70 또는 lck의 억제제); 본원에 기재된 혈관 내피 세포 성장 인자 또는 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체의 억제제; 본원에 기재된 혈관신생 억제제; 코르티코스테로이드 항염증성 약물 (예를 들어, SB203580); TNF-전환효소 억제제; IL-11; IL-13; IL-17 억제제; 금; 페니실라민; 클로로퀸; 히드록시클로로퀸; 클로람부실; 시클로포스파미드; 시클로스포린; 전 림프 조사; 항가슴샘세포 글로불린; CD5-독소; 경구 투여되는 펩티드 및 콜라겐; 로벤자리트 2나트륨; 사이토카인 조절제 (CRA) HP228 및 HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); 가용성 보체 수용체 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); 프레드니손; 오르고테인; 글리코사미노글리칸 폴리설페이트; 미노시클린 (MINOCIN(등록상표)), 항-IL2R 항체; 해양성 및 식물성 지질 (어류 및 식물 종자 지방산); 아우라노핀; 페닐부타존; 메클로페남산; 플루페남산; 정맥내 면역 글로불린; 질레우톤; 미코페놀산 (RS-61443); 타크로니무스 (FK-506); 시로리무스 (라파마이신); 아미프릴로스 (테라펙틴); 클라드리빈 (2-클로로데옥시아데노신); 및 아자리빈. 바람직한 병용제로서, 메토트렉세이트 또는 레플루노미드와 병용되고, 심각한 류마티스 관절염의 경우 시클로스포린과 병용되는, 하나 이상의 IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드; 가용성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (이의 단편 및/또는 융합 단백질을 포함함); 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트 소분자 등)를 들 수 있다.
관절염성 장애를 치료하기 위하여 IL-17F 신호전달 안타고니스트와 병용하여 사용되는 억제제의 바람직한 예는 TNF 안타고니스트 (예를 들어, TNF에 결합되는 키메라, 인간화, 인간 또는 시험관내 생성된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편; TNF 수용체, 예를 들어, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 이의 유도체의 가용성 단편, 예를 들어, 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF-수용체-IgG 융합 단백질, ENBREL(상표명)), p55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; TNF 효소 안타고니스트, 예를 들어, TNFα 전환 효소 (TACE) 억제제); IL-12, IL-15, IL-18, IL-22의 안타고니스트; T-세포 및 B-세포 제거제 (예를 들어, 항-CD4 또는 항-CD22 항체); 소분자 억제제, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 레플루노미드; 시로리무스 (라파마이신) 및 이의 유사체, 예를 들어, CCI-779; cox-2 및 cPLA2 억제제; NSAID; p38 억제제, TPL-2, Mk-2 및 NFkb 억제제; RAGE 또는 가용성 RAGE; P-셀렉틴 또는 PSGL-1 억제제 (예를 들어, 소분자 억제제, 이에 대한 항체, 예를 들어, P-셀렉틴에 대한 항체); 에스트로겐 수용체 베타 (ERB) 아고니스트 또는 ERB-NFkb 안타고니스트를 포함한다. 하나 이상의 IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R 및/또는 IL- 17RC 억제성 폴리뉴클레오티드; 가용성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (이의 단편 및/또는 융합 단백질을 포함함); 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트 소분자 등)와 공동 투여하고/하거나 공동 제형화할 수 있는 가장 바람직한 추가의 치료제로서 하기 중 하나 이상을 들 수 있다: TNF 수용체, 예를 들어, p55 또는 p75 인간 TNF 수용체 또는 이의 유도체의 가용성 단편, 예를 들어, 75 kdTNFR-IgG (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, ENBREL(상표명)); 메토트렉세이트; 레플루노미드, 또는 시로리무스 (라파마이신) 또는 이의 유사체, 예를 들어, CCI-779.
IL-17F 신호전달 안타고니스트와 병용할 수 있는, 다발경화증의 치료 또는 예방을 위한 작용제의 비제한적인 예로서 하기를 들 수 있다: 인터페론, 예를 들어, 인터페론 알파 1a (예를 들어, AVONEX(상표명); Biogen) 및 인터페론-1b (BETASERON(상표명) Chiron/Berlex); 공중합체 1 (Cop-1; COPAXONE(상표명) Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압 산소; 정맥내 면역글로불린; 클라드리빈; 본원에 기재된 TNF 안타고니스트; 코르티코스테로이드; 프레드니솔론; 메틸프레드니솔론; 아자티오프린; 시클로포스파미드; 시클로스포린; 시클로스포린 A, 메토트렉세이트; 4-아미노피리딘; 및 티자니딘. IL-17F 신호전달 안타고니스트와 병용하여 사용할 수 있는 추가의 안타고니스트로서 기타 사이토카인 또는 성장 인자, 예를 들어, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-11, GM-CSF, FGF, 및 PDGF에 대한 항체 또는 이의 안타고니스트를 들 수 있다. 본원에 기재된 IL-17F 신호전달 안타고니스트는 세포 표면 분자, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 SMS 이의 리간드와 병용할 수 있다. IL-17F 신호전달 안타고니스트는 또한 메토트렉세이트, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID (예를 들어, 이부프로펜), 코르티코스테로이드 (예컨대, 프레드니솔론), 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 아고니스트, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린제, 본원에 기재된 전염증성 사이토카인에 의해 신호전달을 방해하는 작용제, IL-Ib 전환 효소 억제제 (예를 들어, Vx740), 항-P7, PSGL, TACE 억제제, T-세포 신호전달 억제제 (예컨대, 키나제 억제제), 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자틀로프린, 6-메르캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 본원에 기재된 가용성 사이토카인 수용체 및 이의 유도체 및 항염증성 사이토카인 (예를 들어, IL-4 IL-10, IL-13 및 TGF)과 같은 작용제와도 병용할 수 있다.
IL-17F 신호전달 안타고니스트와 병용할 수 있는, 다발경화증에 대한 치료제의 바람직한 예로서 인터페론-β, 예를 들어, IFNβ-1a 및 IFNβ-1b; 코팍손, 코르티코스테로이드, IL-1 억제제, TNF 억제제, CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체 IL-12 안타고니스트를 들 수 있다.
IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드; 가용성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (이의 단편 및/또는 융합 단백질을 포함함); 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트 소분자 등)와 병용할 수 있는, 염증성 장질환 (예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염)을 치료하거나 예방하기 위한 작용제의 비제한적인 예로서 하기를 들 수 있다: 부데노사이드; 표피 성장 인자; 코르티코스테로이드; 시클로스포린; 설파살라진; 아미노살리실레이트; 6-메르캅토퓨린; 아자티오프린; 메트로니다졸; 리포옥시게나제 억제제; 메살라민; 올살라진; 발살라지드; 산화방지제; 트롬복산 억제제; IL-1 수용체 안타고니스트; 항-IL-1 단클론 항체; 항-IL-6 단클론 항체; 성장 인자; 엘라스타제 억제제; 피리미딜-이미다졸 화합물; 본원에 기재된 TNF 안타고니스트; IL-4, IL-10, IL-13 및/또는 TGFβ 사이토카인 또는 이의 아고니스트 (예를 들어, 아고니스트 항체); IL-11; 프레드니솔론, 덱사메타손 또는 부데소나이드의 글루쿠로니드- 또는 덱스트란-컨쥬게이션된 프로드러그; ICAM-1 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); 가용성 보체 수용체 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); 서방성 메살라진; 메토트렉세이트; 혈소판 자극 인자(PAF)의 안타고니스트; 시프로플록사신; 및 리그노카인.
하나의 구체예에서, IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드; 가용성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (이의 단편 및/또는 융합 단백질을 포함함); 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트 소분자 등)는 면역 반응, 예를 들어, 이식 거부의 조절에 수반되는 다른 표적에 대한 하나 이상의 항체와 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 IL-17F 신호전달 안타고니스트와 병용할 수 있는, 면역 반응을 치료하거나 예방하기 위한 작용제의 비제한적인 예로서 하기를 들 수 있다: 다른 세포 표면 분자, 이의 비제한적인 예로서 CD25 (인터루킨-2 수용체-a), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4 (CD80 (B7.1), 예를 들어, CTLA4 Ig-아바타셉트 (ORENCIA(등록상표))), ICOSL, ICOS 및/또는 CD86 (B7.2)에 대한 항체. 또다른 구체예에서, IL-17F 신호전달 안타고니스트는 하나 이상의 일반적인 면역억제제, 예컨대 시클로스포린 A 또는 FK506과 병용하여 사용한다.
다른 구체예에서, IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드; 가용성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (이의 단편 및/또는 융합 단백질을 포함함); 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체; 및/또는 안타고니스트 소분자 등)는 자가면역 장애, 염증성 질환 등에 대한 백신 아주반트로서 사용한다. 상기 유형의 장애를 치료하기 위한 아주반트 병용제는 표적화된 자가-항원, 즉 자가면역에 수반되는 자가 항원,예를 들어, 수초 염기성 단백질; 염증성 자가 항원, 예를 들어, 아밀로이드 펩티드 단백질, 또는 이식 항원, 예를 들어, 동종 항원으로부터의 광범위한 항원과 병용하여 사용하기에 적절하다. 상기 항원은 단백질로부터 유도된 펩티드 또는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 하기 중 임의의 단편을 포함할 수 있다: 당류, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 자가 항원, 아밀로이드 펩티드 단백질, 이식 항원, 알레르겐, 또는 기타 고분자 성분. 일부 경우, 하나 초과의 항원이 항원 조성물에 포함될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 아주반트 병용제를 함유하는, 척추동물 숙주의 알레르겐에 대한 반응을 조절하기 위한 바람직한 백신으로서 알레르겐 또는 이의 단편을 함유하는 것을 들 수 있다. 상기 알레르겐의 예는 본원에서 그 전문을 참고로 인용하는 미국 특허 제 5,830,877호 및 공개된 국제 특허 출원 제 WO 99/51259호에 기재되어 있으며, 이는 화분, 곤충 독액, 동물 비듬, 균류 포자 및 약물 (예컨대, 페니실린)을 포함한다. 백신은 알레르기 반응의 공지된 원인인, IgE 항체의 생성을 방해한다. 또다른 예에서, 척추동물 숙주에서 아밀로이드 침착을 특징으로 하는 질환의 예방 또는 치료에 바람직한 백신은, 본 발명의 보조제 병용물을 함유하는데, 아밀로이드 펩티드 단백질 (APP) 의 일부를 함유하는 것을 포함한다. 상기 질환은 알츠하이머 질환, 아밀로이드형성 또는 아밀로이드형성 질환으로서 다양하게 불린다. 따라서, 본 발명의 백신은 본 발명의 보조제 병용물 + Aβ 펩티드, 뿐만 아니라 Aβ 펩티드 절편 및 Aβ 펩티드 또는 그의 절편에 대한 항체를 포함한다.
1) 항원 제시 세포 기능을 하향조절함 ; 및
2) 면역억제 조절을 위한 병용 치료 방법이 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, Xiao 등 (2003) BioDrugs 17 : 103- 11 ; Kuwana (2002) Hum. Immunol. 63 : 1156 - 63 ; Lu 등 (2002) Transplantation 73 : S19-S22 ; Rifle 등 (2002) Transplantation 73 : S1 - S2 ; Mancini 등 (2004) Crit. Care. Nurs. Q. 27 : 61 - 64).
따라서, 본 발명의 또다른 측면은 IL-17F 신호전달 안타고니스트 (예를 들어, IL-17F, IL-17R, 및/또는 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드 ; 용해성 IL-17R 및/또는 IL-17RC 폴리펩티드 (그의 절편 및/또는 융합 단백질 포함) ; 억제성 항-IL-17F, 항-IL-17R, 또는 IL-17RC 항체 ; 및/또는 안타고니스트성 소분자 등) 와 기타 치료적 화합물의 투여를 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 한 구현예에서, 키트는 약학적 담체에서 제형되는 하나 이상의 결합제, 및 치료제와 같은 하나 이상의 제제를 적절하게 제형된다면, 하나 이상의 별개의 약학적 제제 내에서 포함한다.
본 출원을 통틀어서 언급된 모든 참조, 특허, 및 공개된 특허 출원의 전체 내용은 본원에 참조로써 삽입되어 있다.
하기 실시예는 본 발명의 예시적인 구현예를 제공하는 것이고, 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 당업자는 많은 다른 구현예가 본 발명의 범주 내에 포함되는 것을 알게 될 것이다.
실시예는 통상의 방법, 벡터의 구축, 폴리펩티드를 상기 벡터 및 플라스미드로 암호화하는 유전자의 삽입, 상기 벡터 및 플라스미드의 숙주세포로의 도입, 및 숙주세포 내에서의 상기 벡터 및 플라스미드로부터의 폴리펩티드의 발현에 사용되는 상기 방법의 상세한 설명을 포함하는 것은 아니다. 상기 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
실시예 1 : IL-17F-매개 염증 반응 및 염증 장애, 예를 들어, 류마티스 관절염, 염증 호흡계 장애, 및 염증성 장 질환에서의 관련.
실시예 1.1 : 본래의 마우스에 인간 IL-17F 를 투여하는 것은 복막으로의 중 성구 유입을 유도함.
IL-17F 처리가 증가된 프로테오글리칸 와해 및 관절 연골에 의한 감소된 프로테오글리칸 합성을 초래한다는 관찰은 (Hymowitz 등, (2001) EMBOJ. 20:5332-41) 관절 조직의 염증 질환의 발달에 있어서 IL-17F 신호전달에 대한 역할을 제시한다. 실제로, 류마티스 관절염 및 오스테오관절염 환자의 활막액 샘플은 예를 들어, 아그레칸, 케라틴 및 콜라겐을 포함하여, 프로테오글리칸의 분해를 보여주고 (예를 들어, [Witter 등, (1987) Arth. Rheum. 30:519-29] 및 [Yagi 등, (2005) J. Orthop. Res. 23(5):1128-38] 참조), 시험관내 관절염 모델이 매트릭스 및 프로테오글리칸 분해를 보여줌으로서 상기 현상을 흉내낸다 (Neidhart 등, (2000) Arth. Rheum. 43:1719-28).
추가로, 천식으로 고통받는 환자로부터 단리된 BAL 샘플 (Kawaguchi 등, (2002) J. Immunol.167:4430-35), 및 염증성 장 질환, 예를 들어, 궤양성 대장염 또는 크론병으로 고통받는 환자로부터 단리된 결장 샘플 (Gurney 등, (2003) GTCBIO Conference: Cytokines and Beyond) 에서 관찰된 IL-17F 의 증가된 발현은 폐 및 장 조직의 염증 장애에서 IL-17F 신호전달을 위한 추가의 역할을 제안한다. 염증 반응에서 IL-17F 신호전달의 역할을 알아보기 위해, 본래의 마우스에 PBS (대조군으로서) 또는 100 μg 인간 IL-17F (SEQ ID NO:2) 를 복강 내 주사하였다. 처리 후 몇 시간째에, 말초혈액 샘플 (PB; 1, 2, 4, 6, 8, 및 10 시간) 및 복강 (PEC; 2, 4, 6, 8, 및 10 시간) 을 취하고, 각 샘플 내 완전 중성구 수 (ANC) 를 측정하였다. 표 2 의 데이타는 혈액 및 복막에서 중성구 수를 증가시키는 IL- 17F 의 역할을 반영한다. 상기 효과는 류마티스 관절염 및 만성 폐쇄성 폐질환 질환 (COPD) 으로 고통받는 환자에서 보여진 호중구증가증을 설명할 수 있다.
표 2. PBS (n = 5) 또는 IL-17F (n = 5) 로 주사한 마우스에서 단리된 말초 혈액 (PB) 및 복강 (PEC) 샘플 내 완전 중성구 수 (ANC; 평균 ± SEM). 별표는 대조군 샘플에 비해 p-값 < 0.05 을 나타냄.
주사 후 시간 PB ANC x 103/uL PBC ANC x 105/mL
PBS IL-17F PBS IL-17F
1 1.24 ± 0.59 1.97 ± 0.45 - -
2 0.15 ± 0.10 1.07 ± 0.25* 0.08 ± 0.05 2.28 ± 2.52
4 0.15 ± 0.08 0.75 ± 0.13* 0.00 ± 0.01 0.30 ± 0.15*
6 0.25 ± 0.13 0.93 ± 0.4* 0.04 ± 0.06 2.03 ± 1.35*
8 0.22 ± 0.06 0.31 ± 0.08 0.02 ± 0.02 1.20 ± 2.11
10 0.11 ± 0.09 0.48 ± 0.36 0.02 ± 0.03 2.06 ± 1.53*
실시예 1.2 : IL-17F 신호전달은 염증 관절 장애에서 역할함.
염증, 특히 관절 질환 (예를 들어, 관절염) 에 포함된 염증 반응에서의 IL-17F 신호전달의 관여를 추가로 평가하기 위해, 1 차 연골 세포에서 염증 사이토카인, 즉, NF-κB 의 전사에 관여되는 1 차 인자를 활성화시키는 IL-17F 의 능력을 측정하였다. 1 차 인간 또는 돼지 연골 세포를, NF-κB-반응성 프로모터 (BD Mercury 경로 Profiling 시스템s, BD Biosciences, Palo Alto, CA) 에 의해 조절되는 루시퍼라제 유전자의 발현을 측정함으로써 내인성 NF-κB (즉, 세포질로부터 핵으로의 NF-κB 의 전좌) 의 활성화를 검출하는, NF-κB 수용체 유전자 시스템을 발현하는 아데노바이러스로 감염시켰다 (100 MOI). 48 ~ 72 시간 후, 감염된 연골 세포를 IL-17A (SEQ ID NO:4) 또는 IL-17F 의 농도를 달리하면서 배양하였다. IL-17A 또는 IL-17F 와 함께 인큐베이션한 지 수 시간 후에, 세포를 25 μl 파쇄 완충액 (Promega, Madison, WI) 내에서 실온에서 20 분 동안 파쇄시키고, NF-κB 의 활성화를 자동화된 발광분석기를 사용하여 측정하였다. 상기 데이타는 IL-17F 가 1 차 인간 연골 세포 (도 IA) 및 1 차 돼지 연골 세포 (도 IB) 에서 NF-κB 를 농도-의존성 방식으로 활성화시켰음을 보여준다. 마지막으로, 배경을 초과하는 수준까지 NF-κB 를 활성화시키는데 필요한 IL-17F 의 양은 배경을 초과하는 수준까지 NF-κB 를 활성화시키는데 필요한 IL-17A 의 양과 유사하였다 (도 1A).
1 차 연골 세포에서 사이토카인 전사 인자인 NF-κB 를 활성화시키는 IL-17F 의 능력은, IL-17F 의 역할이 예를 들어, 관절염의 발달 동안에 관절 조직의 염증에서 역할을 하고, 염증 사이토카인의 유도에 관여한다는 것을 제안한다. 관절 조직에 의한 염증 사이토카인 생성에 대한 IL-17F 의 효과를 시험하기 위해, 류마티스 관절염 (RA) 으로 진단받은 2 명의 환자로부터 단리된 인간 섬유아세포-유사 활막 세포를 24 웰 플레이트에서 반-정도 풍부한 상태로 플레이팅하고, 150 ng/ml IL-17F 의 부재 또는 존재 하에 배양하였다. 상청액을 48 시간째에 수합하고, 멀티플렉스 사이토카인 시스템 (Pierce-Bio, Rockford, EL) 을 사용하여 사이토카인 생성을 평가하였다. 도 2 에서 보여진 바와 같이, IL-17F 는 IL-6 및 IL-8 와 같은 염증 사이토카인, 및 MCP-I 및 GRO-α 와 같은 케모카인의, RA 환자로부터 단리된 인간 섬유아세포-유사 활막 세포에 의한 생성을 유도하였다.
RA 환자의 인간 섬유아세포-유사 활막 세포에 의한 1 차 연골 세포에서 NF-κB 를 활성화시키고 염증 사이토카인 및 케모카인, 특히 중성구 보충에 관여하는 케모카인의 생성을 유도하는 IL-17F 의 능력은 관절 조직에 의한 염증 반응을 매개하는데 있어서 IL-17F 에 대한 역할을 제안한다. 대조군 동물과 비교해 콜라겐 유도 관절염으로 고통받는 마우스의 발에서의 증가된 IL-17F 발현 (데이타 제시안됨), 및 퇴화된 관절 염골 및 관절 공간 내의 중성구의 존재를 설명하고 있는 데이타 (데이타 제시안됨) 와 함께 취해진 상기 데이타는, IL-17F 가 사이토카인 및 케모카인 생성을 유도함으로써 염증 관절 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염) 을 매개하고, 이어서 주변 조직에 손상을 야기하는 면역 세포 (예를 들어, 중성구) 를 염증 부위에 보충하는 것을 제안한다.
실시예 1.3 : 1 차 마우스 폐 섬유아세포는 염증 케모카인 및 사이토카인의 생성을 상향조절함으로써 IL-17F 에 반응함.
염증 호흡계 질환의 발달에 있어서 IL-17F 의 역할을 시험하기 위해, 쥣과 폐 섬유아세포 (MFL) 세포를 24 웰 플레이트에 반-정도 채워지게 배양하고, IL-17F (50 ng/ml) 로 처리하였다. 상청액을 48 시간째에 수합하고, 사이토카인 생성을 멀티플렉스 사이토카인 시스템 (Pierce-Bio, Rockford, IL) 을 사용하여 평가하였다. 도 3 에서는, IL-17F 가 IL-6 와 같은 염증 사이토카인, 및 JE (CCL2) 및 KC 와 같은 케모카인의 MFL 생성을 유도하였음을 보여준다. 이러한 결과는, IL-17F 가 염증 사이토카인 및 백혈구 화학주성물의 생성을 유도함으로써 폐의 염증 장애 (예를 들어, COPD, 천식, 알레르기, 낭성 섬유증) 에 관여하는 염증 반응에 기여함을 제안한다.
실시예 2 : IL-17F 수용체의 특징화
실시예 2.1 : IL-17F 는 IL-17R 및 IL-17RC 에 결합함.
IL-17F 가 IL-17 패밀리 내 IL-17A 와 가장 큰 동종성을 공유하고, IL-17 수용체를 통한 IL-17A 및 IL-17F 의 신호전달이 이루어진다고 제안되어 왔기 때문에, IL-17A 에 대한 수용체 (즉, IL-17R; SEQ ID NO:6) 에 결합하는 IL-17F 의 능력을 측정하였다. 그의 리간드가 아직까지 규명되지 않은 IL-17 수용체인 IL-17RC 에 IL-17F 가 결합하는 능력을 또한 시험하였다.
ELISA 플레이트를 1.5 μg/ml 인간 IL-17R-Ig (SEQ ID NO:34) 또는 1.5 μg/ml 인간 IL-17RC-Ig (SEQ ID NO:35) 와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS/1%BSA 로 세척하고, 비오틴-공액 IL-17A 또는 비오틴-공액 IL-17F 의 단계 희석액과 함께 실온 (RT) 에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 포화 농도의 아비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 추가의 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 비결합 아비딘-HRP 를 PBS/1% BSA 를 사용하여 세척하고, ELISA 를 TBM 을 사용하여 발색시켰다. 결합 IL-17A 또는 IL-17F 를 405 nm 에서의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다.
도 4A 및 4B 는, IL-17F 가 IL-17RC 에 대한 친화성에 비해 IL-17R 에 대해 더 큰 친화성을 가지고 (IL-17R 에 대한 EC50 값 :IL-17F = 1.23 μg/ml; IL-17RC 에 대한 EC50 값 :IL-17F = 15 μg/ml), IL-17F 가 IL-17R 및 IL-17RC 둘 다에 각각 결합한다는 것을 보여준다. 그러나, IL-17F 가 IL-17R 에 결합되더라도, 수용체에 대한 그의 친화성은 동일한 수용체에 대한 IL-17A 의 친화성보다 더 낮았다 (IL-17R 에 대한 EC50 값 : IL-17F = 1.23 μg/ml, IL-17R:IL-17A = 0.35 μg/ml; 도 4A).
실시예 2.2 : IL-17R-Ig 융합 단백질이 아닌 항-IL-17R 항체 및 IL-17RC-Ig 융합 단백질이 IL-17F 활성을 차단함.
IL-17F 수용체 결합을 추가로 특징짓기 위해, 인간 섬유아세포 세포 (104 세포/웰) 를 IL-17R-Ig 융합 단백질, IL-17RC-Ig 융합 단백질 또는 항-IL-17R 항체의 농도를 증가시키면서, 0.5 ng/ml IL-17A 또는 20 ng/ml IL-17F 로 자극시켰다. 24 시간 후, 수합된 상청액의 GRO-α 농도를 시판의 ELISA (R&D, Minneapolis, MN) 를 사용하여 측정하였다. GRO-α 의 농도는 표준 커브를 기준으로 측정되었다.
도 5 는 IL-17A (A) 또는 IL-17F (B) 로 인큐베이션되었을 때, 인간 섬유아세포 세포에 의한 증가된 GRO-α 생성을 보여주고, 실시예 1.2 의 발견을 추가로 보강하였다 (IL-17F 로 배양된 인간 섬유아세포-유사 활막 세포에 의한 증가된 염증 사이토카인 생성을 설명함). 도 5A 는 모든 3 가지 수용체 안타고니스트, 즉, IL-17R-Ig (h17R.Fc), IL-17RC-Ig (h17RH2.Fc) 및 항-IL-17R 항체 (ahIL17R) 가 GRO-α 를 유도하는 IL-17A 의 능력을 차단하였음을 추가로 보여주었다. 상기 데이타는, IL-17A 가 IL-17A 신호전달을 위한 IL-17R 및 IL-17RC 수용체 둘 다에 결합하고 그것을 필요로 한다는 것을 보여주었다. 이와는 달리, IL-17R-Ig 융합 단백질가 아닌 단지 항-IL-17R 항체 및 IL-17RC-Ig 융합 단백질만이 IL-17F 활성을 두드러지게 차단하였다 (도 5B). 도 5B 에 나타낸 데이타는, IL-17F 가 IL-17R 에 결합하나 (도 4 참조), IL-17F-매개 신호전달을 위해 상기 수용체를 필요로 하지는 않음을 보여준다. 상기 데이타는, IL-17A 및 IL-17F 가 인간 섬유아세포 세포 상에서의 그의 활성을 매개하기 위해서 상이한 수용체를 사용할 수 있음을 제안한다.
실시예 3 : 항-IL-17F 항체의 발생 및 특징화
실시예 3.1 : 항-IL-17F 항체의 발생
5 마리의 마우스 (Jackson Labs, Maine) 1 군에 인간 IL-17F 를 암호화하는 cDNA 2 μg 을 주사하였다. 정제된 플라스미드 cDNA 를 1 μg cDNA/0.5 mg 금의 농도로 금 비드에 침전시켰다. 금 비드 및 침전된 cDNA 를 2 개의 비오버랩핑 샷에서 매달, Helios 전하된 유전자를 사용하여 11-주령 암컷 Balb/c 마우스의 복부에 내피로 전달하였다. 상기 동물을 매 4 주마다 면역시키고, 상기 기간의 끝에서 비장을 제거하였다. 정제된 IL-17F 단백질 + IL-17F cDNA 를 사용하여 재면역화를 수행하였다. 비장을 처리하여 림프구 현탁액을 수득하고, 생성 현탁액을 구축된 과정에 의해 50% (w/v) 폴리에틸렌 글리콜 1500 을 사용하여 골수종 세포주 653/P3 와 융합시켰다 (Oi and Herzenberg (1980) in Selected Methods in Cellular Immunology, Mishel and Schigi, eds. W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, p. 351). 융합된 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 2 x 105 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 24 시간 후에 HAT 선택을 시켰다. 추정의 항-IL-17F 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 고체 및 용액상 ELISA 에 의해 규명하였다. 상기 어세이에 대해 양성인 하이브리도마를 함유하는 웰을 늘리고, 희석을 한정시킴으로써 클로닝하고, 동결보관하였다. 항체의 아이소타입을 고체상 ELISA 를 사용하여 규명하였다. 정제된 인간 IL-17F-Ig 을 사용하여 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 코팅하고, 상이한 아이소타입-특이적 비오틴-공액 염소 항-마우스 IgG (Zymed, South San Francisco, CA) 에 의해 검출하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 와 공액된 스트렙타비딘을 첨가하고, 색채계 기질을 사용하여 특이적으로 결합된 효소를 측정하였다.
실시예 3.2 : 일부 항-IL-17F 항체는 IL-17F 의 IL-17R 에의 결합을 차단함.
IL-17F 가 IL-17R 에 결합하는 것을 차단하는 항-IL-17F 항체의 능력을 평가하기 위해, 실시예 2.1 에서 기술된 ELISA 를 변형시켜서 억제 어세이를 수행하였다. 간략하게는, 항-IL-17F 항체의 단계 희석액을 7 μg/ml IL-17F 로 실온에서 1 시간 동안 예비인큐베이션시켰다. 각각의 사이토카인:항체 혼합물을 1.5 μg/ml IL-17R-Ig 의 100 μl/웰로 미리 코팅시킨 ELISA 플레이트의 개별 웰에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 상기 웰에서 인큐베이션시켰다. PBS/1% BSA 로 상기 플레이트를 세척한 다음, 포화 농도의 아비딘-HRP 를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 추가의 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 비결합 아비딘-HRP 를 PBS/1% BSA 를 사용하여 세척해 내었다. 상기 어세이를 TMB 를 사용하여 발색시켰다. 도 6 은, 시험된 6 가지의 항체 중 5 가지, 즉, 항-IL-17F-01, 항-IL-17F-02, 항-IL-17F-06, 항-IL-17F-07, 및 (더 적은 정도로) 항-IL-17F-05 가 IL-17F 의 IL-17R 에의 결합을 차단할 수 있었음을 보여주었다. 반대로, 항-IL-17F-03 항체는 IL-17F 의 IL-17R 에의 결합을 억제하지 못하였다 (도 6).
실시예 3.3 : 일부 항-IL-17F 항체는 IL-17F 의 IL-17RC 에의 결합을 억제시킴.
항-IL-17F 항체가 IL-17F 의 IL-17RC 에의 결합을 억제시키는 능력을 평가하기 위해, 상기 기술된 바와 같이, 1.5 μg/ml IL-17RC-Ig 및 20 μg/ml 의 농도에서 IL-17F 로 미리 코팅시킨 플레이트를 사용하여, 변형된 ELISA 를 사용한 억제 어세이를 수행하였다. 도 7 은, 시험된 6 가지의 항체 중 2 가지 (항-IL-17F-01 및 항-IL-17F-07) 가 IL-17F 의 IL-17RC 에의 결합을 억제할 수 있었음을 나타내었다. 반대로, 항-IL-17F-02, 항-IL-17F-03, 항-IL-17F-05 및 항-IL-17F-06 항체는 IL-17F 의 IL-17RC 에의 결합을 억제하지 못하였다 (도 7). 도 6 및 7 을 함께 고려하여, 데이타는 항-IL-17F 항체가 IL-17F 상의 확실한 부위에 결합하고, 뿐만 아니라, 항-IL-17F-02, 및 항-IL-17F-06 항체가 IL-17F:IL-17R 상호작용에 특이적인 IL-17F 상의 위치에 결합하고/거나 또는 상기 위치에의 결합을 억제시키고, 한편, 항-IL-17F-01 및 항-IL-17F-07 항체는 IL-17R 및 IL-17RC 사이에 공유된 IL-17F 상의 위치에 결합하고/거나 또는 그러한 결합을 억제시킨다는 것을 제안하였다. 결과적으로, 상기 6 가지의 항체는 IL-17F 상에 있는 분명한 위치, 즉, 에피토프를 정하는데 사용될 수 있다.
실시예 4 : 항-IL-17F 항체는 IL-17F 생물활성을 억제시킴.
실시예 4.1 : 항-IL-17F 항체는 IL-17F-매개 사이토카인 생성을 억제시킴.
실시예 3 에서 기술된 항-IL-17F 항체 중 임의의 것이 IL-17F 생물활성을 억제시키는지 알아보기 위해, 인간 섬유아세포 세포 (104 세포/웰) 를 증가하는 농도의 대조군 항체 (mIgGl) 또는 IL-17F 에의 항체, 즉, 항-IL-17F-01, 항-IL-17F-02, 항-IL-17F-03, 항-IL-17F-05, 항-IL-17F-06, 또는 항-IL-17F-07 의 존재 하에, 인간 20 ng/ml IL-17F 로 자극시켰다. 24 시간 후, 상청액을 수합하고, 시판의 ELISA 를 사용하여 GRO-α 농도를 측정하였다. 생성된 GRO-α 의 농도는 표준 커브를 기준으로 결정되었다.
도 8 은, 항-IL-17F-01, 항-IL-17F-02, 및 항-IL-17F-07 항체가 인간 섬유아세포 세포에 의한 인간 IL-17F-매개 GRO-α 생성을 억제시켰음을 나타낸다. 도 6, 7, 및 8 에서 나타낸 결과는, IL-17F 신호전달이 IL-17F 의 IL-17R 에의 결합에 의해 개시되어, IL-17RC 를 통한 후속하는 보충 및 필요한 신호전달을 초래함을 제안한다.
실시예 4.2 : 염증 장애의 치료에 있어서 항-IL-17F 항체의 잠재적인 용도.
IL-17F 신호전달과 관련된 장애 (예를 들어, 자가면역 질환, 호흡계 질환, 염증성 장 질환 등) 의 치료에서 치료제로서의 항-IL-17F 항체, 특히 항-IL-17F-07 항체의 잠재성을 알아보기 위해, NF-κB 수용체 벡터로 감염된 돼지 1 차 연골 세포를, 하기 중 어느 하나의 부재 또는 존재 하에 실온에서 1 시간 동안 예비인큐베이션시킨 100 ng/ml IL-17A 또는 500 ng/ml IL-17F 와 함께, 48 시간 동안 인큐베이션시켰다 : 20 μg/ml IL-17R-Ig 융합 단백질 (IL17R/Fc), 10 μg/ml 항-IL-17F-07 항체 (항IL17F), 또는 10 μg/ml 대조군 항체 (마우스IgG). 도 9 는, IL-17R-Ig 융합 단백질의 인큐베이션이 NF-κB 의 IL-17A-매개 활성화를 억제시킨 한편, NF-κB 의 IL-17F-매개 활성화에는 아무런 영향을 미치지 못하였음을 나타내었다. 반대로, 항-IL-17F-07 항체는 NF-κB 의 IL-17F-매개 활성화를 억제시킬 수 있었으나, NF-κB 의 IL-17A-매개 활성화에는 아무런 영향을 미치지 못하였다 (도 9).
억제된 사이토카인 생성과 연관된 항-IL-17F 항체의 존재 하에 NF-κB 활성화가 억제되는지 알아보기 위해, 실시예 1.2 에서 기술된 바와 같이 IL-17F 로 인큐베이션시킨 인간 섬유아세포-유사 활막 세포를 아이소타입 대조군 항체, 항-IL-17F-01 항체, 또는 항-IL-17F-07 항체로 인큐베이션시켰다. IL-6, IL-8, 또는GRO-α 의 농도를 실시예 1.2 에서 기술된 바와 같이 평가하였다. 도 10 은, 류마티스 관절염 환자 2 명으로부터 단리된 1 차 섬유아세포-유사 활막 세포에 의한 IL-6, IL-8, 및 GRO-α 의 감소된 생성과 연관된 NF-κB 의 IL-17F 활성화를 항-IL-17F 항체가 억제시키는 능력을 나타내었다. 상기 데이타는, IL-17F 에 대한 억제성 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 IL-17F 신호전달의 안타고니스트가염증 반응을 감소시키는데 사용될 수 있음을 제안한다. 특히, IL-17F 의 억제제가 IL-17F 신호전달과 관련된 장애, 즉, IL-17F-관련 장애와 연관된 염증 반응의 치료에 사용될 수 있다.
실시예 5 : IL-17F 및 IL-17A 에 대한 항체는 재조합 및 자연 IL-17F 동종이량체, IL-17A 동종이량체, 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체를 검출하고 정제하는데 사용될 수 있음.
실시예 5.1 : ELISA 에 의한 재조합 IL-17A/IL-17A, IL-17F/IL-17F 및 IL-17A/IL-17F 의 검출
인간 IL-17A, 인간 IL-17F 또는 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F 둘 다를 암호화하는 cDNA 를 사용하여 293 세포를 개질하였다. 상기 cDNA 의 발현은 IL-17A/IL-17A, IL-17F/IL-17F 또는 IL-17A/IL-17F 이량체의 생성을 초래하였다. 상기 세포로부터 유도된 조건화된 배지, 즉, 재조합 사이토카인, 및 시판의 항체 또는 상기 기술된 항체를 사용하여, IL-17A 단백질, IL-17F 단백질, 또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 검출을 위한 ELISA 포맷을 발달시켰다. IL-17A 단백질의, 즉, IL-17A 동종이량체 또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체로서의 검출을 위해, 항-IL-17A 항체를 캡처 항체로서 사용하고, 비오틴 표지 항-IL-17A 항체를 검출 항체로서 사용하였다 (두 항체 모두 R&D Systems, Minneapolis, MN 에서 구입가능함). 즉, IL-17F 동종이량체 또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체로서의 IL-17F 단백질의 검출을 위해, 항-IL-17F-01 항체 (상기 기술됨) 및 비오틴-표지 항-IL-17F-07 항체 (상기 기술됨) 를 캡처 및 검출 항체로서 각각 사용하였다. IL-17A/IL-17F 이종이량체의 검출을 위해, 항-IL-17A 항체 (R&D Systems) 를 캡처 항체로서 사용하고, 비오틴 표지 항-IL-17F-07 항체를 검출 항체로서 사용하였다. IL-17A 및 IL-17F 항체는 교차-활성이지 않다 (데이타 제시안됨).
잘-알려진 프로토콜에 따라 ELISA 를 수행하였다. 간략하게는, ELISA 플레이트를 캡처 항체 2 μg/ml 로 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS/1%BSA 로 세척하여, 잉여량의 캡처 항체를 제거하고, 조건화된 배지 (즉, 재조합 IL-17A/IL-17A, IL-17F/IL-17F, IL-17A/IL-17F 사이토카인) 의 단계 희석액과 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 비결합 사이토카인을 세척한 후, 0.07-0.5 μg/ml 비오틴-공액 발색 항체를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하여, 비결합 발색 항체를 제거하고, 포화 농도의 아비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 비결합 아비딘-HRP 를 PBS/1% BSA 를 사용하여 세척하여 제거하였다. 상기 어세이를 TBM 를 사용하여 발색시켰다.
도 11 은 재조합 IL-17A 및 IL-17F 동종이량체의 검출, 뿐만 아니라 재조합 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 검출을 기술한다. 캡처 및 검출 항체가 둘 다 하나의 사이토카인, (즉, IL-17A 또는 IL-17F) 에 관한 것일 때, 상기 사이토카인의 2 가지 동종이량체 및 이종이량체를 검출하였다 (도 HA 및 HB). 반대로, 항-IL-17A 항체 및 항-IL-17F 항체를 캡처 및 검출 항체로서 각각 사용할 때, 단지 IL-17A/IL-17F 이종이량체만 검출된다 (도 11C). 이러한 데이타는, IL-17A/IL-17F 항체 쌍이 1 차 세포로부터 유래된 조건화된 배지 내에서 자연 (즉, 비재조합) IL-17A/IL-17F 이종이량체를 검출하고 잠재적으로 정제하는데 사용될 수 있음을 제안하였다. 추가로, 상기 결과는, 본원에 기술된 바와 같이, 항-IL-17F-01 항체 및 다른 항-Il-17F 항체처럼 항-IL-17F-07 항체가 또한 IL-17A/IL-17F 이종이량체에 관한 것일 수 있음을 제안한다.
실시예 5.2 : 자연 IL-17A 동종이량체, 자연 IL-17F 동종이량체, 및 자연 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 검출
인간 CD4+ T 세포 (5 x 105 세포/ml) 를 IL-21 (60 ng/ml) 또는 IL-23 (0.5 ng/ml) 의 부재 또는 존재 하에 항-CD3-결합 비드 (5 μg/107 비드), 및 증가하는 농도의 항-CD28 항체 (R&D, Minneapolis, MN) 를 사용하여 활성화시켰다. 1 차 활성화 후 72 시간째에 상청액을 수합하고, IL-17A 또는 IL-17F 의 농도를 상기 기술된 IL-17A 단백질, 또는 IL-17F 단백질 각각에 대한 ELISA 에 의해 측정하였다 (실시예 5.1). 도 12 는, IL-21 또는 IL-23 가 1 차 활성화를 수행하는 T 세포에 의한 IL-17A 또는 IL-17F 의 생성을 증진시키는데 사용될 수 있음을 제안한다. IL-2, IL-7, 및 IL-15 는 또한 CD3/CD28 자극 시 IL-17A 및 IL-17F 생성을 유도하였다 (데이타 제시안됨).
인간 CD4+ T 세포 (5 x 105 세포/ml) 를 항-CD3-결합 비드 (5 μg/107 비드) 및 용해성 항-CD28 항체로 48 시간 동안 활성화시켰다. 활성화된 T 세포를 수합하고, 밤새 놔두고, 비드-결합된 항-CD3, 항-CD28 항체, IL-21 (60 ng/ml) 또는 IL-23 (0.5 ng/ml) 의 존재 하에 재활성화시켰다. 상청액을 제 2 차 활성화 후 72 시간째에 수합하고, IL-17A 또는 IL-17F 생성을 상기 기술된 IL-17A 단백질, 또는 IL-17F 단백질 각각에 대한 ELISA 에 의해 측정하였다. 도 13 은, IL-21 또는 IL-23 이 제 2 차 활성화를 수행하는 T 세포에 의한 IL-17A 또는 IL-17F 생성을 증진시키는 CD28 공동자극과 함께 상승작용함을 기술한다.
인간 CD4+ T 세포 (2 x 106 세포/ml) 를 항-CD3-결합 비드 (5 μg/107 비드) 및 용해성 항-CD28 항체 (0.5 μg/ml) 로 1 차 활성화시켰다. 1 차 활성화 후 48 시간째에, 조건화된 배지 (CM1) 를 수합하고, 세포를 밤새 놔두었다. 다음 날, 세포의 수를 세고, 상기 1 차 활성화에 대해 기술된 바와 같이, 60 ng/ml IL-21 의 존재 하에 2 x 106 세포/ml 에서 재자극시켰다. 재자극한지 72 시간 후, 조건화된 배지 (CM2) 를 수합하였다. 니트 (neat) 및 1:10 희석 CM1 및 CM2 에서 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 존재 또는 부재를 실시예 5.1 에서 기술된 ELISA 포맷을 사용하여 평가하였다.
데이타는, CM1 배지, 즉, 1 차 활성화를 수행한 T 세포의 배지에서는 IL-17A 동종이량체 또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체가 거의 검출되지 않거나 또는 아예 검출되지 않았음을 나타내었다 (도 14A 및 14C). 반대로, 재자극된 T 세포 (CM2) 의 조건화된 배지는 IL-17A 및 IL-17F 동종이량체뿐만 아니라,IL-17A/IL-17F 이종이량체도 포함하였다 (도 14A, 14B, 및 14C). 상기 데이타는, IL-17 사이토카인의 "자연" 공급원인 T 세포가 IL-17A 및 IL-17F 의 동종이량체 및 이종이량체 둘 다를 발현함을 나타내었다. 상기 결과는 또한 IL-17F 에 대한 항체가 IL-17F 동종이량체 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체 둘 다를 인지하고 그 둘 다와 반응할 수 있고, 상기 항체가 IL-17F 동종이량체 및/또는 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 생물학적 활성을 고립시키고 억제시키는데 사용될 수 있음을 지시한다.
실시예 5.3 : T 세포로부터의 자연 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 면역침전
실시예 5.2 에서 기술된 바와 같이, IL-21 의 존재 하에 제 2 차 활성화를 수행하는 T 세포로부터 유래된 조건화된 배지 (CM2) 를 20 μg/ml 쥣과 항-인간 IL-17A-02 (Wyeth) 또는 쥣과 항-인간 IL-17F-01 (Wyeth) 단일클론 항체와 온화한 회전 하에 4℃ 에서 1 시간 동안 혼합하였다. 각각의 혼합물로부터의 항체 복합체를 50 μl 수화된 단백질 A-세파로스를 사용해 온화한 회전 하에 4℃ 에서 밤새 따로 면역침전시켰다. 다음, 이어서 면역침전된 펠렛을 PBS/1% Tween 20, PBS/0.1% Tween 20, 및 PBS/0.05% Tween 20 으로 세척하였다. 면역침전된 펠렛을 비환원 샘플 완충액에 재현탁시키고, 항-인간 IL-17A 비오틴 공액 (R&D, Minneapolis, MN) 또는 토끼 항-인간 IL-17F 항체 (Wyeth) 를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 위해 10% Tricine 젤에 로딩하였다.
IL-17F 동종이량체 (35 kDa) 를 쥣과 항-인간 IL-17F-01 항체를 사용하여 면역침전시키고, 500 μl 의 CM2 로부터의 토끼 항-인간 IL-17F 다클론 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출하였다. IL-17F/IL-17A 이종이량체 (32 kDa) 를 쥣과 항-인간 IL-17A-02 항체를 사용하여 면역침전시키고, 500 μl 의 CM2 로부터의 토끼 항-인간 IL-17F 다클론 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출하였다 (도 15). 단일클론 또는 다클론 항체 어느 것도 IL-17A 와 교차-반응하지 않았다 (데이타 제시안됨). 유사하게는, IL-17A 동종이량체 (31 kDa) 및 IL-17F/A 이종이량체를 쥣과 항-인간 IL-17A-02 항체를 사용해 면역침전시키고, 700 μl 의 CM2 의 다클론 염소 항-IL-17A 비오틴화 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출하였다. IL-17F/IL-17A 이종이량체를 쥣과 항-인간 IL-17F-01 항체를 사용해 면역침전시키고, 700 μl 의 CM2 로부터의 다클론 염소 항-IL-17A 비오틴화 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출하였다 (도 16). 다클론 항체는 높은 단백질 농도에서 IL-17F 동종이량체와 교차반응한다 (데이타 제시안됨).
대조군 (도 15 및 16 의 레인 2) 으로서, IL-17F 동종이량체를 His 태깅된 인간 IL-17F 를 과다발현하는 농축된 조건화된 배지로부터 정제하였다. 간략하게는, 농축된 조건화된 배지를 100 mM Tris pH 8/1M NaCl/10 mM 이미다졸로 1:1 희석시키고, Nickel-NTA Fast Flow 칼럼 (Qiagen, Valencia, CA) 에 로딩하였다. 동종이량체를 250 mM 이미다졸 완충액으로 단계 희석시켰다. 단백질을 PBS-NSO 에 대해 투석하였다. 다음, 동종이량체를 EK (엔테로키나아제) 를 사용해 실온에서 4 시간 동안 분해시켜서, His6 태그를 제거하였다. 분해된 단백질을 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 8/20 mM 이미다졸/300 mM NaCl 로 1:1 희석시키고, Nickel-NTA 칼럼 (Qiagen, Valencia, CA) 에 결합시켰다. <단백질 - (마이너스) 태그> 를 40 mM 이미다졸 완충액으로 용출하고, PBS NSO 에 대해 투석하였다. 대조군으로서 사용하기 위한 정제된 IL-17A 동종이량체 (도 15 의 레인 5) 를 R&D Systems (Minneapolis, MN) 에서 구입하였다.
실시예 5.4 : 트랜스펙션된 COS 세포로부터의 재조합 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체의 면역침전
재조합 인간 IL-17F 및 IL-17A 가 COS 세포에서의 발현 시 이종이량체를 형성하는지, 그리고 항-IL-17F 및 항-IL-17A 항체가 IL-17F/IL-17A 이종이량체를 면역침전시키고 검출할 수 있는지 알아보기 위해 실험을 수행하였다. COS 세포 배양물을 IL-17F cDNA, IL-17A cDNA, 또는 IL-17F 및 IL-17A cDNA 둘 다로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포 배양물이 생성 단백질(들) 을 배지 내로 분비하도록 놔두었다. IL-17F 또는 IL-17A 의 발현 또는 IL-17F 및 IL-17A 의 공동발현으로부터 유래된 조건화된 배지를 20 μg/ml 쥣과 항-인간 IL-17A-02 (Wyeth) 또는 쥣과 항-인간 IL-17F-01 (Wyeth) 단일클론 항체와 온화한 회전 하에 4℃ 에서 1 시간 동안 혼합하였다. 각각의 혼합물로부터의 항체 복합체를 50 μl-수화된 단백질 A-세파로스를 사용해 온화한 회전 하에 4℃ 에서 밤새 따로 면역침전시켰다. 다음, 면역침전된 펠렛을 PBS/1% Tween 20, PBS/0.1% Tween 20, 및 PBS/0.05% Tween 20 으로 연속해서 세척하였다. 면역침전된 펠렛을 비환원 샘플 완충액 중에서 재현탁시키고, 염소 항-인간 IL-17A (R&D, Minneapolis, MN) 또는 토끼 항-인간 IL-17F 항체 (Wyeth) 를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 위해 10% Tricine 젤에 로딩하였다.
IL-17F 동종이량체 (35 fcDa) 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체를 쥣과 항-인간 IL-17F-01 항체를 사용하여 면역침전시키고, 50 μl 의 CM2 로부터의 토끼 항-인간 IL-17F 다클론 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출하였다 (도 17A ; 각각 레인 3 및 4). IL-17F/IL-17A 이종이량체 (32 kDa) 를 또한 쥣과 항-인간 IL-17A-02 항체를 사용하여 면역침전시키고, 50 μl 의 CM2 의 토끼 항-인간 IL-17F 다클론 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출하였다 (도 17A; 레인 9). 도 17A 의 레인 8-10 에서 면역침전에 사용된 IL-17A 항체는 높은 단백질 농도에서 IL-17F 와 교차-반응하는 것으로 보였는데, 이는 IL-17F 동종이량체에 상응하는 밴드가 레인 10 에 있는 항-IL-17F 항체 프로브에 의해 검출되기 때문이다. 도 17B 에서 나타낸 바와 같이, IL-17A 동종이량체 (31 kDa) 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체를 쥣과 항-인간 IL-17A-02 항체를 사용해 면역침전시키고, 50 μl 의 CM2 로부터의 다클론 염소 항-인간 IL-17A 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출하였다 (도 17B; 각각 레인 3 및 4). 또한, IL-17F/IL-17A 이종이량체를 쥣과 항-인간 IL-17F-01 항체를 사용해 면역침전시키고, 50 μl 의 CM2 로부터의 다클론 염소 항-인간 IL-17A 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출하였다 (도 17B; 레인 6). 도 17A 에서 면역침전에 사용된 IL-17A 항체와는 달리, 도 17B 의 레인 5-7 에서 면역침전에 사용된 IL-17F 항체는 IL-17A 와 유의하게 교차-반응하지 않았는데, 이는 IL-17A 동종이량체에 상응하는 밴드가 레인 5 에 있는 항-IL-17A 항체 프로브에 의해 거의 검출되지 않기 때문이다.
대조군 (도 17A 의 레인 6-7) 으로서, IL-17F 동종이량체를 실시예 5.3 에서 기술된 바와 같이 정제하였다. 대조군 (도 17A 의 레인 5) 으로서 사용되는 정제된 IL-17A 동종이량체는 R&D 시스템 (Minneapolis, MN) 에서 구입되었다 대조군인 정제된 IL-17F 동종이량체는 조건화된 배지로부터 면역침전된 IL-17F 동종이량체보다 약간 더 빨리 이동한다. 이는, 글리코실화에서의 차이 및/또는 정제된 샘플 내 IL-17F 단백질 상에 에피토프 태그의 결여 때문인 것 같다.
실시예 5.5 : 재조합 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 정제
IL-17A/IL-17F 이종이량체의 2 가지 정제 방법을 본원에 제공한다. 제 1 방법에서, COS 세포를 His6-태깅된 IL-17F (SEQ ID NO:36) 및 비태깅된 IL-17A 로 공동트랜스펙션시켰다. 염화나트륨 및 이미다졸을 각각 최종 농도 500 mM 및 6 mM 로 되게 조건화된 배지에 첨가하였다. 다음, 조건화된 배지를 Nickel NTA 칼럼 (Qiagen, Valencia, CA) 에 로딩하였다. 따라서, His 태그를 함유하는 단지 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체만이 니켈 칼럼 상에서 캡처되었다. 다음, IL-17F 동종이량체 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체를 이미다졸 구배를 사용해 분리하고, IL-17F/IL-17A 이종이량체를 EK 로 분해하여, His6 태그를 제거하였다. 상기 단백질을 PBS 에 대해 투석하였다. IL-17F 및 IL-17A 단백질이 IL-17F/A 이종이량체 샘플에서 검출되었음을 증명하기 위해, Edman 서열화를 수행하였다. N-말단 서열 결과는, 이종이량체, 즉, IL-17F 에 대한 처음의 5 개의 아미노산의 존재가 RKIPK (SEQ ID NO:37) 인 것으로 보여졌고, IL-17A 에 대한 것은 IVKAG (SEQ ID NO:38) 인 것으로 보여졌음을 확인해주었다.
제 2 방법은 이중 칼럼 정제 도식을 사용하였는데, 이는 도 18 에 나타낸 유동 도식에 나타나 있다. 플래그-태깅된 인간 IL-17A (SEQ ID NO:39) 및 His6-태깅된 인간 IL-17F (SEQ ID NO:36) 를 별개의 2 개의 pSMED 벡터 (Wyeth) 에 클로닝하고, 리포펙션에 의해 HEK293 세포에서 공동발현시켰다. 간략하게는, 트랜스펙션하기 24 시간 전에 세포를 2 개의 175-cm2 플라스크에 심었다. 각각의 플라스크에 대해, 24 μg pSMED2/플래그-IL-17A + 24 μg pSMED2/His6-IL-17F 를 2 ml 혈청-없는 배지 중 120 μl TRANSIT® 시약-LTl (Minis, Madison, WI) 과 혼합하고, 세포 (90% 풍부), 및 10% 가열-비활성화된 태아 소 혈청을 함유하는 25 ml DMEM 배지를 함유하는 플라스크에 첨가하였다. 트랜스펙션-후 1 일째에, 배지를 제거하고, 세포를 1x 혈청-없는 배지로 헹구고, 새로운 혈청-없는 배지를 첨가하였다 (40 ml/플라스크). 조건화된 배지를 48 시간 후에 수합하고, 여과하여 (0.45 μ) 세포를 제거하고, -20℃ 에 보관하였다. 단백질 발현을 특이적 항체를 사용한 웨스턴 분석에 의해 확인하였다.
조건화된 배지는 4℃ 에서 2 시간 동안 항-플래그 M2 친화성 수지 (Sigma, St. Louis, MO) 에 배치-결합되었다. 결합된 단백질인 IL-17A 동종이량체 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체를 50 mM Tris pH 8/500 mM NaCl/200 μg/ml 플래그 펩티드 (Sigma, St. Louis, MO) 를 사용하여 용출하였다. 다음, 플래그 용출물을 4℃ 에서 밤새 Nickel-NTA 수지 (Qiagen, Valencia, CA) 에 배치-결합시켰다. 결합된 단백질인 IL-17F/IL-17A 이종이량체를 50 mM Tris pH 8/1 M NaCl/500 mM 이미다졸을 사용하여 용출하였다.
IL-17F 및 IL-17A 동종이량체가 실질적으로 없는 재조합 IL-17F/IL-17A 이종이량체의 정제 후에, 상기 이종이량체의 활성을 BJ 세포 배양 배지 내에서 GRO-α 수준을 자극시키는 이종이량체의 능력을 측정함으로써 BJ 세포 상에서 시험하였다. 따라서, BJ 배양물을 다양한 농도의 IL-17F 동종이량체, IL-17A 동종이량체, 또는 정제된 재조합 IL-17F/IL-17A 이종이량체로 자극시켰다. 24 시간 후, BJ 배양물로부터의 상청액을 수합하고, 시판의 ELISA 를 사용하여 GRO-α 농도를 측정하였다. 간략하게는, BJ 세포를 5 x 103 세포/웰로 편평-바닥 96-웰 플레이트에 심고, IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 또는 IL-17F/IL-17A 이종이량체를 함유하는 배지 15 μl 을 공급하였다. 다음, 플레이트를 37℃ 에서 16 - 24 시간 동안 인큐베이션시키고, 그런 후 상청액을 제거하고, GRO-α 에의 항체를 사용한 표준 샌드위치 ELISA 를 사용하여 GRO-α 의 농도를 측정하였다 (R & D Systems, Minneapolis, MN). 생성된 GRO-α 를 표준 커브를 기준으로 측정하였다. 결과를 도 19A 에 나타낸다. IL-17F 및 IL-17A 동종이량체 둘 다와 유사하게, IL-17A/IL-17F 이종이량체는 BJ 세포 내에서 IL-17 GRO-α 농도를 자극시킬 수 있다. 더욱이, 도 19B 에서 나타낸 바와 같이, 항-IL-17A 항체, 또는 항-IL-17F 항체와 병용된 항-IL-17A 로 BJ 배양물을 처리하면 GRO-a 수준을 자극시키는 IL-17F/IL-17A 이종이량체의 능력을 제거하였다.
실시예 5.6 : IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 질량 분석
2 개의 IL-17 단량체 사이의 이황화 결합의 직접적인 증거를 제공하기 위해, 이황화 결합의 존재를 증명하고, 분자내 이황화 결합 펩티드 (IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체) 를 탠덤 질량 분석계 분석에 의해 규명하였다. 트립틱 절단 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (rpHPLC) 를 사용하여 이황화 결합 펩티드를 단리하고, 그런 다음 나노LC-MS/MS 에 의해 분석하였다. 간략하게는, 1-2 μg 의 정제된, 비환원된 재조합 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체 및 IL-17A/IL-17F 이종이량체를 10% Bis-Tris 겔 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 상에서 진행시키고, IMPERIAL™ 단백질 염색 용액 (Pierce, Rockford, IL) 으로 염색시켰다. 질량 분석계 분석을 위해 양성으로 염색된 밴드를 절단하고, 수동으로 트립신 분해 (Promega, Madison, WI) 시켰다. 분해를 위해, 절단된 젤 조각을 아세토니트릴 (ACN) 중에서 탈수시키고, 재수화시키고, 25 mM 나트륨 포스페이트 완충액 (pH 6.0) 중에서 세척하고, 다시 ACN 중에서 탈수시켰다. 프로테아제 트립신 (25 mM 나트륨 포스페이트 완충액 중에 용해된 0.5 μg 의 트립신) 을 첨가하고, 재수화에 의해 젤 조각 내로 들어가게 하고, 37℃ 에서 4 시간 동안 인큐베이션시켰다. 생성 펩티드를, 추가로 60% ACN/1% 포름산 (FA) 및 90% ACN/5% FA 의 분획을 사용하여 3 번의 연속 세척으로 젤로부터 추출하였다. 상기 추출물을 조합하고, 증발시키고, 최종 샘플을 2% ACN 및 0.1% FA 중에서 재구성하였다.
소화된 샘플을 Magic C18 비드 (5 μm, 75 μm x 11 cm, Michrom BioResources, Auburn, CA) 가 꾸려진 C18 PICOFRIT® 미세관 칼럼 (New Objective, Woburn, MA) 상에 가압-하중시켰다. 다음, 상기 칼럼을 선형 이온 트랩 질량 분석계 (LTQ, ThermoFinnigan, San Jose, CA) 에 연결하였다. HPLC 구배는 개질제로서 용매 B (용매 A, 2% ACN 및 0.1% FA; 용매 B, 90% ACN 및 0.1% FA) 를 사용하여 250 nl/분의 유속으로 70 분에 걸쳐 4 - 60% ACN 에서 선형으로 증가하였다. 탠덤 질량분석 모드 (MS/MS 라고 함) 에서 LTQ 를 사용하여 질량 스펙트럼을 수합하고, 여기서 각각의 MS 획득은 이전의 MS 스펙트럼에서 처음의 6 개의 가장 집중적인 펩티드 이온의 6 가지의 MS/MS 획득에 의해 이어졌다. 일부 경우에, MS/MS 획득은 이전의 MS/MS 획득의 처음의 2 개의 가장 집중적인 펩티드 이온의 2 가지 MS/MS/MS 획득에 의해 이어졌다. 펩티드 질량을 375 내지 1500 범위의 m/z (질량-대-전하 비율) 을 스캐닝함으로서 기록하였다. 제조업자에 의해 공급된 획득 소프트웨어에서의 동적 배제를, 또한 분석되는 흥미로운 펩티드 이온의 수를 증가시키기 위해 적용하였다. MS/MS 데이타를 매뉴얼로 해석하였다.
MS 수준에서, 펩티드 절편 (IL-17A 동종이량체에 대해서는 [M+3H]3+=919.7 ; IL-17F 동종이량체에 대해서는 [M+3H]3+=1196.9 ; IL-17F/IL-17A 이종이량체에 대해서는 [M+3H]3+=1138.1 또는 807.9) 의 관찰된 m/z 는 계산된 후보 이황화 결합 펩티드와 일치하였다. 추가로, 상기 표적화된 질량의 MS/MS 데이타에 따른 펩티드 서열을 수득하고, 이것들이 도 20 에서 나타낸 바와 같은 이황화 결합 형성을 위한 IL-17A 및/또는 IL-17F 유래의 기대된 시스테인(C)-함유 펩티드였음을 확인하였다. 또한, MS/MS 수준에서 불량한 절편화로 인한 IL-17A 동종이량체 펩티드 ([M+3H]3+=907.7 및 [M+3H]3+=843.3) 에 대해 MS3 데이타를 수득하였다. 이는 IL-17A 동종이량체, IL-17F 동종이량체, 및 IL-17F/IL-17A 이종이량체가 이황화 결합을 통해 이량체로서 존재한다는 것을 말한다. 결론적으로, 2 개의 동종이량체 및 이종이량체의 이황화 결합 패턴을 분석하였고, 이는 각각의 단량체 사이의 C1 및 C4 와 일치하였다. 상기 연구에 유사한 접근을 사용하여, 분자내 이황화 결합 형성에 대한 기타 시스테인 (C2/C3 및 C5/C6) 의 관여를 기술한다.
실시예 6 : 인간 IL-17F 에 대한 항체는 영장류 IL-17F 생물활성을 억제시킴.
항-IL-17F 항체가 영장류 IL-17F 와 교차-반응할 수 있는지 알아보기 위해, 다양한 농도의 짧은꼬리원숭이 IL-17F 조건화된 배지 또는 정제된 인간 IL-17F 를 사용하여 100 μg/ml 항-IL-17F-01 또는 항-IL-17F-07 항체의 존재 또는 부재 하에 BJ 세포를 자극하였다. 본 실험에 사용되는 짧은꼬리원숭이 IL-17F 조건화된 배지는 HEK293 세포에서 pCRII 에 서브클로닝된 짧은꼬리원숭이 IL-17F cDNA (SEQ ID NO:40) 를 발현시키고, 짧은꼬리원숭이 IL-17F 동종이량체를 함유하는 조건화된 배지를 수합함으로써 생성되었다. 인간 또는 짧은꼬리원숭이 IL-17F 로 처리한지 16 - 24 시간 후에, 처리된 배양물로부터 수합된 상청액의 GRO-α 농도를 실시예 5.5 에서 기술된 바와 같이 시판의 ELISA (R&D, Minneapolis, MN) 를 사용하여 측정하였다. GRO-α 의 농도를 표준 커브를 기준으로 측정하였다.
도 21 은 짧은꼬리원숭이 IL-17F 조건화된 배지 또는 인간 IL-17F 단백질로 접종된 BJ 세포에 의한 증가된 GRO-α 생성을 보여준다. 이전에 기술된 바와 같이 (도 2 및 도 8 참조), 인간 IL-17F 는 GRO-α 수준을 자극하고, 이러한 자극은 항-IL-17F-01 및 항-IL-17F-07 항체 둘 다에 의해 억제된다 (도 21A). 도 21B 에서 나타낸 바와 같이, 짧은꼬리원숭이 IL-17F 는 또한 BJ 세포에서 GRO-α 의 생성을 자극한다. 항-IL-17F-01 및 항-IL-17F-07 항체 둘 다 GRO-α 사이토카인 수준을 자극시키는 짧은꼬리원숭이 IL-17F 조건화된 배지의 능력을 억제시킬 수 있다. 따라서, 인간 IL-17F 에 대한 안타고니스트 항체는 영장류 IL-17F 생물활성을 억제시키기 위해 영장류 IL-17F 와 교차-반응할 수 있다.
실시예 7 : 인간 연골 세포에서 아그레카나제 1 수준의 IL-17F 자극은 IL-17F 항체로 공동처리함으로써 감소됨.
IL-17F 가 예를 들어, 류마티스 관절염을 수반하는 염증 반응에 관여할 수 있는지 알아보기 위해, 비관절염성 인간 연골을 National Diseases Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) 로부터 수득하고, 연골 세포를 프로나제 (1 mg/ml, 37℃ 에서 30 분) 및 콜라게나제 P (1 mg/ml, 37℃ 에서 밤새) 의 단계 효소 분해에 의해 사후 48 시간 내에 단리하였다. 단리 시, 세포를, 10% 태아 소 혈청 (FBS) 을 함유하는 2 μM L-글루타민, 및 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신이 있는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)/F-12 배지에서 재현탁시켰다. 세포를 1 x 106 세포/웰로 24-웰 플레이트에 심었다. 배지를 72 시간 후에 혈청-없는 배지로 교환하고, 연골 세포를 항-IL-17F-07 또는 그의 아이소타입 대조군 (IgG) 의 존재 또는 부재 하에 37℃ 에서 6 시간 동안 인간 IL-17F 로 자극시켰다. 세포를 즉시 β-머캅토에탄올이 있는 RLT 완충액 (Qiagen, Valencia, CA, RNEASY® Kit) 중에서 수합하고, RNA 단리에 준비될 때까지 -80℃ 에 보관하였다. RNA 를 RNEASY® 미니 키트를 사용하여 제조하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 실온에서 15 분 동안 RNEASY® 칼럼 상에서 DNase 처리를 수행하였다. ADAMTS-4 (아그레카나제-1) mRNA 발현 수준을 TAQMAN® PCR 분석 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 에 의해 모니터링하였다. 간략하게는, 단리된 RNA 100 ng 을 Applied Biosystems 로부터 수득된 ADAMTS-4 프로브/프라이머를 사용한 QPCR 반응에 사용하였다. ADAMTS-4 의 발현을 각 샘플에 대해 GAPDH (10 ng 의 단리된 RNA 가 Applied Biosystems 로부터 수득된 GAPDH 프라이머와 함께 사용됨) 의 발현에 대해 정상화시켰다. 상이한 조직의 풀 (pool) 로 이루어진 Universal Reference Total RNA (Clontech, Palo Alto, CA) 0.16 ng 내지 100 ng 을 사용하여 샘플 외삽을 위한 표준 커브를 제조하였다.
TAQMAN® 단위로서 존재하는 결과를 도 22 에 나타내었다. 따라서, IL-17F 처리는 인간 연골 세포에서의 아그레카나제 1 의 발현을 증가시키고, 항-IL-17F-07 항체로의 처리는 이 자극을 없앤다. 상기 데이타는, 염증 및 관절 분해에의 IL-17F 관여가 자가면역 관절염, 예를 들어, 반응성 및 류마티스 관절염 동안에 발생하기 때문에, 항-IL-17F 항체로의 처리에 의해 완화될 수 있다고 제안한다.
실시예 8 : BJ 세포에서 수용체 IL-17R 및 IL-17RC 의 siRNA 녹다운에 의한 IL-17F 및 IL-17A 생물활성의 조절
IL-17R 및/또는 IL-17RC 전사체의 수준의 감소가 IL-17F 및/또는 IL-17A 의 생물활성을 감소시키는지 알아보기 위해 실험을 디자인하였다. 트랜스펙션 24 시간 전에 BJ 세포를 9x103 세포/100 μl 배지/웰로 96-웰 플레이트에 심었다. 세포를 0.3 μl/웰에서 DHARMAFECI® 1 (Dharmacon, Lafayette, CO) 을 사용하여, 화학적으로 합성된 RNAi 시약 (Dharmacon, Lafayette, CO), 및 10 nM 이하에서 개별 또는 풀링된 siRNA 로 트랜스펙션시켰다 (SEQ JD NO :17-32 를 참조). siRNA 트랜스펙션 후, 세포를 트랜스펙션 복합체로 18 시간 동안 인큐베이션시켰다. 다음, 트랜스펙션 배지를 통상의 배양 배지로 대체하고, 추가의 6 시간 동안 인큐베이션시켰다. 다음, 통상의 배양 배지를 1 ng/ml 에서 IL-17A 또는 50 ng/ml 에서 IL-17F 를 함유하는 150 μl 의 배양 배지로 대체하였다. 지정된 사이토카인으로 인큐베이션시킨 지 16 시간 후에, IL-6, IL-8, 및 GRO-α 의 수준을 유도하는 IL-17F 및/또는 IL-17A 의 능력을 표준 샌드위치 ELISA 에 의해 분석하기 위해 배양 상청액을 수합하였다 (도 2 참조). hGRO-α, hIL-6 및 hIL-8 에 대한 매치하는 항체 쌍을 R&D Systems (Minneapolis, MN) 로부터 구입하였다.
siRNA 처리 후의 IL-17R 및 IL-17RC 수용체 수준의 감소를 측정하기 위해, TURBOCAPTURE® mRNA 키트 (Qiagen, Valencia, CA) 를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 BJ 섬유아세포로부터 mRNA 를 단리하였다. 1-단계 RT qPCR MASTERMIX PLUS® (Eurogentec, San Diego, CA) TAQMAN® (Applied Biosystems) 프로토콜을 사용함으로써, 샘플 당 10 μl mRNA 가 ABI PRISM® 7700 DNA 서열 검출기 (Applied Biosystems) 상에서 수행되는 25 μl TAQMAN® PCR 반응에 사용되었다. TAQMAN® PCR 의 조건은 하기와 같았다 : MICROAMP OPTICAL® 캡이 씌워진 MICROAMP OPTICAL® (Applied Biosystems) 96-웰 플레이트 상에서, 48℃ 에서 30 분, 95℃ 에서 10 분, 그런 다음 사이클 당 95℃ 에서 15 초 동안 40 사이클 및 60℃ 에서 1 분. 각각의 플레이트에는 각 반응 혼합물에 대해 테스트 cDNA 주형 또는 비-주형 대조군이 3 벌로 함유되어 있었다. 각각의 마우스 유전자에 대한 발현을 인간 β2 마이크로글로불린 유전자발현에 대해 정상화하였다. IL-17R 및 IL-17R 에 대한 TAQMAN® 유전자발현 어세이 프로브-프라이머 세트를 Applied Biosystems 에서 구입하였다.
도 23 에서 나타낸 결과는 BJ 배양의 siRNA 처리 후의 GRO-α 수준 (β2-마이크로글로불린에 대해 정상화됨) 에서의 % 감소를 나타낸다. BJ 배양물의 siRNA 처리는 IL-17R 및 IL-17RC 전사체 수준을 약 80% 까지 감소시켰다 (도 23A 및 도 23B - "Taqman"). IL-17R 및 IL-17RC 수준 둘다가 감소된 것이 GRO-α 수준을 자극하는 IL-17A 및 IL-17F 의 능력을 감소시키는 한편 (도 23A 및 도 23B), IL-17RC 수준의 감소 (도 23B) 는 IL-17A 및 IL-17F 생물활성 둘 다에 대해 IL-17R 수준 (도 23A) 의 감소보다 더욱 현저한 효과를 가졌다. 흥미롭게도, IL-17RC 의 감소는 GRO-α 수준을 자극하는 IL-17A 의 능력에 더 큰 영향을 미쳤다 (도 23B). IL-17R 및 IL-17RC 를 표적으로 하는 siRNA 의 바람직한 실시예는 도 23C 에 개시되어 있다 (또한 SEQ ID NO:17-32 참조). 상기 데이타는, IL-17A 및 IL-17F 둘 다 IL-17R 및 IL-17RC 를 통해 신호전달하고, IL-17RC 는 GRO-α 자극과 관련된 두 분자에 대한 바람직한 수용체일 수 있음을 제안한다.
실시예 9 : IL-17A 및 IL-17F 는 건선, 크론병, 및 궤양성 대장염을 가진 인간 환자의 고통받은 조직에서 상향조절됨.
건선 조직 생검 샘플을 Wyeth-스폰서드 임상 연구 #3067K6-207 (활성 건선 환자에서의 재조합 인간 인터루킨 11 인 rhIL-11 의 무작위, 이중-맹검, 플라세보-조절된, 탐구적인 질환관련 유전체 연구) 에 등록된 환자로부터 수합하였다. 48 명의 환자로부터의 기준선 (비지트 (visit) 2) 건선 병변 및 비병변 피부 생검을 수합 후에 바로 액체 질소에서 플래쉬 냉동시키고, Wyeth Clinical Pharmacogenomics Laboratory in Andover, MA 에 이송하였다.
크론병 샘플을 Wyeth-스폰서드 임상 연구 #3067K6-204 (활성 크론병 환자의 치료를 위한 재조합 인간 인터루킨 11 (RhIL-11) 의 경구 투여에 대한 복합중심, 무작위, 이중-맹검, 플라세보-조절된, 안정성 및 탐구적인 질환관련 유전체 연구) 에 등록된 환자로부터 수합하고, 궤양성 대장염 샘플을 임상 연구 #3067K5-114 (경미한 내지 온건한 좌측 궤양성 대장염 환자의 치료를 위한 재조합 인간 인터루킨 11 (RhIL-11) 의 경구 투여에 대한 복합중심, 무작위, 이중-맹검, 플라세보-조절된, 투여량-상승적, 안정성 및 탐구적인 질환관련 유전체 연구) 에 등록한 환자로부터 수합하였다. 기준선 (비지트 2) 은 #3067K6-204 환자 (16 명의 환자) 로부터의 관여 및 비관여 조직 생검과 쌍을 이루고, 기준선 (비지트 1) 은 #3067K5-114 환자 (12 명의 환자) 로부터의 S 자 결장 및 좌 결장의 동일한 해부학적 영역으로부터의 조직 생검과 쌍을 이루고, 이 조직 생검들을 수합 후 바로 액체 질소 내에서 플래쉬 동결시키고, Wyeth Clinical Pharmacogenomics Laboratory in Andover, MA 에 이송하였다.
조직을 폴리트론을 사용하여 균질화시키고, RNA 를 RNEASY® 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA) 를 사용하여 파쇄물의 상청액으로부터 단리시키고, DNase (Qiagen RNase-free DNase Kit) 로 처리하였다. DNase-처리된 RNA 제제를 Phase Lock Gel 칼럼 (Brinkman, Westbury NY) 을 사용하여 추가로 정제하고, 페놀:클로로포름:IAA (이소아밀 알콜) 로 추출하고 (Ambion, Austin, TX), RNEASY® 미니 칼럼을 사용하여 농축시켰다. SPECTRAMAX® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 를 사용하여 RNA 를 정량화하고, RNA 양을 Agilent Bioanalyzer 겔 (Model 2100; Agilent Technologies, Palo Alto, CA) 에 의해 평가하였다. 상기 제제로부터의 총 RNA 2 μg 을, 제조업자의 지시에 따라 Applied Biosystems High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) 를 사용하여 cDNA 로 전환시켰다. 완료된 반응물을 함유하는 플레이트를 -2O℃ (단기 보관) 또는 -8O℃ (장기 보관) 의 온도에서 보관하였다.
Applied Biosystem's Assays-on-Demand (AOD) 유전자-특이적 프라이머-프로브쌍을 미리입증하고, QC 테스트하고, 임의의 ABI PRISM® 서열 검출 시스템 상에서의 사용을 위해 최적화시켰다 (모두 Applied Biosystems 로부터 구매). 제조업자의 AOD 프로토콜에 따라, 마스터 믹스를 IL-17F 또는 IL-17A 프라이머를 함유하는 TAQM AN® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) 를 사용하여 제조하고, 50 μl/웰의 최종 부피로 96-웰 플레이트에 분획하였다. 단계 희석된 표준 및 cDNA 샘플 (50 ng/웰) 에 대한 2 벌의 웰을 50℃ 에서 2 분, 95℃ 에서 10 분, 95℃ 에서 15 초 (40 사이클), 및 60℃ 에서 1 분 확장의 전반적인 열 순환 조건을 사용하여, ABI PRISM® 7700 서열 검출기 (서열 검출기 소프트웨어 vl.7) 상에서 검출하였다.
IL-17F 및 IL-17A 의 RNA 전사체 수준의 상대적인 정량화를 ABI PRISM® 7700 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems) 에 대해 기술된 제조업자의 가이드라인에 따라 수행하였다. 구체적으로는, 표준 커브를 표적 표준 및 내인성 대조군에 대해 계산하고, 표준 커브의 기울기 및 y-인터셉트를 사용하여 표적 및 내인성 대조군에 대해 측정된 값을 입력하고, 표적 입력 값을 내인성 대조군에 대해 정상화시켰다. IL-17F 및 IL-17A 발현의 폴드-체인지를 칼리브레이터로서 50 ng 표준을 사용하여 계산하고, 샘플의 상대적인 농도를, 폴드-체인지를 칼리브레이터로 곱해서 수득하고, 이를 평균내었다.
표준 커브 방법을 사용하기 위해, 조직이 TAQMAN® AOD (Applied Biosystems) 을 사용하는 표적 유전자를 발현하는 것으로 경험상 결정하였다. 10 개 초과의 후보 표적-양성 조직으로부터의 총 RNA 를 Wyeth (Cambridge/Andover) 및 외부 매각인으로부터 수득하였다. 단일 RNA 제제로부터의 다수의 2 μg 분획을 cDNA (상기 기술됨) 로 전환시키고, 풀링하고, -80℃ 에서 분획으로서 보관하고, TAQMAN® (Applied Biosystems) 에 의해 표적 유전자의 발현에 대해 어세이하였다. ≥ 35 의 순환 역치 (Ct) 값을 검출의 한계 미만으로 간주하였다. 표준 커브 발달에서, 목표는 cDNA 100 ng 에 대해 18 내지 25 사이의 Ct 값을 달성하는 것이었고 ; 이는 적절한 표준 커브 역동 범위에 대해 허용하였다. 상기 요건을 충족시키는 양성 대조군 조직의 제제를 사용하여 각 어세이에 대한 표준 커브를 생성하였다. 표준 커브는 100 ng/웰 내지 1.5 ng/웰의 총 cDNA 의 2-배 단계 희석액으로 이루어졌다. 각 어세이에 대해 각각의 플레이트 상에서 표준 커브를 수행하고, 표준 커브를 샘플 정량화 및 어세이 성능 모니터링에 사용하였다. 96-웰 플레이트 공간 제한으로 인해, 25 ng 및 3 ng 의 표준 커브 희석점을 샘플을 진행시킬 때 생략하였다. 내부-플레이트 % CV 는 건선 샘플에 대해서는 < 3% 였고, 크론병 및 궤양성 대장염 샘플에 대해서는 < 5% 였다.
모든 샘플 (즉, 처리 및 비처리, 병변 및 비병변 등) 에서 유사한 수준으로 발현되는 유전자를 상대적인 표준 커브 방법에서 내인성 대조군으로 작용하는 것으로 선택하였다. 후보 내인성 대조군의 목록으로부터, ZNF 592 (GenBank Accession No. NM_014630) 라고 하는 유전자는 허용가능한 표준 커브를 생성하였고, 병변 및 비병변 조직, 및 관여 및 비관여 조직에서 유의하게 다양하지 않았음을 결정하였다 (건선에 대해서는 p<0.05 및 크론병 및 궤양성 대장염 샘플에 대해서는 p<0.09). 모든 연구 샘플을 상대적인 농도 값을 결정하는데 있어서 ZNF592 수준으로 정상화시켰다.
페어드 스튜던트 t-테스트 (paired Student's t-test) (각각의 환자로부터의 병변 및 비병변 샘플, 또는 관여 및 비관여 조직이 쌍을 이룸) 를 사용하여, IL-17F 및 IL-17A 발현 수준 및 병변 (건선) 또는 염증 표현형 (크론병 또는 궤양성 대장염) 사이의 관계의 유의성을 평가하였다. 비병변 상대적인 농도값으로 나누어서 건선 연구에 대한 폴드-체인지를 병변 상대적인 농도값을 계산하였다. 비관여 상대적인 농도값으로 나누어서 크론병 및 궤양성 대장염 (IBD) 연구에 대한 폴드-체인지를 관여 상대적인 농도값을 수득하였다. 요약의 폴드-체인지를 IL-17A 수준의 IL-17F 에 대해 모든 환자로부터의 폴드-체인지를 평균내어서 계산하였다.
상기 연구의 결과를 도 24 및 도 25 에 나타내었다. 도 24 에서 나타낸 바와 같이, IL-17F 및 IL-17A 발현 수준 둘 다는 고통받는 환자의 병변 조직에서 유의하게 증가하였고, 이는 IL-17F 및 IL-17A 가 생체 내에서 건선에 관여하고 있음을 나타낸다. 도 25 에서 나타낸 바와 같이, IL-17A 및 IL-17F 둘 다는 크론병으로 고통받는 환자의 관여 조직에서 증가되었고, 뿐만 아니라 궤양성 대장염으로 고통받는 환자의 관여 조직에서도 증가되었다. 크론병 및 궤양성 대장염 환자 사이의 상당한 이종성은 상대적으로 소분자 크기와 결합하고, 관여 표현형을 가진 IL-17A 및 IL-17F 의 통계학적으로 유의한 관계를 규명하는데 대해 완화시켰다. 그러나, 클러스터링 툴은 IL-17A 및 IL-17F 둘 다가 크론병 샘플 세트에서 관여 표현형과 상호연관되어 있음을 보여주었다 (r=0.65) (데이타 제시 안됨). 상기 데이타는, 관여 조직에서의 증가된 수준의 IL-17A 및 IL-17F 가 생체 내에서 IBD 와 연관된 염증 조건에서 역할을 할 수 있음을 제안한다.
실시예 10 : 오브알부민 면역화된 마우스로부터의 LN 세포는 IL-17F 를 생성함.
8-주령 C57BL/6 마우스를 완전 프로인트 보조제 중에서 에멀젼화된 100 μg 오브알부민 단백질로 옆구리에 면역시켰다. 7 일 후에, 서혜부 림프절을 수합하였다. 림프절을 분해하고, 상기 세포를 50 ng 포르볼 에스테르 12-테트라데카노일포르볼-13 아세테이트, 1 μg/ml 이오노마이신, 및 1 μg/ml GOLGDPLUG™ 로 12 시간 동안 재자극시켰다. 다음, 상기 세포를 수합하고, 항-마우스 CD4 PerCP Cy5.5 (Pharmagen, San Diego, CA) 를 사용하여 표면 CD4 에 대해 염색하였다. 세포를 고정하고, CYTOFIX/CYTOPERM™ (BD Biosciences, San. Diego, CA) 로 침투시킨 후, 상기 세포를 4 μg/ml 래트 IgG1 ALEXA FLUOR® 647 컨쥬게이트 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 또는 4 μg/ml 래트 항-IL-17F (클론 15-1) ALEXA FLUOR® 647 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 로 30 분 동안 염색시켰다. 다음, 세포를 PERM/WASH™ (BD Biosciences, San. Diego, CA) 로 2 회 세척하고, FACSCALD3UR™ (BD Biosciences, San. Diego, CA) 을 사용하여 분석하였다. 래트 항-IL-17F (클론 15-1) ALEXA FLUOR® 647 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 Invitrogen 사의 ALEXA FLUOR® 647 공액 키트를 사용하여 제조하였다. 그 결과를 도 26 에 나타내었다. 따라서, 오브알부민-면역된 마우스의 림프절로부터의 생체 내 CD4+ T 세포는 IL-17F 단백질을 생성한다.
실시예 11 : 결론 및 토의
여러 발견 중에서도, 상기 데이타는 IL-21 및 IL-23 이 TCR/CD28 공동자극 시 IL-17A 및 IL-17F 를 유도하고, IL-23 및 IL-21 이 IL-17A 및 IL-17F 생성에 대한 공동자극과 함께 상승효과를 가짐을 나타낸다. IL-23 및 IL-21 은 둘 다 IL-17 유도에 동일하게 효과적이다. 상기 데이타는, IL-17A, 및 특히 IL-17F (IL-17A 에 비해 10 - 20 배 더 높은 수준으로 생성되기 때문) 가 IL-21 에 부여되는 전염증성 효과의 일부를 매개할 수 있고, IL-17F (IL-17F 동종이량체 또는 IL-17F 이종이량체) 의 억제가 IL-21 신호전달을 차단하는 유사한 치료 효과를 가질 수 있음을 제시한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 제 60/599,086호 및 제 60/639,176 호 참조). IL-17F 신호전달 및 IL-21 신호전달의 효과 사이의 유사성은, IL-17F 신호전달의 억제가 IL-21 신호전달을 억제하는 치료적으로 가치있는 것일 수 있다는 강한 결론을 초래한다. 추가로, 상기 결과는 우선, T 세포가 IL-17A/IL-17F 이종이량체, 뿐만 아니라 IL-17A 및 IL-17F 동종이량체를 발현함을 보여주고 ; 상기 결과는 또한 상기 사이토카인이 자연 및 재조합 형태로 단리되고 정제될 수 있음을 보여준다. 본원에 제시된 데이타는 또한 항-IL-17F 항체, IL-17F 로 이루어진 융합 단백질, 및 siRNA 표적화 IL-17R 및 IL-17RC 이 IL-17F 생물활성을 감소시킴을 보여준다. 추가로, 상기 결과는, IL-17F 처리가 인간 연골 세포에서 아그레카나제 발현을 증가시키고, 이는 항-IL-17F 항체에 의해 감소될 수 있고, IL-17F 및 IL-17A 가 인간 생검으로부터의 IBD 에 관여하는 조직 및 건선 병변에서 상승되어 있음을 보여준다.
IL-17A 및 IL-17F 는 활성화된 T 세포에 의해 생성되는 신규 전염증성 사이토카인이다. 상기 사이토카인은 시스테인 노트 모티프의 구조적 특징을 보여주는 보존된 시스테인을 포함하여, 고도의 아미노산 동일성을 공유한다. 두 사이토카인 모두 수용체 사슬을 공유하고, 유사한 생물학적 기능을 나타낸다고 제안되어 왔다. IL-17 사이토카인 패밀리의 원은 류마티스 관절염, 염증성 장 장애 (IBD) 및 천식과 같은 비정상적인 면역 반응에 의해 매개되는 질환에 관련되어 왔다. 상기 열거된 유사성으로 인해, 활성화 시 인간 T 세포에 의해 생성되는 IL-17A 및 IL-17F 를 특징지었다. CD4+ T 세포는 CD28 공동자극, γ-공통 사이토카인 (IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, IL-21) 또는 IL-23 의 존재 또는 부재 하에 항-CD3 로 활성화되었다. IL-17A 및 IL-17F 의 최적의 생성은 TCR 뿐만 아니라, CD28 공동자극을 필요로 하였다. 추가로, CD28 및 IL-21 는 IL-17A 및 IL-17F 생성에 있어서 상승적으로 작용하고, 이는 IL-17A 및 IL-17F 가 IL-21 신호전달에 기여하는 전염증성 효과를 매개할 수 있음을 제안한다. 모든 활성화 조건 하에, IL-17F 의 단백질 수준은 IL-17A 에 대해 수득된 것보다 10 - 20 배 초과였다. 흥미롭게도, IL-17A 동종이량체 및 IL-17F 동종이량체 외에도, T 세포는 또한 IL-17A/IL-17F 이종이량체를 생성하였다. 이러한 발견은, 상기 사이토카인의 복합 형태가 생체 내에서 존재하고, 각각의 형태가 구분되는 생물학적 기능을 설명하는데, 예를 들어, IL-17A/IL-17F 이종이량체는 염증 질환의 치료에서 새로운 사이토카인 표적을 구성할 수 있다고 제안한다.
<110> Wyeth <120> INTERLEUKIN-17F ANTIBODIES AND OTHER IL-17F SIGNALING ANTAGONISTS AND USES THEREFOR <130> 01997.039301 <150> 60/653,260 <151> 2005-02-14 <150> 60/667,492 <151> 2005-04-01 <160> 40 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 492 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(489) <400> 1 atg aca gtg aag acc ctg cat ggc cca gcc atg gtc aag tac ttg ctg 48 Met Thr Val Lys Thr Leu His Gly Pro Ala Met Val Lys Tyr Leu Leu 1 5 10 15 ctg tcg ata ttg ggg ctt gcc ttt ctg agt gag gcg gca gct cgg aaa 96 Leu Ser Ile Leu Gly Leu Ala Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ala Arg Lys 20 25 30 atc ccc aaa gta gga cat act ttt ttc caa aag cct gag agt tgc ccg 144 Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser Cys Pro 35 40 45 cct gtg cca gga ggt agt atg aag ctt gac att ggc atc atc aat gaa 192 Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile Asn Glu 50 55 60 aac cag cgc gtt tcc atg tca cgt aac atc gag agc cgc tcc acc tcc 240 Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Arg Ser 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Val Gly Cys 130 135 140 acc tgt gtc acc ccg att gtc cac cat gtg gcc ta agagctctgg 530 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 145 150 155 ggagcccaca ctccccaaag cagttagact atggagagcc gacccagccc ctcaggaacc 590 ctcatccttc aaagacagcc tcatttcgga ctaaactcat tagagttctt aaggcagttt 650 gtccaattaa agcttcagag gtaacacttg gccaagatat gagatctgaa ttacctttcc 710 ctctttccaa gaaggaaggt ttgactgagt accaatttgc ttcttgttta cttttttaag 770 ggctttaagt tatttatgta tttaatatgc cctgagataa ctttggggta taagattcca 830 ttttaatgaa ttacctactt tattttgttt gtctttttaa agaagataag attctgggct 890 tgggaatttt attatttaaa aggtaaaacc tgtatttatt tgagctattt aaggatctat 950 ttatgtttaa gtatttagaa aaaggtgaaa aagcactatt atcagttctg cctaggtaaa 1010 tgtaagatag aattaaatgg cagtgcaaaa tttctgagtc tttacaacat acggatatag 1070 tatttcctcc tctttgtttt taaaagttat aacatggctg aaaagaaaga ttaaacctac 1130 tttcatatgt attaatttaa attttgcaat ttgttgaggt tttacaagag atacagcaag 1190 tctaactctc tgttccatta aacccttata ataaaatcct tctgtaataa taaagtttca 1250 aaagaaaatg 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Met His His 240 245 250 ata cct gcg ccc aga cca gaa gag ttc cac cag cga tcc aac gtc aca 934 Ile Pro Ala Pro Arg Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr 255 260 265 ctc act cta cgc aac ctt aaa ggg tgc tgt cgc cac caa gtg cag atc 982 Leu Thr Leu Arg Asn Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile 270 275 280 cag ccc ttc ttc agc agc tgc ctc aat gac tgc ctc aga cac tcc gcg 1030 Gln Pro Phe Phe Ser Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala 285 290 295 act gtt tcc tgc cca gaa atg cca gac act cca gaa cca att ccg gac 1078 Thr Val Ser Cys Pro Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp 300 305 310 315 tac atg ccc ctg tgg gtg tac tgg ttc atc acg ggc atc tcc atc ctg 1126 Tyr Met Pro Leu Trp Val Tyr Trp Phe Ile Thr Gly Ile Ser Ile Leu 320 325 330 ctg gtg ggc tcc gtc atc ctg ctc atc gtc tgc atg acc tgg agg cta 1174 Leu Val Gly Ser Val Ile Leu Leu Ile Val Cys Met Thr Trp Arg Leu 335 340 345 gct ggg cct gga agt gaa aaa tac agt gat gac acc aaa tac acc gat 1222 Ala Gly Pro Gly Ser Glu Lys Tyr Ser Asp Asp Thr Lys Tyr Thr Asp 350 355 360 ggc ctg cct gcg gct gac ctg atc ccc cca ccg ctg aag ccc agg aag 1270 Gly Leu Pro Ala Ala Asp Leu Ile Pro Pro Pro Leu Lys Pro Arg Lys 365 370 375 gtc tgg atc atc tac tca gcc gac cac ccc ctc tac gtg gac gtg gtc 1318 Val Trp Ile Ile Tyr Ser Ala Asp His Pro Leu Tyr Val Asp Val Val 380 385 390 395 ctg aaa ttc gcc cag ttc ctg ctc acc gcc tgc ggc acg gaa gtg gcc 1366 Leu Lys Phe Ala Gln Phe Leu Leu Thr Ala Cys Gly Thr Glu Val Ala 400 405 410 ctg gac ctg ctg gaa gag cag gcc atc tcg gag gca gga gtc atg acc 1414 Leu Asp Leu Leu Glu Glu Gln Ala Ile Ser Glu Ala Gly Val Met Thr 415 420 425 tgg gtg ggc cgt cag aag cag gag atg gtg gag agc aac tct aag atc 1462 Trp Val Gly Arg Gln Lys Gln Glu Met Val Glu Ser Asn Ser Lys Ile 430 435 440 atc gtc ctg tgc tcc cgc ggc acg cgc gcc aag tgg cag gcg ctc ctg 1510 Ile Val Leu Cys Ser Arg Gly Thr Arg Ala Lys Trp Gln Ala Leu Leu 445 450 455 ggc cgg ggg gcg cct gtg cgg ctg cgc tgc gac cac gga aag ccc gtg 1558 Gly Arg Gly Ala Pro Val Arg Leu Arg Cys Asp His Gly Lys Pro Val 460 465 470 475 ggg gac ctg ttc act gca gcc atg aac atg atc ctc ccg gac ttc aag 1606 Gly Asp Leu Phe Thr Ala Ala Met Asn Met Ile Leu Pro Asp Phe Lys 480 485 490 agg cca gcc tgc ttc ggc acc tac gta gtc tgc tac ttc agc gag gtc 1654 Arg Pro Ala Cys Phe Gly Thr Tyr Val Val Cys Tyr Phe Ser Glu Val 495 500 505 agc tgt gac ggc gac gtc ccc gac ctg ttc ggc gcg gcg ccg cgg tac 1702 Ser Cys Asp Gly Asp Val Pro Asp Leu Phe Gly Ala Ala Pro Arg Tyr 510 515 520 ccg ctc atg gac agg ttc gag gag gtg tac ttc cgc atc cag gac ctg 1750 Pro Leu Met Asp Arg Phe Glu Glu Val Tyr Phe Arg Ile Gln Asp Leu 525 530 535 gag atg ttc cag ccg ggc cgc atg cac cgc gta ggg gag ctg tcg ggg 1798 Glu Met Phe Gln Pro Gly Arg Met His Arg Val Gly Glu Leu Ser Gly 540 545 550 555 gac aac tac ctg cgg agc ccg ggc ggc agg cag ctc cgc gcc gcc ctg 1846 Asp Asn Tyr Leu Arg Ser Pro Gly Gly Arg Gln Leu Arg Ala Ala Leu 560 565 570 gac agg ttc cgg gac tgg cag gtc cgc tgt ccc gac tgg ttc gaa 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ctg gca ctg gcg ggg gag 2230 Gly Pro Leu Ala Asp Gly Ala Ala Val Arg Leu Ala Leu Ala Gly Glu 685 690 695 ggc gag gcc tgc ccg ctg ctg ggc agc ccg ggc gct ggg cga aat agc 2278 Gly Glu Ala Cys Pro Leu Leu Gly Ser Pro Gly Ala Gly Arg Asn Ser 700 705 710 715 gtc ctc ttc ctc ccc gtg gac ccc gag gac tcg ccc ctt ggc agc agc 2326 Val Leu Phe Leu Pro Val Asp Pro Glu Asp Ser Pro Leu Gly Ser Ser 720 725 730 acc ccc atg gcg tct cct gac ctc ctt cca gag gac gtg agg gag cac 2374 Thr Pro Met Ala Ser Pro Asp Leu Leu Pro Glu Asp Val Arg Glu His 735 740 745 ctc gaa ggc ttg atg ctc tcg ctc ttc gag cag agt ctg agc tgc cag 2422 Leu Glu Gly Leu Met Leu Ser Leu Phe Glu Gln Ser Leu Ser Cys Gln 750 755 760 gcc cag ggg ggc tgc agt aga ccc gcc atg gtc ctc aca gac cca cac 2470 Ala Gln Gly Gly Cys Ser Arg Pro Ala Met Val Leu Thr Asp Pro His 765 770 775 acg ccc tac gag gag gag cag cgg cag tca gtg cag tct gac cag ggc 2518 Thr Pro Tyr Glu Glu Glu Gln Arg Gln Ser Val Gln Ser Asp Gln Gly 780 785 790 795 tac atc tcc agg agc tcc ccg cag ccc ccc gag gga ctc acg gaa atg 2566 Tyr Ile Ser Arg Ser Ser Pro Gln Pro Pro Glu Gly Leu Thr Glu Met 800 805 810 gag gaa gag gag gaa gag gag cag gac cca ggg aag ccg gcc ctg cca 2614 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gln Asp Pro Gly Lys Pro Ala Leu Pro 815 820 825 ctc tct ccc gag gac ctg gag agc ctg agg agc ctc cag cgg cag ctg 2662 Leu Ser Pro Glu Asp Leu Glu Ser Leu Arg Ser Leu Gln Arg Gln Leu 830 835 840 ctt ttc cgc cag ctg cag aag aac tcg ggc tgg gac acg atg ggg tca 2710 Leu Phe Arg Gln Leu Gln Lys Asn Ser Gly Trp Asp Thr Met Gly Ser 845 850 855 gag tca gag ggg ccc agt gca tgagggcgg ctccccaggg accgcccaga 2760 Glu Ser Glu Gly Pro Ser Ala 860 865 tcccagcttt gagagaggag tgtgtgtgca cgtattcatc tgtgtgtaca tgtctgcatg 2820 tgtatatgtt cgtgtgtgaa atgtaggctt taaaatgtaa atgtctggat tttaatccca 2880 ggcatccctc ctaacttttc tttgtgcagc ggtctggtta tcgtctatcc ccaggggaat 2940 ccacacagcc cgctcccagg agctaatggt agagcgtcct tgaggctcca ttattcgttc 3000 attcagcatt tattgtgcac ctactatgtg gcgggcattt gggataccaa gataaattgc 3060 atgcggcatg gccccagcca tgaaggaact taaccgctag tgccgaggac acgttaaacg 3120 aacaggatgg gccgggcacg gtggctcacg cctgtaatcc cagcacactg ggaggccgag 3180 gcaggtggat cactctgagg tcaggagttt gagccagcct ggccaacatg gtgaaacccc 3240 atctccacta aaaatagaaa aattagccgg gcatggtgac acatgcctgt agtcctagct 3300 acttgggagg ctgaggcagg agaattgctt gaatctggga ggcagaggtt gcagtgagcc 3360 gagattgtgc cattgcactg cagcctggat gacagagcga gactctatct caaaaaaaaa 3420 3420 <210> 6 <211> 866 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser 20 25 30 Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu 35 40 45 Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His 50 55 60 Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu 65 70 75 80 His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile 85 90 95 Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu 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Leu Met Asp Arg 515 520 525 Phe Glu Glu Val Tyr Phe Arg Ile Gln Asp Leu Glu Met Phe Gln Pro 530 535 540 Gly Arg Met His Arg Val Gly Glu Leu Ser Gly Asp Asn Tyr Leu Arg 545 550 555 560 Ser Pro Gly Gly Arg Gln Leu Arg Ala Ala Leu Asp Arg Phe Arg Asp 565 570 575 Trp Gln Val Arg Cys Pro Asp Trp Phe Glu Cys Glu Asn Leu Tyr Ser 580 585 590 Ala Asp Asp Gln Asp Ala Pro Ser Leu Asp Glu Glu Val Phe Glu Glu 595 600 605 Pro Leu Leu Pro Pro Gly Thr Gly Ile Val Lys Arg Ala Pro Leu Val 610 615 620 Arg Glu Pro Gly Ser Gln Ala Cys Leu Ala Ile Asp Pro Leu Val Gly 625 630 635 640 Glu Glu Gly Gly Ala Ala Val Ala Lys Leu Glu Pro His Leu Gln Pro 645 650 655 Arg Gly Gln Pro Ala Pro Gln Pro Leu His Thr Leu Val Leu Ala Ala 660 665 670 Glu Glu Gly Ala Leu Val Ala Ala Val Glu Pro Gly Pro Leu Ala Asp 675 680 685 Gly Ala Ala Val Arg Leu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Cys Pro 690 695 700 Leu Leu Gly Ser Pro Gly Ala Gly Arg Asn Ser Val Leu Phe Leu Pro 705 710 715 720 Val Asp Pro Glu Asp Ser Pro Leu Gly Ser Ser Thr Pro Met Ala Ser 725 730 735 Pro Asp Leu Leu Pro Glu Asp Val Arg Glu His Leu Glu Gly Leu Met 740 745 750 Leu Ser Leu Phe Glu Gln Ser Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Gly Cys 755 760 765 Ser Arg Pro Ala Met Val Leu Thr Asp Pro His Thr Pro Tyr Glu Glu 770 775 780 Glu Gln Arg Gln Ser Val Gln Ser Asp Gln Gly Tyr Ile Ser Arg Ser 785 790 795 800 Ser Pro Gln Pro Pro Glu Gly Leu Thr Glu Met Glu Glu Glu Glu Glu 805 810 815 Glu Glu Gln Asp Pro Gly Lys Pro Ala Leu Pro Leu Ser Pro Glu Asp 820 825 830 Leu Glu Ser Leu Arg Ser Leu Gln Arg Gln Leu Leu Phe Arg Gln Leu 835 840 845 Gln Lys Asn Ser Gly Trp Asp Thr Met Gly Ser Glu Ser Glu Gly Pro 850 855 860 Ser Ala 865 <210> 7 <211> 2691 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (219)..(2591) <400> 7 aaaacgaaag cactccgtgc tggaagtagg aggagagtca ggactcccag gacagagagt 60 gcacaaacta cccagcacag ccccctccgc cccctctgga ggctgaagag ggattccagc 120 ccctgccacc cacagacacg ggctgactgg ggtgtctgcc ccccttgggg gggggcagca 180 cagggcctca ggcctgggtg ccacctggca cctagaag atg cct gtg ccc tgg 233 Met Pro Val Pro Trp 1 5 ttc ttg ctg tcc ttg gca ctg ggc cga agc cca gtg gtc ctt tct ctg 281 Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro Val Val Leu Ser Leu 10 15 20 gag agg ctt gtg ggg cct cag gac gct acc cac tgc tct ccg gtg agt 329 Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His Cys Ser Pro Val Ser 25 30 35 ctg gaa ccc tgg gga gac gag gaa agg ctc agg gtt cag ttt ttg gct 377 Leu Glu Pro Trp Gly Asp Glu Glu Arg Leu Arg Val Gln Phe Leu Ala 40 45 50 cag caa agc ctt agc ctg gct cct gtc act gct gcc act gcc aga act 425 Gln Gln Ser Leu Ser Leu Ala Pro Val Thr Ala Ala Thr Ala Arg Thr 55 60 65 gcc ctg tct ggt ctg tct ggt gct gat ggt aga aga gaa gaa cgg gga 473 Ala Leu Ser Gly Leu Ser Gly Ala Asp Gly Arg Arg Glu Glu Arg Gly 70 75 80 85 agg ggc aag agc tgg gtc tgt ctt tct ctg gga ggg tct ggg aat acg 521 Arg Gly Lys Ser Trp Val Cys Leu Ser Leu Gly Gly Ser Gly Asn Thr 90 95 100 gag ccc cag aaa aag ggc ctc tcc tgc cgc ctc tgg gac agt gac ata 569 Glu Pro Gln Lys Lys Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile 105 110 115 ctc tgc ctg cct ggg gac atc gtg cct gct ccg ggc ccc gtg ctg gcg 617 Leu Cys Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala 120 125 130 cct acg cac ctg cag aca gag ctg gtg ctg agg tgc cag aag gag acc 665 Pro Thr His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr 135 140 145 gac tgt gac ctc tgt ctg cgt gtg gct gtc cac ttg gcc gtg cat ggg 713 Asp Cys Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly 150 155 160 165 cac tgg gaa gag cct gaa gat gag gaa aag ttt gga gga gca gct gac 761 His Trp Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp 170 175 180 tca ggg gtg gag gag cct agg aat gcc tct ctc cag gcc caa gtc gtg 809 Ser Gly Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val 185 190 195 ctc tcc ttc cag gcc tac cct act gcc cgc tgc gtc ctg ctg gag gtg 857 Leu Ser Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val 200 205 210 caa gtg cct gct gcc ctt gtg cag ttt ggt cag tct gtg ggc tct gtg 905 Gln Val Pro Ala Ala Leu 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ctg cag gag tgc 1577 Leu Cys Val Gln Val Asn Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys 440 445 450 ttg tgg gct gac tcc ctg ggg cct ctc aaa gac gat gtg cta ctg ttg 1625 Leu Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu 455 460 465 gag aca cga ggc ccc cag gac aac aga tcc ctc tgt gcc ttg gaa ccc 1673 Glu Thr Arg Gly Pro Gln Asp Asn Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro 470 475 480 485 agt ggc tgt act tca cta ccc agc aaa gcc tcc acg agg gca gct cgc 1721 Ser Gly Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg 490 495 500 ctt gga gag tac tta cta caa gac ctg cag tca ggc cag tgt ctg cag 1769 Leu Gly Glu Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln 505 510 515 cta tgg gac gat gac ttg gga gcg cta tgg gcc tgc ccc atg gac aaa 1817 Leu Trp Asp Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys 520 525 530 tac atc cac aag cgc tgg gcc ctc gtg tgg ctg gcc tgc cta ctc ttt 1865 Tyr Ile His Lys Arg Trp Ala Leu Val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Phe 535 540 545 gcc gct gcg ctt tcc ctc atc ctc ctt ctc aaa aag gat cac gcg aaa 1913 Ala Ala Ala Leu Ser Leu Ile Leu Leu Leu Lys Lys Asp His Ala Lys 550 555 560 565 ggg tgg ctg agg ctc ttg aaa cag gac gtc cgc tcg ggg gcg gcc gcc 1961 Gly Trp Leu Arg Leu Leu Lys Gln Asp Val Arg Ser Gly Ala Ala Ala 570 575 580 agg ggc cgc gcg gct ctg ctc ctc tac tca gcc gat gac tcg ggt ttc 2009 Arg Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Ser Gly Phe 585 590 595 gag cgc ctg gtg ggc gcc ctg gcg tcg gcc ctg tgc cag ctg ccg ctg 2057 Glu Arg Leu Val Gly Ala Leu Ala Ser Ala Leu Cys Gln Leu Pro Leu 600 605 610 cgc gtg gcc gta gac ctg tgg agc cgt cgt gaa ctg agc gcg cag ggg 2105 Arg Val Ala Val Asp Leu Trp Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala Gln Gly 615 620 625 ccc gtg gct tgg ttt cac gcg cag cgg cgc cag acc ctg cag gag ggc 2153 Pro Val Ala Trp Phe His Ala Gln Arg Arg Gln Thr Leu Gln Glu Gly 630 635 640 645 ggc gtg gtg gtc ttg ctc ttc tct ccc ggt gcg gtg gcg ctg tgc agc 2201 Gly Val Val Val Leu Leu Phe Ser Pro Gly Ala Val Ala Leu Cys Ser 650 655 660 gag tgg cta cag gat ggg gtg tcc ggg ccc ggg gcg cac ggc ccg cac 2249 Glu Trp Leu Gln Asp Gly Val Ser Gly Pro Gly Ala His Gly Pro His 665 670 675 gac gcc ttc cgc gcc tcg ctc agc tgc gtg ctg ccc gac ttc ttg cag 2297 Asp Ala Phe Arg Ala Ser Leu Ser Cys Val Leu Pro Asp Phe Leu Gln 680 685 690 ggc cgg gcg ccc ggc agc tac gtg ggg gcc tgc ttc gac agg ctg ctc 2345 Gly Arg Ala Pro Gly Ser Tyr Val Gly Ala Cys Phe Asp Arg Leu Leu 695 700 705 cac ccg gac gcc gta ccc gcc ctt ttc cgc acc gtg ccc gtc ttc aca 2393 His Pro Asp Ala Val Pro Ala Leu Phe Arg Thr Val Pro Val Phe Thr 710 715 720 725 ctg ccc tcc caa ctg cca gac ttc ctg ggg gcc ctg cag cag cct cgc 2441 Leu Pro Ser Gln Leu Pro Asp Phe Leu Gly Ala Leu Gln Gln Pro Arg 730 735 740 gcc ccg cgt tcc ggg cgg ctc caa gag aga gcg gag caa gtg tcc cgg 2489 Ala Pro Arg Ser Gly Arg Leu Gln Glu Arg Ala Glu Gln Val Ser Arg 745 750 755 gcc ctt cag cca gcc ctg gat agc tac ttc cat ccc ccg ggg act ccc 2537 Ala Leu Gln Pro Ala Leu Asp Ser Tyr Phe His Pro Pro Gly Thr 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ctg cag aca gag 425 Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr His Leu Gln Thr Glu 55 60 65 ctg gtg ctg agg tgc cag aag gag acc gac tgt gac ctc tgt ctg cgt 473 Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys Asp Leu Cys Leu Arg 70 75 80 85 gtg gct gtc cac ttg gcc gtg cat ggg cac tgg gaa gag cct gaa gat 521 Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp Glu Glu Pro Glu Asp 90 95 100 gag gaa aag ttt gga gga gca gct gac tca ggg gtg gag gag cct agg 569 Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly Val Glu Glu Pro Arg 105 110 115 aat gcc tct ctc cag gcc caa gtc gtg ctc tcc ttc cag gcc tac cct 617 Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe Gln Ala Tyr Pro 120 125 130 act gcc cgc tgc gtc ctg ctg gag gtg caa gtg cct gct gcc ctt gtg 665 Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val Pro Ala Ala Leu Val 135 140 145 cag ttt ggt cag tct gtg ggc tct gtg gta tat gac tgc ttc gag gct 713 Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr Asp Cys Phe Glu Ala 150 155 160 165 gcc cta ggg agt gag gta cga atc tgg tcc tat act cag ccc agg tac 761 Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr Thr Gln Pro Arg Tyr 170 175 180 gag aag gaa ctc aac cac aca cag cag ctg cct gac tgc agg ggg ctc 809 Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro Asp Cys Arg Gly Leu 185 190 195 gaa gtc tgg aac agc atc ccg agc tgc tgg gcc ctg ccc tgg ctc aac 857 Glu Val Trp Asn Ser Ile Pro Ser Cys Trp Ala Leu Pro Trp Leu Asn 200 205 210 gtg tca gca gat ggt gac aac gtg cat ctg gtt ctg aat gtc tct gag 905 Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu Val Leu Asn Val Ser Glu 215 220 225 gag cag cac ttc ggc ctc tcc ctg tac tgg aat cag gtc cag ggc ccc 953 Glu Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn Gln Val Gln Gly Pro 230 235 240 245 cca aaa ccc cgg tgg cac aaa aac ctg act gga ccg cag atc att acc 1001 Pro Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Ile Ile Thr 250 255 260 ttg aac cac aca gac ctg gtt ccc tgc ctc tgt att cag gtg tgg cct 1049 Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val Trp Pro 265 270 275 ctg gaa cct gac tcc gtt agg acg aac atc tgc ccc ttc agg gag gac 1097 Leu Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys Pro Phe Arg Glu Asp 280 285 290 ccc cgc gca cac cag aac ctc tgg caa gcc gcc cga ctg cga ctg ctg 1145 Pro Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala Arg Leu Arg Leu Leu 295 300 305 acc ctg cag agc tgg ctg ctg gac gca ccg tgc tcg ctg ccc gca gaa 1193 Thr Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys Ser Leu Pro Ala Glu 310 315 320 325 gcg gca ctg tgc tgg cgg gct ccg ggt ggg gac ccc tgc cag cca ctg 1241 Ala Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp Pro Cys Gln Pro Leu 330 335 340 gtc cca ccg ctt tcc tgg gag aac gtc act gtg gac aag gtt ctc gag 1289 Val Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val Asp Lys Val Leu Glu 345 350 355 ttc cca ttg ctg aaa ggc cac cct aac ctc tgt gtt cag gtg aac agc 1337 Phe Pro Leu Leu Lys Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val Asn Ser 360 365 370 tcg gag aag ctg cag ctg cag gag tgc ttg tgg gct gac tcc ctg ggg 1385 Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala Asp Ser Leu Gly 375 380 385 cct ctc aaa gac gat gtg cta ctg ttg gag aca cga ggc ccc cag gac 1433 Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg Gly Pro Gln Asp 390 395 400 405 aac aga tcc ctc tgt gcc ttg gaa ccc agt ggc tgt act tca cta ccc 1481 Asn Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Ser Leu Pro 410 415 420 agc aaa gcc tcc acg agg gca gct cgc ctt gga gag tac tta cta caa 1529 Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Leu Gln 425 430 435 gac ctg cag tca ggc cag tgt ctg cag cta tgg gac gat gac ttg gga 1577 Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp Asp Asp Leu Gly 440 445 450 gcg cta tgg gcc tgc ccc atg gac aaa tac atc cac aag cgc tgg gcc 1625 Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Lys Arg Trp Ala 455 460 465 ctc gtg tgg ctg gcc tgc cta ctc ttt gcc gct gcg ctt tcc ctc atc 1673 Leu Val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Leu Ser Leu Ile 470 475 480 485 ctc ctt ctc aaa aag gat cac gcg aaa ggg tgg ctg agg ctc ttg aaa 1721 Leu Leu Leu Lys Lys Asp His Ala Lys Gly Trp Leu Arg Leu 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Asp Ala Phe Arg Ala Ser Leu 600 605 610 agc tgc gtg ctg ccc gac ttc ttg cag ggc cgg gcg ccc ggc agc tac 2105 Ser Cys Val Leu Pro Asp Phe Leu Gln Gly Arg Ala Pro Gly Ser Tyr 615 620 625 gtg ggg gcc tgc ttc gac agg ctg ctc cac ccg gac gcc gta ccc gcc 2153 Val Gly Ala Cys Phe Asp Arg Leu Leu His Pro Asp Ala Val Pro Ala 630 635 640 645 ctt ttc cgc acc gtg ccc gtc ttc aca ctg ccc tcc caa ctg cca gac 2201 Leu Phe Arg Thr Val Pro Val Phe Thr Leu Pro Ser Gln Leu Pro Asp 650 655 660 ttc ctg ggg gcc ctg cag cag cct cgc gcc ccg cgt tcc ggg cgg ctc 2249 Phe Leu Gly Ala Leu Gln Gln Pro Arg Ala Pro Arg Ser Gly Arg Leu 665 670 675 caa gag aga gcg gag caa gtg tcc cgg gcc ctt cag cca gcc ctg gat 2297 Gln Glu Arg Ala Glu Gln Val Ser Arg Ala Leu Gln Pro Ala Leu Asp 680 685 690 agc tac ttc cat ccc ccg ggg act ccc gcg ccg gga cgc ggg gtg gga 2345 Ser Tyr Phe His Pro Pro Gly Thr Pro Ala Pro Gly Arg Gly Val Gly 695 700 705 cca ggg gcg gga cct ggg gcg ggg gac ggg act ta aataaaggca 2390 Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly Asp Gly Thr 710 715 720 gacgctgttt ttctacccat gtggcccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2450 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2478 <210> 10 <211> 720 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro 1 5 10 15 Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His 20 25 30 Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys 35 40 45 Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr 50 55 60 His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys 65 70 75 80 Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp 85 90 95 Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly 100 105 110 Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser 115 120 125 Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val 130 135 140 Pro Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr 145 150 155 160 Asp Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile 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233 Met Pro Val Pro Trp 1 5 ttc ttg ctg tcc ttg gca ctg ggc cga agc cca gtg gtc ctt tct ctg 281 Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro Val Val Leu Ser Leu 10 15 20 gag agg ctt gtg ggg cct cag gac gct acc cac tgc tct ccg ggc ctc 329 Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His Cys Ser Pro Gly Leu 25 30 35 tcc tgc cgc ctc tgg gac agt gac ata ctc tgc ctg cct ggg gac atc 377 Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys Leu Pro Gly Asp Ile 40 45 50 gtg cct gct ccg ggc ccc gtg ctg gcg cct acg cac ctg cag aca gag 425 Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr His Leu Gln Thr Glu 55 60 65 ctg gtg ctg agg tgc cag aag gag acc gac tgt gac ctc tgt ctg cgt 473 Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys Asp Leu Cys Leu Arg 70 75 80 85 gtg gct gtc cac ttg gcc gtg cat ggg cac tgg gaa gag cct gaa gat 521 Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp Glu Glu Pro Glu Asp 90 95 100 gag gaa aag ttt gga gga gca gct gac tca ggg gtg gag gag cct agg 569 Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly Val Glu 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Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val Asp Lys Val Leu 330 335 340 gag ttc cca ttg ctg aaa ggc cac cct aac ctc tgt gtt cag gtg aac 1289 Glu Phe Pro Leu Leu Lys Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val Asn 345 350 355 agc tcg gag aag ctg cag ctg cag gag tgc ttg tgg gct gac tcc ctg 1337 Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala Asp Ser Leu 360 365 370 ggg cct ctc aaa gac gat gtg cta ctg ttg gag aca cga ggc ccc cag 1385 Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg Gly Pro Gln 375 380 385 gac aac aga tcc ctc tgt gcc ttg gaa ccc agt ggc tgt act tca cta 1433 Asp Asn Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Ser Leu 390 395 400 405 ccc agc aaa gcc tcc acg agg gca gct cgc ctt gga gag tac tta cta 1481 Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Leu 410 415 420 caa gac ctg cag tca ggc cag tgt ctg cag cta tgg gac gat gac ttg 1529 Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp Asp Asp Leu 425 430 435 gga gcg cta tgg gcc tgc ccc atg gac aaa tac atc cac aag cgc tgg 1577 Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Lys Arg Trp 440 445 450 gcc ctc gtg tgg ctg gcc tgc cta ctc ttt gcc gct gcg ctt tcc ctc 1625 Ala Leu Val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Leu Ser Leu 455 460 465 atc ctc ctt ctc aaa aag gat cac gcg aaa ggg tgg ctg agg ctc ttg 1673 Ile Leu Leu Leu Lys Lys Asp His Ala Lys Gly Trp Leu Arg Leu Leu 470 475 480 485 aaa cag gac gtc cgc tcg ggg ggt gag tgg gag caa gcg ctg ggc gga 1721 Lys Gln Asp Val Arg Ser Gly Gly Glu Trp Glu Gln Ala Leu Gly Gly 490 495 500 ggg ccg ccc ccg ggg agc cag gcc tgt gcc agc tca cct ctt ccc tcc 1769 Gly Pro Pro Pro Gly Ser Gln Ala Cys Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ser 505 510 515 cca tct gtt ttc tcc ggc agc ggc cgc cag ggg ccg cgc ggc tct gct 1817 Pro Ser Val Phe Ser Gly Ser Gly Arg Gln Gly Pro Arg Gly Ser Ala 520 525 530 cct cta ctc agc cga tgactcgg gtttcgagcg cctggtgggc gccctggcgt 1870 Pro Leu Leu Ser Arg 535 cggccctgtg ccagctgccg ctgcgcgtgg ccgtagacct gtggagccgt cgtgaactga 1930 gcgcgcaggg gcccgtggct tggtttcacg cgcagcggcg ccagaccctg caggagggcg 1990 gcgtggtggt cttgctcttc tctcccggtg cggtggcgct gtgcagcgag tggctacagg 2050 atggggtgtc cgggcccggg gcgcacggcc cgcacgacgc cttccgcgcc tcgctcagct 2110 gcgtgctgcc cgacttcttg cagggccggg cgcccggcag ctacgtgggg gcctgcttcg 2170 acaggctgct ccacccggac gccgtacccg cccttttccg caccgtgccc gtcttcacac 2230 tgccctccca actgccagac ttcctggggg ccctgcagca gcctcgcgcc ccgcgttccg 2290 ggcggctcca agagagagcg gagcaagtgt cccgggccct tcagccagcc ctggatagct 2350 acttccatcc cccggggact cccgcgccgg gacgcggggt gggaccaggg gcgggacctg 2410 gggcggggga cgggacttaa ataaaggcag acgctgtttt tctacccatg tggcccaaaa 2470 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2527 <210> 12 <211> 538 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro 1 5 10 15 Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His 20 25 30 Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys 35 40 45 Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr 50 55 60 His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys 65 70 75 80 Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp 85 90 95 Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly 100 105 110 Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser 115 120 125 Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val 130 135 140 Pro Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr 145 150 155 160 Asp Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr 165 170 175 Thr Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro 180 185 190 Ala Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu 195 200 205 Val Leu Asn Val Ser Glu Glu Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp 210 215 220 Asn Gln Val Gln Gly Pro Pro Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr 225 230 235 240 Gly Pro Gln Ile Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu 245 250 255 Cys Ile Gln Val Trp Pro Leu Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile 260 265 270 Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala 275 280 285 Ala Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro 290 295 300 Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly 305 310 315 320 Asp Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr 325 330 335 Val Asp Lys Val Leu Glu Phe Pro Leu Leu Lys Gly His Pro Asn Leu 340 345 350 Cys Val Gln Val Asn Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu 355 360 365 Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu 370 375 380 Thr Arg Gly Pro Gln Asp Asn Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser 385 390 395 400 Gly Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu 405 410 415 Gly Glu Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu 420 425 430 Trp Asp Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr 435 440 445 Ile His Lys Arg Trp Ala Leu Val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala 450 455 460 Ala Ala Leu Ser Leu Ile Leu Leu Leu Lys Lys Asp 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tgg gac agt gac ata ctc tgc ctg cct ggg gac atc 377 Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys Leu Pro Gly Asp Ile 40 45 50 gtg cct gct ccg ggc ccc gtg ctg gcg cct acg cac ctg cag aca gag 425 Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr His Leu Gln Thr Glu 55 60 65 ctg gtg ctg agg tgc cag aag gag acc gac tgt gac ctc tgt ctg cgt 473 Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys Asp Leu Cys Leu Arg 70 75 80 85 gtg gct gtc cac ttg gcc gtg cat ggg cac tgg gaa gag cct gaa gat 521 Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp Glu Glu Pro Glu Asp 90 95 100 gag gaa aag ttt gga gga gca gct gac tca ggg gtg gag gag cct agg 569 Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly Val Glu Glu Pro Arg 105 110 115 aat gcc tct ctc cag gcc caa gtc gtg ctc tcc ttc cag gcc tac cct 617 Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser Phe Gln Ala Tyr Pro 120 125 130 act gcc cgc tgc gtc ctg ctg gag gtg caa gtg cct gct gcc ctt gtg 665 Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val Pro Ala Ala Leu Val 135 140 145 cag ttt ggt cag tct gtg ggc tct gtg gta tat gac tgc ttc gag gct 713 Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr Asp Cys Phe Glu Ala 150 155 160 165 gcc cta ggg agt gag gta cga atc tgg tcc tat act cag ccc agg tac 761 Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr Thr Gln Pro Arg Tyr 170 175 180 gag aag gaa ctc aac cac aca cag cag ctg cct gcc ctg ccc tgg ctc 809 Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro Ala Leu Pro Trp Leu 185 190 195 aac gtg tca gca gat ggt gac aac gtg cat ctg gtt ctg aat gtc tct 857 Asn Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu Val Leu Asn Val Ser 200 205 210 gag gag cag cac ttc ggc ctc tcc ctg tac tgg aat cag gtc cag ggc 905 Glu Glu Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn Gln Val Gln Gly 215 220 225 ccc cca aaa ccc cgg tgg cac aaa aac ctg gtg agg cct ccc cct tcc 953 Pro Pro Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Val Arg Pro Pro Pro Ser 230 235 240 245 caa gtc cat tcc cac tgt agg ccg atg cct gtg caa agg acg cag tgc 1001 Gln Val His Ser His Cys Arg Pro Met Pro Val Gln Arg Thr Gln Cys 250 255 260 cat atc aga gag gat cct t gaagaggact caccccaagc aagggaaaat 1050 His Ile Arg Glu Asp Pro 265 tggtggggga acttctgcct tcctggtttc cttgactttg gcctcctcct cttcctcctt 1110 atcttctcca acctccttcc tttatttgtt ccacagactg gaccgcagat cattaccttg 1170 aaccacacag acctggttcc ctgcctctgt attcaggtgt ggcctctgga acctgactcc 1230 gttaggacga acatctgccc cttcagggag gacccccgcg cacaccagaa cctctggcaa 1290 gccgcccgac tgcgactgct gaccctgcag agctggctgc tggacgcacc gtgctcgctg 1350 cccgcagaag cggcactgtg ctggcgggct ccgggtgggg acccctgcca gccactggtc 1410 ccaccgcttt cctgggagaa cgtcactgtg gacaaggttc tcgagttccc attgctgaaa 1470 ggccacccta acctctgtgt tcaggtgaac agctcggaga agctgcagct gcaggagtgc 1530 ttgtgggctg actccctggg gcctctcaaa gacgatgtgc tactgttgga gacacgaggc 1590 ccccaggaca acagatccct ctgtgccttg gaacccagtg gctgtacttc actacccagc 1650 aaagcctcca cgctatggga cgatgacttg ggagcgctat gggcctgccc catggacaaa 1710 tacatccaca agcgctgggc cctcgtgtgg ctggcctgcc tactctttgc cgctgcgctt 1770 tccctcatcc tccttctcaa aaaggatcac gcgaaagggt ggctgaggct cttgaaacag 1830 gacgtccgct cgggggcggc cgccaggggc cgcgcggctc tgctcctcta ctcagccgat 1890 gactcgggtt tcgagcgcct ggtgggcgcc ctggcgtcgg ccctgtgcca gctgccgctg 1950 cgcgtggccg tagacctgtg gagccgtcgt gaactgagcg cgcaggggcc cgtggcttgg 2010 tttcacgcgc agcggcgcca gaccctgcag gagggcggcg tggtggtctt gctcttctct 2070 cccggtgcgg tggcgctgtg cagcgagtgg ctacaggatg gggtgtccgg gcccggggcg 2130 cacggcccgc acgacgcctt ccgcgcctcg ctcagctgcg tgctgcccga cttcttgcag 2190 ggccgggcgc ccggcagcta cgtgggggcc tgcttcgaca ggctgctcca cccggacgcc 2250 gtacccgccc ttttccgcac cgtgcccgtc ttcacactgc cctcccaact gccagacttc 2310 ctgggggccc tgcagcagcc tcgcgccccg cgttccgggc ggctccaaga gagagcggag 2370 caagtgtccc gggcccttca gccagccctg gatagctact tccatccccc ggggactccc 2430 gcgccgggac gcggggtggg accaggggcg ggacctgggg cgggggacgg gacttaaata 2490 aaggcagacg ctgtttttct acccatgtgg cccaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2550 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2584 <210> 14 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu 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Ala Thr Lys Phe Trp Ala Trp Asn Ser Phe 40 45 50 agc tcc cac ccg ctc ctc cac aca cag aca gtg aca tac tct gcc tgc 425 Ser Ser His Pro Leu Leu His Thr Gln Thr Val Thr Tyr Ser Ala Cys 55 60 65 ctg ggg aca tcg tgc ctg ctc cgg gcc ccg tgc tgg cgc cta cgc acc 473 Leu Gly Thr Ser Cys Leu Leu Arg Ala Pro Cys Trp Arg Leu Arg Thr 70 75 80 85 tgc aga cag agc tgg tgc tgaggtgcc agaaggagac cgactgtgac 520 Cys Arg Gln Ser Trp Cys 90 ctctgtctgc gtgtggctgt ccacttggcc gtgcatgggc actgggaaga gcctgaagat 580 gaggaaaagt ttggaggagc agctgactca ggggtggagg agcctaggaa tgcctctctc 640 caggcccaag tcgtgctctc cttccaggcc taccctactg cccgctgcgt cctgctggag 700 gtgcaagtgc ctgctgccct tgtgcagttt ggtcagtctg tgggctctgt ggtatatgac 760 tgcttcgagg ctgccctagg gagtgaggta cgaatctggt cctatactca gcccaggtac 820 gagaaggaac tcaaccacac acagcagctg cctgccctgc cctggctcaa cgtgtcagca 880 gatggtgaca acgtgcatct ggttctgaat gtctctgagg agcagcactt cggcctctcc 940 ctgtactgga atcaggtcca gggcccccca aaaccccggt ggcacaaaaa cctggtgagg 1000 cctccccctt cccaagtcca ttcccactgt aggccgatgc ctgtgcaaag gacgcagtgc 1060 catatcagag aggatccttg aagaggactc accccaagca agggaaaatt gactggaccg 1120 cagatcatta ccttgaacca cacagacctg gttccctgcc tctgtattca ggtgtggcct 1180 ctggaacctg actccgttag gacgaacatc tgccccttca gggaggaccc ccgcgcacac 1240 cagaacctct ggcaagccgc ccgactgcga ctgctgaccc tgcagagctg gctgctggac 1300 gcaccgtgct cgctgcccgc agaagcggca ctgtgctggc gggctccggg tggggacccc 1360 tgccagccac tggtcccacc gctttcctgg gagaacgtca ctgtggacaa ggttctcgag 1420 ttcccattgc tgaaaggcca ccctaacctc tgtgttcagg tgaacagctc ggagaagctg 1480 cagctgcagg agtgcttgtg ggctgctatg ggacgatgac ttgggagcgc tatgggcctg 1540 ccccatggac aaatacatcc acaagcgctg ggccctcgtg tggctggcct gcctactctt 1600 tgccgctgcg ctttccctca tcctccttct caaaaaggat cacgcgaaag ggtggctgag 1660 gctcttgaaa caggacgtcc gctcgggggc ggccgccagg ggccgcgcgg ctctgctcct 1720 ctactcagcc gatgactcgg gtttcgagcg cctggtgggc gccctggcgt cggccctgtg 1780 ccagctgccg ctgcgcgtgg ccgtagacct gtggagccgt cgtgaactga gcgcgcaggg 1840 gcccgtggct tggtttcacg cgcagcggcg ccagaccctg caggagggcg gcgtggtggt 1900 cttgctcttc tctcccggtg cggtggcgct gtgcagcgag tggctacagg atggggtgtc 1960 cgggcccggg gcgcacggcc cgcacgacgc cttccgcgcc tcgctcagct gcgtgctgcc 2020 cgacttcttg cagggccggg cgcccggcag ctacgtgggg gcctgcttcg acaggctgct 2080 ccacccggac gccgtacccg cccttttccg caccgtgccc gtcttcacac tgccctccca 2140 actgccagac ttcctggggg ccctgcagca gcctcgcgcc ccgcgttccg ggcggctcca 2200 agagagagcg gagcaagtgt cccgggccct tcagccagcc ctggatagct acttccatcc 2260 cccggggact cccgcgccgg gacgcggggt gggaccaggg gcgggacctg gggcggggga 2320 cgggacttaa ataaaggcag acgctgtttt tctacccatg tggcccaaaa aaaaaaaaaa 2380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2427 <210> 16 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro 1 5 10 15 Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His 20 25 30 Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Gly Ala Thr Lys Phe Trp 35 40 45 Ala Trp Asn Ser Phe Ser Ser His Pro Leu 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Artificial Sequence <220> <223> siRNA IL-17R <400> 24 ugaacgguca ccucauauuu u 21 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA IL-17RC <400> 25 guacgaaucu gguccuauau u 21 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA IL-17RC <400> 26 uauaggacca gauucguacu u 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA IL-17RC <400> 27 gaaccugacu ccguuaggau u 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA IL-17RC <400> 28 uccuaacgga gucagguucu u 21 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA IL-17RC <400> 29 gcuaugggac gaugacuugu u 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA IL-17RC <400> 30 caagucaucg ucccauagcu u 21 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA IL-17RC <400> 31 gaccgcagau cauuaccuuu u 21 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA IL-17RC <400> 32 aagguaauga ucugcggucu u 21 <210> 33 <211> 21 <212> PRT <213> Apis mellifera <400> 33 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile 1 5 10 15 Ser Tyr Ile Tyr Ala 20 <210> 34 <211> 527 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein: human IL-17R - human IgG1 <400> 34 Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu 1 5 10 15 Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His 20 25 30 Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu 35 40 45 His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile 50 55 60 Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala 65 70 75 80 Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg 85 90 95 Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe 100 105 110 Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val Thr 115 120 125 Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln 130 135 140 Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val 145 150 155 160 Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr 165 170 175 Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp 180 185 190 Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met 195 200 205 Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg 210 215 220 Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn 225 230 235 240 Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser 245 250 255 Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro 260 265 270 Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp 275 280 285 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 290 295 300 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val 305 310 315 320 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 325 330 335 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 340 345 350 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 355 360 365 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 370 375 380 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 385 390 395 400 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 405 410 415 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 420 425 430 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 435 440 445 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 450 455 460 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 465 470 475 480 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 485 490 495 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 500 505 510 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 515 520 525 <210> 35 <211> 660 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein: human IL-17RC - human IgG1 <400> 35 Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro 1 5 10 15 Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His 20 25 30 Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys 35 40 45 Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr 50 55 60 His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys 65 70 75 80 Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp 85 90 95 Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly 100 105 110 Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser 115 120 125 Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val 130 135 140 Pro Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr 145 150 155 160 Asp Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr 165 170 175 Thr Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro 180 185 190 Ala Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala Asp Gly Asp Asn Val His Leu 195 200 205 Val Leu Asn Val Ser Glu Glu Gln His Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp 210 215 220 Asn Gln Val Gln Gly Pro Pro Lys Pro Arg Trp His Lys Asn Leu Thr 225 230 235 240 Gly Pro Gln Ile Ile Thr Leu Asn His Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu 245 250 255 Cys Ile Gln Val Trp Pro Leu Glu Pro Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile 260 265 270 Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala His Gln Asn Leu Trp Gln Ala 275 280 285 Ala Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gln Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro 290 295 300 Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly 305 310 315 320 Asp Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr 325 330 335 Val Asp Lys Val Leu Glu Phe Pro Leu Leu Lys Gly His Pro Asn Leu 340 345 350 Cys Val Gln Val Asn Ser Ser Glu Lys Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu 355 360 365 Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu 370 375 380 Thr Arg Gly Pro Gln Asp Asn Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser 385 390 395 400 Gly Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu 405 410 415 Gly Glu Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu 420 425 430 Trp Asp Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr 435 440 445 Ile His Lys Arg Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu Pro Lys Ser 450 455 460 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu 465 470 475 480 Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 485 490 495 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 500 505 510 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 515 520 525 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 530 535 540 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 545 550 555 560 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 565 570 575 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 580 585 590 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 595 600 605 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 610 615 620 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 625 630 635 640 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 645 650 655 Val Asp Lys Ser 660 <210> 36 <211> 510 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tagged human IL-17F <400> 36 atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tgtacatttc ttacatctat 60 gcgggatctg gtcaccacca tcatcaccac ggtgacgatg acgataagcg gaaaatcccc 120 aaagtaggac atactttttt ccaaaagcct gagagttgcc cgcctgtgcc aggaggtagt 180 atgaagcttg acattggcat catcaatgaa aaccagcgcg tttccatgtc acgtaacatc 240 gagagccgct ccacctcccc ctggaattac actgtcactt gggaccccaa ccggtacccc 300 tcggaagttg tacaggccca gtgtaggaac ttgggctgca tcaatgctca aggaaaggaa 360 gacatctcca tgaattccgt tcccatccag caagagaccc tggtcgtccg gaggaagcac 420 caaggctgct ctgtttcttt ccagttggag aaggtgctgg tgactgttgg ctgcacctgc 480 gtcacccctg tcatccacca tgtgcagtaa 510 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Arg Lys Ile Pro Lys 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 38 Ile Val Lys Ala Gly 1 5 <210> 39 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag-tagged human IL-17A <400> 39 atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tgtacatttc ttacatctat 60 gcgggatctc ctgactataa agacgatgac gataagatag tgaaggcagg aatcacaatc 120 ccacgaaatc caggatgccc aaattctgag gacaagaact tcccccggac tgtgatggtc 180 aacctgaaca tccataaccg gaataccaat accaatccca aaaggtcctc agattactac 240 aaccgatcca cctcaccttg gaatctccac cgcaatgagg accctgagag atatccctct 300 gtgatctggg aggcaaagtg ccgccacttg ggctgcatca acgctgatgg gaacgtggac 360 taccacatga actctgtccc catccagcaa gagatcctgg tcctgcgcag ggagcctcca 420 cactgcccca actccttccg gctggagaag atactggtgt ccgtgggctg cacctgtgtc 480 accccgattg tccaccatgt ggcctaa 507 <210> 40 <211> 492 <212> DNA <213> Macaca sp. <400> 40 atgacagtga agaccctgca tggcccagtc atggtcaagt acttgctgct gttgatattg 60 ggacttgcct ttctgaatga ggtggcagct aggaaaatcc ccaaagtagg acatactttt 120 ttccaaaagc ctgagagttg cccacctgtg ccagaaggta gtatgaagct tgacactggc 180 atcatcaatg aaaaccagcg tgtttccatg tcacgtaaca tcgagagccg ctccacctcc 240 ccctggaatt acactgtcac ttgggacccc aaccggtatc cctcggaagt tgtacaggcc 300 cagtgtaagc acttgggctg catcaatgct caaggaaagg aagacatctc catgaattcc 360 gttcccatcc agcaagagac cctggtcctc cggaggaagc accaaggctg ctctgtttct 420 ttccagttgg agaaggtgct ggtgactgtt ggctgcacct gcgtcacccc cgtcgtccac 480 catgtgcagt aa 492

Claims (75)

  1. 하기 단계를 포함하는, IL-17F 신호전달에 대항할 수 있는 테스트 화합물의 스크리닝 방법 :
    IL-17F 및 IL-17R 을 함유하는 샘플을 화합물과 접촉시키는 단계 ; 및
    상기 샘플 내에서의 IL-17F 와 IL-17R 과의 상호작용이 화합물과 접촉되지 않은 샘플 내에서의 IL-17F 와 IL-17R 과의 상호작용에 비해 감소되는지를 측정하는 단계,
    그로 인해 화합물과 접촉된 샘플 내에서의 IL-17F 와 IL-17R 과의 상호작용에서의 그러한 감소가, IL-17F 와 IL-17R 과의 상호작용을 억제시키고 IL-17F 신호전달에 대항할 수 있는 것으로서의 상기 화합물을 규명함.
  2. 하기 단계를 포함하는, IL-17F 신호전달에 대항할 수 있는 테스트 화합물의 스크리닝 방법 :
    IL-17F 및 IL-17RC 를 함유하는 샘플을 화합물과 접촉시키는 단계 ; 및
    상기 샘플 내에서의 IL-17F 와 IL-17RC 와의 상호작용이 화합물과 접촉되지 않은 샘플 내에서의 IL-17F 와 IL-17RC 와의 상호작용에 비해 감소되는지를 측정하는 단계,
    그로 인해 화합물과 접촉된 샘플 내에서의 IL-17F 와 IL-17RC 와의 상호작용의 감소가, IL-17F 와 IL-17RC 와의 상호작용을 억제시키고 IL-17F 신호전달에 대 항할 수 있는 것으로서의 상기 화합물을 규명함.
  3. 하기 단계를 포함하는, 개체에서의 증가된 IL-17F 신호전달과 관련된 장애의 진단 방법 :
    개체의 샘플 내에 있는 IL-17F 신호전달 유전자 생성물의 테스트 양을 검출하는 단계 ; 및
    대조군 샘플 내의 동일한 IL-17F 신호전달 유전자 생성물의 정상적인 양과 테스트 양을 비교하는 단계,
    그로 인해, 정상적인 양보다 유의하게 더 상승된 테스트 양이, 증가된 IL-17F 신호전달과 관련된 장애의 진단에 있어서 양성 지시를 제공함.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 장애가 자가면역 질환, 호흡계 질환, 및 염증성 장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, IL-17F 신호전달 유전자 생성물이 IL-17F 유전자 생성물인 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, IL-17F 신호전달 유전자 생성물이 IL-17R 유전자 생성물인 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, IL-17F 신호전달 유전자 생성물이 IL-17RC 유전자 생성물인 방법.
  8. 치료적 유효량의 IL-17F 신호전달 안타고니스트를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 증가된 IL-17F 신호전달과 관련된 장애의 위험이 있거나, 또는 장애가 있는 것으로 진단받은 개체의 치료 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, IL-17F 신호전달 안타고니스트가 IL-17F 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, IL-17RC 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, 억제성 항-IL-17F 항체, 억제성 항-IL-17R 항체, 억제성 IL-17RC 항체, 및 안타고니스트성 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, IL-17F 신호전달 안타고니스트가 IL-17R 억제성 폴리뉴클레오티드인 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, IL-17F 신호전달 안타고니스트가 IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드인 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 억제성 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO :17-24 로 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 siRNA 인 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 억제성 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO :25-32 로 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 siRNA 인 방법.
  14. 제 9 항에 있어서, IL-17F 신호전달 안타고니스트가 IL-17R 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드인 방법.
  15. 제 9 항에 있어서, IL-17F 신호전달 안타고니스트가 IL-17RC 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드인 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 용해성 폴리펩티드가 SEQ ID NO:34 에 나타나 있는 아미노산 서열을 갖는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 용해성 폴리펩티드가 SEQ ID NO:35 에 나타나 있는 아미노산 서열을 갖는 방법.
  18. 제 9 항에 있어서, IL-17F 억제성 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1 의 절편에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 그 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 RNA 당량체를 포함하는 방법으로서, 여기서 세포 내에서의 억제성 폴리뉴클레오티드의 발현이 IL-17F 의 감소된 발현을 초래하는 방법.
  19. 제 9 항에 있어서, IL-17R 억제성 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:5 의 절편에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 그 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 RNA 당량체를 포함하는 방법으로서, 여기서 세포 내에서의 억제성 폴리뉴클레오티드의 발현이 IL-17R 의 감소된 발현을 초래하는 방법.
  20. 제 9 항에 있어서, IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, 및 SEQ ID NO:15 에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ TD NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 13, 및 SEQ ID NO: 15 에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 절편에 나타나 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 그 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 RNA 당량체를 포함하며, 여기서 세포 내에서의 억제성 폴리뉴클레오티드의 발현이 IL-17RC 의 감소된 발현을 초래하는 방법.
  21. 제 8 항에 있어서, 증가된 IL-17F 신호전달과 관련된 장애가 염증 장애인 방 법.
  22. 제 21 항에 있어서, 염증 장애가 자가면역 질환, 호흡계 질환, 및 염증성 장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 염증 장애가 자가면역 질환이고, 자가면역 질환이 관절염, 건선, 전신 루푸스성 홍반, 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스 관절염인 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 염증 장애가 호흡계 질환이고, 호흡계 질환이 낭성 섬유증인 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 염증 장애가 염증성 장 질환인 방법.
  27. 제 8 항에 있어서, 치료적 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제를 개체에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 치료제가 사이토카인 억제제, 성장 인자 억제제, 면역억제제, 항-염증제, 대사 억제제, 효소 억제제, 세포독성제, 및 세포증식억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  29. 제 27 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 치료제가 TNF 안타고니스트, 항-TNF 제제, IL-12 안타고니스트, IL-15 안타고니스트, IL-17 안타고니스트, IL-18 안타고니스트, IL-22 안타고니스트, T 세포-소실제, B 세포-소실제, 시클로스포린, FK-506, CCI-779, 에타네르셉트, 인플릭시마브, 리툭시마브, 아달리무마브, 프레드니솔론, 아자티오프린, 금, 술파살라진, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 미노시클린, 아나킨라, 아바타셉트, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 라파마이신, 라파마이신 유사체, Cox-2 억제제, cPLA2 억제제, NSAID, p38 억제제, B7.1, B7.2, ICOSL, ICOS 및/또는 CD28 의 안타고니스트, 및 CTLA4 의 아고니스트로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  30. 세포 집단 또는 개체에 IL-17F 신호전달 안타고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 세포 집단 또는 개체에서 NF-κB-반응성 프로모터를 활성화시키는 NF-κB 의 능력을 억제시키는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, IL-17F 신호전달 안타고니스트가 IL-17F 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, IL-17RC 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, 억제성 항-IL-17F 항체, 억제성 항-IL-17R 항체, 억제성 IL-17RC 항체, 및 안타고니스트성 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  32. 세포 집단 또는 개체에 IL-17F 신호전달 안타고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 세포 집단 또는 개체에서 IL-17F 생물활성을 억제시키는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, IL-17F 신호전달 안타고니스트가 IL-17F 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, IL-17RC 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, 억제성 항-IL-17F 항체, 억제성 항-IL-17R 항체, 억제성 IL-17RC 항체, 및 안타고니스트성 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, IL-17F 생물활성이 중성구 분화, 중성구 보충 및 사이토카인 유도로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  35. IL-17F 신호전달 안타고니스트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  36. 제 35 항에 있어서,IL-17F 신호전달 안타고니스트가 IL-17F 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, IL-17RC 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, 억제성 항-IL-17F 항체, 억제성 항-IL-17R 항체, 억제성 IL-17RC 항체, 및 안타고니스트성 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  37. IL-17F 신호전달 안타고니스트, 및 자가항원, 알레르기원, 이종항원, 및 그의 절편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원을 포함하는 백신 보조제.
  38. 제 37 항에 있어서, IL-17F 신호전달 안타고니스트가 IL-17F 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17RC 억제성 폴리뉴클레오티드, IL-17R 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, IL-17RC 또는 그의 IL-17F 결합 절편을 포함하는 용해성 폴리펩티드, 억제성 항-IL-17F 항체, 억제성 항-IL-17R 항체, 억제성 IL-17RC 항체, 및 안타고니스트성 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신 보조제.
  39. SEQ ID NO : 6 에 나타나 있는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체.
  40. SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, 및 SEQ ID NO:15 에 나타나 있는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체.
  41. 제 39 항에 있어서, IL-17F 신호전달에 대항하는 항체.
  42. 제 40 항에 있어서, IL-17F 신호전달에 대항하는 항체.
  43. IL-17F 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항체.
  44. 제 43 항에 있어서, IL-17F 단백질이 인간 또는 영장류 유래인 항체.
  45. 제 43 항에 있어서, IL-17F 단백질이 다량체성인 항체.
  46. 제 45 항에 있어서, IL-17F 단백질이 IL-17F 동종이량체 또는 IL-17F 이종이량체인 항체.
  47. 제 46 항에 있어서, IL-17F 단백질이 이종이량체이고, 여기서 IL-17F 이종이량체가 IL-17A/IL-17F 인 항체.
  48. 제 43 항에 있어서, IL-17F 생물활성을 억제시키는 항체.
  49. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, IL-17F 신호전달이 IL-17F 동종이량체, IL-17F 이종이량체, 또는 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 둘 다에 의해 매개되는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, IL-17F 신호전달이 IL-17F 이종이량체에 의해 일부 이상이 매개되고, 여기서 IL-17F 이종이량체가 IL-17A/IL-17F 인 방법.
  51. 제 32 항에 있어서, IL-17F 생물활성이 IL-17F 동종이량체, IL-17F 이종이량체, 또는 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 둘 다에 의해 매개되는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, IL-17F 생물활성이 IL-17F 이종이량체에 의해 일부 이상이 매개되고, 여기서 IL-17F 이종이량체가 IL-17A/IL-17F 인 방법.
  53. 제 35 항에 있어서, IL-17F 신호전달 안타고니스트가 IL-17F 동종이량체, IL-17F 이종이량체, 또는 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 둘 다에 대항하는 약학적 조성물.
  54. 제 37 항에 있어서, IL-17F 신호전달 안타고니스트가 IL-17F 동종이량체, IL-17F 이종이량체, 또는 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 둘 다에 대항하는 백신 보조제.
  55. IL-17F 신호전달에 대항하는 것을 포함하는, IL-21 신호전달과 연관된 하나 이상의 활성을 억제시키는 방법.
  56. IL-17F 신호전달에 대항하는 것을 포함하는 IL-23 신호전달과 연관된 하나 이상의 활성을 억제시키는 방법.
  57. 제 55 항에 있어서, IL-17F 신호전달이 IL-17F 동종이량체, IL-17F 이종이량체, 또는 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 둘 다에 의해 매개되는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, IL-17F 신호전달이 IL-17F 이종이량체에 의해 일부 이상이 매개되고, 여기서 IL-17F 이종이량체가 IL-17A/IL-17F 인 방법.
  59. 하기를 포함하는, 자연 IL-17A 단백질의 정제 방법 :
    a) 배지 내에서 T 세포를 활성화시킴 ; 및
    b) 배지로부터 IL-17A 단백질을 면역침전시킴.
  60. 하기를 포함하는, 자연 IL-17F 단백질의 정제 방법 :
    a) 배지 내에서 T 세포를 활성화시킴 ; 및
    b) 배지로부터 IL-17F 단백질을 면역침전시킴.
  61. 제 59 항에 있어서, IL-17A 단백질이 IL-17A 동종이량체, IL-17A 이종이량체, 또는 IL-17A 동종이량체 및 IL-17A 이종이량체 둘 다인 방법.
  62. 제 60 항에 있어서, IL-17F 단백질이 IL-17F 동종이량체, IL-17F 이종이량체, 또는 IL-17F 동종이량체 및 IL-17F 이종이량체 둘 다인 방법.
  63. 제 61 항에 있어서, IL-17A 단백질이 이종이량체이고, 여기서 IL-17A 이종이량체가 IL-17A/IL-17F 인 방법.
  64. 제 62 항에 있어서, IL-17F 단백질이 이종이량체이고, 여기서 IL-17F 이종이량체가 IL-17A/IL-17F 인 방법.
  65. 제 59 항 또는 제 60 항에 있어서, 배지가 IL-21 을 포함하는 방법.
  66. IL-17F 동종이량체 또는 IL-17F 이종이량체인 단리된 IL-17F 단백질.
  67. 제 66 항에 있어서, 자연 공급원으로부터 단리되는 IL-17F 단백질.
  68. 제 67 항에 있어서, 자연 공급원이 하나 이상의 T 세포인 IL-17F 단백질.
  69. IL-17A 단백질이 IL-17A 동종이량체 또는 IL-17A 이종이량체인 단리된 IL-17A 단백질.
  70. 제 69 항에 있어서, 자연 공급원으로부터 단리되는 IL-17A 단백질.
  71. 제 70 항에 있어서, 자연 공급원이 하나 이상의 T 세포인 IL-17A 단백질.
  72. IL-17F 안타고니스트를 투여하는 것을 포함하는, IL-17A 신호전달과 연관된 하나 이상의 활성을 억제시키는 방법.
  73. 하기를 포함하는, IL-17A 동종이량체 및 IL-17F 동종이량체가 실질적으로 없는 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 단리 방법 :
    a) 배지 내에서 배양된 숙주세포 내에서 IL-17A 융합 단백질 및 IL-17F 융합 단백질을 발현시킴 (여기서, IL-17A 융합 단백질은 제 1 친화성 태그에 융합된 IL-17A 단백질 또는 그의 절편을 포함하고, IL-17F 융합 단백질은 제 2 친화성 태그에 융합된 IL-17F 단백질 또는 그의 절편을 포함함) ;
    b) 숙주세포가 IL-17A 융합 단백질 및 IL-17F 융합 단백질을 배지 내로 분비 하도록 함 ;
    c) IL-17A 융합 단백질이 제 1 친화성 칼럼에 결합하도록 하는 비환원 조건 하에 제 1 친화성 칼럼 위에 배지를 놓음 ;
    d) 비환원 조건 하에 제 1 친화성 칼럼으로부터 결합 단백질을 용출시킴 ;
    e) IL-17F 융합 단백질이 제 2 친화성 칼럼에 결합하도록 하는 비환원 조건 하에 제 2 친화성 칼럼 위에 단계 d) 로부터 수득된 용출물을 놓음 ; 및
    f) 비환원 조건 하에 제 2 친화성 칼럼으로부터 결합 단백질을 용출시킴
    (여기서, 단계 f) 로부터 수득되는 용출물은 IL-17A 융합 단백질 및 IL-17F 융합 단백질을 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 형태로 함유함).
  74. 하기를 포함하는, IL-17A 동종이량체 및 IL-17F 동종이량체가 실질적으로 없는 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 단리 방법 :
    a) 배지 내에서 배양된 숙주세포 내에서 IL-17A 융합 단백질 및 IL-17F 융합 단백질을 발현시킴 (여기서, IL-17F 융합 단백질은 제 1 친화성 태그에 융합된 IL-17F 단백질 또는 그의 절편을 포함하고, IL-17A 융합 단백질은 제 2 친화성 태그에 융합된 IL-17A 단백질 또는 그의 절편을 포함함) ;
    b) 숙주세포가 IL-17A 융합 단백질 및 IL-17F 융합 단백질을 배지 내로 분비하도록 함 ;
    c) IL-17F 융합 단백질이 제 1 친화성 칼럼에 결합하도록 하는 비환원 조건 하에 제 1 친화성 칼럼 위에 배지를 놓음 ;
    d) 비환원 조건 하에 제 1 친화성 칼럼으로부터 결합 단백질을 용출시킴 ;
    e) IL-17A 융합 단백질이 제 2 친화성 칼럼에 결합하도록 하는 비환원 조건 하에 제 2 친화성 칼럼 위에 단계 d) 로부터 수득된 용출물을 놓음 ; 및
    f) 비환원 조건 하에 제 2 친화성 칼럼으로부터 결합 단백질을 용출시킴
    (여기서, 단계 f) 로부터 수득되는 용출물은 IL-17A 융합 단백질 및 IL-17F 융합 단백질 둘 다를 IL-17A/IL-17F 이종이량체의 형태로 함유함).
  75. 제 73 항 또는 제 74 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 단리된 IL-17A/IL-17F 이종이량체.
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Patent event code: PC12021R01D

Patent event date: 20090806

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