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KR20070100241A - 척수 외상 통증을 위한 말초로 전달된 글루탐산데카르복실라제 유전자 치료법 - Google Patents

척수 외상 통증을 위한 말초로 전달된 글루탐산데카르복실라제 유전자 치료법 Download PDF

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KR20070100241A
KR20070100241A KR1020077011768A KR20077011768A KR20070100241A KR 20070100241 A KR20070100241 A KR 20070100241A KR 1020077011768 A KR1020077011768 A KR 1020077011768A KR 20077011768 A KR20077011768 A KR 20077011768A KR 20070100241 A KR20070100241 A KR 20070100241A
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KR
South Korea
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vector
hsv
pain
spinal cord
gad
Prior art date
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Ceased
Application number
KR1020077011768A
Other languages
English (en)
Inventor
조셉 씨. 글로리오소
데이비드 제이. 핑크
대런 울프
데이비드 크리스키
Original Assignee
유니버시티 오브 피츠버그 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 베터란스 어페어즈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 피츠버그 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션, 더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 베터란스 어페어즈 filed Critical 유니버시티 오브 피츠버그 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
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Abstract

본원 발명은 글루탐산 데카르복실라제 (GAD) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 바람직하게는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 벡터를 제공한다. 또한, 본원 발명은 그와 같은 벡터 스톡 및 그와 같은 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 추가로, 본원 발명은 척수 손상 통증을 치료하는 유효량으로 글루탐산 데카르복실라제 (GAD) 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물에서 척수 손상 통증과 같은 통증 치료 방법을 제공한다.
글루탐산 데카르복실라제, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 척수 손상 통증

Description

척수 외상 통증을 위한 말초로 전달된 글루탐산 데카르복실라제 유전자 치료법{Peripherally delivered glutamic acid decarboxylase gene therapy for spinal cord injury pain}
연방 지원의 연구 및 개발에 관한 진술
본원 발명은 보훈부의 신경계 장애 및 뇌졸중 미합중국 연구소(United States National Institute of Neurological Disorders and Stroke and a Research Grant)에 의해 인정받았고, 인정 번호 NS044507, NS38850 및 NS43247 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본원 발명의 소정 권리를 가질 수 있다.
본원 발명은 통증 치료 방법 및 통증 치료용 조성물과 관련된 것이다.
척수 외상(spinal cord injury)에 따른 통증은 삶의 질에 부정적 영향을 주고 효율적인 재활을 방해하는 중요한 문제이다. 척수 외상(SCI)으로 고통스러워하는 거의 모든 환자들이 SCI 통증으로 문제를 겪고 있다. SCI 통증은 외상 정도(level) 또는 그 이하 정도가 될 수 있다. 각 개인에 대해, 상기 통증은 강도, 빈도, 1회 통증 지속 기간, 및 겪게 되는 통증의 형태가 달라진다. 겪게 되는 통증의 형태는 환자들에 의하면 쑤시고, 저리며, 아리고, 두근거리고, 화끈거리고, 압박하는 형태라고 기술된다. 통증은 종종 특정 신체 부위에서 설명되고, 신체 중 한쪽 또는 양쪽에서 일어난다. 통증은 지속적이거나 또는 간헐적이 될 수 있고, 신체의 위치 또는 활동과는 무관하다.
만성 SCI 통증은 척수 외상이 있을 때 시작되거나 또는 SCI 이후 수개월 또는 수해가 지나 천천히 발병될 수 있다. 만성 SCI 통증은 오랜 기간의 시간 동안 지속되고, 종종 통상적인 통증 치료에 대해서 반응을 잘 나타내지 않는다. 소정의 보고서에 따르면, SCI가 있는 사람의 90％가 또한 만성 SCI 통증을 겪고 있다. SCI 통증 정도는 단순한 괴로움에서부터 환자가 참을 수 없는 정도까지의 범위가 될 수 있다. SCI 이후의 만성 통증의 두 카테고리가 설명된다. 신경병증성 정도의 SCI 통증은 척수 외상 부위 근처에서 피부 절(dermatome)로 지칭된다. 신경병증성 정도보다 낮은 SCI 통증은 척수 외상 부위 이하에서 피부 절로 지칭된다. 전자는 종종 척수 외상 초기 단계 동안에 종종 나타나는데 시간이 지나면 해소되는 반면에, 후자는 천천히 발병하고 일반적으로 의료상 치료가 어렵다. 척수 외상에 따른 만성 SCI 통증은 삶의 질에 부정적 영향을 주고 효율적인 재활을 방해하는 중요한 문제이다.
SCI 통증은 근골격통 또는 신경통으로 분류될 수 있다. 근골격 SCI 통증은 뼈, 관절 및 근육과 같은 신체에 있는 조직의 과용으로 인해 발생한다. 이것은 종종 움직일 때 더 악화되고 움직이지 않을 때는 진정된다.
신경병증성 SCI 통증은 신경계에 의한 통증으로서 정상적인 감각의 비정상적 진행에 기인할 수 있다. 예를 들면, 척수와 뇌가 다른 방법으로 정상적인 감각을 통증으로 해석할 수 있다. 외상 정도인 신경병증성 SCI 통증은 실제 신경근 또는 척수 그 자체의 손상에 기인할 수 있다. 의사 및 다른 건강 관리 전문가들은 이것을 "국소 구심차단(segmental deafferentiation)" 또는 "대상 동통(girdle zone pain)"으로 지칭할 것이다. 이러한 형태의 신경병증성 SCI 통증은 일반적으로 양방향이어서, 예를 들면 환자의 위에서부터 환자의 등까지 완곡한 반복(circumferential pattern)을 따르게 된다. 다른 형태의 만성 통증과 마찬가지로, 이것은 초기 척수 외상 이후 처음 몇 주 동안에 발병할 수 있고, 또는 장시간에 걸쳐 더 천천히 발병할 수 있다. 외상 정도보다 낮은 확산성 신경병증성 SCI 통증(diffuse neuropathic SCI pain)은 중추 신경계에서 일어나는 실질적 변화에 기인할 수 있다. 이 SCI 신경병증성 통증은 종종 이질통(allodynia)(일반적으로 통증이 없는 것으로부터의 통증, 예를 들면 가벼운 접촉) 또는 통각과민(hyperalgesia)(보통 약한 통증을 유발하는 것에 의해 유발되는 극심한 통증, 예를 들면 핀에 찔림)과 관련된다.
임상 조건의 본질적인 특징을 반복하는 동물 모델의 선정은 손상된 척수에서의 신경화학적 변화의 동정을 가능하게 하였다. SCI 모델 중 한 모델에서, 실험용 랫트는 T13에서 척수의 측면 이등분(leteral hemisection)을 받도록 하였다. T13에서 실험용 랫트의 척수의 측면 이등분은 이등분 아래의 양쪽 뒷 다리(hind limb)에서 양방향의 통증-관련 행동을 만든다. SCI 모델은 SCI 통증의 신규 치료 방법을 테스트하기 위한 특유한 동물 모델을 제공한다.
SCI 이후에 γ-아미노 부티르산(γ-amino butyric acid, GABA) 기능 저하에 의해 활성화된 억제 메카니즘과 척수에서 칼시토닌 유전자-관련 펩티드(calcitonin gene-related peptide, CGRP)의 증가가 모두 보고되었다. 시냅스 전 및 시냅스 후에 작용하는, GABA-매개(GABA-mediated) 억제는 1차 구심성 신경(afferent)과 2차 척수시상로 뉴런 간의 통증반응 신경 전달의 강장 조절을 나타낸다. 척수 GABA에 의한 신경 전달의 약동력학적인 길항 작용은 신경병증성 SCI 통증에서 발견되는 것과 유사한 기계적 과민성을 발생한다. GABA 아고니스트 약물들 (예를 들면, 바클로펜)은 선택된 신경병증성 통증 증상의 치료제로서 승인되었지만, 심지어 수막공간내로 투여되었을 때 중추 신경계에서 GABA 수용체의 편재된 분포는, 바클로펜을 투여함에 있어 심각한 제한을 가하는 부작용을 발생하게 된다.
피하 접종에 의해 전달되는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus, HSV)에 기초한 벡터들이 선택된 후근절(dorsal root ganglia, DRG)의 뉴런에서 신경전달물질을 발현하는데 사용될 수 있음은 이미 입증되어 있다. 프로엔케팔린(proenkephalin)을 발현하도록 구성된 HSV 벡터는 염증성 통증, 신경병증성 통증, 및 뼈에 있는 암으로부터 발생되는 통증이 있는 설치류(rodent) 모델에서 국소 통증-완화 효과를 생성한다. SCI 통증은 일반적으로 아편유사제 치료법에 대해서는 무반응하는 것으로 밝혀졌지만, 이것은 수막 공간내 바클로펜에 대해서는 반응할 수 있다.
GAD를 위한 유전자 코딩을 포함하도록 설계된 아데노관련 바이러스(adenoassociated virus) 또는 헤르페스 앰플리콘 벡터들은 도입된 세포들에서 GABA를 발현하는데 사용될 수 있음을 다른 연구들이 입증하였다. 그러나, 이 연구에서 벡터들은 뇌의 신경핵(neuronal nuclei)에 직접 주입되었고, 통증이 있는 모 델 또는 실험에서는 사용되지 않았다.
현재, SCI 통증에 대해 일관적으로 성공한 의학적 치료법 또는 외과적 치료법이 없다. 현재 SCI 통증 치료법은 아편유사제 및 신경병증성 약물 치료를 포함한다. 이러한 치료법에 대한 반응율은 부작용에 의해 종종 제한된다. 불행하게도, 신경병증성 SCI 통증은 일반적으로 아편유사제 (예를 들면, 모르핀)에 반응하지 않는다. 소정의 경우에, SCI 통증은 또한 신경병증성 약물 치료(예를 들면, 소정의 항경련제 또는 항우울제)에 반응하지 않는다. 어떤 외과의사들은 통증이 있는 부위를 무감각하게 만들 수 있는 신경근 차단제(nerve root blocker)를 추천한다. 이와 같은 무감각하게 만드는 효과는 짧은 시간 동안만 지속된다. 가끔 추천되는 또 다른 접근 방법은 척수 후근 진입부(dorsal root entry zone, DREZ), 신경근절제술(rhizotomy), 또는 척수 시상로 절단술(cordotomy)과 같은 외과적 방법을 갖는 것이다. 이와 같은 방법은 궁극적으로는 SCI 통증 정도를 높여서 장기간에 걸쳐서는 신경병증성 SCI 통증을 악화시킬 수 있다.
말초 신경병증성 통증(peripheral neuropathic pain)은 또 다른 흔한 것으로서 다발신경병증 또는 구조 신경 손상(structural nerve injury)의 부대 증상을 치료하는 것은 어렵다. 아편유사제는 비교적 효과가 없고, 이들을 사용하는 것은 부작용에 의해 제한된다. 항우울제와 항경련제는 임의적으로 통제된 시도에서 효능을 입증하였지만, 그러나 치료 환자의 절반 이하에서 단지 50％ 완화를 제공한다. 신경병증성 통증의 기초가 되는 복잡한 메카니즘들 중에서, 부분적 신경 손상은 비정상적 통증 감도 및 신경병증성 통증 증상의 표현형 특징에 기여하는 척수에서의 GABA 작용에 의한 억제된 시냅스 흐름의 선택적인 감소를 발생시킨다. GABA 작용성 약물은 신경병증성 통증에서는 넓게 사용되지 않고 있는데, 왜냐하면 이와 같은 약물의 치료 영역(therapeutic window)이 별로 크지 않고, 그 투여량이 부작용에 의해 제한되기 때문이다.
그러므로, SCI 및 신경병증성 통증 치료를 위한 치료적 접근법에 대한 필요성이 존재하게 된다.
본원 발명의 요약
본원 발명은 글루탐산 데카르복실라제(glutamic acid decarboxylase, GAD) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 바람직하게는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus, HSV) 벡터를 제공한다. 또한, 본원 발명은 그와 같은 벡터의 스톡(stock) 및 그와 같은 벡터들을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 추가로, 본원 발명은 척수 외상 통증 치료를 위한 유효량으로, 글루탐산 데카르복실라제(GAD) 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물의 척수 외상 통증 또는 말초 신경병증성 통증 치료 방법을 제공한다. 이와 같은 유리점, 및 추가적인 발명의 특징은 하기에 있는 본원 발명의 상세한 설명 및 첨부되는 도면에 의해 명백해질 것이다.
본원 발명의 상세한 설명
본원 발명은 글루탐산 데카르복실라제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 소정의 적합한 유전자 전달 벡터가 될 수 있다. 적절한 벡터의 예는 플라스미드, 리포좀, 분자 칸쥬게이트(molecular conjugate)(예를 들면, 트랜스페린) 및 바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 상기 벡터는 바이러스 벡터이다. 적절한 바이러스 벡터는 예를 들면, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스에 기초한 벡터 및 파보바이러스에 기초한 벡터(예를 들면, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV)에 기초한 벡터, AAV-아데노바이러스 키메릭 벡터, 및 아데노바이러스-기초 벡터)를 포함한다. 당해 분야의 당업자들은 특정 조건에 적합한 벡터를 결정하는데 필요한 이해력을 갖고 있다.
바람직한 실시 형태에서, 벡터는 HSV에 기초하는 벡터와 같은, 헤르페스 바이러스에 기초한 벡터이다. HSV에 기초한 바이러스 벡터는 다양한 세포 형태에 핵산 서열을 도입하는 벡터로 사용하는데 적절하다. 성숙한 HSV 비리온은 152 kb인 선형의 이중-가닥으로 된 DNA 분자로 구성된 바이러스 게놈을 갖는, 둘러싸인 정이십면체의 캡시드로 구성된다. 바람직한 실시 형태에서, HSV에 기초한 바이러스 벡터는 한 개 이상의 필수 HSV 유전자의 결여가 있다. 물론, 택일적으로 또는 추가적으로, 벡터는 비-필수 유전자(non-essential gene)의 결여가 있을 수 있다. 바람직하게는, 한 개 이상의 필수 HSV 유전자의 결여가 있는, HSV에 기초한 바이러스 벡터는 복제 결함(replication deficient)이 있다. 대부분의 복제 결함 HSV 벡터들은 복제를 하지 못하도록 하기 위해 한 개 이상의 중간-초기(intermediate-early), 초기(early), 또는 후기(late) HSV 유전자를 제거하는 결실을 포함한다. 예를 들면, HSV 벡터는 ICP4, ICP22, ICP27, ICP47 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 즉시형-초기 유전자(immediate-early gene)의 결여가 있을 수 있다. HSV 벡터들의 장점은 장-기간의 DNA 발현과, 25 kb까지의 외인성 DNA 삽입을 적합하게 할 수 있도록 거대한 바이러스 DNA 게놈을 발생시킬 수 있는 잠복기(latent stage)로 들어가는 능력이다. HSV-기초 벡터들은 예를 들면, 미국특허 제5,837,532호, 제5,846,782호, 제5,849,572호 및 제5,804,413호와 국제특허출원 WO 91/02788호, WO 96/04394호, WO 98/15637호, 및 WO 99/06583호에서 개시되어 있고, 이들 문헌은 본원 명세서에서 참조로 편입되어 있다. 바람직하게는, HSV 벡터는 "다중 결여가 있고(multiply deficient)", 이것은 HSV 벡터가 바이러스 복제를 위해 필요한 한 개 이상의 유전자 기능에 결함이 있음을 의미한다. HSV의 서열은 인터넷 www. ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve＆db=nucleotide＆list_uids=9629378＆dopt=GenBank＆term=hsv-1＆qty=1에서 입수할 수 있고, 이것은 벡터를 설계할 때 목표로 하는 돌연변이의 발생을 용이하게 할 수 있다.
HSV 벡터는 HSV 게놈의 초기 부위(early region)에서만, HSV 게놈의 즉시형-초기 부위(immediate-early region)에서만, HSV 게놈의 후기 부위(late region)에서만, 또는 HSV 게놈의 초기 부위와 후기 부위 쌍방의 복제-필수 유전자 기능에 결여가 있을 수 있다. 또한, HSV 벡터는 본질적으로 전체 HSV 게놈이 제거될 수 있으며, 그와 같은 경우에는 바이러스의 역방향 말단 반복부(inverted terminal repeat, ITR)와 한 개 이상의 프로모터 또는 바이러스 ITR과 패키징 시그널(packaging signal) 중 적어도 어느 하나가 손상되지 않도록 하는 것(즉, HSV 앰플리콘)이 바람직하다. 제거되는 HSV 게놈의 상기 부위가 커질수록, 게놈에 삽입될 수 있는 외인성 핵산 서열의 조각은 더 커지게 된다. 그러나, 본원 발명의 벡터는 비-앰플리콘(non-amplicon) HSV 벡터가 되는 것이 바람직하다.
HSV 벡터의 서로 다른 부위의 결실이 포유 동물의 면역 반응을 변경시킬 수 있다고 평가되고 있다. 특히, 서로 다른 부위의 결실은 HSV 벡터에 의해 발생되는 염증 반응을 감소시킬 수 있다. 또한, HSV 벡터의 단백질 코트(protein coat)는 야생형 단백질 코트에 대해 형성된 중화 항체(neutralizing antibody)에 의해 인식될 HSV 벡터의 능력 또는 무능력을 감소시키도록 개조될 수 있다.
HSV 벡터가 다중 복제 결함(multiply replication deficient)일 때, HSV 벡터는 바람직하게는 단일 복제 결함 HSV 벡터에 의해 달성되는 것과 유사한, 상보적 세포 주에서 바이러스 성장을 제공하는 연결 요소(spacer element)를 포함한다. 상기 연결 요소는 바람직한 길이의 소정의 핵산 서열 또는 핵산 서열들을 포함할 수 있다. 상기 연결 요소 서열은 HSV 게놈에 대해 코딩 또는 논-코딩(non-coding) 및 본래 상태(native) 또는 비-본래 상태(non-native)가 될 수 있지만, 결여 부위에 복제 필수 기능을 복원시키지는 못한다. 또한, 소정의 또는 모든 결여된 HSV 부위에 연결 요소의 포함은 큰 삽입을 위한 HSV 벡터의 능력을 감소시킬 것이다. HSV 벡터의 제조는 당해 분야에서 공지된 표준의 분자생물학 기법의 사용을 포함한다.
복제 결함 HSV 벡터들은 통상적으로 복제 결함 HSV 벡터에는 존재하지 않는 유전자 기능을 제공하는 상보적 세포 주에서 제조되지만, 높은 역가(titer)의 바이러스 벡터 스톡을 생성하기 위해서는, 적절한 단계에서 바이러스 증식을 필요로 한다. 바람직한 세포주는 복제 결함 HSV 벡터에는 존재하지 않는, 한 개 이상 및 바람직하게는 모든 복제 필수 유전자 기능을 보충한다. 또한, 세포주는 누락하였을 때 성장 또는 복제 능력을 감소시키는 비-필수 유전자(예를 들면, UL55)를 보충할 수 있다. 상보적 세포주는 모든 HSV 기능(예를 들면, 역방향 말단 반복부 및 패키징 시그날 또는 ITR과 같은 최소한의 HSV 서열과 HSV 프로모터를 포함하는 HSV 앰플리콘의 증식을 가능하게 하는 기능)을 포함하여, 초기 부위, 즉시형-초기 부위, 후기 부위, 바이러스 패키징 부위(packaging region), 바이러스-관련 부위, 또는 이들의 조합에 의해 코딩되는 한 개 이상의 복제 필수 유전자 기능의 결함을 보충할 수 있다. 바람직하게는, 세포주는 추가로 HSV 벡터와 중복되지 않는 형태로 상보적 유전자를 포함하고 있어서, 세포내 DNA와 재조합하는 HSV 벡터 게놈의 가능성을 최소화하고, 실질적으로는 제거한다. 따라서, 벡터 스톡에서 피해지지만 않는다면, 복제 가능 HSV의 존재는 최소화되고, 따라서 소정의 치료상 목적, 특히 유전자 치료 목적을 위해 적절하다. 상보적 세포주의 작제는 당해 분야에서 공지되어 있는 표준 분자 생물학 기법 및 세포 배양 기법을 포함한다.
벡터가 복제 결함 HSV일 때, 단백질(예를 들면, GAD 단백질)을 코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 필수 HSV 유전자 좌위(locus)에 위치되고, 가장 바람직하게는 HSV 게놈의 ICP4 또는 ICP27 유전자 좌위 중 어느 하나에 위치된다. 핵산 서열의 HSV 게놈으로의(예를 들면, HSV 게놈의 ICP4 또는 ICP27 유전자 좌위로) 삽입은 공지된 방법, 예를 들면, HSV 게놈의 주어진 위치에서 특유의 제한 효소 부위(restriction site)의 도입에 의해 용이하게 될 수 있다.
본원 발명의 문맥에서 사용하기 위한 바람직한 HSV 벡터는 확장된(expanded) ICP4, 또는 ICP27 결실을 포함하고, 바람직하게는 쌍방 모두의 결실을 포함한다. 이 문맥에서 "확장된(expanded)" 결실이라는 것은, 바람직한 벡터는 이들의 제조에 사용된 상보적 세포주에 대해 이들 좌위 중 어느 일방 또는 쌍방에 소정의 상동 서열(homologous sequence)을 가지고 있지 않음을 의미한다. 바람직하게는, 바이러스는 소정의 남아있는 ICP4 또는 ICP27(또는 쌍방 모두) 코딩 또는 프로모터 서열을 가지고 있지 않다. 바람직하게는, ICP27에서의 결실은 UL55 좌위까지 연장되고, 바람직하게는 쌍방 유전자 모두가 결실된다. 따라서, 본원 발명에서 사용하기 위한 가장 바람직한 바이러스는 ICP4, ICP27 및 UL55에서 연장된 결실을 포함하여, 상보적 세포주에서 사용되는 이러한 유전자와 어떠한 바이러스 상동성(viral homology)도 없게 된다. 바람직하게는, 벡터는 상보적 세포주에서 사용되는 것에 대해 소정의 상동성 DNA 서열을 더 포함하지 않는다(예를 들면, 서로 다른 조절 서열과 폴리아데닐레이션 서열을 사용).
상기에서 언급된 바와 같이, HSV 벡터의 결실된 유전자 기능, 특히 필수 유전자 기능을 보충하는 세포주들이 벡터를 복제하는데 바람직하다(그리고 필수 HSV 유전자의 경우, 필요함). 따라서, ICP4 및 ICP2 쌍방이 없는 바람직한 벡터를 사용하기 위하여, 쌍방의 필수 유전자들을 보충하도록 설계된 세포주가 사용되어야만 한다. 또한, UL55 HSV 변종은 불충분하게 자라기 때문에, 그것을 보충하는 세포주는 벡터 백본(vector backbone)으로부터 결실될 때 사용하기에 바람직하다. 상보적 세포주를 생성하는 방법은 당해 분야의 당업자들에게 알려져 있다.
상기에서 밝힌 바와 같이, 또한, 본원 발명의 벡터는 GAD 단백질을 코딩하는 핵산 서열(즉, 한 개 이상의 GAD 단백질을 코딩하는 한 개 이상의 핵산 서열)을 포함한다. GAD 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 소정의 공급원으로부터 수득할 수 있는데, 예를 들면 자연으로부터 분리될 수 있고, 합성에 의해 만들어질 수 있고, 유전학적으로 설계된 유기체로부터 분리될 수 있고, 및 기타 같은 종류의 방법으로 수득할 수 있다. 통상의 당업자는 벡터에 삽입될 수 있는 소정 형태의 핵산 서열(예를 들면, DNA, RNA, 및 cDNA)이 본원 발명과 관련되어 사용될 수 있음을 알 것이다.
본원 발명 벡터의 핵산 서열은 분비되는 단백질, 예를 들면 감염된 세포에 의해 자연적으로 분비되는 단백질을 코딩할 수 있다. 택일적으로, 핵산 서열은 세포내 효소 촉매반응에 의해 분비되는 생성물(예를 들면, GABA) 또는 펩티드를 만드는, GAD와 같은 단백질을 코딩할 수 있다. 택일적으로, 핵산 서열은 세포에 의해 자연적으로 분비되지 않는 단백질(즉, 비-분비성 단백질(non-secretable protein))을 코딩할 수 있지만, 단백질 분비를 용이하게 하는 단일 펩티드(signal peptide)를 포함한다. 이러한 방식에서, 예를 들면, 핵산 서열은 소포체 국소 단일 펩티드(endoplasmic reticulum (ER) localization signal peptide)와 비-분비성 단백질을 코딩한다. ER 국소 단일 펩티드는 소포체 막으로 DNA, RNA, 및/또는 단백질을 지시하는 작용을 하며, 이때 단백질은 발현되어 분비 대상이 된다. ER 국소 단일 펩티드는 바람직하게는 (i) 세포에 의해서는 정상적으로 분비되지(즉, 분비가능하지) 않는 단백질들 및/또는 (ii) 세포에 의해서 정상적으로 분비되지만, 적은(즉, 목표로 하는 것보다 적은) 양으로 분비되는 단백질들의 세포에 의한 분비(즉, 분비 가능성)를 증가시키는 작용을 한다. 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 ER 국소 단일 펩티드는 소정의 적절한 ER 국소 단일 펩티드 또는 폴리펩티드(즉, 단백질)가 될 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열에 의해 코딩되는 ER 국소 단일 펩티드는 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 면역글로불린(Ig)(예를 들면, Ig K 선도 서열(leader sequence)), 및 미드킨(midkine, MK), 또는 이들의 일 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 또는 폴리펩티드(즉, 단백질)가 될 수 있다. 또한, 적절한 ER 국소 단일 펩티드는 Ladunga에 의해 등재된 Current Opinions in Biotechnology, 11, 13-18 (2000)에서 기술된 것들을 포함한다.
핵산 서열이 소정의 단백질을 코딩할 수 있지만, 바람직하게는 단백질은 GAD 단백질 또는 엔케팔린(enkephalin)이다. 수개의 서로 다른 유전자에 의해 코딩되는 포유 동물 GAD의 수개의 아이소형(isoform), 특히 GAD25, GAD65, 및 GAD67이 있다. 주로 막과 신경 말단에 표적이 되는 GAD65는 피리독살-5'-포스페이트 및 다른 보조 인자들에 의해 조절된다. GAD65는 시냅스 방출 준비에서 소포 내로 GABA 패키징의 원인이 되는 것으로 여겨진다. 포유 동물 GAD의 또 다른 아이소형인 GAD67은 주로 세포질 효소이고 그 효소 활성은 단백질 수준에 의해 조절되는 것 같다. GAD25는 GAD67의 대체 스플라이싱 변형체(alternate splicing variant)이다. 바람직하게는, 벡터는 GAD67을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 인간 GAD67 유전자의 코딩 서열과 코딩된 유전자 생성물(즉, 코딩된 단백질)의 아미노산 서열은 생물공학 정보를 위한 국립 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 웹사이트에서 각각 GenBank Accession No. NM_000817 (서열번호: 1) 및 NP_000808 (서열번호: 2)로 공개적으로 입수가능하다. 마찬가지로, 인간 엔케팔린 유전자의 코딩 서열과 코딩된 유전자 생성물(즉, 코딩된 단백질)의 아미노산 서열은 GenBank Accession No. NM_006211으로 공개적으로 입수가능하다.
핵산 서열은 전술된 단백질의 소정의 변형체(variant), 호모로그(homolog), 또는 기능성 부분(functional portion)을 코딩할 수 있다. 단백질 변형체는 상응하는 자연적으로 발생하는(naturally occurring) 단백질에서 한 개 이상의 돌연변이(예를 들면, 점 돌연변이, 결실, 삽입 등)를 포함할 수 있다. "자연적으로 발생하는" 이라는 것은 단백질이 자연에서 발견될 수 있고 합성에 의해 개조되지 않음을 의미한다. 따라서, 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 돌연변이가 도입될 때, 그와 같은 돌연변이는 바람직하게는 코딩된 단백질에서 치환을 초래하여, 양으로-하전된 잔기를 코딩하는 코돈(H, K, 및 R)은 양으로-하전된 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환되고, 음으로-하전된 잔기를 코딩하는 코돈(D 및 E)은 음으로-하전된 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환되고, 중성의 극성 잔기를 코딩하는 코돈(C, G, N, Q, S, T, 및 Y)은 중성의 극성 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환되고, 및 중성의 비-극성 잔기를 코딩하는 코돈(A, F, I, L, M, P, V, 및 W)은 중성의 비-극성 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환된다. 또한, 단백질의 호모로그는 아미노산 단계에서 상기 단백질에 대해 약 70％ 이상 동일한(바람직하게는 약 80％ 이상 동일한, 더 바람직하게는 약 90％ 이상 동일한, 및 가장 바람직하게는 약 95 ％ 이상 동일한), 소정의 펩티드, 폴리펩티드 또는 이들의 일 부분이 될 수 있다. 아미노산의 동일함 정도는 BLAST 서열 데이터베이스와 같은, 당해 분야에서 공지된 소정의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. "기능성 부분"은 자연적으로 발생하고, 측정가능한 수준에서 완전한-길이의 GAD 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 GAD 단백질의 소정의 일 부분이다. 벡터의 핵산 서열 발현에 의해 만들어지는 GAD 단백질의 기능성 부분은 GAD 단백질 부분을 코딩하는 핵산 서열로 일시적으로 감염된 인간 세포에서 GAD 단백질 부분의 생물학적 활성을 분석하는 것과 같은, 표준 분자 생물학 및 세포 배양 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현은 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된(operably linked) 적절한 발현 조절 서열(expression control sequence)에 의해 조절된다. "발현 조절 서열"은 또 다른 핵산 서열의 발현(통상적으로 및 바람직하게는 전사)을 개시하고, 높이고, 또는 조절하는 소정의 핵산 서열이다. 적절한 발현 조절 서열은 구성 프로모터(constitutive promoter), 유도성 프로모터(inducible promoter), 억제성 프로모터(repressible promoter) 및 인핸서를 포함한다. 벡터에서 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 그의 내인성 프로모터 또는, 바람직하게는 비-본래 상태의 프로모터 서열에 의해 조절될 수 있다. 적절한 비-본래 상태의 프로모터의 예는 HCMV 즉시형-초기 프로모터(HCMV IEp)와 같은 인간 사이토메갈로바이러스(human cytomegalovirus, HCMV) 프로모터, HIV 장 말단 반복서열 프로모터(HIV long terminal repeat promoter)와 같은 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)로부터 유래되는 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터, RSV 장 말단 반복서열과 같은 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(mouse mammary tumor virus, MMTV) 프로모터, Lap2 프로모터, 또는 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner 등에 의해 등재된 Proc . Natl . Acad . Sci, 78, 144-145 (1981)), SV40 또는 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr virus)로부터 유래되는 프로모터, 및 이의 등가물을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 프로모터는 HCMV IEp이다. HCMV IEp 프로모터는 재조합 HSV의 ICP4 좌위로 삽입될 수 있다. 택일적으로, 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현은 키메릭 프로모터 서열에 의해 조절될 수 있다. 프로모터 서열이 두 개 이상의 서로 다른 소스(예를 들면, 유기체 게놈의 두 개의 서로 다른 부위, 두 개의 서로 다른 유기체, 또는 합성 서열로 결합된 유기체)로부터 수득되고, 유래되고, 또는 기초하는 두 개 이상의 핵산 서열 부분을 포함한다면, 상기 프로모터 서열은 "키메릭"이 된다. 작동 가능하게 서열을 서로 연결시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다.
프로모터는 유도성 프로모터 즉, 적절한 시그널에 반응하여 상향-조절(up-regulated) 및/또는 하향-조절되는(down-regulated) 프로모터가 될 수 있다. 예를 들면, 약제학상 약물에 의해 상향-조절되는 발현 조절 서열(expression control sequence)은 통증 처리 적용시 특히 유용하다. 예를 들면, 프로모터는 약제학적으로-유도가능한 프로모터(예를 들면, 테트라시클린에 반응하여)가 될 수 있다. 그와 같은 프로모터의 예는 아리아드(Ariad)에 의해 판매된다. 프로모터는 당해 분야에서 공지된 방법, 예를 들면 게놈의 주어진 부위에서 특유의 제한 효소 부위의 도입에 의해, 벡터 게놈으로 도입될 수 있다. 택일적으로, 프로모터는 GAD와 같은 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트(expression cassette)의 일 부분으로 삽입될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 GAD 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 작동 가능하게 연결된다.
바람직하게는, 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 단백질을 코딩하는 부위의 3'에 위치된 폴리아데닐레이션 서열과 같은 전사-종결 부위를 더 포함한다. BGH(소 성장 호르몬), 폴리오마 바이러스, TK(티미딘 키나제), EBV(엡스테인 바 바이러스), 및 인간 유두종 바이러스 및 BPV(소 유두종 바이러스)를 포함하는 유두종 바이러스의 폴리아데닐레이션 서열뿐만 아니라, 합성으로 최적화된 서열을 포함하여, 소정의 적절한 폴리아데닐레이션 서열이 사용될 수 있다.
단백질을 코딩하는 핵산(프로모터와 전사-종결 부위를 포함) 외에, 벡터는 한 개 이상의 다른 유전자 생성물, 예를 들면 그 자체로 예방 또는 치료 기능을 수행하거나 또는 단백질의 예방 또는 치료 가능성을 증대시키거나 또는 강화하는 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 한 개 이상 더 포함할 수 있다. 추가적인 핵산 서열에 의해 코딩되는 유전자 생성물은 바람직한 활성을 갖는 RNA, 펩티드, 또는 폴리펩티드가 될 수 있다. 추가적인 핵산 서열이 예방 또는 치료상 이득을 준다면, 핵산 서열은 RNA 또는 단백질의 단계에서 그 효과를 발휘할 수 있다. 택일적으로, 추가적인 핵산 서열은 안티센스 분자, 리보자임, 스플라이싱 또는 3' 프로세싱(예를 들면, 폴리아데닐레이션)에 영향을 주는 단백질, 또는 mRNA 축적 또는 이동의 변경된 정도 또는 전사-후 조절(post-transcriptional regulation)의 변경을 매개함으로써 세포 내에서 또 다른 유전자의 발현 정도에 영향을 주는 단백질(즉, 이때 유전자 발현은 프로세스 단백질(process protein)의 생성을 통해 전사 개시로부터의 모든 단계를 포함하는 것으로 간주됨)을 코딩할 수 있다. 추가적인 핵산 서열은 조성물의 의도된 최종-목적에 따라, 예방 또는 치료 이득을 주는 다양한 유전자 생성물 중 소정의 어느 하나를 코딩할 수 있다. 또한, 추가적인 핵산 서열은 벡터의 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질 이외에 다른 표적에 작용하는 인자(factor)를 코딩할 수 있으며, 이 때문에 다원적(multifactorial) 치료를 제공하게 된다. 추가적인 핵산 서열은 병용 요법을 위한 키메릭 단백질을 코딩할 수 있다. 추가적인 유전자 생성물은 분비될 수 있고, 또는 세포가 용해되지 않는다면 또는 용해될 때까지 추가적인 유전자 생성물이 생성되는 세포 내에서 남아있을 수 있다. 다양한 유전자 생성물은 벡터의 치료 가능성을 높일 수 있다.
추가적인 핵산 서열은 하나의 유전자 생성물 또는 다수 개의 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 택일적으로, 각각 한 개 이상의 유전자 생성물을 코딩하는 다수 개의 추가적인 핵산 서열이 벡터에 삽입될 수 있다. 어느 한쪽 경우에서, 유전자 생성물(들)의 발현은 개별적인 발현 조절 서열에 의해 개별적으로 조절될 수 있고, 또는 하나의 공통된 발현 조절 서열에 의해 통합적으로 조절될 수 있다. 택일적으로, 추가적인 핵산(들)의 발현은 벡터의 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 조절하는 동일한 발현 조절 서열에 의해 조절될 수 있다; 그러나, 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 존재하는 소정의 전사 종결 부위는 추가적인 핵산 서열(들)의 읽고-지나가는 전사(transcriptional read-through)를 위해 제거될 것이다. 추가적인 핵산 서열(들)은 벡터의 핵산 서열의 발현에 의해 만들어진 단백질의 발현과 관련하여 본원 명세서에서 논의된, 소정의 적절한 발현 조절 서열(들)과 소정의 적절한 전사-종결 부위(들)를 포함할 수 있다.
벡터가 만들어진 후에, 벡터는 정제된다. 조성물에서 벡터의 농도를 높이기 위한 벡터의 정제는 소정의 적절한 방법, 밀도 구배 정제(density gradient purification)에 의해, 크로마토그래피 기법에 의해, 또는 제한된 희석 정제에 의해 수행될 수 있다. 벡터, 바람직하게는 복제 결함 HSV 벡터는 바람직하게는 HSV 벡터로 감염된 세포들을 용해하는 단계와 HSV 벡터를 포함하는 분획을 포집하는 단계로 이루어지는 방법을 사용하여, 복제 결함 HSV 벡터로 감염된 세포로부터 정제된다.
세포들은 디터전트(detergent)에 노출, 동결-융해(freeze-thawing), 및 세포 막 파열(예를 들면, 프렌치 프레스(French press) 또는 미세유동화(microfluidization)를 경유함)과 같은 소정의 적절한 방법을 사용하여 용해될 수 있다. 그런 다음, 선택적으로 세포 용해물은 적당한 원심 분리, 여과 또는 접선 흐름 여과(tangential flow filtration, TFF)와 같은 소정의 적절한 방법을 사용하여, 다수의 세포 찌꺼기들을 제거하기 위해 정제될 수 있다. 그런 다음, 정제된 세포 용해물은 선택적으로는 벡터 분자에 포함되지 않는 정제된 세포 융해물에 있는 DNA 또는 RNA를 제거하기 위하여 DNA 및 RNA를 분해시킬 수 있는 효소("DNase/RNase")로 처리될 수 있다.
일반적으로, 본원 발명의 재조합 HSV는 세포들이 예정된 수의 바이러스에 직면함을 확인하기 위하여, 충분한 바이러스가 세포 군체(cell population)로 전달될 수 있을 때, 가장 유용하다. 따라서, 본원 발명은 본원 발명의 HSV 벡터를 포함하는 스톡, 바람직하게는 균질한 스톡을 제공한다. HSV 벡터 스톡의 제조 및 분석은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 바이러스 스톡(viral stock)은 HSV 벡터로 형질 도입된 세포들을 포함하는 로울러 병(roller bottle)에서 제조될 수 있다. 그런 다음, 바이러스 스톡은 연속적인 니코덴제 구배(continuous nycodenze gradient)에서 정제되고, 분취될(aliquot) 수 있고, 필요할 때까지 보관될 수 있다. 바이러스 스톡은 역가(titer)에서 상당히 다양하고, 이것은 대개 바이러스 유전형 및 이들을 제조하는데 사용된 프로토콜과 세포주에 따라 달라진다. 바람직하게는, 그와 같은 스톡은 약 106 pfu 이상과 같은 약 105 플라크 형성 단위(plaque-forming unit, pfu)의 바이러스성 역가(viral titer)를 가지며, 또는 더욱 바람직하게는 약 107 pfu 이상의 바이러스성 역가를 가진다. 훨씬 더 바람직한 실시 형태에서, 역가는 약 108 pfu 이상, 또는 약 109 pfu 이상이 될 수 있고, 약 1010 pfu 이상 또는 약 1011 pfu 이상의 높은 역가를 갖는 스톡이 가장 바람직하다.
또한, 본원 발명은 HSV 벡터와 캐리어(carrier), 바람직하게는 생리적으로-허용가능한 캐리어를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물의 캐리어는 벡터를 위한 소정의 적절한 캐리어가 될 수 있다. 통상적으로, 캐리어는 액체 성분이 될 수 있고, 또한 고체 성분, 또는 액체 성분 및 고체 성분의 배합이 될 수 있다. 캐리어는 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한(예를 들면, 생리적으로 또는 약동력학적으로 허용가능한) 캐리어(예를 들면, 부형제 또는 희석제)이다. 약제학적으로 허용가능한 캐리어는 잘 알려져 있으며 쉽게 입수가능하다. 캐리어 선택은 적어도 부분적으로는 특정 벡터 및 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 조성물은 소정의 다른 적절한 성분, 특히 조성물의 안정성 및/또는 그의 최종-목적을 높이기 위한 성분들을 더 포함할 수 있다. 따라서, 본원 발명에 따른 조성물의 다양한 적절한 제형들이 있다. 하기의 제형 및 방법은 단순히 예로 든 것이며, 결코 제한되지 않는다.
비경구 투여에 적절한 제형들은 수성 및 비-수성, 등장성 멸균 주사 용액을 포함하고, 이들은 항-산화제, 버퍼, 세균 발육 저지제, 및 지정된 수령자의 혈액에 대해 제제가 등장성이 되도록 만드는 용질, 및 현탁제, 용해제, 증점제(thickening agent), 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 앰풀 및 바이엘과 같은 1 회-투여량 또는 복수 회-투여량으로 밀봉된 용기에 넣어질 수 있고, 주사용으로 사용하기 전에 즉시 멸균된 액성 부형제, 예를 들면 물의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조(동결 건조, lyophilized) 조건에서 보관될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 전술된 종류의 멸균된 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다.
또한, 조성물은 추가적인 치료 약물 또는 생물학적-활성 약물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 특정 징후의 치료에 유용한 치료 약물(therapeutic factor)이 존재할 수 있다. 이부프로펜 또는 스테로이드와 같은, 염증 억제 약물들은 벡터의 생체 내 투여 및 생리적 고통(physiological distress)과 관련된 종창 및 염증을 줄이기 위해, 조성물의 일 부분이 될 수 있다. 면역 시스템 억제인자가 벡터 자체에 대한 소정의 면역 반응 또는 장애와 관련된 소정의 면역 반응을 줄이기 위하여 조성 방법으로 투여될 수 있다. 택일적으로, 면역 증강제(immune enhancer)가 질병에 대한 신체의 자연적 방어력을 상향 조절하기 위하여 조성물에 포함될 수 있다.
항생제 즉, 살균제 및 항균제가 유전자 전달 절차 및 다른 장애와 관련된 감염 위험을 줄이기 위해 존재할 수 있다.
또한, 본원 발명은 척수 외상 통증 또는 말초 신경병증성 통증을 치료하는 유효량으로, 글루탐산 데카르복실라제 (GAD) 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본원 발명의 벡터 또는 조성물을 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물에서 척수 외상 통증 또는 말초 신경병증성 통증 치료 방법을 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 투여된 벡터는 바이러스 벡터이다. 바람직한 실시 형태에서, 포유 동물은 인간이다.
척수 외상 통증 또는 말초 신경병증성 통증 치료 방법은 다른 치료제 및/또는 방법의 효능을 변경하기 위한(예를 들면, 증가하기 위한) 약물 투여 단계(즉, 사전-투여, 동시-투여, 및/또는 사후-투여)를 더 포함할 수 있다. 본원 발명의 방법은 객체에서 조성물의 효과를 국소적으로 또는 전신으로 바꾸는(예를 들면, 줄이거나 높이는) 다른 물질의 투여를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 객체에서 벡터의 핵산 서열의 발현을 통해 만들어지는 단백질의 소정의 전신 효과를 줄이는 물질들이 객체에서 전신 독성 정도를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, 객체에서 벡터의 핵산 서열의 발현을 통해 만들어지는 단백질의 국소 효과를 높이는 물질들이 상기 객체에서 예방 또는 치료 효과를 만드는데 필요한 단백질의 농도를 줄이기 위해 사용될 수 있다. 그와 같은 물질들은 안타고니스트(antagonist), 예를 들면 벡터의 핵산 서열의 발현을 통해 생성된 단백질에 대한 가용성 수용체(soluble receptor) 또는 항체, 및 단백질의 아고니스트(agonist)를 포함한다.
당해 분야의 당업자는 치료 또는 예방 목적으로 동물(특히 인간)에게 본원 발명의 벡터와 본원 발명의 조성물을 투여하는 적절한 방법, 예를 들면 유전자 치료, 예방 접종 및 이들의 등가물(예를 들면, Rosenfeld 등에 의해 등재된 Science, 252, 431-434 (1991), Jaffe 등에 의해 등재된 Clin . Res ., 39(2), 302A (1991), Rosenfeld 등에 의해 등재된 Clin . Res ., 39(2), 311A (1991), Berkner에 의해 등재된 BioTechniques, 6, 616-629 (1988)을 참조)이 이용가능하고, 한 개 이상의 루트가 상기 조성물을 투여하기 위하여 사용될 수 있지만, 특정 루트가 또 다른 루트보다 더 속효성이고 더 효율적인 반응을 제공할 수 있음을 알 것이다. 바람직한 투여 루트는 척수의 후각(dorsal horn)에서 GABA를 방출시키기 위해, 말초 접종을 통한 DRG 뉴런의 형질 도입을 포함한다. 많은 실시 형태에서, 이것은 피하 접종에 의해 GAD 벡터를 전달함으로써 수행될 수 있는데, 이것은 SCI 통증 또는 말초 신경병증성 통증을 치료하는 본원 발명의 접근법의 매력적인 특징이 된다.
본원 발명의 문맥에서, 동물, 특히 인간에게 투여되는 투여량은 특정 벡터, 벡터를 포함하는 조성물 및 이들을 위한 캐리어(상기에서 논의됨), 투여 방법 및 특정 부위 및 치료될 유기체에 따라 달라질 것이다. 투여량은 목표로 하는 시간 틀 내에, 목표로 하는 반응, 예를 들면 치료 또는 예방 반응을 초래하는데 충분해야만 한다. 따라서, 본원 발명 조성물의 벡터 투여량은 통상적으로 약 1 x 105 이상의 파티클 유닛(particle unit)(예를 들면, 약 1 x 106 이상의 파티클 유닛, 약 1 x 107 이상의 파티클 유닛, 1 x 108 이상의 파티클 유닛, 1 x 109 이상의 파티클 유닛, 1 x 1010 이상의 파티클 유닛, 1 x 1011 이상의 파티클 유닛, 또는 약 1 x 1012 이상의 파티클 유닛)이 될 것이다. 벡터 투여량은 통상적으로 1 x 1013 이하 파티클 유닛(예를 들면, 4 x1012 이하 파티클 유닛, 1 x 1012 이하 파티클 유닛, 1 x 1011 이하 파티클 유닛, 또는 심지어 1 x 1010 이하 파티클 유닛)이 되지 않을 것이다.
도 1은 본원 발명에서 사용될 수 있는 일례가 되는 벡터 작제물(vector construct)이 도시된 개요도이다.
도 2는 발바닥 접종에 의한 QHGAD67 형질 도입으로 인한 허리 척수 후근 신경절(lumber dorsal root ganglia, DRG)에서 GAD67 mRNA 증가의 도해이다. 한 쪽 뒷 발에 1 X 109 pfu/ml QHGAD67 또는 QOZHG 30㎕를 피하 접종하고 1 주 후에, 전체 RNA가 풀링된(pooled) L4-L6 DRG (500 ng)로부터 추출되었고, 실-시간 PCR에 의해 증폭되었고, 표준 물질로 GAPDH를 사용하여 정량화되었다. QOZHG-형질 도입된 신경절에 대한 상대적 양이 표시된다. 평균±표준 평균 오차(SEM), N=6
도 3은 내부 표준으로서 β-액틴을 사용한 웨스턴 블롯에 의해 측정되었고 상대적 광학 밀도(relative optical density)에 의해 정량화된, 허리 척수의 등쪽 사분원으로부터 나온 단백질을 나타낸다. 평균±SEM, N = 6, ＊P<0.05. QHGAD67로 형질 도입한 후에 GAD67-유사 면역 반응력이 증가되었다.
도 4A는 생체 외에서 m.o.i. 1로 형질 도입된 프라이머리 DRG 뉴런으로부터 방출된 감마 아미노 부티르산(GABA)의 양이, 대조군 또는 QOZHG-감염된 세포에 비해 QHGAD67-감염된 세포에서 실질적으로 증가하였음을 보여주는 도해이다. 5분 동안 방출된 GABA는 하기 물질 및 방법 하에 설명된 바와 같이 HPLC에 의해 측정되었다. GABA 농도/웰 측정은 3회 수행되었고, 각각의 조건에 대해 3배의 시료들이 사용되었다. 평균±SEM, QOZHG 또는 비히클에 대해 ＊P<0.01. 도 4B는 생체 내에서 척수의 신경 말단으로부터 방출된 GABA 양이 척수 후각(dorsal horn)의 미세 투석액에서 HPLC에 의해 측정되었음의 도해이다. 1 X 109 pfu/ml QHGAD67 30㎕를 한 쪽 뒷 발에 피하 접종하고 1 주 후에, GABA 양(pmol/미세 투석액 중 10㎕ 부분)은 대조군 동물에 비해 QHGAD67-접종된 동물에서 실질적으로 증가되었다. 평균±SEM, N = 6, ＊P<0.05.
도 5A-D는 기계적 이질통과 온도 통각과민이 QHGAD67 접종에 의해 상당히 줄어들었음의 도해이다. 도 5A와 도 5B는 비히클-처리 동물(x)에서 보여지는 바와 같이, 반절단하고 1주 후에 발 회피 반응 역치(paw withdrawl threshold)(기계적 이질통)의 감소가 있었고 이것은 15주 동안 지속되었음을 입증한다. QHGAD67 접종 은 증가된 역치 값으로 반영되는 항이질통 효과를 만들었다(개방된 원). 최초 접종하고 7주 후에, QHGAD67 항이질통 효과는 감소하였지만, 동일 동물에 QHGAD67 재접종은 항이질통 효과를 복귀시켰다(QOZHG-접종된 것에 대해 ＊P<0.05, ＊＊P<0.01, N=6). 반절단에 대해 동(同)측(ipsilateral)(A) 및 반대 측(contralateral)(B). 도 5C와 도 5D는 반절단하고 1주 후에, 발 회피 반응 시간(paw withdrawl latency)(온도 통각과민)의 상당한 감소가 있었고, 벡터의 주입이 발 회피 반응 시간의 상당한 증가를 초래하였음을 입증한다(개방된 원). 최초 접종하고 7주 후 까지, QHGAD67의 항통각과민 효과 모두 감소하였지만, QHGAD67 재접종은 항통각과민 효과를 복귀시켰다(QOZHG-접종된 것에 대해 ＊P<0.05, ＊＊P<0.01, N=6). 반절단에 대해 동측(C) 및 반대 측(D). QOZHG-접종된 동물들(개방된 삼각형)은 모든 경우에서 비히클-처리된 대조군과 구별할 수 없었다(A-D).
도 6A와 도 6B는 반절단하고 3주 후 그리고 발 접종하고 2주 후에 수막 공간 내로 투여된 비큐쿨린(0.5 ㎍) 또는 파클로펜(0.5 ㎍)이 벡터 접종의 항이질통 효과(A)와 항통각과민 효과(B)를 부분적으로 역전(reverse)시켰음을 입증한다. 점선은 대조군 벡터 또는 비히클 접종된 동물에서 SCI 이후에 평균 역치 (A)와 회피 반응 시간 (B)을 나타낸다. 평균±SEM, N=6, 비히클-처리된 것에 대해 ＊P<0.05, ＊＊P<0.01.
도 7은 척수 후각에서 CGRP-유사 면역 반응력의 상대적 광학 밀도 측정의 히스토그램이다. 상대적 광학 밀도 측정은 각각 동물의 L5 분절에서 6개의 연속된 부분의 시리즈로부터 수행되었다. 점선은 비히클 또는 QOZHG 접종된 동물의 CGRP- IR 밀도가 T13 반절단까지 동측 및 반대 측 모두에서 실질적으로 증가하였음을 나타내고, QHGAD67 접종은 이러한 증가를 상당히 약화시킨다. 평균±오차, n=6, 비히클 또는 QOZHG에 비해 ＊P<0.051.
도 8은 본원 명세서에서 논의된 서열번호: 1을 도시한다.
도 9는 본원 명세서에서 논의된 서열번호: 2를 도시한다.
도 10은 본원 명세서에서 논의된 서열번호: 3-8을 도시한다.
도 11 (a)와 도 11 (b)는 신경병증성 통증에서 QOGAD67의 항통각 효과(antinociceptive effect)를 입증하는 데이타를 도시한다. (A) L5 척수 신경 결찰(spinal nerve ligation, SNL)은 촉각 자극에 대한 역치의 유효성 있는 감소를 초래하였고, 이것은 4개월 이상 지속되었다. QHGAD67의 피하 접종 (화살표)은 기계적 역치의 증가로 반영되는 항이질통 효과를 만들었다. 최초 접종하고 7주 후 QHGAD67 재접종 (화살표)은 항이질통 효과를 복귀시켰다. 결과는 평균±평균의 표준 오차로 나타낸다(개방된 원(open circle))QHGAD67; (닫힌 원(closed circle))QOZHG; ＊<P 0.05; ＊＊<P 0.01; n=한 그룹당 8마리의 동물. (B) 또한, L5 SNL은 유효성 있는 온도 통각과민을 초래하였고, 이것은 6주 동안 지속되었다. QHGAD67를 접종하고(화살표), 그러나 QOZHG를 접종하지 않은 경우, 척수 신경 외상에 의해 유도된 온도 통각과민을 역전시켰다. QOZHG-접종에 대해 ＊p < 0.05;＊＊<P 0.01; n=한 그룹당 8마리의 동물. 차이점의 통계적 유의성은 쉐페의 검정(Scheffe's F test)을 사용한 사후 비교 수로 보정된 분산 분석(StatView 5.2; SAS Institute, Cary, NC)에 의해 결정되었다.
도 12는 척수 후각에서 Fos-LI에 대한 QHGAD67 효과와 관계있는 데이타를 도시한 히스토그램이다. 척수 신경 결찰(spinal nerve ligation (SNL))하고 1주 지나고, 2주 후에 테스트 되었을 때(SNL하고 3주 후), 10분의 적당한 촉각 자극에 의해 유도된, 후각에 있는 Fos-LI은 QOZHG 접종된 랫트에서 현저하게 증가하였다. 이와 같은 증가는, SNL 이후 1주 지나고, 2주 후에 테스트 되었을 때(SNL하고 3주 후), QHGAD67 접종했었던 SNL 랫트에서는 차단되었으며, 그것은 후각의 제 I층판 내지 제 VI층판에서 발견되었다. 결과는 평균±평균의 표준 오차로 나타낸다. ＊＊p < 0.01; n=한 그룹당 5 마리. 또한, 샴-시술된 동물과 QOZHG 접종된 SNL 동물 간의 차이점은 통계학적으로 유효성이 있었다(p < 0.01).
도 13은 척수 후각에서 인산화된 세포외 시그날-조절된 키나제 1과 2(p-ERK 1/2)의 발현에 대한 QHGAD67의 효과와 관계가 있는 데이타를 그래프 형으로 나타낸 것이다. 결과는 평균±평균의 표준 오차로 나타낸다. ＊＊p < 0.01; ＊＊＊p < 0.001; n=한 그룹당 5 마리.
도 14는 ICP4 및 ICP27 좌위의 연장된 결실(extended deletion)과, UL55 결실을 갖는 HSV 벡터의 작제 과정을 도시한다.
하기 실시예들은 본원 발명을 추가로 설명하지만, 물론 본원 발명의 범위를 제한하는 소정의 방식으로 해석되어져는 안 된다. 이 실시예에서, 다수의 측정치가 기록되었고, 통계학적으로 분석되었다. 치료 벡터와 대조군 동물 간의 차이점의 통계적 유의도는 편차의 다변량 해석(multivariate analysis) 또는 비-파라미터 측정을 위한 크루스칼-왈리스 테스트(Kruskal-Wallis test)를 사용하여 결정되었다. P 값<0.05의 유의수준을 사용하여, 일회 비교는 스튜던트 T 테스트(Student's t test)로 수행되었다. 모든 데이터는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로 표현되었다.
실시예 1
이 실시예는 GAD 벡터 작제(construction)를 입증한다.
비 복제성 HSV 벡터 QHGAD67은 HSV 즉시형 초기 유전자(immediate early (IE) gene) ICP4, ICP22, ICP27, 및 ICP47의 발현에 결함이 있고, UL41 좌위에 인간 사이토메갈로바이러스 즉시형 초기 프로모터(human cytomegalovirus immediate early promoter, HCMV IEp)의 조절하에 있는 인간 GAD67 유전자를 포함한다(도 1). 조절 벡터 QOZHG (Chen 등에 의해 등재된 J. Virol, 74(21), 10132-41 (2000)에서 개시된 방법에 따라 작제됨)는 상기 동일 유전자의 결여가 있지만, 상기 동일 위치에서 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) lacZ 리포터 유전자(reporter gene)를 포함한다(도 1).
GAD67 cDNA (Bu, D.F.등에 의해 등재된 Proc . Natl . Acad . Sci USA, 89, 2115-2119 (1992)에 기재된 방법에 따라 작제됨)는 벡터의 UL41 유전자 좌위에서 효과적인 상동성 재조합(homologous recombination)을 할 수 있도록 하기 위하여, 프로모터 및 적절한 HSV 플랭킹 DNA 서열(flanking DNA sequence)을 포함하는 셔틀 플라스미드(shuttle plasmid) p41H에 인간 사이토메갈로바이러스 즉시형 초기 프로 모터의 ClaI/Xbal 단편 하류(downstream)로서 개별적으로 서브-클로닝되었다. LacZ 마커 유전자(marker gene)를 GAD 발현 작제물로 대체하기 위하여, PmeI-분해된 바이러스성의 및 표적 플라스미드 DNA로 7b 세포들을 보충하는 코트랜스펙션(cotransfection)에 의해, 발현/표적 카세트(expression/targeting cassette)를 벡터 QOZHG의 UL41 좌위로 재조합하였다. 재조합 QHGAD67을 3회의 제한 희석 정제법에 의해 정제하였고, 그 유전자 구조를 서던 블롯(Southern blot)에 의해 확인하였다. 롤러 바틀에 넣은 7b 세포에서 벡터 스톡을 제조하였고, 연속된 니코덴제 구배에서 정제하였으며, 분취하였고, 사용하기 위해 해동할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 최종 벡터 생성물의 역가를 Krisky, D. 등에 의해 등재된 In Methods in Molecular Medicine, Human Press, Totowa, NJ (1996)에서 기재된 바에 따라 결정하였다.
실시예 2
이 실시예는 ICP4 및 ICP27 좌위의 확장된 결실 및 UL55 결실을 갖는 HSV 벡터 작제를 입증한다.
이 벡터를 작제하기 위한 개요도는 도 14에서 설명되어 있다. 특히, QOZHG.1을 제조하기 위하여, 플라스미드 d1O6 (Hadjipanayis and DeLuca, Can Res 65(12): 5310-6 (2005))을 플라스미드 TOZ.1 (Arafat 등에 의해 등재된 Clin Can Res 6: 4442-8 (2000))과 바이러스로 교차시켰다. 벡터 QOZHG.1의 상세부는 실시예 1 및 Chen 등에 의해 등재된 J Virol 74(21), 10132-41 (2000)에서 개시된 작제 에 의해 설명된다.
플라스미드 pPXE (Niranjan 등에 의해 등재된 Mol Ther 8(4):530-42 (2003))를 QOZHG.1의 ICP27 좌위로 재조합하여, 이전의 ICP27 결실을 회복하였고 HCMV-eGFP 유전자를 제거하였다. 그런 다음, 형광 현미경 하에서 녹색 형광을 나타내지 않았던 플라크(plaque)를 선택함으로써, 단일한 재조합형(recombinant)을 분리하였고, 정제하였으며, 확인하였다. 상기 재조합형을 E1으로 칭하였다. E1은 GFP 유전자에 대해 음성이었고, LacZ 유전자에 대해 양성이었다.
UL41 코딩 서열을 포함하는 Hind Ⅲ에서 Not I 까지의 단편(HSV-1 게놈 뉴클레오티드 90145에서 93858까지)을 pBSSK(Stratagene)의 Hind Ⅲ에서 Not I 까지의 부위로 클로닝함으로써, 플라스미드 41HN를 제조하였다. 그런 다음, 플라스미드 41HN를 E1의 UL41 좌위로 재조합하여 야생형 UL41 유전자를 회복하였고 LacZ를 제거하였다. E1-1으로 명명된, 그 결과 생성된 벡터를 표준 방법에 의해 분리하였고, 정제하였고, 확인하였다. 이 벡터는 gfp 및 lacZ 유전자 모두에 대해 음성이었다.
HSV-1 KOS 변종(strain) 게놈(뉴클레오티드 124485-126413)의 Sph I에서 Afl Ⅲ (Sal I 링커됨)까지의 단편 (1928 bp)을 Sph I/Sal I 분해된 pSP72로 클로닝하고, 뒤이어 단형 역위 반복 부위(short inverted repeat region) 내에 포함된 바이러스 기원(viral origin)을 포함하는 ICP4 프로모터의 상류인 부위를 포함하는 695 bp의 Bgl Ⅱ에서 BamH I까지의 단편(뉴클레오티드 131931에서 132626)을, 상기 벡 터 플라스미드의 Bgl Ⅱ에서 BamH I까지의 부위로 삽입하여, 플라스미드 pSASB3를 제조하였다.
pSASB3의 BamHI 부위에 HCMV-eGFP 단편을 클로닝함으로써 플라스미드 pSASB3gfp를 작제하였다. 그런 다음, E1-1의 ICP4 좌위로 플라스미드 pSASB3gfp를 재조합하여 ICP4 결실을 확장하였다. 그런 다음, E1G6/d1O6-4HG으로 명명되는, 그 결과 생성된 벡터를 표준 방법에 의해 분리하였고, 정제하였고, 확인하였다.
HCMV 즉시형 초기 프로모터, SV40의 16s/19s RNA로부터의 SV40 인트론(180 bp XhoI-PstI), 전체 hPPE 코딩 서열, 및 SV40 폴리아데닐레이션 시그날(SV40 염기 2533에서 2729)을 포함하고 사우스 캐롤리나 대학(University of South Carolina)의 스티븐 윌슨(Steven Wilson) 박사로부터 얻은 플라스미드 pCMV-hPPE의 EcoR I에서 Sal I까지의 단편(Liu F, Housley PR5 Wilson SP. J Neurochem. 1996 Oct;67(4): 1457-62.)을 플라스미드 pSASB3으로 특정 Sal I 부위에서 클로닝함으로써, 플라스미드 pSASB3-HPPE를 만들었다. 이전의 EcoR I 분해, 뒤이어 EcoR I 부위의 클레노우 단편 블런팅(Klenow fragment blunting) 및 Sal I 링커로 연결에 의하여, hPPE 발현 작제물의 Sal I 방출이 가능하게 되었다. 그런 다음, 이 연결의 제조물을 Sal I으로 분해하여, Sal I 플랭크된(flanked) 발현 작제물을 정제하였다. 바바라 스프루스(Barbara Spruce) 박사로부터 얻은 cDNA 클론 pUR292로부터 둔단된(blunt-ended) pUR292의 946 bp BamHI-HindⅢ 단편으로서 pCMV-hPPE을 서브클로닝하였고, NotI 링커를 첨가하였고, 발현 플라스미드 pCMVB의 특정 NotI 부위로 클로닝하였다.
최종 엔케팔린 발현/ICP4 표적 작제물(targeting construct) (pSASB3-HPPE)은 하기 요소들을 포함한다: 1) ICP4 좌위를 타겟으로 하는 5' 재조합 플랭킹 서열을 제공하는, HSV 게놈의 131931에서 132626까지의 염기, 2) 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 즉시형 초기 프로모터 (immediate early promoter, IEp), 3) SV40 16s/19s 인트론 스플라이스 도너(intron splice donor)와 억셉터(acceptor) 부위, 4) 프리프로엔케팔린(preproenkephalin) cDNA, 5) SV40 후기 폴리아데닐레이션 시그날, 6) ICP4 좌위를 타겟으로 하는 3' 재조합 플랭크를 제공하는 HSV 게놈의 124485에서 126413까지의 염기.
그런 다음, 플라스미드 pSASB3-hppe를 E1G6/d106-4HG의 ICP4 좌위로 재조합하여, 유전학적으로 6221로 알려진, NurelP1 (NP1) 벡터를 만들었다.
Bgl II - BamH I 플랭크된 유비퀴틴 프로모터(ubiquitin promoter)에 의한 Red2(인비트로겐, Invitrogen)를 PSP4의 BamH I 부위에 클로닝함으로써 플라스미드 PS-UB6R-6을 만들었다. PSP4의 BamH I 부위는 5' ICP27 플랭크 단편(flank fragment)과 UL56 코딩 서열 사이에 위치하고 있다.
플라스미드 PS-UB6R-6을 NP1의 ICP27 좌위로 재조합하여, ICP27 및 UL55 모두를 포함하여 ICP27 결실을 확장하고 UB6-Red 유전자를 삽입하였다. 붉은 색 플라크를 선택함으로써, HPPE6221R로 명명되는 그 결과 생성된 벡터를 분리하였고, 정제하였고, 확인하였다.
EcoR I에서 BamH I 까지(HSV-I 게놈의 110095에서 113322까지)의 서열 5'에서 ICP27 코딩 서열까지를 플라스미드 PS.2로 클로닝함으로써, 플라스미드 PSP4를 만들었다. PS.2는 pBSSK(Stratagene)의 Not I 부위로 연결된 Dde I에서 Sma I 까지(HSV-I 게놈의 단편 116156에서 117119까지)의 블런트 엔드(blunt end)를 포함한다.
플라스미드 PSP4를 HPPE6221R 벡터의 ICP27 좌위로 재조합하여, UB6-Red를 제거하고 ICP27/UL55 결실을 남겨두었다. 표준 방법에 의해, NurelP2 (NP2)로 명명되는 그 결과 생성된 벡터를 분리하였고, 정제하였고, 확인하였다.
플라스미드 pSASB3GFP를 NP2의 ICP4 좌위로 재조합하여, HCMV-hppe를 HCMV-eGFP로 대체하였다. 표준 방법에 의해, SAS2로 명명되는 그 결과 생성된 벡터를 분리하였고, 정제하였고, 확인하였다.
플라스미드 pRC2 (인비트로겐)를 1) HinDIII 부위를 ClaI 부위로, 2) BbvII 부위를 HinDIII 부위로, 3) 그 결과인 HinDIII 부위를 BgⅢ 부위로 변환시킴으로써 순차적으로 개조하여, 플라스미드 pRC2HB2를 만들었다. 약 1200 염기 쌍인 pRC2HB2의 BgIII 단편을 플라스미드 pSHB3을 만드는 플라스미드 pSASB3의 BamHI 부위로 클로닝하였다. 개별적으로는, HinDIII 부위를 BamHI 부위로 변환시킴으로써 GAD67 클론을 개조하여, pGADHB2를 만들었다. pGADHB2로부터의 그 결과 생성된 2.8kb BamHI 단편을 pSHB3의 BamHI 부위로 클로닝하여, pGADL1을 만들었다.
플라스미드 pGAD-L1을 SAS2의 ICP4 좌위로 재조합하여, 벡터 NurelG2 (NG2)를 제조하였다.
벡터 NP2, SAS2 및 NG2는 세포 주와 어떠한 상동성을 가지지 않는 벡터이므로, 세포 주와 벡터 간에는 어떠한 상동성 재조합이 일어날 수 없다. 그러므로, 이러한 벡터들은 벡터 제조를 위한 세포 ICP4, ICP27, UL55 보충 주(complementing line)와 결합하여 사용하는데 이상적이다.
실시예 3
이 실시예는 GAD 벡터 형질 도입된 세포들에 의한 GAD 단백질의 발현을 입증한다.
실험용 랫트의 뒤쪽 발 발바닥 표면에 QHGAD67를 피하 접종하고 일 주일 후에, 실-시간 RT-PCR로 측정한 풀링된(pooled) L4-L6 DRG에 있는 GAD67 mRNA 양은, QOZHG로 형질 도입된 몸 반대 측(contralateral) DRG에서의 양보다 5배 높았다(도 2). 또한, 형질 도입된 DRG에서 GAD67 면역 반응력(immunoreactivity)은 반대 측 (비히클-주입된) DRG에 비해, 모든 크기의 광범위한 스펙트럼의 DRG 뉴런들의 뉴런에서 나타났다. 웨스턴 블롯으로 측정한 GAD67 단백질은 샴-접종된(sham-inoculated) 대조군에 비해(0.025±0.006 OD 유니트, P＜0.01), 허리 DRG 모두에서 상당히 증가하였다(0.048±0.009 OD 유니트).
11 x 109 pfu/㎖ QHGAD67 30㎕를 피하 접종하고 일 주일 후에, 반대 측 (비히클-주입된) 척수 후각에 비해, 증가된 면역 반응력이 제Ⅱ 층판(lamina)과 제Ⅲ 층판에서 현저하게 나타남을 보았다. 대조군 랫트의 표면 척수 후각(superficial dorsal horn)에서, GAD67 면역 반응력은 표면 척수 후각에서 내인성 GABA-성 연합 뉴런에서 보일 것 같은 신경성 연장(neuritic extension)이 거의 없고, 정맥류성 종창(varicosity) 또는 축삭 말단이 될 것 같은 다소 보다 작고, 중단되며, 짙게 염색되고, 불규칙한 프로파일을 가지며, 제Ⅲ 층판의 작은 범위의 세포에서 주로 발견되었다. 면역 염색 강도는 QHGAD67로 형질 도입된 DRG의 액손의 중추 터미날(central terminal)을 포함하는 척수 후각에서 실질적으로 증가하였고, 증가된 면역 반응력은 액손 터미날을 나타내는 불규칙한 프로파일에서 발견되는 것으로 나타났다. 웨스턴 블롯에 의할 때, 그와 같은 액손의 중추 터미날을 포함하는 허리 분절(lumber segement)의 척수 후각에 있는 GAD의 양은, 샴-접종된 대조군(0.027±0.004 OD 유니트)과 비교할 때, 상당히 증가하였다(0.041±0.008 OD 유니트)(P＜0.01, 도 3).
실-시간 RT-PCR에 의한 GAD RNA의 분석을 하기와 같이 수행하였다:L4-6 DRG를 빨리 제거하였고, 전체 RNA를 트리리즌트(TriReagent(Sigma))를 사용하여, 풀링된 L4-6 신경절로부터 추출하였다. DNase I 분해 후에, 옴니스크리프트 역전사 효소(OmniScript reverse transcriptase, Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여, 제 1-선형(first-strand) cDNA를 만들었다. GAD67과 GAPDH를 위한 프라이머와 프로브(Synthegen, Houston, TX, USA)를 프라이머 익스프레스(Primer Express)(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 설계하였다. GAD67 정방향 프라이머(forward primer) 서열번호 3; 역방향 프라이머 서열번호 4; 프로브 서열번호 5(Synthegen); GAPDH 정방향 프라이머 서열번호 6; 역방향 프라이머 서열번호 7; 프로브 서열번호 8(Invitrogen). 전체 부피 50㎕으로 ABI 프리즘 7700 서열 확인 시스템(Applied Biosystems)에서 PCR을 수행하였다. 내부 대조군으로 GAPDH를 사용하여 RNA 양을 측정하였고, Q0ZHG로 형질 도입된 DRG에 대해 계 산하였다. 각각의 PCR 증폭은 하기의 조건을 사용하여 3배로 웰에서 수행하였다.:50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 뒤이어 95℃에서 15초 동안 40 사이클 및 60℃에서 1분.
하기 프로토콜에 따라 웨스턴 블롯에 의해 GAD67 단백질의 양을 측정하였다: L4-L6 DRG 또는 척수의 요수 팽대(lumber enlargement)의 등쪽 사분원(L4 내지 L6 분절)을 60 mM 포스페이트 완충용액, pH 7.4, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 및 0.5％ 트리톤 X-100으로 구성되는 균질화용 완충용액(homogenization buffer) (100 mg 조직/㎖)에서 소니케이션시켰다. 균질 현탁액을 TL 100 울트라센트리퓨지 (Beckman)를 사용하여 100,000 g에서 15 분 동안 원심 분리하였고, 상층액에 있는 전체 단백질을 브래드포드 분석방법(Bradford assay)(BioRad, Hercules. CA, USA)에 의해 측정하였다. 단백질을 4-15％ SDS 구배 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하였고, 니트로셀룰로오스 막(Immobilon-P, Millipore, Billerica, Ma, USA)으로 옮겼고, 래빗 안티-GAD67(1:4000, Chemicon, Temecula, CA, USA)에서 배양하였고, 뒤이어 호스래디쉬 페록시다제-칸쥬게이티드 고트 안티-마우스(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse)(1:10,000, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA)에서 배양하였고, 높인 화학 발광(NEN, Boston, MA, USA)으로 검출하였다. 막을 벗기고, 로딩 대조군(loading control)으로서 래빗-안티-β-액틴(rabbit anti-β-actin)으로 다시 프로브하였다. 각각의 밴드의 강도를 PC-기초 이미지 분석 시스템(PC-based image analysis system)(MCID, Imaging Research; Brock, Ontario, Canada)을 사용하여 정량 농도 측정계에 의해 결정하였다.
실시예 4
이 실시예는 GAD 벡터 형질 도입된 세포에서 증가된 GABA의 방출을 입증한다.
감염 다중도(multiplicity of infection, m.o.i.) 1로 및 QHGAD67로 생체 외에서 형질 도입된 프라이머리 DRG 뉴런은 대조군으로부터 방출된 양(2.34±0.22 pmol/10㎕, P＜0.01), 또는 Q0ZHG-형질도입된 DRG 뉴런으로부터 방출된 양(2.56±0.64 pmol/10㎕, P＜0.01)보다 실질적으로 더 높은 양(9.53±2.15 pmol/10㎕, P＜0.01)으로, 배지에 GABA를 방출하였다. 1 주일 일찍 발쪽 피하 접종에 의해 형질 도입된 DRG의 중추 터미날로부터 등쪽 척수(dorsal spinal cord)로 방출된 생체 내 GABA 양은 동측 허리의 척수 후각에 주입된 카테터로부터 얻은 미세투석(microdialysis)에 의해 결정하였다. Q0ZHG로 접종된 동물로부터 포집된 투석액에 포함된 GABA는 1.46±0.25 pmol/10㎕(P＜0.05)을 포함한, QHGAD67로 접종된 동물의 투석액에 비하여, 0.74±0.24 pmol/10㎕를 포함하였다(도 4B).
17 일령 랫트 엠브리오로부터 분리된 DRG 뉴런을, 24-웰 플레이트에 105 세포/웰의 밀도로, 폴리-D-리신-처리된 커버슬립에 플레이트하였다. 각각의 웰은 7.0S NGF (Sigma, St. Louis, MO) 100 ng/㎖를 보충하고, B27, 글루타막스(Glutamax) Ⅰ, 알부막스(Albumax) Ⅱ, 및 페니실린/스트렙토마이신(Gibco-BRL, Carlsbad, CA)를 포함하는 500 ㎕ 뉴로베이슬(Neurobasal) 배지를 포함하였다. 배양하고 14일 될 때, 세포들을 QHGAD67 또는 Q0ZHG 중 어느 하나로 m.o.i. 1로 1시 간 동안 감염시켰고, 그 이후에 바이러스를 제거하였다. 48시간 후에, 인공 뇌척수액 100㎕로 배지를 교체하였고, 포집 시간 5분 후에, 배양액(bathing solution)을 10,000g에서 5분 동안 원심분리하였고, 상층액을 채택하여 HPLC로 GABA를 측정하였다. 면역 세포 화학에 의해 GAD 67 단백질 발현을 DGR 세포로 조사하였다.
생체 내에서 척수 후각에 있는 신경 터미날로부터 방출된 GABA 양은 하기 프로토콜을 사용하여 미세 투석액의 HPLC로 측정하였다.: 랫트를 클로랄 하이드레이트(400 mg/kg)로 마취시켰고, 척수 허리 분절 위에 놓은 척추뼈 고리판(vertebrae lamina) T11 및 T12을 경질막을 손상시키지 않은 상태로 제거하였고, 동물들을 정위적 장치(stereotaxic apparatus)에 두었다. 방열 램프(heating lamp)를 사용하여 열 손실을 차단하였고, 피드백 센서(feedback sensor)를 사용하여 체온을 37.5℃로 유지하였다. 날카로운 니들로 중앙선의 측면으로 작은 경막 절개를 하였고, 미세 투석 탐침 (CMA/11, 쿠프로판 투석 막, 길이 1 mm, 직경 0.24 mm, 분자량 차단 6kDa, CMA/Microdialysis, Stockholm, Sweden)을 경막 절개 부위를 통해 척수 후각 안으로 삽입하였고, 1 ㎕/분의 속도로 인공 뇌척수액을 관류시켰다. 세포 외 액과 평형이 되도록 1 시간 지난 후에, 1 시간 동안 시료를 포집하였다. 실험 종료시에, 탐침에 대해 공기 방울 존부를 체크하였고, 관류-고정된 부분의 현미경 검사로 척수 후각에서의 위치를 확인하였다.
다음으로, 생체 외에서 형질도입된 세포로부터 방출된, 또는 생체 내에서 미세 투석에 의해 포집된 GABA 양은 6-아미노퀴놀일-N-하이드록시숙시니미딜-카바메이트 유도체화(AccQ.Fluor Reagent Kit; Waters, USA)를 갖는 HPLC를 사용하여 측 정하였다. 배양 용액 20 마이크로리터를 보레이트 버퍼 60 ㎕에 넣은 유도체화제 20 ㎕와 혼합하였고; 얻은 시료 10 ㎕가 55℃에서 10분 동안 반응하도록 하였고, 용리액 A(물)와 아세토니트릴을 포함하는 이동상 및 1 ㎖/분의 유속으로 AccQ.Taq 컬럼 (3.9 x 150mm; Waters)에서 구배 HPLC (Waters 2695 Separations Module)에 의해 분리하였다. 여기 파장 250 nm와 방출 파장 395 nm을 사용하여, 37℃에서 형광(Waters 2475 Detector)에 의해 피크를 검출하였다.
하기 프로토콜에 따라, 실험용 랫트에게 수막 공간 내 카테터를 수술에 의해 이식하였다.: Storkson 방법을 변형하여, T13이 척수 반절단에 남겨지고 1주 후에, 수막 공간 내 카테터를 1주 동안 넣었다. 간단하게는, 동물을 클로랄 하이드레이트(400 mg/kg)로 다시 마취시켰고, 중앙선으로부터 몇 밀리미터를 남겨두고, L2부터 L6까지 세로선 절개를 하였고, 폴리에틸렌 카테터 (PE-10, Clay Adams, Parsippany, NJ, USA)를 L4-L5 척수 사이 공간부터 허리 지주막하 공간으로 주입하여, 카테터 끝이 척수의 요수 팽대 근처에 위치하도록 하였다. 소용없는 공간(dead space) 7 ㎕를 남겨놓고, 카테터 말단 끝을 피하로 관통시켜 목에서 나타나도록 하였다. 수막 공간 내 카테터 이식 후에, 랫트를 개별적인 케이지에서 사육하였고, 운동 기능 장애의 징후를 보인 동물들을 죽였다. 20-30분 동안 지속되는 운동 마비를 만들기 위해, 리도카인 (20 mg/ml) 15 ㎕, 뒤이어 식염수 8 ㎕ 주입에 의해 카테터 말단의 위치를 확인하였다. 깨어 있고, 잠깐 구금된 랫트에 대해, 수막 공간 내 카테터와 연결된 미세주입용 시린지(Hamilton Co., Reno, NV, USA)를 사용하여, 수막 공간 내 약물 투여를 수행하였다.
실시예 5
이 실시예는 실험용 랫트에게 GAD 벡터의 피하 접종이 SCI 이후의 기계적 이질통(mechanical allodynia)과 온도 통각과민(thermal hyperalgesia)을 감소시킴을 입증한다.
T13이 척수 반절단 상태로 된지 1일 후에, 모든 동물들은 척수 반절단 반대측 뒷 팔다리에서는 어떠한 운동 기능장애 없이 동측 뒷 팔다리에서 마비를 나타내었다. 척수 반절단하고 2주 후에, 운동 기능의 상당한 회복이 있었다(12-13의 BBB 스코어, 데이타는 도시되지 않음). 빈번하게-일관적이고 체중을-지지하는 인체 모형 단계 및 가끔 앞다리-뒷다리 조화와 일치하는, BBB 스코어 12는 몸 감각으로-유도된 발 회피의 완전한 행동 테스트를 하기에는 충분하다. 척수 반 절단하고 1주 후에, 시술 전 역치(threshold)(11.2±1.68 g 동측, 11.6±1.71 g 반대 측)와 비교할 때, 본 프레이 필라멘트 자극(von Frey filament stimuli) 등급 시리즈까지 뒷-발 회피 반응 역치의 상당한 감소(1.71±0.35 g 동측, 1.9±0.52 g 반대 측)에 의해 입증되는 바와 같이, 양쪽 뒷발에서는 기계적 이질통이 관찰되었다. 척수 반 절단하고 1주 후에, 뒷발 발바닥 표면의 좌우 양측에 QHGAD67 (1 x 109 pfu/ml, 30㎕/발)의 피하 접종은, 접종하고 1주 후(손상하고 2주 후)에 측정된 바에 따르면, 뒷발 회피반응 역치(4.4±1.12 g 동측, 4.1±0.75 g 반대 측)를 증대시켰다. QOZHG으로 접종된 대조군 동물들은 그들의 기계적 역치에서 소정의 변화를 보여주지 않았다(1.8±0.28 g 동측, 1.6±0.34 g 반대 측, P<0.01 QHGAD67와 비교). 최 대 항이질통 효능(maximal antiallodynic effect)(즉, 발 회피 반응 역치의 증가)은 QHGAD67 접종하고 2주 후에 나타났고(5.19±0.82 g 동측 및 5.8±1.14 g 반 대측), 및 항이질통 효능은 5주 동안 계속되어, 접종한 후 6주에는 2.86±0.63 g 동측 값 및 3.2±0.47 g 반대 측 값까지 감소시켰다(도면 5A와 5B). 최초 접종하고 6주 후에 발바닥 양쪽으로 동일 투여량의 QHGAD67 재접종은 항이질통 효능을 복구하였다. 재접종에 의해 얻어진 효과의 크기는 적어도 벡터 최초 주입에 의해 만들어진 효과만큼 컸으며, 재접종에 의해 만들어진 효과의 지속 시간은 최초 접종으로 만들어진 지속 시간보다 약간 더 길었다(6-7주). 모든 시점에서 QOZHG-접종된 랫트와 비히클-처리된 랫트 간에 소정의 유효성 있는 차이점은 없었다(도 5A와 5B).
척수 반 절단한 후, 또한 동물들은 시술하기 전 값(12.6±1.23 s 동측, 12.1±1.25 s 반대 측)에 비해 해로운 온도 자극에 감응하여 회피 반응을 보이는 시간(withdrawl latency)의 감소(6.7±0.51 s 동측, 6.9±0.6 s 반대 측)에 의해 입증되는, 온도 통각과민을 입증하였다. QHGAD67 접종하고 1주 후에(척수 반 절단하고 2주 후에), QOZHG-접종된 대조군(6.5±0.43 s 동측, 7.1±0.42 s 반대 측)에 비해, 온도에 대해 회피 반응을 보이는 시간(thermal latency)에 있어서 통계학적으로 유효성 있는 증가가 있었다(8.8±0.48 s 동측, 8.7±0.71 s 반대 측). 피크 효과가 접종하고 4주 후에 나타난 것을 제외하고는(9.7±0.71 s 동측, 9.62±0.78 s 반대 측), 항통각과민 효과의 시간 코스는 벡터의 항이질통 효과의 시간 코스와 유사하였다(도 5C와 5D). 6주 되었을 때, 또한 QHGAD67 벡터의 재접종은 항통각과민 효과를 복구하였다. 두 번째 접종한 후에, 항통각과민 효과의 지속 시간과 크기는 최초 접종에 의한 것보다 더 길었고 더 컸다. 소정의 시점에서 양쪽 뒷-발 온도에 대해 회피 반응을 보이는 시간에 있어서, 비히클-처리된 동물과 QOZHG-접종된 동물들 간의 소정의 유효성 있는 차이점은 없었다(도 5C와 5D).
이와 같은 테스트를 위해, 175-200g의 수컷 스프래그-둘리 랫트를 사용하였다. 서식 상태와 실험 방법은 피츠버그 대학, 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인을 받았다. 랫트를 클로랄 하이드레이트 마취제(400 mg/kg)로 마취시키고, 마지막 늑골(T13에 붙어있음)을 촉진함으로써, 척수의 척추 후궁판(spinal lamina) T11-T12를 찾아내었다. 세로 방향으로 절단하여 다수개의 분절(segment)들을 노출시켰고, 척추 분절 두 개(T11-T12)에서 척추후궁절제술(laminectomy)을 실시하였다. 동반되는 등쪽 혈관에 의해 요수 팽대를 확인하였고, 주요 등쪽 혈관과 혈관 가지를 손상시키지 않도록 주의하면서 No. 11 스캘펠 칼을 이용하여 T13에서 척수를 반절단하였다. 28-게이지 니들이 있는 투베르쿨린 시린지를 척수 중간부위의 등배쪽에 꽂았고, 옆쪽으로 밀어 척수 반절단이 완료되었음을 확인하였다. 근육과 근막을 꿰매어 밀봉하였고, 피부를 오토클립으로 닫았다. 시술 다음에, 동물들을 수술 전 동일한 상태에 두었다. 시술하고 3시간 내에, 모든 동물들에게 먹이를 주었고 물을 주었다. BBB 로코모터 래이팅 스케일(Locomotor Rating Scale)을 사용하여, 운동 기능(locomotor function)을 관찰하였고 기록함으로써, 척수 반절단의 동측에 있는 팔다리의 운동 회복이 몸 감각 행동 테스트를 허용하기에 충분함을 확인하였다. 양쪽 피질 척수로(corticospinal tract) 상호작용을 가리키는, 양쪽 뒤 팔다리의 운동 손상을 나타낸 동물들은 그 시점에서 이번 연구에서 배제되었다. 그런 다음, 그 기준을 충족한 동물들에게 벡터를 접종하였다. 각 그룹을 구성하는 6마리의 동물들에게 벡터를 접종하였고, 재접종에 의해 테스트하였다. 기계적 이질통과 온도 통각과민에 대한 운동 테스트는 하루 주기 중 낮 동안에(8:00 AM에서 5:00 PM) 수행하였다. 본 프레이 필라멘트 시리즈(0.4, 0.7, 1.2, 1.5, 2.0, 3.6, 5.5, 8.5, 11.8, 및 15.1 g)를 사용하여, 등급화된 기계적 자극에 대한 발-회피 반응의 역치를 측정함으로써, 기계적 이질통을 평가하였다. 순응을 위해 랫트를 30분 이상 동안의 기간 동안 망사 바닥에 놓은 투명한 플라스틱 상자에 넣었고, 그 이후에 발을 약간 구부리기에 충분한 힘으로 강도 크기를 증가시키면서 본 프레이 필라멘트를 랫트의 발 발바닥 표면에 연속적으로 적용하고 6초 동안 유지하였다. 본 프레이 필라멘트 적용에 대해 활발하게 발을 회피하는 것은 다음의 보다 약한 자극을 나타내는 양성 반응과 원인으로 간주하였다. 복사 열 공급원으로부터 발 회피 반응을 보이는 시간을 측정함으로써, 온도 통각과민을 평가하였다. 이 테스트에서는, 밝은 상자에 놓은 글래스 플레이트에 랫트를 놓았다. 적응 기간 10분 후에, 유리판을 통해 적용된 복사 열 빔을 발 바닥 표면에 노출시켰다. 랫트가 팔다리를 들어올렸을 때, 광 전지에 의해 자동적으로 빛이 꺼지게 함으로써, 빛이 개시된 때와 발을 회피한 때 사이의 시간을 측정하였다. 이 시간을 발 회피 반응을 보이는 시간(paw withdrawl time)으로 정하였다. 테스트를 5분 간격으로 3회 반복 실시하였고, 차단 시간으로 20초를 사용하였다.
실시예 6
이 실시예는 GAD 벡터 접종의 행동 효과가 비큐쿨린(bicuculline)과 파클로펜(phaclofen)에 의해 역전(reverse)됨을 입증한다.
GABAA 수용체-선택적 안타고니스트인 비큐쿨린과 GABAB 수용체-선택적 안타고니스트 파클로펜을 사용하여, QHGAD67-매개 항통각 효과의 약리학적 기초를 조사하였다. 시술하고 2주 후에, 샴-시술된 동물에게 비큐쿨린(0.5 ㎍; 시그마) 또는 파클로펜(0.8 ㎍; 시그마)의 수막 공간내 투여는 기계적 역치 또는 온도 회피 반응 시간(thermal latency)을 변화시키지 않았다. QHGAD67을 접종한 척수 반절단된 랫트에게 동일 투여량의 비큐쿨린 투여는, 약물 투여하고 10-15분 후에 기계적 역치를 측정하였을 때, 척수 반절단의 동측에서는 4.87±1.13 g에서 3.5±0.7 g로(P<0.05), 척수 반절단 반대 측에서는 5.75±1.41 g에서 3.38+0.9 g로 (P<0.01), 기계적 역치를 감소시켰다(도 6A.). 수막 공간 내 파클로펜은 기계적 역치를 척수 반절단 동측에서 3.6±0.78 g (P<0.05)까지, 척수 반절단 반대 측에서 4.05± 0.75 g (P<0.05)까지 감소시켰다(도 6A). 비큐쿨린 투여에 의해 온도 회피 반응 시간은 동측에서는 9.28±1.39 s에서 7.23±1.21 s (P<0.05)로, 반대 측에서는 9.56±1.5 s에서 7.41±1.29 s P<0.05)로, 파클로펜 투여에 의해 온도 회피 반응 시간은 동측에서는 7.54±1.16 s (P<0.05)로, 반대 측에서는 7.66±1.24 s (P<0.05)로 감소되었다(도 6B). 각각의 경우에, 약물의 효과는 약물 투여하고 30분 후 피크 효과에서 측정되었다. 접종하고 1 시간 후에, 소정의 인지가능한 약물 효과는 없었다. QOZHG 접종하고, 동일 투여량의 비큐쿨린 또는 파클로펜으로 처리된 랫트의 척수 반절단에서는 기계적 역치 또는 온도 회피 반응 시간에 있어서 소정의 유효성 있는 변화는 없었다.
실시예 7
이 실시예는 GAD 벡터에 의한 세포의 형질 도입이 척수 후각에서 CGRP 면역 반응력을 감소시킴을 입증한다.
샴-시술된 동물의, L5 분절에서 CGRP 면역 반응력은 약했고, 이것은 양측 방향으로 척수의 표면 척수 후각 내의 제I 층판 및 제Ⅱ 층판에 대부분 한정되어 있다. T13 반절단 부분을 남기고 1주 후에, CGRP 면역 반응력은 증대되었고, 척수 후각의 제III 층판과 제IV 층판에까지 확장되는 염색을 확인할 수 있었다. 척수 반절단된 랫트에서, 양쪽 뒤 발에 QHGAD67을 접종하고 1주 후에, QOZHG 접종한 척수 반절단된 랫트(107.3±22.4 OD 유니트 동측, 86±23.5 유니트 반대 측, P＜O.05) 또는 비히클-처리된 동물(96.7±21.8 OD 단위 동측, 104.6±22.6 OD 단위 반대 측, P＜O.05)과 비교할 때, CGRP-유사 면역 반응력이 감소하였다(76.5±13.3 OD 유니트 동측, 63.6±12.4 OD 유니트 반대 측). QOZHG-접종된 동물과 비히클-처리된 동물 간에 염색에 있어서는 소정의 유효성 있는 차이가 없었다(도 7).
병변 없는 형질도입된 동물에서 GAD 단백질의 분포와, 병변 있는 형질도입된 동물에서 CGRP 펩티드의 분포를 면역조직화학으로 측정하였다. 0.1 M 포스페이트 완충 용액에 넣은 4％ 파라포름알데히드를 심장 내부로 관류시켜 랫트에게 주입하였고, 척수 L5 분절 및 붙어있는 근(root)을 제거하였고, 두 시간 동안 동일 용액에 후치시켰고, PBS에 넣은 30％ 수크로스로 2일 동안 동결방지하였다. 20-마이크 로미터의 냉동 미세 절단 부분을 해동시켜 차가운 슈퍼프로스트 마이크로스코프 슬라이드(Superfrost microscope slide)(Fisher, Pittsburgh, PA, USA)에 올려놓았고, 래빗 안티-GAD67 (1:2000, Chemicon) 또는 래빗 안티-CGRP (1:500, PLI, San Carlos, CA, USA)와 4℃에서 밤새 배양하였고, 뒤이어 실온에서 2 시간 동안 형광성 안티-래빗 IgG (Alexa Fluor 594, 1:500, Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 배양하였다. 공초점 마이크로스코피(Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI USA)로, 형광성 이미지를 포착하였다.
실시예 8
이 실시예는 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터를 사용하여, GAD를 코딩하는 유전자를 척수 후근 신경절로 전달하는 것이 말초 신경병증성 통증을 경감시킴을 입증한다.
225gm 내지 250gm의 웅성 스프래그-둘리 랫트에게 선택적 L5 SNL을 하였다(Hao 등에 의해 등재된 Pain; 102: 135-42 (2003)에서 개시된 바와 같음). SNL하고 1 주 후에, 벡터 30㎕(QHGAD67 또는 QOZHG 중 어느 하나, 1 밀리리터당 4 x 108 플라크-형성 단위)를 결찰에 대한 동측으로, 왼쪽 뒷발 발바닥 표면에 피하 주입하였다. 업-다운(up-down) 방법(Dixon 등에 의해 등재된 Annu Rev Pharmacol Toxicol; 20:441-62 (1980)을 참조)을 사용하여 결정된, 회피 반응 50％ 가능성을 만드는 촉각 자극으로, 등급화된 인장 강도의 본 프레이 헤어(von Frey hair)에 대한 발 회피 반응을 평가함으로써(Hao 등에 의해 등재된 상기 문헌, 및 Chaplan 등 에 의해 등재된 J Neurosci Methods, 53:55-63 (1994)을 참조), SNL에 의해 유도된 기계적 이질통을 측정하였다. 뒷발 아래에 직접적으로 배치된 복사열 자극에 대한 회피 반응 시간을 기록하는 하그리브스 장치(Hargreaves apparatus)(Hargreaves 등에 의해 등재된 Pain; 32:77-88 (1988)에서 개시된 바와 같음)를 사용하여, 온도 통각과민을 측정하였다.
L5 SNL 이후에, 랫트는 본 프레이 헤어 자극에 대한 활발한 회피 반응을 일으키는데 필요한 기계적 자극의 크기에 있어 유효성 있는 감소를 보여주었고(도. 11A), 열 자극으로부터 회피 반응에 이르는 시간에 있어 유효성 있는 감소를 보여주었다(온도 통각과민; 도 11B를 참조). QH-GAD67 접종한 랫트는, 접종하고 시작되는 1주에 기계적 역치에 있어 통계학적으로 유효성 있는 증가를 보여주었다. QHGAD67-매개 GABA 발현의 항이질통 효과는 유지되었고 지속되었으며, 5 내지 6주 동안 지속되었고, 접종하고 2 주 때에 절정에 도달하였다(도 11A를 참조). 기계적 역치의 피크 값, 8.6gm은 시술 전 값과 가까웠다. 접종하고 7주 무렵에, 벡터 형질 도입의 항이질통 효과가 사라졌고, QHGAD67-주입 랫트의 기계적 역치는 대조군 랫트의 역치와 동일하게 되었다. 동일 투여량의 QHGAD67를 동일한 발에 재접종하자, 항이질통 효과가 복구되었다(도 11A를 참조). SNL은 온도 회피 반응 시간을 10.7초에서 6.5초까지 감소시켰고, 이것은 점차적으로 회복되기 전에 3 주 동안 계속되었다. QHGAD67 접종한 랫트는 접종하고 시작하는 1 주에 동측 발의 온도 회피 반응 시간에 있어서 통계학적으로 유효성 있는 증가를 보여주었고, 그와 같은 효과는 지속되었고 계속되었으며, 3주 내지 4주 동안 계속되었다(도 11B 참조). 샴-시 술된 동물은 기계적 역치 또는 온도 회피 반응 시간에 있어 소정의 변화를 나타내지 않았다.
적당한 접촉으로 유도되는, c-Fos 및 인산화된 세포외 시그날-조절된 키나제 1과 2(p-ERK 1/2)의 발현은 통각 과정의 간접적인 생물학적 마커가 된다(Catheline 등에 의해 등재된 Pain; 92:389-98 (2001)). SNL하고 3주 후에, 4초에 한 번씩 10분 동안, 실험자의 엄지손가락의 평편한 면으로 랫트의 뒷발을 눌러, 적당한 접촉을 실시하였고, 면역반응 세포(안티-c-Fos 또는 안티-p-ERK 1/2 항체; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)의 수는 아비딘-비오틴 호스래디쉬 페록시다제(horseradish peroxidase)로 검출하였고, 뒤이어 니켈-증대된 디아미노벤지딘으로 검출하였다(Vector Laboratories, Bur- lingame, CA). Fos-LI-양성 뉴런의 수는 샴-시술된 대조군 랫트에 비해, SNL 동측으로 상당히 증가하였고, 벡터 QHGAD67의 접종은 제 I층판 내지 제 VI층판에서 Fos-LI-양성 뉴런의 수를 감소시켰다(도 12를 참조). 또한, 제 I층판과 제 II층판에서 p-ERK 1/2의 발현은 SNL으로 적당한 접촉 자극 이후에, 랫트에서 증가되었고, 그와 같은 증가는 QHGAD67 접종한 동물에서 차단되었다. p-ERK는 샴-시술된 동물에서 10분간의 적당한 접촉 자극에 의해 유도되지 않았지만, QOZHG 접종한 동물에서 척수 신경 결찰(spinal nerve ligation, SNL)한 후 실질적으로 유도되었다. 접촉-유도된 p-ERK 1/2의 발현은 QHGAD67 접종한 동물에서는 억제되었는데, 이것은 후각에서 p-ERK 1/2-양성 뉴런의 수에 의해 확인되었다(도 13).
이와 같은 결과는 생체 내에서 DRG를 형질도입하는 GAD 발현 HSV 벡터의 피 하 접종이 말초 신경병증성 통증이 있는 모델에서, 기계적 역치와 온도 통각과민의 행동 징후들을 약화시켰음을 입증하고; 그와 같은 행동에 있어 효과는 동측의 척수 후각에서 c-Fos와 p-ERK 1/2의 발현 유도의 차단을 보여주는 조직학적 측정에 의해 확인되었다.
논의
실험용 랫트의 척수 T13에서 측면 반절단은 양쪽 뒤 팔다리 병변 아래에서 양측성 SCI 통증 관련 행동을 만든다("SCI 모델"). SCI 통증 관련 행동은 기계적 이질통과 온도 통각과민으로 나타난다. 이와 같은 현상은 양측성 척수 재구성과 동반된다. 상기 전술한 실험에서는, 소정의 SCI 통증 증상을 경감시킴에 있어, GAD 벡터 매개 유전자의 허리 DRG로 전달에 인한, GABA의 국소적 생성과 방출 효과를 조사하기 위해서, 이와 같은 SCI 모델이 사용되었다.
DRG 뉴런은 GAD를 코딩하는 HSV 벡터("GAD 벡터")로 형질 도입되었다. 이와 같은 형질도입된 DRG 뉴런은 생체 외 및 생체 내에서 GAD를 발현하였다. 이와 같은 세포에서 GAD 발현은 GABA가 방출되도록 하였다. 척수 T13에서 측면 반절단되고 뒤이어 GAD 벡터가 피하 접종된 실험용 랫트에서, 형질도입된 DRG 뉴런으로부터의 국소적 GABA 방출은 뒤 팔다리에서 기계적 이질통과 온도 통각과민을 감소시켰다. 이러한 효과는 GAD 벡터 피하 접종 없이 척수 T13에서 측면 반절단된 정상적인 동물 또는 실험용 랫트에서 통각을 변경시키지 않았던 투여량으로 투여된 GABAA 또는 GABAB 수용체 안타고니스트 둘 중 어느 하나에 의해 역전될 수 있었다. 또한, GAD 벡터 매개 GABA 방출은 SCI 이후에 나타나는 허리 척수 후각에서 CGRP 면역 반응력의 증가를 약화시켰다. 따라서, DRG로 GAD 벡터 매개 유전자 전달을 포함하는 본원 발명의 방법은 신경병증성 SCI 통증을 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
생체 외에서 GAD 벡터로 형질 도입된 프라이머리 DRG 뉴런으로부터의 GABA 방출은 60 mM K+을 포함한 배지에서 증가되지 않았고, 배지로부터 Ca2 + 제거에 의해 영향을 받지 않았는데, 이것은 GABA 방출이 소포성이지(vesicular) 않고, 아마도 GABA 트랜스포터의 역전을 통해 구조적으로 일어남을 제안한다. 생체 내에서 신경 말단으로부터 방출된 GABA의 양이 척수 후각의 미세투석에서 GABA 수치를 유효성 있게 상승시키는데 충분하지만, 이와 같은 동물에서 운동 약화에 대한 소정의 증거가 없었으며, 이것은 트랜스진 매개 GABA 방출이 척수 후각에 제한되어 있음을 제안한다. 이것은 프로엔케팔린 발현 HSV 벡터의 피하 접종에 의해 형질 도입된 동물들이 접종에 대해 동측 팔다리에 제한된 진통 효과를 얻었다는 관찰과 일치할 것이다.
손상되지 않은 척수를 갖는 실험용 랫트에서, 낮은 역치의 구심성 신호(afferent input)의 긴장성(tonic) GABA-성 억제는 감각 과정을 조절하고, GABA 수용체 기능의 비큐쿨린 차단은 통증-관련 행동을 만든다. 전기생리학 연구는 GABAA 및 GABAB 수용체 모두가 척수 단계에서 통각 신경전달의 긴장성 조절(tonic modulation)에 기여하고 있음을 제안한다. 말초 신경 손상은 척수 후각에서 GABA 농도의 감소 및 부분적 신경 손상 이후에 척수 후각에서, 프라이머리 구심성 신경에 의해 유발된 억제된 시냅스 후 전류의 감소를 일으킨다. 그러나, 이와 같은 현상이 GABA-성 연합 뉴런의 손실, 또는 중추신경 감작(central sensitization)에서 발견되는 바와 같이 GABA 수용체의 탈감작(desensitization)에 기인하는지 여부는 완전히 확립되어 있지 않다. GABA 면역 반응력의 일시적 감소는 척수 허혈(spinal ischemia)의 광화학적 유도 이후에 허리 척수에서 보고되었지만, 이전 연구들은 반절단 층 아래에서는 GABA 면역 반응력을 조사하지 않았다. 그럼에도 불구하고, DRG 뉴런의 GAD 벡터 형질도입의 결과로서, 반절단 층 아래에서, 척수 후각에 GABA의 구조적 전달은 SCI 이후의 기계적 이질통과 온도 통각과민의 행동 측정치를 감소시켰다. 이것은 SCI 통증이 GABA에 의한 조절에 영향을 받기 쉬움을 나타낸다.
중추 신경병증성 통증에 대한 바클로펜의 효과는 간단한 실험에서 일반적으로 양성 결과를 나타내었지만, 덜 현저한 장-기간 경감을 나타낸 것으로 평가되었다. 바클로펜의 수막 공간 내 투여는 SCI 허혈 모델에서 만성 기계적 및 냉 이질통(cold allodynia)을 부분적으로 경감시킨다. 신경병증성 통증이 있는 만성 수축 손상 모델(chronic constriction injury model)에서, GABA-방출 세포의 수막 공간 내 이식은 신경병증성 통증의 소정 증상을 역전시킨다. GAD 벡터 매개된 GABA 방출의 통증-경감 효과는 수주 진행되는 동안 계속되었음이 발견되었다.
시간에 따른 GABA 방출량은 측정되지 않았다. 그러나, 항통증 효과가 약해진 후 GAD 벡터 재접종이 기계적 이질통과 온도 통각과민의 감소를 복구하였음이 관찰되었다. 이와 같은 관찰은 치료 효과의 감소는 내성의 진행에 기인하는 것이 아니라, 유전자 발현의 감소로 인한 것임을 입증한다. 이것은 트랜스진 발현이 일시적 활성 인간 사이토메갈로바이러스 즉시형 초기 프로모터(HCMV IEp)에 의해 진행된 벡터를 조사하였던 이전 연구의 결과물과 일치한다.
통증 및 통증 경감에 대한 소정의 "객관적인" 측정치는 없다. 그러나, SCI 모델의 손상 층 아래에 있는 척수 분절에서 CGRP 면역 반응력 양이 증가되었음의 측정은 실험실에서 통증 및 통증 경감을 측정하는데 사용되고 있다. 불행하게도, SCI 모델에서 증가된 척수 CGRP 현상에 관해서는 거의 알려져 있지 않다. 아래-층 CGRP의 증가의 원인이 되는 메카니즘이 아직 규정되지 않고 있다. 면역 반응력의 증가가 CGRP의 전환(turnover)의 증대된 방출과 상호관련되어 있는지 여부는 알려져 있지 않다. 또한, CGRP가 SCI 통증 현상에서 소정의 역할을 하고 또는 SCI의 부수 현상으로서 나타나는지 여부는 알려져 있지 않다. 그럼에도 불구하고, 이번 연구에서 SCI 이후에 나타나는 CGRP 증가는 말초 신경병증성 통증의 척수 신경 결찰 모델에서 무해한 접촉에 의해 유도된 c-fos 면역 반응력 증가와 유사한, 통증 행동 측정의 조직학적 상관물로 작용한다. 따라서, CGRP 측정이 SCI 통증 치료시 GAD 벡터의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다. 소정의 특정 이론에 구속되지 않지만, CGRP는 주로 척수 후각의 제 I층판, 제 II층판, 및 제 V층판으로 돌출되어 있는, 무수초성 및 성기게 수초가 있는 구심성 신경에 있기 때문에, CGRP 증가는 프라이머리 구심성 신경의 발생으로부터 생겨나는 것으로 믿어진다. GAD 형질 도입된 세포로부터의 GABA 방출이 CGRP 발현 증가를 억제하는 메카니즘은 알려져 있지 않다.
상술한 내용으로부터, 본원 발명에 따르면, 인간 글루탐산 데카르복실라제(GAD)를 발현하도록 설계된 비복제성 HSV 벡터가 성공적으로 작제되었고, 이 벡터는 SCI 통증 및 또한 말초 신경병증성 통증을 치료하는데 사용되었다. 이러한 실시예들은 유전자 전달 접근법의 사용을 포함하는 본원 발명의 방법이 척수 후각에서 GABA를 방출하기 위해 말초 접종을 통해 DRG 뉴런을 형질도입하는데 사용될 수 있음을 입증한다. 또한, 이러한 실시예들은 GAD 벡터를 사용하는 유전자 전달을 포함하는 본원 발명의 방법이 SCI 이후의 아래-층의 기계적 이질통과 온도 통각과빈을 감소시킴을 입증한다. 피하 접종에 의해 GAD 벡터를 전달하는 능력은 SCI 통증 및 또한 말초 신경병증성 통증을 치료하기 위한 본원 발명 접근법의 매력적인 특징이다.
본원 발명의 실시예에서는, 달리 지적되지 않는다면, 당업자 기술 범위에 내에 있는 바이러스학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기법의 통상적인 방법들을 사용한다. 그러한 기법들은 문헌에서 충분히 설명되어 있다.(예를 들면, Sambrook 등에 의해 등재된 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (최근 판); DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I ＆ II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 최근 판); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames ＆ S. Higgins, eds., 최근 판); Transcription and Translation (B. Hames ＆ S. Higgins, eds., 최근 판); CRC Handbook of Parvoviruses, Vol. I ＆ II (P. Tijessen, ed.); Fundamental Virology, 제 2판, Vol. I ＆ II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)을 참조한다).
본원 명세서에서 인용된 간행물, 특허 출원, 및 특허를 포함한 모든 참조 문헌들은 각각의 참조 문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참조 문헌으로 통합되어 있는 것과 같이 그리고 전문으로 설명된 바와 같이, 동일한 정도로 참조 문헌으로 본원 명세서에 통합되어 있다.
본원 발명을 설명하는 내용에서, 용어 "하나(a)", "하나(an)", "그(the)" 및 유사한 관계사의 사용(특히 하기 청구항의 문맥에서)은, 본원 명세서에서 달리 지적되지 않고 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는다면, 단수와 복수 모두를 포함하는 것으로 해석된다. 용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", 및 "포함하는(containing)"은 달리 지적되지 않는다면, 개방형 용어로 해석된다(즉, "포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아님(including, but not limited to)"을 의미함). 본원 명세서에서 값의 범위에 대한 상술은 본원 명세서에서 달리 지적되지 않는다면, 단순히 그 범위에 들어가는 각각의 독립된 값을 개별적으로 지칭하는 간단한 방법으로 제공하기 위함이고, 각각의 독립된 값은 본원 명세서에서 개별적으로 기술된 바와 같이 본원 명세서에 통합되어 있다. 본원 명세서에서 설명된 모든 방법은 달리 지적되지 않는다면, 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는다면, 소정의 적절한 순서로 실시될 수 있다. 본원 명세서에서 제공된 소정의 모든 실시예, 또는 대표 단어(예를 들면, "그와 같은(such as)")의 사용은 단순히 본원 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이고, 달리 청구되지 않는다면, 본원 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 본원 명세서에서 어떠한 용어도 본원 발명 실시에 필수적인 소정의 청구되지 않는 요소를 지시하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원 발명 실시를 위해 발명자들에게 알려진 최적 형태를 포함하여, 본원 발명의 바람직한 실시 형태가 본원 명세서에서 설명되어 있다. 그와 같은 바람직한 실시 형태를 변경하는 것은 상기 명세서를 읽을 때 당업자에게는 명백할 것이다. 본원 발명자들은 적합한 경우에는 당업자들이 그와 같은 변경을 하도록 기대하고 있으며, 본원 발명자들은 본원 명세서에서 구체적으로 설명된 것 이외로 본원 발명이 실시되기를 의도한다. 따라서, 본원 발명은 적용가능한 법에 의해 허락되는 바에 따라, 본원 명세서 이하에 첨부된 청구항에 인용된 발명 주제의 변경 및 등가물 모두를 포함한다. 또한, 모든 가능한 변경에서 상술된 구성 요소의 소정의 조합은 본원 명세서에서 달리 지적되지 않는다면 또는 문맥상 명백하게 모순되지 않는다면, 본원 발명에 포함된다.
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Arg Thr Glu Thr Asp Phe Ser 85 90 95 Asn Leu Phe Ala Arg Asp Leu Leu Pro Ala Lys Asn Gly Glu Glu Gln 100 105 110 Thr Val Gln Phe Leu Leu Glu Val Val Asp Ile Leu Leu Asn Tyr Val 115 120 125 Arg Lys Thr Phe Asp Arg Ser Thr Lys Val Leu Asp Phe His His Pro 130 135 140 His Gln Leu Leu Glu Gly Met Glu Gly Phe Asn Leu Glu Leu Ser Asp 145 150 155 160 His Pro Glu Ser Leu Glu Gln Ile Leu Val Asp Cys Arg Asp Thr Leu 165 170 175 Lys Tyr Gly Val Arg Thr Gly His Pro Arg Phe Phe Asn Gln Leu Ser 180 185 190 Thr Gly Leu Asp Ile Ile Gly Leu Ala Gly Glu Trp Leu Thr Ser Thr 195 200 205 Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu 210 215 220 Met Glu Gln Ile Thr Leu Lys Lys Met Arg Glu Ile Val Gly Trp Ser 225 230 235 240 Ser Lys Asp Gly Asp Gly Ile Phe Ser Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn 245 250 255 Met Tyr Ser Ile Met Ala Ala Arg Tyr Lys Tyr Phe Pro Glu Val Lys 260 265 270 Thr Lys Gly Met Ala Ala Val Pro Lys Leu Val Leu Phe Thr Ser Glu 275 280 285 Gln Ser His Tyr Ser Ile Lys Lys Ala Gly Ala 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Pro Glu His Thr Asn 500 505 510 Val Cys Phe Trp Tyr Ile Pro Gln Ser Leu Arg Gly Val Pro Asp Ser 515 520 525 Pro Gln Arg Arg Glu Lys Leu His Lys Val Ala Pro Lys Ile Lys Ala 530 535 540 Leu Met Met Glu Ser Gly Thr Thr Met Val Gly Tyr Gln Pro Gln Gly 545 550 555 560 Asp Lys Ala Asn Phe Phe Arg Met Val Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr 565 570 575 Gln Ser Asp Ile Asp Phe Leu Ile Glu Glu Ile Glu Arg Leu Gly Gln 580 585 590 Asp Leu <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer <400> 3 gcgggagcgg atcctaata 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer <400> 4 tggtgcatcc atgggctac 19 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe <400> 5 cgtcctacaa catatgatac ttggtgtg 28 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer <400> 6 ccgagggccc actaaagg 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer <400> 7 tgctgttgaa gtcacaggag a 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe <400> 8 catcctgggc tacactgagg acca 24 <210> 9 <211> 1239 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cggcgagggt cctgccgagg gacccgttct gcgcccaggc aggctcgaag cacgcgtccc 60 tctctcctcg cagtccatgg cgcggttcct gacactttgc acttggctgc tgttgctcgg 120 ccccgggctc ctggcgaccg tgcgggccga atgcagccag gattgcgcga cgtgcagcta 180 ccgcctagtg cgcccggccg acatcaactt cctggcttgc gtaatggaat gtgaaggtaa 240 actgccttct ctgaaaattt gggaaacctg caaggagctc ctgcagctgt ccaaaccaga 300 gcttcctcaa gatggcacca gcaccctcag agaaaatagc aaaccggaag aaagccattt 360 gctagccaaa aggtatgggg gcttcatgaa aaggtatgga ggcttcatga agaaaatgga 420 tgagctttat cccatggagc cagaagaaga ggccaatgga agtgagatcc tcgccaagcg 480 gtatgggggc ttcatgaaga aggatgcaga ggaggacgac tcgctggcca attcctcaga 540 cctgctaaaa gagcttctgg aaacagggga caaccgagag cgtagccacc accaggatgg 600 cagtgataat gaggaagaag tgagcaagag atatgggggc ttcatgagag gcttaaagag 660 aagcccccaa ctggaagatg aagccaaaga gctgcagaag cgatatgggg gcttcatgag 720 aagagtaggt cgcccagagt ggtggatgga ctaccagaaa cggtatggag gtttcctgaa 780 gcgctttgcc gaggctctgc cctccgacga agaaggcgaa agttactcca aagaagttcc 840 tgaaatggaa aaaagatacg gaggatttat gagattttaa tatttttccc actagtggcc 900 ccaggcccca gcaagcctcc ctccatcctc cagtgggaaa ctgttgatgg tgttttattg 960 tcatgtgttg cttgccttgt atagttgact tcattgtctg gataactata caacctgaaa 1020 actgtcattt caggttctgt gctctttttg gagtctttaa gctcagtatt agtctattgc 1080 agctatctcg ttttcatgct aaaatagttt ttgttatctt gtctcttatt tttgacaaac 1140 atcaataaat gcttacttgt atatagagat aataaaccta ttaccccaag tgcaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1239

Claims (23)

  1. 글루탐산 데카르복실라제(GAD) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-앰플리콘(non-amplicon) 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)를 포함하는 벡터로서, 상기 벡터는 ICP4와 ICP27의 연장된 결실(extended deletion)과 UL55 결실을 포함하는 것인 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 GAD 단백질은 GAD67인 것인 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 GAD 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된(operably linked) 유도성 프로모터를 더 포함하는 것인 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 GAD 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된(operably linked) 인간 사이토메갈로바이러스 즉시형 초기 프로모터(human cytomegalovirus immediate early promoter, HCMV IEp)를 더 포함하는 것인 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 GAD 단백질을 코딩하는 서열이 상기 재조합 HSV의 UL41, ICP4, 또는 ICP27 좌위에 삽입되는 것인 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 필수 HSV 유전자가 더 결여되어 있는 것인 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 필수 HSV 유전자가 즉시형 초기(immediate early), 초기(early) 또는 후기(late) HSV 유전자인 것인 벡터.
  8. 제1항에 있어서, ICP22, ICP47 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 즉시형 초기 유전자(immediate early gene)가 더 결여되어 있는 것인 벡터.
  9. 제1항에 있어서, 상기 재조합 HSV는 복제-결함이 있는 것인 벡터.
  10. 제1항 또는 제9항의 벡터를 포함하는 바이러스 스톡.
  11. 제1항 또는 제9항의 벡터 및 생리적으로-허용가능한 캐리어를 포함하는 조성물.
  12. 포유 동물에서 척수 외상 통증 또는 말초 신경병증성 통증 치료용 의약을 제조하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 벡터의 용도.
  13. 제12항에 있어서, 상기 포유 동물은 인간인 것인 방법.
  14. ICP4와 ICP27에서 연장된 결실(extended deletion) 및 UL55 결실을 포함하는 HSV 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 필수 HSV 유전자가 더 결여되어 있는 것인 HSV 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 상기 필수 HSV 유전자는 즉시형 초기, 초기 또는 후기 HSV 유전자인 것인 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 상기 즉시형 초기 유전자는 ICP22, ICP47 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
  18. 제14항에 있어서, 상기 재조합 HSV는 복제-결함이 있는 것인 벡터.
  19. 제14항에 있어서, 트랜스진(transgene)을 더 포함하는 것인 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 상기 트랜스진이 GAD를 코딩하는 것인 벡터.
  21. 제19항에 있어서, 상기 트랜스진이 엔케팔린을 코딩하는 것인 벡터.
  22. 의약을 제조하기 위한 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항의 벡터의 용도.
  23. HSV ICP4, ICP27 및 UL55 유전자를 보충하는 세포주.
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