KR20070083618A

KR20070083618A - Ｆｓｈ를 정제하는 방법

Info

Publication number: KR20070083618A
Application number: KR1020077007365A
Authority: KR
Inventors: 빠스깔 발락; 피에르 벵어; 안느 슈탄리; 리디아 델레그랑에; 루치아노 까포니
Original assignee: 아레스 트레이딩 에스.에이.
Priority date: 2004-11-09
Filing date: 2005-11-08
Publication date: 2007-08-24
Anticipated expiration: 2025-11-08
Also published as: PT1809663E; DK1809663T3; ATE408624T1; EP1809663A1; NO340811B1; BRPI0517973B8; BRPI0517973A; IL182716A; CA2579131A1; CN101087805A; EP1809663B1; PL1809663T3; NO20072863L; HK1108704A1; US20080070832A1; KR101173717B1; AU2005303818B2; EA200701040A1; AU2005303818A1; MX2007005327A

Abstract

본 발명은 1. 염료 친화력 크로마토그래피; 2. 소수성 상호작용 크로마토그래피; 및 3. 역상 크로마토그래피 단계를 포함하여, 미정제 FSH에서 출발하여 재조합 사람 FSH 또는 FSH 변이체를 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＦＳＨ를 정제하는 방법 {METHOD FOR PURIFYING FSH}

본 발명은 난포 자극 호르몬(FSH)을 정제하는 분야에 관한 것이다.

난포 자극 호르몬(FSH)은 생식샘자극호르몬의 부류에 속하는 주사가능한 단백질이다. FSH는 여성 및 남성 환자 둘 모두에서 불임증 및 생식 질환의 치료에 사용된다.

사실상, FSH는 뇌하수체에 의해 생성된다. 약제학적 용도를 위해, FSH는 재조합(rFSH)에 의해 생성되거나, 폐경후 여성(uFSH)의 소변으로부터 단리될 수 있다.

FSH는 보조생식기술(ART)을 위한 배란 유도(OI) 및 조절된 난소 과다자극(COH)에서 여성 환자에게 사용된다. 배란 유도를 위한 통상적인 치료 섭생에서, 환자는 약 6 내지 약 12일 동안 매일 FSH 또는 변이체 (약 75 내지 300 IU FSH/일) 주사를 맞는다. 조절된 난소 과다자극을 위한 통상적인 치료 섭생에서, 환자는 약 6 내지 약 12일 동안 매일 FSH 또는 변이체 (약 150-600 IU FSH/일) 주사를 맞는다.

FSH는 정자부족증에 걸린 남성에서 정자발생을 유도하는 데에도 사용된다. 매주 2회의 2500 IU hCG와 함께 매주 3회의 150 IU FSH를 이용하는 섭생은 저생식 샘자극호르몬 생식샘저하증에 걸린 남성에서 정자 수의 개선을 달성하는데 성공적이었다 [Burgues 등; Subcutaneous self-administration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism; Hum. Reprod.; 1997, 12, 980-6].

수태 질환의 치료에 있어서 FSH의 중요성으로 인해, 고순도 및 높은 특이적 활성의 FSH를 제공하는 것이 요망된다. FSH 치료는 반복된 주사를 필요로 한다. 환자에 의한 자기-투여를 허용하는, 고도로 정제된 FSH 제조물을 피하 투여하여, 환자의 편의 및 순응을 증가시킬 수 있다.

Lynch 등 [The extraction and purification of human pituitary follicle-stimulating hormone and luteinising hormone; Acta Endocrinologica, 1988, 288, 12-19]은 사람 뇌하수체 FSH를 정제하는 방법을 기술하였다. 상기 방법은 음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피, 면역친화력 추출 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다. 상기 방법으로 16 IU/mg의 LH와 함께, 4,990 IU (면역검정)/mg의 특이적 활성을 지닌 뇌하수체 FSH를 수득하였다. 단백질 함량을 건조 중량 또는 용액으로 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다 (1 g/ℓ에 대해 A²⁸⁰ _1cm는 1과 같다고 가정함).

WO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA)는 사람 폐경 생식샘자극호르몬(hMG)라 불리는 소변 추출물에서 출발하여 사람 소변 FSH를 정제하는 방법을 기술 한다. 상기 방법은 DEAE 유형의 약염기성 음이온 교환 수지 상에서의 이온-교환 크로마토그래피에 이어 리간드로서 안트라퀴논 유도체를 지니는 수지 상에서의 친화력 크로마토그래피를 이용한다. 상기 방법으로 LH가 없고 6,870 IU (면역검정)/mg의 특이적 활성을 지닌 소변 FSH를 수득하였다. 단백질 함량을, 1 mg/ml의 단백질 수용액이 277 nm, 1 cm 경로 길이를 지니는 석영 큐벳에서 0.62의 광학 밀도를 지니는 것으로 가정하여 측정하였다.

WO 00/63248 (Instituto Massone SA)은 사람 소변으로부터 FSH를 포함하는 생식샘자극호르몬을 정제하는 방법을 기술한다. 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: 설포프로필 유형의 강 양이온 수지를 이용한 이온 교환 크로마토그래피, 강 음이온 수지를 이용한 이온 교환 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC). 8,400 IU/mg의 특이적 활성 (Steelman-Pohley method: Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616) 및 75 IU FSH에 대해 1 IU 미만의 LH (rat seminal vesicle weight gain method: Van Hell H, Matthijsen R & GA Overbeek; Acta Endocrinol, 1964, 47, 409) 생물학적 활성을 지니는 FSH 제조물을 수득하였다고 보고되어 있다. 단백질 함량은 로우리(Lowry) 방법 [O.H. Lowry 등, J. Biol, Chem., 1951, 193, 265]에 의해 결정되었다.

US 5,990,288호 (Musick 등)는 사람 뇌하수체 또는 사람 폐경후 소변과 같은 생물학적 샘플로부터 FSH를 정제하는 방법을 기술한다. 상기 방법은 프랙토겔 (Fractogel) EMD SO₃-650M 상에서의 양이온 교환 크로마토그래피에 이어서 미메틱 오렌지(Mimetic Orange) 1 수지 상에서의 염료 친화력 크로마토그래피를 이용하고, 이어서 베이커본드 와이드 포어(Bakerbond Wide Pore) HI-프로필 수지 상에서 소수성 상호작용 크로마토그래피의 단계를 이용한다. 상기 방법으로 7,066 IU (면역검정)/mg의 특이적 활성 및 1 IU (면역검정)/mg 미만의 LH를 지니는 사람 뇌하수체 FSH, 및 6,298 IU (면역검정)/mg의 특이적 활성 및 3 IU (면역검정)/mg 미만의 LH를 지니는 소변 FSH를 수득하였다. 단백질 함량을 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다 (1 g/ℓ에 대해 A²⁸⁰ _1cm는 1과 같다고 가정함).

Chiba 등 [Isolation and partial characterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary gland; Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218]은 콘카나발린(Con) A 친화력 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 및 Cu⁺⁺를 이용한 고정된 금속 이온 크로마토그래피를 이용하여, FSH를 포함하는 개과 뇌하수체 생식샘자극호르몬을 정제하는 기술을 개시하고 있다. 생성된 FSH는 생물학적 활성을 측정하기 위한 FSH용 방사선수용체 검정 및 단백질 함량을 결정하기 위한 바이오래드(BioRad) 단백질 검정 키트 (BioRad Laboratories CA USA)를 이용하여 2.17 IU/g 단백질의 특이적 활성을 지니는 것으로 보고되었다.

WO 88/10270 (Instituto di Ricerca Cesare Serono SPA)은 소변으로부터 사람 FSH를 정제하는 방법을 기술한다. 상기 방법은 디비닐 설폰에 의해 세파로스 4B에 결합된 FSH-특이적인 고정된 모노클로날 항체를 이용한 면역크로마토그래피에 이어서 역상 HPLC를 포함한다. 생성된 FSH에는 LH 및 다른 소변 단백질이 없었고, 6,200 IU/mg의 냉동건조된 분말의 특이적 활성을 지녔다 (스틸맨-폴리(Steelman-Pohley) 방법). 제조물은 순도로 인해 피하 투여에 적합한 첫번 째 FSH 제조물이었다.

FSH 및 FSH 변이체를 정제하는 신규한 방법에 대한 계속된 요구가 존재하였다. 특히, 비용 집약적인 면역친화력 크로마토그래피 단계를 사용하지 않는 정제 방법이 요구된다.

발명의 개요

본 발명의 목적은 재조합 FSH 또는 재조합 FSH 변이체를 정제하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.

첫번 째 측면에서, 본 발명은 임의의 순서로 수행될 수 있는,

(1) 염료 친화력 크로마토그래피;

(2) 소수성 상호작용 크로마토그래피; 및

(3) 역상 크로마토그래피 단계를 포함하여, 미정제 FSH를 함유하는 액체에서 출발하여 재조합 사람 FSH 또는 FSH 변이체를 정제하는 방법을 제공한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명, 즉

·염료 친화력 크로마토그래피,

·소수성 상호작용 크로마토그래피,

·역상 크로마토그래피의 단계를 포함하는 정제 방법을 설명한다.

도 2는 본 발명의 특정 구체예, 즉

·초미세여과/정용여과 (diafiltration),

·음이온 교환 크로마토그래피,

·염료 친화력 크로마토그래피,

·소수성 상호작용 크로마토그래피,

·역상 크로마토그래피,

·음이온 교환 크로마토그래피,

·나노여과,

·초미세여과/정용여과의 단계를 포함하는 정제 방법의 흐름도를 도시한다.

약어

하기 약어를 본 발명을 기술하는데 사용한다.

DF: 정용여과;

FSH: 난포 자극 호르몬;

r-FSH: 재조합 FSH;

hFSH: 사람 FSH;

r-hFSH: 재조합 사람 FSH;

BV: 베드 부피;

DEAE: 디에틸아미노에틸;

ELISA: 효소 결합된 면역검정;

DAC: 염료 친화력 크로마토그래피;

IMAC: 고정된 금속 이온 친화력 크로마토그래피;

OD: 광학 밀도;

HIC: 소수성 상호작용 크로마토그래피;

HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피;

IRMA: 면역방사측정 검정;

KD 또는 kD: 킬로달톤;

HCP: FSH의 발현에 사용된 숙주 세포로부터 발생된 숙주 세포 단백질, 단백질들;

IPC: 제조과정 제어;

IEF: 등전자 포커싱;

PES: 폴리에테르설폰;

RP-HPLC: 역상 고성능 액체 크로마토그래피;

Q FF: Q 세파로스 FF 상에서의 음이온 교환;

RT: 실온;

UF: 초미세여과;

WFI: 주사용수

발명의 상세한 설명

본 발명은 임의의 순서로 수행될 수 있는,

(1) 염료 친화력 크로마토그래피;

(2) 소수성 상호작용 크로마토그래피; 및

(3) 역상 크로마토그래피 단계를 포함하여, 미정제 FSH를 함유하는 액체에서 출발하여 재조합 사람 FSH 또는 재조합 FSH 변이체를 정제하는 방법을 제공한다.

정제 방법은 이후 Gonal-F (Serono)와 같은 최종 약제로 제형화될 수 있는 고순도의 재조합 FSH 벌크를 제공한다. 면역친화력 크로마토그래피를 이용하지 않고도 고순도를 수득하는 이점이 있다. 본 발명에 따른 정제를 위한 출발 재료를 형성하는 미정제 FSH는 재조합 FSH를 함유하는 세포 배양 수확물로 구성된다.

바람직한 구체예에서, 항산화제 또는 항산화 및 청소 효과를 지니는 유리 아미노산 또는 디펩티드가 본 발명에 따른 정제 방법의 몇몇 단계 또는 모든 단계에 포함된다. 보다 상세하게, 항산화제는 r-hFSH를 정제하고/거나 농축하고/거나 여과하는데 사용되는 임의의 완충액에 존재한다. 항산화제는 가공처리 동안 FSH의 산화를 억제한다. 바람직한 항산화제는 L-메티오닌이다. 바람직하게는, L-메티오닌은 10-100 mM 또는 약 10-100 mM의 농도로 사용된다. 항산화제의 추가의 예로는 t-부틸-4-메톡시페놀, 2,6-비스(1,1-디메틸에틸)-4-메틸 페놀; 칼륨 또는 나트륨 비메타비설파이트, 나트륨 비설파이트가 있다. 항산화 및 청소 효과를 지니는 유리 아미노산 및 디펩티드의 예로는 히스티딘, 타우린, 글라이신, 알라닌, 카르노신, 안세린, 1-메틸히스티딘 또는 이들의 조합물이 있다.

통상적으로, 출발 재료는 먼저 정화된 다음 임의로 농축되고/거나 (예컨대 초미세여과를 이용) 완충액 교환되고 (예컨대, 정용여과 단계를 통해), 이후 제1 크로마토그래피 단계에서 포획된다.

크로마토그래피 단계에서, 중합체-기재 및 아가로스-기재 수지를 이용할 수 있다. 수지가 작용기화된 막으로 교체된 막 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.

본 발명의 3개의 정제 단계 (즉, 염료 친화력 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피)를 하기에서 보다 상세하게 설명한다.

염료 친화력 크로마토그래피 단계 (1)

본 발명은 방법은 염료 친화력 크로마토그래피의 단계 (1)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 염료 친화력 크로마토그래피의 단계는 당업자에게 널리 공지된 염료 화합물, 즉 시바크론 블루(Cibacron Blue) F3G-A를 고정된 리간드로서 지니는 수지를 이용하여 수행된다. "고정된"이라는 용어는 당업자에 의해 잘 이해되며, 리간드가 수지에 화학적으로 결합되는 정도까지 유도체화됨을 의미한다. 특히 바람직한 수지는 블루 세파로스 FF이다 (Amersham Biosciences Inc.로부터 수득할 수 있음). 블루 세파로스 FF의 기술적인 특징은 하기와 같다:

기술적인 명세
액체	시바크론 블루 F3G-A
리간드 커플링 방법	트리아진 커플링
결합력	= 18 mg 사람 혈청 알부민/ml 배출된 겔
매트릭스	고도로 가교된 아가로스, 6%
배제 한계 (M_r)	4 x 10⁶
입경 범위	45-165 ㎛
선형 유속^*	750 cm/h
리간드 밀도	7 μmol 시바크론 블루/ml 매질
pH 안정성	4-12 (장기), 3-13 (단기)
화학적 안정성	70% 에탄올, 6M 구아니딘 히드로클로라이드, 8M 우레아 중 40℃에서 7일 동안

상기 방법이 유사한 특징을 갖는 대안적인 수지로 수행될 수 있음이 이해된다. 대안적인 수지의 예로는 토요펄(Toyopearl) AF-블루-HC-650M (Tosoh Bioscience), 토요펄 슈퍼부틸(SuperButyl) 550, 토요펄 페닐(Phenyl) 650, 블루 셀트루 빅비드(Cellthru BigBead) (Sterogene), 스웰겔(SwellGel) 블루 (Pierce), 시바크롬 블루 3GA-아가로스 100 (Sigma), 어피-겔(Affi-Gel) 블루 (BioRad), 이코노-팩(Econo-Pac) 블루 카트리지 (Bio-Rad), 블루 세파로스 HP (Amersham), 시바크론 블루 3GA (Sigma)가 있다.

고정된 염료 친화력 크로마토그래피 단계에서의 용리는 바람직하게 인산염 완충액, 특히 바람직하게는 인산나트륨을 이용하여 수행되어야 한다. 용리액의 pH는 바람직하게 6.0 또는 약 6.0 내지 11.5 또는 약 11.5, 보다 바람직하게는 6.5 또는 약 6.5 내지 8 또는 약 8, 특히 바람직하게는 7.0 또는 약 7.0이어야 한다. 7.0의 pH를 유지하기에 적합한 대안적인 완충액으로는 MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES가 있다. 염료 친화력 크로마토그래피 단계를 위한 용리 완충액은 바람직하게 전도성을 증가시키기 위한 염, 바람직하게는 NaCl을 함유하여야 한다.

특히 바람직한 구체예에서, 염료 친화력 크로마토그래피 단계(평형화, 세척 및 용리)를 위한 생성물-접촉 완충액은 L-메티오닌과 같은 항산화제를 함유한다. 항산화제의 추가의 예로는 t-부틸-4-메톡시페놀, 2,6-비스(1,1-디메틸에틸)-4-메틸 페놀; 칼륨 또는 나트륨 비메타비설파이트, 나트륨 비설파이트가 있다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 단계 (2)

본 방법은 또한 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계 (2)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 토요펄 부틸 650M (Tosoh Biosep Inc.로부터 시판됨)과 같은 수지를 이용하여 수행된다.

단계 (2)는 유사한 특징을 지니는 대안적인 수지를 이용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다. 사용될 수 있는 대안적인 수지로는 페닐 세파로스 6 패스트 플로우(Fast Flow)(low sub); 페닐 세파로스 6 패스트 플로우(high sub); 부틸 세파로스 4 패스트 플로우; 옥틸 세파로스 4 패스트 플로우; 페닐 세파로스 하이 퍼포먼스(High Performance); 소스(SOURCE) 15ETH; 소스 15ISO; 소스 15PHE (모두 Amersham Biosciences (800) 526-3593; (참조 www.amershambiosciences.com)에서 시판됨)가 있다. 또한 추가의 수지로는 하이드로셀(Hydrocell) C3 또는 C4; 하이드로셀 페닐 (BioChrom Labs Inc. (812) 234-2558; (참조 www.biochrom.com)에서 시판됨)이 있다.

HIC 수지에 대한 결합은 염(예를 들어, NaCl, (NH₄)₂SO₄ 또는 Na₂SO₄)의 첨가를 통해 수득되며, 고 전도성 완충액에서 달성된다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계에서의 용리는 6 또는 약 6 내지 8 또는 약 8, 보다 바람직하게는 6.5 또는 약 6.5 내지 7.5 또는 약 7.5, 가장 바람직하게는 7 또는 약 7의 pH를 지니는 완충액을 이용하여, 바람직하게 이동상의 전도성을 낮춤(염 농도의 감소)에 의해 수행된다. 특히 바람직한 시스템은 pH를 바람직하게 7 또는 약 7로 완충시키는 인산나트륨, 및 황산암모늄을 함유한다. 대안적인 완충액이 상기에 언급되어 있다.

특히 바람직한 구체예에서, HIC(평형화, 세척, 용리)의 단계 (2)에 대한 생성물-접촉 완충액은 항산화제, 예컨대 L-메티오닌을 함유한다. 대안적인 항산화제가 상기에 언급되어 있다.

역상 크로마토그래피 단계 (3)

본 발명의 방법은 또한 역상 크로마토그래피 단계 (RPC)(3)를 포함한다. RPC는 소스 30 RPC (Amersham Biosciences에서 시판됨)와 같은 수지를 이용하여 수행된다. 단계 (3)은 당업자에게 널리 공지되어 있고 유사한 특징을 지니는 대안적인 수지를 이용하여 수행될 수 있음이 이해된다.

크로마토그래피는 온화한 알칼리성 pH, 예를 들어 7-8.5 또는 약 7-8.5, 보다 바람직하게는 7.5 또는 7.6, 또는 약 7.5 또는 약 7.6의 pH로 완충시키는 이동상을 이용하여 수행된다. 바람직한 구체예에서, 완충용 종류는 암모늄 아세테이트이다. 7.6 또는 약 7.6의 pH를 충족하는 대안적인 완충액으로는 BES, MOPS, 인산염, TES, HEPES가 있다. 본 단계에 사용된 완충용액은 유기 개질제를 함유할 수도 있고, 이의 농도는 크로마토그래피 단계(부하, 세척, 용리 및 재생)의 상이한 상에 대해 조절된다. 바람직한 구체예에서, 유기 개질제는 물과 섞일 수 있는 유기 용매, 바람직하게는 알코올(예컨대, 메탄올, 에탄올 등), 가장 바람직하게는 2-프로판올(이소-프로판올)이다.

특히 바람직한 구체예에서, RPC (평형화, 세척, 용리) 단계를 위한 생성물-접촉 완충액은 항산화제, 예컨대 L-메티오닌을 함유한다. 대안적인 항산화제가 상기에 언급되어 있다.

임의적인 추가의 정제 단계 0 - 이온 교환 크로마토그래피

3개의 주된 정제 단계-상기에 기술됨-에 추가하여, 본 발명은 추가의 정제 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 정제 단계는 바람직하게는 강 음이온 교환 수지, 특히 바람직하게는 4차 암모늄 수지, 예컨대 Q 세파로스 FF (Amersham Biosciences로부터 시판됨)로 수행되는, 하기 특성을 지니는 이온 교환 크로마토그래피의 예비 단계 (0)를 포함한다:

이온 교환기의 유형: 강 음이온

총 수용력(mmol/ml): 0.18-0.25

배제 한계(구상 단백질): 4 x 10⁶

비드 형태: 구면, 직경 45-165 ㎛

비드 구조: 가교된 아가로스, 6%

작업 pH 안정성: 2-12

세정 pH 안정성: 1-14

25℃ 1bar 15cm 베드에서 선형 유속 400-700 cm/h

높이, XK 50/30 컬럼:

대안적으로, 이온 교환 크로마토그래피 단계 (0)는 프랙토겔(Fractogel) EMD TMAE HICAP (Merck KGaA에서 시판됨, Darmstadt Germany)와 같은 수지, 또는 유사한 특징을 지니는 수지를 이용하여 수행될 수 있다, 하기 참조:

지원	프랙토겔 EMD TMAE
Cat.No.	1.16887
입경 S-유형	20-40 ㎛
크로마토그래피의 유형	이온 교환 크로마토그래피
작용기	트리메틸아미노에틸기 (Q-유형)
단량체 구조	CH₂=CH-CONH-(CH₂)₂N+(CH₃)₃
단백질 결합능	120 mg BSA/ml 겔
pH 안정성 범위	pH 2 내지 pH 12
pK 값	> 13
용리 조건	높은 염 농도
압력 한계 (베드: 150x10 mm)	20 bar (컬럼을 따라 압력 강하)
작업 온도	4℃ 내지 실온
보존제	20% 에탄올
바로 사용가능한 카트리지	50-10 mm
벌크 재료 S-유형	100 ml; 500 ml
선형 유속	1.27-6.35 cm/분

이온 교환 크로마토그래피 단계는 온화한 알칼리성 pH (예컨대 7.2 또는 약 7.2 내지 9.0 또는 약 9.0, 또는 8.0 또는 약 8.0 내지 9.0 또는 약 9.0, 가장 바람직하게는 8.5 또는 약 8.5)를 지니는 완충액을 이용하여 수행되는 것이 바람직하다. 적합한 완충액으로는, 예를 들어 붕산염 완충액, 트리에탄올아민/이미노디아세트산 트리스, 암모늄 아세테이트, 트리신, 바이신, TES, HEPES, TAPS가 있다. 가장 바람직한 것은 8.5 또는 약 8.5의 pH의 붕산염 완충액이다. 이온 교환 수지로부터의 용리는 염, 바람직하게는 NaCl을 첨가하여 이동상의 전도성을 증가시킴에 의해 달성된다. 특히 바람직한 구체예에서, 이온 교환 크로마토그래피(평형화, 세척, 용리)를 위한 생성물-접촉 완충액은 항산화제, 바람직하게는 L-메티오닌을 함유한다. 대안적인 항산화제가 상기에 언급되어 있다.

따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은

(0) 바람직하게는 강 음이온 교환 수지 상에서의 음이온 교환 크로마토그래피 [바람직하게는 Q 세파로스 FF 또는 프랙토겔 EMD TMAE와 같은 사차 암모늄 수지];

(1) 염료 친화력 크로마토그래피 [바람직하게는 블루 세파로스 FF 상에서]

(2) 소수성 상호작용 크로마토그래피 [바람직하게는 토요펄 부틸 650M 상에서];

(3) 역상 크로마토그래피 [바람직하게는 소스 30 RPC 상에서] 단계를 포함한다.

임의적인 추가의 정제 단계 (-1) - 초미세여과/정용여과

이온 교환 크로마토그래피 단계 (0) 이전에, 미정제 FSH를 농축시키기 위해 초미세여과의 단계를 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 초미세여과 (또는 정용여과)는 3-10 kD 또는 약 3-10 kD, 가장 바람직하게는 8 kD 또는 약 8 kD의 컷-오프를 지니는 막을 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.

임의적인 추가의 정제 단계 (4) - 음이온 교환 크로마토그래피

추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한 음이온 교환 크로마토그래피의 제2 단계 (4)를 포함한다. 바람직한 수지는 상기 언급된 대로, 프랙토겔 EMD TMAE HICAP (Merck KGaA로부터 시판됨, Darmstadt Germay), 또는 유사한 특징을 지니는 수지를 이용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 크로마토그래피의 제2 단계는 상기 언급된 대로, Q 세파로스 FF, 또는 유사한 특징을 지니는 다른 수지 상에서 수행될 수 있다.

음이온 교환 크로마토그래피, 염료 친화력 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 및 역상 크로마토그래피의 단계들, 및 음이온 교환 크로마토그래피의 제2 단계는 비록 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 먼저 수행되는 것이 바람직하나, 임의의 순서로 수행될 수 있다. 나머지 단계들인 염료 친화력 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), RPC 및 임의적인 제2 음이온 교환 크로마토그래피는 하기 제시된 순서에 따르는 것이 바람직하지만 임의의 순서로 수행될 수 있다:

(0) 음이온 교환 크로마토그래피, (1) 염료 친화력 크로마토그래피, (2) 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), (3) 역상 크로마토그래피 RPC, 및 (4) 제2 음이온 교환 크로마토그래피.

임의적인 추가의 정제 단계 (5) - 초미세여과/정용여과

추가의 바람직한 구체예에서, 임의의 크로마토그래피 단계 이후에 (특히 역상 크로마토그래피 단계 이후), FSH 샘플을 농축 단계에 가한다. 바람직하게는 상기 단계를 정용여과와 조합된 초미세여과를 이용하여 수행함으로써 요망되는 조성을 갖는 벌크를 수득한다. 초미세여과 (또는 정용여과)는 3-10 kD 또는 약 3-10 kD, 가장 바람직하게는 5 kD 또는 약 5 kD의 컷-오프를 지니는 막을 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.

특히 바람직한 구체예에서, 하기 단계들을 아래에 제시된 순서대로 수행한다:

(-1) 초미세여과 (바람직하게는 8 kD 또는 약 8 kD의 컷-오프를 지니는 막을 이용함),

(0) 음이온 교환 크로마토그래피 (바람직하게는 Q 세파로스 FF 컬럼을 이용함);

(1) 염료 친화력 크로마토그래피 (바람직하게는 블루 세파로스 FF 컬럼을 이용함);

(2) 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)(바람직하게는 부틸 650M 컬럼을 이용함);

(3) 역상 크로마토그래피 (RPC)(바람직하게는 소스 30 RPC 컬럼을 이용함);

(4) 강 염기성 음이온 교환 수지 상에서의 음이온 교환 크로마토그래피 (바람직하게는 TMAE hicap 수지를 이용함); 및

(5) 초미세여과 (바람직하게는 5 kD의 컷-오프를 지니는 막을 이용함).

FSH 샘플을 특히 바이러스 청소 단계로서의 나노여과의 단계에 가하고; 즉 세포 배양액에서 비롯된 바이러스 또는 바이러스 유사 입자에 의한 FSH 제조물의 오염 위험을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 나노여과는 정제 공정의 임의의 단계에서 이루어질 수 있으나, 특히 이온 교환 크로마토그래피의 제2 단계 후, 또는 역상 크로마토그래피 후 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 후에 나노여과를 수행하는 것이 바람직하다. 나노여과는 1회 이상 수행될 수 있고, 예를 들어 2회 수행될 수 있다.

특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:

(0) 음이온 교환 크로마토그래피 (바람직하게는 Q 세파로스 FF를 이용함),

(1) 염료 친화력 크로마토그래피 (바람직하게는 블루 세파로스 FF를 이용함),

(2) 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)(바람직하게는 부틸 650M을 이용함),

(3) 역상 크로마토그래피 (RPC)(바람직하게는 소스 30 RPC를 이용함),

(4) 강 염기성 음이온 교환 수지 상에서의 음이온 교환 크로마토그래피 (바람직하게는 TMAE hicap 수지);

(4') 나노여과,

본 발명의 이점은 정제 방법이 비용 집약적인 면역 친화력 크로마토그래피 단계를 생략하며 어떤 식으로든 FSH 고순도 및 고도의 특이적 생체활성을 제공한다는 데에 있다. 또한 정제된 본 발명의 FSH는 면역 친화력 크로마토그래피에 의해 첨가되는 요망되지 않는 불순물을 함유하지 않는다 (예컨대, 수지로부터 걸러진 면역글로불린).

저장/냉동건조

상기 기술된 정제 공정으로부터 생성되고 정제된 FSH를 함유하는 액제 조성물을 그대로 또는 정제 후에 저장을 위해 동결시킬 수 있고, 용리물을 냉동건조시켜 ("동결-건조") 용매를 제거할 수 있다. 생성된 액체 또는 냉동건조된 생성물을 "FSH-벌크"라 명명한다.

FSH 제형

본 발명의 FSH 또는 FSH 변이체 또는 본 발명의 방법에 따라 정제된 FSH 또는 FSH 변이체는 근내 또는 피하, 바람직하게는 피하 주사를 위해 제형화될 수 있다. FSH 제형은 동결-건조될 수 있고, 이 경우 주사 직전에 물에 용해된다. FSH 제형은 또한 액체 제형일 수 있고, 이 경우 사전의 용해 없이 직접 주사될 수 있다.

FSH 제형은 단일 용량 또는 다중 용량일 수 있다. 다중 용량인 경우, 바람직하게 정균제, 예를 들어 벤질 알코올, 메타-크레솔, 티몰 또는 페놀, 바람직하게는 벤질 알코올 또는 메타-크레솔을 함유하여야 한다. 단일 용량 제형이 정균제를 포함할 수도 있다.

본 발명의 FSH는 공지된 부형제 및 안정화제, 예를 들어 수크로스 및 만니톨과 함께 제형화될 수 있다. 또한 메티오닌과 같은 항산화제를 포함할 수도 있다. TWEEN (바람직하게는 TWEEN 20), 또는 플루로닉(Pluronic)(바람직하게는 플루로닉 F68)과 같은 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.

특히 바람직한 다중용량 제형에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 FSH는 이것을 수크로스, 인산염 완충액 (pH 7), 플루로닉 F68, 메티오닌 및 메타-크레솔 또는 벤질 알코올과 함께 주사용수에 용해시킴에 의해 제형화된다.

재조합 FSH의 피하 또는 근내 주사에 특히 바람직한 액체 다중용량 제형은 다음과 같다:

FSH 다중용량 액체 제형의 성분
성분#	설명	300 IU FSH	450 IU FSH	900 IU FSH
1	rhFSH (㎍/카트리지)	22.2 (305 IU)	33.3 (458 IU)	66.7 (916 IU)
2	수크로스 (mg/카트리지)	30.0	45.0	90.0
3	NaH₂PO₄·H₂O (mg/카트리지)	0.225	0.337	0.675
4	Na₂HPO₄·2H₂O (mg/카트리지)	0.555	0.832	1.665
5	플루로닉 F68 (mg/바이알)	0.050	0.075	0.150
6	메티오닌 (mg/바이알)	0.050	0.075	0.150
7	m-크레솔 (mg/바이알)	1.50	2.25	4.50
8	pH	7.0	7.0	7.0
9	WFI	0.5ml가 되게 하는 충분한 양	0.75ml가 되게 하는 충분한 양	1.5ml가 되게 하는 충분한 양

지적사항

본 발명의 FSH는 FSH를 필요로 하는 모든 치료에 사용하기 적합하다. 특히 보조생식기술을 위한 배란 유도 및 조절된 난소 과다자극, 및 정자부족증의 치료에서 피하 투여에 적합하다. 이것은 LH 및 hCG와 같은 다른 생식샘자극호르몬과 함께 사용될 수 있다. 이것은 클로미펜 시트레이트, 아로마타제 억제제, 예컨대 아나스트로졸, 레트로졸, 파드로졸 및 YM-511과 같이 FSH에 대한 반응을 증대시키는 추가의 화합물과 함께 사용될 수도 있다.

서열

서열번호 1: 사람 당단백질 α-서브유닛;

서열번호 2: hFSH β-서브유닛

서열번호 3: hFSH β-서브유닛 변이체 1

서열번호 4: hFSH β-서브유닛 변이체 2

서열번호 5: hFSH β-서브유닛 변이체 3

본원에서 사용된 난포 자극 호르몬, 또는 FSH는 전장 성숙 단백질로서 생성된 사람 FSH (hFSH)를 언급한다. FSH는 사람 당단백질 알파-서브유닛 및 사람 FSH 베타-서브유닛으로 구성된 이량체이다. 사람 당단백질 알파 서브유닛의 단백질 서열은 서열번호 1로 제공되며, 사람 FSH 베타 서브유닛의 단백질 서열은 서열번호 2로 주어진다.

"재조합"이라는 용어의 사용은 재조합 DNA 기술 (참조, 예를 들어 WO 85/01958)을 이용하여 생성되는 FSH의 제조물을 언급한다. 재조합 기술을 이용하여 FSH를 발현시키는 방법의 일례는, 유럽특허 제 EP 0 211 894호 및 EP 0 487 512호에 개시된 대로, 진핵 세포를 하나의 벡터상에서나 분리된 프로모터를 갖는 각각의 서브유닛을 지니는 두 벡터상에서 FSH의 알파 및 베타 서브유닛을 엔코딩하는 DNA 서열로 트랜스펙션시킴에 의해 수행된다. FSH를 엔코딩하는 DNA는 cDNA일 수 있거나 인트론을 함유할 수 있다. 재조합 기술을 이용하여 FSH를 생성하는 또 다른 예는, 유럽특허 제 EP 0 505 500호 (Applied Research Systems ARS Holding NV)에 개시된 대로, 동형 재조합을 이용하여 이종성 조절 세그먼트를 조작 결합으로 FSH의 하나의 서브유닛 또는 두 서브유닛 모두를 엔코딩하는 내인성 서열에 삽입시키는 것이다. WO 99/57263호 (Transkaryotic Therapies)에 개시된 것들과 같은 방법도 고려되며, 이 경우에 서브유닛 중 하나가 세포에 이종성으로 삽입되고, 다른 서브유닛이 동형 재조합을 통한 이종성 조절 세그먼트의 삽입에 의해 게놈 서열을 활성화시켜 발현된다. 본 발명의 방법은 임의의 상기 방법 및 다른 방법을 이용하여 발현된 FSH를 정제하는데 사용될 수 있다.

"재조합 세포"라는 표현은 유전자 조작의 상기 언급된 임의의 방법을 포함하여, 이종성 DNA를 삽입시킴에 의해 생성된 세포를 언급한다.

바람직하게는 사람 당단백질 알파-서브유닛 및 FSH의 베타-서브유닛을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터 또는 벡터들로 트랜스펙션된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 FSH를 재조합에 의해 생성한다. 알파 및 베타-서브유닛을 엔코딩하는 DNA는 동일하거나 상이한 벡터상에 존재할 수 있다.

"FSH 변이체"라는 표현은 사람 FSH와 아미노산 서열, 글리코실화 패턴 또는 서브유닛간 결합에서 상이하나 FSH 활성을 나타내는 분자를 포함한다. 예로는 문헌[LaPolt 등; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; 또는 Klein 등; Development and characterization of a long-acting recombinant hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56]에 개시된 대로, hCG의 카르복시 말단 펩티드가 FSH의 β-서브유닛의 C-말단에 융합된 야생형 α-서브유닛 및 하이브리드 β-서브유닛으로 구성된 긴-작용성 개질된 재조합 FSH인 CTP-FSH가 있다. 또한 하기 서열 (N-말단에서 C-말단)로 구성된 단쇄 분자인 단쇄 CTP-FSH가 있다:

βFSH

βhCG-CTP(113-145)

αFSH

여기에서 Klein 등[Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey; Fertility & Sterility; 2002, 77, 1248-1255]에 의해 개시된 바와 같이, βFSH는 FSH의 β-서브유닛을 나타내고, βhCG-CTP(113-145)는 hCG의 카르복시 말단 펩티드를 나타내며, αFSH는 FSH의 α-서브유닛을 나타낸다. FSH 변이체의 다른 예로는 WO 01/58493호 (Maxygen)에 개시된, α- 및/또는 β-서브유닛에 혼입된 추가의 글리코실화 부위를 지니는 FSH 분자, 및 WO 98/58957호에 개시된 서브유닛간 S-S 결합을 지니는 FSH 분자가 있다. FSH 변이체의 추가의 예로는 WO 91/16922호 및 WO 92/22568호에 개시된 것들과 같은, FSH로부터의 서열 및 hCG 또는 LH로부터의 서열을 포함하는 키메라 분자가 있다.

또한 본원에서 언급된 FSH 변이체는 서열번호 2의 전장 성숙 단백질 보다 짧은 카르복시 말단 결실의 베타 서브유닛을 포함한다. 사람 베타 서브유닛의 카르복시 말단 결실은 서열번호 3, 4, 및 5에서 제공된다. 베타 사슬의 카르복시 말단 변이체가 공지된 알파 서브유닛과 복합체를 형성하여 FSH 변이 헤테로이량체를 형성하는 것으로 이해된다.

바람직한 구체예에서, FSH는 혈청 또는 무-혈청 배지에서 CHO 세포의 재조합에 의해 생성된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 정제된 FSH는 피하 투여에 적합하며, 환자에 의한 자기-투여를 허용한다.

"미정제 재조합 FSH"라는 표현은 임의의 크로마토그래피 단계를 수행하기 이전에, FSH를 발현시키는 재조합 세포로부터의 세포 배양 상청액을 언급한다. 상기 표현은 상청액의 비가공 형태 (세포로부터 단리됨) 뿐만 아니라 농축되고/거나 여과되고/거나 초미세여과된 상청액을 포함한다.

FSH 활성과 관련하여 "생물학적 활성"이라는 용어는 스틸맨-폴리 검정에서의 난소 중량 증가 [Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotrophin; Endocrinology; 1953, 53, 604-616], 또는 여성 환자에서 난포 증가와 같은, FSH와 관련된 생물학적 반응을 유도하는 FSH 제형의 능력을 언급한다. 여성 환자에서 난포의 증가는, 예를 들어 자극 8일째에 16 mm 또는 약 16 mm의 평균 직경을 갖는 난포의 수에 의하여 초음파에 의해 평가될 수 있다. 생물학적 활성은 FSH의 허용 기준과 관련하여 평가된다.

FSH 제조물에서의 LH 함량은 예를 들어 LH-특이적 면역검정, 예컨대 델피아(Delfia) hLH Spec (Wallac Oy, Turku, Finland)을 이용하여 측정될 수 있다.

FSH에 관한 "특이적 활성"이라는 용어는 로우리 검정[O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr and R.J. Randall (1951) J. Biol. Chem. 193: 265; Hartree E.E. (1972). Anal. Biochem. 48: 422; J.R. Dulley and P.A. Grieve (1975) Anal. Biochem. 64: 136]과 같은 총 단백질 함량에 대한 검정, 브래드포드(Bradford) 검정[Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248], 또는 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정된 대로, 단백질의 양에 의해 분할되는 스틸맨 폴리 생체검정과 같이 FSH에 대한 승인된 생물학적 검정에서 제조물의 IU로 표시된 생물학적 활성을 의미한다.

바람직하게는, 본 발명에 의해 수득된 FSH는 8000 IU/mg 초과 또는 약 8000 IU/mg 초과, 보다 바람직하게는 9000 IU/mg 초과 또는 약 9000 IU/mg 초과, 심지어 보다 바람직하게는 10000 IU/mg 초과 또는 약 10000 IU/mg 초과, 심지어 보다 바람직하게는 14000 IU/mg 초과 또는 약 14000 IU/mg 초과의 특이적 활성을 지니며, 여기서 생물학적 활성은 스틸맨-폴리 생체검정에 의해 측정되고 단백질 함량은 SE-HPLC에 의해 측정된다.

FSH 샘플은, 예를 들어 하기 나열과 것들과 같은 기술을 이용하여 절차의 다양한 단계에서 이들의 순도에 대해 분석될 수 있다:

r-hFSH 정량/유리 알파 서브유닛/순도/산화된 형태: RP-HPLC

상기 언급된 대로, FSH는 α- 및 β-서브유닛으로 구성된 헤테로이량체 당단백질이다. 다소의 서브유닛의 해리가 일어날 수 있고, 이것은 샘플에 존재하는 유리 α-서브유닛의 양을 관찰함에 의해 모니터링될 수 있다. 또한, FSH 서브유닛은 산화될 수 있다. 산화된 오염물은 RP-HPLC를 이용하여 정량될 수 있고, 유리 서브유닛은 SDS-PAGE를 이용하여 평가될 수 있다.

r-hFSH 정량: 면역검정

샘플 중 FSH 함량은 FSH에 특이적인 면역검정, 예컨대 델피아 FSH 면역검정을 이용하여 결정될 수 있다.

총 단백질: 브래드포드 검정, 로우리 검정, 280 nm에서의 흡광도

임의의 단백질 제조물에서와 같이, 총 단백질 함량은 브래드포드 검정, 로우리 검정 또는 280 nm에서의 흡광도와 같은 기술을 이용하여 결정될 수 있다.

이소형 패턴: IEF

상기 언급된 대로, FSH는 양 서브유닛 상의 다양한 위치에 부착된 다수의 올리고사카라이드 잔기를 지니는 당단백질이다. 올리고사카라이드 잔기는 상이한 분지도를 지닐 수 있고 시알산 잔기로 캡핑될 수 있다. 시알산 잔기는 음으로 하전된다 (중성 pH에서). 캡핑의 차이는 상이한 등전자점 (pI)을 지니는 종들의 혼합물에 대해 이질성을 초래한다. 이것은 등전자 포커싱(IEF)과 같은 전하에 근거하여 분리하는 기술을 이용하여 평가될 수 있다.

숙주 세포 단백질 (HCP)

숙주 세포 단백질은 ELISA 검정을 이용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 항체는 FSH 유전자가 없는 숙주 세포의 배양액인 "위(mock)배양액"으로 성장될 수 있다.

이제부터 본 발명을 두 실시예에 의해 설명할 것이다.

상기 두 실시예를 설명하는 상응하는 흐름도가 도 1 및 2에 제시되어 있다. 생성되는 정제된 r-hFSH를 "r-hFSH 벌크"라 명명한다.

실시예 1 (참조 도 1)

단계 (1): 블루 세파로스 상에서의 염료 친화력 크로마토그래피

정제를 위한 FSH 출발 재료는 재조합 FSH, 즉 혈청 또는 무-혈청 배지에서 CHO 세포의 재조합에 의해 생성된 FSH를 함유하는 세포 배양 수확물로부터 제조하였다. 염료 친화력 크로마토그래피 컬럼 (블루 세파로스 FF 수지)을 먼저 L-메티오닌을 함유하는 pH가 8.5인 낮은 전도성 완충액으로 평형화시켰다. 이후 FSH를 함유하는 액체를 수지에 직접 가하였다. 부하시킨 후에, 결합되지 않은 재료를 평형화 완충액을 이용하여 세척하였다. 마지막으로 컬럼을 NaCl 및 L-메티오닌을 함유하는 pH가 7.0인 인산나트륨 완충액으로 플러싱시킴에 의해 FSH를 용리시켰다. 용리 푸울을 다음 단계로 직접 가공처리하였다. 상기 단계는 2-8℃에서 수행되었다.

단계 (2): 토요펄 부틸 650M 상에서의 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)

단계 (1)로부터의 블루 세파로스 FF 용리물을 황산암모늄 및 L-메티오닌을 함유하는 pH가 7.0인 인산나트륨 완충액에 대해 평형화된 토요펄 부틸 650M 컬럼 상에 부하시켰다. 결합되지 않은 재료를 평형화 완충액으로 플러싱시켰다. FSH를 감소된 황산암모늄 농도를 갖는 동일한 완충액으로 용리시켰다. 용리물을 다음 단계로 직접 가공처리하였다. 상기 단계는 실온에서 수행되었다.

단계 (3): 소스 30 RPC 상에서의 역상

HIC 용리물 (단계 (2)로부터의)을 먼저 IPA (이소프로판올)을 첨가시켜 조건화시켰다. 소스 30RPC 컬럼을 L-메티오닌, 및 조건화된 부하 재료와 동등한 농도의 2-프로판올을 함유하는 pH가 7.6인 암모늄 아세테이트 완충액에 대해 평형화시켰다. 평형화 완충액과 결합되지 않은 재료를 플러싱시킨 후, 수지를 L-메티오닌, 및 증가된 농도의 2-프로판올을 함유하는 pH가 7.6인 암모늄 아세테이트 완충액으로 세척하였다. 마지막으로 FSH를 2-프로판올의 농도를 추가로 증가시킴에 의해 용리시켰다. 용리 푸울을 최종적으로 L-메티오닌을 함유하는 물로 교반하에 희석 시켰다. 희석된 푸울을 다음 단계로 가공처리하였다. 상기 단계는 실온에서 수행되었다.

상기 과정에 따르는 경우, 정제 인자 -즉, 출발 재료(미정제 FSH) 중 FSH 순도에 대한 정제된 샘플 중 FSH 순도의 비율-는 약 40.000이었다.

실시예 2 (참조 도 2)

단계 (-1): 농축된 r-hFSH의 초미세여과/정용여과

모든 작업은 냉각된 조건(2-8℃)에서 수행되었다. 정제를 위한 출발 재료를 형성하는 미정제 FSH는 재조합 FSH를 함유하는 세포 배양 수확물로부터 유래되었다.

정화

미정제 r-hFSH를 0.5 ㎛ 깊이의 필터 (예컨대 Pall Profile II 필터 또는 등가물)를 통해 여과하였다.

초미세여과

정화된 미정제물을 먼저 10 KD 폴리에테르 설폰 막을 이용한 초미세여과에 의해 농축시켰다. 이후 농축된 체류물을 항산화제로서 L-메티오닌을 함유하는 pH가 8.5인 5 디아볼륨(diavolumes) 이상의 붕산염 완충액에 대해 정용여과시켰다. 체류물의 전도성 및 pH를 정용여과의 진행을 모니터링하기 위해 측정하였다. 이후 체류물을 추가로 농축시키고 시스템을 배수시켰다. 초미세여과 유닛을 최종적으로 정용여과 완충액으로 플러싱하고 세정물을 회수된 체류물과 혼합시켰다. 푸울을 다음 단계로 진행시켰다.

여과

농축된 생성물을 0.2 ㎛ 폴리에테르 설폰 필터(또는 등가물)를 통해 여과시켰다.

단계 (0): Q 세파로스 FF 상에서의 음이온 교환

여과된 재료를 L-메티오닌을 함유하는 pH가 8.5인 붕산나트륨 완충액에 대해 평형화된 강 음이온 교환 (Q-세파로스 FF) 수지에 가하였다. 부하시킨 후, 컬럼을 평형화 완충액으로 세정하여 결합되지 않은 모든 재료를 플러싱시켰다. 이후 컬럼을 NaCl (전도성 증가) 및 L-메티오닌 (항산화제)을 함유하는 pH가 8.5인 붕산나트륨 완충액으로 용리시켰다. 용리 푸울을 염료 친화력 크로마토그래피로 가공처리하였다.

염료 친화력 크로마토그래피 컬럼 (블루 세파로스 FF 수지)을 먼저 Q-세파로스 FF 단계로부터의 용리 완충액으로 평형화시켰다. 포획 용리물을 이후 수지에 직접 가하였다. 부하시킨 후, 결합되지 않은 재료를 평형화 완충액을 이용하여 세척하였다. 컬럼을 NaCl 및 L-메티오닌을 함유하는 pH가 7.0인 인산나트륨 완충액으로 플러싱시켜 FSH를 최종적으로 용리시켰다. 용리 푸울을 다음 단계로 직접 가공처리하였다. 상기 단계는 2-8℃에서 수행되었다.

단계 (2): 토요펄 부틸 650M 상에서의 소수성 상호작용 크로마토그래피

블루 세파로스 FF 용리물을 황산암모늄 및 L-메티오닌을 함유하는 pH가 7.0인 인산나트륨에 대해 평형화된 토요펄 부틸 650M 컬럼 상에 부하시켰다. 결합되 지 않은 재료를 평형화 완충액으로 플러싱시켰다. FSH를 감소된 농도의 황산나트륨 농도를 갖는 동일한 완충액으로 용리시켰다. 용리물을 다음 단계로 가공처리하였다. 상기 단계는 실온에서 수행되었다.

단계 (3): 소스 30 RPC 상에서의 역상

HIC 용리물 (단계 (2)로부터의)에 먼저 IPA (이소프로판올)을 첨가시켜 조건화시켰다. 소스 30RPC 컬럼을 L-메티오닌, 및 조건화된 부하 재료와 동등한 농도의 2-프로판올을 함유하는 pH가 7.6인 암모늄 아세테이트 완충액에 대해 평형화시켰다. 평형화 완충액과 결합되지 않은 재료를 플러싱시킨 후, 수지를 L-메티오닌, 및 증가된 농도의 2-프로판올을 함유하는 pH가 7.6인 암모늄 아세테이트 완충액으로 세척하였다. 마지막으로 FSH를 2-프로판올의 농도를 추가로 증가시킴에 의해 용리시켰다. 용리 푸울을 최종적으로 L-메티오닌을 함유하는 물로 교반하에 희석시켰다. 희석된 푸울을 다음 단계로 가공처리하였다. 상기 단계는 실온에서 수행되었다.

단계 (4): 프랙토겔 EMD TMAE hicap 수지 상에서의 음이온 교환 크로마토그래피

프랙토겔 EMD TMAE hicap 컬럼을 먼저 L-메티오닌을 함유하는 pH가 8.5인 붕산나트륨 완충액으로 평형화시켰다. 희석된 RPC-이후 재료 (단계 (3)으로부터의)를 컬럼 상에 부하시켰다. 결합되지 않은 재료를 평형화 완충액을 이용하여 플러싱시켰다. FSH를 염 농도를 선형으로 증가시키는 컬럼으로부터 용리시켰다. 상기 단계는 2-8℃에서 수행되었다.

단계 (4'): 나노여과

프랙토겔 EMD-TAME 단계 (4)로부터의 용리물을 3 bar의 압력에서 질소하에 20 nm의 나노여과 장치에 직접 가하였다. 여액을 다음 단계로 가공처리하였다. 상기 작업은 2-8℃에서 수행되었다.

단계 (5): 벌크 초미세여과

나노여과된 FSH 재료를 5 KD 폴리에테르 설폰 막 상에서 접선에 따라 작용하는 흐름 여과에 의해 농축시켰다. 체류물이 처음 부피의 약 절반에 도달했을 때, 재료를 WFI에 대한 정용여과에 의해 완충-교환시켰다.

샘플의 순도

정제 단계 후 FSH 샘플의 순도를 측정하였다:

정제 단계	순도
단계 (-1): 초미세여과/정용여과	19% FSH ·RP-HPLC에 의해 측정된 FSH ·브래드포드 검정에 의해 측정된 총 단백질 함량
단계 (0): Q 세파로스 FF 상에서의 음이온 교환	44% FSH ·RP-HPLC에 의해 측정된 FSH ·브래드포드 검정에 의해 측정된 총 단백질 함량
단계 (1): 블루 세파로스 상에서의 염료 친화력 크로마토그래피	68% FSH ·RP-HPLC에 의해 측정된 FSH ·280 nm에서의 흡광도에 의해 측정된 총 단백질 함량 또는 약 420'000 ppm HCP ·RP-HPLC에 의해 측정된 FSH 함량 ·ELISA에 의해 측정된 숙주 세포 단백질 함량
단계 (2): 토요펄 부틸 650M에서의 소수성 상호작용 크로마토그래피	불순물의 양 : 3400 ppm ·RP-HPLC에 의해 측정된 FSH 함량 ·ELISA에 의해 측정된 숙주 세포 단백질 함량
단계 (3): 소스 30 RPC 상에서의 역상	불순물의 양 : 170 ppm ·RP-HPLC에 의해 측정된 FSH 함량 ·ELISA에 의해 측정된 숙주 세포 단백질 함량
단계 (4): 프랙토겔 EMD TMAE hicap 수지 상에서의 음이온 교환 크로마토그래피	불순물의 양 : < 80 ppm ·RP-HPLC에 의해 측정된 FSH 함량 ·ELISA에 의해 측정된 숙주 세포 단백질 함량

샘플의 생물학적 활성

정제된 r-hFSH의 생물학적 활성을 스틸맨-폴리 난소 중량 증가 방법을 이용하여 측정하였다. 특이적 활성을 하기 기술된 SE-HPLC 방법에 의해 측정된 FSH 함량으로 생물학적 활성을 나눔에 의해 계산하였다. 수득된 최종 벌크의 특이적 활성은 통상적으로 10'000 내지 17'000 IU/mg이었다. 실시예 2의 방법에 따라 수득된 최종 벌크 FSH의 두 샘플에 대한 예시적인 수치가 표 1에 제시되어 있다.

표 2. 본 발명의 벌크 정제된 rhFSH의 특이적 활성

분석	샘플 1	샘플 2
SE-HPLC에 의한 단백질 농도 (mg/ml)	0.61	0.54
특이적 활성 (생물학적 활성/SE-HPLC)	12'600 IU/mg	14'600 IU/mg

SEQUENCE LISTING <110> ARES TRADING SA <120> Method of Purifying FSH <130> WO 1001 <160> 5 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro 1 5 10 15 Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys 20 25 30 Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu 35 40 45 Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser 50 55 60 Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Val Glu Asn His Thr Ala 65 70 75 80 Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90 <210> 2 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile 1 5 10 15 Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys 20 25 30 Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 35 40 45 Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 50 55 60 Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg 65 70 75 80 Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val 85 90 95 Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 100 105 110 Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 115 120 125 Glu <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30 Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln 35 40 45 Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 50 55 60 Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 75 80 Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 90 95 Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu 100 105 <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu Cys Arg 1 5 10 15 Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr Arg 20 25 30 Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln Lys Thr Cys 35 40 45 Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly Cys Ala 50 55 60 His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Val Pro Val Ala Thr Gln Cys His 65 70 75 80 Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly Leu 85 90 95 Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met 100 105 <210> 5 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30 Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln 35 40 45 Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 50 55 60 Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 75 80 Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 90 95 Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 100 105 110 1

Claims

FSH를 함유하는 액체를 임의의 순서로 수행될 수 있는,

(1) 염료 친화력 크로마토그래피;

(2) 소수성 상호작용 크로마토그래피; 및

(3) 역상 크로마토그래피로 처리하는 것을 포함하여, 재조합 FSH 또는 FSH 변이체를 정제하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (1)의 염료 친화력 크로마토그래피가 고정된 시바크론 블루(Cibacron Blue) F3G-A를 갖는 수지를 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 (1)의 염료 친화력 크로마토그래피에 사용된 수지가 블루 세파로스(Blue Sepharose) FF임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)의 염료 친화력 크로마토그래피가 약 6.5 내지 약 11.5의 pH에서 인산나트륨 완충액을 용리액으로서 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)가 토야펄 부틸(Toyapearl Butyl) 650M, 또는 유사한 특징을 지니는 수지를 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)의 소수성 상호작용 크로마토그래피가 인산나트륨/황산암모늄을 용리액으로서 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (3)의 역상 크로마토그래피 단계가 소스(Source) 30 RPC를 수지로서 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (3)의 역상 크로마토그래피 단계가 2-프로판올과 함께 암모늄 아세테이트를 용리액으로서 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

(1) 염료 친화력 크로마토그래피;

(2) 소수성 상호작용 크로마토그래피; 그리고 나서

(3) 역상 크로마토그래피의 순서로 단계들이 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계 (0)를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 단계 (1), (2) 및 (3) 이전에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서,

(0) 음이온 교환 크로마토그래피;

(1) 염료 친화력 크로마토그래피;

(2) 소수성 상호작용 크로마토그래피; 및

(3) 역상 크로마토그래피의 순서로 단계들이 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 10항, 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 단계 (0)의 음이온 교환 크로마토그래피가 Q 세파로스 FF 수지 또는 프랙토겔(Fractogel) EMD TMAE HiCap 수지를 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (0)의 이온 교환 크로마토그래피가 붕산염 완충액을 용리액으로서 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 붕산염 완충액의 pH가 약 8.5임을 특징으로 하는 방법.
제 10항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피 단계 (4)를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 단계 (4)의 음이온 교환 크로마토그래피의 제2 단계가 단계 (1), (2) 및 (3) 이후에 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 17항에 있어서,

(0) 음이온 교환 크로마토그래피;

(1) 염료 친화력 크로마토그래피;

(2) 소수성 상호작용 크로마토그래피;

(3) 역상 크로마토그래피; 및

(4) 음이온 교환 크로마토그래피의 순서로 단계들이 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 16항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (4)의 음이온 교환 크로마토그래피의 제2 단계가 프랙토겔 EMD TMAE HiCap 수지 또는 Q 세파로스 FF 수지를 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (4)의 음이온 교환 크로마토그래피의 제2 단계가 붕산염 완충액 및 NaCl 농도를 증가시키는 구배를 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 16항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피 단계 (4)가 수행된 후에 나노여과 단계 (4')를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 21항에 있어서, 나노여과 단계 (4') 이후 초미세여과 단계 (5)를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 용리액 및/또는 완충액이 항산화제, 특히 L-메티오닌을 함유할 수 있음을 특징으로 하는 방법.
(-1) FSH를 초미세여과;

(0) 약 8.5의 pH에서 붕산염/NaCl, L-메티오닌을 용리액으로서 이용하여 Q 세파로스 FF 상에서의 음이온 교환 크로마토그래피로 처리하는 단계;

(1) 단계 (0)의 용리물을 약 7의 pH에서 인산염, NaCl, L-메티오닌을 용리액으로서 이용하여 블루 세파로스 FF 상에서의 염료 친화력 크로마토그래피 단계로 처리하는 단계;

(2) 단계 (1)의 용리물을 약 7의 pH에서 인산염, 황산암모늄, L-메티오닌을 용리액으로서 이용하여 토요펄 부틸 650M 상에서의 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계로 처리하는 단계;

(3) 단계 (2)의 용리물을 약 7.6의 pH에서 암모늄 아세테이트, L-메티오닌, 2-프로판올을 용리액으로서 이용하여 소스 30 RPC 상에서의 역상 크로마토그래피 단계로 처리하는 단계;

(4) 단계 (3)의 용리물을 약 8.5의 pH에서 붕산염, L-메티오닌, 및 NaCl을 이용하여 프랙토겔 EMD TMAE hicap 수지 상에서의 음이온 교환 크로마토그래피 단계로 처리하는 단계;

(4') 단계 (4)의 용리물을 나노여과의 단계로 처리하는 단계; 및

(5) 단계 (4')의 투과물을 초미세여과의 단계로 처리하는 단계를 포함하여, 사람 재조합 FSH를 정제하는 방법.
제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득할 수 있는 재조합 사람 FSH 또는 FSH 변이체.
제 25항에 따른 사람 FSH 또는 FSH 변이체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제 조성물.
제 26항에 있어서, 제 25항에 따른 FSH와 플루로닉(Pluronic) F68, 수크로 스, 메티오닌, m-크레솔 및 pH가 약 7.0인 수성 인산염 완충액을 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
수태 질환을 치료하는 약제를 제조하기 위한 제 25항에 따른 재조합 사람 FSH 또는 FSH 변이체의 용도.