KR20070080606A

KR20070080606A - 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물 및 그를 함유한혈당강하용 조성물

Info

Publication number: KR20070080606A
Application number: KR1020070034998A
Authority: KR
Inventors: 오승희; 김순동; 이상일; 이현구
Original assignee: 유진바이오팜영농조합법인
Priority date: 2007-04-10
Filing date: 2007-04-10
Publication date: 2007-08-10
Anticipated expiration: 2026-02-07
Also published as: KR100859984B1

Abstract

본 발명은 귤피(citrus peel) 또는 녹차(green tea) 추출물을 함유한 배지에서 배양한 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물 및 그를 함유한 혈당강하용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물을 이용하면, 종래의 감자 배지를 사용하여 배양한 배양균사체 추출물의 혈당저하 효과보다 현저히 큰 효과를 나타낼 수 있어서, 당뇨환자를 위한 기능성 식품에 널리 활용될 수 있을 것이다.

소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물, 녹차 배지, 귤피 배지, 혈당강하용 조성물

Description

소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물 및 그를 함유한 혈당강하용 조성물{Submerged-Liquid Culture Extract of Fomitopsis pinicola Mycelium and Composition Comprising the Same for Lowering Blood Sugar}

본 발명은 귤피(citrus peel) 또는 녹차(green tea) 추출물을 함유한 배지에서 배양한 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물 및 그를 함유한 혈당강하용 조성물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 감자 배지와 같은 일반적인 합성배지로 배양한 배양균사체 추출물보다 혈당저하 효과가 우수하고, 혈청지질 개선효과 및 항산화 효과를 나타내는 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물 및 그를 함유한 혈당강하용 조성물에 관한 것이다.

경제성장에 따른 식생활 문화의 변화와 영양과다로 인해 암, 뇌졸중, 고혈압 및 당뇨병과 같은 퇴행성 성인병의 발병율이 증가되고 있다. 이 중, 당뇨병은 우리나라 전체 인구의 3% 이상, 특히, 65세 성인의 경우에는 6.5% 이상의 유병율을 나타내면서 매년 심각하게 증가하고 있으며, 그 기전이 정확히 밝혀지진 않았으나 생체의 당 이용능력의 감퇴로 인해 혈중에 존재하는 과잉의 당이 심장순환계 질환 이나 신경계 및 신장 장애를 초래하는 질환으로 여러가지 면역기능 이상과 합병증을 유발시키기 때문에 약물치료와 음식조절을 통해 평생을 치료해야 하는 것으로 알려져 있다.

또한, 당뇨병은 췌장의 랑게르한스섬의 β세포의 손상으로 인해 여러가지 면역 관련 사이토카인이 증가되는 인슐린 의존형과 비만으로 인해 지방세포에서 TNF-αmRNA와 단백질의 과잉생산 및 복강 내 대식세포의 활성증가 등 인슐린 수용체의 수용장애로 발생되는 인슐린 비의존형으로 구분되며, 우리나라 당뇨병 환자의 약 90% 이상이 인슐린 비의존형 당뇨병으로 알려져 있다. 당뇨병 환자의 대표적인 대사적 특징은 혈당농도 상승과 지질대사의 비정상성인데 인슐린 비의존형에서는 중성지방의 증가와 HDL-콜레스테롤의 감소로 인한 관상동맥 질환의 발생 등을 들 수 있다.

상술한 바와 같이, 당뇨병의 치료방법은 약물치료와 식이요법이 병행되는데 술포닐우레아(sulfonyl urea), 비구아니드(biguanide) 및 트로글리타존(troglitazone) 제제 등의 약물을 장기간 복용 시 인체 면역능에 영향을 미쳐 부작용의 위험이 따르는 것으로 알려져 있어 식이요법의 역할이 매우 중요하다. 식이요법은 혈당조절, 혈청지질 수준의 정상화를 목적으로 하여 저지방식과 전분성 지수가 낮은 탄수화물을 섭취하여 식후 혈당과 혈중 인슐린 상승을 억제하는 방법을 권장하고 있는데, 대표적인 물질로는 다당류인 아카보스(acarbose)와 식이 섬유소 등이며, 최근 홍삼, 구기자, 메밀, 결명자 및 버섯 등에 함유되어 있는 생리활성 물질들이 혈당강하에 효과적이라는 연구결과가 발표되어 이에 관한 연구개발이 활 발히 진행중에 있다. 버섯류는 진균류에 속하며, 일반적으로 지질 함량은 적으나, 단백질, 당질, 무기질, 핵산 및 비타민 등의 풍부한 영양소와 독특한 맛과 향기를 함유하며, 특히, 에르고스테롤이라는 비타민 전구체가 다량 함유되어 있다.

버섯류에서 알려지고 있는 생리활성으로는 항암, 면역증강, 콜레스테롤 및 혈당저하, 뇌졸중 및 심장병 예방과 치유, 감염 방어효과 등이 보고된 바 있으며 그 효과는 이들에 함유된 다당류에 의한 것으로 밝혀지고 있는데 그 대표적인 다당류로서는 표고버섯(Lentinus edodes)으로부터 추출된 β-1,3-글루칸, 운지버섯(Coriolus versicolor)의 배양균사체로부터 추출된 PS-K 등이 보고되고 있다.

지금까지의 버섯에 관한 주요연구로는 영양성분 분석, 인공배양 및 다당류의 추출법 등이 보고되고 있으며, 이 중 버섯의 인공배양법으로는 고체 배양법과 액체 배양법이 이용되고 있으나 전자는 노동력과 소요비용이 높아 효율성이 낮은 반면, 후자는 효율성은 높으나 기반기술이 요구되는 문제점이 지적되고 있다. Lee 등은 표고버섯 균사체 배양의 최적조건으로 온도 25℃, pH 4.0, 교반속도 300rpm, 접종량 10%, 산소통기량 1.0v/v/m을 제시하였으며(참조: Lee, B.W., et al., 'Cultural characteristics and pilot scale fermentation for the submerged mycelial culture of Lentinus edodes', Kor. J. Appl. Microbial Biotechnol., 21, 609-614, (1993)), Fraser는 양송이 균사체 배양시 효모추출물과 카제인은 균사체 증식에 매우 효과적인 영양원으로 보고하였다(참조: Fraser, I.M. 'The growth promptive effect of several amino acids on the common cultivated mushroom', Mushroom Sci., 3, 190-200, (1956)). 또한, 배양 시 균사체의 생육은 탄소원이나 질소원이외에도 비타민류, 금속이온 등 환경조건이 생육에 많은 영향을 미치는 것으로 보고되었다.

균사체 액체배양은 다른 미생물에 비하여 생육속도가 느리고 배양 중 오염 가능성이 높기 때문에, 배양기간의 단축, 균일한 품질의 균사체 대량생산, 경제성, 유용물질의 추출 용이성 및 생리활성 물질뿐만 아니라 균사체와 배양액을 이용한 식품개발 측면까지 고려할 수 있는 배지 성분을 결정하는 것이 매우 중요하며, 균사체의 수율 증대를 위한 인삼박이나 맥주효모 추출물 등 천연소재를 이용한 연구도 있으나 아직까지 합성배지를 이용한 배양이 주류를 이루고 있으며, 천연배지에 관한 연구는 미흡한 실정이다.

또한, 버섯류의 다당류 추출에 관한 방법으로는 자실체를 세절한 후 일정량의 증류수를 가하여 85 내지 110℃에서 2 내지 5시간 열수 추출한 후 에탄올을 가하여 얻은 침전물을 투석하여 다당류를 수득하는 방법이 가장 보편적으로 사용되고 있다. 이외의 다당류 추출방법으로는 배양액을 분자배제량이 100,000인 한외여과장치로 24시간 농축, 2배량의 아세톤을 가해 4℃에서 24시간 방치한 후 추출하는 영지버섯으로부터 세포외 조다당류를 추출하는 방법이 있고, 배양액을 증류수로 희석한 후 NaOH를 1%(w/v) 되게 첨가하여 균체를 유리시키고 원심분리하여 얻은 상등액을 중화, 에탄올 침전하여 수득하는 Bacillus polymyxa KS-1으로부터 다당류를 추출하는 방법이 알려져 있다. Lee 등은 구름버섯의 다당류를 열수(97℃), 냉수(4℃), 메탄올(70℃), 에탄올(70℃), 아세톤(50℃), 헥산(50℃), 0.1N NaOH(60℃) 및 0.1N HCl(60℃) 등 용매별로 추출한 결과, 열수, 냉수, 0.1N HCl 및 0.1N NaOH에서 10.4 내지 18.4% 범위로 수율이 높았음을 확인하였다.

한편, 소나무잔나비버섯(Fomitopsis pinicola)은 우리나라의 자생버섯으로 항균성의 스테로이드를 비롯하여 기능성을 지닌 미지의 단백다당체가 함유되어 있으며 경험적으로 항당뇨 효과가 있는 것으로 알려져 있는데, 대한민국 특허공개 제 2005-60726호에 감자배지를 이용하여 배양한 소나무잔나비버섯 추출물이 포함된 혈당강하제 및 그의 제조방법이 개시되어 있으며, 최근에 본 발명자들은 상기 소나무잔나비버섯의 당뇨합병증 예방효과와 당뇨 유도성 고콜레스테롤증 개선효과(대한민국 특허출원 제 2006-1430호), 췌장세포 손상 억제효과(대한민국 특허출원 제 2006-1431호), 당뇨로 인한 활성산소 생성 억제효과(대한민국 특허출원 제 2005-133990호)를 규명한 바 있고, 활성을 나타내는 단백다당체는 β-1,3-글루칸과 β-1,6-헤테로갈락토만난이 결합되어 있는, 분자량 30만 내지 50만의 β-1,3-글루카노-β-1,6-헤테로갈락토만난에 단백질이 결합되어 있는 물질임을 밝힌 바 있다.

그러나, 종래의 배양방법으로 소나무잔나비버섯을 배양하는 데는 한계가 있었으며, 합성배지를 사용함에 따라 발생하는 위생상의 문제 및 균사체의 수율저하 등의 문제를 해결하기 위하여, 천연배지의 이용 가능성에 대하여 많은 연구가 진행중에 있다.

본 발명자들은 천연배지를 위한 조성물로 녹차 및 귤피를 주목하였는데, 녹차는 소량의 유리아미노산, 카페인 및 비타민 C와 폴리페놀을 함유하고 있는 식품이며, 항산화 활성, 항암, 항염성, 혈중 콜레스테롤 저하 효과 및 고혈압 예방 등의 생리활성 기능을 나타낸다고 알려져 있으며, 귤피는 비타민 A 전구체인 β-카로 틴 및 플라보노이드와 테르펜이 풍부하게 함유되어 있어, 항산화, 노화방지, 순환계 질환의 예방, 면역력 증강 및 항암에 효과적인 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 소나무잔나비버섯 균사체를 천연배지에 배양함으로써 합성배지를 사용함에 따라 발생하는 위생상의 문제를 해결하고 나아가 배양액을 직접 음료 등으로 활용하고자 녹차 및 귤피 추출물을 첨가한 배지에서 소나무잔나비버섯 균사체 배양의 최적 조건을 확립한 바 있으며(참조: 대한민국 특허출원 제 2005-133989호), 그 외에, 소나무잔나비버섯 자실체 및 균사체로부터 다당류를 추출하기 위한 자실체 열수 추출물, 자실체 알칼리 추출물 및 배양균사체 추출물의 제조방법을 확립한 바 있다(참조: 대한민국 특허출원 제 2006-1430호).

따라서, 소나무잔나비버섯 자실체 추출물, 천연 배지에서 배양된 균사체로부터의 추출물 및 종래의 합성 배지로부터 배양된 균사체 추출물 가운데, 가장 우수한 혈당저하 효과를 나타내는 추출물 수득 방법에 대한 연구 및 가장 우수한 혈당저하 효과를 나타내는 추출물을 포함하는 혈당강하용 조성물에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

이에, 본 발명자들은 소나무잔나비버섯 자실체 열수추출물, 일반 합성배지로 배양한 균사체 추출물, 녹차배지 또는 귤피배지로 배양한 균사체 추출물 등을 당뇨를 유발한 쥐에 식이 투여하여 혈당, 혈청지질 등을 조사한 결과, 항당뇨 효과가 증진된 최적의 추출물 조건을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 녹차 또는 귤피 배지에서 배양한, 항당뇨 효과가 증진된 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물이 포함된 혈당강하용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 녹차 또는 귤피 배지에서 배양한, 항당뇨 효과가 증진된 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물을 포함하는 혈당강하용 조성물을 제공한다.

상기 혈당강하용 조성물은 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물을 단독으로 포함하여도 무방하지만, 소나무잔나비버섯 자실체 열수 추출물과 혼합한 추출물을 포함하는 것이 보다 바람직하며, 배양액을 추가로 포함할 수도 있다.

녹차 배지 또는 귤피 배지의 제조방법은 본 발명자들의 이전 출원인 대한민국 특허출원 제 2005-133989호에 개시된 방법을 토대로 하며, 상기 출원 전체를 본 명세서에 참고로 인용한다. 녹차분말에 증류수를 가하고 냉각관을 부착하여 2 내 지 3시간 동안 가열한 후, 여과한 용액을 녹차 추출물 원액으로 하여, 이를 2.0%(v/v) 함유하는 녹차 배지를 제조한다. 또한, 건조분쇄한 귤피에 증류수를 가하고 냉각관을 부착하여 2 내지 3시간 동안 가열한 후, 여과한 용액을 귤피 추출물 원액으로 하여, 이를 2.0%(v/v) 함유하는 귤피 배지를 제조한다.

또한, 소나무잔나비버섯 자실체 열수추출물은 세절, 분쇄한 자실체에 증류수를 가하여 냉각관을 부착한 추출조를 이용하여 24시간 동안 추출한 후, 농축한 용액을 사용한다.

일반 배지인 감자 배지를 이용한 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물은 일단 균사체를 YM배지에 접종해서 계대배양한 후, 살균 및 냉각한 감자 배지(감자 열수추출물 10~20%(v/v), 설탕 1~3%(w/v), 옥수수분말 0.1~0.5%(w/v) 및 음용수 76.5~88.9%(v/v))에 접종하여 배양 및 농축한 용액을 사용한다(참조: 대한민국 특허공개 제 2005-60726호).

상기 방법으로부터 수득한 다양한 소나무잔나비버섯 추출물들의 혈당저하 효과 및 혈청지질 감소 효과 등을 하기와 같은 방법으로 조사하였다. 스트렙토조토신(streptozotocin: STZ)으로 당뇨를 유발한 쥐에 상기 추출물들이 함유된 식이사료를 4주간 투여하여 사육시킨 후, 실험쥐의 꼬리정맥으로부터 채혈하여 혈당을 분석하고, 실험쥐의 복부 대동맥으로부터 채혈하여 혈청지질을 분석하였으며, 간 및 신장을 적출하여 중량의 변화를 비교하고, 간 조직의 크산틴산화효소의 활성을 측정하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 녹차 배지 및 귤피 배지를 이용한 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물의 제조

실시예 1-1: 소나무잔나비버섯 균사체의 분리

경북 포항시 소재 재생농산에서 분양받은 1년생 소나무잔나비버섯의 자실체로부터 소나무잔나비버섯 균사체를 분리하였다. 2×2×2mm의 크기로 절단한 자실체 일정량을 70%(v/v) 에탄올로 세척한 후, 감자 2.0%(w/v), 설탕 1.0%(w/v) 및 펩톤 0.6%(w/v)를 함유하는 배지에서 5.0%(w/v) 되도록 이식하여 10일간 150rpm으로 진탕배양하였다. 전기 배양으로 생성된 소나무잔나비버섯 균사체를 YM agar 배지(효모추출물 0.5%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v), 맥아추출물 0.2%(w/v), 포도당 1.0%(v/v) 및 아가 2.0%(w/v), pH 6.5)에 접종하고, 30℃에서 5 내지 6일간 배양하여 버섯균사체를 확인한 후, 15일 간격으로 계대 배양하여 균주로 사용하였다.

실시예 1-2: 녹차 및 귤피 배지의 제조와 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물의 제조

녹차 추출물을 시판되는 설록차(태평양(주))를 사용하여 귤피 추출물의 제조방법과 동일한 열수추출법으로 제조하였다. 즉, 건조분쇄(100mesh)한 녹차잎 100g에 증류수 2.5L를 가한 다음, 냉각관을 부착하여 2시간 동안 가열한 후, Miracloth(BioChem Co. USA)로 여과한 여액을 원액으로 한 녹차 추출물을 제조하였다. 또한, 대구약령시에서 구입한 귤피(진피)를 건조분쇄(100mesh)하고, 전기 건조분쇄된 귤피 100g에 증류수 2.5L를 가한 다음, 냉각관을 부착하여 2시간 동안 가열한 후, Miracloth(BioChem Co. USA)로 여과한 여액을 원액으로 한 귤피 추출물을 제조하였다.

상기 제조한 녹차 추출물 원액을 2%(v/v) 함유하는 녹차 배지(녹차 추출물 원액 2%(v/v), 포도당 5%(v/v), 효모추출물 0.5%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v) 및 맥아추출물 0.3%(w/v), pH 5.0)와 상기 녹차 배지 조성의 2%(v/v) 녹차 추출물 원액 대신 2%(v/v) 귤피 추출물 원액을 사용한 귤피 배지를 제조하였다.

상기 실시예 1-1에서 수득한 소나무잔나비버섯 균사체를 녹차 배지 및 귤피 배지에 접종하고, 30℃, 150 rpm 조건의 진탕 배양기에서 12일간 배양하였다. 이후, 소나무잔나비버섯 배양균사체를 포함하는 배양액을 중조(NaHCO₃)로 pH 7.0으로 조정한 후 균질화하고 이를 40℃에서 1/20로 감압 농축하여 녹차 및 귤피 배지를 이용한 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 소나무잔나비버섯 자실체 열수 추출물 및 감자 배지를 이용한 배양균사체 추출물의 제조

*실시예 2-1: 소나무잔나비버섯 자실체 열수 추출물의 제조

경북 포항시 소재 재생농산에서 분양받은 1년생 소나무잔나비버섯의 자실체 150g을 2×2×2cm로 세절한 후, 증류수 4L를 가하고 냉각관을 부착한 추출조를 이용하여 24시간 동안 추출한 후, 1/4로 농축하여, 3.75g/100mL의 용액을 제조하였다.

실시예 2-2: 감자 배지를 이용한 배양균사체 추출물의 제조

경북 포항시 소재 재생농산에서 분양받아 보존 중인 소나무잔나비버섯 균사체를 YM 배지(포도당 1%(v/v), 효모추출물 0.5%(w/v), 펩톤 0.5%(w/v) 및 맥아추출물 0.3%(w/v), pH 6.5)에 접종, 30℃에서 10일간 계대배양한 후, 121℃에서 1시간 동안 살균, 냉각한 감자 배지[(감자 열수추출물 15%(v/v), 건물양으로는 4%(w/v)), 설탕 2%(w/v), 옥수수분말 0.3%(w/v), pH 6.5]에 5%(v/v) 되도록 접종하여 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양기에서 12일간 배양하였다. 이후, 소나무잔나비버섯 배 양균사체를 포함하는 배양액을 중조로 pH 7.0으로 조정한 후 균질화하고, 이를 40℃에서 1/20로 감압 농축하여 배양균사체 추출물을 제조하였다.

실시예 3: 각종 소나무잔나비버섯 추출물의 항당뇨 효과 비교

실시예 3-1: 실험군 및 실험방법

평균 체중이 225±5.2g인 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 각 실험군마다 10마리씩 총 70마리를 구입하여 실내온도 23±2℃, 습도 60±5%, 12hr 명암 사이클의 조건에서 환경에 적응시키기 위하여 일반 배합사료(Purina Co., Seoul Korea)로 1주간 예비사육한 후 실험 식이를 행하였다.

7개의 실험 식이군(참조: 표 1)은 다음과 같다.

1) NC: 정상대조군

2) DM: 당뇨대조군

3) DM-PD: 당뇨유발 후, 감자 배지(PD 배지)에서 배양한 균사체 배양 농축액(1/20) 2% 투여군

4) DM-CP: 당뇨유발 후, 귤피 배지(CP 배지)에서 배양한 균사체 배양 농축액(1/20) 2% 투여군

5) DM-GT: 당뇨유발 후, 녹차 배지(GT 배지)에서 배양한 균사체 배양 농축액(1/20) 2% 투여군

6) DM-WE: 당뇨유발 후, 자실체 열수추출물(WE) 농축액 2% 투여군

7) DM-WC: 당뇨유발 후, 자실체 열수추출물 농축액과 귤피 배지에서 배양한 배양균사체 농축액(1/20)의 1:1 혼합액 2% 투여군

표 1: 동물실험을 위한 기본식이조성(g/kg)

식이조성	NC	DM	DM-PD	DM-CP	DM-GT	DM-WE	DM-WC
카제인	200	200	195	200	195	200	195
콘스타치	150	150	142.5	150	142.5	150	142.5
설탕	500	500	500	500	500	500	500
셀룰로즈	50	50	45	49.5	45	49.5	45
콘오일	50	50	48	50	48	50	48
AIN-미네랄믹스쳐¹ ⁾	35	35	34.5	35	34.5	35	34.5
AIN-비타민믹스쳐² ⁾	10	10	10	10	10	10	10
DL-메티오닌	3	3	3	3	3	3	3
콜린바이타타레이트	2	2	2	2	2	2	2
균사체 PD배양액(1/20 농축)	-	-	20	-	-	-	-
균사체 CP배양액(1/20 농축)	-	-	-	20	-	-	10
균사체 GT배양액(1/20 농축)	-	-	-	-	20	-	-
자실체 열수추출물(3.75g/100mL)	-	-	-	-	-	20	-
자실체 열수추출물+균사체 CP배양액(1:1)	-	-	-	-	-	-	10
총합	1,000	1,000	1,000	1,000	1,000	1,000	1,000

¹⁾AIN-미네랄믹스쳐(g/kg): 젖산칼슘 620.0, 염화나트륨 74.0, 제2인산칼륨 220.0, 황산칼륨 52.0, 산화마그네슘 23.0, 아망간산카보네이트 3.3, 구연산철 6.0, 탄산아연 1.0, 탄산구리 0.2, 요오드산칼륨 0.01, 소듐셀레나이트 0.01 및 황산크롬칼륨 0.5를 미세한 분말로 하여 1,000g 제조

²⁾AIN-비타민믹스쳐(mg/kg): 염산티아민 600, 리보플라빈 600, 염산피리독신 700, 니코틴산 3,000, D-판토텐산칼슘 1,600, 엽산 200, D-비오틴 20, 비타민 B12 2.5, 비타민 A 400,000 IU, 비타민 D3 100,000 IU, 비타민 E 7,500 IU 및 비타민 K 75를 미세한 분말로 하여 1,000g 제조

실시예 3-2: 항당뇨 효과 측정

체중증가량, 식이 섭취량 및 식이효율

스트렙토조토신(STZ, Sigma Chem. Co. MO, USA)을 0.1M 시트르산 완충액(pH 4.3)에 용해시켜 체중 250g 당 40mg/kg 농도로 대퇴부 근육에 주사하였으며, STZ 투여 48시간 후에 공복 시 꼬리정맥으로부터 취한 혈액의 혈당농도가 200mg/㎗ 이상일 경우에 당뇨로 간주하였다.

혈당분석은 Gluco-Tester(Life Scan lnc., USA)를 사용하여 매일 오전 10~12시에 측정하였으며, 공복 시의 꼬리부위 혈관에서 란셋으로 채혈하였다.

체중, 식이 및 음용수 섭취량은 전 실험 기간을 통하여 매일 일정한 시간에 측정하였고, 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 같은 기간 동안의 체중증가량을 동일 기간의 식이 섭취량으로 나눈 값으로 하였으며, 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율을 하기 표 2에 나타내었다.

당뇨 유발군(DM)에서는 정상군(NC)에 비하여 유의적으로 체중이 감소하였고(58% 감소), 식이섭취량은 14% 증가, 물 섭취량은 84% 증가, 뇨 배설량은 108%가 증가하여 당뇨로 인한 3다 현상과 체중감소 현상이 나타났다. 나머지 식이투여군에서도 상기 3다 현상과 체중감소 현상이 나타났으나, DM군에 비하여 그 증상이 크게 완화되어 항당뇨 효과를 보였는데, 그 중에서, DM-WC군과 DM-GT군에서 항당뇨 효과가 높았으며, 종래 사용되고 있는 배지인 감자 배지에 비하여 현저한 차이를 나타내었다. 즉, 체중감소율은 DM-GT군, DM-CP군, DM-PD군, DM-WE군 및 DM-WC군에서 각각 17%, 16%, 32%, 23% 및 15%로 녹차 및 귤피 배지에서 배양한 배양액과 자실체 열수추출물과 귤피 배지에서 배양한 배양액의 혼합액이 감자 배지에서 배양한 배양액에 비하여 효과가 약 2배로 컸다. 기타 식이섭취량, 식이효율, 물 섭취량 및 뇨 배설량에 있어서도 DM-CP군과 DM-WC군을 식이투여한 그룹에서 가장 효과가 컸음을 알 수 있었다(참조: 표 2).

표 2: STZ로 당뇨유발한 쥐의 증체량, 식이섭취량, 식이효율, 물섭취량 및 뇨배설량에 미치는 각종 소나무잔나비버섯 추출물이 함유된 식이의 4주간 급여 효과

그룹¹ ⁾	최종체중 (g)	증체량 (g/week)	식이섭취량 (g/week)	식이효율² ⁾	물섭취량 (mL/week)	뇨배설량 (mL/day)
NC	371.2±11.2	36.5±5.3	176.5±6.1	0.21±0.04	231.0±16.1	74.1±16.0
DM	213.4±10.3	-2.9±0.9	201.7±8.9	-0.14±0.01	424.3±31.7	154.4±25.6
DM-PD	250.6 ±6.4	6.3±4.5	187.4±5.1	0.03±0.03	345.6±25.2	124.7±12.4
DM-CP	312.7 ±7.6	21.8±5.7	180.9±4.7	0.12±0.04	298.3±20.4	82.7±13.8
DM-GT	307.0 ±7.5	20.5±6.4	182.0±6.7	0.11±0.04	326.4±29.5	99.6 ±7.5
DM-WE	286.5 ±8.4	15.4±6.2	185.6±6.9	0.08±0.04	320.0±30.8	110.7±7.5
DM-WC	314.3 ±5.7	22.1±4.4	179.8±5.4	0.12±0.03	296.2±21.3	81.9±14.1

¹⁾: NC: 정상대조군, DM: 당뇨대조군, DM-PD: 당뇨유발 후, 감자 배지(PD 배지)에서 배양한 균사체 배양 농축액(1/20) 2% 투여군, DM-CP: 당뇨유발 후, 귤피 배지(CP 배지)에서 배양한 균사체 배양 농축액(1/20) 2% 투여군, DM-GT: 당뇨유발 후, 녹차 배지(GT 배지)에서 배양한 균사체 배양 농축액(1/20) 2% 투여군, DM-WE: 당뇨유발 후, 자실체 열수추출물(WE) 농축액 2% 투여군, DM-WC: 당뇨유발 후, 자실체 열수추출물 농축액과 귤피 배지에서 배양한 배양균사체 농축액(1/20)의 1:1 혼합액 2% 투여군

²⁾ : 식이효율: 전 체중증가량/ 전 식이 섭취량

장기 중량

당뇨병에 걸리면 체내 인슐린 저하와 그 저항성으로 인한 비정상적인 당대사 로 아세틸-CoA에서 지질대사 체계가 형성되어 간장 내에 지질성분이 축적되는 것으로 알려져 있으며, 특히, 스트렙토조토신으로 유발한 당뇨쥐에 있어서는 탄수화물 대사에 관여하는 간장 내 글루코스-6-포스파타제의 활성이 증가하여 간장이 배대해 진다. 또한, 당뇨병에 걸리면 신장도 비대해 지는데 이는 당뇨로 인하여 농도가 높아진 혈장 포도당이 글리코겐 등으로 대사되어 사구체 내의 혈관간세포(mesangial cell)에 축적되기 때문이다.

당뇨유발 후 4주간 사육한 흰쥐의 간장 및 신장의 중량의 변화를 비교해 본 결과, DM군 간장의 체중대비 중량%는 NC군에 비하여 48% 증가하여 당뇨로 인한 간의 비대증상이 확인되었으며, 실험식이군에서는 DM군에 비해서는 당뇨로 인한 간장 비대증상을 완화시켰다. DM-CP군과 DM-WC군에서 이러한 완화효과가 가장 컸으며, 신장의 경우도 간장과 동일한 경향을 나타내었다(참조: 표 3).

표 3: 당뇨유발 후 4주 동안 각종 소나무잔나비버섯 추출물이 함유된 식이 급여가 간장 및 신장 중량(체중대비 %)에 미치는 영향

실험군¹ ⁾	간장중량	간장중량
NC	2.47±0.04^d	0.64±0.07^a
DM	3.65±0.16^a	0.83±0.12^a
DM-PD	3.08±0.09^b	0.74±0.06^a
DM-CP	2.60±0.12^cd	0.65±0.07^a
DM-GT	2.83±0.17^bC	0.66±0.08^a
DM-WE	2.92±0.18^b	0.73±0.07^a
DM-WC	2.59±0.11^cd	0.64±0.06^a

*¹⁾ 표 2에서와 동일

²⁾ 각 실험군 당 10마리의 값을 평균±표준편차로 나타낸 것이고, 서로 다른 문자는 5% 이내에서 유의성이 있음을 나타냄.

혈당 함량

당뇨를 유발시킨 쥐에 실험식이를 4주간 급여하는 동안 혈당의 변화를 조사하였다. 그 결과, DM군은 4주간의 실험식이 동안 523.5~546.5 mg/dL을 유지하였다. 그러나, 실험 식이군에서는 정도의 차이는 있으나 혈당의 감소를 보였으며, 급여 4주째의 혈당 감소율은 DM-GT군이 69%, DM-CP군이 74%, DM-PD군이 53%, DM-WE군이 58%, DM-WC군이 75%로 나타났다. 이러한 결과는 균사체의 배양조건에 따라 그 효능에 차이를 나타낸 결과로 기존의 감자배지에 비하여 귤피나 녹차배지 또는 여기에 자실체 열수추출물을 혼합한 경우에 높은 효과가 있음을 알 수 있었다(참조: 표 4). 특히, 종래의 감자 배지를 이용하여 배양한 배양균사체 추출물 경우의 4주 후 개선효과를 살펴보면, 투여 전과 후에 혈당이 약 292 mg/dl 저하하여 약 53%의 개선효과를 보이고 있는 반면, 귤피 배지를 이용하여 배양한 배양균사체 추출물 경우는 투여 전과 후에 혈당이 약 406 mg/dl 저하하여 약 74%의 혈당 개선효과를 보이고 있다.

표 4: 당뇨유발 후 4주간 소나무잔나비버섯 추출물이 함유된 실험식이를 급여하는 동안 쥐의 혈당변화 비교

그 룹¹ ⁾	식이기간 (주)
그 룹¹ ⁾	1	2	3	4
NC	117.6±12.3^bA ^,2)	124.3±11.3^cA	118.5± 7.3^dA	120.6±12.4^dA
DM	546.5±24.5^aA	550.4±32.3^aA	549.6±32.4^aA	523.5±32.8^aA
DM-PD	538.7±19.6^aA	525.3±35.6^aA	435.5±36.1^bB	254.6±22.5^bC
DM-CP	532.4±20.8^aA	453.9±30.8^bB	344.2±37.6^cC	140.2±27.1^cdD
DM-GT	528.7±28.7^aA	549.8±56.2^aA	347.4±51.2^cB	165.4±19.7^cC
DM-WE	540.5±21.4^aA	500.7±32.3^abA	382.7±35.4^bcB	224.5±23.5^bC
DM-WC	535.3±21.2^aA	456.5±31.4^bB	345.8±338.3^cC	135.8±25.6^cdD

¹⁾ 표 2에서와 동일

²⁾각 실험군 당 10마리의 값을 평균±표준편차로 나타낸 것이고, 서로 다른 문자는 5% 이내에서 유의성이 있음을 나타냄.

실시예 4: 소나무잔나비버섯 추출물이 함유된 실험식이로 인한 혈청지질 개선 및 간조직의 크산틴산화효소 억제효과

실험군 및 실험방법은 실시예 3과 동일하게 실시하였으며, 실험식이로 4주간 사육한 흰쥐를 물 이외는 주지 않으며 24시간 동안 절식시키고, 에틸에테르로 마취하여 개복한 후, 복부 대동맥으로부터 채혈한 다음, 빙냉의 생리식염수로 간장을 관류하고 장기를 적출하였다. 채취한 혈액은 냉장온도에 7시간 방치한 후, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였으며, 적출한 간의 일정량에 4배량의 빙냉의 0.25M 슈크로즈 용액을 가하여 마쇄 균질화한 다음 1,000×g에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 다시 10,000×g에서 30분간 원심분리하여 분리된 상등액을 cytosol 분획으로 하였다. 모든 분석시료는 -70℃ deep freezer에 보관하고, 실험시 꺼내어 사용하였다.

혈청지질의 분석

혈청중성지질, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 함량은 kit 시약(AM 157S-K, AM 202-K, AM 203-K, Asanpharm Co., Korea)으로 측정하였다. 즉, 중성지질의 함량은 혈청 0.02㎖ 에 효소용액 3.0㎖씩을 가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 후 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈청 총콜레스테롤 함량은 중성지질의 경우와 동일한 용량비로 37℃에서 5분간 반응, 500nm에서 흡광도를 측정하여 계산식(mg/dL = (표준용액의 흡광도/검액의 흡광도)×300)에 의하여 함량을 구하였다. 또한, HDL-콜레스테롤 함량은 혈청 0.1㎖에 효소용액 3.0㎖을 가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 500nm에서 흡광도를 측정, 계산식(mg/dL = (표준용액의 흡광도/검체용액의 흡광도)×100)에 의하여 함량을 산출하였다. LDL-콜레스테롤 함량은 총콜레스테롤-(HDL-콜레스테롤량)-(중성지질/5)로 계산하였다.

혈청 중성지질의 함량은 DM군에서는 정상군인 NC군에 비하여 73%가 증가한 반면 DM-GT군은 16%, DM-CP군은 8%, DM-PD군은 47%, DM-WE군은 39%, DM-WC는 7%의 증가로 DM-WC군과 DM-CP군이 비슷한 수준으로 증가율이 가장 낮았다. 총 콜레스테 롤의 평균함량은 중성지질의 경우와 동일한 경향을 보였으나 유의차는 없었다. HDL-콜레스테롤 함량은 DM군이 NC군보다 19%가 낮았으나 실험 식이군에서는 정상군인 NC군과 유의차를 보이지 않았다. LDL-콜레스테롤 함량은 DM군에서는 정상군에 비하여 42%가 높았으나 DM-WC군, DM-CP군 및 DM-GT군은 정상군과 거의 차이가 없거나 오히려 낮아 DM-PD군에 비하여 혈청지질을 개선시키는 효과가 더욱 높았다(참조: 표 5).

표 5: 당뇨유발 후 4주 동안 소나무잔나비버섯 추출물이 함유된 식이 투여가 혈청지질에 미치는 영향

그룹¹ ⁾	중성지질 (mg/dL)	총콜레스테롤 (mg/dL)	HDL-콜레스테롤 (mg/dL)	LDL-콜레스테롤 (mg/dL)²⁾
NC	72.4±13.5^c	121.5±12.4^a,3)	56.5±5.9^a	50.5±5.6^bc
DM	125.6±13.4^a	142.5±17.5^a	45.8±4.7^b	71.6±6.4^a
DM-PD	106.3±12.0^ab	134.6±10.3^a	49.0±2.4^ab	64.3±5.3^a
DM-CP	78.2±11.5^c	112.4±13.3^a	53.5±4.5^ab	43.3±4.7^c
DM-GT	84.3±10.8^bc	120.7±12.4^a	52.3±3.3^ab	51.5±5.6^bc
DM-WE	100.3±12.5^abc	130.5±12.4^a	50.3±3.1^ab	60.1±6.4^ab
DM-WC	77.8±10.3^c	112.4±13.3^a	53.5±4.5^ab	43.3±3.9^c

¹⁾표 2에서와 동일.

²⁾총콜레스테롤 ― (HDL-콜레스테롤량+중성지질/5).

³⁾실험동물 10마리의 평균치와 표준편차를 나타냄. 종축의 서로 다른 문자(a-c)는 5% 이내에서 유의성이 있음을 나타냄.

간 조직의 크산틴산화효소 활성

간조직의 크산틴산화효소(xanthine oxidase:XOD)의 활성도 측정은 크산틴을 기질로 하여 30℃에서 10분간 반응시켜 생성된 요산을 292nm에서 흡광도를 측정하는 Stirpe 등의 방법에 준하여 측정하였다. 효소의 활성 단위는 간 조직 단백질 1mg이 1분 동안 반응하여 기질로부터 생성시킨 요산의 양을 nmol 농도로 표시하였다.

크산틴산화효소는 간의 손상 시에 그 활성이 증가하며, 에탄올, 사염화탄소, 스트렙토조토신 등의 독성물질의 투여 시에 크산틴의 산화가 증가되어 활성이 증가하는 것으로 보고되어 있으며, O type의 활성도와 O/T ratio(%)가 높으면 활성산소 종의 생성이 촉진됨을 나타낸다.

하기 표 6은 당뇨를 유발한 쥐에 4주간의 실험식이를 급여하였을 때의 크산틴산화효소의 활성도를 비교한 것이다. 그 결과, 총 크산틴산화효소의 활성은 유의적인 차이를 보이지 않았으나, O type 활성과 O/T(%)는 DM-PD군에 비하여 DM-CP군과 DM-WC 및 DM-GT군이 현저하게 낮았을 뿐만 아니라 정상군과 대등하여 당뇨에 의하여 생성되는 활성산소종의 생성을 크게 억제하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

표 6: 당뇨유발 후 4주간 실험식이를 급여한 쥐 간조직의 크산틴산화효소 활성 비교

그 룹¹ ⁾	Total	O type	O/T(%)
NC	4.61±0.19^a,2)	1.10±0.39^d	23.86±7.18^d
DM	4.30±0.27^a	3.15±0.54^a	73.26±7.48^a
DM-PD	4.48±0.12^a	2.40±0.20^b	53.57±5.74^b
DM-CP	4.60±0.13^a	1.16±0.39^d	25.22±8.94^d
DM-GT	4.56±0.18^a	1.35±0.34^cd	29.61±8.30^cd
DM-WE	4.52±0.14^a	1.97±0.32^bc	43.58±8.17^bc
DM-WC	4.60±0.12^a	1.18±0.32^d	25.65±8.51^d

¹⁾표 2에서와 동일.

²⁾실험동물 10마리의 평균치와 표준편차를 나타냄. 종축의 서로 다른 문자(a-c)는 5% 이내에서 유의성이 있음을 나타냄.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 녹차 또는 귤피추출물을 함유한 배지에서 배양한, 항당뇨 효과가 증진된 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물에 관한 것이다. 본 발명의 소나무잔나비버섯 배양균사체 추출물을 이용하면, 종래의 감자 배지를 사용하여 배양한 배양균사체 추출물의 혈당저하 효과보다 현저히 큰 효과를 나타낼 수 있어서, 당뇨환자를 위한 기능성 식품에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims

녹차 배지 또는 귤피 배지를 이용하여 배양한 소나무잔나비버섯 배양균사체의 추출물과, 소나무잔나비버섯 자실체 열수 추출물을 포함하는 혈당강하용 조성물.
녹차 배지 또는 귤피 배지를 이용하여 배양한 소나무잔나비버섯 배양균사체의 추출물과, 녹차 배지 또는 귤피 배지로 배양한 소나무잔나비버섯 균사체를 걸러낸 배양액을 포함하는 혈당강하용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 녹차 배지는 녹차분말을 열수추출 및 여과하여 수득한 녹차 추출물 원액 0.5% 내지 3.0%(v/v), 포도당 3.0% 내지 7.0%(v/v), 효모추출물 0.5% 내지 1.5%(w/v), 펩톤 0.1% 내지 1.5%(w/v), 맥아추출물 0.1% 내지 0.7%(w/v) 및 정제수 86.3% 내지 95.8%(v/v)가 함유된 배지임을 특징으로 하는 혈당강하용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 귤피 배지는 건조분쇄한 귤피를 열수추출 및 여과하여 수득한 귤피 추출물 원액 0.5% 내지 3.0%(v/v), 포도당 3.0% 내지 7.0%(v/v), 효모추출물 0.5% 내지 1.5%(w/v), 펩톤 0.1% 내지 1.5%(w/v), 맥아추출물 0.1% 내지 0.7%(w/v) 및 정제수 86.3% 내지 95.8%(v/v)가 함유된 배지임을 특징으로 하는 혈당강하용 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 소나무잔나비버섯 자실체 열수 추출물은 세절, 분쇄한 소나무잔나비버섯 자실체에 증류수를 가하고 냉각관을 부착한 추출조를 이용하여 24시간 동안 추출한 후, 농축한 것을 특징으로 하는 혈당강하용 조성물.