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KR20070077225A - 아폽토시스-특이적 ｅＩＦ-5Ａ 및 이를 암호화하는폴리뉴클레오타이드 - Google Patents

아폽토시스-특이적 ｅＩＦ-5Ａ 및 이를 암호화하는폴리뉴클레오타이드 Download PDF

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KR20070077225A
KR20070077225A KR1020077012556A KR20077012556A KR20070077225A KR 20070077225 A KR20070077225 A KR 20070077225A KR 1020077012556 A KR1020077012556 A KR 1020077012556A KR 20077012556 A KR20077012556 A KR 20077012556A KR 20070077225 A KR20070077225 A KR 20070077225A
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KR
South Korea
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apoptosis
cells
specific eif
eif
sirna
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Withdrawn
Application number
KR1020077012556A
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English (en)
Inventor
죤 이 톰슨
브루스 씨 갈톤
챨스 디나렐로
아드리엔 부네
캐서린 테일러
레오니드 레즈니코브
마리안 홉킨스
Original Assignee
세네스코 테크놀로지스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명은 아폽토시스-특이적 eIF-5A 또는 eIF-5A1로 표기되는 아폽토시스 특이적 진핵세포성 개시 인자 5A(eIF-5A), 핵산 및 폴리펩타이드 및 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 증가시키거나 감소시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 아폽토시스를 증가시키거나 감소시키는 방법에 관한 것이다.
Figure 112007040571121-PCT00001
아폽토시스, eIF-5A, 안티센스, 뉴클레오타이드, siRNA, 패혈증

Description

아폽토시스-특이적 ｅＩＦ-5Ａ 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드{Apoptosis-specific eIF-5A and polynucleotides encoding same}
관련 출원
본 출원은 명세서 내에 참고사항으로 포함된 하기 미국 잠정출원의 우선권을 청구한다: 2004년 12월 2일에 출원된 미국 잠정출원 제60/632,514호; 2005년 3월 21일에 출원된 미국 잠정출원 제60/666,626호; 2005년 4월 29일에 출원된 미국 잠정출원 제60/675,884호 및 2005년 8월 26일에 출원된 미국 잠정출원 제60/711,397호. 본 출원은 2001년 7월 23일 출원된 미국 특허출원 제9/909,796호(현재 미국특허 제6,867,237호)의 부분연속출원인 2002년 5월 5일 출원된 미국 특허출원 제10/141,647호의 부분연속출원인 2002년 7월 23일 출원된 미국 특허출원 제10/200,148호의 부분연속출원인 2002년 10월 10일 출원된 미국 특허출원 제10/277,969호의 부분연속출원인 2003년 3월 10일 출원된 미국 특허출원 제10/383,614호의 부분연속출원인 2004년 3월 5일 출원된 미국 특허출원 제10/729,893호의 부분연속출원인 2004년 6월 7일 출원된 미국 특허출원 제 10/861,980호의 부분연속출원인 2005년 7월 20일 출원된 미국 특허출원 제11/184,982호의 부분연속출원이며 이 모두는 본 명세서 내에 참고사항으로 그 전체가 포함되어 있다.
본 발명은 "아폽토시스-특이적 eIF-5A" 또는 eIF-5A1"으로 표기되는 아폽토시스(apoptosis)-특이적 진핵세포성 개시 인자-5A("eIF-5A") 및 생체 내 패혈증을 치료하기 위한 siRNA에 관한 것이다.
아폽토시스(apoptosis)는 세포 수축, 염색질 응축, 핵 무사분열 및 막 수포형성과 같은 잘-정의된 형태학적 현상을 특징으로 하는 유전적으로 프로그램화된 세포 이벤트이다. Kerr et al.(1972) Br. J. Cancer, 26:239-257; Wyllie et al., (1980) Int. Rev. Cytol., 68:251-306. 이는 정상 조직 발달 및 항상성에 중요한 역할을 하고, 아폽토시스 프로그램 내 결함은 신경퇴행성 및 자가면역성 장애에서부터 종양까지의 광범위한 인간 대사장애에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. Thompson(1995) Science, 267:1456-1462; Mullauer et al.(2001) Mutat. Res, 488:211-231. 아폽토시스성 세포의 형태학적 특성이 잘 특정되었더라도 이러한 과정을 조절하는 분자적 경로는 단지 해명되기 시작했다.
아폽토시스에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지는 단백질 중의 하나의 그룹은 아폽토시스의 대부분의 경로에 필요한 것으로 보이는 시스테인 프로테아제 패밀리, 카스페이즈(caspase)이다. Creagh & Martin(2001) Biochem. Soc. Trans, 29:696-701; Dales et al.(2001) Leuk. Lymphoma, 41:247-253. 카스페이즈는 다양한 세포 단백질을 분열시킴으로서 아폽토시스 자극에 반응하여 아폽토시스를 시작시키고 이는 세포 수축, 멤브레인 수포 및 DNA 무사분열을 포함한 전형적인 아폽토시스의 징후를 유발한다. Chang & Yang(2000) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:821-846.
또한 Bax 또는 Bak와 같은 프로-아폽토시스 단백질은 미토콘드리아 시토크롬 c와 같은 카스페이즈-활성화 분자를 방출하여 아폽토시스를 통한 세포 사멸을 증가시킴으로서 아폽토시스 경로에 중요한 역할을 한다. Martinou & Green(2001) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2:63-67; Zou et al.(1997) Cell, 90:405-413. Bcl-2와 같은 항-아폽토시스 단백질은 프로-아폽토시스 단백질, Bax 및 Bak의 활성을 상쇄시킴으로서 세포 생존을 증가시킨다. Tsujimoto(1998) Genes Cells, 3:697-707; Kroemer(1997) Nature Med., 3:614-620. Bax : Bcl-2의 비율은 세포 운명이 결정되는 하나의 방법으로 여겨진다; Bax의 과잉은 아폽토시스를 증가시키고 Bcl-2의 과잉은 세포 생존을 증가시킨다. Salomons et al.(1997) Int. J. Cancer, 71:959-965; Wallace-Brodeur & Lowe(1999) Cell Mol. Life Sci., 55:64-75.
아폽토시스에서 중요한 또다른 단백질은 종양 억제자 유전자 p53에 의해 인코드된다. 본 단백질은 세포 생장을 조절하고 아마도 Bax의 상향-조절을 통해 손상되고 유전적으로 불안정한 세포 내에서 아폽토시스를 유도하는 조절인자이다. Bold et al.(1997) Surgical Oncology, 6:133-142; Ronen et al.(1996); Schuler & Gree(2001) Biochem. Soc. Trans., 29:684-688; Ryan et al.(2001) Curr. Opin. Cell Biol., 13:332-337; Zorning et al.(2001) Biochem. Biophys. Acta, 1551, F1-F37.
아폽토시스 경로의 변경은 암을 포함한 많은 질병 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. Wyllie et al.(1980) Int. Rev. Cytol., 68:251-306; Thompon(1995) Science, 267:1456-1462; Sen & D'Incalci(1992) FEBS Letters, 307:122-127; McDonnell et al.(1995) Seminars in Cancer and Biology, 6:53-60. 암 발달 및 진행의 조사는 통상적으로 세포 증식에 초점이 맞춰졌다. 그러나 종양발생에 아폽토시스 미치는 중요한 역할이 최근 명백해졌다. 사실상 아폽토시스의 조절이 종양 세포 내에서 어떤 방법으로 일정하게 변화되기 때문에 아폽토시스에 대해 알려진 많은 것은 종양 모델을 이용하여 알려졌다. Bold et al.(1997) Surgical Oncology, 6:133-142.
사이토카인도 또한 아폽토시스 경로에 포함되어 왔다. 생물학적 시스템은 그들의 조절에 대해 세포 상호작용을 요구하고 세포들 간의 크로스-토크는 일반적으로 다양한 사이토카인을 포함한다. 사이토카인은 많은 다양한 세포 형태에 의해 넓은 다양한 자극에 반응에서 생성되는 중재자이다. 사이토카인은 많은 다양한 세포 형태에서 많은 다양한 효과를 발휘할 수 있는 다면발현성 분자이지만 면역 반응 및 조혈 세포 및 분열 증식 및 분화의 조절에 특히 중요하다. 타겟 세포에서 사이토카인의 작용은 특정 사이토카인, 상대적 농도 및 다른 중재자들의 존재에 의존하여 세포 생존, 분열 증식, 활성화, 분화 또는 아폽토시스를 진행시킬 수 있다.
건선, 류마티즘 관절염, Crohn씨 병과 같은 자가면역 장애를 처리하기 위한 항-사이토카인의 사용은 대중성을 획득하고 있다. 전-염증성 사이토카인 IL-1 및 TNF는 이러한 만성 질환의 병리학에서 큰 역할을 하고 이러한 두 개의 사이토카인의 생물학적 작용을 감소시키는 항-사이토카인 요법은 치료법상의 이점을 제공할 수 있다(Dinarello 및 Abraham, 2002).
인터루킨 1(IL-1)은 특정 장소 및 시스템적인 염증 반응을 중재하는 중요한 사이토카인이고 맥관염, 골다공증, 신경퇴행적 장애, 당뇨병, 낭창성신염 및 류마티즘 관절염과 같은 자가면역 장애를 포함하는 많은 장애의 발병에서 TNF와 공동작용을 할 수 있다. 종양 혈관신생 및 침습성에서 IL-1β의 중요성 역시 흑색종 세포가 주입됐을 때 전이 및 혈관신생에 대해 IL-1β 넉아웃 마우스의 저항에 의해 최근 증명되었다(Voronov et al., 2003).
인터루킨 18(IL-18)은 IL-1의 하나로 최근 발견되었고 IL-1에 대한 구조, 수용체 및 기능에 의해 연관되어 있다. IL-18은 인터페론 감마(IFN-λ), TNF-α 및 IL-1을 유도하기 위한 그 능력의 결과로써 염증성 및 자가면역 장애에 포함된 주요한 사이토카인이다. IL-1β 및 IL-18은 모두 심근허혈 동안 심장 기능장애에 기여하는 것으로 알려진 사이토카인인 TNF-α의 생성을 유도하는 것이 가능하다(Maekawa et al., 2002). IL-18 결합 단백질로의 중화에 의한 IL-18의 억제는 서프라퓨즈된(suprafused) 인간 심방심근의 허혈/재관류 모델에서 허열-유도된 심근 기능장애를 감소시키는 것으로 발견되었다(Dinarello, 2001). 마우스 IL-18 결합 단백질을 이용한 IL-18의 중화 역시 IFN-λ, TNF-α 및 IL-1β 전사 수준을 감소시키고 콜라겐-도입된 관절염 마우스 모델에서 관절손상을 감소시키는 것이 가능하였다(Banda et al., 2003). IL-18 생성 또는 효용의 감소는 또한 성공적으로 전이가 억제된 마우스 흑색종 모델에서 IL-18 결합 단백질의 주입으로써 전이 암을 조절하기에 유리한 시험을 할 수도 있다(Carrascal et al., 2003). 전-염증성 사이토카인으로써 더욱 그의 중요성을 나타내는 것으로, IL-18의 플라즈마 수준은 만성 간 질병을 갖는 환자에서 높아졌고 증가된 수준은 질병의 고통과 상호 관련이 있었다(Ludwiczek et al., 2002). 유사하게 IL-18 및 TNF-α는 신장병을 갖는 당뇨병 환자의 혈청에서 높아졌다. 외상성 뇌손상을 수반하는 신경염증 역시 전-염증성 사이토카인 및 뇌 외상을 수반한 마우스에서 신경학상의 회복이 개선된 IL-18 결합 단백질에 의한 IL-18의 억제에 의해 중재되었다(Yatsiv et al., 2002).
사이토카인의 TNF군의 하나인 TNF-α는 많은 세포 형태에서 조혈세포, 염증성 반응의 유도 및 세포사멸의 유도에서 공동-분열유도 효과로부터 정해지는 다면발현성 효과를 갖는 전-염증성 사이토카인이다. TNF-α는 보통 박테리아 리포폴리사카라이드, 기생충, 바이러스, 악성 세포 및 사이토카인에 의해 유도되고 트랜스펙션 및 암으로부터의 세포를 유익하게 보호하기 위해 작용한다. 그러나 TNF-α의 부적당한 유도는 자가면역 장애와 같은 격렬하고 만성적인 염증으로 생기는 장애에 대해 주요한 기여자이고 또한 암, 에이즈, 심장병 및 폐혈증에도 기여할 수 있다(Aggarwal 및 Natarajan, 1996; Sharma 및 Anker, 2002에 의해 재고됨). 인간 장애(즉, 염증성 장질병 및 심한 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)에서뿐만 아니라 질병의 실험 동물 모델(즉, 폐혈증 쇼크 및 류마티즘 관절염)에서도 TNF-α를 방해하는 이로운 효과가 설명될 수 있다(Wallach et al., 1999). TNF-α의 억제 역시 Crohn씨 병(van Deventer, 1999) 및 류마티즘 관절염(Richard-Miceli 및 Dougados, 2001)과 같은 자가면역 장애를 겪고 있는 환자들에게 고통의 경감을 제공하는 데에 효과적이었다. B 림프구의 생존 및 성장을 증진시키는 TNF-α의 능력 역시 B-세포 만성 림프성 백혈병(B-CLL)의 발병에서 역할을 한다고 생각되고 B-CLL 내에서 T 세포에 의해 발현되어 있는 TNF-α수준은 실제로 종양 및 병의 단계와 서로 관련되어 있다(Bojarska-Junak et al., 2002). 인터루킨-1β(IL-1β)는 TNF-α 생성을 유도하는 것으로 알려진 사이토카인이다.
따라서 과도한 사이토카인 및 TNF-α의 축적이 신체 상의 해로운 결과를 초래할 수 있기 때문에 아폽토시스를 억제하거나 감소시킬 뿐만 아니라 신체 내 사이토카인의 수준을 감소시키는 방법에 대한 요구가 있다.
디옥시하이푸신 신타제(DHS) 및 하이푸신-함유 진핵세포성 번역 개시 인자-5A(eIF-5A)는 세포 생장 및 분화를 포함한 많은 세포 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 독특한 아미노산인 하이푸신은 모든 진핵세포 및 일부 알케오박테리아(archeobacteria)(진핵세포와 관련된 것으로 보임)에서 발견되나 유박테리아(eubacteria)는 그렇지 않고, eIF-5A는 하이푸신-함유 단백질 내에서만 알려져 있다. Park(1988) J. Biol. Chem., 263:7447-7449; Schumann & Klink(1989) System. Appl. Microbiol., 11:103-107; Bartig et al.(1990) System. Appl. Microbiol., 13:112-116; Gordon et al.(1987a) J. Biol. Chem., 262:16585-16589. 활성 eIF-5A는 2가지 후-번역 단계에서 형성된다 : 첫 번째 단계는 스퍼미딘의 4-아미노부틸 모이어티(moiety)의 디옥시하이푸신 신타제에 의해 촉매된 전구체 eIF-5A의 특정 라이신의 α-아미노 그룹으로의 이동에 의한 디옥시하이푸신 잔기의 형성이고; 두 번째 단계는 하이푸신 형성을 위해 디옥시하이푸신 하이드록실라제에 의한 본 4-아미노부틸 모이어티의 하이드록실레이션을 포함한다.
eIF-5A의 아미노산 서열은 종 간에 잘 보존되어 있고 eIF-5A 내 하이푸신 잔 기 주변 아미노산 서열의 엄격히 보존되어 있고 이는 이러한 변형이 생존에 중요함을 나타낸다. Park et al.(1993) Biofactors 4:95-104. 이러한 가정은 eIF-5A의 이소폼 모두의 불활성화가 효모 내 데이터에서 관찰되고 또는 그의 활성화 내 첫 번째 단계를 촉매하는 DHS 유전자의 불활성화가 세포 분열을 차단한다는 관찰에 의해 더욱 지지된다. Schnier et al.(1991) Mol. Cell. Biol., 11:3105-3114; Sasaki et al.(1996) FEBS Lett., 384:151-154; Park et al.(1998) J. Biol. Chem., 273:1677-1683. 그러나 효모 내 eIF-5A 단백질의 고갈은 총 단백질 합성 내 작은 감소만을 초래하였고 이는 eIF-5A가 단백질 전체 합성보다는 mRNA의 특정 서브세트의 번역에 필요함을 나타내었다. Kang et al.(1993), "Effect of initiation factor eIF-5A depletion on cell proliferation and protein systhesis" in Tuite, M.(ed.), Protein Sythesis and Targeting in Yeast, NATO Series H. 또한 eIF-5A에 결합하는 리간드가 매우 보존된 모티프를 공유한다는 최근의 발견은 eIF-5A의 중요성을 지지한다. Xu & Chen(2001) J. Biol. Chem., 276-2555-2561. 더욱이 변형된 eIF-5A의 하이푸신 잔기는 RNA로의 서열-특이적 결합에 필수적인 것으로 나타났고, 결합은 리보뉴클레아제로부터 보호되지 않았다.
더욱이 eIF-5A의 세포내 고갈은 핵 내 특정 mRNA의 유의적인 축적을 초래하고 이는 eIF-5A이 핵으로부터 세포질로의 특정 종류의 mRNA를 수송하는데 중요함을 나타내었다. Liu & Tartakoff(1997) Supplement to Molecular Biology of the Cell, 8:426a. Abstract No. 2476,37th American Society for Cell Biology Annual Meeting. 핵공-관련된 핵내 필라멘트에서의 eIF-5A의 축적 및 그의 일반적 핵 익스포트 수용체와의 상호작용은 eIF-5A이 폴리좀의 구성성분이기 보다는 핵세포질성 수송 단백질임을 더욱 나타낸다. Rosorius et al.(1999) J. Cell Science, 112:2369-2380.
eIF-5A의 첫 번째 cDNA는 Smit-McBrid et al.에 의해 1989년 인간으로부터 클론되었고, 그 이후로 eIF-5A의 cDNA 또는 유전자가 효모, 래트, 병아리 배아, 알팔파(alfalfa) 및 토마토를 포함한 다양한 진핵세포로부터 클론되었다. Smit-McBrid et al.(1989a) J. Biol. Chem., 264:1578-1583; Schnier et al.(1991)(효모); Sano, A.(1995) Imahori, M. et al.(eds), Polyamines, Basic and Clinical Aspects, VNU Science Press, The Netherlands 81-88(래트); Rinaudo & Park(1992) FASEB J., 6:A453(병아리 배아); Pay et al.(1991) Plant Mol. Biol., 17:927-929(알팔파); Wang et al.(2001) J. Biol. Chem., 276-17541-17549(토마토).
eIF-5A mRNA의 발현은 다양한 인간 조직 및 포유류 세포주에서 조사되었다. 예를 들어 eIF-5A 발현의 변화가 혈청 손실에 이어 혈청 첨가후 인간 섬유아세포 내에서 관찰되었다. Pang & Chen(1994) J. Cell Physiol., 160:531-538. 디옥시하이푸신 신타제 활성의 노화-관련 감소 및 전구체 eIF-5A의 증가는 이소폼의 분화 변화의 평균화를 반영하는 가능성이 결정되지 않았어도 노화 섬유아세포에서 관찰되었다. Chen & Chen(1997b) J. Cell Physiol., 170:248-254.
연구는 eIF-5A가 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 Rev 단백질 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1 Rex 단백질과 같은 다양한 단백질의 세포가 타겟임을 나타내었다. Ruhl et al.(1993) J. Cell Biol., 123:1309-1320; Katahira et al.(1995) J. Virol., 69:3125-3133. 예비 연구는 Rev와 같은 다른 RNA-결합 단백질과의 상호작용에 의해 RAN를 목표로하여 이들 바이러스성 단백질이 바이러스성 RNA 처리를 위해 eIF-5A를 요구함을 나타낸다. Liu et al.(1997) Biol. Signals, 6:166-174.
따라서, 비록 eIF-5A 및 DHS가 알려져 있지만 어떻게 이 단백질들이 아폽토시스 및 사이토카인 발현을 조절하는 것이 가능한 사이토카인 자극뿐만 아니라 아폽토틱 경로에도 포함되는지를 이해할 필요가 남아 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 "아폽토시스 특이적 eIF-5A" 또는 "eIF-5A1"로 표기되는 아폽토시스 특이적 진핵세포성 개시 인자 5A(eIF-5A)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아폽토시스-특이적 eIF-5A 핵산 및 폴리펩타이드 및 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하기 위해 안티센스 뉴클레오타이드 또는 siRNA를 이용하여 세포 내에서 아폽토시스를 저해 또는 억제하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 생체 내 포유류 폐세포로의 siRNA의 전달 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 억제함으로서 전-염증성 사이토카인의 발현을 억제 또는 저해하는 것에 관한 것이다. 또한 본 발명은 아폽토시스 특이적 eIF-5A의 발현을 억제함으로서 p53의 발현을 저해하거나 억제하는 것에 관한 것이다. 또한 본 발명은 안티센스 뉴클레오타이드 및 siRNA를 이용하여 아폽토시스 특이적 eIF-5A1의 발현을 저해하거나 억제함으로서 Bcl-2 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 사이토카인, 특히 인간 상피 세포 내의 TNF-α의 생성을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 아폽토시스-특이적 eIF-5A에서 목적된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 이용에 의해 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 억제하는 것은 녹내장 눈에서 망막 신경절 세포 사멸을 방지하는 방법을 제공한다.
진핵세포성 개시 인자-5A("eIF-5A")의 몇 개의 이소폼들은 분리되어왔고 출간된 데이터뱅크에 존재한다. 이러한 이소폼들은 기능적으로 과다한 것으로 판단되었다. 본 발명자들은 하나의 이소폼이 아폽토시스의 유도 전에 즉시 상향조절됨을 발견하였고 이는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 또는 eIF-5A1로 명명되었다. 본 발명의 주제는 아폽토시스-특이적 eIF-5A이다.
아폽토시스-특이적 eIF-5A는 아폽토시스 경로에 관련된 다운스트림 이펙터 및 전사 인자의 후-전사 조절의 수준에서 작용하는 것으로 보이기 때문에 아폽토시스-유발 질병 상태에서의 중재에 대한 적당한 타겟이 될 수 있다. 특히, 아폽토시스-특이적 eIF-5A는 아폽토시스의 mRNA 인코딩 다운스트림 이펙터 및 전사 인자의 핵인으로부터 이후에 번역되는 세포질로의 이동을 선택적으로 촉진시키는 것으로 보인다. 아폽토시스를 개시하는 최후의 결정은 내부 및 외부 프로- 미 항-아폽토시스 시그날 사이의 복잡한 상호작용으로부터 유래되는 것으로 보인다. Lowe & Lin(2000) Carcinogenesis, 21:485-495. 다운스트림 아폽토시스 이펙터 및 전사 인자의 번역을 촉진하는 이러한 능력을 통해 아폽토시스-관련 eIF-5A은 아폽토시스에 따라 이들 신호 사이의 균형을 전복시키는 것으로 보인다.
따라서 본 발명은 아폽토시스-특이적 eIF-5A 또는 DHS의 발현을 저해하거나 감소시키는 약제를 투여함으로서 세포 내 아폽토시스를 억제하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하거나 감소시킬 수 있는 하나의 약제는 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 감소시키거나 저해함으로서 세포성 아폽토시스가 지연되거나 저해될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 생체 내 뿐만 아니라 시험관 내에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 안티센스 뉴클레오타이드는 짧고, 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보적)인 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 정지시킴으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 차단하기 위해 제안되었다. 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합으로 올리고뉴클레오타이드에서 포스포디에스테르 결합의 대치와 같이 퇴화에 저항하도록 조절된 백본(backbone)을 사용함으로써(Blake et al., 1985) 뉴클레아제 퇴화를 지연시키기 위해(Matzura and Eckstein, 1968) 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다(Hogrefe, 1999). 올리고뉴클레오타이드를 퇴화에 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있고 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
바람직하게는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 폴리펩타이드 또는 DHS 폴리펩타이드의 코딩 서열의 일부 또는 전체를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열을 지닌다. 본 발명자들은 바이러스 세포주를 하기에 기술한 바와 같이 아폽토시스-특이적 eIF-5A 폴리펩타이드의 일부분을 인코딩하는 안티센스 뉴클레오타이드로 트랜스펙트시켰고 아폽토시스를 진행하는 세포의 수를 측정하였다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트된 세포들은 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트되지 않은 같은 세포와 비교시 아폽토시스를 진행하는 세포의 수에서 감소를 나타내었다. 도 78∼82는 안티센스 아폽토시스-특이적 eIF-5A 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트되지 않은 세포와 비교시 안티센스 아폽토시스-특이적 eIF-5A 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에서 아폽토시스를 진행하는 세포 비율의 감소를 나타낸다.
본 발명은 아폽토시스-특이적 eIF-5A 폴리펩타이드를 인코드하는 많은 적당한 핵산 서열의 이용을 고려한다. 예를 들면 본 발명은 하기 아폽토시스-특이적 eIF-5A 핵산 서열(서열번호: 1, 3, 4, 5, 11, 12, 15, 16, 19, 20 및 21)뿐만 아니라 여기서 기재된 다른 안티센스 뉴클레오타이드의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 제공된 서열번호의 전체 길이를 필요로 하지 않는다. 이들은 mRNA에 결합하고 이러한 mRNA의 발현을 저해할 수 있는 충분한 길이만을 필요로 한다. "발현의 저해 또는 감소" 또는 "발현의 억제"는 아폽토시스-특이적 eIF-5A와 같은 목적 유전자로부터의 단백질 및/또는 mRNA 생성물의 수준의 부재 또는 검출 가능한 감소를 나타낸다.
전체 코딩 서열을 포함하지 않는 예시적인 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하기 서열번호: 35, 37 및 39를 지닌 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
"아폽토시스-특이적 eIF-5A의 안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 상동성을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 추가적인 본 발명의 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 열거된 것에 대해 실질적인 서열 동일성을 지닌 것(즉 90% 상동) 또는 높은 스트린전트 조건 하에서 열거된 서열번호에 하이브리다이즈하는 서열을 지닌 것을 포함한다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 상동성"이라는 용어는 서열이 또다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하는 사용된다. 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 상동성을 지닌 서열들 간의 구조적 또는 기능석 차이는 미소마진(de minimus)이 될 것이다; 즉, 이들은 원하는 적용시 나타난 바와 같은 기능을 하는 서열의 능력에 영향을 미치지 않을 것이다. 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있거나 서열이 길이 또는 구조가 다르더라도 다른 서열이 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 미소마진으로 고려된다. 이러한 특성은 예를 들어 한정된 조건 하에서 하이브리다이즈하는 능력 또는 단백질의 경우 면역학적 교착반응성, 유사한 효소 활성 등을 포함한다. 당업자는 알려진 방법에 의해 이들 특성 각각을 용이하게 측정할 수 있다.
더욱이 2개 뉴클레오타이드 서열은 서열이 적어도 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 서열 유사성을 지닌 경우 "실질적으로 상보적"이다. 2개 아미노산 서열은 폴리펩타이드의 활성 또는 기능적으로 관련된 부분 사이에 적어도 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 유사성을 지닌 경우 실질적으로 상동적이다.
2개 서열의 동일성 비율을 측정하기 위해 서열은 최적 비교 목적으로 정렬된다(즉, 갭이 최적 정렬을 위해 첫 번째 및 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열의 하나 또는 둘 모두 내에 도입될 수 있고, 비-상동적 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 바람직한 실시태양에서 참조 서열 길이의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상이 비교 목적으로 정렬된다. 이후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 첫 번째 서열에서의 위치가 두 번째 서열 내 상응하는 위치로서 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때 분자는 그 위치에서 동일하다(여기서 사용된 바와 같이 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등하다). 2개 서열 사이의 동일성 비율은 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 기능이고 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입되는 데 필요한 각각의 갭의 수, 갭의 길이를 고려한다.
2개 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 및 유사성 비율의 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informations and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 예를 들어 다른 패밀리 멤버 또는 관련된 서열을 확인하기 위해 서열 데이터베이스에 대한 검색을 실행하는 "질문 서열"로서 더욱 이용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul, et al.(1990) J. Mol Biol. 215:403-10의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(2.0 버전)을 이용하여 실행될 수 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 NBLAST 프로그램으로 실행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질에 상동적인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램으로 실행될 수 있다. 비교 목적으로 갭된(gapped) 정렬을 수득하기 위해 갭된 BLAST가 Altschul, et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭된 BLAST 프로그램을 사용할 때 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다(즉, XBLAST 및 NBLAST).
"아폽토시스-특이적 eIF-5A"라는 용어는 그의 기능적 유도체를 포함한다. 핵산의 "기능적 유도체"라는 용어는 여기서 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열의 상동체 또는 아날로그를 의미하는데 사용된다. 기능적 유도체는 제공된 유전자의 기능을 보유하고, 이는 본 발명에 따라 그의 유용성을 허용한다. 여기서 기술된 아폽토시스-특이적 eIF-5A 폴리펩타이드의 "기능적 유도체" 또는 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 기능적 유도체는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 활성 또는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 특이적인 항체와의 면역학적 교차 반응성을 보유한 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 단편, 변이체, 아날로그 또는 화학적 변이체이다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A 폴리펩타이드의 단편은 어떠한 분자 서브세트도 나타낸다.
또한 기능적 변이체는 기능에 있어서 변화가 없거나 무의미한 변화를 초래하는 유사한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 기능에 필수적인 아미노산은 자리-지정 돌연변이 또는 알라닌-스캔닝 돌연변이와 같은 당 분야에 알려진 방법에 의해 확인될 수 있다(Cunningham et al.(1989) Science 244:1081-1985). 후자 방법은 분자 내 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 수득된 돌연변이 분자는 키나제 활성과 같은 생물학적 활성 또는 시험관 내 증식 활성과 같은 에세이로 시험된다. 또한 결합 파트너/기질 결합에 중요한 자리는 결정화, 핵 자기공명 또는 포토어피니티 표지와 같은 구조적 분석에 의해 측정될 수 있다(Smith et al.(1992) J. Mol. Biol. 224:899-904; de Vos et al.(1992) Science 255:306-312).
"변이체"는 하나 이상의 치환된 뉴클레오타이드를 지닌 뉴클레오타이드 치환과 같이 전체 유전자 또는 그의 단편에 실질적으로 유사하나 특정한 유전자와 하이브리다이즈 하거나 본래의 DNA와 하이브리다이즈하는 mRNA 전사체를 인코드하는 능력을 유지하는 분자를 나타낸다. "상동체"는 다른 동물 속 또는 종으로부터의 단편 또는 변이체 서열을 나타낸다. "아날로그"는 전체 분자, 그의 변이체 또는 단편과 유사하거나 이에 관련된 기능을 하는 비-천연 분자이다.
변이체 펩타이드는 자연발생될 뿐만 아니라 당 분야에 잘 알려진 방법에 의해 제조된 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 분자 기술 및 여기에 개시된 서열 정보를 이용하여 용이하게 확인/제조될 수 있다. 또한 이러한 변이체는 본 발명의 eIF-5A 또는 DHS 단백질 서열 및/또는 구조적 상동체에 기초하여 다른 단백질로부터 용이하게 구별될 수 있다. 존재하는 상동성/동일성의 정도는 단백질이 기능적 변이체인지 비-기능적 변이체인지에 따라, 파랄로그(paralog) 패밀리 내 존재하는 차이의 양 및 오르쏠로그(ortholog) 사이의 진화 거리에 기초할 것이다.
본 발명의 eIF-5A 또는 DHS 단백질의 비-자연발생 변이체는 재조합 기술을 이용하여 용이하게 생성될 수 있다. 이러한 변이체는 단백질의 아미노산 서열 내 삭제, 첨가 및 치환을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 예를 들어 치환의 하나의 종류는 보존된 아미노산 치환이다. 이러한 치환은 단백질의 주어진 아미노산을 유사한 특성의 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 일반적으로 보존적 치환은 지방성 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile의 서로 대치; 하이드록실 잔기 Ser과 Thr의 상호교환; 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환; 아미이드 잔기 Asn 및 Gln 사이의 치환; 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환; 방향성 잔기 Phe 및 Tyr 사이의 대치이다. 어떤 아미노산 변화가 표현형적으로 침묵(silent)이 되기 쉬운지에 관한 안내가 Bowie et al., Science 247:1306-1310(1990)에 나타나 있다.
여기서 사용된 "하이브리디제이션"이라는 용어는 일반적으로 프로브 서열 및 타겟 서열의 성질에 따라 다르게 당업자에게 용이하게 명백한 적당한 스트린전시 조건에서의 핵산의 하이브리디제이션을 의미하는데 사용된다. 하이브리디제이션 및 세척의 조건은 당 분야에 잘 알려져 있고 다양한 인큐베이션 시간, 온도 및/또는 용액의 이온 강도의 변화에 의한 원하는 스트린전시에 따라 다른 조건의 조정이 용이하게 달성된다. Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Munual, 2nd edition, Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, New York, 1989 참조.
조건의 선택은 하이브리다이즈하는 서열의 길이 특히, 프로브 서열의 길이, 핵산의 상태 G-C 함량 및 허용된 미스매치의 양에 의해 규정된다. 낮은 스트린전시 조건은 더 낮은 정도의 상보성을 지닌 스트랜드 사이에서의 부분적인 하이브리디제이션을 원할 때 바람직하다. 완전하거나 거의 완전한 상보성을 원할 때는 높은 스트린전시 조건이 바람직하다. 일반적인 높은 스트린전시 조건에 있어서 하이브리디제이션 용액은 6X S.S.C., 0.01 M EDTA, 1X Denhardt's 용액 및 0.5% SDS를 포함한다. 하이브리디제이션은 클론된 DNA의 단편의 경우 약 3∼4시간 동안 총 진핵세포성 DNA의 경우 약 12∼16시간 동안 68℃에서 수행되었다. 낮은 스트린전시에 있어서, 하이브리디제이션의 온도는 이중나선의 녹는점(Tm) 이하의 약 42℃로 감소된다. Tm은 G-C 함량 및 이중나선의 길이 뿐만 아니라 용액의 이온 강도의 기능으로 알려진다.
여기서 사용된 DNA 또는 RNA 분자의 "상응하는 부분에 하이브리다이즈"라는 어구는 하이브리다이즈하는 분자 즉, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 어떤 뉴클레오타이드 서열(센스 또는 안티센스 방향으로)이 거의 동일한 크기이고 충분한 서열 유사성을 지녀서 적당한 조건 하에서 하이브리디제이션 효과를 나타내는 또다른 핵산 분자를 인식하고 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. 예를 들어 100 뉴클레오타이드 길이 센스 분자는 2개의 서열 사이에 70% 이상의 서열 유사성이 있는 한 뉴클레오타이드 서열의 거의 100 뉴클레오타이드 부분을 인식하고 하이브리다이즈할 것이다. "상응하는 부분"의 크기는 하이브리디제이션 내에서 어느 정도 미스매치를 가능하게 하여 "상응하는 부분"이 하이브리다이즈 하는 분자 보다 예를 들어 20∼30% 더 크거나 더 작거나, 바람직하게는 최대한 12∼15% 더 크거나 더 작을 수 있음이 이해된다.
또한 본 발명은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해할 수 있거나 감소시킬 수 있는 다른 약제를 제공한다. 이러한 약제의 하나는 낮은 저해 RNA(small inhibitory RNAs)("siRNA")이다. siRNA 기술은 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 수득된 것에 대해 동등하거나 상위의 발현 수준을 수득하기 위해 낮은 농도가 요구되기 때문에 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대해 생존 가능한 대안을 나타내고 있다(Thompson, 2002). 긴 이중나선 RNA는 식물, 선충류 및 과일파리와 같은 다양한 유기체에서 특정 유전자의 발현을 침묵시키기 위해 사용되어 왔다. Dicer라고 불리는 RNase-Ⅲ 패밀리의 효소는 이러한 긴 이중나선 RNAs를 21∼23개 뉴클레오타이드의 낮은 저해 RNA로 처리하고 그후 RNA-도입된 사일런싱 콤플렉스(RNA-induced silencing complex, RISC) 내로 통합된다. siRNA의 풀림은 RISC를 활성화시키고 염기쌍에 의한 내인성 mRNA에 대해 단일나선 siRNA가 복합체를 이끌게 한다. RISC에 의한 내인성 mRNA의 인지는 분열의 결과를 유발하고 그 결과로 번역에 이용할 수 없도록 한다. 포유류 세포 내로 긴 이중나선 RNA의 도입은 siRNA의 사용에 의해 무시될 수 있는 강한 항바이러스성 반응의 결과를 유발한다(Elbashir et al., 2001). siRNA는 세포 배양에서 넓게 이용되어 왔고 90% 또는 그 이상의 특정 유전자 발현에 있어서 일상적으로 감소를 달성하였다.
또한 siRNA의 이용 또한 질병의 동물 모델에 있어서 유전자 발현을 저해하는 데 대중성을 획득 있다. 루시퍼라제에 대한 siRNA를 설명하는 최근의 연구는 유체역학 주입 방출 기술을 이용하여 전-분만 마우스의 넓고 다양한 기관에서 공동-트랜스펙트된 플라스미드로부터 루시퍼라제 발현을 차단하는 것이 가능하였다(Lewis et al., 2002). 마우스의 꼬리 정맥으로 유체역학적으로 주입된 TNF 군에서 수용체인 Fas에 대한 siRNA는 최종 주입 10일 후 까지 동안 80% 이상의 간세포를 트랜스펙트시키고 간 내 Fas 발현을 90%까지 감소시키는 것이 가하였다(Song et al., 2003). Fas siRNA는 간 섬유증 및 간 괴사로부터 마우스를 보호하는 것이 가능하였다. 치사량의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)로 처리된 마우스에서 폐혈증의 진행은 TNFα에 대해 유도된 siRNA의 이용에 의해 저해되었다(Sorensen et al., 2003). siRNA는 세포 배양 및 생체 내에서 오래 지속되는 효과, 생체 내에서 세포를 트랜스펙트시키는 능력 및 혈청에서 퇴화에 대한 저항의 관점에서 생체 내에서 특정한 유전자의 발현의 저해에 대해 매우 유력한 약물이 되는 잠재력을 지닌다(Bertrand et al., 2002).
본 발명자들은 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNAs를 지니는 세포를 트랜스펙트시켰고 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현에서 그 효과를 연구하였다. 도 99는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트된 세포가 더 적은 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질을 생성함을 나타낸다. 도 87∼89는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNAs로 트랜스펙트된 세포군이 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNAs로 트랜스펙션되지 않는 세포와 비교시 캄포테신 및 TNF-α에 노출된 후 아폽토시스를 진행하는 세포의 낮은 비율을 지님을 나타낸다. 따라서 본 발명의 하나의 실시태양은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA를 포함한 벡터로 세포를 트랜스펙트함으로서 세포 내 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하는 것을 제공한다.
바람직한 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNAs는 서열번호: 30, 31, 32 및 33을 지닌 것을 포함한다. 추가적인 siRNA는 열거된 것에 대해 실질적인 서열 동일성을 지닌 것(즉 90% 상동) 또는 높은 스트린전트 조건 하에서 열거된 서열번호에 하이브리다이즈하는 서열을 지닌 것을 포함한다. 실질적인 서열 동일성 및 상동성이 의미하는 것은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대해 상기 기술된 것이다. "아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA"라는 용어는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대해 상기 기술된 바와 같은 기능적 변이체 또는 유도체를 포함한다.
siRNA의 전달 및 siRNA를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터는 당업자에게 알려져 있다. 참고사항으로 포함된 미국 출원 제2004/106567 및 2004/0086884는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포솜 전달 운반체, 플라스미드 주입 시스템, 인공 바이러스 엔벨로프 및 폴리라이신 컨쥬게이트를 포함한 전달 메커니즘뿐만 아니라 많은 발현 컨스트럭트/벡터를 제공한다.
당업자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열을 이해한다. 예를 들어 조절 서열은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 그의 결합이다.
많은 중요한 인간 질병은 아폽토시스의 조절이 비이상성인 것에 의한 것이다. 이러한 비이상성은 세포 수(예를 들면, 암)에서의 병적인 증가 또는 세포의 손상 손실(예를 들면, 퇴행성 질환)의 결과를 낳을 수 있다. 비-제한 예로써는, 본 발명의 방법 및 조성은 다음의 아폽토시스-관련된 질병 및 장애를 방지하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다: 신경학상/신경퇴행성 장애(예를 들면, 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴, 근위축성 측삭 경화증(루게릭병), 자가면역 장애(예를 들면, 류마티즘 관절염, 전신성 심상성 낭창(systemic lupus erythematosus(SLE), 다발성 경화증), 뒤셴근이영양증(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD), 운동뉴런 장애, 허열, 심허열, 만성 심부전증, 발작, 유아성 척수성 근육위축증, 심장마비, 신부전, 아토피 피부염, 페혈증 및 폐혈증 쇼크, 에이즈, 간염, 녹내장, 당뇨병(제1형 및 제2형), 천식, 망막 색소변성증, 골다공증, 이종이식거부 및 화상.
또한 안티센스 폴리뉴클레오타이드 또는 siRNA는 포유류, 포유류 세포 또는 포유류 조직 내에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 감소시키는 약제를 제조하는데 사용될 수 있다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 감소시킴으로서 세포성 아폽토시스의 감소가 유발된다.
대안으로 본 발명의 방법 및 조성물은 아폽토시스 특이적 eIF-5A의 발현 증가를 유발시키기 위해 아폽토시스 특이적 eIF-5A를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드의 이용을 통해 포유류, 포유류 세포 또는 포유류 조직 내 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 증가시킴으로서 종양 또는 암을 지닌 피험체를 치료하는데 이용될 수 있다.
또한 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드는 포유류, 포유류 세포 또는 포유류 조직 내에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 증가시키는 약제를 제조하는데 이용될 수 있다. 아폽토시스 특이적 eIF-5A의 발현을 증가시킴으로서 세포성 아폽토시스의 감소가 유발된다. 따라서 약제는 암세포 또는 종양 세포 생장을 감소시키거나 암세포 또는 종양 내 아폽토시스를 유도함으로서 암을 치료하는데 이용될 수 있다.
아폽토시스 조절에서 비이상성에 의해 유발되는 질병의 하나는 녹내장이다. 아폽토시스는 녹내장 환자에 있어서 눈을 실명하게 하는 치명적인 인자이다. 녹내장은 진행성 시력상실의 결과를 낳는 시신경에 대한 손상에서 기인하는 눈 상태의 하나이다. 아폽토시스는 이러한 시신경 손상의 직접적인 원인으로 간주되었다.
녹내장 연구 분야에서의 초기 연구는 상승된 안압("IOP")이 망막 신경절 세포의 사멸에 의해 수반되는 사상판(구멍이 난 아교결합조직)의 단계에서 축삭 이동에 방해가 되게 한다고 나타내었다. Quigley 및 Anderson(1976) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 15, 606-16; Minckler, Bunt 및 Klock(1978) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 17, 33-50; Anderson 및 Hendrickson(1974) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 13, 771-83; Quigley et al.,(1980) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 19, 505-17;. 녹내장의 동물 모델 및 사후 인간 조직의 연구는 녹내장에서 망막 신경절 세포의 사멸이 아폽토시스에 의해 발생한다는 것을 암시한다. Garcia-Valenzuela et. al.,(1995) Exp. Eye Res., 61, 33-44; Quigley et al.,(1995) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36, 774-786; Monard(1998) In: Haefliger IO, Flammer J(eds) Nitric Oxide and Endothelin in the Pathogenesis of Glaucoma, New York, NY, Lippincott-Raven, 213-220. 증가된 IOP의 결과로써 축색 이동의 중단은 영양 인자의 손실에 의한 망막 신경절 세포 사멸에 기여할 수도 있다. Quigley(1995) Aust N Z J Ophthalmol, 23(2), 85-91. 녹내장 눈에서 시신경 유두 성상교세포 역시 약간의 신경독성 물질의 증가된 수준을 생성하는 것으로 발견되어 왔다. 예를 들면 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 증가된 생성(Yan et al.,(2000) Arch. Ophthalmol., 118, 666-673) 및 산화질소 합성(Neufeld et al.,(1997) Arch. Ophthalmol., 115, 497-503), 산화질소를 발생시키는 효소는 녹내장 눈의 시신경 유두에서 발견되었다. 더욱이 활성화된 망막 신경교 세포에 의한 산화질소 합성(iNOS) 및 TNF-α의 유도 가능한 형태의 증가된 발현은 유전적 망막 질병의 래트 모델에서 관찰되어 왔다. Cotinet et al., (1997) Glia, 20, 59-69; de Kozak et al., (1997) Ocul. Immunol. Inflamm., 5, 85-94; Goureau et al., (1999) J. Neurochem, 72, 2506-2515. 녹내장 시신경 유두에서, 과도한 산화질소는 망막 신경교 세포의 엑손의 퇴화에 연결되어 왔다. Arthur 및 Neufeld, (1999) Surv Ophthalmol, 43(Suppl 1), S129-S135. 마지막으로 의태된 허혈 또는 높아진 유체역학적 압력에 반응하여 망막 신경교 세포에 의해 TNF-α의 증가된 생성은 공생배양된 망막 신경교 세포에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 보여져 왔다. Tezel 및 Wax,(2000) J.Neurosci,. 20(23), 8693-8700.
아폽토시스에 의한 퇴화로부터의 망막 신경절 세포의 보호는 녹내장으로 인한 실명에 대한 잠재적인 새로운 치료로서 연구중이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안질환의 동물 모델에서 성공적으로 사용되어 왔다. 일시적인 눈 망막 허혈의 모델에서 카스파제 2의 발현은 허열 동안 증가되었다. 일차로 망막의 내부 핵 및 신경절 세포 층 내에서 증가되었다. 안티센스 뉴클레오타이드를 이용하는 카스파제의 억제는 망막 전위도로 측정시 유의적인 조직생리학적 및 기능적 개선을 유도한다. Singh et al., (2001) J. Neurochem., 77(2), 446-75. 시신경의 횡단면에 대한 또다른 연구는 프로-아폽토시스 단백질 박스(Bax)를 상향조절하고 아폽토시스를 진행하는 망막 신경절 세포를 설명하였다. 래트의 관자놀이 상부의 망막 내로 박스 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 되풀이해서 주입하는 것은 박스의 국부 발현을 저해하였고 시신경의 트랜잭션을 수반하는 살아남은 망막 신경절 세포의 수는 증가되었다. Isenmann et al.,(1999) Cell Death Differ., 6(7), 673-82.
망막 신경절 세포로 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 전달은 리포좀 내에서 올리고뉴클레오타이드를 캡슐화한 후 융합(HVJ 리포좀)에 의해 일본의 불활성화된 혈구응집 바이러스(hemagglutinating viru, HVJ; 센다이 바이러스)의 엔벨로프로 코팅됨으로서 개선되었다. 네이키드(naked) FITC-표지 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 형광이 1일 후 사라지는 반면 HVJ 리포좀 내에서 캡슐화된 FITC-표지 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 마우스 내 유리체내 주입은 3일간 지속되는 신경절 층에서 세포의 44% 내에 높은 형광도를 유발하였다. Hangai et al.,(1998) Arch Ophthalmol, 116(7), 976.
본 발명의 하나의 방법은 성상세포, 망막 신경절, 망막 신경교 세포 및 사상판과 같으나 이에 한정적이지 않은 눈 세포 및 조직 내에서 아폽토시스를 방지하거나 감소시키도록 지시된다. 녹내장에서 망막 신경절 세포의 사멸은 아폽토시스에 의해 발생하고 이는 실명을 유도한다. 따라서 망막 신경절 세포 내에서 아폽토시스를 저해하거나 감소시키는 방법의 제공 또는 아폽토시스에 의한 퇴화로부터 망막 신경절 세포를 보호하는 방법의 제공은 녹내장에 의해 기인되는 실명 예방에 대한 신규한 치료법을 제공한다. 이러한 방법은 아폽토시스를 감소시키기 위한 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현 억제를 포함한다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A는 전체적인 아폽토시스 과정을 조절하는 것으로 보이는 강력한 유전자이다. 따라서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 차단함으로서 시신경 유두 내에서 아폽토시스를 조절하는 것은 녹내장의 치료법을 제공한다.
아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현의 억제는 사상판, 성상세포, 망막 신경절 또는 망막 신경교 세포와 같으나 이에 한정적이지 않은 눈의 세포에 인간 아폽토시스-특이적 eIF5A에 대해 타겟된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 것에 의해 달성된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기에 정의된 바와 같이 아폽토시스-특이적 eIF-5A 폴리펩타이드의 적어도 일부를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열을 지닌다. 본 발명의 이러한 관점에서 유용한 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호: 26 또는 27 또는 높은 스트린전트 조건하에서 서열번호: 26 또는 27에 상보적인 서열에 결합하고 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 사상판 세포, 성상세포, 망막 신경절 세포 또는 망막 신경교 세포에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A1의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A1에 대해 타겟된 서열번호: 26 및 27과 같으나 이에 한정적인 것은 아닌 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 사상판 세포, 성상세포, 망막 신경절 세포 또는 망막 신경교 세포에 투여되었다. 세포는 인간 기원일 수도 있다.
본 발명자는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 수준이 허혈성 심장 조직에서 두 개의 사이토카인(인터루킨 1-베타 "IL-1β" 및 인터루킨 18 "IL-18)의 상승된 수준과 상호 관련되어 있음을 발견하였고, 따라서 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 허혈성 심장 조직에 존재시 세포 사멸에 관련되어 있다는 것을 또한 증명하였다. 이러한 아폽토시스-특이적 eIF-5A/인터루킨 상호관계는 비-허혈성 심장 조직에서는 나타나지 않는다. 도 62a-f 참조. PCR 측정법을 이용하여 아폽토시스-특이적 eIF-5A, 증식 eIF-5A("eIF-5A2" - 또다른 이소폼), IL-1β 및 IL-18의 수준이 측정되었고 다양한 허혈성 심장 조직(관상 우회로술 및 판막(승모판 및 심방판막) 치환 환자로부터)에서 비교되었다.
이들 유효한 단백질 인터루킨에 대한 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 상호관계는 허혈에서 염증 및 아폽토시스 경로가 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 수준의 조절을 통해 조절될 수 있다는 것을 더욱 제안한다.
아폽토시스-특이적 eIF-5A가 면역 반응에 포함되어 있다는 또다른 증거는 인간 말초혈 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)가 보통 eIF-5A의 매우 낮은 수준을 발현한다는 사실에 의해 암시되었다. 그러나 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 T-림프구세포-특이적 자극 발현을 지닌 자극에서 매우 효과적으로 증가된다(Bevec et al., 1994). 이것은 T-세포 분열증식 및/또는 활성에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 역할을 암시한다. 활성화된 T 세포가 다양한 사이토카인을 생성하는 것이 가능하기 때문에 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 사이토카인 mRNAs에 대한 핵세포질성 셔틀(shuttle)로써 요구될 수도 있다는 것 역시 가능하다. 상기 참조된 문헌의 저자는 eIF-5A로서 이들 세포 내의 효과적인 HIV 복제에 기여하는 HIV-1 환자의 PBMCs 내의 eIF-5A 증가된 수준이 HIV Rev 단백질에 대한 세포성 결합 인자가 되고 HIV 복제에 요구됨이 증명되었음을 발견하였다(Ruhl et al., 1993).
최근 eIF-5A 발현이 수상돌기 세포 성숙 동안 증가되는 것으로 발견되었다. 수상돌기 세포는 T 세포-매개 면역원을 유도하기 위해 보조 및 상해 T 세포를 민감하게 하는 항원-제시 세포이다(Steinman, 1991). 미성숙 수상돌기 세포는 T 세포를 자극하기 위한 능력이 부족하고 T 세포를 활성화시킬 수 있는 세포 내로 성숙시키기 위해 적당한 자극(즉 염증성 사이토카인 및/또는 미생물 생성)을 요구한다. eIF-5A를 활성화시키는데 필요한 효소인 디옥시하이푸신 신타제의 억제제는 CD83 표면 발현을 방지함으로서 수상돌기 세포에 의한 T 림프구 활성화를 억제하는 것으로 나타났다(Kruse et al., 2000). 따라서 eIF-5A는 CD83 mRNA에 대해 핵세포질성 셔틀로서 작용함으로서 수상돌기 세포 숙성을 촉진시킨다.
면역 체계에서 eIF-5A에 대한 역할을 포함하는 이러한 연구(Bevec et al., 1994; Kruse et al., 2000)들에서 연구자들은 그들이 시험중이었던 eIF-5A의 이소폼을 일일이 열거하거나 확인하지 않았지만 그것에 이유가 있지는 않았다. 상기에 언급한 바를 요약하면 인간은 분리된 염색에 위에 모두 인코드된 아폽토시스-특이적 eIF-5A("eIF5A1") 및 증식 eIF-5A("eIF-5A2")의 두 개의 이소폼을 지니는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들의 발견에 앞서 이러한 이소폼 모두는 기능적으로 과다하다고 판단되었다. 자극된 PBMC에서 eIF-5A mRNA을 검출하기 위해 이용되었던 Bevec et al.에 의해 설명된 올리고뉴클레오타이드는 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A1에 대해 100% 상동성을 가지며 연구에 의해 증식 eIF-5A의 클로닝을 지닌다. 유사하게 수상돌기 세포가 성숙하는 동안 역전사 중합 연쇄 반응에 의해 eIF-5A를 검출하기 위해 이용되었던 Kruse et al.에 의해 설명된 프라이머는 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 100% 상동성을 지닌다.
본 발명은 수상돌기 세포 성숙률 및 PBMC 활성률을 조절하기 위한 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 조절하는 것에 관한 것이고 이것은 결국 T 세포-중재 면역을 조절할 수도 있을 것이다. 단핵세포 및 대식세포는 외부 침입자를 인식하고 이에 의해 활성화/자극되고 면역체계의 휴지를 경고하도록 사이토카인을 생성할 수 있기 때문에 면역체계에 중추적이다. 본 발명자들은 eIF-5A mRNA를 발현하는 것으로 알려진 U-937 세포주를 이용하여 부착성의 대식세포 내로의 단핵세포의 분화에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 역할을 연구하였다(Bevec et al., 1994). U-937은 현탁액에서 성장하는 인간 단핵 세포주이며 PMA의 자극으로 대식세포 내로 점착 및 분화하게 될 것이다. PMA가 배지를 교환하는 것으로 제거되면 세포는 움직이지 않게 되고 그 후 사이토카인을 생성하는 것이 가능해진다(Barrios-Rodiles et al., J. Immunol. 163: 963-969(1999)). 일반적인 염증 반응을 유발하는 것으로 알려진 많은 박테리아의 외부 막에 근거한 인자인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)에 반응하여 대식세포는 TNF-α 및 IL-β 모두를 생성한다(Barrios-Rodiles et al., 1999). 사이토카인의 줄기세포 분화 및 결과 생성물의 챠트를 나타내는 도 78 참조. U-937 세포 역시 LPS-자극을 수반하는 IL-6 및 IL-10을 생성한다(Izeboud et al., J. Receptor & Signal Transduction Research, 19(1-4): 191-202(1999)).
U-937 세포를 이용하여 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 단핵세포 분화 및 TNF-α 분비 동안에 상향조절된다는 것을 나타내었다. 도 77 참조. 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질 발현은 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 억제되었다. 대조군 siRNA 및 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 처리된 세포는 아폽토시스-특이적 eIF-5A, 톨-유사 수용체 4(TLR4), 종양 괴사 인자 수용체(TNF-R1) 및 인터페론 γ 수용체(IFNγ-Rα)의 발현에 대해 웨스턴 블럿팅함으로서 비교되었다. 사이토카인, TNF, 인터루킨-1β(IF-1β), IL-6 및 IL-8은 ELISA 및 액상 전기화학발광(ECL)에 의해 측정되었다.
결과는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로의 처리가 대조군 siRNA로 처리된 세포에 비해 80% 이상까지 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질 발현을 특이적으로 하향-조절시킴을 나타낸다. PMA, LPS 및 IFN-γ 처리는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질 발현을 유도하였다. 또한 감소된 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현을 지닌 세포는 TLR4, TNF-R1 및 IFNγ-R∀의 감소된 단백질 발현을 나타내었다. 또한 초기 실험은 감소된 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현을 지닌 세포 내에서 LPS-유도 TNF 발현이 3시간에 감소되었고, LPS-유도 IL-1β 및 IL-8 생성이 24시간에 감소되었음을 나타낸다. 이들 연구는 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 수용체(TLR4, TNF-Rl 및 IFNγ-Rα) 및 사이토카인(TNFα, IL-Iβ 및 IL-8)을 포함한 많은 중요한 사이토카인 신호전달 분자의 후-전사 조절에 관련됨을 나타낸다.
따라서 본 발명의 하나의 관점은 사이토카인의 생산을 저해하거나 감소시키기 위해 대식세포의 성숙을 저해하거나 지연시키는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 방법은 DHS 또는 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 감소시키는 것을 가능하게 하는 약제를 제공하는 것을 포함한다. DHS의 발현을 감소시키거나 제거하는 것에 의해 아폽토시스-특이적 eIF-5A 활성은 감소되거나 제거될 것이다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 단핵세포 분화 및 TNF-α분비 동안에 상향조절되기 때문에 이러한 결과가 발생하는데 필수적이라고 판단되었다. 따라서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 활성을 감소시키거나 제거하는 것에 의해 또는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현을 직접적으로 감소시키거나 제거하는 것에 의해 단핵세포 분화 및 TNF-α분비는 감소되거나 제거될 수 있다. DHS 또는 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 감소시키는 것이 가능한 어떠한 약제도 사용되거나 포함될 수 있지만 여기에 기술한 바와 같이 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA로만 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명자들은 특정 자극에 반응하여 사이토카인(들)을 예상대로 생산하는 것으로 알려진 세포주를 이용하여 시험관 내에서 사이토카인 mRNAs에 대한 핵세포질성 셔틀로써 작용함으로서 사이토카인의 번역을 촉진시킬 수 있는 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 능력을 연구해 왔다. 최근 일부 연구들은 인간 간 세포주가 다른 사이토카인의 생성을 유도하는 것에 의해 사이토카인 자극에 반응할 수 있다는 것을 발견하였다. HepG2는 사이토카인에 민감한 것으로 알려진 잘 특정지워진 인간 감세포 암종 세포주이다. IL-1β에 반응하여 HepG2 세포는 용량 의존적 방식으로 TNF-α mRNA 및 단백질을 신속하게 생성한다(Frede et al., 1996; Rowell et al., 1997: Wordemann et al., 1998). 따라서 HepG2 세포는 TNF-α 생성의 조절을 연구하기 위한 모델 시스템으로써 이용되었다. 본 발명자들은 HepG2 세포 내에서의 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현의 저해가 아폽토시스-특이적 eIF-5A로 지시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트된 후 세포가 TNF-α를 덜 생성하게 함을 나타내었다.
따라서 본 발명의 하나의 실시태양은 사이토카인의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 감소시키는 것이 가능한 약제를 투여하는 것을 포함한다. 또한 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현 감소는 사이토카인의 발현을 감소시키고 따라서 세포에 의해 생성되는 사이토카인의 감소된 양을 유도한다. 사이토카인은 바람직하게는 전-염증성 사이토카인이며 IL-1, IL-18, IL-6 및 TNF-α를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현 감소에 적당한 약제는 상기 논의된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 예시적인 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 안티센스 뉴클레오타이드는 서열번호: 35, 37 및 39로 구성된 군으로부터 선택되거나 높은 스트린전트 조건 하에서 서열번호: 35, 37 및 39로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 하이브라다이즈하는 안티센스 뉴클레오타이드이다.
또한 또다른 적당한 약제는 상기 논의된 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 포함한다. 예시적인 siRNA는 서열번호: 30, 31, 32 및 33으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 지니거나 높은 스트린전트 조건 하에서 서열번호: 30, 31, 32 및 33으로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 하이브라다이즈하는 siRNA이다. 도 87∼89는 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNAs로 트랜스펙트된 세포가 캄포테신 및 TNF-α에 노출된 후 아폽토시스를 진행하는 세포의 낮은 비율을 나타낸다.
본 발명은 또한 p53의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 상기 기술된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNAs와 같은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 감소시키는 것이 가능한 약제를 투여하는 것을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드(서열번호: 26 및 27)로 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 감소시키는 것은 도 42 및 실시예 10에 나타난 바와 같이 p53의 발현을 감소시킨다.
본 발명은 또한 Bcl-2의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 감소시키는 것이 가능한 약제를 투여하는 것을 수반한다. 바람직한 약제는 상기 기술된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNAs를 포함한다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현 감소는 도 98 및 실시예 13에 나타난 바와 같이 Bcl-2의 발현을 증가시킨다. 도 98은 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트된 세포가 더 적은 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질을 생성하고, 더욱이 더 많은 Bcl-2 단백질을 생성함을 나타낸다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현의 감소는 BCL-2 발현에서의 증가와 상호관련된다.
본 발명은 또한 상기 기술된 안티센스 뉴클레오타이드 또는 siRNA를 환자에게 투여하는 단계를 포함한 필요한 환자 내 TNF-알파의 수치을 감소시키는 방법을 제공한다. 도 100 및 실시예 14에서 증명된 바와 같이 본 발명의 안티센스 아폽토시스-특이적 eIF-5A 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트된 세포는 이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트되지 않은 세포보다 IFN-γ로의 유도 후 더 적은 TNF-α를 생성하였다.
또한 본 발명은 상기 기술된 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 감소시키는 약제(안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA)를 병리학적 이상을 지닌 포유류에 투여하는 단계를 포함한 증가된 IL-1, TNF-알파, IL-6 또는 IL-8 수치가 특징인 병리학적 이상의 치료 방법을 제공한다. IL-1, TNF-알파 또는 IL-6 수치의 증가로 특징지어진 알려진 병리학적 이상은 관절염-류마티스 및 골관절염, 천식, 알레르기, 동맥염증, 크론씨 병, 염증성 장질환(ibd), 궤양성 대장염, 관상동맥성 심장질환, 낭포성섬유증, 당뇨병, 낭창, 다발성 경화증, 그레이브스 병, 치근막염, 녹내장 및 황반변성, 원추각막을 포함하는 안구표면 질병, 기관 허혈-심장, 신장, 재관류 손상, 패혈증, 다발성 골수증, 기관 이식거부, 건선 및 습진을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 예를 들어 염증성 장질환은 전-염증성 사이토카인 및 장 상피 세포에 의해 분비되는 케모카인에 의해 일부 유발된 조직 손상을 특징으로 한다.
인터페론 감마(IFN-γ)는 사이토카인 네트워크에서 중추 역할을 하는 자연 살상세포(NK) 및 T 림프구에 의해 생성되는 사이토카인이다. IFN-γ는 항-바이러스성, 항-증식성 및 면역-조절 활성을 포함한 민감성 세포 내의 다양한 반응을 유도한다. IFN-γ의 그의 수용체(IFN-γR)로의 결합은 야누스 키나제 JAK1 및 JAK2의 자가인산화를 유도한다. 티로신 잔기 1022 및 1023에서의 JAK1의 인산화는 촉매 이벤트의 활성화와 관련된 것으로 판단된다(Liu et al, Curr. Biol. (7): 817-826 (1997)). IFN-γR은 IFN-γRα 및 IFN-γRβ로 명명된 적어도 2 이상의 체인으로 구성된다. 수용체의 그의 리간드로의 결합은 전사(STAT) 전사 인자의 신호 변환제 및 활성제의 동원 및 티로신 인산화를 유도하는 JAK1의 자가인산화를 유발한다. STAT 전사 인자의 인산화는 이후 전사를 조절하는 타겟 프로모터의 업스트림 요소에 결합하는 STAT의 이량체화 및 핵 전위를 유도한다. JAK-STAT 신호전달을 변화시키는 것은 사이토카인-유도 전-염증성 반응을 감소시킬 수 있기 땜누에 JAK-STAT 경로는 항-염증성 치료제에 대한 우수한 타겟을 나타내고 IFN-γ의 부적당한 발현은 자가면역 장애에 기여하는 것으로 판단된다.
정상적인 생리학적 조건 하의 장 상피 세포는 자연적 장 세균층의 리포폴리사카라이드(LPS)를 포함한 생성물에 저반응성이다. IFN-γ은 IL-8 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성을 유도하기 때문에 장 상피 세포가 LPS에 반응성이 되도록 할 수 있는 것으로 나타났다. IFN-γ가 장 상피 세포에 대한 LPS 민감성을 회복시킬 수 있는 하나의 메커니즘은 MD-2 및 Toll 수용체 4(TLR4) - LPS 인식에 필요한 2가지 단백질 -의 발현을 증가시킴으로서 LPS 흡수를 증가시키게 된다(Suzuki et al, Infection and Immunity; (71): 3503-3511 (2003)). 공생 박테리아의 미생물 생성물에 대한 장 상피 세포의 변화된 반응성을 유발하는 IFN-γ와 같은 Th1 사이토카인의 증가된 생성은 염증성 장 질환을 특징으로 하는 만성 염증에 기여하는 것으로 판단된다.
염증에 관련된 또다른 분자는 NFκ-β(또는 NFκ-베타 또는 NFκB로도 표기됨)이다. NFκβ는 그의 활성화가 조직 염증을 유도하는 COX-2의 발현을 유도학 때문에 염증에 대한 주요 세포-신호전달 분자이다. 염증 사이트에서 프로스타글라딘의 대량 생성에 중요한 것으로 고려되는 COX-2-인코딩 유전자의 발현은 NFκB에 의해 전사적으로 조절된다. NFκB는 세포의 세포질 내에 존재하고 그의 저해제에 결합된다. 손상성 및 염증성 자극은 저해제로부터 NFκB를 방출시킨다. NFκB는 세포핵 내로 이동하고 COX-2를 발현하는데 중요한 유전자를 활성화시킨다. 따라서 NFκ 베타의 수치를 감소시킴으로서 염증이 감소될 수 있다.
본 발명에 의한 하나의 실험에서 인간 상피 세포(HT-29 세포)는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 타겟된 siRNA로 처리되었다. 이후 1시간 동안 TNF 또는 인터페론 감마 및 LPS를 첨가함으로서 염증이 NFκB에 의해 유도되었다. 이러한 실험 결과는 siRNA로의 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현 저해는 감마 인터페론 및 LPS에 의해 활성화된 NFκB의 수치의 감소를 제공함을 나타낸다. 도 106 참조.
또한 본 발명자들은 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA가 HT-29 세포 내 IFN-γ 자극에 반응하여 TLR4(도 117 참조) 및 IFN-γRα 단백질(도 116 참조)의 상향조절을 차단함을 증명하였다. 또한 도 115는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNA가 내인성 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 억제함을 나타낸다. 또한 도 118은 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현의 siRNA-매기 억제는 IFN-γ 처리에 반응하여 STAT1α 및 JAK1의 감소된 인산화를 유발함을 증명한다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로의 TLR4의 IFN-γ 자극된 상향조절의 감소는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA가 IFN-γ 및 LPS에 반응하여 HT-29 세포 내에서 NF-κB p50 활성화 및 TNF-α 생성을 감소시킴을 증명하는 선행 데이터와 일치한다. 본 데이터는 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 JAK-STAT 경로를 통해 IFN-γ 신호전달을 조절한다는 이론과 일치한다. 따라서 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현의 방해는 TLR4(LPS를 검출하기 위해 결장 상피 세포에 필요한)의 IFN-γ 자극된 상향조절을 방지하고, 따라서 세포는 LPS에 대해 저반응성으로 유지된다. 그 결과로서 NFκB p50은 TLR4에 의한 LPS 결합에 반응하여 활성화되지 않고 사이토카인 생성(TNF-α 및 IL-8)이 저해된다.
아폽토시스-특이적 eIF-5A이 IFN-γ 신호전달을 조절한다는 의견의 또다른 지지로서 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA가 STAT1α 및 JAK1의 인산화 - IFN-γ 신호 변환시 2가지 중요한 단계 -를 현저히 감소시킴이 발견되었다. IFN-γ로의 자극시 IFN-γ 수용체 α 상향조절의 감소가 나타났으나 IFN-γ 함량은 대조군 siRNA 또는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 처리되는 여부에 관계 없이 IFN-γ 처리 전과 동일한 것으로 나타났다. IFN-γRβ 사슬이 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA에 의해 영향 받을 수 있음이 가능하나 데이터는 IFN-γ의 그의 수용체로의 결합이 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA에 의해 영향 받지 않음을 나타낸다. 이는 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 JAK1 또는 JAK1 발현 또는 인산화를 조절하는 단백질의 후-전사 조절에 필요함을 나타낸다. JAK-STAT 경로(적어도 JAK1 및 STAT1α를 통한)의 적당한 기능 및 이로 인한 IFN-γ 신호전달은 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 필요로 함이 명백하다.
또한 대조군 siRNA가 TLR3을 통한 이중나선 RNA 검출의 결과인 HT-29 세포 내 반응을 유도할 수 있음은 가치가 없다. 특히 대조군 siRNA로 처리된 HT-29 세포는 트랜스펙트되지 않은 세포보다 유의적으로 더 많은 TNF-α 및 IL-8을 생성하였다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA는 이러한 반응을 생성하지 않았다. 또한 Jak1은 IFN-γ로 처리되지 않은 대조군 siRNA-트랜스펙트된 세포 내에서 인산화되었다(도 118 참조). 이는 TLR3에 의한 이중나선 RNA 인식으로부터 유발된 인터페론 반응에 관련된 JAK-STAT 경로의 활성화를 반영하는 것이 가능하다. 본 데이터는 IFN-γ 처리의 부재시에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA-처리된 세포 내에서 JAK1 인산화를 나타내지 않았고, 이는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA가 Jak-STAT 경로를 통해 발생하는 이중나선 RNA의 검출에 의해 시작되는 인터페론 반응을 차단할 수 있다는 가능성을 나타낸다.
본 발명자는 인터페론 감마(IFN-γ) 신호전달 상의 효과를 조사하기 위해 siRNA를 이용하여 HT-29 세포 내 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하였다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA는 IFN-γ 및 LPS에 반응하여 TNF-α를 분비하는 HT-29의 능력을 90% 이상까지 감소시켰다. 또한 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRN는 TNF-α가 아닌 IFN-γ에 반응하여 IL-8 분비를 저해하였다. 유사하게는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA는 IFN-γ-특이적 방식으로 NF-κB p50 활성화를 감소시키고 TLR4 및 TNFR1의 IFN-γ-자극된 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. 또다른 관심은 세포가 IFN-γ로 자극되는 경우 대조군 siRNA로의 트랜스펙션이 모의-트랜스펙트된 대조군과 비교시 TNF-α 분비를 증가시키고 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA가 이러한 반응을 유의적으로 감소시킬 수 있다는 발견이다. 이들 결과는 아폽토시스-특이적 eIF-5A는 IFN-γ-신호전달 경로의 후-전사 조절제이고 이중-나선 RNA에 대한 세포적 반응에 관련될 수 있음을 나타낸다. siRNA에 의한 아폽토시스-특이적 eIF-5A는 IFNγ 신호전달을 방해하고 각각 TLR4 및 TNFR1을 통해 LPS 및 TNF-α에 반응할 수 있는 장 상피 세포의 능력을 감소시킨다. 따라서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 저해는 장 상피 세포 상의 직접적인 면역조절 효과를 지니는 것으로 나타났고 염증성 장질환에 대한 치료 타겟이 된다.
따라서 본 발명의 하나의 실시태양은 내인성 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하거나 감소시킴으로서 전-염증성 반응을 저해하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현 저해는 바람직하게는 상기 기술된 본 발명의 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 또는 siRNA의 이용에 의해 수행된다. 본 발명자들은 내인성 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현의 감소가 발생시 세포 상의 다양한 효과가 유발됨을 나타내었다. 이들 효과는 염증 연쇄반응에 관련된 다양한 생체분자(p53; 전-염증성 사이토카인(도 135, 136 및 137 참조); 활성 NFκβ; TLR4(도 132 및 117 참조); TNFR-1(도 134 참조); IFN-γRα(도 116 참조) 및 iNOS 뿐만 아니라 감소 TNF-α 생성 및 STAT1α 및 JAK1의 감소된 인산화와 같은)의 감소를 포함한다. 염증 연쇄반응에 필수적인 이들 생체분자의 수치 감소 또는 이들 생체분자의 활성화 감소는 염증의 감소를 유발한다. 염증 연쇄반응에 돌입하는 세포의 능력을 감소시키는 것은 염증성 장질환, 관절염, 크론씨병 및 낭창과 같은 것을 포함하나 이에 한정적이지 않은 만성 염증에 관련된 질환/이상을 치료하는데 유용함을 입증한다.
따라서 본 발명은 또한 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 안티센스 또는 siRNA를 이용하여 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하거나 억제함으로서 p53의 수치; 전-염증성 사이토카인의 수치(도 135, 136 및 137 참조); 활성 NFκβ; TLR4; TNFR-1; IFN-γRα, iNOS 또는 TNF-α의 수치 및 STAT1 및 JAK1의 인산화를 감소시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 생체 내에서 포유류 폐세포 내로 siRNA를 전달하는 방법을 제공한다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNA는 마우스 비강내로(물과 혼합) 투여되었다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA의 투여 24시간 후 리포폴리사카라이드(LPS)가 마우스 비강내로 투여되었다. LPS는 생체 내에 적용시 염증 반응의 네트워크를 유발하는 박테리아의 거대분자성 세포 표면 항원이다. LPS의 비강내로의 전달은 폐 내 중성구 수의 증가를 유발한다. 초기 이벤트 중의 하나는 TNF-α를 포함한 많은 사이토카인의 분비를 유도하는 수용체-매개 과정을 통한 단핵성 식세포의 활성화이다. 그 결과 TNF-α에 의해 유도된 상피 세포에 대한 중성구의 증가된 부착은 폐 공간 내의 대규모 침윤을 유도한다.
또다른 24시간 후 우측 폐가 제거되었고 골수세포형과산화효소가 측정되었다. 골수세포형과산화효소("MPO")는 중성구에서 발견되는 리소좀 효소이다. MPO는 염화물을 차아염소산으로 전환시키기 위해 수소 과산화효소를 이용한다. 차아염소산은 박테리아와 반응하여 이를 파괴시킨다. 골수세포형과산화효소는 동맥이 염증 유발시에도 생성된다. 따라서 골수세포형과산화효소가 중성구 및 염증 반응에 관련됨이 명백하다. 마우스 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA는 대조군 siRNA와 비교시 약 90%까지 골수세포형과산화효소를 억제하였다. 본 연구에서 각 그룹 내에 5마리의 마우스가 존재하였다. 본 연구의 결과는 siRNA가 생체 내에서 포유류의 폐 조직 내로 성공적으로 전달될 수 있고, 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNA가 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하여 골수세포형과산화효소 생성 억제를 유발함을 나타낸다.
따라서 본 발명자들은 siRNA로 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 하향 조절하는 것이 LPS(일반적으로 골수세포형과산화효소의 생성과 관련된 염증 반응을 생성하는)에 노출 후 폐 조직 내 골수세포형과산화효소의 수치를 감소시키고, 따라서 염증 반응을 감소시키거나 억제시킴을 입증하였다. 따라서 본 발명의 하나의 실시태양은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하거나 감소시키기 위해 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA를 전달함으로서 폐 조직 내 MPO의 수치를 감소시키는 방법을 제공한다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현의 감소는 MPO 감소를 유도한다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA의 전달은 비강을 통과할 수도 있다.
MPO 수치는 심장마비 및 자가면역 질환에 의해 유발된 사이토카인-유도 염증의 중요한 예보자이다. 염증 반응을 감소시키거나 억제시키는 이러한 능력은 자가-면역 질환과 같은 염증 관련 장애를 치료하는데 유용하게 작용한다. 더욱이 MPO를 저하시킬 수 있는 능력은 허혈성 이벤트 및 심장마비로부터 환자를 보호하는 수단이 될 수 있다.
도 139는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA가 마우스 혈청 내 TNF-α 수치를 감소시킬 수 있는 마우스 내에서 수행된 실험 결과를 나타낸다. TNFα 혈청 수치는 LPS 투여 90분 후 및 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA의 정맥내 트랜스펙션 48시간 후에 측정되었다. 도 140은 siRNA가 비강을 통과하여 전달되는(상기 기술됨) 마우스 내에서 수행된 실험 결과를 나타낸다. TNF-α의 총 수치는 마우스 혈청 내에서 측정되었다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA는 TNFα 함량의 감소를 유발하였다. 따라서 본 발명의 하나의 실시태양은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하거나 감소시키기 위해 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA를 전달함으로서 혈청 내 TNF-α 수치를 감소시키는 방법을 제공한다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현의 감소는 혈청 내 TNF-α의 감소를 유도한다.
도 141은 대식세포 염증성 단백질 1-알파(MIP-1α)의 수치도 감소되었음을 나타낸다. MIP-1α는 사이토카인의 RANTES(발현되고 분비되는 정상 T 세포 활성화 상의 조절(regulated on activation normal T cell expressed and secreted)) 패밀리에 속하고 CCRl, CCR5 및 CCR9에 결합하는 저분자량 케모카인이다. 따라서 본 발명의 하나의 실시태양은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하거나 감소시키기 위해 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA를 전달함으로서 폐 조직 내 MIP-1α 수치를 감소시키는 방법을 제공한다.
도 142는 마우스가 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA로 처리되는 실험 결과를 나타낸다(비강내/비강통과 전달). 그 결과는 LPS 처리 90분 후 및 siRNA 처리 48시간 후 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA로 처리되지 않은 마우스 폐와 비교시 상기 마우스에서 측정된 Il-1a 수치의 현저한 감소가 존재함을 나타낸다. 따라서 본 발명의 하나의 실시태양은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 저해하거나 감소시키기 위해 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA를 전달함으로서 폐 조직 내 Il-1a 수치를 감소시키는 방법을 제공한다.
따라서 본 발명자들은 아폽토시스-특이적 eIF-5A와 면역 반응 사이의 상호관계를 나타낼 뿐만 아니라 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA가 골수세포형과산화효소의 생성을 억제함을 나타내었다(즉, 염증 반응의 일부). 또한 본 발명자들은 생체 내에서 단순한 비강내 전달에 의해 폐 조직 내로 siRNA를 전달하는 것이 가능함을 나타내었다. siRNA는 물에만 혼합되었다. 이는 당업자가 siRNA의 수용가능한 전달 방법을 고안하고자 할 때 주요한 돌파구 및 발견을 제공한다.
또다른 실험에서 마우스는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNA로 유사하게 처리되었다. 리포폴리사카라이드(LPS)가 마우스에 투여되어 염증 및 면역 체계 반응을 유도하였다. 대조군 조건 하에서 LPS는 감염을 방어하기 위해 흉선 내에서 생성되는 중요한 면역 체계 전구체 세포인 흉선세포를 사멸시킨다. 그러나 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNA는 LPS의 존재시 흉선세포의 약 90% 생존율을 가능하게 하였다. 흉선세포가 T 세포의 전구체이기 때문에 이들이 파괴되면 신체의 선천적 면역성은 T 세포를 생성할 수 없게 손상되고 따라서 박테리아 감염 등을 보호할 수 없다. 따라서 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA는 신체의 선척적 면역 방어 체계를 파괴하지 않고 염증을 감소시키는데 이용될 수 있다(첫 번째 실시예에서 낮은 수치의 MPO에 의해 나타난 바와 같이).
본 발명의 또다른 실시태양은 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA를 투여함으로서 패혈증을 치료하는 방법을 제공한다. 패혈증도 전신성 염증 반응 증후군("SIRS")로 알려져 있다. 패혈증 신체 어느 곳에서도 시발될 수 있는 박테리아 감염에 의해 유발된다. 패혈증은 전신성 염증 및 응고가 특징인 감염에 대한 환자의 면역 반응에 의해 유발되는 임상적 이상의 스펙트럼으로 간단히 정의될 수 있다. 이는 기관 기능 장애에 반응한 전신성 염증 반응(SIRS)부터 다발성 기관 기능부전 및 최종적인 사망까지 전체 범위를 포함한다.
패혈증은 매우 복잡한 순서의 이벤트이고 어떻게 환자가 SIRS에서 패혈증 쇼크로 진행되닌즈 완전히 이해하기 위해 많은 연구가 여전히 요구된다. 패혈증 쇼크 증상의 환자는 이상성 면역 반응을 지닌다. 초기에 이들은 감염에 대해 불가항력의 염증 반응을 나타낸다. 이는 전-염증성 사이토카인 종양 괴사 인자(TNF), IL-1, IL-12, 인터페론 감마(IFN감마) 및 IL-6에 의한 것으로 판단된다. 이후 신체는 면역억제 기간에 의해 환자에서 나타나는 항-염증성 사이토카인(IL-10), 용해성 저해제[TNF 수용체, 제2형 IL-1 수용체 및 IL-1RA(IL-1의 불활성형)]를 생성함으로서 이러한 반응을 조절한다. 이러한 반응 저하의 지속은 병원내 감염 및 사망의 증가된 위험과 관련된다.
이러한 전신성 염증 연쇄반응은 다양한 박테리아 생성물에 의해 개시된다. 이들 박테리아 생성물(그람-음성 박테리아 = 내독소, 포르밀 펩타이드, 외독소 및 프로테아제; 그람-양성 박테리아 = 외독소, 초항원(독소 쇼크 증후군 독소(TSST), 연쇄구균성 발영 외독소 A(SpeA)), 장독소, 용혈소, 펩티도글리칸 및 리포테코익산 및 진균 세포벽 물질)은 숙주의 대식세포 상의 세포 수용체에 결합하고 핵 인자 카파 B(NFkB)와 같은 조절 단백질을 활성화시킨다. 내독소는 여러 수용체와 상호작용함으로서 조절 단백질을 활성화시킨다. CD 수용체는 세포 표면 상에 LPS-LPS 결합 단백질 복합체를 수집한 후 TLR 수용체는 세포 내로 신호를 번역한다.
생성된 전-염증성 사이토카인은 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨 1, 6 및 12 및 인터페론 감마(IFN감마)이다. 이들 사이토카인은 기관 기능에 영향을 미치도록 직접적으로 작용하거나 2차 매개제를 통해 간접적으로 작용한다. 이들 2차 매개제는 산화질소, 트롬복산, 류코트리엔, 혈소판-활성화 인자, 프로스타글란딘 및 보체를 포함한다. TNF 및 IL-1(내독소뿐만 아니라)도 섬유소 침전 및 파종 혈관내 응고(DIC)를 유도하는 내피세포에 의한 조직-인자의 방출을 유발할 수 있다.
이후 이들 1차 및 2차 매개제 응고 연쇄반응, 보체 연쇄반응 및 프로스타글란딘 및 류코트리엔의 생성의 활성화를 유발한다. 응고는 기관 수량을 저하시키는 혈관 내에 침적되고 다발성 기관 시스템 기능부전을 유도할 수 있다. 이때 응고 연쇄반응의 이러한 활성화는 환자의 DIC 및 ARDS를 유발하는 응고를 생성할 수 있는 능력을 고갈시킨다.
이러한 연쇄반응의 점증적 효과는 항염증에 대한 우세한 염증 및 섬유소용해에 대해 우세한 염증을 지닌 불균형 상태이다. 미세혈관 혈전증, 관류저하, 허혈 및 조직 손상이 유발된다. 중증 패혈증, 쇼크 및 다발성 기관 기능장애가 발생하고 사망하게 된다.
본 발명자들은 eIF-5A에 대한 siRNA가 TNF-α와 같은 다양한 염증 사이토카인의 발현을 감소시킬 수 있음을 종전에 나타내었다(또한 상기 제공됨). 마우스에서 패혈증을 치료하기 위한 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA의 투여 관련 연구에서 본 발명자들은 siRNA가 생체 내에서 패혈증을 치료하는데 사용될 수 있음을 더욱 나타내었다. 실시예 21 및 도 149∼152 및 160 참조. 이러한 연구에서 마우스는 LPS 투여 48시간 후 동물에서 패혈증 및 사망을 유도하는 용량의 LPS가 제공되었다. siRNA(3'- GCC UUA CUG AAG GUC GAC U-5'; 서열번호: 99)가 LPS 투여 전후에 다른 시간 주기로 마우스에 복막내로 투여되었다. 일부 시험군에서 siRNA를 수용한 5마리의 마우스 전부가 생종하였다. siRNA의 이용이 마우스 내에서 염증 연쇄반응을 정지시키고 따라서 패혈증을 예방할 수 있는 것으로 판단된다.
따라서 본 발명의 하나의 실시태양은 세포내에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 내인성 발현을 억제하고 3'- GCC UUA CUG AAG GUC GAC U-5'(서열번호: 99)의 서열을 지닌 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 억제함으로서 염증성 사이토카인의 생성이 저해되거나 감소되어 염증 연쇄반응이 시작되지 않고 패혈증 쇼크를 유발하지 않는다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A는 아폽토시스 및 염증과 관련된 세포핵 외부로 mRNA 서브세트를 왕복시키는 것으로 판단된다. eIF-5A의 함량이 감소디??거나 완전히 제거되는 경우 다양한 염증성 및 세포 사멸 사이토카인의 mRMA를 세포핵 외부로 왕복시키는데 유용한 왕복이 존재하지 않는다. 이는 세포에 의해 생성되는 염증성 사이토카인의 함량 감소를 유발하고 따라서 염증 연쇄반응의 시작을 저해한다. 패혈증 및 패혈증 쇼크는 염증 연쇄반응의 결과이므로 연쇄반응의 정지는 패혈증/패혈증 쇼크를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 따라서 본 발명의 또다른 실시태양은 상기 기술된 siRNA를 포유류에 투여하는 것을 포함한 포유류 내 패혈증을 치료하는 방법을 제공한다.
예방 또는 치료 목적으로 동물에 사용되는 본 발명의 안티센스 핵산 및 siRNA이 약제적으로 수용 가능한 담체를 추가적으로 포함한 조성물의 형태로 투여될 것이 이해된다. 적당한 약제적으로 수용가능한 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 약제적으로 수용 가능한 담체는 결합 단백질의 저장 수명 또는 유효성을 증가시키는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은 최소량의 보조 물질로 더욱 구성될 수 있다. 당 분야에 알려진 바와 같이 주사 조성물은 포유류 내로의 투여 후 활성 성분의 빠르고, 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 포뮬레이트될 수 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태가 될 수 있다. 이들은 예를 들어 정제, 환약, 분말, 액상 용액, 분산액 또는 현탁액, 리포솜, 좌약, 주사 및 주입 용액과 같은 고형, 반-고형 및 액체 투여 형태를 포함한다. 바람직한 형태는 투여 및 치료 적용의 의도된 방식에 따라 달라진다.
이러한 조성물은 제약 분야에서 잘 알려진 방식으로 제조될 수 있다. 조성물 제조시 활성 성분은 일반적으로 담체와 혼합되거나 담체에 의해 희석되거나 또는 예를 들어 캡슐, 봉지, 종이 또는 다른 용기의 형태가 될 수 있는 담체 내에 봉합될 것이다. 담체가 희석제로서 작용할 때 이는 부형제, 첨가제 또는 활성 성분에 대한 매질로서 작용하는 고형, 반-고형 또는 액상 물질이 될 수 있다. 따라서 조성물은 정제, 마름모형 정제, 봉지, 교갑, 엘릭서(elixir), 현탁액, 연무제(고형 또는 액상 매질), 예를 들어 10 중량%까지의 활성 화합물을 함유한 연고, 연질 및 경질 캡슐, 좌약, 주사 용액, 현탁액, 멸균 포장된 분말 및 국소 패취의 형태가 될 수 있다.
또한 본 발명은 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 투여함으로서 암을 치료하고/또는 혈관형성을 감소시키는 방법(또는 암을 치료하고/또는 혈관형성을 감소시키는 약제)를 제공한다. 암/종양 내 아폽토시스 증가. 본 발명자들은 아폽토시스-특이적 eIF-5A 폴리뉴클레오타이드가 일부 종양/암 모델 내에서 아폽토시스를 증가시키고 또한 주변의 비-암조직 내에서는 아폽토시스를 유도하지 않는 것으로 판단됨을 나타내었다. 또한 본 발명자들은 암세포가 외인성 아폽토시스-특이적 eIF-5A 폴리뉴클레오타이드의 이용을 통해 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 과-발현하도록 유도되는 경우 암세포가 VEGF 발현 감소를 나타냄을 나타내었다. VEGF는 내피 세포 생장 및 혈관형성을 매개하는 사이토카인이다. 다수의 세포주가 VEGF를 분비하므로 VEGF는 병리적 혈관형성에 중요한 것으로 간주된다. VEGF는 대부분의 인간 종양에서 상향조절되는 것으로 나타났다.
또한 본 발명은 암세포 내 아폽토시스를 유도하는 방법을 제공한다. 암세포는 정상적 세포 사멸 경로를 표면적으로 우회하기 때문에 암세포 내에서 아폽토시스를 유도하는 메커니즘을 지니는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 암세포 내에서 아폽토시스를 유도하기 위해 eIF5A1에 대한 siRNA를 이용하였다. 더욱이 본 발명자들은 eIF5A1이 DHS에 의한 하이푸신에 의해 활성화되어야 한다고 종전 판단되었으나 eIF5A1의 비하이푸신화 형태가 아폽토시스를 유도할 수 있음을 발견하였다.
본 발명자들은 아폽토시스 동안 eIF5A1의 역할을 조사하고 결장 암종 세포주 내에서 eIF5A1의 과발현이 p53-독립적 방식으로 아폽토시스를 유도함을 관찰하였다. 세포질에서 세포핵으로의 eIF5A1 단백질의 역동적 전위도 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 사멸 수용체 활성화 또는 악티로마이신 D에 의해 유도된 유전독성 스트레스에 의해 매개된 아폽토시스의 유도 후 관찰되었고, 이는 eIF5A1이 아폽토시스와 관련된 중요한 세포핵성 기능을 지님을 나타낸다.
본 발명의 발명자들에 의한 종전 연구는 인간 사상판 세포의 TNF-α로의 처리가 eIF5A1을 상향조절하고 아폽토시스를 유도함을 입증하였다. 더욱이 eIF5A1에 대한 siRNA는 이러한 사이토카인에 의해 유도된 아폽토시스로부터 사상판 세포를 보호하였다. 이들 관찰은 eIF5A1가 TNF-α-유도된 아폽토시스에 중요한 역할을 함을 나타낸다. eIF5A1이 DNA 손상-유도된 아폽토시스에도 관련된다는 가능성을 조사하기 위해 정상 결장 섬유아세포가 국소이성화효소 Ⅱ를 저해하는 항-종양 약제인 악티노마이신 D로 처리되었고 eIF5A1 발현은 노던 및 웨스턴 블럿팅에 의해 조사되었다(도 30). 노던 블럿 분석은 eIF5A1에 대한 전사체가 이들 세포 내에서 지속적으로 발현되고 악티노마이신 D로의 처리는 eIF5A1 전사체 수량 상에 어떠한 효과도 나타내지 않음을 나타내었다(도 30A). eIF5A1 단백질은 처리 전 섬유아세포 내에서 중간 수치로 존재하였고 악티노마이신 D 처리 1시간 이내에 eIF5A1 단백질 발현의 적당한 증가가 관찰되었다(도 30B). 단백질은 처리후 적어도 24시간 이상 동안 축적이 지속되었다(도 30B). 증가된 전사체 수치의 부재시 eIF5A1 단백질 축적은 eIF5A1가 후-전사적으로 조절됨을 나타낸다. 또한 악티노마이신 D에 반응한 p53의 발현은 이들 세포 내에서 조사되었고 eIF5A1과 병행하여 증가되고 처리 후 적어도 24시간 이상 동안 증가를 지속하는 것으로 판명되었다(도 30B). 따라서 eIF5A1은 DNA 손상에 의해 유도된 세포 사멸에 관련된다.
악티노마이신 D-유도된 세포독성 내 eIF5A1의 필요조건은 인간 결장 선암종 세포주, HT-29를 이용하여 조사되었다. 악티노마이신 D 처리는 48시간 후 60%까지 HT-29 세포 활성을 감소시켰다(도 31A). siRNA로의 트랜스펙션에 의한 eIF5A1의 억제는 악티노마이신 D의 세포독성 효과를 감소시켰다. 대조군 siRNA로 트랜스펙트된 세포 대비 세포 활성 내 40% 증가가 eIF5A1-억제된 세포에 대해 악티노마이신 D 처리 후 관찰되었다(도 31A). 따라서 악티노마이신 D의 세포독성 효과는 eIF5A1의 존재상에 부분적으로 의존적인 것으로 나타났고 이는 유전독성 스트레스 경로 내 eIF5A1의 역할을 나타낸다.
수많은 연구는 eIF5A1가 세포 증식에도 관련됨을 나타낸다. 예를 들어 GC7과 같은 DHS의 저해제로의 eIF5A1의 하이푸신화 차단은 세포주기 저지 및 다양한 종양 세포주 내 아폽토시스를 유도한다. 세포 증식시 제안된 eIF5A1 관련성을 명백히 하기 위한 노력으로 세포 생장 상의 eIF5A1의 siRNA-매개된 억제 효과가 조사되었다. HT-29 세포가 이들 연구에 이용되었고 세포 증식은 BrdU 도입에 의해 측정되었다. >90%까지 eIF5A1 발현을 감소시키는(데이터는 나타내지 않음) eIF5A1 siRNA로의 HT-29 세포의 트랜스펙션에 의한 eIF5A1 단백질 고갈은 세포 생장 및 활성 상에 어떠한 효과도 지니지 않았다(도 31A 및 2B). 이러한 siRNA로 트랜스펙트된 어떠한 세포주에서도 세포 생장 상에 어떠한 음성적 효과도 관찰되지 않았다. 세포 증식 상의 eIF5A1 siRNA의 효과는 혈정의 존재 또는 부재시 생장된 HT-29 세포를 이용하여 GC7과 비교되었다(도 31B). GC7로의 세포 처리는 HT-29 세포의 증식을 저해하였고 이는 이러한 DHS 저해제의 종양 세포 생장 저지 능력의 종전 보고와 일치하고, 이러한 효과는 혈청 고갈에 의해 극적으로 증가되었다(도 31B). 이와 대조적으로 siRNA로의 트랜스펙션에 의한 세포로부터 eIF5A1 단백질의 고갈은 대조군 siRNA와 비교시 세포 증식 상에 어떠한 두드러진 효과도 생성하지 않았다(도 31B). 따라서 eIF5A1 단백질 수치의 감소는 대사 활성 또는 새로운 DNA 합성에 의해 측정시 HT-29 세포의 증식 능력 상에 어떠한 효과를 지니지 않고, 이는 eIF5A1이 세포 활성 및 생장에 필수적이지 않음을 나타낸다. 이들 결과는 보고된 GC7의 세포 증식 억제 활성 및 다른 DHS 저해제가 하이푸신화된 eIF5A1의 감소된 수치와 관련되지 않고 eIF5A1이 세포 생자에 필수적이지 않음을 나타낸다.
본 발명자들의 최근 연구는 HA-태그된 eIF5A1이 시험관 내에서 하이푸신화되지 않음을 입증하였다. HA-태그된 eIF5A1이 하이푸신화될 수 있는지 여부를 측정하기 위해 HA-eIF5A1 융합 단백질을 발현하는 pHM6-eIF5A1 컨스트럭트가 COS-7 세포 내로 일렉트로포레이트되었다. 이후 스퍼미딘이 eIF5A1 내 보존된 리신을 하이푸신으로 변형시키는 DHS에 의해 사용되는 기질이기 때문에 일렉트로포레이트된 세포는 2일간 [3H]-스퍼미딘으로 인큐베이트되었다. HA-태그된 eIF5A1는 항-HA 항체를 이용하여 세포 용해질로부터 면역침전되었고 면역침전된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리되었다. eIF5A1 단백질 내로의 [3H]의 도입을 검출하기 위해 분리된 단백질은 멤브레인으로 옮겨지고 x-선 필름에 노출되었다. 표지된 밴드는 [3H]의 추정 크기에 상응하는 17 kDa에서 검출되었다(도 33A). 멤브레인 상의 eIF5A1 단백질의 위치는 항-eIF5A1 항체(도 8B) 및 항-HA 항체(도 33B)로의 웨스턴 블럿팅에 의해 측정되었다. 항-eIF5A1 웨스턴은 내 상위 밴드(∼20 kDa)는 항-HA 웨스턴에서 관찰된 단일 밴드 크기와 상응하였고(도 33C) 이는 이중의 상위 밴드가 eIF5A1의 HA-태그된 형태인 반면 이중의 하위 밴드(∼17 kDa)는 내인성 eIF5A1이어야 함을 나타낸다. 내인성 eIF5A1가 HA-태그된 eIF5A1에 결합되어 동시-침전된 것으로 나타났기 때문에 내인성 형태의 eIF5A1이항-HA 항체에 의해 면역침전되었음은 흥미롭고, 이는 eIF5A1이 일반적으로 세포 내에 중합체로서 존재함을 나타낸다. 따라서 도 30A의 17 kDa [3H]-표지 밴드는 하이푸신화된 형태의 내인성 eIF5A1 단백질이어야 한다. 20 kDa에서 어떠한 상응하는 밴드도 관찰되지 않았기 때문에 세포 내로 도입된 HA-태그된 eIF5A1은 하이푸신화되지 않거나 내인성 eIF5A1보다 훨씬 적은 정도로 하이푸신화됨는 것으로 판단된다.
이러한 컨스트럭트의 과-발현이 암세포주 내에서 아폽토시스를 유도하는 것이 가능하기 때문에 HA-태그된 eIF5A1이 시험관 내에서 하이푸신화되지 않는다는 사실이 목적이다. 본 실험실의 종전 연구는 암세포주 내 인간 eIF5A1의 과-발현이 증가된 아폽토시스와 관련됨을 입증하였고, 이는 eIF5A1이 암세포 내 아폽토시스를 유도하는 것이 가능한 전-아폽토시스 단백질임을 나타낸다. 인간 결장 암종 세포주인 RKO 및 RKO-E6의 HA-태그된 형태의 eIF5A1를 발현하는 컨스트럭트인 pHM6-eIF5A1로의 트랜스펙션은 아폽토시스 발생률의 200% 이상의 증가를 유발하였다(도 5A 및 5B). 이들 결과는 하이푸신화되지 않은 eIF5A1이 암세포주 내에서 아폽토시스를 유도하는 것이 가능하다는 견지를 강하게 지지한다.
eIF5A1 발현이 p53과 병행하여 DNA 손상-유도된 아폽토시스 동안 상향-조절되는 것으로 판단되고(도 30B), eIF5A1 발현의 억제가 악티노마이신 D의 세포독성 효과로부터 HT-29 세포를 부분적으로 보호한다는 관찰(도 31A)은 eIF5A1과 p53 사이에 관계가 존재할 수 있다는 가능성을 제기한다. eIF5A1이 DNA 손상-유도된 아폽토시스 동아 p53의 적당한 발현에 필수적인지 여부를 측정하기 위해 트랜스펙트된 RKO 세포 내의 p53의 악티노마이신 D-유도된 상향-조절이 조사되었다. RKO 세포는 인간 결장직장 암종 세포주이고 이들이 기능적 p53 종양 억제제 단백질 18을 지닌 것으로 알려져 있기 때문에 본 실험에 사용되었다. p53 단백질 수치는 일반적으로 이들 세포 내에서 검출 한계 이하이나 악티노마이신 D 처리시 신속하게 축적되는 것으로 판명되었다(도 43A). eIF5A1 siRNA로의 트랜스펙션은 eIF5A1 단백질 수치를 유의적으로 감소시켰고(도 43A), 악티노마이신 D 처리에 반응한 p53 축적도 억제시켰다(도 43A 및 43B). siRNA 트랜스펙션에 의한 eIF5A1의 억제는 대조군 siRNA 대비 악티노마이신 D 처리 8시간 후 58%까지, 처리 24시간에는 68%까지 p53 단백질 수치를 감소시켰고(도 43B), 이는 eIF5A1이 DNA 손상에 반응한 적당한 p53 발현에 필수적임을 나타낸다.
아폽토시스에서의 eIF5A1의 역할을 더욱 검증하기 위해 eIF5A1 과-발현에 대한 RKO 세포의 아폽토시스 반응이 조사되었다. 인간 eIF5A1은 RT-PCR을 이용하여 RKO 세포에서 클론되었고 강한 CMV 프로모터의 조절 하에서 발현 벡터 pHM6 내로 서브클론되었다. 수득된 PCR 생성물은 인간 eIF5A1에 대해 종전 보고된 것과 동일한 아미노산 서열을 지닌 것으로 판명되었다. RKO 세포는 pHM6-LacZ 또는 pHM6-eIF5A1로 일시적으로 트랜스펙트되었고, 트랜스펙션 48시간 후 세포는 고정되고 TUNEL-염색되고 유세포분석에 의해 분석되었다(도 44). 30∼40%의 트랜스펙션 효율이 일반적으로 수득되었다. TUNEL 염색은 eIF5A1 함유 플라스미드로 트랜스펙트된 세포의 29.3%가 아폽토시스를 진행한 반면 pHM6-LacZ로 트랜스펙트된 세포의 12.8%만이 아폽토시스되었음을 나타내었다(도 44). 따라서 eIF5A1의 과발현은 RKO 세포 내에서 아폽토시스를 유도한다.
eIF5A1의 C-말단은 올리고뉴클레오타이드 결합 폴드(fold)와의 유사성에 기반한 RNA 결합에 관련된 것으로 제안되었다. C-말단 도메인이 아폽토시스에 중요한지 여부를 측정하기 위해 C-말단의 최종 37개 아미노산이 결실된 절제된 eIF5A1 cDNA를 함유한 플라스미드(pHM6-eIF5A1Δ37)가 구축되었다. 일시적으로 트랜스펙트된 RKO 세포 내 아폽토시스는 형광 현미경을 이용하여 TUNEL에 의해 계산되었다(도 45A). 절제된 eIF5A1 컨스트럭트로 일시적으로 트랜스펙트된 세포는 대조군 벡터로 트랜스펙트된 세포와 유사한 아폽토시스 수준을 나타났다. 이와 대조적으로 pHM6-eIF5A1로 트랜스펙트된 세포는 대조군 벡터로 트랜스펙트된 세포보다 2-배 이상 더 높은 수준의 아폽토시스를 나타내었다(도 45A).
eIF5A1이 p53 발현을 조절하는 것으로 나타난 관찰의 관점에서(도 43) 기능성 p53이 결핍된 세포주의 eIF5A1에 의해 유도된 아폽토시스에 대한 감수성이 조사되었다. 안정하게 도입된 인간 유두종 바이러스 E6 종양유전자를 포함하고 분명한 기능성 p53이 결핍된 RKO에서 유래된 세포주 RKO-E6가 본 목적을 위해 이용되었다. RKO-E6 내 eIF5A1의 과-발현은 pHM6-LacZ로 트랜스펙트된 대조군 세포와 비교시 아폽토시스 세포 수의 3-배 이상의 증가를 유발하였고(도 45B), 이는 eIF5A1 과발현이 p53과 독립적으로 아폽토시스를 유도할 수 있음을 나타낸다. RKO 세포주로 수득된 결과와 유사하게 절제된 eIF5A1로 트랜스펙트된 RKO-E6 세포 내의 아폽토시스 수준은 pHM6-LacZ로 트랜스펙트된 세포와 유의적인 차이를 나타내지 않았고, 이는 eIF5A1의 최종 37개 아미노산이 그의 아폽토시스 활성에 필수적임을 나타낸다(도 45B). eIF5A1의 C-말단이 RNA 결합에 관련된다고 간주하는 경우 이들 결과는 eIF5A1이 아폽토시스 동안 세포핵세포질(nucleocytoplasmic) 셔틀 단백질로 기능한다는 개념을 지지한다. pHM6-eIF5A1로 트랜스펙트된 RKO-E6 세포 내 아폽토시스 수준이 상응하는 pHM6-LacZ로 트랜스펙트된 세포보다 평균 >3-배 더 높았으나 이러한 차이는 쌍대 t-테스트에 의해 측정시 통계적으로 유의적이지는 않았다(도 45B). 이는 트랜스펙트된 RKO-E6 내에서 유도된 아폽토시스 정도에 있어서의 실험간 변동을 반영한다. 그러나 1회 이내 실험에서 pHM6-LacZ로 트랜스펙트된 대조군 세포에 대한 아폽토시스 수준을 세팅함으로서 이러한 변동이 표준화되는 경우 표준화된 대조군 수치 대비 pHM6-eIF5A1로 트랜스펙트된 세포에 대한 아폽토시스 증가는 도 45B에 나타난 자료에 대해 <0.03의 유의성 가능성으로 평균 3.25-배이었다.
세포핵세포질 셔틀 단백질로서의 eIF5A1의 역할은 이들이 세포질 및 세포핵 주위 영역 내에 위치하고 이러한 위치가 세포주기에 따라 변화하지 않는 것으로 수차례 판명되었기 때문에 의심을 받아 왔다. eIF5A1이 세포핵으로부터의 mRNA의 동원에 관련되는 경우 세포랙 내에 적어도 일시적으로 위치하는 것으로 기대된다. eIF5A1이 세포 분열이 아닌 아폽토시스에 관련된다는 본 발명자들의 종전 발견의 견지에서 eIF5A1의 하위세포 위치가 아폽토시스를 유도하는 것으로 알려진 약제로 처리후 변경되는지 여부를 측정하는 연구가 수행되었다. IFN-γ26-30으로의 민감화 후 TNF-α로의 인큐베이션에 의해 HT-29 세포 내에서 아폽토시스가 유도될 수 있다. IFN-γ-프라임된 HT-29 세포의 TUNEL 염색은 약 30%의 세포가 TNF-α로의 자극 24시간 후 아폽토시스를 진행함을 입증하였다(데이터는 나타내지 않음). IFN-γ 및 TNF-α 모두 이러한 세포 형태에서 독립적으로 아폽토시스를 유도하는 것이 불가능하기 때문에 동시-자극이 아폽토시스에 필수적이다. 따라서 HT-29 세포는 IFN-γ로 16시간 동안 프라임된 후 TNF-α로 처리되었다. 세포는 TNF-α 처리 시작 10분 내지 8시간의 범위의 간격에서 포름알데하이드로 고정되었고, eIF5A1 위치는 통상의 항-eIF5A1 항체를 이용하여 간접적 면역형광에 의해 관찰되었다. 종전 보고와 일치하여 eIF5A1는 비처리 세포의 세포질 내에 우세하게 위치하였고[도 19A(ⅰ), 6B(ⅰ)], 이러한 위치는 IFN-γ 단독 처리에 의해 변경되지 않았다[도 19A(ⅱ)]. 그러나 IFN-γ-프라임된 세포 내 TNF-α 처리 10분 이내에 우세한 세포질에서 주로 세포핵으로의 eIF5A1 위치의 역동적 변화가 존재하였다[도 19A(ⅲ)]. eIF5A1이 IFN-γ-프라이밍 없이 TNF-α로 자극된 세포 내에서 세포핵에 위치하지 않았가 때문에 세포의 IFN-γ 민감화는 TNF-α 처리에 반응한 eIF5A1의 전위에 필수적이었다(데이터는 나타내지 않음). eIF5A1는 IFN-γ-/TNF-α 처리후 적어도 8시간 이상 동안 세포핵 위치를 유지하였다[도 19A(ⅵ)]. eIF5A1 위치 변화가 유전독성 스트레스에 반응하여서도 발생하는지 여부를 측정하기 위해 HT-29 세포는 증가되는 시간 주기 동안 악티노마이신 D로 인큐베이트되었다(도 19B). 악티노마이신 D로의 24시간 동안 인큐베이션은 약 10%의 HT-29 세포 내에서 아폽토시스를 유도하였다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 경우 eIF5A1는 악티노마이신 D 처리 개시 후 적어도 30분 이상 동안 세포질 분포를 유지하였으나[도 19B (ⅱ)] 90분 이내에[도 19B (ⅲ)] 세포핵 내에서 우세하게 발견되었고 적어도 16시간 이상 동안 유지되었다[도 19B (ⅵ)]. 고정된 세포가 2차 항체만으로 인큐베이트된 경우 형광 신호는 관찰되지 않았고 이는 관찰된 형광(도 19)이 1차 항체에 의한 eIF5A1의 인식에 기인함을 나타낸다(데이터는 나타내지 않음). 이들 관찰은 eIF5A1이 사멸 수용체 활성화뿐만 아니라 유전독성 스트레스에 의해 유도된 아폽토시스 동안 실제로 세포핵세포질 셔틀 단백질로서 기능하고 eIF5A1의 위치가 아폽토시스 조절시 중요한 역할을 한다는 개념을 지지한다(도 32).
eIF5A1는 특정 아미노산인 하이푸신을 포함한다고 알려진 유일한 단백질인 점에서 특별하다. 하이푸신 잔기는 디옥시하이푸신 신타제(DHS)에 의해 촉매되는 2가지 효소 반응에서 후번역적으로 형성되고 eIF5A1의 기능은 규명되지 않았고 세포핵세포질 셔틀 단백질로서 기능한다고 제안되었다. 본 연구에서 사용된 GC7와 같은 DHS 저해제로의 많은 연구는 이들 저해제의 세포 증식을 차단하는 능력을 입증하였고, 이는 하이푸신화된 eIF5A1가 세포 분열에 관련된 mRNA의 번역을 촉진시킨다는 관점을 고무시킨다. 이러한 제안은 eIF5A1 이소폼 또는 DHS의 불활성화가 세포 분열을 차단함을 입증하는 효모로의 실험에 의해 더욱 지지된다. 그러나 이러한 관점은 본 발명자들이 eIF5A1의 siRNA-매개된 억제가 결장 선암종 세포주의 세포 활성 또는 증식에 어떠한 효과를 지니지 않음을 관찰했기 때문에 본 연구에서 보고된 데이터와 일치하지 않는다. 더욱이 백혈병 세포주로의 초기 연구에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드로의 eIF5A1 발현 저해가 세포 생장 상의 GM-CSF의 자극 효과를 실질적으로 증가시킴이 발견되었다. eIF5A1 발현과 증식 사이의 상호관련성의 명백한 부재도 2개의 폐 선암종 세포주에서 관찰되었다. 더욱이 본 연구에서 본 발명자는 GC7로의 처리 결과로서 세포 증식의 감소를 관찰하였으나 eIF5A1 단백질 수치가 >90%까지 고갈된 세포는 정상적으로 증식될 수 있었다. siRNA로의 트랜스펙션 후 잔존하는 eIF5A1 단백질의 잔여 함량이 생장을 지지하기에 충분하였음이 가능하나 이들 데이터는 세포 생장 상의 DHS 저해제의 저해 효과가 하이푸신-변형된 eIF5A1 수치의 감소와 관련된다는 관점에 이의를 제기하는 것으로 나타났다. 실제로 이들 발견은 신규한 DHS 저해제가 세포 활성 또는 생장 상에 어떠한 효과도 나타내지 않음을 나타내는 최근 보고와 일치하고 종전 연구에 사용된 DHS 저해제의 항증식 효과가 eIF5A1의 하이푸신화를 저해하는 능력과는 관계가 없고 세포 대사 상의 관련되지 않은 효과에 기인함을 나타낸다.
최근 여러 연구는 eIF5A1가 아폽토시스 경로에 관련됨을 나타내었다. 예를 들어 eIF5A1에 대한 siRNA는 TNF-α-유도된 아폽토시스 유래의 인간 사상판 세포를 보호하였다. 또다른 연구에서 본 발명자들은 eIF5A1의 과-발현이 폐암 세포주의 증가된 아폽토시스를 유발함을 입증하였다. 또한 최근 연구 결과는 아폽토시스 내 eIF5A1의 역할을 지지한다. 첫 번째로 eIF5A1 단백질의 발현은 악티노마이신 D에 의해 유도된 p53 축적과 상호관련되었고, eIF5A1의 siRNA-매개된 억제는 HT-29 세포 상에서 악티노마이신 D의 세포독성 효과를 감소시켰다. 이는 사이토카인 IFN-α 및 TNF-α에 의해 유도된 아폽토시스 동안 증가된 eIF5A1 발현의 종전 보고와 일치한다. 두 번째로 eIF5A1의 과발현은 그의 p53 상태와 관계없이 인간 결장직장 암종 세포 내에서 아폽토시스를 유도하였다. 이는 eIF5A1의 과-발현이 p53-무효 H1299 세포가 아닌 H460(p53+/+) 세포 내에서 아폽토시스를 유도하고, 사용된 세포 형태 내 차이를 반영할 수 있다는 최근 보고와 일치한다. 또한 본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드 결합 폴드를 포함한 것으로 제안된 eIF5A1의 C-말단 도메인이 그의 아폽토시스 활성에 필수적임을 관찰하였다. 이들 결과는 RNA, 아마도 아폽토시스에 필수적인 mRNA의 결합이 eIF5A1의 전-아폽토시스에 중요함을 나타낸다. 실제로 본 연구에서 본 발명자들은 RKO 세포 내에서 악티노마이신 D에 의한 DNA 손상에 반응한 p53의 적당한 발현시 eIF5A1에 대한 필요조건을 입증하였다. eIF5A1 상의 p53 발현의 의존도도 COS-7 세포에 대해 보고되었다. 더욱이 eIF5A1 단백질 발현은 폐 선암종 내 p53의 세포핵 축적과 양성적으로 상호관련되는 것으로 나타났다. 또다른 RNA 결합 단백질인 HuR은 RKO 세포 내에서 p53의 전사체에 결합하고 자외선에 반응하여 p53 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서 유전독성 스트레스에 반응한 p53 발현은 하나 이상의 RNA 결합 단백질을 요구하는 것으로 판단된다. 감마 방사선과 같은 유전독성 스트레스에 반응하여 관찰되는 p53 단백질의 증가된 발현은 아마도 하나 이상의 RNA 결합 단백질과의 상호작용 결과로서 그의 3'UTR의 저해 효과의 경감으로부터 유발된 p53 전사체의 증가된 번역에 기인한 것으로 판단된다. 본 발명자들의 데이터는 eIF5A1이 유전독성 스트레스에 반응한 p53의 증가된 번역에 중요한 RNA 결합 단백질 중의 하나가 될 수 있음을 나타낸다.
세포핵세포질 셔틀 단백질로서의 eIF5A1의 제안된 역할은 위치 연구에 의해 혼동되었다. eIF5A1이 세포질 및 세포핵의 도처에 분포된다는 일부 보고가 존재하나 대부분의 연구는 eIF5A1이 세포질 및 세포핵주변 영역에 위치하고 세포핵에는 거의 존재하지 않음을 나타낸다. 특히 eIF5A1 하위세포 위치를 상세히 연구한 Shi et al.(1996b)은 본 단백질이 세포의 세포질 및 세포핵주변 영역에 크게 제한되고 1% 이하가 세포핵에 존재함을 보고하였다. 또한 이들은 eIF5A1의 하위세포 위치가 세포주기 변화동안 또는 바이러스 종양유전자 형질전환 후 변경되지 않음을 발견하였다. 이러한 위치 패턴은 eIF5A1이 세포 생장에 필수적인 전사체에 대한 세포핵세포질 셔틀 단백질로서 기능한다는 제안과 일치하지 않는다. 본 연구에서 eIF5A1 발현은 정상 생장 조건 하에서 HT-29 세포의 세포질 및 세포핵주변 영역에 제한되었다. 그러나 IFN-γ로 민감화된 HT-29 세포가 이러한 세포주에서 아폽토시스를 유도한다고 알려진 처리인 TNF-α로 처리된 경우 eIF5A1 단백질의 세포핵 내로의 매우 신속한 전위가 관찰되었다. 이러한 세포핵 내로의 전위는 자극의 처음 10분 이내에 발생하였고 이는 사멸 수용체 신호전달이 세포질에서 세포핵으로의 eIF5A1 단백질의 신속한 수송을 개시함을 나타낸다. 유사하게는 결과들은 TNF-α 만큼 신속하지는 않으나 악티노마이신 D 자극된 eIF5A1의 세포핵 내로의 수송을 나타낸다. 종전 연구들은 eIF5A1 위치가 악티노마이신 D에 의해 영향받지 않음을 보고하였다. 이러한 불일치의 원인이 명백하지는 않으나 세포주 및 세포를 자극시키는데 사용된 악티노마이신 D의 농도(4∼5 ㎍/mL 대 본 연구에서 사용된 1 ㎍/mL) 상의 차이가 다른 발견을 설명할 수 있다. eIF5A1은 수동적 확산에 의해서만 세포핵으로 진입한다고 보고되었다. 그러나 사멸 수용체 활성화 또는 유전독성 스트레스에 의해 유도된 아폽토시스와 관련된 조건 하에서 eIF5A1의 조절된 세포핵 유입의 증거가 제공된다.
비하이푸신화 eIF5A1의 증가된 수치는 아폽토시스 유도와 상호관련되었다. 이들 관찰은 비변형화 eIF5A1의 축적이 특정 형태의 아폽토시스의 유도에 중요한 역할을 한다는 제안을 도출하였다. 또한 비변형화 eIF5A1만이 세포핵 위치가 가능함이 보고되었고, 이는 비변형화 형태의 eIF5A1이 세포핵에서 발생하는 아폽토시스 기능을 지님을 나타낸다. 정상 생장 조건 하에서 실질적으로 모든 세포성 eIF5A1 단백질이 대부분 합성 직후 하이푸신화된다. 따라서 eIF5A1이 하이푸신화되고 아폽토시스 자극이 전-아폽토시스 기능을 지닌 세포핵으로의 전위를 촉발시킬 때까지 세포질 내에 유지되는 것으로 판단된다. 하이푸신화는 비가역적 변형으로 간주되나 탈-하이푸신화 활성을 지닌 단백질이 정상 생리 조건 하에서 불활성인 것으로 판단될 수 있다.
결론적으로 eIF5A1은 사멸 수용체 활성화 및 유전독성 스트레스 모두에 의해 유도되는 아폽토시스 동안 세포핵성 기능을 지닌 전아폽토시스 단백질인 것으로 판단된다. 이러한 특정 단백질의 아폽토시스 기능의 주요한 이해는 암 치료에 대한 새로운 치료적 중재를 도출할 수 있다.
일반적으로 본 발명에서 기술된 것은 하기 예증의 방법으로 제공된 실시예를 통해 더욱 용이하게 이해될 것이다. 실시예는 본 발명을 이해하도록 설명되나 본 범위를 한정하도록 의도되지는 않는다. 실시예는 통상적인 방법의 상세한 설명을 포함하지 않는다. 이러한 방법은 당 분야의 일반적인 숙련자에게 잘 알려져 있고 많은 간행물에 기술된다. 벡터 및 플라스미드의 구조, 플라스미드의 숙주 세포로의 도입 및 유전자 및 유전자 생성물의 발현 및 측정에서 사용된 바와 같은 통상적인 방법의 상세한 설명은 Sambrook, J. et al.,(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press를 포함한 많은 간행물에서 수득될 수 있다. 여기에 언급된 모든 참고사항은 그 전체가 포함된다.
도 1은 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 3' 말단의 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 11) 및 유도된 아미노산 서열(서열번호: 12)을 나타낸다.
도 2는 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 5' 말단의 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 15) 및 유도된 아미노산 서열(서열번호: 16)을 나타낸다.
도 3은 래트 황체 아폽토시스-특이적 eIF-5A 전체 길이 cDNA의 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 1)을 나타낸다. 아미노산 서열은 서열번호: 2에 나타나 있다.
도 4는 래트 아폽토시스-특이적 DHS cDNA의 3' 말단의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호: 6)및 유도된 아미노산 서열(서열번호: 7)을 나타낸다.
도 5는 래트 황체 아폽토시스-특이적 eIF-5A cDNA의 전체-길이 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 20)과 인간 eIF-5A의 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 3)의 정렬이다(수납번호 BC000751 또는 NM_001970, 서열번호: 3).
도 6은 래트 황체 아폽토시스-특이적 eIF-5A cDNA의 전체-길이 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 20)과 인간 eIF-5A의 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 4)의 정렬이다(수납번호 NM_020390, 서열번호: 4).
도 7은 래트 황체 아폽토시스-특이적 eIF-5A cDNA의 전체-길이 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 20)과 마우스 eIF-5A의 뉴클레오타이드 서열(수납번호 BC003889)의 정렬이다. 마우스 뉴클레오타이드 서열(수납번호 BC003889)은 서열번호: 5이다.
도 8은 래트 황체 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 유도된 전체-길이 아미노산 서열(서열번호: 2)과 인간 eIF-5A의 유도된 아미노산 서열(서열번호: 21)(수납번호 BC000751 또는 NM_001970)의 정렬이다.
도 9는 래트 황체 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 유도된 전체-길이 아미노산 서열(서열번호: 2)과 인간 eIF-5A의 유도된 아미노산 서열(서열번호: 22)(수납번호 NM_020390)의 정렬이다.
도 10은 래트 황체 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 유도된 전체-길이 아미노산 서열(서열번호: 2)과 마우스 eIF-5A의 유도된 아미노산 서열(서열번호: 23)(수납번호 BC003889)의 정렬이다.
도 11은 래트 황체 아폽토시스-특이적 DHS cDNA의 일부-길이 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 6의 잔기 1-453)과 인간 DHS의 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 8)(수납번호 BC000333, 서열번호: 8)의 정렬이다.
도 12는 래트 황체 아폽토시스-특이적 eIF-5A cDNA의 32P-dCTP-표지 3'-말단으로 프로브된 총 RNA의 노던 블럿(상단) 및 에티듐 브로마이드 염색된 겔(하단)이다.
도 13은 래트 황체 아폽토시스-특이적 DHS cDNA의 32P-dCTP-표지 3'-말단으로 프로브된 총 RNA의 노던 블럿(상단) 및 에티듐 브로마이드 염색된 겔(하단)이다.
도 14는 과배란된 래트 황체 내 아폽토시스 정도가 PGF-2α로 주입된 후 조사된 DNA 래더링(laddering) 실험을 나타낸다.
도 15는 PGF F-2α로의 래트 처리 후 DNA 래더링을 나타내는 아폽토시스 래트 황체로부터 분리된 게놈 DNA의 아가로스 겔이다.
도 16은 과배란된 래트 황체의 분산된 세포 내 아폽토시스 정도가 PGF-2α에 노출되기 전에 스퍼미딘으로 처리된 래트 내에서 조사된 DNA 래더링 실험을 나타낸다.
도 17은 과배란된 래트 황체 내 아폽토시스 정도가 스퍼미딘 및/또는 PGF-2α로 처리된 래트 내에서 조사된 DNA 래더링 실험을 나타낸다.
도 18은 32P-dCTP-표지된 일부-길이 래트 황체 아폽토시스-특이적 eIF-5A cDNA로 프로브된 래트 게놈 DNA의 서던 블럿이다.
도 19는 pHM6, 포유류 에피토프 태그 발현 벡터(Roche Molecular Biochemicals)를 나타낸다.
도 20은 래트 황체 아폽토시스-특이적 DHS cDNA의 32P-dCTP-표지된 3'-비번역된 구역으로 프로브된 혈청의 철회에 의한 아폽토시스 유도 후 COS-7 세포로부터 분리된 총 RNA의 노던 블럿(상단) 및 에티듐 브로마이드 염색된 겔(하단)이다.
도 21은 COS-7 세포의 일시적 트랜스펙션의 절차를 나타내는 흐름도이다.
도 22는 pHM6로의 트랜스펙션 후 COS-7 세포 내 외부 단백질의 일시적 발현의 웨스턴 블럿이다.
도 23은 소듐 니트로프루사이드의 처리에 의한 정상 섬유아세포 내 아폽토시스 유도가 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 상향-조절함을 나타낸다.
도 24는 RKO 세포로부터 분리된 인간 eIF5A2(서열번호: 24)와 인간 eIF5A2(서열번호: 22)(유전자은행 수납번호 XM_113401)와의 정렬이다. 공통 서열은 서열번호: 28에 나타나 있다.
도 25는 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A(서열번호: 29)의 서열 및 본 발명의 siRNAs의 서열(서열번호: 30, 31, 32, 33 및 34)을 나타낸다.
도 26은 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A(서열번호: 29) 및 본 발명의 3개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 서열(각각 서열번호: 63, 64 및 64)뿐만 아니라 3개의 타겟 폴리뉴클레오타이드 서열(각각 나타낸 순서대로 서열번호: 36,38 및 40)을 나타낸다.
도 27은 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 목적된 3개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드(각각 나타낸 순서대로 서열번호: 25∼27)의 결합 위치를 나타낸 다. 전체-길이의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 19이다.
도 28a 및 b는 인간 증식 eIF-5A에 대한 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 뉴클레오타이드 정렬(각각 나타낸 순서대로 서열번호: 41 및 42) 및 아미노산 정렬(각각 나타낸 순서대로 서열번호: 43 및 22)을 나타낸다.
도 29는 아폽토시스-특이적 eIF5-A1에 대한 siRNA의 디자인을 나타낸다. siRNA는 서열번호: 45, 48, 51, 54 및 57을 지닌다. 전체-길이의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 29에 나타나 있다.
도 30은 eIF5A1 발현이 유전독성 스트레스에 의해 증가됨을 나타낸다. A) 0, 1, 4 및 8시간 동안 0.5 ㎍/ml의 악티노마이신 D로 처리된 정상 결장 섬유아세포 내 eIF5A1의 노던 블럿 분석. B) 0, 1, 4 및 24시간 동안 0.5 ㎍/ml의 악티노마이신 D로 처리된 정상 결장 섬유아세포에서 분리된 세포 용해질의 웨스턴 블럿 분석. 블럿은 eIF5A1, p53 및 β-액틴에 대한 항체로 프로브되었다.
도 31은 eIF5A1이 세포증식에 요구되지 않음을 나타낸다. A) eIF5A1 siRNA로 트랜스펙트된 세포의 대사 활성은 XTT 세포 증식 분석을 이용하여 측정되었다. HT-29 세포는 대조군 siRNA 또는 eIF5A1 siRNA로의 트랜스펙션 24시간 전에 96-웰 플레이트 상에 분주되었다. 트랜스펙션 24시간 후 세포는 대사 활성을 측정하기 전 악티노마이신 D(1.0 ㎍/ml)로 48시간 동안 처리되거나 처리되지 않았다. 수치는 4반복으로 수행된 2회 실험의 평균이고 1로 세팅된 0시간 대조군에 대해 수득된 수치로 표준화되었다. B) 대조군 또는 eIF5A1 siRNA로 트랜스펙트된 HT-29 세포의 증식 활성은 50 μM GC7로 72시간동안 인큐베이트된 세포와 비교되었다. 세포 증식은 BrdU 결합에 의해 측정되었다. 수치는 n=4에 대해 평균 ± SE 이고 1로 세팅된 GC7 (+) 혈청 표본에 대한 수치로 표준화되었다. 별표(*)는 수치가 쌍 Student t-테스트(p < 0.01)에 의해 유의적으로 다른 것으로 간주됨을 나타내다.
도 32는 eIF5A1 기능 및 조절 모델이다. 건강한 세포에서 eIF5A1는 DHS에 의해 하이푸신화되고 세포질에 위치한다. 하이푸신화된 eIF5A1는 일부 알려지지 않은 세포질성 기능을 통해 세포 생장을 지속시킨다. 유전독성 스트레스 또는 사멸 수용체 활성화는 아폽토시스 세포 사멸의 유도 또는 실행에 참여하는 세포핵 내로 eIF5A1의 이동을 자극한다. 유전독성 스트레스에 의해 유도된 아폽토시스 이벤트시 세포핵 eIF5A1은 그의 mRNA의 세포핵 유출을 조절함으로서 p53의 발현을 조절하는 기능을 한다.
도 33은 HA-태그된 eIF5A11이 시험관 내에서 하이푸신화되지 않음을 나타낸다.
도 34는 XTT 세포 증식 분석의 결과를 나타낸다. 본 결과는 아폽토시스-특 이적 eIF-5A(eIF-5A1)에 대한 siRNA가 세포 분열을 저해하지 않음을 나타낸다. 세포 증식 eIF-5A(eIF-5A2)에 대해 지시된 siRNA는 세포 분열을 저해한다.
도 35는 염증 및 아폽토시스에 관련된 다양한 스킴을 나타낸다.
도 36은 일시적 트랜스펙션 후 RKO 및 RKO-E6 세포 내에서 발생한 아폽토시스의 비율을 나타내는 그래프이다. RKO 및 RKO-E6 세포는 pHM6-LacZ 또는 pHM6-아폽토시스-특이적 eIF-5A로 일시적으로 트랜스펙트되었다. 악티노마이신 D로 처리되고 pHM6-아폽토시스-특이적 eIF-5A로 트랜스펙트된 RKO 세포는 악티노마이신 D로 처리되지 않고 pHM6-LacZ로 트랜스펙션된 세포에 비해 아폽토시스의 240% 증가를 나타내었다. 악티노마이신 D로 처리되고 pHM6-아폽토시스-특이적 eIF-5A로 트랜스펙트된 RKO-E6 세포는 악티노마이신 D로 처리되지 않고 pHM6-LacZ로 트랜스펙션된 세포에 비해 아폽토시스의 105% 증가를 나타내었다.
도 37은 일시적 트랜스펙션 후 RKO 세포 내에서 발생한 아폽토시스의 비율을 나타낸 그래프이다. RKO 세포는 pHM6-LacZ, pHM6-아폽토시스-특이적 eIF-5A, pHM6-eIF5A2 또는 pHM6-절제된 아폽토시스-특이적 eIF-5A로 일시적으로 트랜스펙트되었다. pHM6-아폽토시스-특이적 eIF-5A로 트랜스펙트된 세포는 pHM6-LacZ로 트랜스펙트된 대조군 세포에 비해 아폽토시스의 25% 증가를 나타내었다. 이러한 증가는 pHM6-eIF5A2 또는 pHM6-절제된 eIF5A1으로 트랜스펙트된 세포에서는 분명하지 않았다.
도 38은 일시적 트랜스펙션 후 RKO 세포 내에서 발생한 아폽토시스의 비율을 나타낸 그래프이다. RKO 세포는 트랜스펙트되지 않거나 pHM6-LacZ 또는 pHM6-아폽토시스-특이적 eIF-5A로 일시적으로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 효율에 대한 보정 후 pHM6-아폽토시스-특이적 eIF-5A로 트랜스펙트된 세포의 60%가 아폽토시스되었다.
도 39는 일시적 트랜스펙션 후 RKO 세포 아폽토시스의 흐름세포측정 분석 결과를 제공한다. RKO 세포는 트랜스펙트되지 않거나 pHM6-LacZ, pHM6-아폽토시스-특이적 eIF-5A, pHM6-eIF5A2 또는 pHM6-절제된 아폽토시스-특이적 eIF-5A로 일시적으로 트랜스펙트되었다. 표는 각 게이트의 최대점 하의 구역을 기초로 계산된 아폽토시스를 진행하는 세포의 비율을 나타낸다. 트랜스펙트되지 않은 세포 내 배경 아폽토시스 및 트랜스펙션 효율의 보정 후 pHM6-아폽토시스-특이적 eIF-5A로 트랜스펙트된 세포의 80%가 아폽토시스를 나타내었다. pHM6-LacZ, pHM6-eIF5A2 또는 pHM6-절제된 아폽토시스-특이적 eIF-5A로 트랜스펙트된 세포는 단지 배경 수준의 아폽토시스를 나타내었다.
도 40은 RKO 세포가 아폽토시스-특이적 eIF-5A(eIF-5A1) siRNA로 트랜스펙트된 후 악티노마이신 D(세포가 아폽토시스를 진행하도록 유도하는)로 처리되는 실험 결과를 나타낸다. siRNA로 트랜스펙트된 세포는 더 적은 eIF-5A 발현, 더 적은 p53 발현, 더 많은 bcl-2 발현 및 대조군 유전자, 액틴과 동일한 발현 수준을 나타낸다.
도 41은 0, 3, 7, 24 및 48시간 동안 0.25 ㎍/ml의 악티노마이신 D로 처리된 RKO 세포로부터 추출된 단백질의 웨스턴 블럿을 제공한다. 상위 패널은 1차 항체로서 항-p53을 이용한 웨스턴 블럿을 나타낸다. 중앙 패널은 1차 항체로서 항-아폽토시스-특이적 eIF-5A를 이용한 웨스턴 블럿을 나타낸다. 하위 패널은 동일한 로딩을 나타내는 화학발광 검출 후 쿠마시 블루로 염색된 항-아폽토시스-특이적 eIF-5A 블럿에 사용된 멤브레인을 나타낸다. p53 및 아폽토시스-특이적 eIF-5A는 모두 악티노마이신 D 처리에 의해 상향조절된다.
도 42는 안티센스 올리고 1, 2 및 3(아폽토시스-특이적 eIF-5A의)(각각 서열번호: 35, 37 및 39)으로 처리된 후 RKO 세포에 의해 생성된 단백질의 수준을 나타낸다. RKO 세포는 안티센스 아폽토시스-특이적 eIF-5A 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트된 후 p53뿐만 아니라 아폽토시스-특이적 eIF-5A도 덜 생성하였다.
도 43은 eIF5A1이 악티노마이신 D에 반응하여 p53의 발현을 조절함을 나타낸다. RKO 세포는 대조군 siRNA 또는 eIF5A1에 대해 지시된 siRNA로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 72시간 후 세포는 0.5 ㎍/ml 악티노마이신 D로 0, 4, 8 또는 24시간 동안 처리되었다. A) eIF5A1, p53 또는 β-액틴에 대한 항체로 블럿된 세포 용해질의 웨스턴 블럿. 결과는 3회 독립적 실험을 대표한다. B) 대응 액틴 밴드로 표준화된 웨스턴 블럿 내 p53의 상대 강도의 플롯. p53/액틴 강도 비율은 1로 세팅된 0시간 대조군에 대해 수득된 비율로 표준화되었다. 수치는 n=3에 대한 평균 ± SE를 나타낸다. 별표(*)는 수치가 쌍 Student t-테스트(p < 0.05)에 의한 대응 대조군 수치와 유의적으로 다른 것으로 간주됨을 나타낸다.
도 44는 인간 eIF5A1의 과-발현이 아폽토시스를 유도함을 나타낸다. RKO 세포는 pHM6-LacZ 또는 pHM6-eIF5A1로 트랜스펙트되었다. 아폽토시스 세포의 DNA 무사분열 특성을 탐지하기 위해 트랜스펙션 48시간 후 세포는 고정되었고 TUNEL 방법을 이용하여 표지되었다. 아폽토시스 세포의 수는 유식세포측정 분석에 의해 정량화되었다. 수치는 n=3에 대한 평균 ± SE 이다. 별표(*)는 쌍 Student t-테스트(p < 0.01)에 의해 유의적인 차이를 나타낸다.
도 45는 인간 eIF5A1의 과-발현이 p53에 독립적으로 아폽토시스를 유도함을 나타낸다. RKO 세포(A) 또는 RKOE6 세포(B)는 pHM6-LacZ, pHM6-eIF5A1 또는 pHM6-eIF5A1Δ37(C-말단의 37개 아미노산 절단)로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 48시간 후 세포는 고정되었고 TUNEL 방법을 이용하여 표지되었다. 세포핵은 Hoescht 33258로 염색되었고 표지된 세포는 형광 현미경으로 가시화되었다. Hoescht-염색된 세포핵은 총 세포수를 측정하는데 사용되었다. 수치는 n=4(A) 또는 n=3(B)에 대한 평균 ± SE 이다. 별표(*)는 쌍 Student t-테스트(p < 0.02)에 의해 대조군과의 유의적 차이를 나타낸다.
도 46은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트되었을 때 증가된 카스페이즈 활성에 의해 반영된 증가된 아폽토시스를 나타낸다.
도 47은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트되었을 때 증가된 DNA 무사분열에 의해 반영된 증가된 아폽토시스를 나타낸다.
도 48은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트되었을 때 증가된 세포핵 무사분열에 의해 반영된 아폽토시스 검출을 나타낸다.
도 49는 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트되었을 때 증가된 핵 무사분열에 의해 반영된 증가된 아폽토시스를 나타낸다.
도 50은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트되었을 때 포스파티딜세린 노출에 의해 반영된 아폽토시스 검출을 나타낸다.
도 51은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트되었을 때 증가된 포스파티딜세린 노출에 의해 반영된 증가된 아폽토시스를 나타낸다.
도 52는 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트되었을 때 증가된 세포핵 무사분열에 의해 반영된 증가된 아폽토시스를 나타낸다.
도 53은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트되었을 때 증가된 아폽토시스를 나타낸다.
도 54는 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트되었을 때 Bcl-2의 하향-조절을 나타낸다. 상단 사진은 쿠마시-블루-염색된 단백질 블럿이고; 하단의 사진은 상응하는 웨스턴 블럿이다.
도 55는 프로브로서 Bcl-2를 이용하여 안티센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트된 COS-7의 쿠마시-블루-염색된 단백질 블럿 및 상응하는 웨스턴 블럿이다.
도 56은 프로브로서 c-Myc를 이용하여 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙션트된 COS-7의 쿠마시-블루-염색된 단백질 블럿 및 상응하는 웨스턴 블럿이다.
도 57은 프로브로서 p53이 사용될 때 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트된 COS-7의 쿠마시-블루-염색된 단백질 블럿 및 상응하는 웨스턴 블럿이다.
도 58a∼c는 항-[HA]-퍼옥시다제 프로브를 이용한 COS-7 세포 내 pHM6-전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현의 쿠마시-블루-염색된 단백질 블럿 및 상응하는 웨스턴 블럿 및 p53 프로브 사용시 COS-7 세포 내 pHM6-전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현의 쿠마시-블루-염색된 단백질 블럿 및 상응하는 웨스턴 블럿이다.
도 59는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 증식 eIF-5A 둘 모두가 심장 조직 내에서 발현됨을 나타내는 막대그래프이다. 심장 조직은 관상동맥 우회로 이식 술("CABG")을 받은 환자로부터 채취되었다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A(밝은 회색 막대)의 유전자 발현 수준은 증식 eIF-5A(어두운 회색 막대)와 비교되었다. X-축은 환자 식별자 수이다. Y-축은 pg/18s의 ng이다(리보솜 RNA 18S의 나노그램 중의 메신저 RNA의 피코그램).
도 60은 아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 증식 eIF-5A 둘 모두가 심장 조직 내에서 발현됨을 나타내는 막대그래프이다. 심장 조직은 판막 대치술을 받은 환자로부터 채취되었다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A(밝은 회색 막대)의 유전자 발현 수준은 증식 eIF-5A(어두운 회색 막대)와 비교되었다. X-축은 환자 식별자 수이다. Y-축은 pg/18s의 ng이다(리보솜 RNA 18S의 나노그램 중의 메신저 RNA의 피코그램).
도 61은 허혈-전 심장 조직 및 허혈-후 심장 조직 내에서의 증식 eIF-5A(eIF5b) 대비 아폽토시스-특이적 eIF-5A(eIf5a)의 실시간 PCR에 의해 측정된 유전자 발현 수준을 나타낸 막대그래프이다. Y-축은 pg/18s의 ng이다(리보솜 RNA 18S의 나노그램 중의 메신저 RNA의 피코그램).
도 62a∼f는 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 수준과 IL-1β 및 IL18의 수준과 상호 관련된 환자의 데이터를 나타낸다. 도 62a는 관상동맥 우회로 이식술(CABG) 환자로부터 수득된 데이터의 차트이다. 도 62b는 인공판막 대치술 환자로부터 수 득된 데이터의 차트이다. 도 62c는 CABG 환자에서 IL-18에 대한 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 상호 관계를 나타내는 그래프이다. 도 62d는 CABG 환자에서 IL-18에 대한 증식 eIF-5A의 상호 관계를 나타내는 그래프이다. 도 62e는 인공판막 대치술 환자에서 IL-18에 대한 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 상호 관계를 나타내는 그래프이다. 도 62f는 인공판막 대치술 환자에서 IL-18에 대한 증식 eIF-5A의 상호 관계를 나타내는 그래프이다.
도 63∼64는 허혈 이벤트 동안 및 전후의 심장 조직의 수축력의 도표이다. 허혈 후 조직은 허혈-전 조직만큼 많은 수축력을 생성하지 않는다.
도 65는 인간 심근 내 IL-18 위치를 나타낸다
도 66은 허혈/재관류가 인간 심방 조직 내 IL-18의 합성을 유도함을 나타낸다.
도 67은 ICE 저해제(인터루킨-1β 전환 효소)의 존재가 허혈/재관류 손상을 감소시킴을 나타낸다.
도 68은 IL-18BP(IL-18의 내인성 저해제)에 의한 IL-18의 중화는 허혈/재관류 손상을 감소시킴을 나타낸다.
도 69는 TNF-α에 노출시 심장 조직의 수축력의 시간 경과에 따른 감소를 나타낸다.
도 70은 TNF-α 유도된 심근 억제는 IL-18BP에 의해 감소됨을 나타낸다.
도 71은 IL-1β 유도된 심근 억제는 IL-18BP에 의해 감소됨을 나타낸다.
도 72는 크레아틴 키나제 활성(CK)이 IL-1β 및 IL-18의 처리 저해 또는 IL-1β 및 IL-18 활성 저해에 의해 허혈/재관류 증상의 심방 조직 내에 보존됨을 나타낸다.
도 73은 허혈/재관류 후 개략적인 근유세포 손상 및 TNFα 부터 IL-18까지의 연쇄반응을 나타낸다.
도 74는 아폽토시스-특이적 eIF-5A(eIF-5A1)가 증식 eIF-5A(eIF-5A2) 보다 더 많은 함량으로 허혈 심장 조직 내에서 상향-조절됨을 나타낸다.
도 75는 허혈성 및 비-허혈성 심장마비 둘 모두에서 IL-18 발현의 증가가 존재함을 나타낸다.
도 76은 허혈성 및 팽창된 심근병증에서 IL-18의 상대 발현이 정상 심장 조직과 비교시 증가되는 반면 IL-18BP(IL-18의 내인성 저해제)의 발현은 감소됨을 나타낸다.
도 77A 및 B는 형광 표지된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 흡수를 나타낸다.
도 78∼82는 안티센스 아폽토시스-특이적 eIF-5A 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트되지 않은 세포와 비교시 안티센스 아폽토시스-특이적 eIF-5A 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포 내 아폽토시스를 진행하는 세포 비율의 감소를 나타낸다.
도 83은 TNF-α 및/또는 캄포테신으로의 사상판 세포 처리가 아폽토시를 진행하는 세포 수 증가를 유발함을 나타낸다.
도 84 및 85는 안티센스 아폽토시스-특이적 eIF-5A 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트되지 않은 세포와 비교시 안티센스 아폽토시스-특이적 eIF-5A 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포 내 아폽토시스를 진행하는 세포 비율의 감소를 나타낸다.
도 86 A 및 B는 혈청의 존재 또는 부재하에서 표지된 siRNA를 흡수하는 사상판 세포를 나타낸다.
도 87∼89는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트된 사상판 세포가 트랜스펙트되지 않은 세포보다 캄포테신 및 TNF-α에 노출된 후 아폽토시스를 진행하는 세포의 낮은 비율을 지님을 나타낸다.
도 90은 도 89 및 실시예 13에서 설명된 실험으로부터 siRNA로 트랜스펙트되고 캄포테신 및 TNF-α로 처리된 Hoescht-염색된 사상판 세포주 #506의 사진이다. 아폽토시스 세포는 더 밝게 염색된 세포로 나타난다. 이들은 염색질 응축 때문에 더 작은 핵을 지니며 그 형태도 더 작고 불규칙하다.
도 91은 면역형광에 의한 사상판 세포의 특성을 나타낸다. 83세의 남성의 시신경 유두로부터 분리된 사상판 세포(#506)는 면역형광에 의해 나타내었다. 1차 항체는 a) 액틴; (b) 피브로넥틴(fibronection); c) 라미닌(laminin); d) GFAP이었다. 모든 사진은 400배 확대되었다.
도 92는 캄포테신 및 TNF-α의 처리에 반응한 사상판 세포주 #506의 아폽토시스 비율을 나타낸다. 사상판 세포주 #506 세포는 8-웰 배양 슬라이드 위에 웰 당 40,000개의 세포가 분주되었다. 3일 후 합류한 LC 세포는 10 ng/ml TFN-α, 50 μM 캄포테신 또는 10 ng/ml TNF-α와 50 μM 캄포테신 혼합으로 처리되었다. 캄포테신에 대한 용액 대조군으로, 동등한 부피의 DMSO가 처리되지 않은 대조군 세포에 첨가되었다. 세포는 Hoescht 33258로 48시간 동안 염색되었고 UV 필터를 사용하여 형광 현미경에 의해 관찰되었다. 응축되거나 단편화된 핵의 밝게 염색된 세포는 아폽토시스로서 계산되었다.
도 93은 캄포테신 또는 TNF-α와 캄포테신의 혼합으로 처리되는 동안의 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 나타낸다. 사상판 세포 # 506 세포는 24-웰 플레이트에서 웰 당 40,000개의 세포가 분주되었다. 3일 후 LC 세포는 50 μM 캄포테신 또는 10 ng/ml TNF-α와 50 μM 캄포테신 혼합으로 처리되었고 단백질 용해질은 1, 4, 8, 24 시간 후에 채취되었다. 용액 대조군으로서 대조군 세포에 동등한 부피의 DMSO가 첨가되었고 세포 용해질은 1시간 및 24시간 후에 채취되었다. 각 표본으로부터 단백질 5 ㎍이 SDS-PAGE에 의해 분리되었고 PVDF 멤브레인에 옮겨졌고 항-eIF-5A 항체로 웨스턴 블럿되었다. 결합된 항체는 화학발광에 의해 검출되었고 X-레이 필름에 노출되었다. 이후 멤브레인이 제거되었고 내부 로딩 조절로써 항-β-액틴으로 재-블럿되었다.
도 94는 siRNAs로 트랜스펙트된 것을 수반하는 사상판 세포주 #506 및 #517에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 나타낸다. 사상판 세포주 #506 및 #517 세포는 24-웰 플레이트위에 웰 당 10,000개의 세포로 분주되었다. 3일 후 LC 세포는 GAPDH siRNA, 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNAs #1-4(서열번호: 30∼33) 또는 대조군 siRNA #5(서열번호: 34)로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 3일 후 단백질 용해질은 채취되었고 각 표본으로부터 단백질 5 ㎍이 SDS-PAGE에 의해 분리되었고 PVDF 멤브레인으로 옮겨져 항-eIF-5A 항체로 웨스턴 블럿되었다. 결합된 항체는 화학발광에 의해 검출되었고 X-레이 필름에 노출되었다. 이후 멤브레인이 제거되었고 내부 로딩 조절로써 항-β-액틴으로 재-블럿되었다.
도 95는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트되고 TNF-α 및 캄포테신으로 처리된 사상판 세포주 #506세포의 아폽토시스를 나타낸다. 사상판 세포주 #506 세포는 8-웰 배양 슬라이드에서 웰 당 7,500개의 세포로 분주되었다. 3일 후 LC 세포는 GAPCH siRNA, 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNAs#1-4(서열번호: 30∼33) 또는 대조군 siRNA #5(서열번호: 34)로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 72시간 후 트랜스펙트된 세포는 10 ng/ml TFN-α와 50 μM 캄포테신의 혼합으로 처리되었다. 24시간 후 세포는 Hoescht 33258로 염색되었고 UV 필터를 이용하여 형광 현미경에 의해 관찰되었다. 응축되거나 단편화된 핵의 밝게 염색된 세포는 아폽토시스로써 계산되었다. 이러한 그래프는 n=4 독립적 실험의 평균을 나타낸다. 본 도면은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA로 처리된 세포가 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA로 처리되지 않은 세포와 비교시 캄포테신 및 TNF로 처리할 때 더 작은 비율의 아폽토시스를 나타냄을 나타낸다.
도 96은 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA #1로 트랜스펙트되고 TNF-α 및 캄포테신으로 처리된 사상판 세포주 #517 세포의 아폽토시스를 나타낸다. 사상판 세포주 #517 세포는 8-웰 배양 슬라이드에서 웰 당 7,500개의 세포로 분주되었다. 3일 후 LC 세포는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA #1 또는 대조군 siRNA #5로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 72시간 후 트랜스펙트된 세포는 10 ng/ml TFN-α와 50μM 캄포테신의 혼합으로 처리되었다. 24시간 후 세포는 Hoescht 33258로 염색되었고 UV 필터를 이용하여 형광 현미경에 의해 관찰되었다. 응축되거나 단편화된 핵의 밝게 염색된 세포는 아폽토시스로서 계산되었다. 2회 독립적 실험의 결과는 여기에 나타내었다. 이는 siRNA로 처리된 세포가 낮은 비율의 아폽토시스를 지님을 나타낸다.
도 97a∼d는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA #1로 트랜스펙트되고 TNF-α 및 캄포테신으로 처리된 사상판 세포주 #506 세포의 TUNEL-표지를 나타낸다. 사상판 세포주 #506 세포는 8-웰 배양 슬라이드에서 웰 당 7,500개의 세포로 분주되었다. 3일 후 LC 세포는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA #1(서열번호: 30) 또는 대조군 siRNA #5(서열번호: 34)로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 72시간 후 트랜스펙트된 세포는 10 ng/ml TFN-α와 50 μM 캄포테신의 혼합으로 처리되었다. 24시간 후 세포는 Hoescht 33258로 염색되었고 DNA 무사분열은 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개 dUTP-디옥시게닌 틈 말단 표지(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end labeling, TUNEL) 방법을 이용하여 원위치에서 평가되었다. 패널 A는 아폽토시스 세포의 단편화된 DNA의 TUNEL-표지를 가시화하기 위해 형광 필터를 이용한 형광 현미경에 의해 관찰된 슬라이드를 나타낸다. 패널 B는 Hoescht-염색된 핵을 가시화하기 위해 UV 필터를 통해 관찰된 동일한 슬라이드를 나타낸다. 그 결과는 2회 독립적인 실험을 대표한다. 모든 사진은 400배 확대되었다.
도 98은 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙션된 세포가 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질을 더 적게 생산하고 또한 Bcl-2 단백질을 더 많이 생산함을 나타낸다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현의 감소는 BCL-2 발현의 증가와 상호 관련이 있다.
도 99는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRAN로 트랜스펙트된 세포가 아폽토시스 인자 5a 단백질을 더 적게 생산함을 나타낸다.
도 100은 아폽토시스-특이적 eIF-5A 세포로 트랜스펙트된 HepG2 세포에 노출된 IL-1이 비-트랜스펙트된 세포보다 더 적은 TNF-α를 분비함을 나타낸다.
도 101a는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNAs가 억제되지 않은 경우 트랜스펙트된 HT-29 세포 내의 TNF-α의 생성을 억제한 웨스턴 블럿의 도면을 나타 낸다. 도 100b는 ELISA의 결과를 나타낸다.
도 102는 ELISA의 결과를 나타낸다. TNF-α 생성은 대조군 세포와 비교시 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNAs로 처리된 세포에서 감소되었다.
도 103은 IL-8이 인터페론에 반응할 뿐 아니라 TNF-알파에도 반응하여 생성됨을 나타내는 막대그래프이다. 이러한 그래프는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA가 인터페론 및 TNF의 결합된 처리 결과로써 생성된 IL-8의 유의적인 함량뿐만 아니라 인터페론에 반응하여 생성된 대부분의 IL-8을 차단함을 나타낸다.
도 104는 IL-8이 인터페론에 반응할 뿐 아니라 TNF-알파에도 반응하여 생성됨을 나타내는 또다른 막대그래프이다. 이러한 그래프는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA가 인터페론 및 TNF의 결합된 처리 결과로써 생성된 IL-8의 유의적인 함량뿐만 아니라 인터페론에 반응하여 생성된 대부분의 IL-8을 차단함을 나타낸다.
도 105는 8시간 및 24시간 동안 IFN 감마로 처리된 HT-29 세포의 웨스턴 블럿을 나타낸다. 이러한 블럿은 인터페론 감마에 반응하여 HT-29 세포 내의 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 상향-조절(8 시간에서 4배)을 나타낸다.
도 106은 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNA가 인터페론 감마 및 LPS의 존재시 NKkB 활성화의 감소를 제공하는 실험 결과를 나타낸다.
도 107은 대조군 siRNA 또는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트된 HT-29 세포 유래의 세포 용해질의 웨스턴 블럿을 나타낸다. 본 도면은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA가 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현을 저해함을 나타낸다. HT-29 세포는 트랜스펙션 48시간 후 인터페론 감마로 프라임되었다. 인터페론 감마 프리이밍 16시간 후 세포는 LPS로 8 또는 24시간 동안 처리되었다. 용해질이 채취되고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 eIF5A에 대한 항체(BD Bioscience Laboratories)로 블럿되었다.
도 108은 아폽토시스-특이적 siRNA로 트랜스펙트된 HT-29 세포가 감소된 수준의 TNF 생성을 지님을 나타낸다. 트랜스펙트되지 않은 [(-)siRNA] 또는 트랜스펙트된 HT-29 세포는 트랜스펙션 48시간 후 인터페론 감마로 프라임되었다. 인터페론 감마 프리이밍 16시간 후 세포는 LPS로 8 또는 24시간 동안 처리되었다. 프라임되었으나 LPS를 수용하지 않은 세포는 배지 교환되었다. 배지는 세포에서 제거되었고 세포는 TNFα ELISA(Assay Designs)에 의해 분석될 때까지 -20℃에서 보관되었다. 세포 용해질이 채취되었고 단백질 농도는 BCA 단백질 정량 키트를 사용하여 측정되었 세포수를 보정하는데 사용되었다.
도 109는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트된 HT-29 세포가 대조군 세포와 비교시 아폽토시스의 감소를 나타냄을 나타낸다. 대조군과 siRNA-트랜스펙트된 세포 모두는 인터페론 감마로 프라임되었고 TNF-α로 처리되었다. 트랜스펙트된 HT-29 세포는 트랜스펙션 48시간 후 인터페론 감마로 프라임되었다. 인터페론 감마 프라이밍 16시간 후 세포는 TNFα로 24시간 동안 처리되었다. 아폽토시스는 고정 세포의 Hoescht 염색 및 TUNEL 표지에 의해 검출되었다.
도 110은 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트된 HT-29 세포가 대조군 세포보다 더 적은 TLR4 단백질을 발현함을 나타낸다. 트랜스펙션 48시간 후 HT-29 세포는 HT-29 세포는 8 또는 24시간 동안 인터페론 감마로 프라임되었다. 세포 용해질이 채취되고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 TLR4에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology)로 블럿되었다. 이후 블럿은 스트라이프(strip)되고 β-액틴(Oncogene)에 대한 항체로 블럿되었다.
도 111은 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트된 HT-29 세포가 대조군 세포보다 더 적은 TNFR1 단백질을 발현함을 나타낸다. 트랜스펙션 48시간 후 HT-29 세포는 HT-29 세포는 0 또는 8시간 동안 인터페론 감마로 프라임되었다. 세포 용해질이 채취되고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 TNF-R1에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology)로 블럿되었다. 이후 블럿은 스트라이프(strip)되고 β-액틴(Oncogene)에 대한 항체로 블럿되었다.
도 112는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트된 HT-29 세포가 대조군 세포보다 더 적은 iNOS 단백질을 발현함을 나타낸다. 트랜스펙션 48시간 후 HT-29 세포는 HT-29 세포는 24시간 동안 인터페론 감마로 프라임되었다. 세포 용해질이 채취되고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 iNOS에 대한 항체(BD Transduction Laboratories)로 블럿되었다. 이후 블럿은 스트라이프(strip)되고 β-액틴(Oncogene)에 대한 항체로 블럿되었다.
도 113은 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트된 HT-29 세포가 대조군 세포보다 더 적은 TLR4 mRNA를 발현함을 나타낸다. 트랜스펙션 48시간 후 HT-29 세포는 6시간 동안 인터페론 감마로 처리되거나 처리되지 않았다. 총 mRNA가 분리되고 RT-PCR용 주형으로 사용되었다. RT-PCR은 TLR4 및 GAPDH에 대한 프라이머를 이용하여 수행되었다.
도 114는 IFN-γ 및 LPS에 노출된 HT-29 세포 내에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA로의 트랜스펙션은 NFκB p50 활성화 및 TNF-α 생성의 감소를 유발함을 나타낸다.
도 115는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA는 HT-29 세포 내 내인성 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 억제함을 나타낸다. HT-29 세포는 트랜스펙 션 2일 후 인터페론 감마로 0 또는 24시간 동안 처리되었다. 용해질이 채취되고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨졌고 eIF5A에 대한 항체(BD Bioscience Laboratories)로 블럿되었다. 이후 멤브레인은 스트라이프되었고 β-액틴에 대한 항체(Oncogene)으로 블럿되었다.
도 116은 HT-29 세포 내에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA-매개 억제가 IFN-γ에 반응한 IFN-γ 수용체-α 축적을 감소시킴을 나타낸다. HT-29 세포는 트랜스펙션 2일 후 인터페론 감마로 0시간, 4시간, 8시간 또는 24시간 동안 처리되었다. 용해질이 채취되고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨졌고 IFN-γRα에 대한 항체(C-20; Santa Cruz Biotechnology Inc.; 1:1000)로 블럿되었다. 이후 멤브레인은 스트라이프되었고 β-액틴에 대한 항체(Oncogene)으로 블럿되었다.
도 117은 HT-29 세포 내에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA-매개 억제가 IFN-γ에 반응하여 Toll 수용체 4(Toll Receptor 4, TLR4) 축적을 감소시킴을 나타낸다. HT-29 세포는 트랜스펙션 2일 후 인터페론 감마로 0시간, 4시간, 8시간 또는 24시간 동안 처리되었다. 용해질이 채취되고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨졌고 TLR4에 대한 항체(H-80; Santa Cruz Biotechnology Inc.; 1:250)로 블럿되었다. 이후 멤브레인은 스트라이프되었고 β-액틴에 대한 항체(Oncogene)으로 블럿되었다. 이는 IFN-γRα에 사용된 멤브레인과 동일하므 로 액틴 블럿은 도 2 및 3과 동일하다.
도 118은 HT-29 세포 내에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA-매개 억제가 IFN-γ에 반응하여 JAK1 및 STAT1 인산화를 감소시킴을 나타낸다. HT-29 세포는 트랜스펙션 2일 후 인터페론 감마로 0분, 20분, 1시간 또는 4시간 동안 처리되었다. 용해질이 채취되고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨졌고 pJak1[pJak1 (Tyr 1022/1023); Santa Cruz Biotechnology Inc.; 1:500]로 블럿되었다. 이후 멤브레인은 스트라이프되었고 Tyr 701 인산화된 Stat1 α p91을 검출하는 STAT1에 대한 항체[pSTAT1(Tyr 701); Santa Cruz Biotechnology Inc.; 1:1000]로 블럿되었다.
도 119는 eIF5A1의 면역형광 위치를 나타낸다. IFN-γ 및 TNF-α(A) 또는 악티노마이신 D(B)로 자극된 HT-29 세포 내 eIF5A1 단백질의 하위세포 위치는 간접적 면역형광으로 측정되었다. A) HT-29 세포는 비처리되거나(ⅰ) 또는 TNF-α로 0분(ⅱ), 10분(ⅲ), 30분(ⅳ), 90분(ⅴ) 또는 8시간(ⅵ) 동안 자극되기 전 IFN-γ로 16시간 동안 프라임되었다. B) HT-29 세포는 비처리되거나(ⅰ) 악티노마이신 D로30분(ⅱ), 90분(ⅲ), 4시간(ⅳ), 8시간(ⅴ) 또는 16시간(ⅵ) 동안 처리되었다. 모든 사진은 400 X 배율로 촬영되었다. 결과는 3회 독립적 실험을 대표한다.
도 120은 PBMC 실험의 시간 경과를 나타낸다(실시예 18).
도 121은 시간 경과에 따른 2명의 제공자로부터 수집된 PBMC 유래의 세포 용해질의 웨스턴 블럿을 나타낸다. PBMC는 PMA로 처리된 후 LPS로 자극되어 증가된 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현을 지닌다. PBMC는 PMA(100 ng/ml) 및 LPS(100 ng/ml)로 자극되었다. 세포 용해질이 채취되고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 eIF5A에 대한 항체(BD Bioscience Laboratories)로 블럿되었다. 이후 블럿은 스트라이프되고 β-액틴(Oncogene)에 대한 항체로 블럿되었다. PMA의 첨가는 대식세포 분화를 유도한 반면 LPS의 첨가는 TNF를 생성하는 대식세포를 유도하였다.
도 122는 PMA로 처리된 후 LPS로 자극된 PBMC가 증가된 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현을 지니고, 이는 증가된 TNF 생성과 일치함을 나타낸다.
도 123은 PBMC가 PMA 분화 없이 LPS에 반응함을 증명한다. 좌측의 번호는 제공자 정보 자료에 상응한다. 세포 용해질이 채취되고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 eIF5A에 대한 항체(BD Bioscience Laboratories)로 블럿되었다. 아폽토시스-특이적 eIF5A 발현의 총 수준은 정제된 PBMC 내에서 증가되기 시작하였으나 첫 번째 자극 24시간 후 이내에 최대치가 된 후 감소되었다. 이러한 실험은 PCMC가 PMA 분화 없이 LPS에 반응함을 입증하였다.
도 124는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트된 PBMC가 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현 억제를 입증함을 나타낸다. 좌측 번호는 제공자 정보 자료에 상응한다. 트랜스펙션 72시간 후 PBMC는 LPS로 24시간 동안 처리되었다. 배지 및 세포 용해질이 채취되고 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 eIF5A에 대한 항체(BD Bioscience Laboratories)로 블럿되었다. 이후 블럿은 스트라이프되고 β-액틴(Oncogene)에 대한 항체로 블럿되었다. 억제 수준은 트랜스펙션 효율에 의해 측정되었다. 또한 상기 블럿은 총 eIF5A 발현(즉, 아폽토시스-특이적 eIF5A 및 증식 eIF5A 모두)을 나타낸다.
도 125는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 트랜스펙트되고 LPS로 자극된 PBMC가 아폽토시스-특이적 eIF-5A로 트랜스펙트되지 않은 PBMC보다 더 적은 TNF를 생성함을 나타낸다. PBMC는 Percoll 기울기 분리에 의해 신선하게 제공된 혈액에서 수집되고 측정되고 siRNA로 트랜스펙트되었다. 72시간 후(eIF5A의 고갈에 요구되는 시간) 세포는 24시간 동안 100 ng/ml LPS의 첨가에 의해 자극되었다. 분비된 TNF는 ELISA로 정량화되고 총 세포 단백질에 대해 계산되었다. 상기 도표는 본 실험의 각 제공자 표본 내 TNF 생성 감소 비율을 나타낸다.
도 126은 U-937 분화 실험의 시간 경과를 나타낸다. 실시예 16 참조.
도 127은 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 단핵세포 분화 및 뒤이은 TNF-α 분비 동안 상향-조절됨을 나타내는 웨스턴 블럿의 결과를 나타낸다.
도 128은 U937 처리에 대한 시간 경과를 나타낸다. 세포는 일렉트로포레이션에 의해 siRNA로(아폽토시스-특이적 eIF-5A 또는 대조군 siRNA)로 트랜스펙트되었다. 단핵세포는 48시간 동안 PMA(100 ng/ml)로의 처리에 의해 부착성 대식세포로 분화되었다. 48시간에 배지 교환은 세포가 정지되게 하였다. 72시간에 LPS(100 ng/ml), IFNγ(10 단위/ml) 도는 둘 모두가 첨가되었다. 표본은 나타난 바와 같이 채취되었다.
도 129는 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 U937 세포 내에서 PMA로 상향조절됨을 나타낸다. U937 세포는 대조군 siRNA로 일렉트로포레이트되었다. 16시간 후 PMA(100 ng/ml)가 첨가되었고 세포는 0시간(PMA 첨가 전), 24시간, 48시간 및 72시간에 채취된 표본으로 37℃에서 인큐베이트되었다. 표본(5 ㎍)은 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 eIF5A 함량 및 액틴에 대한 웨스턴 블럿팅으로 분석되었다. U937 세포는 시간 경과에 따라 현탁액 내 단핵세포에서 부착성 대식세포로 분화되었다. 부착의 초기 단계는 PMA로의 6시간 후 두드러졌다.
도 130은 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 U937 세포 내에서 LPS로 상향조절됨을 나타낸다. U937 세포는 대조군 siRNA로 일렉트로포레이트되고, PMA(100 ng/ml)로 대식세포로 분화되고, 72시간에 LPS 첨가 전 정지되었다. 설명을 위해 도 105 내 시간 경과 스킴을 참조. LPS(100 ng/ml)가 정지 대식세포에 첨가되었고 표본은 첨가 전 및 37℃에서의 24시간 인큐베이션 후 채취되었다. 표본(5 ㎍)은 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 eIF5A 함량 및 액틴(로딩 대조군)에 대한 웨스턴 블럿팅으로 분석되었다.
도 131은 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질 발현이 siRNA 처리 수 시간 후에도 감소됨을 나타낸다. U937 세포는 eIF5A1(5) 또는 대조군(C) siRNA로 일렉트로포레이트되었다. 16시간 후 PMA(100 ng/ml)이 첨가되었고 세포는 부착성 대식세포로 분화되고 72시간에 LPS(100 ng/ml) 첨가 전 정지되었다. 세포는 LPS 첨가전(시간 0), 첨가 3시간, 6시간 및 24시간 후 채취되었다. 설명을 위해 도 105 내 시간 경과 스킴을 참조. 표본(5 ㎍)은 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 eIF5A 함량 및 액틴(로딩 대조군)에 대한 웨스턴 블럿팅으로 분석되었다.
도 132는 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA 매개 하향-조절이 TLR4의 감소와 일치함을 나타낸다. U937 세포는 아폽토시스-특이적 eIF-5A("eIF5A1") 또는 대조군 siRNA으로 일렉트로포레이트되었다. 16시간 후 PMA(100 ng/ml)이 첨가되었고 세포는 부착성 대식세포로 분화되고 IFNγ(100 단위/ml)로의 6시간 인큐베이션 전 정지되었다. 설명을 위해 도 105 내 시간 경과 스킴을 참조. 표본(5 ㎍)은 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 TLR4 함량 및 액틴 (로딩 대조군)에 대한 웨스턴 블럿팅으로 분석되었다.
도 133은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA 매개 하향-조절이 U937 세포 내의 적게 당화된 형태의 인터페론 감마 수용체와 일치함을 나타낸다. U937 세포는 eIF5A1 또는 대조군 siRNA으로 일렉트로포레이트되었다. 16시간 후 PMA(100 ng/ml)이 첨가되었고 세포는 부착성 대식세포로 분화되고 IFNγ(100 단위/ml)로의 6시간 인큐베이션 전 정지되었다. 설명을 위해 도 105 내 시간 경과 스킴을 참조. 표본(5 ㎍)은 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 IFNγ-Rα 함량 및 액틴(로딩 대조군)에 대한 웨스턴 블럿팅으로 분석되었다.
도 134는 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA 매개 하향-조절이 U937 세포 내의 TNFR1의 감소와 일치함을 나타낸다. U937 세포는 eIF5A1 또는 대조군 siRNA으로 일렉트로포레이트되었다. 16시간 후 PMA(100 ng/ml)이 첨가되었고 세포는 부착성 대식세포로 분화되고 IFNγ(100 단위/ml)로의 6시간 인큐베이션 전 정지되었다. 설명을 위해 도 105 내 시간 경과 스킴을 참조. 표본(5 ㎍)은 SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨지고 TNF-R1 함량 및 액틴(로딩 대조군)에 대한 웨스턴 블럿팅으로 분석되었다.
도 135는 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA 매개 하향-조절이 U937 세포 내의 LPS-유도된 TNF-α 생성의 감소와 일치함을 나타낸다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A("eIF5A1")의 siRNA-매개 하향조절은 U937 내 LPS-유도된 TNFα 생성의 감소와 일치한다. U937 세포는 eIF5A1 또는 대조군 siRNA으로 일렉트로포레이트되었다. 16시간 후 PMA(100 ng/ml)이 첨가되었고 세포는 부착성 대식세포로 분화되고 LPS(100 ng/ml) 첨가 전 정지되었다. 표본은 LPS 첨가 전 및 첨가 3시간 후 채취되었다. 설명을 위해 도 105 내 시간 경과 스킴을 참조. 분비된 TNFα는 ELISA로 정량화되었고 총 세포 단백질에 대해 보정되었다. 결과는 2회 독립적 실험의 특성을 나타낸다.
도 136은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA 매개 하향-조절이 U937 세포 내의 LPS-유도된 IL-1β 생성의 감소와 일치함을 나타낸다. U937 세포는 eIF5A1 또는 대조군 siRNA으로 일렉트로포레이트되었다. 16시간 후 PMA(100 ng/ml)이 첨가되었고 세포는 부착성 대식세포로 분화되고 LPS(100 ng/ml)+/-IFNγ(100 단위/ml) 첨가 전 정지되었다. 표본은 LPS 또는 LPS와 IFNγ 첨가 전 및 첨가 24시간 후 채취되었다. 설명을 위해 도 105 내 시간 경과 스킴을 참조. 분비된 IL-1β는 액상 전기화학발광(ECL)으로 정량화되었고 총 세포 단백질에 대해 보정되었다.
도 137은 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA 매개 하향-조절이 U937 세포 내의 LPS-유도된 IL-8 생성의 감소와 일치함을 나타낸다. U937 세포는 eIF5A1 또는 대조군 siRNA으로 일렉트로포레이트되었다. 16시간 후 PMA(100 ng/ml)이 첨가되었고 세포는 부착성 대식세포로 분화되고 LPS(100 ng/ml) 및/또는 IFNγ(100 단 위/ml) 첨가 전 정지되었다. 표본은 LPS 또는 LPS와 IFNγ 첨가 전 및 첨가 24시간 후 채취되었다. 설명을 위해 도 105 내 시간 경과 스킴을 참조. 분비된 IL-8은 액상 전기화학발광(ECL)으로 정량화되었고 총 세포 단백질에 대해 보정되었다.
도 138은 IL-6 생성이 U937 세포 내의 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA 매개 하향-조절과 관계없음을 나타낸다. U937 세포는 eIF5A1 또는 대조군 siRNA으로 일렉트로포레이트되었다. 16시간 후 PMA(100 ng/ml)이 첨가되었고 세포는 부착성 대식세포로 분화되고 LPS(100 ng/ml) 및/또는 IFNγ(100 단위/ml) 첨가 전 정지되었다. 표본은 LPS 또는 LPS와 IFNγ 첨가 전 및 첨가 24시간 후 채취되었다. 설명을 위해 도 105 내 시간 경과 스킴을 참조. 분비된 IL-6은 액상 전기화학발광(ECL)으로 정량화되었고 총 세포 단백질에 대해 보정되었다.
도 139는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNA의 정맥내 전달은 혈청 내 TNF-α 수치의 감소를 유발함을 나타낸다.
도 140은 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNA의 비강통과 전달은 폐 내 TNF-α 수치의 감소를 유발함을 나타낸다.
도 141은 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNA의 비강통과 전달은 폐 내 MIP-1 수치의 감소를 유발함을 나타낸다.
도 142는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNA의 비강내 전달은 IL-α 수치의 감소를 유발함을 나타낸다.
도 143은 마우스가 LPS 및 eIF-5A1 siRNA를 비강내로 수용한 후 대조군 siRNA를 수용한 마우스보다 감소된 골수세포형과산화효소 활성을 지님을 나타낸다.
도 144는 흉선세포의 비강-LPS-유도된 소실이 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로의 전-처리에 의해 차단됨을 나타낸다.
도 145는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA의 비강내 전달 실험의 시간 경과를 나타낸다. 50 ㎍의 siRNA는 1 mg/ml 농도로 마우스에 전달되었다. 75 ㎍의 LPS는 1 mg/ml의 농도로 전달되었다. 50 ㎍의 siRNA는 대조군 마우스에 사용되었다.
도 146은 흉선세포의 비강-LPS-유도된 소실이 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로의 전-처리에 의해 차단됨을 나타낸다.
도 147은 eIF-5A에 대한 siRNA가 IL-6, IFN-γ 및 Il-1α의 생성을 감소시킴 을 나타낸다.
도 148은 eIF-5A에 대한 siRNA이 LPS로의 처리 결과로서 TNFα의 발현을 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 상단 패널은 원자료를 나타내고 하단 패널은 막대그래프 내 데이터를 나타낸다.
도 149는 패혈증성 Balb/C 마우스가 다른 농도의 siRNA 및 다른 시간으로 처리된 실험 결과를 나타낸다.
도 150은 다른 포맷의 도 133 결과를 나타낸다.
도 151은 패혈증성 C57BL/6 마우스가 다른 농도의 siRNA 및 다른 시간으로 처리된 실험 결과를 나타낸다.
도 152는 다른 포맷의 도 151의 결과를 나타낸다.
도 153∼155는 Balb/C 마우스의 결합된 패혈증 생존율 연구 결과를 나타낸다. 본 연구는 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 수용한 마우스가 대조군 마우스보다 더 오래 생존함을 나타낸다.
도 156∼158은 C57BL/6 마우스의 결합된 패혈증 생존율 연구 결과를 나타낸다. 본 연구는 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 수용한 마우스가 대조군 마우스보다 더 오래 생존함을 나타낸다.
도 159는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 처리된 동물이 더 우수한 생존 기회를 지님을 나타내는 패혈증 연구를 요약하였다.
도 160은 패혈증 마우스 모델(각각 나타낸 순서대로 서열번호: 96∼98)에 사용된 siRNA의 컨스트럭트를 나타낸다.
도 161은 대조군 siRNA로 처리된 종양 및 비-종양(건강한) 조직의 사진이고, 이는 암조직 내에서 아폽토시스가 거의 존재하지 않거나 전혀 존재하지 않음을 나타낸다.
도 162∼170은 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA로 처리된 종양 내에서 강한 아폽토시스가 존재하나 비-종양 조직에서는 존재하지 않음을 나타낸다. 다양한 조직이 나타나 있다(도 167내 신장, 도 168 내 간, 도 169 내 심장, 도 170 내 비장).
도 171은 전신 주입된 ad5orioP.루시페라제가 비강인두 제노그래 프(xenograph) 종양 내에서 선택적으로 발현됨을 입증하는 그래프를 나타낸다.
도 172는 ad5orioP.eIF-5A1이 2회 세포 분열 이내에 비강인두 암세포(C666-1)의 98%를 선택적으로 살생함을 나타낸다.
도 173은 암세포가 마우스 내로 주입되고 폐암 발달을 유발한 실험 결과를 나타낸다. eIF-5A로 주입된 마우스는 대조군 마우스와 비교시 암세포 양의 감소를 나타내었다.
도 174는 아폽토시스-특이적 eIF-5A로 처리된 암성 폐 조직이 아폽토시스-특이적 eIF-5A로 처리되지 않은 대조군 폐와 비교시 암조직 양의 감소를 나타냄을 나타낸다.
도 175는 폐암 식험에 사용된 폐 중량을 나타낸다.
도 176은 줄기세포 분화 및 사이토카인 생성을 저해하기 위한 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA의 이용을 나타낸다.
도 177은 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA가 COX-2의 LPS-유도된 상향-조절을 저해함을 나타낸다.
도 178은 eIF-5A1이 VEGF 발현을 하향-조절할 수 있는 실험 결과를 나타낸다.
도 179는 활액 육종 세포주 내 과-발현하는 아폽토시스-특이적 eIF-5A이 종양 세포에 의한 VEGF의 생성을 감소시킴을 나타낸다.
(실시예 1)
DNA 래더링에 의한 래트 황체 내 아폽토시스의 시각화
아폽토시스의 정도는 DNA 래더링에 의해 측정되었다. 게놈 DNA는 제조사의 지시에 따라 QIAamp DNA Blood Kit(Qiagen)을 이용하여 분산된 황체 세포 및 절제된 황체 조직으로부터 분리되었다. 황체 조직은 PGF-2α로의 처리에 의한 아폽토시스의 유도 전, 아폽토시스의 유도 처리 1 및 24시간 후 절제되었다. 분리된 DNA는 30분간 실온에서 500 ng의 DNA를 0.2 μCi[α-32P]dCTP, 1 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 3 유니트의 Klenow 효소 및 각각 0.2 pM의 dATP, dGTP 및 dTTP와 함께 인큐 베이트함으로서 말단-표지되었다. 도입되지 않은 뉴클레오타이드는 Sambrook et al.에 따라 표본을 1 ml의 Sepadex G-50 컬럼을 통해 통과시킴으로서 제거되었다. 이후 표본은 Tris-아세테이트-EDTA(1.8%) 겔 전기영동에 의해 분해되었다. 겔은 실온에서 진공상태로 30분간 건조되었고 24시간 동안 -80℃에서 x-선 필름에 노출되었다.
하나의 실험에서 과배란된 래트 황체 내 아폽토시스의 정도는 PGF-2α로의 주사 0, 1 또는 24시간 후에 조사되었다. 0시간의 대조군에서 난소는 PGF-2α 주사없이 제거되었다. 아폽토시스에 관련된 뉴클레아제 활성을 반영하는 낮은 분자량의 DNA 단편의 래더링은 PGF-2α로의 처리 전 절제된 대조군 황체 조직 내에서는 뚜렷하지 않으나 아폽토시스 유도 1시간 후에서는 식별할 수 있고 도 14에 나타난 아폽토시스 유도 24시간 후에서 판명된다. 본 도면에서 상위 패널은 래트 황체 아폽토시스-특이적 DHS cDNA의 32P-dCTP-표지된 3'-비번역 구역으로 프로부된 노던 블럿의 방사능사진이다. 하위 패널은 총 RNA의 에티듐 브로마이드 염색된 겔이다. 각 레인은 10 ㎍의 RNA를 포함한다. 데이터는 혈청 철회 후 아폽토시스-특이적 eIF-5A 전사체의 하향조절이 있음을 나타낸다.
또다른 실험에서 상응하는 대조군 동물은 PGF-2α 대신 식염수로 처리되었다. 식염수 또는 PGF-2α로의 처리 15분 후 황체는 동물로부터 제거되었다. 게 놈 DNA는 동물로부터의 조직의 제거 3시간 및 6시간 후 황체로부터 분리되었다. 게놈 DNA의 DNA 래더링 및 증가된 말단 표지는 PGF-2α-처리된 동물로부터의 조직 제거 6시간 후에서 뚜렷하나 조직 제거 3시간 후에는 그렇지 않다. 도 15 참조. 아폽토시스를 반영하는 DNA 래더링도 황체가 PGF-2α로의 처리 15분 후 처리될 때 뚜렷하고 EBSS(Gibco) 내 시험관 내 조건 하에서 6시간 동안 유지된다. 아폽토시스와 관련된 뉴클레아제 활성도 게놈 DNA의 더욱 광범위한 말단 표지로부터 뚜렷하다.
또다른 실험에서 과배란은 500 ㎍의 PGF-2α으로의 피하 주사에 의해 유도되었다. 대조군 래트는 등량의 식염수로 처리되었다. 15∼30분 후 난소가 제거되었고 콜라게나제로 분해되었다. PGF-2α로 처리된 래트로부터의 분산된 세포는 10 mM 글루타민 + 10 mM 스퍼미딘 내에서 1시간 동안, 스퍼미딘 없이 10 mM 글루타민 내에서 추가 5시간 동안(레인 2) 또는 10 mM 글루타민 + 10 mM 스퍼미딘 내에서 1시간 동안, 10 mM 글루타민 + 1 mM 스퍼미딘 내에서 추가 5시간 동안(레인 3) 인큐베이트되었다. 식염수로 처리된 래트로부터의 대조군 세포는 콜라게나제로 분산되었고 글루타민만으로 1시간 및 5시간 더 인큐베이트되었다(레인 1). 각 표본으로부터의 DNA의 500 ng이 Klenow 효소를 이용하여 [α-32P]-dCTP로 표지되었고, 1.8%의 아가로스 겔 상에서 분리되었고 24시간 동안 필름에 노출되었다. 결과는 도 16에 나타나 있다.
또다른 실험에서 과배란된 래트는 1 mg 스퍼미딘/100 g 체중으로 피하 주사되었고 500 ㎍의 PGF-2α으로의 피하 주사 24, 12 및 2시간 전에 0.333 mg/100 g 체중의 3 동일 투여량으로 전달되었다. 대조군 래트는 3 세트로 분리되었다 : 주사 없음; PGF-2α없이 스퍼미딘의 3회 주사; 및 PGF-2α처리 전 동일한 부피의 식염수 3회 주사. 난소는 프로스타글란딘 처리 1시간 35분 또는 3시간 45분 후 래트로부터 제거되었고 DNA 분리에 사용되었다. 각 표본으로부터의 500 ng의 DNA는 Klenow 효소를 이용하여 [α-32P]-dCTP로 표지되었고, 1.8%의 아가로스 겔 상에서 분리되었고 24시간 동안 필름에 노출되었다(도 17 참조): 레인 1, 주사 없음(동물은 레인 3-5와 동일한 시간에 희생되었음); 레인 2, 스퍼미딘 3회 주사(동물은 레인 3-5와 동일한 시간에 희생되었음); 레인 3, 식염수 3회 주사 후 PGF-2α 주사(동물은 PGF-2α처리 1시간 35분 후 희생되었음); 레인 4, 스퍼미딘 3회 주사 후 PGF-2α 주사(동물은 PGF-2α처리 1시간 35분 후 희생되었음); 레인 5, 스퍼미딘 3회 주사 후 PGF-2α 주사(동물은 PGF-2α처리 1시간 35분 후 희생되었음); 레인 6, 스퍼미딘 3회 주사 후 PGF-2α 주사(동물은 PGF-2α처리 3시간 45분 후 희생되었음); 레인 7, 스퍼미딘 3회 주사 후 PGF-2α 주사(동물은 PGF-2α처리 3시간 45분 후 희생되었음).
RNA 분리
총 RNA는 아폽토시스의 PGF-2α유도 후 다양한 시간에 래트로부터의 황체 조직으로부터 분리되었다. 간단하게는, 조직(5 g)은 액체 질소 내에서 분쇄되었다. 분쇄된 분말은 30 ml의 구아니디늄 완충액(4 M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 2.5 mM NaOAc pH 8.5, 0.8% β-멀캅토에탄올)과 혼합되었다. 혼합물은 4겹의 Miracloth를 통해 여과되었고 30분간 4℃에서 10,000g로 원심분리되었다. 상청액은 20시간 동안 11,200 g로 염화세슘 밀도 변화(gradient) 원심분리되었다. 펠렛된 RNA는 75% 에탄올로 세척되었고 600 ml의 DEPC-처리된 물에 재현탁되었고 RNA는 -70℃에서 1.5 ml의 95% 에탄올 및 60 ml의 3 M NaOAc로 침전되었다.
게놈 DNA 분리 및 래더링
게놈 DNA는 제조사의 지시에 따라 QIAamp DNA Blood Kit(Qiagen)를 이용하여 추출된 황체 조직 또는 분산된 황체 조직으로부터 분리되었다. DNA는 30분간 실온에서 500 ng의 DNA를 0.2 μCi[α-32P]dCTP, 1 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 3 유니트의 Klenow 효소 및 각각 0.2 pM의 dATP, dGTP 및 dTTP와 함께 인큐베이트함으로서 말단-표지되었다. 도입되지 않은 뉴클레오타이드는 Maniatis et al.에 따라 표본을 1 ml의 Sepadex G-50 컬럼을 통해 통과시킴으로서 제거되었다. 이후 표본은 Tris-아세테이트-EDTA(2%) 겔 전기영동에 의해 해상되었다. 겔은 실온에서 진공 상태로 30분간 건조되었고 24시간 동안 -80℃에서 x-선 필름에 노출되었다.
플라스미드 DNA 분리, DNA 서열분석
Sambrook et al., 상동에서 기술된 알칼리성 용해 방법이 플라스미드 DNA를 분리하는데 사용되었다. 전체-길이 양성 cDNA 클론은 다이디옥시 서열분석 방법을 이용하여 서열분석되었다. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467. 오픈 리딩 프레임은 BLAST 검색(유전자은행, Bethesad, MD)을 이용하여 실행되었고 서열 정렬은 BCM Search Launcher를 이용하여 달성되었다 : Multiple Sequence Alignment Pattern-Induced Multiple Alignment Method(F. Corpet, Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, (1987) 참조). 서열 및 서열 정렬은 도 5∼11에 나타나 있다.
래트 황체 RNA의 노던 블럿 하이브리디제이션
아폽토시스의 다양한 단계에 래트 황체로부터 분리된 20 mg의 총 RNA가 1%의 변성된 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 분리되었고 나일론 멤브레인 상에 고정되었다. 무작위 프라이머 키트(Boehringer)를 이용하여 32P-dCTP로 표지된 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A cDNA(서열번호: 1)가 멤브레인 7 ×107을 프로브 하는데 사용되었다. 대안으로, 무작위 프라이머 키트(Boehringer)를 이용하여 32P-dCTP로 표지된 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 DHS cDNA(서열번호: 6)가 멤브레인(7 ×107 cpm)을 프로브하는데 사용되었다. 멤브레인은 실온에서 1x SSc, 0.1% SDS로 1회 세척되었고, 65℃에서 0.2x SSC, 0.1% SDS로 3회 세척되었다. 멤브레인은 건조되었고 -70℃에서 밤새 x-선에 노출되었다.
나타난 바와 같이 아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 DHS는 모두 아폽토시스하는 황체 조직에서 상향조절되었다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현은 PGF-2α로의 처리에 의한 아폽토시스 유도 후 유의적으로 증가된다 - 0시간에는 낮으나 처리 1시간 내에 실질적으로 증가되고, 처리 8시간 내에 훨씬 더 증가되고, 처리 24시간 내에 약간 더 증가된다(도 12). DHS의 발현은 0시간에 낮고, 처리 1시간 내에 실질적으로 증가되고 처리 8시간 내에 훨씬 더 증가되고 처리 24시간 내에 약간 더 증가된다(도 13).
효모, 진균, 인간 eIF-5A 서열에 기초한 프라이머를 이용한 아폽토시스하는 래트 황체 RT-PCR 생성물의 생성
유전자의 3'-말단에 상응하는 일부-길이 아폽토시스-특이적 eIF-5A 서열(서열번호: 11)은 효모, 진균 및 인간 eIF-5A 서열로부터 고안된 올리고뉴클레오타이 드 프라이머쌍을 이용한 RT-PCR에 의해 아폽토시스하는 래트 황체 RNA 주형으로부터 생성되었다. 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A 유전자의 3'-말단을 분리하는데 사용된 업스트림 프라이머는 20 뉴클레오타이드 퇴화 프라이머이다 : S는 C및 G로부터 선택되고; R은 A 및 G로부터 선택되고; H는 A, T 및 C로부터 선택되고; Y는 C 및 T로부터 선택되고; N은 어떤 핵산도 되는 5' TCSAARACHGGNAAGCAYGG 3'(서열번호: 9). 래트 eIF-5A 유전자의 3'말단을 분리하는데 사용되는 다운스트림 프라이머는 42 뉴클레오타이드를 포함한다 : 5' GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'(서열번호: 10). 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이 수행되었다. 간단하게, 5 mg의 다운스트림 프라이머를 이용하여 cDNA의 첫 번째 스트랜드가 합성되었다. 첫 번째 스트랜드는 이후 업스트림 및 다운스트림 프라이머 모두를 이용하여 RT-PCR 내에서 주형으로 사용되었다.
아가로스 겔 상에서의 RT-PCR 생성물의 분리는 900 bp 단편의 존재를 나타내었고 이는 블런트 말단 라이게이션을 이용하여 pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA) 내로 서브클론되었고 서열분석되었다(서열번호: 11). 3'말단의 cDNA 서열은 서열번호: 11이고 3'말단의 아미노산 서열은 서열번호: 12이다. 도 1∼2 참조.
유전자의 5'말단에 상응하고 3'말단과 중복되는 일부-길이 아폽토시스-특이적 eIF-5A 서열(서열번호: 15)은 RT-PCR에 의해 아폽토시스하는 래트 황체 RNA 주형으로부터 생성되었다. 5' 프라이머는 인간 eIF-5A 서열로 지정된 서열, 5' CAGGTCTAGAGTTGGAATCGAAGC 3'(서열번호: 13)을 지닌 24-머(mer)이다. 3' 프라이머는 3' 말단 RT-PCR 단편에 따라 고안된, 서열, 5' ATATCTCGAGCCTTGATTGC AACAGCTGCC 3'(서열번호: 14)를 지닌 30-머이다. 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이 수행되었다. 간단하게, 5 mg의 다운스트림 프라이머를 이용하여 cDNA의 첫 번째 스트랜드가 합성되었다. 첫 번째 스트랜드는 이후 업스트림 및 다운스트림 프라이머 모두를 이용하여 RT-PCR 내에서 주형으로 사용되었다.
아가로스 겔 상에서의 RT-PCR 생성물의 분리는 500 bp 단편의 존재를 나타내었고 이는 각각 업스트림 및 다운스트림 프라이머 내에 존재하는 XbaI 및 XhoI 클로닝 사이트을 이용하여 pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems, LsJolla, CA) 내로 서브클론되었고 서열분석되었다(서열번호: 15). 5'말단의 cDNA 서열은 서열번호: 15이고 5'말단의 아미노산 서열은 서열번호: 16이다. 도 2 참조.
래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 3' 및 5' 말단의 서열(각각 서열번호: 11 및 서열번호: 15)은 전체-길이 cDNA 서열(서열번호: 1)과 중복되었고 전체-길이 cDNA 서열(서열번호: 1)을 제공하였다. 본 전체-길이 서열은 GenBank 데이터베이 스 내 서열과 정렬되었고 비교되었다. 도 1∼2 참조. cDNA 클론은 16.8 KDa의 계산된 분자량을 지닌 154 아미노산 폴리펩타이드(서열번호: 2)를 인코드한다. RT-PCR에 의해 수득된 래트 아폽토시스-특이적 황체 eIF-5A 유전자의 전체-길이 cDNA에 대한 뉴클레오타이드 서열, 서열번호: 1은 도 3에 나타나 있고, 상응하는 추론된 아미노산 서열은 서열번호: 9이다. eIF-5A의 유도된 전체-길이 아미노산 서열은 인간 및 마우스 eIF-5A 서열과 정렬되었다. 도 7∼9 참조.
인간 DHS 서열에 기초한 프라이머를 이용한 아폽토시스하는 래트 황체 RT-PCR 생성물의 생성
유전자의 3'말단에 상응하는 일부-길이 아폽토시스-특이적 DHS 서열(서열번호: 6)은 인간 DHS 서열로 지정된 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍을 이용한 RT-PCR에 의해 아폽토시스하는 래트 황체 RNA 주형으로부터 생성되었다. 5' 프라이머는 서열, 5' GTCTGTGTATTATTGGGCCC 3'(서열번호: 17)을 지닌 20-머이고; 3' 프라이머는 서열, 5' GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'(서열번호: 18)을 지닌 42-머이다. 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이 수행되었다. 간단하게, 5 mg의 다운스트림 프라이머를 이용하여 cDNA의 첫 번째 스트랜드가 합성되었다. 첫 번째 스트랜드는 이후 업스트림 및 다운스트림 프라이머 모두를 이용하여 RT-PCR 내에서 주형으로 사용되었다.
아가로스 겔 상에서의 RT-PCR 생성물의 분리는 606 bp 단편의 존재를 나타내었고 이는 블런트 말단 라이게이션을 이용하여 pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA) 내로 서브클론되었고 서열분석되었다(서열번호: 6). RT-PCR에 의해 수득된 래트 아폽토시스-특이적 황체 DHS 유전자의 일부 길이 cDNA에 대한 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 6)은 도 4에 나타나 있고, 상응하는 유도된 아미노산 서열은 서열번호: 7이다.
게놈 DNA의 분리 및 서던 분석
서던 블럿을 위해 게놈 DNA가 절제된 래트 난소로부터 분리되었다. 약 100 mg의 난소 조직은 작은 조각으로 분리되었고 15 ml 튜브에 놓였다. 조직은 조직 현탁액을 천천히 진탕함으로서 1 ml의 PBS로 2회 세척하였고 이후 피펫을 이용하여 PBS를 제거하였다. 조직은 2.06 ml의 DNA-완충액(0.2 M Tris-HCl pH 8.0 및 0.1 mM EDTA) 내에 재현탁되었고 240 ㎕의 10% SDS 및 100 ㎕의 단백질가수분해효소 K(Boehringer Manheim; 10 mg/ml)가 첨가되었다. 조직은 45℃에서 밤새 진탕 워터 배쓰 내에 놓였다. 다음날 또다른 100 ㎕의 단백질가수분해효소 K(10 mg/ml)이 첨가되었고 조직 현탁액은 추가 4시간 동안 45℃에서 워터 배쓰 내에 인큐베이트되었다. 인큐베이션후 조직 현탁액은 페놀 : 클로로포름 : 이소-아밀 알코올 (25:24:1)의 동일한 부피로 1회, 클로로포름 : 이소-아밀 알코올 (24:1)의 동일한 부피로 1회 추출되었다. 추출 후 3 M 아세트산나트륨의 1/10th 부피(pH 5.2) 및 에탄올 2 부피가 첨가되었다. 밀봉되고 Bunsen 버너를 이용하여 후크 내로 형성된 유리 피펫이 용액으로부터 DNA 실을 끌어당기고 DNA를 청결한 마이크로원심분리 튜브 내로 옮기는데 사용되었다. DNA는 70% 에탄올로 1회 세척되었고 10분간 공기-건조되었다. DNA 펠렛은 500 ㎕의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 용해되었고, 10 ㎕의 RNase A(10 mg/ml)가 첨가되었고, DNA는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트되었다. DNA는 페놀 : 클로로포름 : 이소-아밀 알코올 (25 : 24 : 1)로 1회 추출되었고 DNA는 3 M 아세트산나트륨의 1/10th 부피(pH 5.2) 및 에탄올 2 부피를 첨가함으로서 침전되었다. DNA는 4℃에서 13,000 x g로 10분간 원심분리에 의해 펠렛되었다. DNA 펠렛은 70% 에탄올로 1회 세척되었고 4℃에서 밤새 DNA를 회전시킴으로서 200 ㎕의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0) 내에 용해되었다.
서던 블럿 분석을 위해 래트 난소로부터 분리된 게놈 DNA가 내인성 유전자 내에서 절단되지 않거나 한번만 절단된 다양한 제한효소로 분해되었다. 이를 달성하기 위해 10 ㎍의 게놈 DNA, 20 ㎕의 10X 반응 완충액 및 100 U 제한효소가 200 ㎕의 총 반응 부피로 5∼6시간 동안 반응되었다. 분해된 DNA는 0.7% 아가로스 겔 상에 로드되었고, 40 볼트에서 6시간 동안 또는 15 볼트에서 밤새 전기영동되었다. 전기영동 후 겔은 0.2 N HCl 내에서 10분간 정화된 후 변성 용액(0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl) 내에서 2회 15-분 세척되었고 중성화 완충액(1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl pH 7.4)으로 2회 15분 세척되었다. DNA는 나일론 멤브레인으로 옮겨졌고 멤브레 인은 하이브리디제이션 용액(40% 포름아미드, 6 X SSC, 5 X Denhart's 용액(1 X Denhart's 용액은 0.02% Ficoll, 0.02% PVP 및 0.02% BSA임), 0.5% SDS 및 1.5 mg의 변성된 연어 혈청 DNA) 내에서 미리 하이브리다이즈되었다. 래트 eIF-5A cDNA의 3' UTR의 700 bp PCR 단편(3' UTR의 650 bp 및 코딩의 50 bp)은 무작위 프라이밍에 의해 [α-32P]-dCTP로 표지되었고 1 X 106 cpm/ml에서 멤브레인에 첨가되었다.
유사하게, 래트 DHS cDNA의 606 bp PCR 단편(450 bp 코딩 및 156 bp 3' UTR)은 [α-32P]-dCTP로 무작위 프라임 표지되었고 두 번째 동일한 멤브레인으로 1 X 106 cpm/ml에서 첨가되었다. 블럿은 42℃에서 밤새 하이브리다이즈되었고 이후 42℃에서 2 X SSC 및 0.1% SDS로 2회, 42℃에서 1 X SSC 및 0.1% SDS로 2회 세척되었다. 블럿은 3∼10일간 필름에 노출되었다.
래트 황체 게놈 DNA는 도 18에 나타난 바와 같이 제한효소로 절단되었고 32P-dCTP-표지된 전체-길이 eIF-5A cDNA로 프로브되었다. 높은 스트린전시 조건 하에서의 하이브리디제이션은 각각의 제한효소 분해된 DNA 표본에 대한 일부 제한 단편으로의 전체-길이 cDNA 프로브의 하이브리디제이션을 나타내었고 이는 eIF-5A 일부 이소폼의 존재를 나타내었다. 특히 래트 게놈 DNA가 아폽토시스-특이적 eIF-5A이 오픈 리딩 프레임 내 제한 사이트를 지닌 EcoRV로 분해되었을 때 eIF-5A 의 아폽토시스-특이적 이소폼의 제한 단편이 서던 블럿 내에서 검출가능하였다. 2개의 단편은 도 18의 이중 화살표로 나타나 있다. eIF-5A의 아폽토시스-특이적 이소폼에 상응하는 제한 단편은 오픈 리딩 프레임 내에서 절단 사이트가 없는 제한 효소인 EcoR1 및 BamH1로 표지된 레인에서 단일 화살표로 나타나 있다. 이들 결과는 아폽토시스-특이적 eIF-5A이 래트에서 단일 카피(copy)임을 나타낸다. 도 5∼11에 나타난 바와 같이 eIF-5A 유전자는 종간에 매우 보존되어 있고 어떠한 종 내에서도 이소폼 간의 유의적인 양의 보존이 있음이 예측된다.
도 18은 32P-dCTP-표지된 일부-길이 래트 황체 아폽토시스-특이적 DHS cDNA로 프로브된 개트 게놈 DNA의 서던 블럿을 나타낸다. 게놈 DNA는 프로브로 사용된 일부-길이 cDNA를 절단하지 않는 제한 효소인 EcoRV로 절단되었다. 2개의 제한 단편은 유전자의 2개 카피가 있다거나 또는 유전자가 EcoRV 사이트를 지닌 인트론을 포함함을 나타내는 것이 뚜렷하다.
(실시예 2)
본 실시예는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 DHS로의 아폽토시스 조절(센스 방향으로 아폽토시스-특이적 eIF-5A로 아폽토시스를 증가시킴)을 설명한다.
COS-7 세포의 배양 및 RNA의 분리
야생형 T 항원을 코드하는 SV40의 돌연변이로 형질전환된 아프리카 그린 원숭이 신장 섬유아세포-유사 세포주인 COS-7이 모든 형질전환-기초 실험에 사용되었다. COS-7 세포는 리터 당 0.584 g의 L-글루타민, 4.5 g의 글루코스, 0.37%의 중탄산나트륨을 지닌 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM) 내에서 배양되었다. 배양 배지는 10%의 우태아 혈청(FBS) 및 100 유니트의 페니실린/스트렙토마이신으로 보충되었다. 세포는 37℃의 5% CO2 및 95% 공기의 습한 환경에서 생장되었다. 세포는 0.25%의 트립신 및 1 mM EDTA의 용액으로 부착성 세포를 탈착시킴으로서 3∼4일 마다 계대배양되었다. 탈착된 세포는 신선한 배지의 새로운 배양 접시 내에서 1 : 10의 분할 비율로 분산되었다.
RNA의 분리에 사용되는 COS-7 세포는 150-mm 조직 배양 처리된 접시(Corning) 내에서 생장되었다. 세포는 트립신-EDTA의 용액으로 이들을 탈착시킴으로서 배양되었다. 탈착된 세포는 원심분리 튜브에 수집되었고 3000 rmp으로 5분간 원심분리함으로서 펠렛되었다. 상청액은 제거되었고 세포 펠렛은 액체 질소 내에서 순간-동결되었다. RNA는 제조사의 지시에 따라 GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit(Sigma)를 이용하여 동결된 세포로부터 분리되었다.
재조합 플라스미드의 구축 및 COS-7 세포의 트랜스펙션
센스 방향으로 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 전체-길이 코딩 서열 및 안티센스 방향으로 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 3' 비번역된 구역(UTR)을 운반하는 재조합 플라스미드가 도 19에 나타난 포유류 에피토프 태그 발현 벡터, pHM6(Rowhe Molecular Biochemicals)을 이용하여 구축되었다. 벡터는 하기를 포함한다 : CMV 프로모터 - 인간 사이토메갈로바이러스 매개-초기 프로모터/인핸서; HA - 인플루엔자 헤마그글루티닌으로부터의 노나펩타이드 에피토프 태그; BGH pA - 소 생장 호르몬 폴리아데닐레이션 시그날; f1 ori - f1 오리진; SV40 ori - SV40 초기 프로모터 및 오리진; 네오마이신 - 네오마이신 저항성(G418) 유전자; SV40 pA - SV40 폴리아데닐레이션 시그날; Co1 E1 - Co1E1 오리진; 암피실린 - 암피실린 저항성 유전자. 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 전체-길이 코딩 서열 및 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 3' UTR은 pBluescript 내 본래의 래트 eIF-5A 5A RT-PCR 단편(서열번호: 1)으로부터 PCR에 의해 증폭되었다. 전체-길이 eIF-5A를 증폭하기 위해 사용된 프라이머는 하기와 같았다 : 전방 5' GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTT GG 3'(서열번호: 59)(Hind3) 및 역 5' CTGAATTCCAGT TATTTTGCCATGG 3'(서열번호: 60)(EcoRl). 3' UTR 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 증폭하기 위해 사용된 프라이머는 하기와 같았다 : 전방 5' AATGAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC 3'(서열번호: 61)(EcoRl) 및 역5' GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'(서열번호: 62)(Hind3).
아가로스 겔 전기영동 후 분리된 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A PRC 생성물은 430 bp 길이인 반면 3' UTR 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A PCR 생성물은 697 bp 길이였다. pHM6-전체-길이 아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 pHM6-안티센스 3' UTR eIF-5A를 생성하기 위해 PCR 생성물 모두는 pHM6의 Hind3 및 EcoR1 사이트 내로 서브클론되었다. 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A PCR 생성물은 멀티플 클로닝 사이트의 업스트림에 존재하는 인플루엔자 헤마그글루티닌(HA)로부터의 노나펩타이드 에피토프 태그와 인 프레임으로 서브클론되어 항-[HA]-퍼옥시다제 항체를 이용한 재조합 단백질의 검출을 가능하게 하였다. 발현은 인간 시토메갈로바이러스 매개-초기 프로모터/인핸서에 의해 시작되어 포유류 세포주 내 높은 수준의 발현을 확보한다. 또한 플라스미드는 안정한 트랜스펙턴트(transfectant)의 선택을 가능하게 하는 네오마이신-저항성(G418) 및 COS-7과 같은 SV40 큰 T 항원을 발현하는 세포 내에서 에피솜 복제를 가능하게 하는 SV40 초기 프로모터 및 오리진을 특징으로 한다.
트랜스펙션 실험에 사용되는 COS-7 세포는 단백질 추출에 사용되는 세포용 24 웰 세포 배양 플레이트(Corning) 또는 염색에 사용되는 세포용 4 챔버 배양 슬라이드(Falcon) 내에서 배양되었다. 세포는 10% FBS로 보충되었으나 페니실린/스트렙토마이신이 없는 DMEM 배지 내에서 50∼70% 합류(confluency)가 되도록 생장되었다. 24-웰 플레이트의 하나의 웰 또는 배양 슬라이드에 충분한 트랜스펙션 배지는 42.5 ㎕의 무혈청 DMEM 내에 0.32 ㎍의 플라스미드 DNA를 희석시키고 실온에 서 15분간 혼합물을 인큐베이트시킴으로서 준비되었다. 1.6 ㎕의 트랜스펙션 시약, LipofectAMINE(Gibco, BRL)은 42.5 ㎕의 무혈청 DMEM 내에 희석되었고 실온에서 5분간 인큐베이트되었다. 5분 후 LipofectAMINE 혼합물은 DNA 혼합물에 첨가되었고 실온에서 30∼60분간 함께 인큐베이트되었다. 트랜스펙트되는 세포는 트랜스펙션 배지와 중복시키기 전에 무혈청 DMEM으로 1회 세척되었고 세포는 4시간 동안 그로쓰 챔버 내에 다시 놓였다.
인큐베이션 후 0.17 ml DMED + 20% FBS가 세포에 첨가되었다. 세포는 염색전 아폽토시스를 겪도록 유도되거나 웨스턴 블럿을 위해 채취되기 전에 40시간 더 배양되었다. 대조군으로서 플라스미드 DNA가 트랜스펙션 배지로부터 생략된 모의 트랜스펙션이 수행되었다.
단백질 추출 및 웨스턴 블럿팅
세포를 PBS(8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 및 0.24 g/L KH2PO4) 내에서 2회 세척하고 150 ㎕의 뜨거운 SDS 겔-로딩 완충액(50 mM Tris-HCl pH 6.8, 100 mM 디티오트레이톨, 2% SDS, 0.1% 브로모페놀 블루 및 10% 글리세롤)을 첨가함으로서 트랜스펙트된 세로부터 웨스턴 블럿팅을 위해 단백질이 분리되었다. 세포 용해질이 마이크로원심분리관 내에 수집되었고 10분간 95℃에서 가열된 후 10분간 13,000 x g로 원심분리되었다. 상청액은 신선한 마이크로원심분리관으로 옮겨졌고 사용전까지 -20℃에서 보관되었다.
웨스턴 블럿팅을 위해 2.5 또는 5 ㎍의 총 단백질이 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리되었다. 분리된 단백질은 폴리비닐리덴 다이플로라이드 멤브레인으로 옮겨졌다. 멤브레인은 블록 용액(PBS 내 5% 탈지 우유 분말, 0.02% 아지드화나트륨)에서 1시간 동안 인큐베이트되었고 PBS-T(PBS + 0.05% Tween-20)로 15분간 3회 세척되었다. 멤브레인은 밤새 4℃ PBS-T내에서 보관되었다. 다음날 실온으로 데워진 후 멤브레인은 1 ㎍/ml의 폴리비닐 알코올 내에서 30초간 블록되었다. 멤브레인은 탈이온수로 5회 세척된 후 PBS 내 5% 우유 용액 내에서 30분간 블록되었다. 1차 항체는 멤브레인과의 인큐베이션 전에 PBS 내 5% 우유 용액에서 30분간 미리 인큐베이트되었다.
여러 1차 항체가 사용되었다. 항-[HA]-퍼옥시다제 항체(Roche Molecular Biochemicals)가 재조합 단백질의 발현을 검출하기 위해 1 : 5000으로 희석되어 사용되었다. 이러한 항체는 퍼옥시다제에 컨쥬게이트되기 때문에 어떠한 2차 항체도 필요하지 않았고, 블럿은 세척되었고 화학발광에 의해 발달되었다. 사용된 다른 1차 항체는 p53(Ab-6), Bcl-2(Ab-1) 및 c-Myc(Ab-2)를 인식하는 Oncogene사의 단일클론 항체이다. p53에 대한 단일클론 항체는 0.1 ㎍/ml로 희석되어 사용되었고 Bcl-2 및 c-Myc에 대한 단일클론 항체는 모두 0.83 ㎍/ml로 희석되어 사용되었 다. 1차 항체와의 60∼90분간의 인큐베이션 후 멤브레인은 PBS-T 내에서 15분간 3회 세척되었다. 이후 2차 항체가 PBS 내 1% 우유에서 희석되었고 60∼90분간 멤브레인과 인큐베이트되었다. p53(Ab-6)가 1차 항체로 사용된 경우 사용된 2차 항체는 1 : 1000으로 희석된 알칼리성 포스파타제(Rockland)에 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG이다. Bcl-2(Ab-1) 및 c-Myc(Ab-2)가 1차 항체로 사용된 경우 퍼옥시다제(Sigma)에 컨쥬게이트된 토끼 항-마우스 IgG가 1 : 5000으로 희석되어 사용되었다. 2차 항체와의 인큐베이션 후 멤브레인은 PBS-T로 3회 세척되었다.
표색 방법 및 화학발광 방법의 2가지 검출 방법이 블럿을 발달시키는데 사용되었다. 표색 방법은 p53(Ab-6)이 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이트된 2차 항체와 컨쥬게이션된 1차 항체로서 사용된 경우에만 사용되었다. 결합된 항체는 0.33 mg/ml 니트로 블루 테트라졸륨, 0.165 mg/ml 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 및 100 mM Tris-HCl(pH 9.5)의 용액 내에서 암조건으로 블럿을 인큐베이트함으로서 시각화되었다. 발색 반응은 PBS 내 2 mM의 EDTA에서 블럿을 인큐베이트함으로서 정지되었다. 화학발광 검출 방법은 항-[HA]-퍼옥시다제, Bcl-2(Ab-1) 및 c-Myc(Ab-2)를 포함한 다른 모든 1차 항체에 사용되었다. ECL Plus 웨스턴 블럿팅 검출 키트(Amersham Pharmacia Biotech)가 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 결합 항체를 검출하는데 사용되었다. 간단히, 멤브레인은 가볍게 블럿드 드라이된 후 시약 A와 시약 B의 40 : 1 혼합으로 5분간 암조건으로 인큐베이 트되었다. 멤브레인은 블럿드 드라이되었고 아세테이트 시트(sheet) 사이에 놓였고 10초에서 10분까지 다양한 기간 동안 x-선 필름에 노출되었다.
COS-7 세포 내 아폽토시스의 유도
혈청 결핍 및 악티노마이신 D, 스트렙토마이세스 sp.(Calbiochem)로의 처리의 2가지 방법이 트랜스펙트된 COS-7 세포 내 아폽토시스를 유도하는데 사용되었다. 두 가지 처리 모두에 있어서 배지는 후-트랜스펙션 40시간에 제거되었다. 혈청 결핍 실험에서 배지는 무혈청- 및 무항생제- DMEM으로 대치되었다. 10% FBS로 보충된 무항생제-DMEM 내에서 생장된 세포가 대조군으로 사용되었다. 아폽토시스의 악티도마이신 유도에서 배지는 10% FBS 및 1 ㎍/ml의 메탄올 내에 용해된 악티노마이신 D로 보충된 무항생제-DMEM로 대치되었다. 대조군 세포는 10% FBS 및 동일한 부피의 메탄올로 보충된 무항생제-DMEM 내에서 생장되었다. 두 가지 방법 모두에 있어서, 아폽토시스 세포의 비율이 Hoescht 또는 Annexin V-Cy3으로 염색함으로서 48시간 후 측정되었다. 아폽토시스의 유도는 도 20에 나타난 바와 같이 노던 블럿 분석에 의해 확인되었다.
Hoesht 염색
핵 무사분열 및 응축과 같은 형태학적 특징에 기초하여 아폽토시스 세포를 확인하기 위해 핵 염색제, Hoesht이 트랜스펙트된 COS-7 세포의 핵을 표지하는데 사용되었다. 순수 메탄올과 빙초산의 혼합물 3 : 1로 구성된 고정제는 사용 직전에 준비되었다. 동일한 부피의 고정제가 배양 슬라이드 상에서 생장하는 COS-7 세포이 배지에 첨가되었고 2분간 인큐베이트되었다. 배지/고정제 혼합물이 세포로부터 제거되었고 폐기되었고 1 ml의 고정제가 세포에 첨가되었다. 5분 후 고정제가 제거되었고 1 m의 신선한 고정제가 세포에 첨가되었고 5분간 인큐베이트되었다. 고정제가 제거되었고 세포는 1 ml의 Hoesht 염색제(PBS 내 0.5 ㎍/ml Hoescht 33258)를 첨가하기 전에 4분간 공기-건조되었다. 암조건에서 10분간 인큐베이션한 후 염색 용액이 제거되었고 슬라이드는 탈이온수로 1분간 3회 세척되었다. 세척 후 1 ml의 McIlvaine's 완충액(0.021 M 구연산, 0.058 M Na2HPO4·7H2O; pH 5.6)이 세포에 첨가되었고 20분간 암조건에서 인큐베이트되었다. 완충액은 제거되었고 세포는 암조건에서 5분간 공기-건조되었고 배양 슬라이드의 웰을 분리하는 챔버가 제거되었다. 형광용 Vectashield 마운팅 배지(Vector Laboratories) 몇 방울이 슬라이드에 첨가되었고 커버슬립으로 덮였다. 염색된 세포는 UV 필터를 이용한 형광 현미경하에서 관찰되었다. 밝게 염색된 세포 또는 무사분열된 핵이 아폽토시스로서 득점되었다.
아넥신 V-Cy3 염색
아넥신 V-Cy3 아폽토시스 검출 키트(Sigma)가 아폽토시스 세포 상에 외부화된 포스파티딜세린을 형광 표지하는데 사용되었다. 키트는 하기 변형과 함께 제조사의 프로토콜에 따라 사용되었다. 간단히, 4개의 챔버 배양 슬라이드 상에서 생장하는 트랜스펙트된 COS-7 세포가 PBS로 2회 세척되었고 1 X 결합 완충액으로 3회 세척되었다. 150 ㎕의 염색 용액(1 X 결합 완충액 내 1 ㎍/ml AnnCy3)이 첨가되었고 세포는 10분간 암조건에서 인큐베이트되었다. 염색 용액이 제거되었고 세포는 1 X 결합 완충액으로 5회 세척되었다. 챔버 벽이 배양 슬라이드에서 제거되었고 1 X 결합 완충액 몇 방울이 세포에 놓였고 커버슬립으로 덮였다. 염색된 세포는 양성으로 염색된(아폽토시스) 세포의 적색 형광을 가시화하기 위해 녹색 필터를 이용하여 형광 현미경으로 분석되었다. 총 세포군은 가시광선하에서 세포수를 셈으로서 측정되었다.
(실시예 3)
본 실시예는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 DHS의 아폽토시스 조절을 설명한다.
상기 실시예에 기술된 일반적인 절차 및 방법을 이용하여 도 21은 무혈청 배지 내에서 세포가 LipofectAMINE 내 플라스미드 DNA 내에서 4시간 동안 인큐베이트되었고, 혈청이 첨가되었고, 세포가 40시간 더 인큐베이트된 COS-7 세포의 일시적 트랜스펙션의 절차를 나타내는 흐름도이다. 이후 세포는 분석전 48시간 더 혈청 함유 일반 배지 내에서 인큐베이트되고(즉, 부가 처리 없음) 분석 전 아폽토시스를 유도하도록 48시간 동안 혈청 제거되거나 분석 전 아폽토시스를 유도하도록 48시간 동안 악티노마이신 D로 처리된다.
도 22는 pHM6로의 트랜스펙션 후 COS-7 내 외부 단백질의 일시적 발현을 나타내는 웨스턴 블럿이다. 단백질은 모의 트랜스펙션 또는 pHM6-LacZ, pHM6-안티센스 3' rF5A(pHM6-안티센스 3' UTR 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A) 또는 pHM6-센스 rF5A(pHM6-전체길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A)로의 트랜스펙션 후 COS-7 세포로부터 분리되었다. 각 표본으로부터의 5 ㎍의 단백질이 SDS-PAGE에 의해 분획화되었고 PVDF 멤브레인에 옮겨졌고 항-[HA]-퍼옥시다제로 웨스턴 블럿되었다. 결합된 항체는 화학발광에 의해 검출되었고 30초간 x-선 필름에 노출되었다. LacZ(레인 2) 및 센스 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A(레인 4)의 발현은 분명히 볼 수 있다.
상기에 기술된 바와 같이 COS-7 세포는 모의 트랜펙션 또는 pHM6-센스 rF5A(pHM6-전체 길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A)로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 40시간 후 세포는 48시간 동안 혈청의 철회에 의해 아폽토시스를 겪도록 유도되었다. 트랜스펙트된 세포 추출물 내 카스페이즈 단백질가수분해 활성은 형광 상동성 카스페이즈 에세이 키트(Roche Diagnostics)를 이용하여 측정되었다. DNA 무사분열도 형광-표지된 디옥시뉴클레오타이드로 DNA 단편의 3'-OH 말단을 표지하는 FragEL DNA 분열 아폽토시스 검출 키트(Oncogene)를 이용하여 측정되었다.
부가적 COS-7 세포는 모의 트랜스펙션 또는 pHM6-센스 rF5A(pHM6-전체 길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A)로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 40시간 후 세포는 혈청 함유 일반 배지(추가 처리 없음) 내에 48시가 더 생장되고, 48시간 동안 혈청의 철회에 의해 아폽토시스를 겪도록 유도되거나 48시간 동안 0.5 ㎍/ml의 악티노마이신 D으로의 처리에 의해 아폽토시스를 겪도록 유도되었다. 세포는 아폽토시스를 수반하는 핵 무사분열을 나타내는 Hoescht 33258로 염색되거나 아폽토시스를 수반하는 포스파티틸세린 노출을 나타내는 아넥신 V-Cy3으로 염색되었다. 염색된 세포는 녹색 필터를 이용하여 형광 현미경으로 관찰되었고 아폽토시스를 진행하는 세포의 비율을 측정하기 위해 계산되었다. 총 세포군은 가시광선하에서 카운트되었다.
도 46는 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 포함한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트될 때 증가된 카스페이즈 활성이 반영된 증가된 아폽토시스를 나타낸다. 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현은 60% 증가된 카스페이즈 활성을 나타내었다.
도 47은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 포함한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트될 때 증가된 DNA 무사분열이 반영된 증가된 아폽토시스를 나타낸다. 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현은 273% 증가된 DNA 무사분열을 나타내었다. 도 48은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 포함한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트될 때 증가된 핵 무사분열이 반영된 증가된 아폽토시스를 나타낸다. 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 발현하는 세포에서 무사분열된 핵의 더 큰 발생률이 있다. 도 49는 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 포함한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트될 때 증가된 핵 무사분열이 반영된 증가된 아폽토시스를 나타낸다. 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현은 각각 비-혈청 결핍된 표본 및 혈청 결핍된 표본 보다 27% 및 63%로 핵 무사분열이 증가되었다.
도 50은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 포함한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트될 때 포스파티딜세린 노출이 반영된 아폽토시스 검출을 나타낸다. 도 51은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 포함한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트될 때 증가된 포스파티딜세린 노출이 반영된 증가된 아폽토시스 검출을 나타낸다. 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현은 각각 비-혈청 결핍된 표본 및 혈청 결핍된 표본 보다 140% 및 198%로 포스파티딜세린 노출이 증가되었다.
도 52는 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 포함한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트될 때 증가된 핵 무사분열이 반영된 증가된 아폽토시스 검출을 나타낸다. 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현은 각각 비처리 및 처리 표본 보다 115% 및 62%로 핵 무사분열이 증가되었다. 도 53은 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 포함한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트된 COS-7 세포가 더 이상의 처리가 없거나 아폽토시스를 유도하는 처리가 있는 조건 하에서 증가된 아폽토시스의 비교를 나타낸다.
(실시예 4)
본 실시예는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 DHS의 투여 후 아폽토시스 활성 조절을 설명한다.
더욱이 COS-7 세포는 모의 트랜스펙션, pHM6-LacZ으로 트랜스펙션 또는 pHM6-센스 rF5A(pHM6-전체 길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A)로 트랜스펙션되고 40시간 동안 인큐베이트되었다. 각 표본으로부터의 단백질 추출물 5 ㎍이 SDS-PAGE에 의해 분획화되었고 PVDF 멤브레인에 옮겨졌고 Bcl-2를 인식하는 단일클론 항체로 웨스턴 블럿되었다. 퍼옥시다제에 컨쥬게이트된 토끼 항-마우스 IgG가 2차 항체로 사용되었고 결합된 항체는 화학발광 및 x-선 필름으로의 노출에 의해 검출되었다. 결과는 도 54에 나타나 있다. 이러한 도면은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트될 때 Bcl-2의 하향-조절을 나타낸다. 상단 패널은 쿠마시-블루-염색된 단백질 블럿을 나타내고; 하단 패널은 상응하는 웨스턴 블럿을 나타낸다. pHM6-LacZ으로 트랜스펙트된 것보다 pHM6-센스 rF5A로 트랜스펙트된 세포에서 Bcl-2가 덜 검출되었고; 따라서 Bcl-2는 pHM6-센스 rF5A 컨스트럭트로 하향-조절된다.
추가 COS-7 세포는 모의 트랜스펙션, pHM6-안티센스 3' rF5A(래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 pHM6-안티센스 3' UTR)로 트랜스펙션 또는 pHM6-센스 rF5A(pHM6-전체 길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A)로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 40시간 후 세포는 48시간 동안 혈청의 철회에 의해 아폽토시스를 겪도록 유도되었다. 각 표본으로부터의 단백질 추출물 5 ㎍이 SDS-PAGE에 의해 분획화되었고 PVDF 멤브레인에 옮겨졌고 Bcl-2를 인식하는 단일클론 항체로 웨스턴 블럿되었다. 퍼옥시다제에 컨쥬게이트된 토끼 항-마우스 IgG가 2차 항체로 사용되었고 결합된 항체는 화학발광 및 x-선 필름으로의 노출에 의해 검출되었다. 도 55 참조. 이러한 도면은 COS-7 세포가 안티센스 방향으로 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 3' 말단을 함유한 pHM6로 일시적으로 트랜스펙트될 때 Bcl-2의 하향-조절을 나타낸다. 상단 패널은 쿠마시-블루-염색된 단백질 블럿을 나타내고; 하단 패널은 상응하는 웨스턴 블럿을 나타낸다. 모의 트랜스펙트되거나 pHM6-센스 rF5A로 트랜스펙트된 것 보다 pHM6-안티센스 3' rF5A로 트랜스펙트된 세포에서 더 많은 Bcl-2가 검출되었다.
또한 부가적으로, COS-7 세포는 모의 트랜스펙션, pHM6-LacZ으로 트랜스펙션 또는 pHM6-센스 rF5A(pHM6-전체 길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A)로 트랜스펙트되고 40시간 동안 인큐베이트되었다. 각 표본으로부터의 단백질 추출물 5 ㎍이 SDS-PAGE에 의해 분획화되었고 PVDF 멤브레인에 옮겨졌고 p53을 인식하는 단일클론 항체로 웨스턴 블럿되었다. 알칼리성 포스파타제에 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG가 2차 항체로 사용되었고 결합된 항체는 표색적으로 검출되었다.
마지막으로, COS-7 세포는 모의 트랜스펙션, pHM6-LacZ으로 트랜스펙션 또는 pHM6-센스 rF5A(pHM6-전체 길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A)로 트랜스펙트되고 40시간 동안 인큐베이트되었다. 각 표본으로부터의 단백질 추출물 5 ㎍이 SDS-PAGE에 의해 분획화되었고 PVDF 멤브레인에 옮겨졌고 p53을 인식하는 단일클론 항체로 웨스턴 블럿되었다. 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현을 측정하기 위해 상응하는 단백질 블럿이 항-[HA]-퍼옥시다제로 프로브되었다. 알칼리성 포스파타제에 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG가 2차 항체로 사용되었고 결합된 항체는 화학발광에 의해 검출되었다. 도 57 참조. 이러한 도면은 COS-7 세포가 센스 방향으로 전체-길이 아폽토시스-특이적 eIF-5A을 함유한 pHM6으로 일시적으로 트랜스펙트될 때 p53의 상향-조절을 나타낸다. 상단 패널은 쿠마시-블루-염색된 단백질 블럿을 나타내고; 하단 패널은 상응하는 웨스턴 블럿을 나타낸다. pHM6-LacZ로 트랜스펙트된 것 또는 모의 대조군 보다 pHM6-센스 rF5A로 트랜스펙트된 세포에서 더 높은 수치의 p53이 검출되었다.
도 58-A-E는 COS-7 세포 내 pHM6-전체 길이 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현시 p53 상향조절의 의존도를 나타낸다. 두 번째 트랜스펙션보다 첫 번째 트랜스펙션에서 더 많은 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 검출될 수 있다. 항-p53으로 프로브된 웨스턴 블럿에서 상위 패널은 상응하는 쿠마시 블루-염색된 단백질 블럿을 나타내고 하위 패널은 p53으로의 웨스턴 블럿을 나타낸다. 첫 번째 트랜스펙션에 있어서 더 많은 p53이 pHM6-LacZ로 트랜스펙트된 것 또는 모의 대조군 보다 pHM6-센스 rF5A로 트랜스펙트된 세포에서 검출될 수 있다. 래트 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현이 거의 없는 두 번째 트랜스펙션에 있어서, pHM6-센스 fF5A, pHM6-LacZ로 트랜스펙트된 세포 또는 모의 대조군 사이의 어떠한 검출가능한 차별적 수준의 p53이 없었다.
(실시예 5)
심장 조직은 정상 산소 수준에 노출되었고 아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 증식 eIF-5A의 발현 수치가 측정되었다. 이후 심장 조직에 전달되는 산소량이 저하되었고 따라서 심장 조직 내 저산소증 및 허혈을 유도하였고 결국 심장마비를 유도하였다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 증식 eIF-5A의 발현 수치가 측정되었고 허혈에 의해 손상되기 전 심장 조직의 발현 수치와 비교되었다.
판막 대치 시술동안 제거된 인간 심장 조직의 슬라이스가 전극에 후크로 채워졌다. 심장 박동의 강도 측정을 용이하게 하기 위해 심장 조직에 작은 중량이 부착되었다. 전극은 조직이 박동을 시작하게 하는 전기적 자극을 제공하였다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A와 증식 eIF-5A 둘 모두의 유전자 발현 수준이 허혈이 유도되기 전에 심장 조직 내에서 측정되었다. 도 61 참조. 허혈-전 심장 조직 내에서 낮은 수준의 아폽토시스-특이적 eIF-5A와 증식 eIF-5A가 생성되었고, 그의 수준은 상대적으로 균형을 이루었다. 이때 산소 및 이산화탄소는 각각 92.5% 및 7.5%로 완충액 내에서 심장으로 전달되었다. 이후, 산소 수준은 감소되었고 질소 수준은 증가되어 허혈을 유도하였고 결국 "심장마비"를 유도하였다. 심장 조직은 박동을 중지하였다. 이후 산소 수준은 정상으로 복귀되었고, 심장 조직은 전기 자극으로 다시 펄스되어 심장 박동을 다시 시작하였다. "심장마비"후 아폽토시스-특이적 eIF-5A와 증식 eIF-5A의 발현 수준이 다시 측정되었다. 이때 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현 수준 내에 유의적인 증가가 있는 반면, 증식 eIF-5A의 발현 수준 내의 증가는 두드러지게 적었다. 도 61 참조.
"심장마비"후 심장은 부착된 중량의 더욱 적은 압박/이동에 의해 나타난 바와 같이 강하게 박동하지 않았고, 따라서 심장 조직 세포가 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 존재에 기인하여 빠르게 사멸되고 있음을 나타내었다.
(실시예 6)
하기 실시예는 세포 배양 조건을 제공한다.
인간 사상판 및 성상세포 배양
캐나다 온타리오 디비젼의 Eye Bank에서 사후 48 시간 이내인 한쌍의 인간 안구가 수득되었다. 시신경 유두(부착된 전극으로)는 제거되었고 항생물질/항진균, 글루타민 및 10% FBS를 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM) 내에 3시간 동안 두었다. 시신경 유두(ONH) 버튼이 각 조직 표본으로부터 회수되었고 정밀한 해부 가위로 4개의 작은 조각으로 잘게 썰었다. 외식편은 DMEM 배지에서 12.5㎠ 플라스틱 배양 플라스크에서 배양되었다. 생존 가능한 외식편에서 한달 이내에 성장이 관찰되었다. 세포가 한번 90% 합류에 도달하면 세포는 트립신처리되었고 사상판(LC) 및 성상세포 개체를 생성하기 위해 차별적 계대배양이 수행되었다. 구체적으로는 LC 세포는 젠타마이신, 글루타민 및 10% FBS를 함유한 DMEM 내 25 ㎠에서 계대배양되었고 반면 성상세포는 FBS없이 EBM 완전 배지(Clonetics)를 함유하는 25㎠ 플라스크에 전개되었다. FBS는 계대배양 10일 후에 성상세포 배지에 첨가되었다. 세포는 이러한 절차에 의하여 유지되었고 계대배양되었다.
차별적 계대배양에 의해 수득된 세포군은 8 웰 배양 슬라이드위에 염색하는 특이적인 형광 항체를 이용하여 동일성과 개체 순도에 대해 특징지어졌다. 세포 는 10% 포르말린 용액으로 고정되었고 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(DPBS)로 3번 세척되었다. DPBS 내 무지방 우유 2%로 블록한 후 항체는 DPBS내 1% BSA에서 희석되었고 6 윌에서 세포에 적용되었다. 남아있는 두 개의 웰은 오직 1% 소 혈청 알부민(BSA) 용액만으로 처리되었고 대조군으로써 1차 항체는 없었다. 세포는 실온에서 1시간 동안 1차 항체로 인큐베이트되었고 그후 DPBS로 3회 세척되었다. 적절한 2차 항체는 DPBS내 1% BSA에서 희석되었고 각 웰에 첨가되었으며 1시간 동안 인큐베이트되었다. DPBS로 세척한 후 배양 슬라이드의 웰을 분리하는 챔버는 슬라이드로부터 제거되었고 슬라이드는 이중 증류된 증류수에 침지되었고 그 후 공기로 건조되었다. 플루오로마운트(Vector Laboratories)는 각각의 슬라이드에 적용되었고 22 x 60 mm 커버글라스 슬립에 의해 얇게 뒤덮여 졌다.
면역형광 염색은 적절한 필터로 형광 현미경으로 관찰되었고 1차 항체로 처리되지 않은 대조군 웰과 비교되었다. 모든 1차 항체는 특별히 언급하지 않는 한 Sigma로부터 구입되었다. 모든 2차 항체는 Molecular Probes로부터 구입되었다. LC 세포를 확인하기 위해 사용된 1차 항체는 다음과 같다: 항-콜라겐 I, 항-콜라겐 Ⅳ, 항-라미닌(laminin), 항-세포 피브로넥틴(cellular fibronectin). 성상세포를 확인하기 위해 사용된 1차 항체는 다음과 같다: 항-갈락토세레브로시드(galactocerebroside)(Chemicon International), 항-A2B5(Chemicon International), 항-NCAM, 항-인간 폰 빌리브란트 인자(Von Willebrand Factor). 양쪽 모두의 세포 개체에 대해 사용된 추가적인 항체는 항-신경교원섬유(GFAP) 및 항-알파-평활근 액틴을 포함하였다. 세포군은 이들이 콜라겐 Ⅰ, 콜라겐 Ⅳ, 라미닌, 세포 피브로넥틴, 알파 평활근 액틴에 대해서는 양성으로 염색되고 신경교원섬유(GFAP)에 대해서는 음성으로 염색된 경우 이는 LC 세포로 구성되는 것으로 결정되었다. 세포군이 NCAM, 글리아섬유상(GFAP)에 대해서는 양성으로 염색되고 갈락토세레브로시드, A2B5, 인간 폰 빌리브란트 인자 및 알파 평활근 액틴에 대해서는 음성으로 염색된 경우 이는 성상세포 구성되는 것으로 결정되었다.
본 예비 연구에서 3개의 인간 안구 세트가 배양을 개시하기 위해 사용되었다. LC 세포주 #506, #517 및 #524는 각각 83세 남성, 17세 남성 및 26세 여성의 시신경 유두로부터 수득되었다. 모든 LC 세포주는 충분히 특성화되었고 90% LC 세포보다 더 많이 포함하는 것으로 밝혀졌다.
RKO 세포 배양
야생형 p53을 발현하는 인간 결장 암세포주인 RKO(American Type Culture Collection CRL-2577)는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질 발현을 억제하기 위한 능력에 대해 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 테스트하는데 이용되었다. RKO는 비-필수 아미노산, Earle's 염 및 L-글루타민을 함유한 Minimum Essential Medium Eagle(MEM)에서 배양되었다. 배양 배지는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 페니 실린/스트렙토마이신 100 유니트로 보충되었다. 세포는 5% CO2 및 95% 공기의 습한 환경에서 37℃에서 성장되었다. 세포는 0.25% 트립신 및 1mM EDTA로 부착성 세포를 분리하는 것에 의해 각각 3, 4일에 계대배양되었다. 분리된 세포는 새로운 배지를 지닌 스플릿 비율이 1:10∼1:12인 새로운 배양기 내로 분배되었다.
HepG2 세포 배양
인간 간세포암 세포주인 HepG2가 IL-1β로 처리하는 것에 반응하여 TNF-α의 생성을 방해하는 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대하여 영향을 미치는 안티센스 올리고의 능력을 테스트하기 위하여 사용되었다. HepG2 세포는 젠타마이신, 글루타민 및 10% FBS로 채워진 DMEM 내에서 배양되었고 5% CO2 및 95% 공기의 습한 환경에서 37℃에서 성장되었다.
(실시예 7)
아폽토시스의 유도
아폽토시스는 각각 악티노마이신 D(actinomycin D), RNA 중합 저해제 및 캄포테신, 국소이성화효소 저해제를 이용하여 RKO 및 사상세포 내로 유도되었다. 악티노마이신 D는 0.25 ㎍/ml 농도에서 사용되었고 캄포테신은 20, 40 또는 50 μM 농도에서 사용되었다. 아폽토시스는 또한 캄포테신(50 μM)과 TNF-α(10ng/ml)의 조합을 이용하여 사상판 세포로 유도되었다. 캄포테신과 TNF-α의 조합은 캄포테신 또는 TNF-α를 단독으로 사용하는 것보다 아폽토시스를 유도하는데 있어서 더 효과적이라는 것이 밝혀졌다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드
인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 타겟된 3개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 세트는 Molecula Research Labs에 의해 설계되고 획득되었다. 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A(#1)에 대해 타겟된 첫 번째 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 서열은 5'CCT GTC TCG AAG TCC AAG TC 3'(서열번호: 63)이었다. 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A(#2)에 대해 타겟된 두 번째 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 서열은 5'GGA CCT TGG CGT GGC CGT GC 3'(서열번호: 64)이었다. 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A(#3)에 대해 타겟된 세 번째 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 서열은 5'CTC GTA CCT CCC CGC TCT CC 3'(서열번호: 65)이었다. 대조군 올리고뉴클레오타이드는 서열 5'CGT ACC GGT ACG GTT CCA GG 3'(서열번호: 66)이었다. FITC(fluorescein isothiocyanate)-표지된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(Molecula Research Labs)는 트랜스펙션 효율을 모니터하기 위해 사용되었고 서열은 5'GGA CCT TGG CGT GGC CGT GCX 3'(서열번호: 67)이었다. 여기서 X는 FITC 표지를 나타낸다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 충분히 포스포로티오에이트(phosphorothiate)되었다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 트랜스펙션
아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질 발현을 차단하는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 능력은 RKO 세포에서 시험되었다. RKO 세포는 트랜스펙션 시약인 Oligofectamin(Invitrogen)을 이용하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트렌스펙션되었다. 트랜스펙션전 24시간에 세포는 10% FBS로 보충되었으나 페니실린/스트렙토마이신이 부재한 MEM 배지 내의 웰 당 157,000 웰에서 24 웰 플레이트 상에서 분리되었다. 24시간 후 세포는 일반적으로 약 50%의 합류에 도달하였다. RKO 세포는 모의 트랜스펙션되었거나 100 nM 또는 200 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트렌스펙트되었다. 24 웰 플레이트의 하나의 웰에 대해 트랜스펙션 배지 충분한 수량은 무혈청 MEM으로 20 μM 원액 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 0 ㎕, 0.125 ㎕ 또는 2.5 ㎕을 최종 부피가 42.5 ㎕가 되도록 희석하는 것에 의해 준비되었고 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이트하였다. 올리고펙타민(Oligofectamine) 1.5 ㎕은 무혈청 MEM 6 ㎕에서 희석되었고 실온에서 7.5분간 인큐베이트되었다. 5분 후 희석된 올리고펙타민 혼합물은 DNA 혼합물에 첨가되었고 실온에서 20분간 함께 인큐베이트되었다. 세포에 MEM 200 ㎕을 첨가하고 트랜스펙션 배지 50 ㎕을 얇게 뒤덮기 전에 세포는 무혈청 MEM으로 1회 세척 되었다. 세포는 4시간 동안 성장 챔버 내에 암조건 상태로 놓여졌다. 인큐베이션 후 MEM + 30% FBS 125 ㎕가 세포에 첨가되었다. 세포는 24시간 동안 0.25 ㎍/ml 액틴마이오신 D로 처리되어 그 후 48시간 동안 더 배양된 후 세포 추출물은 웨스턴 블럿 분석으로 수집되었다.
사상판 세포의 트랜스펙션은 또한 RKO 세포에 대해서 설명했던 동일한 순서로 100 nM 및 200 nM 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 올리고펙타민을 이용하여 시험되었다. 그러나 사상판 세포의 효과적인 트랜스펙션은 무혈청 배지에서 1 μM에서 10 μM까지 희석된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 24시간 동안 세포에 간단하게 첨가하고 그 후에 총 2∼5일 동안 매 24시간 혈청-함유 배지에서 희석된 신선한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 배지를 교체하는 것에 의해 수행되었다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드 트랜스펙션의 효율은 아폽토시스-특이적 eIF-5A 안티센스 올리고뉴클레오타이드 #2로써 동일한 서열을 지닌 3' 말단에서 FITC에 컨쥬게이트되어 있지는 않지만 FITC-표지된 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙션을 수행하는 것에 의해 활용되거나 모니터되었다. RKO 및 사상판 세포는 8-웰 배양 슬라이드 위에서 FITC-표지된 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트되었다. 48시간 후 세포는 PBS로 세척되었고 PBS내의 3.7% 포름알데하이드 내에서 10분간 고정되었다. 웰은 제거되었고 마운팅 배지(Vectashield)가 첨가되었고 커버슬립으로 덮였다. 세포는 그 후 플루오레세인 필터(Green H546, 필터 세트 48915)를 이용하여 형광 현미경핵 위의 UV 빛 하에서 가시화되었고 밝은 녹색 형광을 내는 세포는 올리고뉴클레오타이드를 취하는 것으로 결정되었다.
아폽토시스의 검출
안티센스 올리고뉴클레오타이드로 사상판의 트랜스펙션 및 캄포테신으로 아폽토시스의 도입 후, 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A 서열번호: 26으로 처리된 세포 내에서 아폽토시스를 진행하는 세포의 비율이 측정되었다. 두 개의 방법이 아폽토틱 사상판 세포를 검출하기 위해 이용되었다 - Hoescht 염색법 및 DeadEndTM Fluorometric TUNEL. 핵 염색은 핵 무사분열 및 응축과 같은 형태학적 특징에 기초하여 아폽토틱 세포를 확인하기 위하여 사상판 세포의 핵을 표지하기 위해 Hoescht 염색법이 이용되었다. 순수한 메탄올 및 결정 아세트산이 3 : 1의 비율로 구성된 염료 고정제는 사용되기 직전에 준비되었다. 동일한 부피의 염료 고정제가 배양 슬라이드 위에서 성장하는 세포의 배지로 첨가되었고 2분간 인큐베이트되었다. 배지/염료 고정제 혼합물은 세포로부터 제거되어 폐기되었고 염료 고정제 1 ml가 세포에 첨가되었다. 5분 후에 염료 고정제는 제거되었고 신선한 염료 고정제 1 ml가 세포에 첨가되었고 5분간 인큐베이트되었다. 염료 고정제는 제거되었고 세포는 Hoescht 염색 1 ml(PBS 내의 0.5㎍/ml Hoescht 33258)가 첨가되기 전에 4분간 공기-건조되었다. 암조건에서 10분간 인큐베이션 후 염색된 용액은 버려졌고 배양 슬라이드의 웰을 분리하는 챔버는 제거되었고 슬라이드는 탈이온수로 1분간 3회 세척되었다. 세척 후 McIlvaine 완충액(0.021M 시트르산, 0.058M Na2HPO4·7H2O; pH 5.6)이 세포에 몇 방울 첨가되었고 커버슬립으로 덮여졌다. 염색된 세포는 UV 필터를 사용하여 형광 현미경으로 관찰되었다. 밝게 염색되거나 파괴된 핵을 지닌 세포는 아폽토시스로 기록되었다. 웰 당 최소 200개의 세포가 계산되었다.
DeadEndTM Fluorometric TUNEL(Promega)은 아폽토틱 세포의 특유한 특징인 DNA 파괴를 검출하기 위해 이용되었다. Hoescht 염색 후 배양 슬라이드는 증류수로 간단하게 세척되었고 PBS(137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4)에서 5분간 두 번 슬라이드를 침지시키는 것에 의해 더욱 세척되었다. 두 번의 세척 사이에 종이 타월 위에 슬라이드를 블럿(blot)하였다. 세포는 5분 동안 PBS 내의 0.2% Triton X-100 내에 침지됨으로서 투수되었다. 세포는 그 후 PBS에서 5분 동안 두 번 슬라이드를 침지시키는 것에 의해 다시 세척되었고 두 번의 세척 사이에 종이 타월 위에 슬라이트를 블럿하였다. 평형 완충액[200 mM 카코딜레이트 칼륨(potassium cacodylate)(pH 6.6), 25 mM Tris-HCl(pH 6.6), 0.2 mM 디티오트레이톨(dithithreitol), 0.25 mg/ml 우혈청 알부민 및 2.5mM 염화코발트] 25 ㎕를 웰 당 첨가하였고 5∼10분간 인큐베이트하였다. 평형 완충액, 뉴클레오타이 드 믹스[50 μM 플루오레세인-12-dUTP, 100 μM dATP, 10 mM Tris-HCl(pH 7.6) 및 1 mM EDTA] 및 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 효소(terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme, Tdt, 25 U/㎕)가 각각 45:5:1의 비율로 혼합된 반응 혼합물 30 ㎕이 평형 동안 각 웰에 대해 준비되었다. 평형 완충액 안에서의 인큐베이션 후 반응 혼합물 30 ㎕이 웰 당 첨가되었고 커버슬립으로 덮여졌다. 반응은 1시간 동안 37℃의 암조건에서 계속되었다. 반응은 2 X SSC[0.3 M NaCl 및 30 mM 구연산 나트륨(pH 7.0)]에서 슬라이드를 담구는 것에 의해 종결되었고 15분 동안 인큐베이트하였다. 슬라이드는 그 후 5분간 3회 PBS에 침지시키는 것에 의해 세척되었다. PBS는 Kim wipe로 웰 주변을 빨아들이는 것으로 제거되었고 마운팅 배지 한 방울(Oncogene research project, JA1750-4ML)은 각각의 웰에 첨가되었고 슬라이드는 커버슬립으로 덮여졌다. 세포는 Hoescht-염색된 핵의 수를 세기 위해 UV 필터(UVG 365, 필터 세트 487902)를 이용하여 형광 현미경으로 관찰되었다. 밝게 염색되거나 파괴된 핵을 갖는 어떠한 세포도 아폽토틱으로 계산되었다. 동일한 시야에서 세포는 그 후 플루오레세인 필터를 이용하여 관찰되었고 밝은 녹색으로 형광된 어떠한 핵도 아폽토시스로 계산되었다. 시야에서 아폽토시스 세포의 비율은 플루오레세인 필터를 이용하여 계산된 밝은 녹색 핵의 수를 UV 필터 하에서 계산된 총 핵의 수로 나누는 것에 의해 계산되었다. 웰 당 최소 200개의 세포가 계산되었다.
도 78∼82는 이러한 연구의 결과를 나타낸다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A로 트랜스펙트된 표본에서 아폽토시스 세포의 비율은 대조군 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트된 세포에서 나타난 것보다 명백히 훨씬 더 적었다.
단백질 추출 및 웨스턴 블럿
트랜스펙트된 RKO 세포로부터의 단백질은 PBS로 세포를 세척하고 웰 당 뜨거운 세포용해 완충액[0.5% SDS, 1 mM 디티오트레이톨, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)]을 첨가하는 것에 의해 웨스턴 블럿 분석을 위해 수집되었다. 세포는 폐기되었고 추출 결과물은 마이크로퓨즈 튜브에 옮겨졌고 5분 동안 끓이고 -20℃에 저장되었다. 단백질은 제조사의 지시에 따라 Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad)를 이용하여 양을 측정하였다.
웨스턴 블럿을 위해 총 단백질 5 ㎍이 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 위에서 분리되었다. 분리된 단백질은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 옮겨졌다. 멤브레인은 블록 용액(PBS 내 5% 탈지 우유 분말)에서 1시간 동안 인큐베이트되었고 0.05% Tween-20/PBS로 15분간 3회 세척되었다. 멤브레인은 밤새 4℃ PBS-T 내에서 보관되었다. 다음날 실온으로 데워진 후 멤브레인은 1 ㎍/ml의 폴리비닐 알코올 내에서 30초간 블록되었다. 멤브레인은 탈이온수로 5회 세척된 후 0.025% Tween-20/PBS 내 5% 우유 용액 내에서 30분간 블록되었다. 1차 항체는 멤브레인과의 인큐베이션 전에 0.025% Tween-20/PBS 내 5% 우유 용액에서 30분간 미 리 인큐베이트되었다.
여러 1차 항체가 사용되었다. p53(Ab-6) 및 다클론성 항체를 인지하는 Oncogene에서 단일클론성 항체는 닭에서 야기된 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 c-종결 말단과 상동인 합성 펩타이드(아미노-CRLPEGDLGKEIEQKYD-카르복시)(서열번호: 68)에 대해 영향을 미쳤다(Gallus Immunotech). 항-β-액틴 항체(Oncogene)는 또한 단백질의 동일한 로딩(loading)을 설명하는데 이용되었다. p53에 대한 단일클론성 항체는 0.05 ㎍/ml로 희석되어 사용되었고 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 항체는 1:1000로 희석되어 사용되었으며 액틴에 대한 항체는 1:20,000으로 희석되어 사용되었다. 60∼90분 동안 1차 항체로 인큐베이션한 후 멤브레인은 Tween-20/PBS에서 15분 동안 3번 세척되었다. 2차 항체는 그 후 0.025% Tween-20/PBS 내 1% 우유로 희석되었으며 60∼90분 동안 멤브레인과 인큐베이트되었다. p53(Ab-6)이 1차 항체로 사용된 경우 사용된 2차 항체는 1:5000으로 희석된 퍼옥시다제(Sigma)에 컨쥬게이트된 토끼 항-마우스 IgG이었다. 항-아폽토시스-특이적 eIF-5A가 1차 항체로 사용된 경우 퍼옥시다제(Gallus Immunotech)에 컨쥬게이트된 토끼-항닭 IgY가 1 : 5000으로 희석되어 사용되었다. 액틴과 사용된 2차 항체는 1 : 5000으로 희석되어 사용된 퍼옥시다제(Calbiochem)에 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgM이었다. 2차 항체와 인큐베이션 후 멤브레인은 PBS-T에서 3회 세척되었다.
ECL 플러스 웨스턴 브럿팅 검출 키트(Amersham Pharmacia Biotech)는 항체를 결합한 퍼옥시다제-컨쥬게이트를 검출하기 위해 사용되었다. 간단히, 멤브레인은 가볍게 블럿드 드라이된 후 시약 A와 시약 B의 40 : 1 혼합으로 5분간 암조건으로 인큐베이트되었다. 멤브레인은 블럿드 드라이되었고 아세테이트 시트(sheet) 사이에 놓였고 10초에서 30분까지 다양한 기간 동안 X-선 필름에 노출되었다. 멤브레인은 스트립핑 완충액(stripping buffer)[100 mM 2-머캅토에탄올, 2% SDS 및 62.5 mM Tris-HCl(pH 6.7)]내로 멤브레인을 침지시킴으로서 제거되었고 30분 동안 50℃에서 인큐베이트되었다. 멤브레인은 그 후 탈이온수로 세척되었고 큰 부피의 0.05% Tween-20/PBS에서 10분 동안 2회 세척되었다. 멤브레인은 제거되었고 3회 재블럿되었다.
(실시예 8)
siRNA의 구축
인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 낮은 저해 RNAs(small inhibitory RNAs, siRNA)는 RKO 및 사상판 세포에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현을 특이적으로 억제하는데 사용되었다. 6개의 siRNAs는 Silencer TM siRNA 구축 키트(Ambion Inc.)를 이용하여 생체 내 전사에 의해 발생되었다. 4개의 siRNAs는 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 발생되었다(siRNAs #1∼ #4)(서열번호: 30∼33). 도 70 참조. 2개의 siRNAs는 대조군으로써 이용되었다; 키트내로 공급된 GAPDH에 대해 지시된 siRNA, 그 자신은 아폽토시스-특이적 eIF-5A을 타겟으로 하지 않으나 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA #1(서열번호: 30)의 역서열을 지닌 siRNA(siRNA #5)(서열번호: 34). siRNAs는 제조사의 프로토콜에 따라 생성되었다. 간단히, 원하는 siRNA 가닥을 인코드하는 DNA 올리고뉴클레오타이드는 siRNA의 개별적 가닥을 생성시키기 위해 T7 프로모터 프라이머의 어닐링 및 Klenow 단편과의 반응 충족 후에 T7 RNA 중합효소에 대한 주형으로써 사용되었다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥 모두에 대한 전사 반응 후에 반응은 결합되었고 2개의 siRNA 가닥은 어닐링되었고 DNase 및 RNase로 처리된 후 컬럼은 정화되었다. siRNAs를 생성시키기 위해 사용된 DNA 올리고뉴클레오타이드(밑줄은 T7 프라이머 어닐링 부분)의 서열은 다음과 같았다: siRNA #1 안티센스 5' AAAGGAATGACTTCCAGCTGACCTGTCT 3' (서열번호: 69) 및 siRNA #1 센스 5' AATCAGCTGGAAGTCATTCCTCCTGTCTC 3'(서열번호: 70); siRNA #2 안티센스 5' AAGATCGTCGAGATGTCTACTCCTGTCTC 3'(서열번호: 71) 및 siRNA #2 센스 5' AAAGTAGACATCTCGACGATCCCTGTCTC 3'(서열번호: 72); siRNA #3 안티센스 5' AAGGTCCATCTGGTTGGTATTCCTGTCTC 3'(서열번호: 73) 및 siRNA #3 센스 5' AAAATACCAACCAGATGGACCCCTGTCTC 3'(서열번호: 74); siRNA #4 안티센스 5' AAGCTGGACTCCTCCTACACACCTGTCTC 3'(서열번호: 75) 및 siRNA #4 센스 5' AATGTGTAGGAGGAGTCCAGCCCTGTCTC 3'(서열번호: 76); siRNA #5 안티센스 5' AAAGTCGACCTTCAGTAAGGACCTGTCTC 3'(서열번호: 77) 및 siRNA #5 센스 5' AATCCTTACTGAAGGTCGACTCCTGTCTC 3'(서열번호: 78).
Silencer TM siRNA 표지 키트-FAM(Ambion)은 RKO 및 사상판 세포 내로 siRNA의 업테이크(uptake)를 모니터하기 위해 FAM으로 GAPDH siRNA를 표지하는데 사용되었다. 8-웰 배양 슬라이드에서 트랜스펙션 후, 세포는 PBS로 세척되었고 PBS 내 3.7% 포름알데하이드에서 10분 동안 고정되었다. 웰은 제거되었고 마운팅 배지(Vectashiled)는 첨가되었고 커버슬립으로 덮여졌다.FAM-표지된 siRNA의 업테이크는 플루오레세인 필터를 이용하여 UV 빛 하에서 형광 현미경으로 관찰되었다. GAPDH siRNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 표지되었다.
siRNA의 트랜스펙션
RKO 세포 및 사상판 세포는 동일한 트랜스펙션 프로토콜을 이용하여 siRNA로 트랜스펙트되었다. RKO 세포는 각각 웰 당 46,000개 세포 및 105,800개 세포의 밀도로 8-웰 배지 슬라이드 또는 24-웰 플레이트에서 트랜스펙션 전날 뿌려졌다. 사상판 세포는 트랜스펙션 3일 전 세포 합류가 40∼70%이고 웰 당 7500∼10,000개의 세포로 8-웰 배양 슬라이드 위에 일반적으로 뿌려진 경우 트랜스펙트되었다. 8-웰 배양 슬라이드의 하나의 웰에 대해 충분한 트랜스펙션 배지는 Opti- Mem(Sigma)에서 siRNA 원액 25.5 pmole을 최종 부피 21.2 ㎕가 되도록 희석함으로서 제조되었다. 0.425 ㎕의 리포펙타민(Lipofectamine) 2000은 Opti-Mem에서 최종 부피가 21.2 ㎕가 될 때까지 희석되었고 실온에서 7∼10분 동안 인큐베이트되었다. 희석된 리포펙타민 2000 혼합물은 그 후 희석된 siRNA 혼합물에 첨가되었고 20∼30분 동안 실온에서 함께 인큐베이트되었다. 세포에 무혈청 배지 135 ㎕를 첨가하고 트랜스펙션 배지 42.4 ㎕를 덮기 전에 세포는 무혈청 배지로 1회 세척되었다. 세포는 다시 4시간 동안 성장 챔버 내로 놓였다. 인큐베이션 후 무혈청 배지 65 ㎕ + 30% FBS는 세포에 첨가되었다. 웨스턴 블럿 분석을 위해 사용되는 세포 내로의 siRNA의 트랜스펙션은 부피가 2.3배 증가한 것을 제외하고는 8-웰 슬라이드에서의 트랜스펙션과 동일한 조건으로 24-웰 플레이트에서 수행되었다.
트랜스펙션 후, RKO 및 사상판 세포는 웨스턴 블럿 분석을 위한 세포 추출물을 수집하기 전에 72시간 동안 인큐베이트되었다. 아폽토시스를 방해하는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNAs의 유효성을 측정하기 위해 사상판 세포는 트랜스펙션 후 48시간 또는 72시간에서 아폽토시스를 유발시키기 위해 캄포테신(Sigma) 50 μM 및 TNF-α 10 ng/ml로 처리되었다. 세포는 아폽토시스를 진행하는 세포의 비율을 결정하기 위해 24시간 또는 48시간 후에 Hoescht로 염색되었다.
(실시예 9)
HepG2 TNF-α 생성의 정량화
HepG2 세포는 48-웰 플레이트 위에서 웰 당 20,000세포로 플레이트되었다. 72시간 후 배지는 제거되었고 2.5 μM의 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드 2.5 μM 또는 2.5 μM의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A #2를 함유한 신선한 배지가 세포에 첨가되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유한 신선한 배지는 24시간 후에 첨가되었다. 올리고뉴클레오타이드와의 인큐베이션 총 48시간 후, 배지는 인터루킨 1β(IK-1β, 1000 pg/ml; Leinco Technologies)을 함유한 배지로 교체되었고 6시간 동안 인큐베이트되었다. TNF-α 정량화를 위해 배지는 수집되었고 냉동되었다(-20℃). 처리되지 않은 세포와 IL-1β로만 처리된 세포와의 추가적인 대등한 인큐베이션은 대조군을 위해 이용되었다. 모든 처리는 2반복으로 수행되었다. 배지 내로 방출된 TNF-α는 제조사의 프로토콜에 따라 ELISA 에세이(Assay Designs Inc.)로 측정되었다.
(실시예 10)
하기의 실험은 안티센스 아폽토시스-특이적 eIF-5A 뉴클레오타이드가 아폽토시스-특이적 eIF-5A 뿐만 아니라 p53의 발현도 저해할 수 있음을 나타낸다.
RKO 세포는 트랜스펙트되지 않은 채로 있거나, 모의 트랜스펙트되거나 또는 200 nM의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A #1, #2 또는 #3(서열번호: 25, 26 및 27)으로 트랜스펙트되었다. RKO 세포는 또한 100 nM의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A #2(서얼변호: 26)로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 48시간 후 세포는 0.25 ㎍/ml 악티노마이신 D로 처리되었다. 24시간 후 세포 추출물은 채취되어 각 표본으부터의 단백질 5 ㎍이 SDS-PAGE 젤 위에서 분리되었고, PVDF 멤브레인으로 옮겨졌고, 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 항체로 웨스턴 블럿되었다. 화학발광 검출 후, 멤브레인은 제거되었고 p53에 대한 항체로 다시 프로브되었다. 화학발광 검출 후, 멤브레인은 다시 제거되었고 액틴에 대한 항체로 다시 프로브되었다. 안티센스 올리고 1, 2 및 3(아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한)(각각 서열번호: 25, 26 및 27)으로 처리된 후 RKO 세포에 의해 생성된 단백질의 수준을 나타내는 도 42 참조. RKO 세포는 안티센스 아폽토시스-특이적 eIF-5A 뉴클레오타이드로 트랜스펙트된 후 아폽토시스-특이적 eIF-5A도 더 적게 생산할 뿐만 아니라 p53도 더 적게 생산하였다.
(실시예 11)
하기의 실험은 안티센스 아폽토시스-특이적 eIF-5A 뉴클레오타이드가 아폽토시스를 감소시키는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
하나의 실험에서, 사상판 세포주 #506은 (A) 올리고펙타민 트랜스펙션 시약을 이용하여 FITC-표지된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 100 nM로 트랜스펙트되거나 (B) 무혈청 배지에서 직접 희석된 그대로의 FITC-표지된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 10 μM로 트랜스펙트되었다. 24시간 후 10% FBS를 함유한 배지 및 10 μM로 희석된 신선한 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 세포에 첨가되었다. (A) 및 (B)의 세포는 총 48시간 후 고정되었고 플루오레세인 필터를 이용하여 UV 광 하에서 형광현미경으로 관찰되었다. 도 77A 및 B는 형광 표지된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 흡수를 나타낸다.
또다른 실험에서, 사상판 세포주 #506은 총 4일 동안 10μM의 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A #2(서열번호: 26)로 트랜스펙트되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 시작 48시간 후 세포는 48시간 동안 캄포테신 20 μM 또는 40 μM로 처리되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 캄포테신-함유 배지는 매일 교체되었다. 아폽토시스 세포의 비율은 Hoescht 및 TUNEL로 세포를 표지함으로서 측정되었다. 도 78 참조.
또다른 실험에서, 사상판 세포주 #506은 10 μM의 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A #2(서열번호: 26)로 트랜스펙트되었다. 24시간 후 배지는 교체되었고 신선한 안 티센스 올리고뉴클레오타이드가 첨가되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 시작 48시간 후 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 제거되었고 세포는 3일 동안 캄포테신 20 μM로 처리되었다. 캄포테신-함유 배지는 매일 교체되었다. 아폽토시스 세포의 비율은 Hoescht 및 TUNEL로 세포를 표지함으로서 측정되었다. 도 79 참조.
또다른 실험에서, 사상판 세포주 #517은 총 5일 동안 1 μM의 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A #2(서열번호: 26)로 트랜스펙트되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 시작 48시간 후 세포는 3일 또는 4일 동안 캄포테신 20 μM으로 처리되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 캄포테신-함유 배지는 매일 교체되었다. 아폽토시스 세포의 비율은 Hoescht 및 TUNEL로 세포를 표지함으로서 측정되었다. 도 80 참조.
또다른 실험에서, 사상판 세포주 #517은 총 5일 동안 2.5 μM의 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A #2(서열번호: 26)로 트랜스펙트되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 시작 48시간 후 세포는 3일 동안 캄포테신 40 μM으로 처리되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 캄포테신-함유 배지는 매일 교체되었다. 아폽토시스 세포의 비율은 Hoescht로 세포를 표지함으로서 측정되었다. 도 81 참조.
또다른 실험에서, 사상판 세포주 #517은 총 5일 동안 1 μM 또는 2.5 μM의 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A #2(서열번호: 26)로 트랜스펙트되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 시작 48시간 후 세포는 3일 동안 캄포테신 40 μM으로 처리되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 캄포테신-함유 배지는 매일 교체되었다. 아폽토시스 세포의 비율은 Hoescht로 세포를 표지함으로서 측정되었다. 도 82 참조.
또다른 실험에서, 사상판 세포주 #517은 처리되지 않거나 TNF-α 10 ng/ml, 캄포테신 50 μM 또는 TNF-α 10 ng/ml과 캄포테신 50 μM로 처리되었다. 아폽토시스 세포의 비율은 Hoescht로 세포를 표지함으로서 측정되었다. 도 83 참조.
또다른 실험에서, 사상판 세포주 #506 및 #517은 총 2일 동안 2.5 μM 또는 5 μM의 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A #2(서열번호: 26)로 트랜스펙트되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유한 신선한 배지가 24시간 후에 첨가되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 시작 48시간 후 세포는 2일 동안 캄포테신 50 μM 및 TNF-α 10 ng/ml으로 처리되었다. 아폽토시스 세포의 비율은 Hoescht로 세포를 표지함으로서 측정되었다. 도 84 참조.
또다른 실험에서, 사상판 세포주 #506, #517 및 #524는 총 2일 동안 2.5 μM의 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A #2(서열번호: 26)로 트랜스펙트되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유한 신선한 배지가 24시간 후에 첨가되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 처리 시작 48시간 후 세포는 2일 동안 캄포테신 50 μM 및 TNF-α 10 ng/ml으로 처리되었다. 아폽토시스 세포의 비율은 Hoescht로 세포를 표지함으로서 측정되었다. 도 85 참조.
(실시예 12)
하기의 실험은 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 타겟된 siRNAs로 트랜스펙트된 세포가 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 더 적게 발현함을 나타낸다. 본 실험은 또한 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 타겟된 siRNAs가 아폽토시스를 감소시키는 것이 가능함을 나타낸다.
하나의 실험에서, 사상판 세포주 #517은 트랜스펙션 동안 (A) 혈청이 있거나, (B) 혈청이 없는 리포펙타민 2000 트랜스펙션 시약을 이용하여 FAM-표지된 siRNA 100 nM로 트랜스펙트되었다. (A) 및 (B)의 세포는 총 24시간 후 고정되었고 플루오레세인 필터를 이용하여 UV 광 하에서 형광 현미경으로 관찰되었다. 도 86 참조.
또다른 실험에서, RKO 세포는 트랜스펙션 동안 혈청이 있거나 혈청이 없는 siRNA 100 nM으로 트랜스펙트되었다. 2개의 대조군 siRNAs(siRNA #5(서열번호: 34) 및 GAPDH에 대해 타겟된 것) 및 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 타겟된 4개의 siRNAs(siRNA #1∼#4)(서열번호: 30∼33)로 총 6개의 siRNAs가 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 72시간 후 세포 추출물은 채취되어 각 표본으로부터 단백질 5 ㎍이 SDS-PAGE 겔 위에서 분리되어 PVDF 멤브레인으로 옮겨져 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 항체로 웨스턴 블럿되었다. 화학발광 검출 후, 멤브레인은 제거되었고 bcl-2에 대한 항체로 다시 프로브되었다. 화학발광 검출 후, 멤브레인은 다시 제거되었고 액틴에 대한 항체로 다시 프로브되었다. 도 98 참조.
또다른 실험에서 사상판 세포주 #506 및 #517은 siRNA 100 nM로 트랜스펙트되었다. 2개의 대조군 siRNAs(siRNA #5(서열번호: 34) 및 GAPDH에 대해 타겟된 것) 및 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 타겟된 4개의 siRNAs(siRNA #1∼#4)(서열번호: 30∼33)로 총 6개의 siRNAs가 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 72시간 후 세포 추출물은 채취되어 각 표본으로부터 단백질 5 ㎍이 SDS-PAGE 겔 위에서 분리되어 PVDF 멤브레인으로 옮겨져 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 항체로 웨스턴 블럿되었다. 화학발광 검출 후, 멤브레인은 제거되었고 액틴에 대한 항체로 다시 프로브되었다. 도 99 참조.
또다른 실험에서 사상판 세포주 #506은 siRNA 100 nM로 트랜스펙트되었다. 2개의 대조군 siRNAs(siRNA #5(서열번호: 34) 및 GAPDH에 대해 타겟된 것) 및 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 타겟된 4개의 siRNAs(siRNA #1∼#4)(서열번호: 30∼33)로 총 6개의 siRNAs가 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 48시간 후 배지는 캄포테신 50 μM 및 TNF-α 10 ng/ml를 함유한 배지로 교체되었다. 24시간 후, 아폽토시스 세포의 비율은 Hoescht로 세포를 표지함으로서 측정되었다. 도 87 참조.
또다른 실험에서 사상판 세포주 #506은 siRNA 100nM로 트랜스펙트되었다. 2개의 대조군 siRNAs(siRNA #5(서열번호: 34) 및 GAPDH에 대해 타겟된 것) 및 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 타겟된 4개의 siRNAs(siRNA #1∼#4)(서열번호: 30∼33)로 총 6개의 siRNAs가 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 72시간 후 배지는 캄포테신 50 μM 및 TNF-α 10 ng/ml를 함유한 배지로 교체되었다. 24시간 후, 아폽토시스 세포의 비율은 Hoescht로 세포를 표지함으로서 측정되었다. 도 88 참조.
또다른 실험에서 사상판 세포주 #506은 트랜스펙트되지 않은 채로 있거나 siRNA 100 nM로 트랜스펙트되었다. 2개의 대조군 siRNAs(siRNA #5(서열번호: 34) 및 GAPDH에 대해 타겟된 것) 및 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 타겟된 4개의 siRNAs(siRNA #1∼#4)(서열번호: 30∼33)로 총 6개의 siRNAs가 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 72시간 후 배지는 캄포테신 50 μM 및 TNF-α 10 ng/ml를 함유한 배지 로 교체되었다. 신선한 배지는 처리되지 않은 대조군 세포인 트랜스펙트되지 않은 것에도 첨가되었다. 48시간 후, 아폽토시스 세포의 비율은 Hoescht로 세포를 표지함으로서 측정되었다. 도 89 참조.
도 67 및 실시예 13에 기술된 실험으로부터의 siRNA로 트랜스펙트되고 캄포테신 및 TNF-α로 처리된 Hoescht-염색된 사상판 세포주 #506 사진은 도 90에 제공된다.
(실시예 13)
본 실험은 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 지닌 인간 세포주를 처리하는 것이 세포가 TNF-α를 더 적게 생성하게 함을 나타낸다.
HepG2 세포는 총 2일 동안 2.5 μM의 대조군 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 아폽토시스-특이적 eIF-5A #2로 처리되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유한 신선한 배지는 24시간 후에 첨가되었다. 추가된 세포는 2일 동안 처리되지 않았다. 처리가 시작된 24시간 후 세포는 6시간 동안 신선한 배지에서 IL-1β(1000 pg/ml)로 처리되었다. 실험 종료시 배지는 TNF-α 정량화를 위해 수집되었고 냉동되었다(-20℃). 배지 내로 분비된 TNF-α 는 ELISA 에세이(Assay Designs Inc.)로 측정되었다. 도 100 참조. 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 트랜스펙트된 세포는 TNF-α를 더 적게 생성하였다.
(실시예 14)
HT-29 세포(인간 결장 선암종)는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA 또는 역서열을 지닌 대조군 siRNA로 트랜스펙트되었다. 사용된 siRNA는 다음과 같다:
위치 690(3'UTR) % G/C=48
5' AAGCUGGACUCCUCCUACAC 3'(서열번호: 79)
사용된 대조군 서열은 다음과 같다:
% G/C=39
5' AAACACAUCCUCCUCAGGUCG 3'(서열번호: 80)
48시간 후 세포는 16시간 동안 인터페론-감마(IFN-γ)로 처리되었다. 16시간 후 세포는 신선한 배지로 세척되었고 리포폴리사카라이드(LPS)로 8시간 또는 24시간 동안 처리되었다. 각 시점(8시간 또는 24시간)에서 세포 배양 배지는 세포로부터 제거되어 냉동되었고 배지에 존재하는 TNF-α는 ELISA에 의해 정량화되었 다. 세포 용해질 역시 채취되어 단백질에 대해 정량화되었으며 pg/mg 단백질에 대한 TNF-α 수치의 조정하는데 사용되었다(다른 웰에서의 세포 수 차이에 대해 조정하기 위해). 웨스턴 블럿 및 ELISA의 결과는 도 101a 및 b에 나타나 있다. 도 102는 세포가 더 높은 밀도로 존재한 것을 제외하고는 동일한 실험의 결과를 나타낸다.
(실시예 15)
U-937 세포주의 조직 배양 조건
U-937은 현탁액 내에서 성장하고 PMA(ATCC No. CRL-1593.2)(ATCC로부터 직접 수득된 세포는 아님)로 자극시 대식세포 내로 부착되거나 분화하는 인간 단핵세포 세포주이다. 세포는 37℃의 CO2(5%) 내 L-글루타민 2 mM, 중탄산나트륨 1.5 g/L, 글루코스 4.5 g/L, HEPES 10 mM, 피루브산나트륨 1.0 mM 및 FBS(fetal bovine serum) 10%를 지닌 RPMI 1640 배지에서 유지되었다. 세포는 주 2회 신선한 배지 내로 분할되었고(1:4 또는 1:5의 분할비율) 세포 밀도는 항상 105 내지 2 x 106 세포/ml 사이에서 유지되었다. 세포는 조직 배양-처리 플라스틱 T-25 플라스크 내의 현탁액 내에서 배양되었고 실험은 24-웰 플레이트에서 수행되었다.
시간 경과 실험
실험 시작 2일 전, 세포 밀도는 3 x 105 세포/ml 배지로 조정되었다. 실험 당일 세포는 성장기(log phase)로 채취되었다. 세포 현탁액은 15 ml의 시험관으로 옮겨졌고 실온에서 10분 동안 400 x g에서 원심분리되었다. 상청액은 흡입되었고 세포 펠렛은 신선한 배지로 세척/재현탁되었다. 세포는 다시 10분 동안 400 x g에서 원심분리되었고 상청액은 흡입되고 세포 펠렛은 최종적으로 신선한 배지에서 재현탁되었다. 세포 현탁액과 트리판 블루 용액(PBS 내 트리판 블루 염료 0.4%)이 같은 부피로 혼합되었고 살아있는 세포는 헤모사이토미터(haemocytometer) 및 현미경을 이용하여 계산되었다. 세포는 4 x 105 세포/ml로 희석되었다.
24-웰 플레이트는 각각의 웰에 PMA 또는 DMSO(용액 조절)를 첨가하는 것으로 준비되었다. 각각의 웰이 400,000개의 세포, 0.1% DMSO +/- 162nM PMA을 함유하기 위해 세포 현탁액 1 ml가 각각의 웰에 첨가되었다. 세포는 37℃ CO2(5%) 인큐베이터에서 유지되었다. 세포의 각각의 웰은 0, 24, 48, 72, 96, 99 및 102 시간에 채취되었다. 실험 시간 시점 및 추가의 개요에 대해서는 도 126 참조.
배지는 72시간에서 교체되었다. 일부 세포들이 부착되고 다른 일부는 현탁되어 있었기 때문에 부착된 세포의 분열을 방지하기 위해 주의가 요구되었다. 각 각의 웰의 배지는 상응하는 마이크로원심분리관 내로 조심스럽게 옮겨졌고 튜브는 3분 동안 14,000 x g에서 원심분리되었다. 튜브는 흡입되었고 세포 펠렛은 신선한 배지(1 ml, (-)DMSO, (-)PMA)에서 재현탁되었고 본래의 웰로 복귀되었다. 세포는 PMA 없는 신선한 배지에서 정치되었다. 96시간에, LPS(100 ng/ml)가 첨가되었고 세포는 3시간 후(99시간) 및 6시간 후(102시간)에 채취되었다.
이러한 시점에서 현탁액 세포 및 배지는 각각의 웰에서 마이크로원심분리관으로 옮겨졌다. 세포는 3분 동안 14,000 x g에서 펠렛되었다. 배지(상청액)는 청결한 시험관으로 옮겨졌고 ELISA/사이토카인 분석을 위해 보관되었다(-20℃). 웰에 남아있는 세포는 PBS(1 ml, 37℃)로 세척되었고 또한 PBS는 상응하는 마이크로원심분리관에서 세포 펠렛을 세척하는데에도 이용되었다. 세포는 다시 3분 동안 14,000 x g에서 펠렛되었다. 세포는 끓는 세포용해 완충액(50 mM Tris pH 7.4 및 2% SDS)에서 세포용해되었다. 각각의 웰에 부착한 세포 및 현탁액 세포는 수집되었다. 표본은 끓여진 후 -20℃에서 보관되었다.
웨스턴 블럿팅
각각의 세포 표본 내의 단백질 농도는 기준 단백질로써 BSA(소혈청 알부민)을 사용하여 BCA(비신코닌산)법으로 결정되었다. 단백질 표본(총 단백질 5 ㎍)은 12% SDS-PAGE 전기영동으로 분리되었고 PVDF 멤브레인으로 옮겨졌다. 멤브레인은 폴리비닐알콜(1㎍/ml, 30초)와 PBS-t(1시간) 내 5% 탈지 우유로 블록되었다. 멤브레인은 인간 eIF-5A(BD Biosciences cat #611976l; 5% 탈지 우유 내 1:20,000, 1시간)에 대해 야기되는 마우스 단일클론성 항체로 프로브되었다. 멤브레인은 3 x 10 분 동안 PBS-t로 세척되었다. 2차 항체는 양고추냉이 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 항마우스 항체였다(Sigma, 1% 탈지 우유 내 1:5000, 1시간). 멤브레인은 3 x 10 분 동안 PBS-T로 세척되었다. 단백질 밴드는 화학발광에 의해 가시화되었다(ECL 검출 시스템, Amersham Pharmacia Biotech).
각 겔 레인에 로드된 유사한 양의 단백질을 설명하기 위해 멤브레인은 제거되었고 액틴에 대해 다시 프로브되었다. 멤브레인은 제거되었고(100 mM 2-머캅토에탄올, 2% SDS, 62.5 mM Tris-Hcl pH 6.7; 50℃에서 30분 동안) 세척되어 상기와 같이 블록되었다. 멤브레인은 액틴 1차 항체로 프로브되었다(마우스에서 제조된 액틴 단일클로 항체; Oncogene, Ab-1; 5% 스팀 우유 내 1:20,000). 2차 항체는 상기와 동일한 방법으로 세척되고 검출되었다.
도 127은 eIF-5A가 단핵세포(U-397) 분화 및 수반하는 TNF-α 분비 동안 상향 조절됨을 나타낸다.
(실시예 16) 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA에 의해 인터페론 감마에 반응하는 Il-8 생성의 억제
HT-29(인간 결장 선암종) 세포는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 지시된 siRNA로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙트 약 48시간 후 시험 표본의 일부는 인터페론 감마를 지닌 배지를 지니고 표본의 일부는 인터페론 감마가 없는 배지를 지니도록 배지가 교환되었다. 인터페론 감마 첨가 16시간 후 세포는 세척되었고 TFN-α가 있거나 또는 없는 배지가 세포 위에 놓였다. 배지(IL-8의 ELISA 검출에 사용되는) 및 세포 용해질은 8시간 및 24시간 후에 채취되었다.
도 103 및 도 106은 IL-8이 인터페론뿐만 아니라 TNF-α에도 반응하여 생성됨을 나타낸다. TNF 처리 전 인터페론 감마로 세포를 프라이밍(priming)하는 것은 세포가 어느 하나의 단독으로 처리하는 것 보다 더 많은 IL-8을 생성하게 한다. 이는 인터페론에 반응하는 TNF 수용체 1의 알려진 상향조절 때문일 수도 있고, 따라서 세포를 인터페론으로 '프라이밍'하는 것은 세포가 더 많은 수용체를 갖기 때문에 세포가 TNF에 더 잘 반응하게 한다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA은 단지 TNF에만 반응하는 IL-8 생성에는 효과가 없으나(이전의 실험), siRNA는 인터페론에 반응하여 생성된 대부분의 IL-8뿐만 아니라 인터페론과 TNF를 결합하여 처리한 결과로써 생성된 IL-8의 유의적인 양을 차단한다. 이러한 결과는 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNAs를 이용함으로서 본 발명자들이 TNF 경로가 아닌 IL-8을 유도하는 인터페론 신호전달 경로를 지님을 나타낸다. 도 105는 HT-29 세포에서 인터페론 감마에 반응하여 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 상향 조절(8시간에서 4배)을 나타내는 웨스턴 블럿을 나타낸다.
(실시예 17)
인간 사상판 배양
캐나다 온타리오 디비젼의 Eye Bank로부터 사후 48시간 이내의 한 쌍의 인간의 안구가 수득되었다. 시신경 유두(부착된 전극으로)는 제거되었고 항생물질/항진균, 글루타민 및 10% FBS를 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM) 내에 3시간 동안 두었다. 시신경 유두(ONH) 버튼이 각 조직 표본으로부터 회수되었고 정밀한 해부 가위로 4개의 작은 조각으로 잘게 썰었다. 외식편은 DMEM 배지에서 12.5 ㎠ 플라스틱 배양 플라스크에서 배양되었다. 생존 가능한 외식편에서 한달 이내에 성장이 관찰되었다. 세포가 90% 합류에 도달하면 세포는 트립신처리되었고 사상판(LC) 및 성상세포 개체를 생성하기 위해 차별적 계대배양이 수행된다. 구체적으로는 LC 세포는 젠타마이신, 글루타민 및 10% FBS를 함유한 DMEM에서 25 ㎠에서 계대배양되었고 반면 성상세포는 FBS 없이 EBM 완전 배지(Clonetics)를 함유하는 25 ㎠ 플라스크에 전개되었다. 세포는 이러한 절차에 의하여 유지되었고 계대배양되었다.
차별적 계대배양에 의해 수득된 세포 개체의 확인 및 개체 순도는 8-웰 배양 슬라드이에서 특이적인 형광 항체 염색을 이용하여 특성화되었다. 세포는 10% 포르말린 용액으로 고정되었고 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(DPBS)로 3회 세척되었다. DPBS에서 무지방 우유 2%로 블록한 후 항체는 DPBS내 1% BSA에서 희석되었고 6 웰에서 세포에 적용되었다. 남아있는 두 개의 웰은 대조군으로써 오직 1% 소혈청 알부민(BSA) 용액 및 2차 항체로만 처리되었다. 세포는 실온에서 1시간 동안 1차 항체로 인큐베이트된 후 DPBS로 3회 세척되었다. 적절한 2차 항체는 DPBS내 1% BSA에서 희석되었고 각 웰에 첨가되었으며 1시간 동안 인큐베이트되었다. DPBS로 세척한 후 슬라이드는 물에서 세척되었고 공기 건조되었으며 플루오로마운트(Vector Laboratories)로 뒤덮였다. 면역형광 염색은 적절한 필터로 형광현미경으로 관찰되었고 1차 항체로 처리되지 않은 대조군 웰과 비교되었다. 모든 1차 항체는 특별히 언급하지 않는 한 Sigma로부터 구입되었다. 모든 2차 항체는 Molecular Probes로부터 구입되었다. LC 세포를 확인하기 위해 사용된 1차 항체는 다음과 같다: 항-콜라겐 I, 항-콜라겐 Ⅳ, 항-라미닌(laminin), 항-세포 피브로넥틴(cellular fibronectin), 항-신경교원섬유산단백(glial fibrillary acidic protein, GFAP) 및 항-알파-평활근 액틴. 세포군이 콜라겐 Ⅰ, 콜라겐 Ⅳ, 라미닌, 세포 피브로넥틴, 알파 평활근 액틴에 대해서는 양성으로 염색되었고 신경교원섬유(GFAP)에 대해서는 음성으로 염색되었다면 세포 개체는 LC 세포로 구성되는 것으로 측정되었다. 본 연구에서는 두 세트의 인간 안구가 배양을 개시하는데 이용되었다. LC 세포주 #506 및 #517는 각각 83세 남성과 17세 남성의 시신경 유두로부터 수득되었다. 모든 LC 세포주는 충분히 특징지어졌고 90% LC 세포보다 더 많 이 포함하는 것으로 밝혀졌다.
LC 세포의 처리
아폽토시스는 50 μM 캄포테신(Sigma)과 10 ng/ml TNF-α(Leinco Technologies)의 화합물을 이용하여 사상판 세포내로 유도되었다. 캄포테신과 TNF-α의 화합물이 카포테신 또는 TNF-α를 단독으로 이용할 때보다 아폽토시스 유도에 있어서 훨씬 효과적이라는 것이 발견되었다.
siRNAs의 구축 및 트랜스펙션
인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 siRNAs(낮은 저해(small inhibitory) RNAs)는 사상판 세포에서 eIF-5A의 발현을 특히 억제하기 위해 사용되었다. 6개의 siRNAs는 Silencer TM siRNA 구축 키트(Ambion Inc.)를 이용하여 생체 내 전사에 의해 생성되었다. 4개의 siRNAs는 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 생성되었다(siRNAs #1∼ #4). 2개의 siRNAs는 대조군으로써 이용되었다; 키트내로 공급된 GAPDH에 영향을 미치는 siRNA, 그 자신은 eIF-5A을 타겟으로 하지 않지만 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA #1의 역서열을 지닌 siRNA(siRNA #5). siRNAs는 제조업자의 프로토콜에 따라 발생되었다. eIF-5A 및 대조군 siRNA 타겟 은 서열은 다음과 같았다: siRNA #1 5' AAAGGAATGACTTCCAGCTGA 3' (서열번호: 81); siRNA #2 5' AAGATCGTCGAGATGTCTACT 3'(서열번호: 82); siRNA #3 5' AAGGTCCATCTGGTTGGTATT 3'(서열번호: 83); siRNA #4 5' AAGCTGGACTCCTCCTACACA 3'(서열번호: 84); siRNA #5 5' AAAGTCGACCTTCAGTAAGGA 3'(서열번호: 85). 사상판 세포는 리포펙타민 2000을 이용하여 siRNA로 트랜스펙트되었다.
사상판 세포는 세포 합류가 40∼70%인 때에 트랜스펙트되었고 트랜스펙션에 앞서 3일 동안 웰 당 7500개의 세포로 8-웰 배양 슬라이드 위에서 일반적으로 뿌려졌다. 8-웰 배양 슬라이드의 하나의 웰에 충분한 트랜스펙션 배지는 Opti-Mem(Sigma) 내에서 siRNA 25.5 pmole을 최종 부피 21.2 ㎕가 되도록 희석함으로서 제조되었다. 0.425 ㎕ 리포펙타민 2000은 Opti-Mem 내에서 최종 부피가 21.2 ㎕가 될 때까지 희석되었고 실온에서 7∼10분 동안 인큐베이트되었다. 희석된 리포펙타민 2000 혼합물은 그 후 희석된 siRNA 혼합물에 첨가되었고 실온에서 20∼30분 동안 인큐베이트되었다. 세포는 세포에 무혈청 배지 135 ㎕를 첨가하고 트랜스펙션 배지 42.4 ㎕로 덮여지기 전에 무혈청 배지로 한번 세척되었다. 세포는 4시간 동안 다시 성장 챔버에 놓여졌다. 인큐베이션 후 무혈청 배지 65 ㎕ + FBS 30%가 세포에 첨가되었다. 웨스턴 블럿 분석에 사용되기 위한 세포 내로 siRNA의 트랜스펙션은 부피가 2.3배 증가된 것을 제외하고는 8-웰 슬라이드에서의 트랜스펙션과 동일한 조건을 이용하여 24-웰 플레이트에서 수행되었다. 트랜스펙션 후, 사상판 세포는 아폽토시를 유도하기 위해 50 μM 캄포테신(Sigma) 및 10 ng/㎕ TNF- α(Leinco Technologies)로의 처리전서 72시간 동안 인큐베이트되었다. 세포 용해질은 그 후 웨스턴 블럿을 위해 채취되거나 아폽토시스를 위해 실험되었다.
아폽토시스 세포의 검출
24시간 동안 TNF-α 및 캄포테신으로 처리된 트랜스펙트된 세포는 아폽토시스를 진행하는 세포의 비율을 측정하기 위해 Hoeschtt 33258로 염색되었다. 간단히, 세포는 순수한 메탄올 및 결정 아세트산이 3 : 1의 비율로 구성된 혼합물로 고정되었고 그 후 Hoescht 염색(PBS 내의 0.5 ㎍/ml Hoescht 33258)으로 인큐베이트되었다. 암조건에서 10분간 인큐베이션 후 염색된 용액은 제거되었고 배양 슬라이드의 웰을 분리하는 챔버는 제거되었고 슬라이드는 탈이온수로 1분 동안 3회 세척되었다. 세척 후 McIlvaine 완충액(0.021 M 시트르산, 0.058 M Na2HPO4·7H2O; pH 5.6)이 세포에 몇 방울 첨가되었고 커버슬립으로 덮여졌다. 염색된 세포는 UV 필터를 사용하여 형광 현미경으로 관찰되었다. 밝게 염색되거나 파괴된 핵을 갖는 세포는 아폽토시스로 기록되었다. 웰 당 최소 200개의 세포가 계산되었다. DeadEndTM Fluorometric TUNEL(Promega)은 아폽토틱 세포의 특유한 특징인 DNA 파괴를 검출하기 위해 사용되었다. Hoescht 염색 후 배양 슬라이드는 증류수로 간단하게 세척되었고 PBS(137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4)에서 5분 동안 두 번 슬라이드를 침지시킴으로서 다시 세척되었고 두 번의 세척 사이 에 종이 타월 위에 슬라이드를 블럿(blot)하였다. 세포는 5분 동안 PBS 내 0.2% Triton X-100에 침지시킴으로서 투수되었다. 세포는 그 후 PBS에서 5분 동안 두 번 슬라이드를 담구는 것에 의해 다시 세척되었고 두 번의 세척 사이에 종이 타월 위에 슬라이트를 블럿하였다. 평형 완충액[200 mM 카코딜레이트(pH 6.6), 25 mM Tris-HCl(pH 6.6), 0.2 mM 디티오트레이톨, 0.25 mg/ml 소혈청 알부민 및 2.5 mM 염화코발트] 25 ㎕를 웰 당 첨가하였고 5∼10분 동안 인큐베이트하였다. 평형 완충액, 뉴클레오타이드 혼합물[50 μM 플루오레세인-12-dUTP, 100μM dATP, 10 mM Tris-HCl(pH 7.6) 및 1 mM EDTA] 및 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 효소(terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme, Tdt, 25 U/㎕)가 각각 45:5:1의 비율로 혼합된 반응 혼합물 30 ㎕이 평형 동안 각 웰에 대해 준비되었다. 평형 완충액 안에서의 인큐베이션 후 반응 혼합물 30 ㎕이 웰 당 첨가되었고 커버슬립으로 덮여졌다. 반응은 1시간 동안 37℃의 암조건에서 계속되었다. 반응은 2 X SSC[0.3M NaCl 및 30 mM 구연산 나트륨(pH 7.0)]에서 슬라이드를 침지시킴으로서 종결되었고 15분 동안 인큐베이트하였다. 슬라이드는 그 후 5분 동안 세 번 PBS에 침지시킴으로서 세척되었다. PBS는 Kim wipe로 웰 주변을 빨아들이는 것으로 제거되었고 마운팅 배지 한 방울(Oncogene research project, JA1750-4ML)은 각각의 웰에 첨가되었고 슬라이드는 커버슬립으로 덮여졌다. 세포는 Hoescht-염색된 핵의 수를 계산하기 위해 UV 필터(UV-G 365, 필터 세트 487902)를 이용하여 형광 현미경으로 관찰되었다. 밝게 염색되거나 파괴된 핵을 지니는 어떠한 세포도 아폽토시스로 계산되었다. 동일한 시야에서 세포는 그 후 플루오레세인 필터를 이 용하여 관찰되었고(녹색 H546, 필터 세트 48915) 밝은 녹색으로 형광된 어떠한 핵도 아폽토시스로 계산되었다. 시야에서 아폽토시스 세포의 비율은 플루오레세인 필터를 이용하여 계산된 밝은 녹색 핵의 수를 UV 필터 하에서 계산된 총 핵의 수로 나누는 것에 의해 계산되었다. 웰 당 최소 200개의 세포가 계산되었다.
단백질 추출 및 웨스턴 블럿 분석
단백질은 24-웰 플레이트 상에서 생장된 사상판 세포로부터 PBS(8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4 및 0.24 g/L KH2PO4) 내에서 세포를 2회 세척한 후 세포용해 완충액[2% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)] 50 ㎕를 첨가함으로서 웨스턴 블럿으로 분리되었다. 세포 용해질은 마이크로원심분리관에 수집되었고, 5분간 끓이고, 사용되기 전까지 -20℃에서 보관되었다. 단백질 농도는 Bicinchoninic Acid Kit(BCA; Sigma)를 이용하여 측정되었다. 웨스턴 블럿에 대해 총 단백질의 5 ㎍이 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리되었다. 분리된 단백질은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 옮겨졌다. 멤브레인은 블록 용액(PBS 내의 탈지 우유 분말, 0.02% 아지드화나트륨)으로 1시간 동안 인큐베이트되었고 PBS-T(PBS + 0.05% Tween-20) 내에서 15분간 3회 세척되었다. 멤브레인은 4℃에서 PBS-T 내에 밤새 보관되었다. 다음날 실온으로 데워진 후 멤브레인은 1 ㎍/ml 폴리비닐 알코올로 30초간 블록되었다. 멤브레인은 탈이온수에서 5회 헹궈진 후 PBS 내 5% 우유 용액 내에서 30분간 블록되었다. 1차 항체는 멤브레인과의 인큐베이션에 앞서 PBS 내 5% 우유 용액 내에서 30분간 예비 인큐베이트되었다. 사용된 1차 항체는 1 : 20,000의 항-eIF-5A(BD Transduction Laboratories) 및 항-β-액틴(Oncogene)이었다. 멤브레인은 PBS-T로 3회 세척되었고 PBS 내의 1% 우유 내에서 희석된 적당한 HRP-컨쥬게이트 2차 항체로 1시간 동안 인큐베이트되었다. 블럿은 세척되었고 ECL Plus Western blotting detection kit(Amersharm Pharmacia Biotech)가 퍼옥시다제-컨쥬게이트 결합된 항체를 검출하는데 사용되었다.
결과
2개의 사상판(LC) 세포주가 83세(#506)부터 17세(#517)까지의 연령에 걸친 남성 제공자로부터 수득된 시신경 유두로부터 수립되었다. 인간 사상판으로부터 분리된 세포는 다른 연구에서 관철된 돌기 핵(prominent nucleus)과 동일하게 넓고 평평한 형태를 지녔다(Lambert et al., 2001). 다른 그룹의 특성과 일치하게 LC 세포는 세포 프브로넥틴(도 91b), 라미닌(도 91c), 콜라겐 Ⅰ 및 콜라겐 Ⅳ(데이터는 나타나지 않음)을 포함한 많은 세포외 매트릭스 단백질뿐만 아니라 알파 평활근 액틴(도 91a)에 대한 면역반응성을 나타내었다(Clark et al., 1995; Hernandez et al., 1998; Hernandez and Yang, 2000; Lambert et al., 2001). 신경교원섬유산단백질(GFAP)과의 LC 세포의 음성적 면역반응성도 앞선 발견과 일치하게 관찰되었다(도 91d)(Lambert et al., 2001). 이들 발견은 시신경 유두 성상세포보다는 LC 세포로서 분리된 세포의 식별을 지지한다.
TNF-α가 녹내장 과정 동안 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지기 때문에 TNF-α의 세포독성 효과에 대한 LC 세포의 민감성이 조사되었다. 융합성 LC 세포가 캄포테신 및 TNF-α 또는 캄포테신과 TNF-α의 결합에 48시간 동안 노출되었다(도 92). Hoesht 염색은 TNF-α단독으로는 LC 세포에 세포독성적이지 않음을 나타내었다. 캄포테신의 처리는 LC 세포의 약 30% 세포 사멸을 유발하였다. 그러나 아폽토시스 내의 상승적 증가는 LC 세포가 캄포테신과 TNF-α 모두로 처리될 때 관찰되었고, 이러한 처리는 48시간까지 LC 세포의 45%의 사멸을 유발하였다. 이들 결과는 LC 세포가 캄포테신에 의해 아폽토시스에 대해 프라임될 때 TNF-α의 세포독성 효과에 반응할 수 있음을 나타낸다.
eIF-5A는 세포 분열에 필요한 것으로 알려진 핵세포질성 셔틀 단백질이고, 최근 아폽토시스에도 관련되는 것으로 제안되었다. 캄포테신 또는 캄포테신 플러스 TNF-α에 의해 아폽토시스를 진행하도록 유도된 LC 세포 내에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질 발현을 조사하였다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현은 다소 감소된 것을 제외하고는 캄포테신으로의 처리시 유의적으로 변화되지 않았다(도 93). 그러나 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질의 유의적인 상향조절은 캄포테신 플러스 TNF-α 처리의 8 및 24시간 후 관찰되었다(도 93). 이들 결과는 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현이 TNF-α으로의 노출에 의해 특이적으로 유도되고, 발현이 아폽토시스의 유도에 상호관련됨을 나타낸다. 이는 TNF-α 수용체 결합의 아폽토시스 경로 다운스트림 내에서의 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 역할을 지적한다.
LC 세포 내에서 TNF-α-유도된 아폽토시스 동안 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현의 중요성을 조사하기 위해 eIF-5A을 타겟하는 4개의 siRNAs 시리즈(siRNAs #1∼#4)(서열번호: 81∼84)가 고안되었고 시험관 내 전사에 의해 합성되었다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질 발현의 억제에 있어서의 siRNA의 유효성을 측정하기 위해 LC 세포주 #506 및 #517이 각각의 siRNAs로 트랜스펙트되었고 세포 용해질 내의 아폽토시스-특이적 eIF-5A 단백질 발현이 72시간 후 조사되었다(도 94). 또한 비교를 위해 세포는 siRNA #1과 동일한 화학 조성을 지니나 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 인식하지 않는 GAPDH에 대한 siRNA 및/또는 대조군 siRNA(siRNA #5)으로 트랜스펙트되었다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대해 지시된 모든 siRNA는 LC 세포주 모두에서 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현을 유의적으로 억제시킬 수 있었다(도 94). GAPDH siRNA가 단순히 siRNA #1의 역서열을 지니나 세포 타겟을 지니지 않는 대조군 siRNA #5와 달리 그의 타겟 단백질 GAPDH의 발현을 억제할 수 있는 활성적 siRNA이기 때문에 GAPDH siRNA는 추가적 대조군으로서 사용되었다(데이터는 나타나지 않음). 또한 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 4개 siRNA 모두는 TNF-α와 캄포테신으로의 24시간 처리에 의해 유도된 아폽토시스로부터 트랜스펙트된 LC 세포(#506)를 보호할 수 있었다(도 95). 세포 사멸을 검출하는 Hoesht 염색을 이용하여 siRNA(siRNAs #1∼#4)(서열번호: 81∼84)는 59%(siRNA #1)(서열번호: 81), 35%(siRNA #2)(서열번호: 82), 50%(siRNA #3)(서열번호: 83) 및 69%(siRNA #4)(서열번호: 84)까지 LC 세포의 아폽토시스를 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 흥미롭게는, GAPDH에 대한 siRNA도 42%까지 LC 세포의 아폽토시스를 감소시킬 수 있었다(도 95). GAPDH는 소뇌 뉴런의 아폽토시스 동안의 제안된 기능을 포함하여 당분해 효소로서 역할 외에 세포적 기능을 지니는 것으로 알려져 있다(Ishitani and Chung, 1996; Ishitani et al, 1996a; Ishitani et al., 1996b). 유사한 실험에서 siRNA #1(서열번호: 81)은 TNF-α와 캄포테신에 반응하여 53%까지 LC 세포주 #517의 아폽토시스를 감소시킬 수 있고 이는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA가 다른 시신경 유두로부터 분리된 LC 세포에 대해 보호적임을 나타냄을 증명하였다(도 96). 이들 결과는 아폽토시스-특이적 eIF-5A가 아폽토시스 동안 기능을 지니고 LC 세포 내에서 TNF-α-유도된 아폽토시스를 유도하는 경로 내 중요한 매개물임을 나타낸다.
TNF-α와 캄포테신에 노출된 LC 세포가 일반적인 아폽토시스에 의해 죽는 것을 확인하기 위해 DNA 단편화가 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개 dUPT-디작시게닌(digoxigenin) 틈(nick) 말단 표지(TUNEL) 방법을 이용하여 원위치에서 평가되었다. LC 세포(#506)는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA(siRNA #1) 또는 대조군 siRNA(siRNA #5)(서열번호: 85)로의 트랜스펙션 3일 후 TNF-α와 캄포테신으로 24시간 동안 처리되었다. 또한 세포는 핵의 시각화를 촉진시키기 위해 Hoescht로 염색되었다. 대조군 siRNA로 트랜스펙트된 LC 세포의 46%가 TUNEL 염 색에 양성인 반면 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA #1(서열번호: 81)로 트랜스펙트된 LC 세포의 8%만이 양성적으로 표지되어 이는 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA가 아폽토시스로부터 80% 이상의 보호를 제공하였음을 나타내었다(도 97). 유사한 결과가 대조군 siRNA에 대해 아폽토시스로부터 60% 이상의 보호를 제공한 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA #4로 수득되었다(데이터는 나타나지 않음).
(실시예 18)
혈액 수집 및 PBMCs의 준비
약 10 ml의 혈액이 각각의 건강한 제공자로부터 수집되었다. 혈액은 항-응고제로서 구연산나트륨을 포함한 진공채혈기 내에서 정맥천자에 의해 수집되었다. 표본은 수집 24시간 이내에 처리되었다.
60% SIP(1 부피부 1.5 M NaCl을 지닌 9 부피부 Percoll)이 15 ml의 원뿔형 시험관의 바닥 위에 큐션되었다. 이후 혈액은 혈액과 Percoll 쿠션의 최소 혼합으로 위에 겹쳐졌다. 표본은 첫 번째 5분은 느린 가속으로 1000xg 및 마지막 5분은 느린 감속으로 총 30분간 원심분리되었다. 수득된 그레디언트(gradient)의 최상위에서의 정제 혈청이 제거되었고 PBMCs의 백색 쿠션(1-2 ml)가 수집되었고 10 ml의 따뜻한 RPMI + 15 FBS를 함유한 관에 한방울씩 첨가되었다. PBMCs는 펠렛되 었고 카운트되었다.
시간 경과에 따른 PBMCs에서의 사이토카인 생성을 유도하는 자극
PBMCs가 분리되었고 2x105∼5x105 세포/웰에서 시드(seed)되었다. 세포는 포르볼 12-미리스테이트(myristate) 13-아세테이트(PMA; 100 ng/웰)로 처리되었다. 72시간에 배지가 교체되었고 어떠한 자극 인자도 포함하지 않았다. 이후 PBMCs 내로의 PMA 첨가 후 96시간에 리포폴리사카라이드(LPS; 100 ng/웰; E. coli로부터, 혈청형 0111)가 웰에 첨가되었다. 도 120에 약술된 바와 같이 표본이 LPS 첨가(96h) 전 및 첨가 후 다양한 시간에 수집되었다. 부착성 세포(단핵세포 및 대식세포이기 쉬운) 둘 모두가 부유 세포(림프구이기 쉬운)와 함께 수집되었다. 사이토카인 분비 분석을 위한 표본을 수집하기 위해 각 웰로부터의 배지가 청결한 마이크로원심분리관으로 옮겨졌고 3분간 13000 x g에서의 원심분리에 의해 파편을 제거하였다. 수득된 펠렛은 부착성 세포와 함께 수집되었다. 배지는 분석 전에 200∼250 ㎕ 알리쿼트로 -20℃에서 보관되었다. 세포는 1 ml의 37℃ 인산 완충 식염수(PBS)로 세척된 후 끓인 세포용해 완충액(웰 당 50 mM Tris pH 7, 2% SDS; 100 ㎕) 내에서 세포용해되었다. 세포 용해질은 끓여졌고 -20℃에서 동결 보관되었다. 웨스턴 블럿은 도 121에 나타나 있고 상응하는 ELISA는 도 120에 나타나 있다.
아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현을 유도하는 PBMC 자극
PBMC가 2x105∼5x105 세포/웰에서 시드되었다. 어떤 자극제가 아폽토시스-특이적 eIF-5A를 유도하는지 측정할 뿐만 아니라 이들이 공동으로 작용하는지 여부를 알기 위해 PBMCs가 파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)(PHA; 100 ng/ml), 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA; 100 ng/ml), 리포폴리사카라이드(LPS; 100 ng/ml) 또는 셋 모두로 자극되었다. 표본은 자극 12시간 및 36시간 후 수집되었고 아폽토시스-특이적 eIF-5A 발현에 대해 분석되었다(도 123).
PBMC의 트랜스펙션
PBMC는 준비된 날 트랜스펙트되었다. 세포는 2x105∼5x105 세포/웰에서 시드되었다(240웰 플레이트 내에서의 트랜스펙션을 위해 웰 당 150 ㎕). 이들은 각 웰 내에서 개별적으로(제공자 77, 78 및 79; 도 124 및 125) 또는 시딩 전 원뿔형 튜브 내에 한꺼번에(제공자 80 및 84; 도 125) 트랜스펙트되었다. 트랜스펙트되는 세포의 각 웰의 경우 15 pmole의 siRNA가 50 ㎕의 Opti-MEM(Sigma) 내에서 희석되었다. 1 ㎕의 리포펙타민 2000(Invitrogen)이 49 ㎕의 Opti-MEM(Sigma)에서 희석되었고 7∼10분간 인큐베이트되었고 희석된 siRNA에 첨가되었고 25분간 인큐베이 트되었다. 트랜스펙션 배지가 세포 위에 도포되었고 4시간 동안 37℃ 성장 챔버에 놓였다. 최종 트랜스펙션 배지는 9% 혈청을 포함하였다. 인큐베이션 후 250 ㎕의 무-혈청 RPMI + 21% FBS가 세포 내로 첨가되어 최종 혈청 농도를 15%로 만들었다.
PBMC 후 트랜스펙션 내의 사이토카인 생성을 유도하는 자극
상기 기술된 바와 같이 PBMC의 트랜스펙션 72시간 후 리포폴리사카라이드(LPS; 100 ng/웰; E. col로부터, 혈청형 0111)가 500 ㎕의 배지 내에서 세포에 첨가되었다. 표본은 후 자극 24시간에 수집되었다. LPS로 처리되고 트랜스펙트만된(즉, 무자극) 두 웰 모두 수집되었다. 사이토카인 분비의 분석을 위한 표본을 수집하기 위해 각 웰로부터의 배지가 청결한 마이크로원심분리관으로 옮겨졌고 3분간 13000xg에서의 원심분리에 의해 파편을 제거하였다. 수득된 펠렛은 부착성 세포와 함께 수집되었다. 배지는 분석 전에 200∼250 ㎕ 일정량으로 -20℃에서 보관되었다. 세포는 1 ml의 37℃ 인산 완충 식염수(PBS)로 세척된 후 끓인 세포용해 완충액(웰 당 50 mM Tris pH 7, 2% SDS; 100 ㎕) 내에서 세포용해되었다. 세포 용해질은 끓여졌고 BCA 단백질 정량화를 위해 -20℃에서 동결 보관되었다.
(실시예 19)
세포 배양
인간 결장 선암 세포주인 HT-29는 0% 우태아 혈청(FBS)을 지닌 RPMI 내에 유지되었다. 조직구림프종 세포주인 U937은 10% FBS를 지닌 RPMI 내 현탁액 내에서 성장되었다. 두 세포주 모두는 37℃ 및 5% CO2의 습한 환경 내에서 유지되었다. U937 세포로의 실험의 경우 세포는 카운트되었고 실험 시작 2일 전에 3x105 세포/ml로 조정되었다. 실험 첫 번째 날에 세포가 10분간 400 x g에서의 원심분리에 의해 수집되었고 세포 펠렛이 10% FBS를 지닌 신선한 RPMI 배지 내로 재현탁되었고, 원심분리가 반복되었고 재펠렛된 세포가 FBS 없는 신선한 RPMI 배지 내에 재현탁되었다. 세포는 카운트되었고 2x106 세포/ml로 조정되었다.
siRNA
siRNA는 인간 아폽토시스-특이적 eIF-5A 서열에 기반하여 고안되었고 Dharmacon RNA Techologies에 의해 합성되었다. 아폽토시스-특이적 eIF-5A siRNA(h5A1) 타겟 서열은: 5' NNGCUGGACUCCUCCUACACA 3'(서열번호: 86) 이었다. 상응하는 이중나선 siRNA 서열은: 5' GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT 3'(서열번호: 87), 3' dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU 5'(서열번호: 88) 이었다.
대조군 siRNA(h대조군) 서열은 5' NNACACAUCCUCCUCAGGUCG 3'(서열번호: 89) 이었다. 상응하는 이중나선 siRNA 서열은: 5 ' ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT 3 ' (서열번호: 90), 3' dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC 5'(서열번호: 91) 이었다.
HT-29 세포의 트랜스펙션
트랜스펙션 전 날 HT-29 세포가 24-웰 플레이트 상에 웰 당 105,000 세포로 시드되었다. 트랜스펙트되는 세포의 각 웰에 대해 25.5 pmole의 siRNA가 50 ㎕의 Opti-Mem(Sigma) 내에서 희석되었다. 1 ㎕의 리포펙타민 2000(Invitrogen)이 49 ㎕의 Opti-MEM(Sigma)에서 희석되었고 7∼10분간 인큐베이트되었고 희석된 siRNA에 첨가되었고 25분간 인큐베이트되었다. 트랜스페트되는 세포는 300 ㎕의 무-혈청 RPMI을 첨가하기 전에 무-혈청 RPMI로 1회 세척되었고 100 ㎕의 트랜스펙션 배지에 도포되었다. 세포는 4시간 동안 37℃ 성장 챔버에 놓였다. 인큐베이션 후 300 ㎕의 무-혈청 RPMI + 30% FBS가 세포 내로 첨가되었다.
U937 세포의 일렉트로포레이션(electroporation)
아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 대조군 siRNA가 Opti-Mem 배지(Sigma) 내에서 희석되었다. 400 ㎕의 세포(800,000 세포) 및 100 pmole siRNA가 0.4 mm 일렉트로포레이션 큐벳 내에서 혼합되었다. 세포는 ECM 830 Electrosquare porator(BTX, San Diego, CA)로 300 V, 10 mSec, 1 펄스에서 일렉트로포레이트되었다. 일렉트로포레이션 후 세포는 천천히 혼합되었고 최종 FBS 농도가 10%가 되도록 RPMI 및 농축 FBS를 함유한 웰 내로 첨가되었다.
HT-29 세포의 처리
TNF-α 생성은 Suzuki et al., 2003에 의해 개발된 방법에 따라 HT-29 세포 내로 유도되었다. HT-29 세포는 트랜스펙션 48시간 후 200 unit/ml 인터페론 감마(Roche Diagnostics)로 프라임되었다. 인터페론 감마(IFNγ) 프라이밍 16시간 후 세포는 배지로 세척되었고 리포폴리사카라이드(LPS; 100 ng/ml; E. coli로부터, 혈청형 0111; Sigma)가 100 ㎍/ml에서 첨가되었다. LPS 자극 8 또는 24시간 후 각 웰로부터의 배지가 마이크로원심분리관으로 옮겨졌고 ELISA에 의한 TNFα에 대해 분석될 때까지 -20℃에서 보관되었다. 세포는 37℃로 가열된 1 ml의 인산 완충 식염수(PBS)로 세척된 후 끓인 세포용해 완충액(50 mM Tris pH 7, 2% SDS) 내에서 세포용해되었다. 세포 용해질은 끓여졌고 -20℃에서 동결 보관되었다. 세포 용해질 내의 단백질 농도는 기준으로 사용되는 소 혈청 알부민과 함께 비신코닌산(bicinchoninic acid) 분석(BCA)에 의해 측정되었다.
IL-8 생성은 IFNγ의 처리에 의해 HT-29 세포 내에서 유도되었다. HT-29 세포는 트랜스펙션 48시간 후 200 unit/ml IFNγ로 처리되었다. 처리 24시간 후 각 웰로부터의 배지는 마이크로원심분리관으로 옮겨졌고 액체-상 전기화학발광(electrochemilumiescence, ECL)에 의해 IL-8에 대해 분석될 때까지 -20℃에서 보관되었다. 세포는 37℃로 가열된 1 ml의 인산 완충 식염수(PBS)로 세척된 후 끓인 세포용해 완충액(50 mM Tris pH 7, 2% SDS) 내에서 세포용해되었다. 세포 용해질은 끓여졌고 -20℃에서 동결 보관되었다. 세포 용해질 내의 단백질 농도는 기준으로 사용되는 소 혈청 알부민과 함께 비신코닌산(bicinchoninic acid) 분석(BCA)에 의해 측정되었다.
U937 세포 내의 분화 유도
U937 세포가 수집되었고 일렉트로포레이션 16시간 후 카운트되었다. 1 ml의 배지 내의 200,000 세포가 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가되었다. 대식세포 분화는 프로볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA; 100 ng/ml)를 첨가함으로서 자극되었다. PMA로의 48시간 후 >80의 단핵세포가 현탁액 내의 세포(단핵세포)로부터 부착성 세포(대식세포)로 형질전환되었다. 48시간에 배지 및 비-부착성 세포가 제거되었고 10% FBS를 지닌 신선한 RPMI 배지(웰 당 1 ml)가 첨가되었다. 세포는 정지하도록 신선한 배지 내에서 24시간 동안 놓였다.
U937 세포 내 사이토카인 생성을 유도하는 자극
U937 세포 내로의 PMA 첨가 72시간 후 리포폴리사카라이드(LPS; 100 ng/ml; E. coli로부터, 혈청형 0111), 인터페론 γ(IFNγ; 100 unit/ml) 또는 LPS와 IFNγ의 결합이 웰에 첨가되었다. 표본은 도 131에서 기술된 바와 같이 자극제 첨가전(72시간) 및 첨가 후 다양한 시간에 수집되었다. 사이토카인 분비 분석을 위한표본을 수집하기 위해 각 웰로부터의 배지가 청결한 마이크로원심분리관으로 옮겨졌고 3분간 13000 x g에서의 원심분리에 의해 파편을 제거하였다. 배지는 분석 전에 200∼250 ㎕ 일정량으로 -20℃에서 보관되었다. 세포는 1 ml의 37℃ 인산 완충 식염수(PBS)로 세척된 후 끓인 세포용해 완충액(웰 당 50 mM Tris pH 7, 2% SDS; 75 ㎕) 내에서 세포용해되었다. 유사한 웰이 풀되었다. 세포 용해질은 끓여졌고 -20℃에서 동결 보관되었다.
사이토카인 정량화
모든 배지 표본은 -20℃에서 동결 보관되었다. TNFα는 0∼250 pg TNFα/ml에 대한 표준이 공급된 제조사의 지시에 따라 Assay Design으로부터의 ELISA 키트를 이용하여 정량화되었다. U937 실험의 경우 TNFα에 대한 배지 표본이 RPMI+10% FBS로 20배(0h, 3h LPS) 또는 80배(6h, 24h, 30h LPS)로 희석되었다. IL-1β, IL-8 및 IL-6은 액체-상 전기화학발광(ECL)에 의해 정량화되었다. HT-29 실험으로부터의 배지는 희석되지 않았다. 모든 사이토카인 측정 결과는 웰 당 총 세포 단백질의 양(mg)에 대해 교정되었다.
IL-8, IL-1β 및 IL-6은 액상에 의해 분석되었다. 간단히, 정제된 단일클론 마우스 항-마우스 항-인간 IL-8, IL-1β 및 IL-6(R&D Systems)이 비오틴(Igen, Inc., Gaithersburg, MD)으로 표지되었다. 더욱이 염소 항-인간 IL-8, IL-1β 및 IL-6 항체(R&D)는 제조사의 지침에 따라 류테늄(Igen)으로 표지되었다. 비오틴화된 항체는 0.25% BSA, 0.5% Tween-20 및 0.01% 아지드를 함유한 pH 7.4 PBS(ECL 완충액) 내에 1 mg/ml의 최종 농도로 희석되었다. 분석 튜브 당 25 ml의 비오틴화된 항체가 실온에서 강한 진탕으로 30분간 1 mg/ml의 스트렙트아비딘-코팅된 파라마그네틱 비드 용액(Dynal Corp., Lake Success, NY) 25 ml로 예비-인큐베이트되었다. RPMI 내에서 희석된 시험되는 표본(25 ml) 및 표준은 튜브에 첨가된 후 25 ml의 루테늄화된 항체에 첨가되었다(최종 농도 1 mg/ml, ECL 완충액 내에서 희석). 이후 튜브는 추가 2시간 동안 진탕되었다. 반응은 200 ml/튜브의 PBS의 첨가에 의해 중지되었고 화학발광의 양이 Origen Analyzer(Igen)을 이용하여 측정되었다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿팅
세포 용해질 내의 단백질 농도는 표준으로 사용된 소 혈청 알부민으로 비신크로닌산 분석(BCA)에 의해 측정되었다. 5 ㎍의 총 세포 단백질이 10% 또는 14% SDS-PAGE(소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동)에 의해 분리되었다. 10% 겔은 상기 50 kDa(TLR4, IFNγ, TNF-R1, iNOS) 단백질 분석에 사용된 반 면 14% 겔은 아폽토시스-특이적 eIF-5A(17 kDa)에 사용되었다. 겔은 반-건조 트랜스퍼 키트(Bio-Rad)를 이용하여 트랜스퍼 완충액(48 mM Tris, 39 mM 글리신, 1.3 mM SDS, pH 9.2; 18분간 15 V)로 플루오르화폴리비닐리덴(PVDF) 멤브레인으로 옮겨졌다. 멤브레인은 PBS-t(0.1% Tween 20을 지닌 PBS) 내에서 5% 탈지 우유로 1시간 동안 블록되었다. 1차 항체는 블록 용액 내에서 희석되었고 모든 블럿은 진탕하면서 실온에서 인큐베이트되었다. 사용된 1차 항체는 아폽토시스-특이적 eIF-5A(BD Bioscience; 1:20,000, 1시간 인큐베이트; 아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 eIF-5A2 모두 인식), TLR4(Santa Cruz Biotechnology Inc; TLR4(H-80): sc-10741; 1:1000; 2시간 인큐베이트), IFN-γRα(Santa Cruz Biotechonology Inc; IFN-γRα(C-20): sc-700; 1:1000; 1시간 인큐베이트), TNF-R1(Santa Cruz Biotechonology Inc; TNF-R1(H-5): sc-8436; 1:200; 3시간 인큐베이트), iNOS(BD Trandsuction Laboratories:610431; 1:10,000; 1시간 인큐베이트) 및 β-액틴(Oncogene; 액틴(Ab-1); 1:20,000; 1시간 인큐베이트)이었다. 1차 항체 인큐베이션 후 블럿은 PBS-t로 5∼10분간 3회 세척되었다. 양고추냉이 퍼옥시다제-컨쥬게이트된(HRP) 2차 항체는 1% 탈지 밀크로 희석되었고 1시간 동안 멤브레인으로 인큐베이트되었다. 사용된 2차 항체는 항-마우스 IgG-HRP(Sigma; 1:5000; 아폽토시스-특이적 eIF-5A 및 TNF-R1용), 항-토끼 IgG-HRP(Amersham Pharmacia Biotech; 1:2500; TLR4 및 IFNγ-Rα용), 항-마우스 IgM-HRP(Calbiochem; 1:5000; 액틴용)이었다. 2차 항체 인큐베이션 후 블럿은 PBS-t로 5∼10분간 4회 세척되었다. 블럿은 제조사의 지침에 따라 증가된 화학발광 검출 시약(ECL; Amersham Pharamcia Biotech)으로 발달되었 고 밴드는 X-선 필름(Fuji)으로 시각화되었다.
RT-PCR
IFNγ에 반응한 트랜스펙트된 HT-29 내의 TLR4 mRNA 내의 변화를 관찰하기 위해 RT-PCR이 Medvedev et al. 2002에 따라 수행되었다. 동량의 cDNA가 표본들 사이에서 사용됨을 나타내기 위해 GAPDH의 발현이 대조군으로 사용되었다. PCR 사이클 증가(20, 25, 30 및 35)는 비포화 조건 하에서 검출 가능한 증폭된 생성에서 초래된 최적 사이클 수를 결정하는데 사용되었다. PCR 생성물은 에티듐 브로마이드-도입에 의해 검출되었고 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리되었다. IFNγ로 6시간 동안 처리되거나 처리되지 않은 siRNA-트랜스펙트된 HT-29 세포로부터 분리된 총 mRNA의 RT-PCR이 TLR4 및 GAPDH 전사체를 검출하는데 사용되었다. HT-29 세포는 상기 기술된 바와 같이 siRNA로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 48시간 후 세포는 200 unit/ml IFNγ로 처리되었다. IFNγ로 처리되지 않은 대조군 세포는 배지 교환만 되었다. 총 mRNA는 부착성 세포에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 GenElute Mammalian RNA miniprep kit(Sigma)를 이용하여 분리되었다. 배지는 제거되었고 세포는 따뜻한 PBS로 2회 세척되었다. 세포용해 완충액이 세포에 첨가되었고 용해질은 마이크로원심분리관에 옮겨졌고 총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 분리되었다.
TLR4(NM_003266)용 프라이머는:
전방 5' CGGATGGCAACATTTAGAATTAGT 3'(서열번호: 92)
역방 5' TGATTGAGACTGTAATCAAGAACC 3'(서열번호: 93)
예측되는 단편 크기: 674 bp
이었다.
GAPDH(BC023632)용 프라이머는:
전방 5' CTGATGCCCCCATGTTCGTCAT 3'(서열번호: 94)
역방 5' CCACCACCCTGTTGCTGTAG 3'(서열번호: 95)
예측되는 단편 크기: 599 bp
이었다.
총 RNA는 하기 조건을 이용하여 역전사되었다.
혼합:
RNA 2.5 ㎍
폴리(T)프라이머 6.25 ㎕
Depc 물 13.75 ㎕까지
가열 70℃ 5분
얼음 위에서 냉각 5분
첨가:
5X AMV 완충액 5.O ㎕
dNTPs(lO mM) 2.5 ㎕
Rnase 저해제 1.25 ㎕
AMV RT 2.5 ㎕
가열 42℃ 60분
가열 70℃ 10분
단일 PCR 반응은 하기 조건을 이용하여 수행되었다:
10X Tsg 완충액 2.0 ㎕
dNTP(10 mM) 0.4 ㎕
전방 프라이머(25 pmol/㎕) 0.4 ㎕
역방 프라이머(25 pmol/㎕) 0.4 ㎕
MgCl2(15 mM) 2.0 ㎕
cDNA 0.8 ㎕
H2O 13.88 ㎕
Tsg 중합효소 0.12 ㎕
TLR4용 PCR 조건:
95℃ 5분 가열
20, 25, 30 또는 35 사이클 : 95℃ 1분
55℃ 1분
72℃ 2분
72℃에서 10분간 확장
4℃에 침지
GAPDH용 PCR 조건:
95℃ 5분 가열
20, 25, 30 또는 35 사이클 : 95℃ 1분
57℃ 1분
72℃ 2분
72℃에서 10분간 확장
4℃에 침지
(실시예 20) NFκB 분석용 물질 및 방법
본 분석 결과는 HT-29 세포가 IFNγ에 노출되고 아폽토시스-특이적 eIF-5A에 대한 siRNA로 트랜스펙트되면 NFκB p50 활성화 및 TNF-α 생성의 감소가 존재함을 나타낸다. 도 114 참조.
배양
인간 결장직장 선암종 세포주인 HT-29는 37℃ 및 5% CO2의 습한 환경 내에서 10% FBS가 보충된 RPMI 내 유지되었다.
트랜스펙션
트랜스펙션 전날 HT-29 세포는 6-웰 플레이트 상에 웰 당 500,000개 세포로 분주되었다. 트랜스펙트되는 세포의 각 웰에 대해 155 pmole의 siRNA가 240 ㎕의 Opti-Mem(Sigma) 내에 희석되었다. 4.8 ㎕의 리포펙타민 2000(Invitrogen)이 Opti-Mem으로 240 ㎕로 희석되었고 7∼10분간 인큐베이트되었고 희석된 siRNA 내로 첨가되었고 25분간 인큐베이트되었다. 트랜스펙트되는 세포는 1400 ㎕의 무혈청 RPMI를 첨가하고 480 ㎕의 트랜스펙션 배지로 중첩시키기 전에 무혈청 RPMI로 1회 세척되었다. 세포는 4시간 동안 성장 챔버로 복귀되었다. 인큐베이션 후 30% FBS를 포함한 720 ㎕의 무혈청 RPMI가 세포에 첨가되었다. 트랜스펙션 24시간 후 신선한 배지가 세포에 첨가되었다.
세포의 처리
트랜스펙션 48시간 후 인터페론 감마(IFNγ; Roche Diagnostics)로 프라임된 세포는 200 단위/ml의 IFNγ를 수용하였다. 모든 잔존 웰은 배지가 교환되었다. IFNγ 첨가 16시간 후 세포는 TNF-α(20 ng/ml; Leinco Technologies Inc., St. Louis, MO) 또는 리포폴리사카라이드(LPS; 100 ng/ml; E. coli 유래, 혈청형 0111; Sigma) 또는 처리되지 않은 대조군용으로 어떠한 첨가도 없는 배지로 처리되었다. IFNγ로만 처리되어야 하는 세포는 IFNγ로 밤새 프라임되었고 16시간 후 IFNγ를 지닌 배지를 수용하였다.
핵 추출 및 NFκB 전사 인자 분석
다양한 자극제로의 처리 1시간 후 핵 단백질이 세포로부터 수집되었고 NFκB 활성을 측정하는데 사용되었다. 핵 추출은 제조사의 프로토콜에 따라 TransAM Nuclear Extract Kit (Active Motif, Carlsbad, CA)를 이용하여 수행되었다. NFκB의 p50 서브유니트의 DNA-결합 능력은 제조사의 프로토콜에 따라 20 ㎍의 핵 추출물을 이용하여 TransAM NFKB Family Transcription Factor Assay Kit (Active Motif, Carlsbad, CA)로 측정되었다.
(실시예 21)
마우스 패혈증 모델 기반-포유류 내 패혈증 치료
2가지 형태의 마우스 그룹이 본 연구에 이용되었다. Balb/C 마우스 및 C57BL/6 마우스가 이용되었다. 두 연구 모두에서 마우스는 패혈증을 유도하고 48시간 이내에 100% 사망을 유도하는 투여량의 LPS가 제공되었다. 시험은 eIF-5A1에 대한 siRNA(3'- GCC UUA CUG AAG GUC GAC U -5'; 서열번호: 99)이 다른 시간 경과시 복막 내에 제공되도록 고안되었다. siRNA의 전체 투여량은 50 ㎍이었다. 초기 연구에서 5개 시험군 및 1개 대조군이 이용되었다. 각 군은 5마리의 마우스로 시작되었다. 대조군은 siRNA를 수용하지 않았다.
Balb/C 마우스 모델
도 149 및 150은 Balb/C 마우스 내 시험 결과를 나타낸다. 모든 마우스는 48시간에 치사량의 LPS를 수용하였다. 그룹 1은 0 및 24시간에 siRNA를 수용하였고 5마리 중 3마리가 생존하였다. 그룹 2는 0, 24 및 48시간에 siRNA를 수용하였고 5마리 중 5마리가 생존하였다. 그룹 3은 48시간에 siRNA를 수용하였고 5마리 중 5마리가 생존하였다. 그룹 4는 50, 56, 64 및 72시간에 siRNA를 수용하였고 5마리 중 4마리가 생존하였다. 그룹 5는 48, 56, 64 및 72시간에에 siRNA를 수용하였고 5마리 중 2마리가 생존하였다. 대조군인 그룹 6은 siRNA를 수용하지 않았고 0마리가 생존하였으며 LPS 처리 48시간 이내에 5마리 모두가 사망하였다(제4일 ).
C57BL/6 마우스
도 151 및 152는 C57BL/6 마우스 내 시험 결과를 나타낸다. 모든 마우스는 48시간에 치사량의 LPS를 수용하였다. 그룹 1은 0 및 24시간에 siRNA를 수용하였고 5마리 중 1마리가 생존하였다. 그룹 2는 0, 24 및 48시간에 siRNA를 수용하였고 5마리 중 2마리가 생존하였다. 그룹 3은 48시간에 siRNA를 수용하였고 5마리 중 2마리가 생존하였다. 그룹 4는 50, 56, 64 및 72시간에 siRNA를 수용하였고 5마리 중 2마리가 생존하였다. 그룹 5는 48, 56, 64 및 72시간에에 siRNA를 수용하였고 5마리 중 2마리가 생존하였다. 대조군인 그룹 6은 siRNA를 수용하지 않았고 0마리가 생존하였으며 LPS 처리 48시간 이내에 5마리 모두가 사망하였다(제4일).
(실시예 22)
화학물질
DHS의 유효 저해제인 N1-구아닐-1,7-디아미노헵탄(GC7; Biosearch Technologies)이 50 μM 농도로 사용되었다. 악티노마이신 D(Calbiochem)는 0.5 또는 1.0 ㎍/ml로 사용되었다.
세포 배양 및 처리
인간 결장 선암종 세포주인 HT-29가 세포 증식 및 eIF-5A 위치 연구에 이용되었고 Anita Antes(뉴저지 의학 및 치의학 대학)에서 제공받았다. HT-29 세포는 1 mM 피루부산나트륨, 10 mM HEPES 및 10% 우태아혈청(FBS)으로 보충된 RPMI 1640 내에서 유지되었다. 모든 다른 세포주는 미국 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에서 획득되었다.
CCD112Co는 정상 결장 섬유아세포 세포주이다. RKO는 야생형 p53을 포함한 인간 결장직장 암종 세포주(CRL-2577)이다. RKO-E6 세포주(CRL-2578)는 RKO 세포주에서 유래되었다. 이는 안정하게 도입된 인간 유두종 바이러스 E6 종양유전자를 포함하므로 분명한 기능적 p53 종양 억제제 단백질이 결핍되어 있다. RKO, RKO-E6 및 세포주 CCD112Co는 2 mM L-글루타민을 지닌 변형된 이글(Eagle) 최소 필수 배지 및 1.5 g/L 중탄산나트륨, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1 mM 피루브산나트륨을 포함하도록 조정되고 10% FBS로 보충된 얼(Earle) 균형 염 용액 내에서 생장되었다. 세포는 5% CO2를 함유한 가습 환경 내에 37℃에서 유지되었다.
플라스미드 클로닝 및 구축
인간 eIF5A1은 점착성 세포에 대한 제조사 지침에 따라 GenElute Mammalian RNA miniprep kit(Sigma)를 이용하여 RKO 세포에서 분리된 총 RNA로부터 RT-PCR에 의해 클론되었다. 사용된 프라이머는: 전방, 5'-CGAGTTGGAATCGAAGCCTC-3'(서열번호: 100); 및 역방, 5'-GGTTCAGAGGATCACTGCTG-3'(서열번호: 101)이었다. 수득된 532개 염기쌍 생성물은 pGEM-T Easy(Promega) 내로 서브클론되고 서열분석되었다. 수득된 플라스미드는 하기 프로모터를 이용하여 PCR용 주형으로 사용되었고: 전방, 5'-GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG-3'(서열번호: 102); 및 역방, 5'-CCTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG-3'(서열번호: 103), PCR 생성물은 pHM6-eIF5A1 벡터를 생성하기 위해 pHM6([HA]-태그된 적혈구응집소; Roche Molecular Biochemicals)의 HindⅢ 및 EcoRI 사이트 내로 서브클론되었다. eIF5A1의 C-말단 절제된 컨스트럭트(pHM6-eIF5A1Δ37)는 하기 프라이머를 이용한 PCR에 의해 생성되었다: 전방, 5'-GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG-3'(서열번호: 104); 역방, 5'-GCCGAATTCTCCCTCAGGCAGAGAAG-3'(서열번호: 105). 수득된 PCR 생성물은 pHM6 벡터 내로 서브클론되었다. pHM6-LacZ 벡터(Roche Molecular Biochemicals)는 트랜스펙트을 최적화하고 아폽토시스 상의 트랜스펙션의 효과에 대한 대조군으로서 사용되었다.
노던 블럿팅
RKO 세포는 6-웰 플레이트 상에 합류로 생장되고 1.0 ㎍/ml 악티노마이신 D로 0, 1, 4 또는 8시간 동안 처리되었다. 총 RNA는 GenElute Mammalian RNA miniprep kit(Sigma)를 이용하여 세포에서 분리되었고 5 ㎍의 RNA가 1.2% 아가로스/포름알데하이드 겔 상에서 분획화되었다. 멤브레인은 수립된 방법에 따라 eIF5A1의 3'-비번역 영역(3'-UTR)에 상동적인 32-표지 cDNA로 프로브되었다. 노던 블럿팅에 사용된 eIF5A1 3'-UTR cDNA는 하기 프라이머를 이용하여 RKO로부터 RT-PCR에 의해 클론되었다: 전방, 5'-GAGGAATTCGCTGTTGCAATCAAGGC-3'(서열번호: 106); 역방, 5'-TTTAAGCTTTGTGTCGGGGAGAGAGC-3'(서열번호: 107).
플라스미드의 트랜스펙션 및 아폽토시스의 검출
RKO 및 RKO-E6 세포는 제조사의 추천 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하여 플라스미드 DNA로 일시적으로 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 48시간 후 단편화된 DNA를 포함한 아폽토시스 세포는 제조사의 프로토콜에 따라 DNA Fragmentation Detection Kit(Oncogene Research Products)를 이용하여 말단 데옥시뉴클레오티닐 트랜스퍼라제-매개 dUTP-디옥시게닌 틈 말단 표지(TUNEL)에 의해 검출되었다. 이후 표지된 세포는 유식 세포측정기 또는 형광 현미경에 의해 분석되었다. 유식 세포측정 분석의 경우 채취된 세포는 PBS 내 4% 포름알데하이드로 고정되고 TUNEL에 의해 표지되고 488 nm 아르곤 레이저 및 형광물질 검출용 필터를 지닌 유식 세포측정기(Coulter Epics XL-MCL) 상에서 분석되었다. 형광 현미경 분석의 경우 세포는 Taylor et al. (2004)에 의해 기술된 방법에 따라 8-웰 배양 슬라이드 상에서 트랜스펙트되고 4% 포름알데하이드로 고정된 후 TUNEL에 의해 표지되고 Hoescht 33258로 염색되었다.
siRNA의 트랜스펙션
모든 siRNA는 Dharmacon사에서 구입되었다. eIF5A1 siRNA는 하기 서열을 지녔다: 센스 스트랜드, 5'-GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3'(서열번호: 108); 및 안티센스 스트랜드, 3'-dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5'(서열번호: 109). 사용된 대조군 siRNA는 eIF5A1 특이적 siRNA의 역서열을 지녔고 어떠한 알려진 인간 유전자 생성물과의 동일성을 지니지 않았다. 대조군 siRNA는 하기 서열을 지녔다: 센스 스트랜드, 5'-ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT-3'(서열번호: 110); 및 안티센스 스트랜드, 3'-dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC-5'(서열번호: 111). 세포는 Lipofectamine 2000을 이용하여 siRNA로 트랜스펙트되었고 증식 연구 및 웨스턴 블럿팅에 이용되었다.
웨스턴 블럿팅
웨스턴 블럿팅용 단백질은 비등 세포용해 완충액[2% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)]을 이용하여 분리되었다. 단백질 농도는 Bicinchoninic Acid Kit(Sigma)를 이용하여 측정되었다. 웨스턴 블럿팅을 위해 5 ㎍의 총 단백질은 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리되고 폴리비닐 디플루오라이드 멤브레인에 옮겨졌다. 사용된 1차 항체는 항-eIF5A1(BD Transduction Laboratories; 마우스 IgG) 및 항-β-액틴(Oncogene; 마우스 IgM)이고 둘 모두 5% 우유 내 1:20,000으로 희석되었다. 2차 항체는 당근 과산화효소(HRP; Sigma)에 컨쥬게이트된 항-마우스 IgG 및 항-마우스 IgMHRP(Oncogene)이었다. 항체-단백질 복합체는 증가된 화학발광방법(ECL, Amersham Biosciences)를 이용하여 가시화되었다. eIF5A1 검출 후 블럿은 ECL Plus Western 블럿팅 검출 시스템에 의해 제공된 프로토콜에 따라 스트라이프되었고 동일한 로딩을 확인하기 위해 항-β-액틴 항체로 재-프로브되었다.
증식 분석
HT-29 세포는 Lipofectamine 2000(Invitroge)을 이용하여 96-웰 플레이트 상에서 siRNA로 트랜스펙트되었다. 증식 세포의 대사 활성은 XTT Cell Proliferation Kit(Roche Applied Science)로 측정되었다. BrdU Cell Proliferation Kit(Roche Applied Science)는 제조사의 프로토콜에 따라 DNA 합성을 측정하기 위해 사용되었다.
간접적 면역형광
HT-29 세포는 폴리-L-리신-코팅된 글래스 커버슬립 상에서 배양되었다. 하위합류 세포는 200 단위의 인터페론 감마(IFN-γ; Roche Applied Science)로 16시간 동안 인큐베이트된 후 TNF-α(100 ng/ml; Leinco Technologies)에 의해 10분 내지 8시간 사이의 다른 시간 동안 인큐베이트되었다. 대안으로 세포는 1.0 ㎍/ml 악티노마이신 D로 30분 내지 16시간 사이의 시간 길이를 증가시키면서 처리되었다. 처리된 세포는 20분간 3% 포름알데하이드(메탄올-부재; Polysciences Inc.)로 고정되었고 PBS로 5분간 2회 세척되었고 100 mM 글리신 함유 PBS로 5분간 1회 세척되었고 PBS 내 0.2% Triton X-100으로 4분간 투과되었다. 이후 세포는 표준 프로토콜을 이용하여 면역형광을 위해 표지되었다. 1차 항체는 1시간 동안 1:250으로 희석되어 인큐베이트된 항-eIF5A1(BD Transduction Laboratories; 마우스 IgG)이었다. 2차 항체는 1시간 동안 1:200으로 희석되어 사용된 항-마우스 IgG-AlexaFluor 488(Molecular Probes)이었다. 항체 표지 후 세포핵은 Hoescht 33258로 염색되었고 표지된 세포는 형광 현미경으로 관찰되었다.
하이푸신 변형의 검출
COS-7 세포는 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Dulbelcco 변형 이글 배지(DMEM) 내에서 유지되었다. COS-7 세포는 90∼95% 합류로 T-25 플라스 크 내에서 배양되었다. 0.25% 트립신-EDTA로의 탈착(3분간 37℃) 후 COS-7 세포가 채취되고 10% FBS를 함유한 DMEM 내에서 희석되고 1000 RPM으로 5분간 원심분리되었다. 펠렛은 1 ml DMEM 내에서 재현탁되고 총 세포수는 혈구계로 계산되었다. 세포는 DMEM으로 1.5×106 세포/ml의 농도로 희석되고 650 ㎕의 희석 세포가 일렉트로포레잉션에 사용되었다. 15 ㎍의 플라스미드 DNA(pHM6-eIF5A1)는 50 ㎕의 Opti-MEM(Gibco)로 희석되고 650 ㎕의 희석 COS-7 세포가 첨가되고 큐벳에 옮겨졌다. 세포는 하기 조건으로 T820 ElectroSquarePorator을 이용하여 일렉트로포레이트되었다:
ⅰ. 모드: 고압 모드(HV), 99 μsec;
ⅱ. 전압: 1.5 kV;
ⅲ. 펄스 길이: 90 μsec;
ⅳ. 펄스 수: 1 또는 2
일렉트로포레이션 후 세포는 큐펫에서 각 웰 당 16% FBS를 함유한 1.2 ml의 DMEM으로 미리-로드된 6-웰 플레이트 중 하나의 웰로 옮겨지고 37℃에서 인큐베이트되었다. 트랜스펙션 6시간 후 10% FBS 및 50 μCi[3H]스퍼미딘을 함유한 100 ㎕의 DMEM이 각 웰에 첨가되었다. 일렉트로포레이션 48시간 후 세포는 냉각된 PBS로 세척되고 얼음 위에 놓였다. 200 ㎕의 냉각된 세포용해 완충액[150 mM NaCl, 1% NP40, 50 mM Tris-HCl {pH 8.0}, 프로테아제 저해제 칵테일]이 각 웰에 첨가되 고 진탕기 상에서 30분간 얼음 위에서 인큐베이트되었다. 세포는 플레이트에서 채취되어 원심분리관에 옮겨지고 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리되었다. 용해질은 신선한 시험관에 옮겨지고 20 ㎕의 항-HA 항체(Roche Applied Science)가 첨가되었다. 혼합물은 회전하면서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이트되었다. 50 ㎕의 단백질 A 아가로스(Roche Applied Science)가 첨가되고 혼합물은 회전기 상에서 1시간 동안 4℃로 인큐베이트된 후 4℃에서 15초간 13000 rpm으로 원심분리되었다. 상청액이 제거되고 800 ㎕의 냉각된 세포용해 완충액이 비드에 첨가되고 볼텍스함으서 재현탁되었다. 비드는 2회 이상 세척된 후 80 ㎕의 1 X SDS PAGE 로딩 완충액 내에 재현탁되었다. 비드는 85℃로 10분간 가열되고 13000 rpm으로 15초간 원심분리되었다. 상청액은 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고 PVDF 멤브레인으로 옮겨졌다. 멤브레인은 3H에 대한 검출 효율을 증가시키기 위해 AmplifyTM Fluorographic Reagent(Amersham) 내에 인큐베이트된 후 전개 전 10이간 -80℃에서 Hyperfilm(Amersham)에 노출되었다. 이후 멤브레인은 항-HA(Roche Applied Science) 및 항-eIF5A1(BD Transduction Laboratories)로의 웨스턴 블럿팅에 사용되었다.
웨스턴 블럿팅
PBS(8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, and 0.24 g/L KH2PO4) 내 에서 세포를 세척한 후 50 ㎕의 비등 세포용해 완충액[2 % SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)]을 첨가함으로서 단백질은 24-웰 플레이트 상에서 생장한 정상 결장 섬유아세포에서 웨스턴 블럿팅을 위해 분리되었다. 세포 용해질은 미세원심분리관 내에 수집되었고 5분간 비등되고 -20℃에서 보관되었다. 단백질 농도는 Bicinchoninic Acid Kit(BCA; Sigma)를 이용하여 측정되었다. 웨스턴 블럿팅을 위해 5 ㎍의 총 단백질이 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분획화되었다. 분리된 단백질은 폴리비닐리덴 디플로라이드 멤브레인으로 옮겨졌다. 사용된 1차 항체는 각각 5% 우유 내 1:20,000 또는 1:5000으로 희석된 항-eIF5A1(BD Transduction Laboratories; 마우스 IgG) 및 항-HA(Roche Applied Science)이었다. 멤브레인은 PBS-T 내에서 3회 세척되고 PBS 내 1% 우유에서 1:5000으로 희석된 적당한 HRP-컨쥬게이트 2차 항체로 1시간 동안 인큐베이트되었다. ECL Plus Western blotting detection kit(Amersham Pharmacia Biotech)는 항체-결합 단백질을 검출하는데 이용되었다.
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Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp 115 120 125 Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140 Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 145 150 <210> 3 <211> 462 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt 180 attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat 240 gtccccaaca tcaaaaggaa 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aaggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggc 180 attgacattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taatatggat 240 gtccccaaca tcaaacggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc 300 ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaagg agaccttggc 360 aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtctgcc 420 atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462 <210> 6 <211> 606 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(453) <400> 6 gct gtg tat tat tgg gcc cat aag aac cac ata cct gtg ctg agt cct 48 Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro 1 5 10 15 gca ctc aca gac ggc tca ctg ggt gac atg atc ttt ttc cat tcc tat 96 Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr 20 25 30 aaa aac cca ggc ttg gtc ctg gac atc gtt gaa gac ctg cgg ctc atc 144 Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile 35 40 45 aac atg cag gcc att ttc gcc aag cgc act ggg atg atc atc ctg ggt 192 Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly 50 55 60 gga ggc gtg gtc aag cac cac atc gcc aat gct aac ctc atg cgg aat 240 Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 65 70 75 80 gga gct gac tac gct gtt tat atc aac aca gcc cag gag ttt gat ggc 288 Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly 85 90 95 tca gac tca gga gcc cgg cca gat gag gct gtc tcc tgg ggc aag atc 336 Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile 100 105 110 cgg atg gat gca cag cca gta aag gtc tat gct gat gca tct ctg gtt 384 Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val 115 120 125 ttc ccc ttg ctg gtg gct gag aca ttc gcc caa aag gca gat gcc ttc 432 Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140 aga gct gag aag aat gag gac tgagcagatg ggtaaagacg gaggcttctg 483 Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150 ccacaccttt atttattatt tgcataccaa cccctcctgg gccctctcct tggtcagcag 543 catcttgaga ataaatggcc tttttgttgg tttctgtaaa aaaaggactt taaaaaaaaa 603 aaa 606 <210> 7 <211> 151 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 7 Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro 1 5 10 15 Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr 20 25 30 Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile 35 40 45 Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly 50 55 60 Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 65 70 75 80 Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly 85 90 95 Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile 100 105 110 Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val 115 120 125 Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140 Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150 <210> 8 <211> 453 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tccgtgtatt actgggccca gaagaaccac atccctgtgt ttagtcccgc acttacagac 60 ggctcgctgg gcgacatgat cttcttccat tcctacaaga acccgggcct ggtcctggac 120 atcgttgagg acctgaggct catcaacaca caggccatct ttgccaagtg cactgggatg 180 atcattctgg gcgggggcgt ggtcaagcac cacattgcca atgccaacct catgcggaac 240 ggggccgact acgctgttta catcaacaca gcccaggagt ttgatggctc tgactcaggt 300 gcccgaccag acgaggctgt ctcctggggc aagatccggg tggatgcaca gcccgtcaag 360 gtctatgctg acgcctccct ggtcttcccc ctgcttgtgg ctgaaacctt tgcccagaag 420 atggatgcct tcatgcatga gaagaacgag gac 453 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <220> <221> modified_base <222> (12) <223> any nucleic acid <400> 9 tcsaarachg gnaagcaygg 20 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 10 gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42 <210> 11 <211> 972 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 11 tcg aag acc ggt aag cac ggc cat gcc aag gtc cat ctg gtt ggt att 48 Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile 1 5 10 15 gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat atc tgc ccg tcg act cat 96 Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His 20 25 30 aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat gat ttc cag ctg att ggc 144 Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly 35 40 45 atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag gac agt ggg gag gta cga 192 Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg 50 55 60 gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt ggc aag gag att gag cag 240 Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln 65 70 75 80 aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc aca gtg ctg tcc gcc atg 288 Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met 85 90 95 aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc atg gca aaa taactggctt 337 Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 100 105 ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc atgagcctac agaggcccct cccccagctc 397 tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggttttcct 457 caccccttca aactgtcggg gagaccctgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga 517 gggagccatg gccttggtga agctacctgc ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag 577 ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc cctctccctt tttcttttta attcaatttg 637 gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca 697 tctggtcccc tgttctccat agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca 757 gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat aggggtgaca agaagaggag 817 ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc atctgggaag gccttgcccc catgggcttt 877 accctttcct gtgggctttc tccctgacac atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact 937 acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 972 <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 12 Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile 1 5 10 15 Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His 20 25 30 Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly 35 40 45 Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg 50 55 60 Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln 65 70 75 80 Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met 85 90 95 Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 100 105 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 13 caggtctaga gttggaatcg aagc 24 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 14 atatctcgag ccttgattgc aacagctgcc 30 <210> 15 <211> 489 <212> DNA <213> Rattus sp. <220> <221> CDS <222> (33)..(485) <400> 15 caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe 1 5 gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca 101 Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser 10 15 20 gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag 149 Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 25 30 35 atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197 Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys 40 45 50 55 gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245 Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 60 65 70 atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat 293 Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn 75 80 85 gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag 341 Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln 90 95 100 gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt 389 Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu 105 110 115 ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc 437 Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile 120 125 130 135 aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gct 485 Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala 140 145 150 cgag 489 <210> 16 <211> 151 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 16 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp 115 120 125 Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140 Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala 145 150 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 17 gtctgtgtat tattgggccc 20 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 18 gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42 <210> 19 <211> 1299 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ggcacgaggg cggcggcggc ggtagaggcg gcggcggcgg cggcagcggg ctcggaggca 60 gcggttgggc tcgcggcgag cggacggggt cgagtcagtg cgttcgcgcg agttggaatc 120 gaagcctctt aaaatggcag atgacttgga cttcgagaca ggagatgcag gggcctcagc 180 caccttccca atgcagtgct cagcattacg taagaatggc tttgtggtgc tcaaaggccg 240 gccatgtaag atcgtcgaga tgtctacttc gaagactggc aagcacggcc acgccaaggt 300 ccatctggtt ggtattgaca tctttactgg gaagaaatat gaagatatct gcccgtcaac 360 tcataatatg gatgtcccca acatcaaaag gaatgacttc cagctgattg gcatccagga 420 tgggtaccta tcactgctcc aggacagcgg ggaggtacga gaggaccttc gtctccctga 480 gggagacctt ggcaaggaga ttgagcagaa gtacgactgt ggagaagaga tcctgatcac 540 ggtgctgtct gccatgacag aggaggcagc tgttgcaatc aaggccatgg caaaataact 600 ggctcccagg atggcggtgg tggcagcagt gatcctctga acctgcagag gccccctccc 660 cgagcctggc ctggctctgg cccggtccta agctggactc ctcctacaca atttatttga 720 cgttttattt tggttttccc caccccctca atctgtcggg gagcccctgc ccttcaccta 780 gctcccttgg ccaggagcga gcgaagctgt ggccttggtg aagctgccct cctcttctcc 840 cctcacacta cagccctggt gggggagaag ggggtgggtg ctgcttgtgg tttagtcttt 900 tttttttttt tttttttttt tttaaattca atctggaatc agaaagcggt ggattctggc 960 aaatggtcct tgtgccctcc ccactcatcc ctggtctggt cccctgttgc ccatagccct 1020 ttaccctgag caccacccca acagactggg gaccagcccc ctcgcctgcc tgtgtctctc 1080 cccaaacccc tttagatggg gagggaagag gaggagaggg gaggggacct gccccctcct 1140 caggcatctg ggagggccct gcccccatgg gctttaccct tccctgcggg ctctctcccc 1200 gacacatttg ttaaaatcaa acctgaataa aactacaagt ttaatatgaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1299 <210> 20 <211> 462 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 20 atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca agggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggt 180 attgatattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taacatggat 240 gtccccaaca tcaaaaggaa tgatttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc 300 ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaggg agaccttggc 360 aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtccgcc 420 atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462 <210> 21 <211> 154 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp 115 120 125 Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140 Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 145 150 <210> 22 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn 115 120 125 Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu 130 135 140 Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys 145 150 <210> 23 <211> 154 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp 115 120 125 Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140 Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 145 150 <210> 24 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn 115 120 125 Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu 130 135 140 Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys 145 150 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 gacttggact tcgagacagg 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 gcacggccac gccaaggtc 19 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 ggacagcggg gaggtacgag 20 <210> 28 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <400> 28 Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn 115 120 125 Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu 130 135 140 Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys 145 150 <210> 29 <211> 1309 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ggcacgaggg tagaggcggc ggcggcggcg gcagcgggct cggaggcagc ggttgggctc 60 gcggcgagcg gacggggtcg agtcagtgcg ttcgcgcgag ttggaatcga agcctcttaa 120 aatggcagat gacttggact tcgagacagg agatgcaggg gcctcagcca ccttcccaat 180 gcagtgctca gcattacgta agaatggctt tgtggtgctc aaaggccggc catgtaagat 240 cgtcgagatg tctacttcga agactggcaa gcacggccac gccaaggtcc atctggttgg 300 tattgacatc tttactggga agaaatatga agatatctgc ccgtcaactc ataatatgga 360 tgtccccaac atcaaaagga atgacttcca gctgattggc atccaggatg ggtacctatc 420 actgctccag gacagcgggg aggtacgaga ggaccttcgt ctccctgagg gagaccttgg 480 caaggagatt gagcagaagt acgactgtgg agaagagatc ctgatcacgg tgctgtctgc 540 catgacagag gaggcagctg ttgcaatcaa ggccatggca aaataactgg ctcccaggat 600 ggcggtggtg gcagcagtga tcctctgaac ctgcagaggc cccctccccg agcctggcct 660 ggctctggcc cggtcctaag ctggactcct cctacacaat ttatttgacg ttttattttg 720 gttttcccca ccccctcaat ctgtcgggga gcccctgccc ttcacctagc tcccttggcc 780 aggagcgagc gaagctgtgg ccttggtgaa gctgccctcc tcttctcccc tcacactaca 840 gccctggtgg gggagaaggg ggtgggtgct gcttgtggtt tagtcttttt tttttttttt 900 tttttttttt aaattcaatc tggaatcaga aagcggtgga ttctggcaaa tggtccttgt 960 gccctcccca ctcatccctg gtctggtccc ctgttgccca tagcccttta ccctgagcac 1020 caccccaaca gactggggac cagccccctc gcctgcctgt gtctctcccc aaaccccttt 1080 agatggggag ggaagaggag gagaggggag gggacctgcc ccctcctcag gcatctggga 1140 gggccctgcc cccatgggct ttacccttcc ctgcgggctc tctccccgac acatttgtta 1200 aaatcaaacc tgaataaaac tacaagttta atatgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1309 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 aaaggaatga cttccagctg att 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 aagatcgtcg agatgtctac ttc 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 aaggtccatc tggttggtat tga 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 aagctggact cctcctacac aat 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 aaagtcgacc ttcagtaagg att 23 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 cctgtctcga agtccaagtc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gacttggact tcgagacagg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 ggaccttggc gtggccgtgc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 gcacggccac gccaaggtcc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 ctcgtacctc cccgctctcc 20 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 ggacagcggg gaggtacga 19 <210> 41 <211> 465 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt 180 attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat 240 gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca 300 ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc 360 aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc 420 atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aataa 465 <210> 42 <211> 462 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg 60 cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata 120 gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga 180 attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat 240 gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc 300 ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc 360 aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca 420 atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctgcaaat aa 462 <210> 43 <211> 154 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30 Leu Lys Gly Trp Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Ala Ser Lys Thr 35 40 45 Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe 50 55 60 Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp 65 70 75 80 Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp 85 90 95 Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Pro Glu Asp Leu 100 105 110 Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp 115 120 125 Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Leu Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140 Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys 145 150 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 aaaggaatga cttccagctg a 21 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 aaaggaauga cuuccagcug att 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 ucagcuggaa gucauuccuu utt 23 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 aagatcgtcg agatgtctac t 21 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 aagaucgucg agaugucuac utt 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 aguagacauc ucgacgaucu utt 23 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 aaggtccatc tggttggtat t 21 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 aagguccauc ugguugguau utt 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 aauaccaacc agauggaccu utt 23 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 aagctggact cctcctacac a 21 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 aagcuggacu ccuccuacac att 23 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 uguguaggag gaguccagcu utt 23 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 aaagtcgacc ttcagtaagg a 21 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 57 aaagucgacc uucaguaagg att 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 58 uccuuacuga aggucgacuu utt 23 <210> 59 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 gccaagctta atggcagatg atttgg 26 <210> 60 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 ctgaattcca gttattttgc catgg 25 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 aatgaattcc gccatgacag aggaggc 27 <210> 62 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 cctgtctcga agtccaagtc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 ggaccttggc gtggccgtgc 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 ctcgtacctc cccgctctcc 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 cgtaccggta cggttccagg 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 67 ggaccttggc gtggccgtgc 20 <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Cys Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr 1 5 10 15 Asp <210> 69 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 aaaggaatga cttccagctg acctgtctc 29 <210> 70 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 aatcagctgg aagtcattcc tcctgtctc 29 <210> 71 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 aagatcgtcg agatgtctac tcctgtctc 29 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 72 aaagtagaca tctcgacgat ccctgtctc 29 <210> 73 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 73 aaggtccatc tggttggtat tcctgtctc 29 <210> 74 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 74 aaaataccaa ccagatggac ccctgtctc 29 <210> 75 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 aagctggact cctcctacac acctgtctc 29 <210> 76 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 aatgtgtagg aggagtccag ccctgtctc 29 <210> 77 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 aaagtcgacc ttcagtaagg acctgtctc 29 <210> 78 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 aatccttact gaaggtcgac tcctgtctc 29 <210> 79 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 aagcuggacu ccuccuacac a 21 <210> 80 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 aaacacaucc uccucagguc g 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 aaaggaatga cttccagctg a 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 aagatcgtcg agatgtctac t 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 aaggtccatc tggttggtat t 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 aagctggact cctcctacac a 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 aaagtcgacc ttcagtaagg a 21 <210> 86 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, t, c, g or u <400> 86 nngcuggacu ccuccuacac a 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 87 gcuggacucc uccuacacat t 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 88 uguguaggag gaguccagct t 21 <210> 89 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(2) <223> a, t, c, g or u <400> 89 nnacacaucc uccucagguc g 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 90 acacauccuc cucaggucgt t 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 91 cgaccugagg aggaugugut t 21 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 92 cggatggcaa catttagaat tagt 24 <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 93 tgattgagac tgtaatcaag aacc 24 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 94 ctgatgcccc catgttcgtc at 22 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 95 ccaccaccct gttgctgtag 20 <210> 96 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 96 aacggaauga cuuccagcug att 23 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 97 cggaaugacu uccagcugat t 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 98 ucagcuggaa gucauuccgt t 21 <210> 99 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 99 ucagcuggaa gucauuccg 19 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 100 cgagttggaa tcgaagcctc 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 101 ggttcagagg atcactgctg 20 <210> 102 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 102 gccaagctta atggcagatg atttgg 26 <210> 103 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 103 cctgaattcc agttattttg ccatgg 26 <210> 104 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 104 gccaagctta atggcagatg atttgg 26 <210> 105 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 105 gccgaattct ccctcaggca gagaag 26 <210> 106 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 106 gaggaattcg ctgttgcaat caaggc 26 <210> 107 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 107 tttaagcttt gtgtcgggga gagagc 26 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 108 gcuggacucc uccuacacat t 21 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 109 uguguaggag gaguccagct t 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 110 acacauccuc cucaggucgt t 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 111 cgaccugagg aggaugugut t 21 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 112 cggaaugacu uccagcugat t 21 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic siRNA sequence <400> 113 agucgaccuu caguaaggct t 21 <210> 114 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 114 gctccatggc agatgatttg gacttcg 27 <210> 115 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 115 cgcgctagcc agttattttg ccatcgcc 28 <210> 116 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 116 gctccatgga tgtacccata cgacgtccc 29 3 1 2 1

Claims (5)

  1. 세포 내 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 내인성 발현을 억제하고 3'-GCC UUA CUG AAG GUC GAC U-5'(서열번호: 99)의 서열을 지님을 특징으로 하는 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA
  2. 포유류 내 패혈증 치료용 약제를 위한 제 1항의 siRNA의 이용
  3. 암세포 내 아폽토시스 유도 또는 증가용 약제를 위한 제 1항의 siRNA
  4. 암세포 내 아폽토시스 유도 또는 증가용 약제를 위한 센스 방향으로 하기 서열을 지닌 siRNA의 이용: 5' GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT 3'(서열번호: 108)
  5. 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 발현 감소용 약제를 위한 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 또는 아폽토시스-특이적 eIF-5A의 siRNA의 이용
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