[go: up one dir, main page]

KR20070069680A - 스타필로코코스 아우레우스 검출용 ｄｎａ 칩 - Google Patents

스타필로코코스 아우레우스 검출용 ｄｎａ 칩 Download PDF

Info

Publication number
KR20070069680A
KR20070069680A KR1020050132072A KR20050132072A KR20070069680A KR 20070069680 A KR20070069680 A KR 20070069680A KR 1020050132072 A KR1020050132072 A KR 1020050132072A KR 20050132072 A KR20050132072 A KR 20050132072A KR 20070069680 A KR20070069680 A KR 20070069680A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
probe
dna
staphylococcus aureus
nucleic acid
hybridization
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
KR1020050132072A
Other languages
English (en)
Inventor
이상엽
유승민
금기창
유내춘
유원민
김준명
최준용
Original Assignee
메디제네스(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메디제네스(주) filed Critical 메디제네스(주)
Priority to KR1020050132072A priority Critical patent/KR20070069680A/ko
Publication of KR20070069680A publication Critical patent/KR20070069680A/ko
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/44—Staphylococcus
    • C12R2001/445—Staphylococcus aureus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 생물학적 시료 중에서 스타필로코코스 아우레우스를 검출 및 동정하는데 유용한 스타필로코코스 아우레우스 특이적 핵산 탐침에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 스타필로코코스 아우레우스의 23S rRNA 유전자로부터 유도된 핵산 탐침이 고정된 스타필로코코스 아우레우스 검출 및 동정용 DNA 칩에 관한 것이다.
본 발명에 따른 DNA 칩을 사용하면, 현재 사용되고 있는 방법인 샘플 배양에 의하여 감염성 질환을 진단하는 방법보다 더욱 신속하고 정확하게 세균 감염을 진단할 수 있다.
스타필로코코스 아우레우스균, 탐침, DNA chip, 23S rRNA, 검출, 동정

Description

스타필로코코스 아우레우스 검출용 ＤＮＡ 칩{DNA Chip for Detection of Staphylococcus aureus}
도 1의 A는 스타필로코코스 아우레우스 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험을 위한 DNA 칩의 디자인을 도시한 것이다.
도 1의 B는 스타필로코코스 아우레우스 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 어레이웍스 마이크로 어레이 스캐너(ArrayWorks)를 이용하여 검색된 혼성화 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 A는 스타필로코코스 아우레우스 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험을 위한 DNA 칩의 디자인을 도시한 것이다.
도 2의 B는 스타필로코코스 아우레우스 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 어레이웍스 마이크로 어레이 스캐너를 이용하여 검색된 혼성화 반응 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 생물학적 시료 중에서 스타필로코코스 아우레우스를 검출 및 동정하는데 유용한 스타필로코코스 아우레우스 특이적 핵산 탐침에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 스타필로코코스 아우레우스의 23S rRNA 유전자로부터 유도된 핵산 탐침이 고정된 스타필로코코스 아우레우스 검출 및 동정용 DNA 칩에 관한 것이다.
감염질환은 병원체가 혈액, 체액 및 조직 내에 출현하여 서식하기 시작하면서 발병하는 질환으로서, 원인균의 정확한 동정 및 적절한 치료가 이루어지지 않을 경우, 생명을 잃을 수 있는 질병이다. 더욱이 최근에는 항생제투여의 오남용으로 인해 병원체의 배양률이 감소하게 되었고, 이식에 따른 면역억제제 사용의 증가, 항암 치료로 인한 약물투여의 증가 등으로 인한 원인병원체가 다양해지게 되면서 배양 검사와 같은 기존의 감염질환을 진단하는 진단방법들이 점차 어려움에 부딪히고 있는 실정이다. 따라서, 이를 조속히 진단함과 동시에 원인 병원체의 종류를 확인하는 것이 치료에 있어서 상당히 중요한 위치를 차지한다.
이들 감염성 병원균 중 스타필로코코스 아우레우스는 황색 포도상구균으로 불리며, 피부감염, 연조직 감염, 골관절염, 폐렴, 균혈증, 식중독 등을 일으키는 병원균으로 적절한 항생제로 치료를 하지 못했을 때 이환율과 치명률이 높다. 스타필로코코스 아우레우스 감염은 비강정착자에서 자주 발생하고 중환자 실에는 메티실린 내성 스타필로코코스 아우레우스 (MRAS:methicillin-resistant Staphylococcus aureus)에 감염되거나 집락이 형성된 환자들이 입원하기 쉽기 때문에 이들 환자들에서 다른 환자들로 전염이 일어날 가능성이 매우 높다. 따라서 선 별검사를 통하여 적절한 예방조치를 취하는 것이 중요하다.
이와 같은 필요성으로 인해 오랫동안 감염질환 원인균인 스타필로코코스 아우레우스를 동정하고자 하는 진단 방법들이 연구 및 개발되어 왔다. 지난 10년 동안에 많은 미생물을 검출하는데 상당한 진보가 있어 왔지만 현재 이용되고 있는 진단 방법들은 여전히 많은 노동을 필요로 하고 있고 민감도 및 특이성이 낮은 형편이다.
바이러스를 제외하고, 모든 원핵 유기체는 원핵성 5S, 16S 및 23S rRNA 분자들의 상동체를 코딩하는 rRNA 유전자를 함유한다. 진핵 세포의 경우는 이들 rRNA 분자들이 원핵 세포의 분자와 실질적으로 유사한 5S rRNA, 5.8S rRNA, 18S rRNA 및 28S rRNA이다. 생물학적 시료에서 특정한 유기체 또는 유기체 군의 rRNA 아서열을 특정한 표적으로 하여 검출하기 위한 탐침들이 많이 공개되어 있다. 이러한 핵산 탐침을 잘 알려진 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 함께 병용함으로써 종래의 진단 방법에서의 상기 문제점 가운데 많은 것들이 해결될 수 있었다. 진단을 위한 핵산 탐침 기술에서는 증폭시키는 표적 유전자의 선택이 매우 중요한데 대체로 rRNA, 특히 23S rRNA 유전자가 많이 이용되고 있으며 이들에 대한 핵산 탐침서열은 유리하게는 적당한 긴축 조건하에서 다른 유기체로부터 유래된 핵산과 교차 반응하는 확률이 낮은 것으로 알려져 있다 (P. Wattiau et. al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:816, 2001; D, A. Stahlm et. al., J. Bacteriol., 172:116, 1990; Boddinghaus. et. al., J. Clin., Microbiol., 28:1751, 1990; T. Rogall et al., J. Gen. Microbiol., 136:1915, 1990; T. Rogall, et. al., Int. J. System. Bacteriol., 40:323, 1990; K. Rantakokko-Jalava et. al., J. Clin., Mirobiol., 38:32, 2000; Park et. al., J. Clin., Mirobiol., 38:4080, 2000; A. Schmalenberger et. al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 67:3557, 2001; WO98/55646; 미국특허 제6,025,132호 및 미국특허 제6,277,577호).
본 발명자들은 비바이러스성 감염성 유기체를 검출 및 동정하기 위하여 상기 감염성 유기체들에 특이적인 핵산서열을 탐침으로 이용한 DNA 칩에 대한 특허를 출원한 바 있으며(대한민국 특허출원 10-2005-7014626 등), 상기 DNA 칩의 민감성을 높이기 위한 연구를 계속하고 있다.
이에, 본 발명자들은 스타필로코코스 아우레우스 감염 의심 환자의 샘플에서 스타필로코코스 아우레우스를 신속하게 검출하고자 예의 노력한 결과, 스타필로코코스 아우레우스 게놈의 23S rRNA 유전자에서 스타필로코코스 아우레우스 특이적인 서열을 발견하고, 이를 스타필로코코스 아우레우스 검출용 탐침으로 사용하여, DNA 칩을 제작함으로써, 신속하고 정확하게 스타필로코코스 아우레우스를 검출할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 스타필로코코스 아우레우스 게놈의 23S rRNA 유전자에서 스타필로코코스 아우레우스에 특이적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 스타필로코코스 아우레우스 검출 및 동정용 DNA 칩을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오티드로 구성된 스타필로코코스 아우레우스 검출 및 동정용 탐침을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AGGACGACATTAGAC (서열번호 1); CAAAGGACGACATTAGACGA (서열번호 2);CGAAGCGTGCGATTG 서열번호 3); AGGCGAAGCGTGCGATTGGA (서열번호 4); TGGATTGCACGTCTAAGCAG (서열번호 5); CAAATCCGGTACTCGTTAAG (서열번호 6); GAGTCTTCGAGTCGTTGATT (서열번호 7); 및 TCTTCGAGTCGTTGA (서열번호 8)의 염기 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 스타필로코코스 아우레우스 검출 및 동정용 DNA 칩을 제공한다.
본 발명은 또한, AGGACGACATTAGAC (서열번호 1); CAAAGGACGACATTAGACGA (서열번호 2);CGAAGCGTGCGATTG 서열번호 3); AGGCGAAGCGTGCGATTGGA (서열번호 4); TGGATTGCACGTCTAAGCAG (서열번호 5); CAAATCCGGTACTCGTTAAG (서열번호 6); GAGTCTTCGAGTCGTTGATT (서열번호 7); 및 TCTTCGAGTCGTTGA (서열번호 8)의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 스타필로코코스 아우레우스 검출 및 동정용 탐침을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 스타필로코코스 아우레우스의 23S rRNA 염기서열을 지금까지 서열이 밝혀진 세균들의 염기서열과 다중정렬하여 비교하고, 스타필로코코스 아우레우스에 특이적인 서열을 확인하여, 상기 스타필로코코스 아우레우스 특이 서열을 이용하여 탐침 후보군을 선정하고, 스타필로코코스 아우레우스 특이 탐침을 합성하였다. 상기 합성된 탐침을 알데히드-아민 결합을 이용하여, 유리판에 고정하여 스타필로코코스 아우레우스 검출용 DNA 칩을 제작하였다.
또한, 상기 스타필로코코스 아우레우스 검출용 DNA 칩 및 탐침의 특이성을 검증하기 위하여 표준균주의 게놈을 분리하고, 상기 게놈을 주형으로 PCR을 수행한 PCR 산물을 DNA 칩에 혼성화하여 상기 DNA 칩이 스타필로코코스 아우레우스 검출에 효과적임을 확인하였다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어 및 표현을 설명한다.
"분리된" 핵산 분자는 핵산의 천연원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 예를 들면, 게놈 DNA와 관련하여, 용어 "분리된"은 게놈 DNA가 천연적으로 결합하고 있는 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 포함한다.
"탐침" 또는 "핵산 탐침"은 검출하고자 하는 표적 염기 서열과 충분히 상보적이어서 혼성화하는 염기 서열을 갖는 단일 가닥에 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 가리킨다.
"조성물"은 세균 또는 진균의 rRNA에 상보적인 탐침이 순수한 상태이거나 다 른 탐침과 배합되어 있을 수 있음을 의미한다. 또한, 탐침은 염 또는 완충제와 배합되어 건조된 상태, 침전물로서 알코올 용액 또는 수용액의 상태로 있을 수 있다.
"표적"은 본 발명에 따른 탐침 중 어느 것과도 상보적인 서열을 갖는 생물학적 시료 유래의 핵산 분자를 의미한다. 표적 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA (임의로 증폭 후 수득함)이거나 RNA일 수 있으며 적어도 한 개의 탐침 올리고뉴클레오타이드와 적어도 부분적인 상보성을 갖는 서열을 함유한다.
"생물학적 시료"는 목적하는 표적 서열을 검출하고자 하는 임상 시료 (예, 농즙, 타액, 혈액, 뇨 등), 환경 시료, 세균 콜로니, 오염된 또는 순수한 배양물, 정제된 핵산 등의 검체 (specimen)를 가리킨다.
"올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 고분자를 의미한다. 그러나, 뉴클레오타이드의 길이는 100개 이상이거나 10개 이하일 수 있다.
"뉴클레오타이드"는 포스페이트 그룹, 5-탄당 및 질소 염기로 구성된 핵산의 기본 단위이다. RNA에서 5-탄당은 리보스이다. DNA에서 5-탄당은 2-데옥시리보스이다. 5-뉴클레오타이드의 경우, 당은 5-탄당-2에서 하이드록실그룹(-OH)을 함유한다. 이 용어는 또한 리보스의 2 위치에 메톡시 그룹과 같이 상기 기본 단위의 유사체를 포함한다.
"상동성"은 동일성과 동의어로서, 예를 들면 90% 상동성이라고 하는 폴리핵산은 서열의 배열시 동일한 위치에서 90%의 동일한 염기쌍을 나타내는 것을 의미한다.
"혼성화"는 표적 핵산(검출하고자 하는 서열)에 상보 서열의 교잡(annealing)을 의미한다. 상보 서열을 포함한 두 핵산 고분자가 서로를 발견하고 염기 쌍 상호작용을 통해 교잡하는 능력은 잘 알려진 현상이다.
"프라이머"는 복제하고자 하는 핵산 본쇄에 상보적인 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드 서열을 가리킨다. 프라이머의 길이 및 서열은 이들이 연장 산물의 합성을 개시할 수 있을 정도이면 되는데 바람직하게는 약 5 내지 50개의 뉴클레오타이드로 구성된다. 특정한 길이 및 서열은 목적하는 DNA 또는 RNA 표적의 복잡성뿐만 아니라 온도 및 이온강도와 같은 프라이머 사용의 조건에 의해 결정될 것이다.
"표지"는 검출가능한 (바람직하게는 정량가능한) 시그날을 제공하고 핵산에 결합될 수 있는 모든 원자 또는 분자를 가리킨다. 표지는 형광, 방사성, 색도, X-선 회절 또는 흡수, 마그네티즘 등에 의해 검출가능한 시그날을 제공할 수 있다.
"하이브리드"는 상보적인 염기사이의 왓슨-크릭 염기 쌍 또는 비표준 염기 쌍에 의해 두개의 단일가닥 핵산 서열사이에 형성된 복합체이다.
"탐침 특이성"은 표적과 비표적 서열을 구분하는 능력을 기술하기 위한 탐침의 특징을 가리킨다. 이와 관련하여, 탐침이 특이적이다라고 하는 것은 뉴클레오타이드 서열이 정해진 표적 서열과 혼성화하고 비표적 서열과는 실질적으로 하이브리드하지 않거나 비표적 서열과의 혼성화가 최소로 이루어진다는 것을 의미한다. 탐침 특이성은 서열 및 검정 조건에 의해 좌우된다.
"표준균주"는 시판중에 있거나 용이하게 입수가능한 균주를 가리킨다.
탐침의 동정
균의 검출용 핵산 탐침을 제작하기 위해서는 각 균에만 특이성을 가져야 하는데 이를 위하여 먼저 각 균에 대한 특이 탐침 후보군을 선정한다. 특이 탐침 후보군은 가능한 모든 균들의 염기서열들을 다중 정렬(multiple alignment)을 통해서 일렬로 정렬 비교하여 각 균에만 존재하는 특이적인 염기서열을 별도로 구분하여 그 내부에 존재하는 탐침 후보군을 제작하여 선별한다. 탐침 후보군은 세균의 경우 각 균내의 23S rRNA 유전자 내에서 결정하고, 진균의 경우는 18S rRNA 유전자 부위 내에서 결정한다. 탐침 후보군의 특이성 여부는 먼저 BLAST 검색을 통해 균별간 유사성을 비교하여 확인하고 실제로 혼성화 반응에 균주들을 적용하여 각 균에서만 반응하는 탐침을 후보군 내에서 동정용으로 선별한다. 추가로, 상기와 같이 선별된 동정용 핵산 탐침은 여러 생물학적 시료를 대상으로 하는 임상 시험에 적응하여 민감성을 확인한다.
본 발명에 따라 선별된 핵산 탐침은 적어도 15량체의 올리고뉴클레오타이드이며, 바람직하게는 검출하고자 하는 표적의 완전한 상보서열과 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 갖는다. 본 발명에 따른 각 균의 검출 및 동정용 핵산 탐침의 올리고뉴클레오타이드의 길이는 50개 또는 그 이상도 가능하다. 본 발명에 사용되는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 및 이노신 또는 변형 그룹을 함유한 뉴클레오타이드와 같은 변형된 뉴클레오타이드도 가능하나, 이들은 혼성화 특징에 반드시 영향을 미치지 않아야 한다.
탐침 이용
본 발명의 핵산 탐침은 진단 목적상 생물학적 시료중에서 표적 핵산의 유무를 시험하는데 있어서 공지된 모든 혼성화 기술, 예를 들면 도트-블롯이라고 하는 필터상에의 포인트 침착 기술(MANIATIS et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), 써던 블롯이라고 하는 DNA 전달 기술 (SOUTHERN, E.M., J. Mol . Biol., 98:503, 1975), 노썬 블롯이라고 하는 RNA 전달 기술에 따라 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 탐침은 핵산 탐침-기본 검정의 특이성을 높여주는 샌드위치 혼성화 시스템에 사용할 수 있다. 핵산 탐침-기본 검정에서 샌드위치 혼성화의 원리 및 사용은 공지되어 있다(DUNN and HASSEL, Cell, 12:23, 1977; 및 RNAKI et al., Gene, 21:77, 1983). 샌드위치 혼성화 기술은 포획 탐침 및/또는 검출 탐침이 사용되며 이들 탐침은 표적 핵산의 상이한 두 영역과 혼성화할 수 있고 그들 중 적어도 하나 (일반적으로 검출 탐침)가 목적하는 균에 대해 특이적인 표적의 영역과 혼성화할 수 있다. 포획 탐침과 검출 탐침은 적어도 부분적으로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가져야 한다. 직접적인 혼성화 검정이 유리한 역학을 제시하지만, 샌드위치 혼성화는 시그날-대-노이즈 비율이 높다는 점에서 유리하다. 또한, 샌드위치 혼성화는 핵산 탐침-기본 검정의 특이성을 높일 수 있다. 샌드위치 혼성화 과정의 주요 단계를 구성하는 배양 및 후속 세척 단계는 각각 항온, 약 20 내지 65℃에서 실시한다. 핵산 하이브리드는 혼성화된 염기의 수에 의해 좌우되고 (온도는 하이브리드의 크기에 비례하여 증가한다) 또한 혼성화된 염기의 성질 및 각각의 혼성화된 염기의 경우 인접한 염기의 성질에 의해 좌우되는 해리 온도를 갖는 것으로 알려져 있다. 샌드위치 혼성화 기술에서 사용되는 혼성화 온도는 주어진 탐침과 상보적인 서열의 표적사이에 형성된 하이브리드의 반-해리 온도 이하에서 선택되어야 한다. 이러한 반-해리 온도는 간단한 통상의 실험에 의해 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 탐침은 경쟁 혼성화 프로토콜에 사용할 수 있다. 경쟁 혼성화에서, 표적 분자는 특정 탐침과 이의 상보체사이에서의 하이브리드 형성과 경쟁한다. 표적이 더 많이 존재할수록 탐침과 이의 상보체사이에 형성된 하이브리드의 양은 줄어든다. 특정 표적이 존재함을 지시하는 양성 시그날은 표적이 첨가되지 않은 시스템과 비교하여 혼성화 반응이 감소하는 것으로 나타난다. 특정 양태로서, 편리하게는 표지되는 특이적 올리고뉴클레오타이드 탐침을 표적 분자와 혼성화한다. 이어서, 혼합물을 특이적 탐침과 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 고정된 미세역가 디쉬 웰에 넣고 계속 혼성화 반응이 일어나도록 한다. 세척 후 상보적인 올리고뉴클레오타이드와 탐침사이의 하이브리드를 바람직하게는 사용된 표지에 따라 정량한다.
또한, 본 발명의 핵산 탐침은 역혼성화 (reversed hybridization) (Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 86:6230, 1989)에 사용할 수 있다. 이 경우는 우선 표적 서열을 5 바이오티닐화 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 효소적으로 증폭할 수 있다. 두 번째 단계로 증폭된 산물은 고체 지지체상에 고정된 특정 올리고뉴클 레오타이드와의 혼성시켜 검출한다. 역혼성화는 증폭하지 않고서 실시할 수 있다. 이러한 경우는 생물학적 시료에 존재하는 핵산은 혼성화이전에 화학적으로나 특정 염료을 첨가하여 특이적으로 또는 비특이적으로 표지 또는 변형시켜야 한다.
본 발명의 핵산 탐침은 상기 본 발명에서 목적하는 병원균의 존재 여부를 신속히 결정하는데 사용할 수 있는 키트에 포함될 수 있다. 키트는 병원균의 존재를 검정하는데 필요한 모든 구성요소를 포함한다. 통상의 개념으로, 키트는 표지된 탐침의 안정한 제제, 표적과 탐침 핵산의 혼성화를 유도하기 위한 무수 또는 액체 형태의 혼성화액, 원치않거나 혼성화되지 않은 핵산을 세척하여 제거하기 위한 용액, 표지된 하이브리드를 검출하기 위한 기질 및 임의로 표지를 검출하기 위한 기기를 포함한다.
본 발명의 한 가지 특정 양태는 샌드위치 검정의 개념을 이용하는 키트를 포함한다. 이 키트는 환자의 특정 부위에서 검체를 수집하기 위한 제1 요소, 예를들면 검체의 스크랩핑 도구 또는 페이터 포인트, 수용 바이알, 분산 및 용해 완충액이 포함된다. 제2 요소는 표적과 탐침 핵산사이의 혼성화를 위한 무수 또는 액체 상태의 매질 및 혼성화되지 않고 원하지 않는 형태를 세척하여 제거하기 위한 매질을 포함한다. 제3 요소는 표적 핵산의 일부에 상보적인 비표지된 핵산 탐침이 고정되어 있거나 결합되어 있는 고체 지지체를 포함한다. 다수의 표적을 분석하는 경우는 개개 자신의 rRNA에 대해 특이적인 한종 이상의 포획 탐침이 딥스틱의 다른 개별 영역에 적용된다. 제4 요소는 제3 요소의 고정되고 비표지된 핵산 탐침이 혼성화되는 동일한 rRNA 본쇄의 제2의 다른 영역에 상보적인 표지된 탐침을 함유한다. 여기서, 핵산 탐침은 동결건조된 핵산과 같은 무수 형태 또는 알코올 침전된 핵산과 같은 침전형태 또는 완충액으로서 탐침의 배합물을 포함한다. 표지된 알려진 어떠한 표지도 가능할 수 있다. 예를 들면, 탐침은 통상적인 수단에 의해 바이오티닐화할 수 있으며 바이오티닐화된 탐침의 존재는 고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소에 결합된 아비딘을 첨가한 다음, 퍼옥시다제와 반응했을 때 시각적으로 모니터링하거나 색도계 또는 분광계를 이용한 장비로 모니터링할 수 있는 기질과 접촉시켜 검출할 수 있다. 이러한 표지 방법 및 기타 효소 형태의 표지는 방사능 표지방법과 비교하여 경제적이고, 고도로 민감하며, 비교적 안전하다는 이점을 갖는다. 검정 키트의 완성품에는 표지된 탐침의 검출을 위한 여러 시약 및 기타 키트에 포함되는 것들, 예를 들면 지침서, 양성 및 음성 대조군 및 여러 성분을 혼합 반응시키기 위한 용기 등이 포함된다.
DNA 칩
또한, 본 발명의 핵산 탐침은 유전자 칩으로 사용된다. 본 발명의 바람직한 양태는 본 발명의 핵산 탐침이 고체 지지체에 고정된 DNA 칩을 제공한다. DNA 칩은 작은 기판상에 여러 염기 서열의 단편이 고밀도로 집적된 것으로 기판에 고정된 DNA와 이에 상보적인 미지의 DNA 시료사이의 혼성화에 의해 미지 시료의 DNA를 검출하는데 사용한다. 탐침을 고정시킬 기판은 유리, 실리콘 등과 같은 무기질이나 또는 아크릴계, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (polyethylene terephtalate, PET), 폴리스틸렌 (polystylene), 폴리카보네이트 (polycarbonate), 폴리프로필렌 (polypropylene) 등과 같은 고분자 물질로 이루어지고, 기판의 표면은 편평하거나 다수개의 구멍(hole)이 있는 것을 사용할 수 있다. 탐침의 고정은 5' 또는 3' 중 어느 한 위치가 기판에 공유결합으로 고정된다. 고정화 방법은 통상의 기술로서 예를 들면 정전기적 힘을 이용하거나, 합성된 올리고상에 아민기를 붙여 알데하이드 코팅된 슬라이드에 붙여 이 둘간의 결합을 유도하거나, 아민기 코팅된 슬라이드상에 혹은 L-라이신이 코팅된 슬라이드상에 혹은 니트로셀룰로즈 막이 코팅된 슬라이드 상에 집적함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명의 한 양태로서, 탐침을 합성할 때 3' 위치에 아민기 (amino residue)를 가진 염기를 삽입하여 알데하이드 잔기로 코팅된 유리판에 공유결합 되도록 한다.
기판 표면에 각기 다른 탐침들을 고정, 배열하는 것은 핀 마이크로어레이, 잉크젯, 포토리소그래피, 전기적 어레이 등의 방법을 사용한다. 본 발명의 한 양태로는 탐침을 완충용액에 용해시킨 상태로 공지방법에 따라 제작된 마이크로어레이어(microarrayer)를 이용하여(Yoon et al, J. Microbiol . Biotechnol., 10:21, 2000) 집적한다. 마이크로어레이어의 원리는 미세하게 제작된 핀이 DNA를 플레이트로부터 담아서 기판으로 컴퓨터가 지정한 똑같은 장소에 옮기는 것이다. 마이크로어레이어에 의해 옮겨진 탐침의 고정을 위해 45% 내지 65% 정도, 바람직하게는 50% 내지 55% 정도의 습도가 유지되는 조건에서 탐침의 3' 위치의 아민기와 유리판에 코팅되어 있는 알데히드기 사이의 반응이 원활이 이루어지도록 하기 위해 1시간 이상 반응을 유도하고, 6시간 이상 방치하여 DNA 탐침을 고정시킨다.
생존 유기체로부터 유래된 세포 또는 유기체 자체를 검출하기 위해 필요한 경우 이들 세포를 화학적 및/또는 물리적 방법으로 부분적으로 또는 완전히 용해시켜 그들 세포의 RNA 및/또는 DNA에 접근이 용이하게 만들고 본 발명의 탐침과 접촉시킨다. 접촉은 액체 매질 또는 용액중에서 니트로셀룰로즈, 셀룰로즈 또는 나일론 필터와 같은 적절한 지지체상에서 수행할 수 있다. 이러한 접촉은 최적 조건, 하위 최적 조건 또는 제한 조건하에서 일으킬 수 있다, 이러한 조건은 온도, 반응물 농도, 핵산의 염기쌍 최적 온도를 낮추는 물질 (예, 포름아미드, 디메틸설폭사이드 및 우레아)의 존재 및 반응 부피를 저감시키고/시키거나 하이브리드 형성을 가속하는 물질 (예, 덱스트란 설페이트, 폴리에틸렌글리콜 또는 페놀)의 존재를 포함한다.
탐침 제작
핵산 탐침은 통상의 클로닝 방법(Maniatis, T., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982)을 이용하여 목적하는 서열을 클로닝하거나 시판되는 DNA 합성기를 이용하여 화학적으로 합성하여 다량으로 얻을 수 있다.
본 발명의 탐침은 통상적인 방법에 따라 일본쇄 또는 이본쇄로 제작할 수 있다. 일본쇄의 탐침을 얻는 방법으로서 가장 대표적인 예는 자동화학합성기에서 DMT (dimethoxytrityl) 오프 (off) 방식에 의해 합성하여 탈보호 반응을 시행한 후, 원하는 수의 염기로 이루어진 탐침을 합성하는 것이다. 이렇게 제작된 탐침은 합성시 한 쪽 가닥 말단에 FITC (fluorescein isothiocyanate)와 같은 형광물질을 부착하여 특정 핵산의 존재유무를 확인할 수 있다. 다른 방식으로는 일본쇄의 DNA를 주형 으로 하여 그와 상보적인 염기서열을 가지는 탐침을 만드는 방법으로, 주형의 DNA에 프라이머를 교잡시키고, 그 프라이머로부터 클레노우(Klenow) 효소와 형광물질이 부착된 염기(dNTP)를 사용하여 탐침을 합성하게 된다. 이는 DNA 내부에 형광물질이 부착하게 되므로, 높은 민감도 및 특이성을 갖는 탐침을 합성할 수 있다. 이중가닥의 탐침을 얻는 방법으로서, 게놈 DNA 혹은 플라스미드 DNA를 특정 제한효소로 절단하여 원하는 부분의 유전자 혹은 염기부분을 포함한 탐침을 얻을 수 있다. 랜덤 프라이밍(random priming) 방법은 6개의 랜덤 핵사머(random hexamer)와 주형 DNA를 혼성화시킨 후, 형광물질이 부착되어 있는 다양한 길이의 탐침을 합성하는 방법이고, 또 다른 방식으로는 DNA의 5'말단에 32P를 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(polynucleotide kinase)를 이용하여 옮겨서 형광물질이 부착된 탐침을 합성할 수도 있으며, DNA 분해효소(DNase) I을 이용하여 이본쇄의 DNA에 절단부분을 만든 후, 이 DNA를 주형으로 하여 DNA 중합효소 I과 형광물질이 부착된 염기(dNTP)를 사용하여 탐침을 합성할 수 있다. 이렇게 이중가닥으로 합성된 탐침은 변성(denaturation)과정을 거쳐 일본쇄로 만든 후 혼성화 반응에 사용된다.
본 발명의 탐침은 유리하게는 표지될 수 있다. 어떠한 통상의 표지도 사용할 수 있다. 탐침은 32P, 35S, 125I, 3H 및 14C와 같은 방사성 동위원소를 사용하여 표지할 수 있다. 방사성 표지는 3 또는 5 위치를 방사성 표지된 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 키나제, 말단 트랜스퍼라제 또는 리가제를 사용하여 말단 표지하는 것과 같은 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다. 방사성 표지의 다른 방법은 본 발명의 탐침을 화학적으로 요도드화하는 것이며 이러한 요오드화에 의해 탐침상에 수개의 125I 원자가 결합하게 된다. 이와 같이 본 발명의 탐침중 하나가 방사성으로 표지되면 일반적으로 자가방사기록, 액체 신틸레이션, 감마 계수 또는 다른 통상의 방법을 사용하여 방사선을 검출한다. 또한, 본 발명의 탐침은 면역 특성을 갖는 잔기(예, 항원 또는 합텐), 일부 시약에 대해 특이적 친화성을 갖는 잔기(예, 리간드), 검출가능한 효소 반응을 제공한 잔기(예, 효소, 보조효소, 효소 기질 또는 효소 반응에 참여하는 기질) 또는 어떤 파장에서 형광, 발광 또는 흡광의 물리적 특성을 제공하는 잔기과 결합하여 비방사성 표지될 수 있다. 또한, 탐침과 표적에 의해 형성된 하이브리드를 특이적으로 검출하는 항체를 사용할 수 있다. 비방사성 표지는 본 발명의 탐침을 화학적으로 합성할 때 제공할 수 있다. 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘 및 우라실 잔기는 다른 화학 잔기와 쉽게 결합하며 이에 탐침 또는 탐침과 상보적인 DNA 또는 RNA 단편사이에 형성된 하이브리드의 검출을 가능케 한다.
표적
생물학적 시료에서 세균을 검출하고 동정하는데 사용하기 위한 핵산 기질을 제공하기 위해 시료로부터 핵산을 추출한다. 핵산은 표준 기술 또는 시판되고 있는 키트를 사용하여 다양한 시료로부터 추출할 수 있다. 예를 들면, 조직 시료로부터 RNA 또는 DNA를 분리하는데 사용하는 키트는 Qiagen, Inc. (미국 캘리포니아) 및 Stratagene (미국 캘리포니아)에서 구입할 수 있다. QIAAMP 블러드 키트는 혈액뿐 만 아니라 골수, 체액 또는 세포 현탁액으로부터 DNA의 분리를 가능케 한다. QIAAMP 조직 키트는 근육 및 기관으로부터 DNA의 분리를 가능케 한다. 생물학적 시료가 목적하는 균주의 존재를 지시하는 rRNA 또는 rDNA를 함유하는 지의 여부를 결정하는 바람직한 방법으로 핵산을 균주세포로부터 음파 분쇄, 예를 들면 Murphy 등의 미국특허 제5,374,522호에 기술된 방법에 따라 방출시킬 수 있다. 세포를 분쇄하는 다른 공지 방법으로는 효소 사용, 삼투압 쇼크, 화학 처리 및 유리 비드와의 와동이 포함된다. 균주로부터 핵산을 방출시킬 수 있는 다른 적합한 방법이 Clark 등의 미국특허 제5,837,452호 및 Kacian 등의 미국특허 제5,364,763호에 기술되어 있다. rRNA의 방출 후 또는 방출과 동시에 표지된 탐침을 혼성화 촉진제의 존재하에 첨가하고 최적의 혼성화 온도에서 유의적인 혼성화 반응에 도달하는데 필요한 시간 동안 배양할 수 있다.
표적 핵산이 이본쇄인 경우에는 검출 과정을 이행하기 이전에 변성을 실시하는 것이 바람직하다. 이본쇄 핵산의 변성은 화학적, 물리적 또는 효소적 변성의 공지 방법, 특히 적절한 온도, 80℃ 이상의 온도로 가열함으로써 수행할 수 있다.
또한, 탐침과 혼성화 반응을 하는 표적 DNA는 보통 두 종류의 방법으로 준비될 수 있다. 첫째는, 서던 블럿 또는 노던 블럿시 사용되는 방법으로, 게놈 DNA 혹은 플라스미드 DNA를 적당한 제한효소로 자른 후 아가로스 겔(agarose gel) 상에서 전기영동을 하여 크기별로 DNA 조각을 분리하여 사용한다. 둘째는, PCR 방법을 이용하여 원하는 부분의 DNA를 증폭시켜 사용하는 방법이다. 이때, 사용하는 PCR 방법을 살펴보면, 전방향과 역방향의 프라이머 쌍을 동일한 양을 사용해서 증폭시키 는 가장 보편화되어 있는 PCR과 전방향과 역방향의 프라이머 쌍을 비대칭적으로 첨가시켜서 2중 가닥과 단일 가닥의 밴드를 동시에 얻을 수 있는 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR), 여러 가지의 프라이머 쌍을 넣어서 한꺼번에 증폭시킬 수 있는 다중 증폭 방법(Multiplex PCR), 특이적인 4개의 프라이머와 리가아제(Ligase)를 이용해 증폭한 후 효소면역법으로 형광량을 판정하는 리가아제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction; LCR)방법, 이 밖에도 핫스타트 PCR, 네스트 PCR, 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머 PCR, 역전사 효소 PCR, 반-정량적(Semi-quantitative) 역전사 효소 PCR, 실시간 PCR(Real time PCR), SACE(Rapid Amplification of cDNA Ends), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 연쇄반복(short tandem repeats; STR), 단일가닥입체다형화(Single Strand Conformation Polymorphism; SSCP), 동소 PCR, DDRT-PCR(Differential Display Reverse Transcriptase PCR) 등의 방법 등이 있다.
특정 PCR 산물의 증폭을 위한 주형으로서 비교적 균질한 시료(예, 혈액, 세균 콜로니 또는 뇌척수액)가 보다 복합적인 시료(예, 뇨, 타액 또는 배설물)보다 더 적합한 것으로 알려져 있다(Shibata in PCR:The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., Birkhauser, Boston (1994), pp, 47-54). 뇌척수액과 같이 증폭하고자 하는 표적 핵산의 복제물이 비교적 적게 함유된 시료는 PCR에 직접 첨가할 수 있다. 혈액 시료는 적혈구의 억제 특성으로 인해 PCR시 특별히 다루어야 하는데 PCR에 혈액을 사용하기 전에 적혈구 세포를 제거해야 한다. 이 목적을 위해 많은 방법이 이용되고 있으며, 예를 들면 CHELEX 100 컬럼(BioRad) 등을 통과시키는 것과 QIAAMP 블러드 키트를 사용하는 것들이 포함된다. 타액으로부터 핵산을 추 출하는 것은 목적하는 균외의 다른 세균 종을 사멸시키거나 성장을 억제하는 사전 정화 과정이 필요하다. 이러한 정화 과정은 시료를 N-아세틸-L-시스테인 및 NaOH로 처리함으로써 달성된다. 이러한 정화과정은 타액 시료를 분석하기 전에 배양할 때만이 필요하다.
본 발명의 바람직한 양태는 분리된 검체의 DNA를 주형으로 하고 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)을 수행하여 단편 유전자를 제작한다. 단편 유전자는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 첨가비율을 1:5로 차별화 함으로써 한번의 중합효소연쇄반응으로 획득한다. 이때 사용한 프라이머는 세균의 경우 공통적으로 16S rRNA내지 23S rRNA에 존재하는 염기 서열 부분으로(Pirkko K. et al., Clin. Micorbiol., 36:2205, 1999) 다음과 같다:
프라이머 1-S(센스): P-TTGTACACACCGCCCGTC(1585Fw: 서열번호 9)
프라이머 1-A(안티센스): Cy3-TTTCGCCTTTCCCTCACGGTACT(23BR: 서열번호 10)
프라이머 2-S(센스): P-AGTACCGTGAGGGAAAGGCGAA(23BFw: 서열번호 11)
프라이머 2-A(안티센스): Cy3-TGCTTCTAAGCCAACATCCT(MS37R:서열번호 12)
프라이머 3-S(센스): P-AGGATGTTGGCTTAGAAGCA(MS37F: 서열번호 13)
프라이머 3-A(안티센스): Cy3-CCCGACAAGGAATTTCGCTACCTT(MS38R:서열번호 14)
이들 프라이머에 대한 대략 위치도는 도 1과 같고 F는 5' 말단에 부착된 FITC 형광물질을 가리킨다. PCR 수행시 탐침과 결합한 DNA를 확인하기 위해 5-FITC가 부착된 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 형광을 통해 결합을 확인함으로써 감 염 여부와 감염균의 종류를 알 수 있도록 한다. 또한, 이들 프라이머로 증폭할 수 없는 부분을 얻기 위해 바이오인포메틱스 (Bioinformatics) 방법으로 다중정렬, BLAST를 실시하여 프라이머를 디자인한다.
본 발명의 바람직한 양태로서 PCR 반응은 10X PCR 완충액(100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl2) 5ul, dNTP 혼합물(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 각각 2.5mM) 4ul, 10pmole 전방향 프라이머 0.5ul, 10pmole 역방항 프라이머 2.5ul, 1/10로 희석한 주형DNA(100ng) 1ul, Taq 폴리머라제(5unit/ul, Takara Shuzo Co., Shiga, Japan) 0.5ul를 첨가후 총 부피가 50ul가 되도록 물을 첨가한다. 첫 번째 변성은 94℃에서 7분간, 두 번째 변성은 94℃에서 1분간 수행한다. 교잡(annealing)은 52℃에서 1분, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하며, 이를 10회 반복한다. 그 후, 다시 세 번째 변성은 94℃에서 1분, 교잡은 54℃에서 1분, 연장은 72℃ 에서 1분간 수행하며, 이를 30회 반복한다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행한다. PCR 반응결과로 생성된 산물은 아가로스 겔 전기영동법(agarose gel electrophoresis)으로 확인한다.
혼성화 및 세척
혼성화 기술은 본 발명에서 특정적인 것이 아니다. 이 기술은 일반적으로 문헌(Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Ed. Hames, B. D. and Higgins, S. J., IRL Press, 1987; Gall and Pardue, Proc . Natl . Acad . Sci ., U.S.A., 63:378, 1969, John, Burnsteil and Jones, Nature, 223:582, 1969)에 기술되어 있다.
혼성화 조건은 긴축(stringency), 즉 작용 조건의 엄격함에 의해 결정된다. 혼성화가 이루어지는 긴축이 고도하면 할수록 혼성화는 더욱 특이적이 된다. 긴축은 특히 탐침/표적 결합체의 염기 조성뿐만 아니라 두 핵산사이의 부정합 정도의 함수이다. 긴축은 또한 혼성화 용액에 존재하는 이온의 농도 및 종류, 변성제의 성질 및 농도 및/또는 혼성화 온도와 같은 혼성화 반응 변수의 함수일 수 있다. 혼성화 반응이 수행되어야 하는 조건의 기축은 특히 사용된 탐침에 의존한다. 모든 이들 데이터는 잘 알려져 있으며 적절한 조건은 개개의 경우에 통상의 실험에 의해 결정할 수 있다. 일반적으로, 사용된 탐침의 길이에 따라 혼성화 반응의 온도는 약 0.8 내지 1 M 농도의 염수 용액중에서 약 20℃ 내지 65℃, 특히 35℃ 내지 65℃이다.
표지된 올리고뉴클레오타이드 탐침과 표적 핵산사이의 혼성화는 Hogan 등의 미국특허 제5,030,557호에 기술된 절차에 따라 비표지된 헬퍼올리고뉴클레오타이드를 사용하여 증가시킬 수 있다. 헬퍼올리고뉴클레오타이드는 탐침에 의해 결합되는 영역외의 다른 표적 핵산의 영역과 결합한다. 이 결합은 일본쇄 핵산의 표적 영역에 새로운 이차 및 삼차 구조를 취해서 탐침의 결합 속도를 가속화한다.
당업자는 탐침과 표적사이에 형성된 하이브리드의 열 안정성에 영향을 미치는 인자들 또한 탐침 특이성에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 탐침과 표적의 하이브리드의 융점 온도를 포함하여 융점 프로필이 각각의 탐침과 표 적의 하이브리드에 대해 경험적으로 결정되어야 한다. 이러한 결정은 Arnold 등의 미국특허 제5,283,174호에 기술된 방법에 따라 수행할 수 있다. 탐침과 표적의 하이브리드의 융점 온도를 결정하는 한 가지 방법은 혼성화 보호 검정을 수행하는 것으로 포함한다. 이 검정 방법에 따르면 리튬 라우릴설페이트를 함유한 리튬 석시네이트 완충 용액중의 과량의 표적의 조건하에서 탐침과 표적의 하이브리드를 형성한다. 미리 형성된 하이브리드의 일부를 혼성화 완충액에 희석하고 예상되는 융점 온도 (전형적으로 55℃) 이하에서 시작하여 2 내지 5℃를 증가시킨 여러 온도에서 5분 동안 배양한다. 그런 후 이 용액을 약알카리성 보레이트 완충액으로 희석하고 보다 낮은 온도 (예, 50℃)에서 10분동안 배양한다. 일본쇄 탐침에 연결된 아크리디늄 에스테르는 이들 조건하에서 가수분해되는 한편 혼성화된 탐침에 연결된 아크리디늄 에스테르는 상대적으로 보호된다. 이 절차를 혼성화 보호 검정이라고 한다. 남아 있는 화학발광의 양은 하이브리드의 양과 비례하며 과산화수소에 이어 알카리를 차례로 첨가하여 발광계측기로 측정한다. 이 데이터를 온도에 대한 최대 시그날 (보통 최저 온도)의 퍼센트로 점적한다. 융점 온도는 최대 시그날의 50%가 남아 있는 포인트로서 정의된다. 다른 방도로서, 탐침과 표적의 하이브리드에 대한 융점 온도는 방사성 동위원소로 표지된 탐침을 이용하여 결정할 수 있다. 모든 경우에 있어서, 주어진 하이브리드에 대한 융점 온도는 혼성화 용액에 함유된 염, 세정제 및 기타 용질의 농도에 의해 다양할 수 있다. 이들 모든 인자는 열변성 동안에 상대적인 하이브리드 안정성에 영향을 미친다(Molecular Cloning: A Laboratory Manual Sambrook et al., eds. Cold Spring Harbor Lab Publ., 9.51,1989).
혼성화 조건은 몇 가지의 변수, 예를 들면 혼성화 온도, 매질 성분의 성질 및 농도, 형성된 하이브리드와 세척시 온도 등을 고려하여 모니터링할 수 있다. 혼성화 및 세척 온도는 탐침의 염기 서열, 종류 및 길이에 따라 상위 값으로 한정하며 최대 혼성화 또는 세척 온도는 약 30℃ 내지 60℃ 이다. 보다 높은 온도에서 혼성화와 탐침과 표적사이에 형성된 하이브리드의 해리 또는 변성과 경쟁한다. 혼성화 매질은 예를 들면 약 3xSSC (1xSSC=0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0), 약 25 mM 인산염 완충액 PH 7.1 및 20% 탈이온 포름아미드, 0.02% 피콜, 0.02% 소혈청 알부민, 0.02% 폴리비닐피롤리돈 및 약 0.1 mg/ml 절삭되고 변성된 연어 정자 DNA를 함유한다. 세척 매질은 예를 들면 약 3xSSC, 25 mM 인산염 완충액 pH 7.1 및 20% 탈이온 포름아미드를 함유한다. 탐침 및 매질의 변형에 따라, 목적하는 특이성을 얻기 위해 혼성화 또는 세척 온도는 알려진 연관성에 따라 바꾸어 주어야 한다(B. D. HAMES and S. J. HIGGINS, (eds.). Nucleic acid hybridzation. A practical approach, IRL Press, Oxford, U.K., 1985). 이러한 관점에서, 일반적으로 DNA:DNA 하이브리드는 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드보다 덜 안정하기 때문에, 검출될 하이브리드의 성질에 따라 혼성화 조건은 특이적 검출을 달성하기 위해 적절히 조정되어야 한다.
본 발명의 바람직한 특정 양태로서, 혼성화 완충용액(6×SSPE (0.15M NaCl, 5mM C6H5Na3O7, pH 7.0), 20% (v/v) 포름아미드)을 PCR 증폭 유전자와 혼합하고 탐침이 고정된 유리판 위에 분주한 후 30℃에서 6시간 동안 반응시켜 상보적인 결합을 유도한다. 시간이 경과한 후 3×SPE, 2×SSPE, 1×SSPE 순으로 각각 5분씩 세척한다.
하이브리드의 정량은 통상적인 방법에 따라 표적을 상기된 탐침에서와 같이 형광 혹은 방사성 동위원소로 표지하여 이루어 질 수 있다. 표지는 프라이머 자체에 할 수도 있고 증폭 및 전사시에 형광 및 방사성 동위원소가 표지된 염기 잔기를 사용함으로써 이루어질 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 스타필로코코스 아우레우스를 동정하기 위한 DNA 탐침 후보군의 선별
스타필로코코스 아우레우스을 검출 및 동정하기 위해서 스타필로코코스 아우레우스에 특이적인 탐침을 제작하였다. 특이 탐침의 제작을 위해서는 스타필로코코스 아우레우스에만 특이성을 가지는 특이 탐침 후보군을 선정하였다. 특이 탐침 후보군은 GenBank에 공지된 스타필로코코스 아우레우스의 23S rRNA 염기 서열을 지금까지 밝혀진 세균들의 염기서열과 다중정렬하여 비교하고, 스타필로코코스 아우레우스에만 존재하는 특이적인 염기서열을 구분하여 그 내부에 존재하는 탐침 후보군을 제작하였다. 탐침 후보군은 스타필롤코코스 아우레우스 게놈의 23S rRNA 유전자 에서 결정하였다. 탐침 후보군의 특이성 여부는 BLAST 검색을 통해 균별간 유사성을 비교하여 확인하였다. 그 결과, 선별된 탐침 후보군은 하기 표 1에 기재하였다.
스타필로코코스 아우레우스 특이 탐침 후보군
탐침번호 염기서열 명칭 서열번호
1 AGGACGACATTAGAC Sau001 서열번호 1
2 CAAAGGACGACATTAGACGA Sau001-20 서열번호 2
3 CGAAGCGTGCGATTG Sau003 서열번호 3
4 AGGCGAAGCGTGCGATTGGA Sau003-20 서열번호 4
5 TGGATTGCACGTCTAAGCAG Sau004-20 서열번호 5
6 CAAATCCGGTACTCGTTAAG Sau005-20 서열번호 6
7 GAGTCTTCGAGTCGTTGATT Sau03-20 서열번호 7
8 TCTTCGAGTCGTTGA Sau3 서열번호 8
실시예 2: 핵산 탐침의 합성
DNA 칩에 적용하기 위해 상기 실시예 1에서 선별된 각 탐침 후보군을 합성하였다. 모노뉴클레오타이드(Proligo Biochemie GmbH Hamburg Co.)를 자동화 합성기(ExpediteTM 8900, PE Biosystems Co.)에 투입하고 목적하는 탐침의 염기서열과 0.05 μmole 합성 스케일을 입력하여 순수한 핵산 탐침을 수득하였다. 수득된 탐침은 전기영동을 통하여 합성 여부를 확인하였다.
실시예 3: DNA 칩의 제작
실시예 2에서 합성된 DNA 탐침을 고정화하기 위해서는 알데히드기-아민기 사이의 결합을 이용하였다. DNA 탐침을 고정화하기 위해 모든 DNA 단편 탐침을 합성할 때, 3'-첫번째 위치에 아미노링커컬럼(Aminolinker column, Cruachem, Glasgrow, Scotland)을 이용하여 아민기(amino residue)를 가진 염기를 삽입하였고, 유리판 (slide glass)은 알데히드기(aldehyde residue)로 코팅되어 있는 것을 구입(CEL Associates, Inc. Huston, Texas, USA)하였다.
탐침을 고정시킬 때에는 3×SSC (0.45 M NaCl, 15 mM C6H5Na3O7, pH 7.0) 완충 용액에 탐침을 용해시킨 상태로 마이크로어레이어(MicroGrid spotter, Biorobotics Inc, England)를 이용하여 스폿팅한 후, 55% 정도의 습도가 유지되는 조건에서 1시간 이상 화학 반응을 유도하고 6시간 이상 방치함으로써 DNA 탐침을 고정화하였다. 균 검색용 탐침은 100 pmole/ul의 농도로 전체 탐침을 250 내지 275 ㎛ 간격을 두고 순서대로 집적화시켜 탐침이 고정된 DNA 칩을 제작하였다.
탐침의 아민기와 유리판 위의 알데히드 사이의 반응이 원활히 이루어져 고정화가 잘 이루어졌는지 확인하기 위해 사이브로 그린 II (SYBRO green II, Molecular Probe, Inc., Leiden, Netherlands)로 염색하여 확인하였다.
실시예 4: 표적 시료의 분리 및 증폭
하기의 59종의 표준균주로부터 게놈 DNA를 별도로 추출하였다.
표준 균주 59종의 입수처
균주명 그람 입수처 균주명 그람 입수처
나이세리아 고노헤아 - ATCC10150 아시네토박터 바우마니 - KCTC2771
나이세리아 메닌자이티디스 - ATCC13100 아이케넬라 코로덴스 - ATCC51724
레지오넬라 뉴모필라 - 임상분리 액티노마이세스 이스라엘이 - ATCC12102
리스테리아 모노사이토제네스 + ATCC700603 언에어로비오스피리룸 숙시니시프로더센스 - ATCC29305
모르가넬라 모르가니 - ATCC25830 에로모나스 하이드로필라 - KCCM32586
박테로이데스 불가투스 - KCCM11423 KCCM8482 에스케리치아 콜라이 - ATCC25922
박테로이데스 오바투스 - ATCC8483 엔테로박터 에어로게네스 - KCCM11783 ATCC29751
박테로이데스 테타이오타오미크론 - ACTC5015 엔테로박터 클로아케 - KCCM40044
박테로이데스 프라질리스 - ATCC25282 엔테로코커스 피칼리스 + ATCC19433
벌코데리아 세파시아 - ATCC25416 엔테로코코스 페슘 + ATCC19434
브란하멜라 카타르할리스 - KCCM4006 ATCC43617 오크로박트룸 안트로피 - ATCC49188
비브리오 벌른피커스 - KCTC2962 카디오박테리움 호미니스 - ATCC14900
비브리오 콜레라 - KCTC2715 코리네박테리움 디프테리애 + ATCC51696
살모넬라 엔테리티디스 - KCCM12021 코마모나스 아시도보란스 - ATCC9355
살모넬라 티피무리움 - ooooooooo 크레브시엘라 뉴모니에 - AATCC700603
세라티아 마르세센스 - KCTC1299 크레브시엘라 옥시토카 - ATCC43863
수테렐라 와즈워텐시스 - ATCC51579 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 - ATCC13253
쉬젤라 소네이 - KCCM11903 클로스트리디움 디프실 + ATCC9689
쉬젤라 플렉시너리 - ATCC11836 클로스리디움 람모섬 + ATCC25582
슈도모나스 애루지노사 - KCTC1636 킨젤라 킨갭 - ATCC23330
스타필로코코스 아우레우스 + KCTC1621 펩토스트렙토코커스 마그누스 + ATCC29328
스타필로코코스 에피더미디스 + KCTC1917 펩토스트렙토코커스 언애어로비우스 + ATCC27337
스토마토코커스 뮤실라지노서스 + ATCC17931 펩토스트렙토코코스 프레보티 + KCTC3319
스트렌트로포모나스 말토필라 - ATCC13637 포피로모나스 진지발리스 + ATCC33277
스트렙토코커스 뮤탄스 + KCCM11823 ATCC25175 푸소박테리움 네크로포룸 - ATCC25286
스트렙토코커스 비리단스 + ATCC35037 프로테우스 미라빌리스 - KCCM11381
스트렙토코커스 아갈락티애 + 000000000 프로테우스 불가리스 - KCCM11539
스트렙토코커스 피오젠 + KCCM11817 헤모필루스 아프로필라스 - ATCC13252
스트렙토코커스 뉴모니에 + KCCM40410 헤모필루스 인플루엔자 - ATCC51907
시트로박터 프레운디 - ATCC51579
먼저, 적정배지에서 배양한 균을 200㎕ 멸균된 증류수에 현탁하여 14,000 rpm에서 10분간 원심분리한 뒤 상층액을 버리고 균체만 수득하였다.
그람 음성균의 경우, 상기 균체를 ATL용액(Tissue Lysis용액, DNeasy Tissue Kit, QIAGEN) 180㎕에 부유시키고, Proteinase K 20㎕를 넣어 용균한 후, 55℃에서 1시간 반응시킨 후, AL용액 (Lysis용액, DNeasy Tissue Kit, QIAGEN) 200㎕를 넣고 70℃에서 10분간 반응시켜, 용균액으로 사용하였다. 상기 용균액에 에탄올(100%) 200㎕을 넣고 섞은 후 DNeasy 미니 컬럼이 들어 있는 2mL 튜브에 전 용액을 옮겨 8,000rpm이상에서 1분간 원심분리하여 하부의 튜브에 모이는 액을 제거하였다. 다시 상부 튜브에 AW1용액(Wash용액1, DNeasy Tissue Kit, Qiagen) 500㎕를 넣고 8,000rpm 이상에서 1분간 원심분리하여 유출물을 제거하고, 다시 AW2용액(Wash용액2, DNeasy Tissue Kit, QIAGEN) 500㎕를 넣어 15,000rpm에서 3분간 원심분리하여 DNeasy 막을 말리고, 유출물을 제거하였다. 상기 DNeasy 컬럼에 용출용액을 넣어 실온에서 15분간 정치한 후 8,000rpm이상에서 1분간 원심분리하여 게놈 DNA를 용출하였다.
그람 양성균의 경우, 상기 균체를 리소자임 용균 용액(20mm Tris-Cl, pH8.0, 2mM EDTA, 1.2% TritonX-100, 20mg/ml lysozyme) 180㎕에 현탁한 후 37℃에서 30분 이상 반응시킨 후, Proteinase K 25㎕와 AL용액(용균용액, DNeasy Tissue Kit, QIAGEN) 200㎕을 넣어 잘 섞은 뒤 70℃에서 30분간 반응시켜 용균액으로 사용하고, 이후 게놈 분리는 상기와 같은 방법으로 수행하였다.
상기와 같이 분리된 표준균주들의 DNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행시 탐침과 결합한 DNA를 확인하기 위해 5' 말단에 Cy3가 부착된 역방향 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 형광을 통해 결합을 확인하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머는 하기의 3개 쌍의 프라이머가 동시에 사용되었다.
프라이머 1-S(센스): P-TTGTACACACCGCCCGTC(1585Fw: 서열번호 9)
프라이머 1-A(안티센스): Cy3-TTTCGCCTTTCCCTCACGGTACT(23BR: 서열번호 10)
프라이머 2-S(센스): P-AGTACCGTGAGGGAAAGGCGAA(23BFw: 서열번호 11)
프라이머 2-A(안티센스): Cy3-TGCTTCTAAGCCAACATCCT(MS37R:서열번호 12)
프라이머 3-S(센스): P-AGGATGTTGGCTTAGAAGCA(MS37F: 서열번호 13)
프라이머 3-A(안티센스): Cy3-CCCGACAAGGAATTTCGCTACCTT(MS38R:서열번호 14)
상기 서열의 5' 말단에 표시된 P는 인산기(phosphate)를 나타내고, Cy3는 Cy3 형광물질을 나타낸다.
PCR 반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 10×PCR 완충액(100mM Tris-HCl(pH 8.3), 500mM KCl, 15mM MgCl2) 5μl,　dNTP 혼합물(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 각각 10mM) 1μl, 10pmole 전방향 프라이머 1μl, 10pmole 역방향 프라이머 1μl, 1/10로 희석한 주형 DNA(100ng) 1μl, Taq 폴리머라제(5unit/μl, Solgent Co., Korea) 0.2μl를 첨가한 후 총 부피가 50μl가 되도록 증류수를 첨가하였다.
94℃에서 5분간 첫번째 변성을 수행한 후, 변성 94℃에서 50초, 교잡(annealing) 56℃에서 50초, 연장(extension) 72℃에서 1분 10초를 한 사이클로 하여 10회 반복한 후, 변성 94℃에서 50초, 교잡 58℃에서 50초, 연장 72℃에서 1분 10초를 한 사이클로 하여 20회 반복한 후, 마지막으로, 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. PCR 반응결과로 생성된 산물은 아가로스 겔 전기영동법(agarose gel electrophoresis)으로 각 균주들에 대해 DNA 이중 가닥이 합성되었음을 확인하였다. PCR을 통해 얻어진 DNA는 PCR 정제키트(QIAGEN Co.)를 이용하여 정제한 후, 람다엑소뉴클레아제(New England Biolabs Inc., Netherlands)를 1μl 첨가하여 37℃에서 1 시간 반응시킨 후, 단일가닥 DNA를 얻었다. 람다엑소뉴클레아제는 5' 말단에 인산기가 붙어있는 DNA 가닥을 선택적으로 절단시켜 분해하는 효소이다. 그러므로, 5' 말단에 인산기를 붙여 합성한 전방향 프라이머를 가지고 PCR을 수행하게 되면 PCR 산물의 DNA가닥에 인산기가 붙게 된다. 여기에, 람다엑소뉴클레아제를 처리하게 되면 증폭된 DNA 이중가닥 중 5' 말단에 인산기가 붙어있는 가닥은 분해되기 때문에 결국에는 5' 말단에 Cy3 형광물질이 붙어 있는 단일가닥만이 남아있게 된다.
실시예 5: 혼성화 및 세척
탐침 후보군의 특이성과 민감도를 확인하기 위하여 실시예 4에서 증폭한 PCR 생성물을 실시예 3에서 제작한 핵산 탐침이 고정된 DNA 칩에 적용하여 혼성화 반응을 실시하였다. 상기 핵산 탐침이 고정된 DNA 칩을 스타필로코코스 아우레우스 표준균주로부터 분리한 게놈 유전자의 PCR 산물과 혼성화시킨 후 시그널이 나타나는 경우 나머지 종에 대해서 교차반응(특이성) 여부를 시험하였다.
유리판에 핵산 탐침이 고정된 DNA 칩에 수증기를 씌워 가수화시킨 후, 70% 에탄올에 담금질함으로써 유리판에 고정되지 않은 탐침을 제거시켰다.　이후에, 혼성화 과정 중에 형광물질이 유리판 표면에 남아있는 알데하이드 잔기에 부착되어 전체적인 시그널을 높여 특이적인 탐침의 시그널 효과를 저해시키는 것을 방지하기 위해서 유리판을 차단용액(blocking solution)(1.3g NaBH4, 375ml PBS, 125ml 100% 에탄올)에 담근 후 교반기에서 5분간 반응시켰다. 0.2% SDS로 5분간 세척 후, 멸균수로 1분간 5번 세척해준 후, 원심분리기를 이용하여 유리판에 있는 물기를 제거하였다(1,500rpm, 3분간).
혼성화시킬 용액은 혼성화완충용액(hybridization buffer: 6×SSPE; 20X SSPE; 3M NaCl, 0.2M NaH2PO4·H2O, 0.02M EDTA, pH 7.4, 20% (v/v) 포름아미드; Sigma Co., St. Louis)에 실시예 4에서 증폭시킨 DNA 단편을 50㎕ 넣어서 총 부피가 200㎕가 되도록 제조하였다. 제조된 용액을 탐침이 고정화되어 있는 유리판 위에 분주한 후 프로브-클립 프레스-씰 배양실(probe-clip press-seal incubation chamber, Sigma Co., St. Louis, MO.)로 덮었다.
혼성화되는 동안 유리판 주변이 건조되는 것을 방지하기 위해서 혼성화 챔버에 물기가 있는 휴지를 넣은 후, 30℃ 항온 배양기(static incubator)에서 8시간 이상 반응시켜 상보적인 결합을 유도하였다. 시간이 경과한 후 3× SSPE (0.45M NaCl, 15mM C6H5Na3O7, pH 7.0), 1×SSPE (0.15M NaCl, 5mM C6H5Na3O7, pH 7.0) 순으로 각각 5분씩 세척한 후, 원심분리기를 이용하여 유리판에 있는 물기를 제거하였다(1,500rpm, 3분간).
실시예 6: 하이브리드의 검출
혼성화 반응의 결과는 어레이웍스 마이크로 어레이 스캐너(ArrayWorks, Applied Precision, Inc., USA)를 이용하여 검색하였고, 그 결과는 하기 표 3 에 나타나 있다.
명 칭 염기서열 서열번호 위치 특 이 성
Sau001 AGGACGACATTAGAC 1 23S 표 2의 균주로부터 유래된 어떠한 표적 DNA와도 교차반응 일어나지 않음.
Sau001-20 CAAAGGACGACATTAGACGA 2 23S 표 2의 균주로부터 유래된 어떠한 표적 DNA와도 교차반응 일어나지 않음.
Sau003 CGAAGCGTGCGATTG 3 23S 표 2의 균주 중 C. ramosum, E. coli, S. enterica, S. aureus, S. maltophila, S. sonnei, S. typhi 를 제외한 52종에서 교차반응 일어나지 않음.
Sau003-20 AGGCGAAGCGTGCGATTGGA 4 23S 표 2의 균주 중 A. hydrophila, A.succiniproducens, B. cepacia, B. fragilis, B. vulgaris, C. difficile, C. freundii, C. hominis, C. meningitidis, C. ramosum, E. aerogenes, E. cloacea, E. coli, E. facalis, E. faecium, H. actinomyceticomitans, H. aprophilus, H. paraphilus, K. kingae, K. oxytoca, L monocytogenes, M. morganii, N. gonorrhea, O. anthropi, P. aeruginosa, P. gingivalis, P. mirabilis, P. vulgaris, Rothia, S. agalactiae, S. enterica, S. epidermidis, S. flexneri, S. marcescens, S. maltohila, S. mutans, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. sonnei, S. typhi, S. typhimurium, S. viridans, S. wadsworthi, V. cholera 를 제외한 15종에서 교차반응 일어나지 않음.
Sau004-20 TGGATTGCACGTCTAAGCAG 5 23S 표 2의 균주로부터 유래된 어떠한 표적 DNA와도 교차반응 일어나지 않음.
Sau005-20 CAAATCCGGTACTCGTTAAG 6 23S 표 2의 균주로부터 유래된 어떠한 표적 DNA와도 교차반응 일어나지 않음.
Sau03-20 GAGTCTTCGAGTCGTTGATT 7 23S 표 2의 균주로부터 유래된 어떠한 표적 DNA와도 교차반응 일어나지 않음.
Sau3 TCTTCGAGTCGTTGA 8 23S 표 2의 균주로부터 유래된 어떠한 표적 DNA와도 교차반응 일어나지 않음.
실시예 7: 블라인드 시험
실시예 3에서 제작된 DNA 칩을 이용하여 스타필로코코스 아우레우스에 대한 블라인드 시험을 실시하였다. 도 1의 A 및 도 2의 A는 블라인드 시험을 위한 DNA 칩의 디자인을 도시한 것이다. 이들 도면에 기재된 명칭은 상기 표 1 에 수록된 탐침이 유리판에 고정되어 있는 위치를 가리킨다. 포지션 마커로서 아민 3`-AAAAAAAAAAAAAAA-5'-FITC를 사용하였으며, M으로 표기하였으며, 음성 대조군으로서 탐침을 녹인 버퍼(3X SSC)를 사용하였고, 빈칸으로 표시하였다.
본 실시예에 사용된 검체는 64 명의 병원성 감염 환자의 특정 부위로부터 채취된 것을 하루동안 배양후 얻은 샘플이며, 균의 감염여부는 배양방법에 의해 확인하였다.
배양된 검체로부터 게놈 DNA를 다음과 같이 추출하였다. 검체가 체액인 경우, 10ml의 체액을 EDTA 튜브 혹은 플레인 튜브(plain tube)에 수집하였다. 검체의 양이 10ml 이상이면 5,000×g에서 15분간 원심분리하고 10ml 이하이면 14,000rpm에서 15분간 원심분리한 뒤 침전물을 1.5ml 튜브에 모았다. 상기 침전물을 리소자임 완충액(20mM Tris-Cl, pH 8.0, 2mM EDTA, 1.2% Triton X-100, 20㎎/㎖ lysozyme) 180㎕에 현탁하여, 37℃에서 30분간 배양한 후 프로테이나제 K 20㎕와 AL용액 (Lysis용액, QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 200㎕를 넣어 부드럽게 섞은 후 55℃에서 2시간 반응시키고, 다시 95℃에서 10분간 반응시켰다. 100% 에탄올 200㎕를 넣고 섞은 후 QIAamp 스핀 컬럼이 들어 있는 2㎖ 튜브에 전 용액을 옮겨 8,000rpm에서 1분간 원심분리하여 튜브에 모이는 액을 제거하였다. 상기 스핀 칼럼에 AW1용액(Wash용액1, QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 500㎕를 넣고 8,000rpm에서 1분간 원심분리하여 유출물을 버리고 다시 AW2용액(Wash용액2, QIAamp DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 500㎕를 넣어 14,000rpm에서 1분간 원심분리하여 유출물을 버렸다. QIAamp 스핀 컬럼을 1.5㎖의 새 튜브에 옮기고 AE용액(Elution용액, DNA Blood Mini Kit, QIAGEN) 300㎕을 넣어 실온에서 15분간 정치한 후 8,000rpm에서 3분간 원심분리하여 게놈 DNA를 용출하였다. 상기 용출액에 100% 에탄올 750㎕를 넣어 -20℃에서 1시간 정치한 후 14,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등물인 에탄올을 버리고 건조시킨 뒤 DNA 펠렛은 20㎕ 멸균된 증류수에 녹여 농축시켰다.
검체가 혈액인 경우, 10ml 혈액을 EDTA 튜브에 샘플링하였다. 4℃, 1,800rpm에서 10분간 원심분리하여 혈장 층을 1.5㎖ 튜브에 나누어 담고, 14,000rpm에서 10분간 원심분리한 뒤 침전물을 1.5㎖ 튜브에 나누어 담은 후, 상기와 같은 방법으로 게놈 DNA를 농축하였다.
증폭, 혼성화 반응, 세척 및 하이브리드의 검출은 상기 실시예 4 및 실시예 5에 기재된 방법과 동일하게 실시하였다. 그 결과는 하기 표 4에 기재하였으며, 분모는 검체의 적용 횟수이고 분자는 혼성화에 의한 시그널이 나타난 횟수를 가리킨다.
혈액 뇌척수액 농즙 가래 소변
스타필로코코스 아우레우스 20/22 4/4 24/24 13/13 1/1
도 1의 B 및 도 2의 B는 스타필로코코스 아우레우스 균을 포함한 검체에 대한 블라인드 시험에서 스캔어레이 5000을 이용하여 검색된 도 1 A 및 도 2 B의 DNA 칩에서의 혼성화 반응 결과를 나타낸 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
본 발명은 스타필로코코스 아우레우스 게놈의 23S rRNA 유전자에서 스타필로코코스 아우레우스에 특이적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 스타필로코코스 아우레우스 검출 및 동정용 DNA칩 및 상기 올리고뉴클레오티드로 구성된 스타필로코코스 아우레우스 검출 및 동정용 탐침을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 DNA 칩을 사용하면, 현재 사용되고 있는 방법인 샘플 배양에 의하여 감염성 질환을 진단하는 방법보다 더욱 신속하고 정확하게 세균 감염을 진단할 수 있다.
<110> MEDIGENES Co.,Ltd <120> DNA Chip for Detection of Staphylococcus aureus <130> P05-B369 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 1 aggacgacat tagac 15 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 2 caaaggacga cattagacga 20 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CGAAGCGTGCGATTG <400> 3 cgaagcgtgc gattg 15 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 aggcgaagcg tgcgattgga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 tggattgcac gtctaagcag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 caaatccggt actcgttaag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 7 gagtcttcga gtcgttgatt 20 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 8 tcttcgagtc gttga 15 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ttgtacacac cgcccgtc 18 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tttcgccttt ccctcacggt act 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agtaccgtga gggaaaggcg aa 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tgcttctaag ccaacatcct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aggatgttgg cttagaagca 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cccgacaagg aatttcgcta cctt 24

Claims (2)

  1. 하기 염기 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 스타필로코코스 아우레우스 검출 및 동정용 DNA 칩:
    AGGACGACATTAGAC (서열번호 1);
    CAAAGGACGACATTAGACGA (서열번호 2);
    CGAAGCGTGCGATTG (서열번호 3);
    AGGCGAAGCGTGCGATTGGA (서열번호 4);
    TGGATTGCACGTCTAAGCAG (서열번호 5);
    CAAATCCGGTACTCGTTAAG (서열번호 6);
    GAGTCTTCGAGTCGTTGATT (서열번호 7); 및
    TCTTCGAGTCGTTGA (서열번호 8).
  2. 하기 염기 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 스타필로코코스 아우레우스 검출 및 동정용 탐침:
    AGGACGACATTAGAC (서열번호 1);
    CAAAGGACGACATTAGACGA (서열번호 2);
    CGAAGCGTGCGATTG 서열번호 3);
    AGGCGAAGCGTGCGATTGGA (서열번호 4);
    TGGATTGCACGTCTAAGCAG (서열번호 5);
    CAAATCCGGTACTCGTTAAG (서열번호 6);
    GAGTCTTCGAGTCGTTGATT (서열번호 7); 및
    TCTTCGAGTCGTTGA (서열번호 8).
KR1020050132072A 2005-12-28 2005-12-28 스타필로코코스 아우레우스 검출용 ｄｎａ 칩 Ceased KR20070069680A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050132072A KR20070069680A (ko) 2005-12-28 2005-12-28 스타필로코코스 아우레우스 검출용 ｄｎａ 칩

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050132072A KR20070069680A (ko) 2005-12-28 2005-12-28 스타필로코코스 아우레우스 검출용 ｄｎａ 칩

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070069680A true KR20070069680A (ko) 2007-07-03

Family

ID=38505269

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050132072A Ceased KR20070069680A (ko) 2005-12-28 2005-12-28 스타필로코코스 아우레우스 검출용 ｄｎａ 칩

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20070069680A (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008084889A1 (en) * 2007-01-08 2008-07-17 Medigenes Co., Ltd Dna chip for detection of staphylococcus aureus
WO2009086218A3 (en) * 2007-12-21 2009-09-03 Gen-Probe Incorporated Detection of antibiotic-resistant microorganisms

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008084889A1 (en) * 2007-01-08 2008-07-17 Medigenes Co., Ltd Dna chip for detection of staphylococcus aureus
WO2009086218A3 (en) * 2007-12-21 2009-09-03 Gen-Probe Incorporated Detection of antibiotic-resistant microorganisms
US8911946B2 (en) 2007-12-21 2014-12-16 Gen-Probe Incorporated Detection of antibiotic-resistant microorganisms

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100781558B1 (ko) 엑티노마이세스 이스라엘의 검출용 핵산 탐침
US20100167956A1 (en) Dna chip for detection of escherichia coli
US20100167951A1 (en) Dna chip for detection of staphylococcus aureus
KR20070069680A (ko) 스타필로코코스 아우레우스 검출용 ｄｎａ 칩
KR20070069676A (ko) 대장균 검출용 ｄｎａ 칩
KR100781559B1 (ko) 캔디다 알비칸스의 검출용 핵산 탐침
KR100617643B1 (ko) 포피로모나스 진지발리스 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100617640B1 (ko) 킨젤라 킨갭 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100617639B1 (ko) 오크로박트룸 안트로피 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577407B1 (ko) 해모필러스 아프로필라스 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577408B1 (ko) 클로스트리디움 디프실 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577451B1 (ko) 코리네박테리움 디프테리애 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577449B1 (ko) 크레브시엘라 옥시토카 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577444B1 (ko) 엔테로박터 에어로게네스 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577440B1 (ko) 스트렙토코커스 뮤탄스 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577412B1 (ko) 박테로이데스 테타이오타오미크론 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577456B1 (ko) 코마모나스 아시도보란스 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577386B1 (ko) 수테렐라 와즈워텐시스 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577404B1 (ko) 박테로이데스 불가투스 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577397B1 (ko) 브란하멜라 카타르할리스 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577453B1 (ko) 크리서박테리움 메닌고셉티쿰 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577455B1 (ko) 박테로이데스 프라질리스 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577458B1 (ko) 펩토스트렙토코코스 프레보티 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100577460B1 (ko) 펩토스트렙토코커스 마그누스 균의 검출용 ｄｎａ 칩
KR100617645B1 (ko) 아이케넬라 코로덴스 균의 검출용 ｄｎａ 칩

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20051228

A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20070111

Comment text: Request for Examination of Application

Patent event code: PA02011R01I

Patent event date: 20051228

Comment text: Patent Application

PG1501 Laying open of application
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20071120

Patent event code: PE09021S01D

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20080125

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20071120

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I