KR20070028431A - Ｐｒｒｓｖ 아단위 백신 - Google Patents

Abstract

PRRSV에 효과적인 백신은 PRRSV ORF1의 적어도 일부분을 포함한다. 투여이후, 이들 백신은 PRRSV-취약성 동물에서 면역반응을 유도한다. 더 나아가, 본 발명에 따른 조성물은 PRRSV에 대한 보호 면역(protective immunity)을 비롯한 면역반응을 제공할 뿐만 아니라 PRRSV의 심각도(severity) 및/또는 PRRSV의 발병률(incidence)을 감소시킨다. ORF1의 선택된 부분은 단독으로, 서로 간의 조합으로, 다른 PRRSV ORF와의 조합으로, 또는 다른 PRRSV 백신과의 조합으로 이용될 수 있다.

PRRSV

Description

ＰＲＲＳＶ 아단위 백신{PRRSV SUBUNIT VACCINES}

관련된 출원

본 출원은 2004년 6월 17일자로 제출된 미국 가출원 제 60/581,350호에 우선권을 주장한다.

서열 목록

본 출원에 첨부된 서열 목록은 동일한 내용으로, CD-ROM에 담긴 컴퓨터 판독가능 ASCII 파일의 형태로 제출되었다.

본 발명의 기술 분야

본 발명은 전반적으로, 돼지 생식기 호흡기 증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)에 대한 백신에 관계한다. 구체적으로, 본 발명은 PRRS 바이러스(PRRSV)의 DNA 아단위를 포함하는 백신의 투여에 의한 돼지에서 PRRS의 예방에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 PRRSV에 대한 보호 면역(protective immunity)을 돼지에게 제공하는 DNA 아단위 백신에서 개방 해독 틀 1(ORF1)의 용도에 관계한다. 이보다 더욱 구체적으로, 본 발명은 단독으로, PRRSV 게놈의 다른 부분과의 조합으로, 또는 다른 PRRSV 백신과의 조합으로, ORF1의 선택된 부분의 용도에 관계한다.

PRRS는 전세계 돈육 업계에서 중요한 질환이다. PRRS는 PRRSV 감염으로 유발된다. 현재, 변형된-생독 백신(MLV)이 가용한데, 이들은 정확하게 이용되면, PRRSV 감염에 기인한 임상 질환에 대한 보호를 돼지에게 제공한다. PRRS MLV 백신은 효과적인 면역반응이 유도되도록 담보하기 위하여, 예방접종된 동물에서 복제를 요한다(참조: Meng, X.J., Heterogeneity of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus: Implications for Current Vaccine Efficacy and Future Vaccine Development; 74 Vet. Micro., 309-329 (2000)). 하지만, 이런 복제는 PRRS MLV가 예방접종이후 수주동안 동물에서 존속할 수 있고, 또한 다른 PRRSV-음성 돼지로 확산될 수 있다는 점에서, 문제를 유발한다. 예방접종된 동물로부터 PRRS MLV의 확산(shedding)은 예방접종된 동물로부터 PRRS MLV의 PRRSV-접촉없음 개체군으로의 확산을 예방하기 위한 엄격한 차단방역 조치(biosecurity measure)가 시행되지 않고 있는 일부 돼지 무리에서 문제가 될 수 있다. 비록 수백만 분량의 PRRSV MLV가 문제없이 이용되고 있긴 하지만, 더욱 강한 독성을 나타내는 PRRSV 야생형으로 격세유전하는 PRRS MLV의 능력이 기존 문헌에서 산발적으로 보고되고 있다. 불활화된 PRRS 바이러스(즉, PRRS KV)로 구성되는 백신을 활용하여, PRRS MLV 확산과 독성으로의 격세유전 문제를 해결하려는 시도가 있었다. 하지만, 연구를 통하여, PRRS KV는 예방접종된 돼지에서 강한 체액 반응(humoral response)을 유도할 수 있다는 사실에도 불구하고, PRRS-연관된 질환을 예방하는데 무효한 것으로 밝혀졌다.

따라서, PRRS MLV와 연관된 문제없이 보호 면역반응을 유도할 수 있는 예방접종 방법과 백신이 당분야에서 여전히 요구되고 있다. 적절하게는, 투여된 백신은 예방접종된 동물에서 활발하게 복제하지 않고, 강한 체액과 세포-매개된 면역반응을 유도할 수 있어야 한다.

본 발명은 PRRSV DNA 백신을 제공함으로써, 선행 기술에 내재된 문제를 해결하고 선행 기술에 비하여 분명한 진보를 제공한다. 이론적으로, PRRS 항원을 발현하는 DNA 백신 플라스미드는 PRRSV 항원을 합성하는 주형(즉, PRRS MLV와 유사)으로서 기능할 뿐만 아니라 동물에서 활발하게 복제되지 않는 특성(즉, PRRS KV와 유사)을 보유한다. PRRSV에 대한 보호 숙주 반응을 유도하는데 필요한 보호 면역원(protective immunogen)은 알려져 있지 않다. 예방접종된 돼지에서 PRRS MLV가 보호 반응을 유도할 수 있기 때문에, 예방접종된 동물에서 PRRS MLV의 복제는 예방접종된 동물에서 강한 체액과 세포-매개된 면역반응을 유도할 것으로 생각된다.

PRRSV의 ORF1은 PRRSV 복제와 새로운 후손의 생성에 필요한 복제 기구(replication machinery)를 인코딩한다. ORF1은 ORF1 복제 결합체(replicase complex)를 포함하는 두 영역(ORF1a와 ORF1b)을 보유한다(Dea, et al., Current Knowledge on the Structural Proteins of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Prrs) Virus: Comparison of the North American end European Isolates; 145 (4) Archives of Virology, 659-688 (2000)). 레플리카아제-인코딩된 단백질은 다른 바이러스 계통에서 핵심 면역원인 것으로 생각된다(Leitner et al., DAN and RNA-Based Vaccines: Principles, Progress and Prospects; 18 Vaccine 765-777 (2000)). 세포가 PRRSV로 감염될 때 바이러스 레플리카아제의 활성이 강력한 어쥬번트-효과를 제공할 수 있는데, 그 이유는 레플리카아제-연관된 항원이 세포의 감염 동안 발현되기 때문이다. 레플리카아제-연관된 항원은 형질감염된 세포에서 발생된 “위험 신호(danger signal)”로서 기능하고 강한 숙주 면역반응(즉, IFN, HSP, 아폽토시스)을 유도할 수 있다. 따라서, 레플리카아제-연관된 “위험 신호”는 PRRS MLV가 보호를 유도할 수 있는 반면, 비-복제 PRRS(즉, PRRS KV에서 불활화된 항원)가 공격으로부터 보호를 제공하지 못하는 이유를 설명하는 핵심 인자일 수 있다.

ORF1은 진핵 세포에서 형질감염(transfection)과 적절한 발현을 어렵게 하는 거의 12,000개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 따라서, ORF1은 다양한 병원균의 보호 면역원을 결정하기 위한 도구로서 발현 라이브러리 면역화(expression library immunization, ELI)를 이용하여 더욱 작은 절편으로 순차적으로 임으로 분할된다. ELI는 특정 병원균의 게놈을 작은 단편으로 전단하는데, 이들 단편은 DNA 백신 벡터로 클론되고, 이후 임의의 단편이 면역반응을 유도할 수 있는 지를 결정하기 위하여 숙주에 투여된다(Johnston and Barry; Genetic to Genomic Vaccination; 15(8) Vaccine, 808-809 (1997)). 적절하게는, 면역반응은 보호성이다. 본 발명은 ORF1-산출된 단백질에 대한 숙주 면역반응이 PRRSV 공격으로부터 보호에 필수적이라는 가설에 기초한다. PRRSV ORF 2-7을 인코딩하는 영역을 DNA 백신 벡터에 위치시키는 것은 상대적으로 용이한데, 그 이유는 이들 ORF가 317-720개의 뉴클레오티드 길이를 갖기 때문이다. 앞서 기술된 바와 같이, PRRSV의 ORF1 영역은 거의 12,000개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 이런 크기의 영역을 DNA 백신 벡터에 위치시키면, 진핵 세포에서 형질감염과 후속 발현이 용이하지 않다. 따라서, 모든 ORF1 부위의 적절한 발현을 최대로 담보하기 위하여 ORF1 영역을 더욱 작은 절편으로 절단하는 것이 필수적이었다. 다양한 병원균의 보호 면역원을 결정하기 위한 도구로서 발현 라이브러리 면역화(expression library immunization, ELI)가 이용되었다. ELI는 특정 병원균 게놈의 작은 단편으로의 전단(shearing)을 이용한다. 이후, 이들 작은 단편은 DNA 백신 벡터로 클론되고, 임의의 단편이 보호성 면역반응을 유도할 수 있는 지를 결정하기 위하여 숙주로 투여된다. 본 발명에서, ELI 기술은 PRRSV 게놈의 ORF1 인코딩 영역으로 순차적으로 구성되는 PRRSV DNA 백신의 개발을 위하여 변형되었다. 상기 방법은 SELI(순차적 발현 라이브러리 면역화, sequential expression library immunization)로 명명되었다. 이는 전체 ORF1 영역을 DNA 백신으로 이용하는 Barfoed 등(DNA Vaccination of Pigs with Open Reading Frame 1-7 of PRRS Virus; 22 Vaccine, 3628-3641 (2004))에 상반된다.

본 발명의 백신은 단독으로, PRRSV ORF1의 다른 부분과 공동으로, 또는 다른 PRRSV 백신을 비롯하여 PRRSV 감염에 대한 면역반응을 유도하는데 효과적인 다른 조성물과 함께, PRRSV ORF1의 일부분을 포함한다. 본 발명의 목적에 적합한 ORF1 부분은 백신을 섭취하는 동물에서 면역반응을 유도할 만큼 충분한 크기를 갖는다. 적절하게는, 상기 부분은 최대 9,000개의 염기쌍(base pair)을 보유한다. 더욱 적절하게는, ORF-1 부분은 대략 21-9,000개의 연속 뉴클레오티드(contiguous nucleotide) 염기쌍, 바람직하게는 대략 21-6,000개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍, 더욱 바람직하게는 대략 21-3,000개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍, 이보다 더욱 바람직하게는 대략 21-2,000개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍, 이보다 더욱 바람직하게는 대략 21-1,000개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍, 이보다 더욱 바람직하게는 대략 21-500개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍, 이보다 더욱 바람직하게는 대략 21-300개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍, 이보다 더욱 바람직하게는 대략 21-150개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍, 이보다 더욱 바람직하게는 대략 21-75개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍, 이보다 더욱 바람직하게는 대략 21-50개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍, 이보다 더욱 바람직하게는 대략 21-25개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍, 이보다 더욱 바람직하게는 대략 21-23개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍, 가장 바람직하게는 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드 염기쌍을 보유한다. 이들 선호되는 부분 중에서 임의의 하나로부터 산출되는 단백질 역시 본 발명의 일부이다. 임의의 PRRSV 균주로부터 임의의 ORF1 또는 이의 일부분이 본 발명의 목적에 이용될 수 있긴 하지만, 독성 균주를 이용하는 것이 바람직하다.

선택된 부분은 적절한 발현 벡터로 클론될 수 있다. 적절한 벡터의 실례는 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 시겔라(Shigella) 벡터, pVC1650(Valentis, Inc., Burlingame, California), WRG720(W.R. Grace, New York, New York), pcDNA3(Invitrogen, Carlsbad, California)이다. 일부 선호되는 벡터는 즉시 조기 사이토메갈로바이러스 프로모터(immediate early cytomegalovirus promoter), 인트론 A(intron A), 폴리-아데닐화 부분(poly-adenylation portion)(가령, 소 성장 호르몬(BGH) 또는 인간 성장 호르몬(HGH))을 보유한다. 부가적으로, 정제된 PRRSV 단백질은 예로써, 바쿨로바이러스 발현 시스템(baculovirus expression system)을 이용하여 곤충 세포 배양액에서 발현될 수 있다. 이들 단백질은 이후, 어쥬번트와 혼합되고 투여될 수 있다. 물론, 당업자는 진핵 세포에서 다양한 PRRSV ORF의 발현을 유도할 수 있는 적절한 발현 시스템과 벡터를 선별할 수 있다. 적절하게는, ORF1의 개별 부분을 적절한 발현 벡터에 클론한 이후, 클론의 적응(orientation)을 확인한다.

본 발명의 한 실례에서, PRRSV 바이러스 VR-2332가 본 발명에 이용되었다. Genbank U87392를 이용하여 ORF1의 13개 중복 클론(overlapping clone)을 발생시켰다. 상기 ORF1은 12,071개의 뉴클레오티드 염기쌍을 보유한다. 이들 부분의 크기는 773 bp 내지 975 bp이었다. 이들 클론은 대문자 A-M로 명명되었는데, 클론 A(SEQ ID No. 2)는 939 bp이고, 클론 B(SEQ ID No. 3)는 957 bp이고, 클론 C(SEQ ID No. 4)는 976 bp이고, 클론 D(SEQ ID No. 5)는 954 bp이고, 클론 E(SEQ ID No. 6)는 939 bp이고, 클론 F(SEQ ID No. 7)는 957 bp이고, 클론 G(SEQ ID No. 8)는 957 bp이고, 클론 H(SEQ ID No. 9)는 852 bp이고, 클론 I(SEQ ID No. 10)는 917 bp이고, 클론 J(SEQ ID No. 11)는 972 bp이고, 클론 K(SEQ ID No. 12)는 966 bp이고, 클론 L(SEQ ID No. 13)은 783 bp이고, 클론 M(SEQ ID No. 14)은 774 bp이다. 클론 A-H는 ORF1의 영역 la로부터 유래되고, 클론 I-M은 ORF1의 lb로부터 유래된다. 클론 A는 진성 ORF1A ATG 개시 코돈(start codon)을 이용한다. 나머지 ORF1 클론은 그들의 개별 프라임 말단(prime end)에 부가된 인프레임(inframe) ATG 개시 코돈을 보유한다. 이들 각 클론은 DNA 발현 벡터 pVC1650으로 개별적으로 클론되었다. 상기 벡터는 즉시 조기 사이토메갈로바이러스 프로모터(immediate early cytomegalovirus promoter)와 인트론 A(intron A)를 보유하고, 진핵 세포에서 다양한 PRRSV ORF의 발현을 유도한다. 표 1에서는 각 클론 및 이들 각 클론이 유래되는 뉴클레오티드 서열 영역에 관한 정보를 제공한다.

* 주의: 최초 H와 I 클론은 ORF1a/lb 마이너스 1 프레임시프트(frameshift) 영역에 접하고, 새로운 프라이머는 다소 작아진 RT-PCR 산물을 제공하도록 설계되었다.

각 부분은 다른 PRRSV ORF를 포함하는 백신 제조물에서 단독으로 및 다양한 조합으로 이용되었다.

다른 실례에서, 클론 A-M 및 ORF 2-6의 클론은 pVC1650 발현 벡터로 클론되었고, ORF7에 대한 클론은 WRG720 발현 벡터로 클론되었다. 물론, 당업자는 적절한 벡터를 선택할 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 핵산 서열은 제한없이, 공통 분자 클로닝(common molecular cloning), 돌연변이유발(mutagenesis), 화학적 핵산 합성(chemical nucleic acid synthesis) 기술을 비롯한 표준 기술로 생산될 수 있다. 본 발명에는 클론 A-M 중에서 임의의 하나와 적어도 75% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 99%, 가장 바람직하게는 100% 서열 동일성을 갖는 DNA 서열이 포함된다.

본 발명의 한 측면에서, 클론 A-M 각각이 백신 성분으로서 개별적으로 이용된다. 동물은 임의의 통상적인 수단에 의한 투여로, 상기 백신으로 면역화된다. 투여 방법의 실례는 경구, 경피, 정맥내, 피하, 근육내, 안구내, 복강내, 직장내, 질내, 비강내, 위내, 기관지내, 폐내, 또는 이들의 조합이다. 원하거나 필요한 경우에, 추가 예방접종(booster immunization)이 1회, 또는 다양한 간격으로 수회 제공될 수 있다. 이런 백신의 투여이후, 동물에서 면역반응이 유도되고, PRRSV 감염의 임상적 징후가 독성 형태의 PRRSV로 공격접종(challenge)이후 발병률 및/또는 심각도에서 감소된다.

본 발명의 다른 측면에서, 클론 A-M의 조합이 앞서 기술된 바와 같이 동물에 투여된다. 이런 조합은 앞서 언급된 클론을 2개 이상 포함한다. 이들 클론 중에서 일부(A, B, C, D, E, H, I)가 돼지 항-PRRSV 회복기 혈청(convalescent sera)을 이용한 형질감염이후 IFA 반응을 유도했기 때문에, 이들 클론의 조합이 본 발명에 선호된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 앞서 기술된 바와 같이 단독으로 또는 조합으로 클론 A-M은 백신 제조물에서 PRRSV의 다른 ORF와 조합으로 이용된다. 적절한 ORF는 ORF 2-7이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, PRRSV ORF DNA는 다른 PRRSV 백신과 혼합된다. 적절하게는, 백신은 PRRSV ORF1 DNA의 추가에 앞서, 면역반응을 유도하는데 효과적이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 벡터가 제시된다. 본 발명에 따른 벡터는 PRRSV ORF1 DNA의 적어도 일부분을 포함하는 외래 DNA(벡터로부터 유래되지 않음)를 삽입한다. 바람직한 형태에서, 벡터는 플라스미드이다. 적절하게는, PRRSV ORF1 DNA의 일부분은 PRRSV ORF1 DNA로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드를 보유한다. 일부 바람직한 형태에서, 상기 부분은 SEQ ID No.1-14 중에서 임의의 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열 및 이들의 조합에서 선택되는 서열로부터 적어도 150개의 연속 뉴클레오티드를 보유한다. 조성 자체에서처럼, 서열 동일성의 비율 및 서열 길이가 앞서 기술된 바와 같이 변할 수 있다. 다른 바람직한 형태에서, 벡터는 PRRSV DNA의 두 번째 부분을 추가로 포함한다. 상기 두 번째 부분은 ORF1 이외의 PRRSV ORF로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, PRRSV ORF1로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, 이들의 조합에서 선택된다. ORF1로부터 추가로 21개의 연속 뉴클레오티드를 보유하는 구체예에서, 이들 21개의 뉴클레오티드는 PRRSV ORF1 DNA의 첫 번째 부분에 포함된 적어도 21개의 뉴클레오티드와 상이하다. 또한, 적절하게는, 벡터를 작제하는데 이용되는 PRRSV DNA는 PRRSV의 독성 균주로부터 유래된다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 플라스미드를 보유하는 숙주 세포이다. 이는 앞서 언급된 다양한 ORF1 단편의 도입으로 만들어진 플라스미드를 보유한다. 적절하게는, 이런 세포는 PRRSV ORF1 DNA로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 보유한다. 다른 바람직한 형태에서, 세포는 SEQ ID No. 1-14 중에서 임의의 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 서열 및 이들의 조합에서 선택되는 서열로부터 적어도 150개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 보유한다. 또 다른 바람직한 형태에서, 세포에서 플라스미드는 ORF1 이외의 PRRSV ORF로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, PRRSV ORF1로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, 이들의 조합에서 선택되는 PRRSV DNA의 두 번째 부분을 포함한다. 적절하게는, 세포에 내포된 플라스미드를 산출하는데 이용되는 PRRSV DNA는 PRRSV의 독성 균주로부터 유래된다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명의 조성물이 동물에서 면역반응의 유도 및 PRRSV 감염에 의해 유발되는 질환과 증상의 완전한 예방 또는 심각도 감소를 위한 방법에 유용하다.

본 발명의 조성물은 제약학적으로 허용되는 어쥬번트, 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 아래의 정의가 적용된다: 당분야에서 “서열 동일성(sequence identity)”은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 다시 말하면, 참고 서열(reference sequence) 및 참고 서열과 비교되는 특정 서열 사이의 상관관계를 의미한다. 서열 동일성은 최대의 서열 유사성(sequence similarity)이 달성되도록 특정 서열과 참고 서열을 최적으로 정렬한 이후, 이들 두 서열을 비교함으로써 결정된다, 예를 들면, 연속된 이들 서열 사이의 정합(match)으로 결정된다. 이런 정렬이후, 서열 동일성은 위치별( position-by-position) 기초에서 확인된다, 예를 들면, 이들 서열은 특정 위치에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 동일하면 상기 위치에서 “동일”하다. 이후, 이런 위치의 총수는 참고 서열에서 뉴클레오티드 또는 잔기의 총수로 나누어 서열 동일성 %를 제공한다. 서열 동일성은 Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)에 기술된 것들을 비롯한 공지된 방법으로 편의하게 산정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하는데 선호되는 방법은 검사되는 서열 사이에 최대의 정합을 제공하도록 설계된다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 특정 서열 사이의 서열 동일성을 결정하는 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화된다. 이러한 프로그램의 실례에는 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403410 (1990) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 출처(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990))로부터 공객적으로 입수가능하다. 이들 프로그램은 특정 서열과 참고 서열 사이에 최대 수준의 서열 동일성이 달성되도록 하기 위하여 디폴트 갭 중량(default gap weight)을 이용하여 서열을 최적으로 정렬한다. 예로써, 참고 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% “서열 동일성”을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드는 특정 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참고 뉴클레오티드 서열의 각 100개의 뉴클레오티드 마다 최대 5개의 점 돌연변이(point mutation)를 보유한다는 것을 의미한다. 다시 말하면, 참고 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드에, 참고 서열의 전체 뉴클레오티드 중에서 최대 5%의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 결실되거나 치환되고, 또는 참고 서열의 전체 뉴클레오티드의 최대 5% 비율까지 뉴클레오티드가 참고 서열에 삽입된다. 참고 서열의 이들 돌연변이는 참고 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 종결 위치(terminal position)에서 또는 이들 종결 위치 사이의 임의의 위치에서 발생하고, 참고 서열에서 뉴클레오티드 사이에 개별적으로 또는 참고 서열 내에서 하나이상의 연속 그룹으로 산재된다. 유사하게, 참고 아미노산 서열과 적어도 95% “서열 동일성”을 갖는 특정 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 특정 아미노산 서열이 참고 아미노산 서열의 각 100개의 아미노산 마다 최대 5개의 아미노산 변형을 보유한다는 것을 의미한다. 다시 말하면, 참고 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 특정 폴리펩티드 서열을 획득하기 위하여, 참고 서열의 전체 아미노산 잔기 중에서 최대 5%의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 결실되거나 치환되고, 또는 참고 서열의 전체 아미노산의 최대 5% 비율까지 아미노산이 참고 서열에 삽입된다. 참고 서열의 이들 변형은 참고 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복실 종결 위치에서 또는 이들 종결 위치 사이의 임의의 위치에서 발생하고, 참고 서열에서 잔기 사이에 개별적으로 또는 참고 서열 내에서 하나이상의 연속 그룹으로 산재된다. 적절하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)으로 구별된다.

하지만, 보존성 치환은 서열 동일성을 결정할 때 정합으로 간주되지 않는다.

유사하게, 본 명세서에서 “서열 상동성(sequence homology)”은 두 서열의 관련성(relatedness)을 결정하는 방법을 의미한다. 서열 상동성을 결정하기 위하여, 2개 이상의 서열이 앞서 기술된 바와 같이 최적으로 정렬되고, 필요한 경우에 갭(gap)이 도입된다. 하지만, “서열 동일성”과 대조적으로, 보존성 아미노산 치환이 서열 상동성을 결정할 때 정합으로 산정된다. 다시 말하면, 참고 서열과 95% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 획득하기 위하여, 참고 서열에서 95%의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 다른 아미노산 또는 뉴클레오티드와 정합하거나 보존성 치환을 포함해야 하고, 또는 참고 서열의 전체 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 최대 5% 비율까지 아미노산 또는 뉴클레오티드(보존성 치환을 포함하지 않음)가 참고 서열에 삽입된다.

“보존성 치환(conservative substitution)”은 전체 기능성(functionality)이 현저하게 변화되지 않도록 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 크기, 소수성 등에서 유사한 특징이나 특성을 갖는 다른 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로의 치환을 의미한다.

“분리된”은 “인위적으로” 자연 상태로부터 변형되었음을 의미한다, 다시 말하면, 최초 환경으로부터 변화 또는 제거, 또는 둘 모두를 의미한다. 가령, 생물체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 “분리된”것이 아니며, 자연 상태의 공존 재료로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 “분리된”것이다.

“핵산”은 디옥시리보핵산(DNA) 및 적절한 경우에, 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 용어는 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA의 유사체 역시 등가물(equivalent)로서 포괄하고, 구체예에서 단일(센스 또는 안티센스)과 이중-가닥 폴리뉴클레오티드로 기술된다.

“프로모터”는 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 선별된 DNA 서열의 발현을 조절하고, 세포에서 선별된 DNA 서열의 발현을 유도하는 DNA 서열을 의미한다. 상기 용어는 “조직 특이적” 프로모터, 다시 말하면, 특정 세포(가령, 특정 조직의 세포)에서만 선별된 DNA 서열의 발현을 유도하는 프로모터를 포괄한다. 상기 용어는 “누수(leaky)”프로모터 역시 포괄하는데, 이는 선별된 DNA의 발현을 한 조직에서 주로 조절하지만 다른 조직에서도 발현을 유도한다. 상기 용어는 비-조직 특이적 프로모터 및 구조적으로 발현하거나 유도할 수 있는(즉, 발현 수준을 조절할 수 있는) 프로모터 역시 포괄한다.

“형질감염(transfection)”은 핵산-매개된 유전자 전달에 의해, 예로써, 발현 벡터를 통한 핵산의 수용자 세포(recipient cell)로의 도입을 의미한다. 본 명세서에서, “형질전환(transformation)”은 외인성 DNA 또는 RNA의 세포 유입(cellular uptake)의 결과로써 세포의 유전형이 변하는 과정을 의미하는데, 가령 형질전환된 세포가 폴리펩티드의 재조합 형태를 발현하고, 또는 전이된 유전자로부터 항-센스 발현의 경우에, 상기 단백질의 자연-발생 형태의 발현이 교란된다. 형질감염에는 화학 반응물(가령, 지질) 역시 이용될 수 있다.

“벡터”는 상기 벡터에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 선호되는 한가지 유형은 에피솜(episome), 다시 말하면, 염색체외부 복제(extra-chromosomal replication)가 가능한 핵산이다. 선호되는 벡터는 이들 벡터가 연결된 핵산의 독립적 복제 및/또는 발현을 유도할 수 있는 벡터이다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있는 벡터는 본 명세서에서, “발현 벡터(expression vector)”로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 빈번하게 “플라스미드(plasmid)” 형태인데, 이는 벡터 형태로, 크로모좀에 결합되지 않는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 본 명세서에서, “플라스미드”와 “벡터”는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적인 형태이기 때문에, 서로 혼용된다. 벡터는 삽입된 분절의 복제를 달성하기 위하여 다른 DNA 분절이 삽입된, 파지(phage) 또는 코스미드(cosmid)와 같은 다른 레플리콘(replicon) 역시 포괄한다. 본 발명에는 균등한 기능을 수행하고 당분야에 공지되어 있는 발현 벡터의 이와 같은 다른 형태가 포함된다.

핵산 또는 폴리뉴클레오티드의 “증폭(amplification)”은 핵산이나 폴리뉴클레오티드 분자의 하나이상 사본의 형성(지수적 증폭), 또는 핵산이나 폴리뉴클레오티드 분자의 보체(complement)의 하나이상 사본의 형성(선형 증폭)을 유도하는 임의의 방법이다. 증폭 방법에는 변성(denaturation), 올리고뉴클레오티드 프라이머 어닐링(oligonucleotide primer annealing), 내열성 주형 의존성 폴리뉴클레오티드 중합효소(thermophilic template dependent polynucleotide polymerase)에 의한 프라이머 신장(primer extension)에 기초하고, 프라이머가 측면에 위치하는 폴리뉴클레오티드 분석물(polynucleotide analyte)의 원하는 서열의 사본에서 지수적 증가를 결과하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)이 포함된다. 상기 DNA의 마주보는 가닥에 어닐링하는 2가지 상이한 PCR 프라이머는 한 프라이머의 중합효소 촉진된 신장 산물이 다른 프라이머에 대한 주형 가닥(template strand)으로서 기능하여 별개의 이중 가닥 단편의 축적을 유도하도록 배치되는데, 상기 단편의 길이는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 5' 말단 사이의 거리로 정의된다. 이런 증폭을 수행하기 위한 반응물에는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 뉴클레오티드 중합효소, 뉴클레오시드 삼인산염, 예를 들면, 디옥시아데노신 삼인산염(dATP), 디옥시구아노신 삼인산염(dGTP), 디옥시시티딘 삼인산염(dCTP), 디옥시티미딘 삼인산염(dTTP)이 포함된다. 다른 증폭 방법에는 단일 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 증폭, 리가아제 사슬 반응(ligase chain reaction, LCR), 핵산 서열 기초된 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA), Q 베타-레플리카아제 방법, 3SR 등이 포함된다.

본 명세서에 언급된 모든 참고문헌의 교시와 내용은 순전히 참조로 한다.

아래의 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 기술한다. 하지만, 본 실시예는 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명의 전체 범위를 결코 한정하지 않는다.

실시예 1

본 실시예에서는 PRRSV 게놈의 다양한 영역을 포함하는 DNA 백신의 효능에 관한 데이터를 제공한다. 본 실시예는 40마리의 PRRSV-음성 혼성 돼지(Spring Prairie Colony, Hawley, MN 56549)로 시작하였다. 이들 돼지는 연구 시작 시점에 3-4주령이었다. 전체 연구 기간 동안, 이들 돼지는 크기, 연령, 상태에 맞게 충분한 사료가 공급되었다. 물은 무제한으로 공급되었다.

PRRSV DNA 백신을 산출하기 위하여, PRRS 바이러스로부터 19개의 cDNA 클론을 생성하였다. PRRSV 게놈의 개방 해독 틀(ORF) 1a/1b 영역을 순차적으로 나타내는 13개의 cDNA 클론을 산출하였다. 클론 A는 진성 ORF1a ATG 개시 코돈(start codon)을 이용한다. 나머지 ORF1a/1b 클론 B-M은 그들의 개별 5' 말단에 부가된 ATG 개시 코돈을 보유한다. 이들 각 클론은 DNA 발현 벡터 pVC1650으로 개별적으로 클론하였다. 상기 pVC1650 벡터는 즉시 조기 사이토메갈로바이러스 프로모터(immediate early cytomegalovirus promoter)와 인트론 A(intron A)를 보유하고, 진핵 세포에서 다양한 PRRSV ORF의 발현을 유도하였다. 6개의 추가의 cDNA 클론은 PRRSV 구조 단백질 ORF 2, 3, 4, 5, 6, 7을 나타냈다. ORF 2, 3, 4, 5, 6 클론 역시 앞서 기술된 DNA 발현 벡터 pVC1650로 개별적으로 클론하였다. ORF 7 유전자는 유사한 발현 벡터 WRG7020으로 클론하였다. 상기 WRG7020 벡터 역시 즉시 조기 사이토메갈로바이러스 프로모터와 인트론 A를 보유하고, 진핵 세포에서 다양한 PRRSV ORF 7의 발현을 유도하였다.

“A1-19”와 “Tl-l9”로 명명된 두 세트의 백신이 생산되었다. Al-l9 백신의 경우, 앞서 언급된 클론들을 Valentis, Inc. pVC1650 발현 플라스미드로 클론하였다. 각 플라스미드 구조체는 알루미늄 인산염(Adju-Pros)으로 개별적으로 조직하여(Ulmer et al., Enhancement of DNA Vaccine Potency Using Conventional Aluminum Adjuvants; 18 Vaccine, 18-28 (1999)) 1 ㎖ 분량에 1000 ㎍ 산정된 알루미늄을 포함하는 250 ㎍의 개별 ORF 클론을 산출하였다. 최종 백신은 각 조직된 ORF 클론의 개별 1 ㎖ IM 분량으로 구성되었다. Tl-l9 백신의 경우, 앞서 언급된 클론들을 Valentis, Inc. pVC1650 발현 플라스미드로 클론하였다. 각 플라스미드 구조체는 TGV200 PINC-중합체로 개별적으로 조직하여 1 ㎖ 분량에 250 ㎍의 개별 ORF 클론을 산출하였다. 최종 백신은 각 조직된 ORF 클론의 개별 1 ㎖ IM 분량으로 구성되었다.

대조를 산출하기 위하여, ORF PCV2의 cDNA 클론과 SIV의 HA 유전자로 구성되는 DNA 백신을 생산하였다. 이들 두 ORF를 Valentis, Inc. pVC1650 발현 플라스미드에 개별적으로 클론하였다. PCV2 ORF2와 SIV HA 유전자 플라스미드 구조체 모두 알루미늄 인산염(Adju-Pros)으로 개별적으로 조직하여 1 ㎖ 분량에 1000 ㎍ 산정된 알루미늄을 포함하는 250 ㎍의 개별 ORF 클론(A20과 A21)을 산출하였다. 부가적으로, PCV2 ORF2와 SIV HA 유전자 플라스미드 구조체 모두 TGV200 PINC-중합체로 개별적으로 조직하여 1 ㎖ 분량에 250 ㎍의 개별 ORF 클론(T20과 T21)을 산출하였다. 최종 백신은 각 조직된 ORF 클론의 4가지 개별 1 ㎖ IM 분량으로 구성되었다. 표 2에서는 대조 백신을 비롯한 모든 생산된 백신을 보여준다.

40마리의 돼지는 4가지 군으로 분할하였다: 1 군에는 19 x 1 ㎖ 분량의 Al-Al9 Adju-Phos를 연구 0일, 21일, 42일에 투여하였다. 2 군에는 19 x 1 ㎖ 분량의 Tl-Tl9 TGV200을 연구 0일, 21일, 42일에 투여하였다. 3 군에는 4 x 1 ㎖ 개별 분량의 A20, A21, T20, T21을 연구 0일, 21일, 42일에 투여하였다. 4 군(음성 대조)에는 어떤 처리도 하지 않았다.

연구 56일에, 1 군, 2 군, 3 군의 모든 돼지에 PRRSV의 독성 SDSU#73 균주를 투여하였다. PRRSV의 상기 독성 SDSU#73 균주는 돼지 투여에 앞서, 4% 우 태아 혈청(fetal bovine serum)으로 EMEM에서 1:10 희석하였다. 각 콧구멍에 투여된 1 ㎖의 희석된 바이러스로, 총 2 ㎖의 희석된 공격접종 바이러스가 이들 돼지에 비강내 전달되었다. PRRSV 공격접종 바이러스의 공격접종이전과 공격접종이후 역가는 각각, 10^4.59 TCID₅₀/㎖와 10^4.65 TCID₅₀/㎖이었다.

이들 돼지는 백신화(vaccination)로의 혈청전환(seroconversion)을 모니터하기 위하여 연구 0일, 21일, 42일, 56일에 채혈하였다. 또한, 이들 돼지는 공격접종이후 혈청전환과 바이러스혈증(viremia)을 모니터하기 위하여 연구 57일, 59일, 61일, 63일, 66일, 70일에 채혈하였다. 임상적 관찰 결과는 연구 54일에서부터 70일까지 매일 기록하였다. 연구 70일에, 이들 돼지는 안락사시키고, PRRSV에 기인한 폐 침습 비율(percent lung involvement)로 전체 폐 병소(gross lung lesion)를 기록하였다. 이들 돼지는 연구 시작 직전 및 연구 56일과 70일에 칭량하였다. 본 실시예에서 프로토콜의 요약은 표 3에서 확인할 수 있다.

본 실시예의 결과를 평가하기 위하여, 검사 처리물질의 효능을 결정하는데 이용되는 주요 기준은 PRRSV의 특징적인 폐 병소의 발달이었다. 보조 기준으로서 혈청학적 반응(Serological response), 공격접종이후 ADG, 직장 온도(rectal temperature)를 평가하였다. 본 실시예의 결과는 표 4에 요약한다.

개별 A1-A19 Adju-Phos 또는 T1-T19 TGV200 DNA 백신 기본형의 3회 분량을 섭취하는 임의의 돼지에서 IDEXX PRRS ELISA에 의한 측정에서, PRRSV로의 혈청전환은 관찰되지 않았다. 독성 PRRSV 공격접종이후, 1 군 돼지에서보다 2 군 돼지에서 ELISA S/P 비율의 더욱 급격한 증가가 나타났다. 3 군 돼지(예방접종되지 않고/공격접종된 대조)는 독성 PRRSV 공격접종에 노출될 때까지 음성 S/P 비율을 보였다. 4 군에서 엄격한 음성 대조 돼지는 전체 연구 기간 동안 음성 S/P 비율을 보였다. 혈청학적 결과는 표 5에 제시한다.

공격접종 2일전부터 공격접종이후 14일까지 돼지 온도를 모니터하였다. 4 군(예방접종되지 않고/공격접종되지 않은) 대조에 대한 전체 공격접종 기간 동안 기준 군 평균 온도는 103.4℉이었다.

모든 PRRSV-공격접종된 군에서 군 평균 온도는 공격접종이후 머지않은 시점에서 상승되긴 했지만, 군 평균 온도가 최고가 되는 공격접종이후 일자(day)에서 시간적 차이가 존재하였다. PRRSV로 공격접종된 모든 군에서 군 평균 최고 온도는 105.9 내지 106.1 ℉인 반면, 음성 대조 군 평균 최고 온도는 103.9 ℉이었다. 3 군은 공격접종이후 점진적인 온도 증가를 보였는데, 최고 온도는 공격접종이후 9일 시점에 106.1 ℉이었다. 1 군과 2 군은 공격접종이후 급격한 온도 증가를 보였는데, 최고 온도는 각각, 공격접종이후 2일 시점에 105.9 ℉·와 105.6 ℉이었다. 흥미롭게도, 1 군과 2 군에서 DNA 예방접종된 돼지의 공격접종이후 온도가 급격하게 상승하는 방식은 PRRS KV 예방접종된 동물이 공격접종이후 반응하는 양식과 유사하다. 실험적 PRRS KV 기본형으로 예방접종된 돼지는 통상적으로, “체액-프라임(humorally-primed)(즉, 예방접종이후 PRRSV에 혈청양성(seropositive))되는 것으로 관찰되었다. 이들 실험적 PRRS KV 기본형으로 예방접종된 동물들은 또한, 본 연구에서 1 군과 2 군의 DNA 예방접종된 돼지에서 관찰되는 바와 같이, 공격접종직후 급격한 온도 증가를 보인다. PRRSV 공격접종이후 급격한 온도 상승에서 이런 유사성은 DNA 예방접종된 돼지의 면역계가 PRRSV 항원에 실제로 프라임(prime)된다는 것을 더욱 뒷받침한다.

3 군 돼지는 성공적인 PRRSV 공격접종에서 특징적으로 관찰되는 폐 병소를 보였다. 4 군 돼지는 안락사 시점에 폐 병소를 보이지 않았다. 1 군과 2 군 돼지는 각각, 19.84와 28.42의 군 평균 폐 병소를 나타냈다. 이들 개별 돼지에 대한 폐 스코어는 표 6에서 제시한다.

이들 결과로부터, PRRSV 게놈의 다양한 영역을 포함하는 DNA 백신이 호흡기 모형(respiratory model)에서, 독성 공격접종으로부터 보호를 유도할 수 있음을 명확하게 확인할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. VAUGHN, Eric M. STAMMER, Richard <120> PRRSV SUBUNIT VACCINES <130> 35072-PRO <160> 14 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 15411 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 1 atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60 ggcacagccc aaaacttgct gcacagaaac acccttctgt gatagcctcc ttcaggggag 120 cttagggttt gtccctagca ccttgcttcc ggagttgcac tgctttacgg tctctccacc 180 cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc cagggtgttt 240 atggcggagg gccaagtcta ctgcacacga tgcctcagtg cacggtctct ccttcccctg 300 aacctccaag tttctgagct cggggtgcta ggcctattct acaggcccga agagccactc 360 cggtggacgt tgccacgtgc attccccact gttgagtgct cccccgccgg ggcctgctgg 420 ctttctgcaa tctttccaat cgcacgaatg accagtggaa acctgaactt ccaacaaaga 480 atggtacggg tcgcagctga gctttacaga gccggccagc tcacccctgc agtcttgaag 540 gctctacaag tttatgaacg gggttgccgc tggtacccca ttgttggacc tgtccctgga 600 gtggccgttt tcgccaattc cctacatgtg agtgataaac ctttcccggg agcaactcac 660 gtgttgacca acctgccgct cccgcagaga 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957 <210> 4 <211> 976 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 4 cccggaggag gtcgcagcaa agattgacct gtacctccgt ggtgcaacaa atcttgaaga 60 atgcttggcc aggcttgaga aagcgcgccc gccacgcgta atcgacacct cctttgattg 120 ggatgttgtg ctccctgggg ttgaggcggc aacccagacg atcaagctgc cccaggtcaa 180 ccagtgtcgt gctctggtcc ctgttgtgac tcaaaagtcc ttggacaaca actcggtccc 240 cctgaccgcc ttttcactgg ctaactacta ctaccgtgcg caaggtgacg aagttcgtca 300 ccgtgaaaga ctaaccgccg tgctctccaa gttggaaaag gttgttcgag aagaatatgg 360 gctcatgcca accgagcctg gtccacggcc cacactgcca cgcgggctcg acgaactcaa 420 agaccagatg gaggaggact tgctgaaact ggctaacgcc cagacgactt cggacatgat 480 ggcctgggca gtcgagcagg ttgacctaaa aacttgggtc aagaactacc cgcggtggac 540 accaccaccc cctccgccaa aagttcagcc tcgaaaaacg aagcctgtca agagcttgcc 600 ggagagaaag cctgtccccg ccccgcgcag gaaggttggg tccgattgtg gcagcccggt 660 ttcattaggc ggcgatgtcc ctaacagttg ggaagatttg gctgttagta gcccctttga 720 tctcccgacc ccacctgagc cggcaacacc ttcaagtgag ctggtgattg tgtcctcacc 780 gcaatgcatc ttcaggccgg cgacaccctt gagtgagccg gctccaattc ccgcacctcg 840 cggaactgtg tctcgaccgg tgacaccctt gagtgagccg atccctgtgc ccgcaccgcg 900 gcgtaagttt cagcaggtga aaagattgag ttcggcggcg gcaatcccac cgtaccagga 960 cgagcccctg gatttg 976 <210> 5 <211> 954 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 5 caggacgagc ccctggattt gtctgcttcc tcacagactg aatatgaggc ctctccccca 60 gcaccgccgc agagcggggg cgttctggga gtagaggggc atgaagctga ggaaaccctg 120 agtgaaatct cggacatgtc gggtaacatt aaacctgcgt ccgtgtcatc aagcagctcc 180 ttgtccagcg tgagaatcac acgcccaaaa tactcagctc aagccatcat cgactcgggc 240 gggccctgca gtgggcatct ccaagaggta aaggaaacat gccttagtgt catgcgcgag 300 gcatgtgatg cgactaagct tgatgaccct gctacgcagg aatggctttc tcgcatgtgg 360 gatcgggtgg acatgctgac ttggcgcaac acgtctgttt accaggcgat ttgcacctta 420 gatggcaggt taaagttcct cccaaaaatg atactcgaga caccgccgcc ctatccgtgt 480 gagtttgtga tgatgcctca cacgcctgca ccttccgtag gtgcggagag cgaccttacc 540 attggctcag ttgctactga agatgttcca cgcatcctcg agaaaataga aaatgtcggc 600 gagatggcca accagggacc cttggccttc tccgaggata aaccggtaga tgaccaactt 660 gtcaacgacc cccggatatc gtcgcggagg cctgacgaga gcacatcagc tccgtccgca 720 ggcacaggtg gcgccggctc ttttaccgat ttgccgcctt cagatggcgc ggatgcggac 780 gggggggggc cgtttcggac ggtaaaaaga aaagctgaaa ggctctttga ccaactgagc 840 cgtcaggttt ttgacctcgt ctcccatctc cctgttttct tctcacgcct tttctaccct 900 ggcggtggtt attctccggg tgattggggt tttgcagctt ttactctatt gtgc 954 <210> 6 <211> 939 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 6 ttgtgcctct ttttatgtta cagttaccca gcctttggta ttgctcccct cttgggtgtg 60 ttttctgggt cttctcggcg cgttcgaatg ggggtttttg gctgctggtt ggcttttgct 120 gttggtctgt tcaagcctgt gtccgaccca gtcggcgctg cttgtgagtt tgactcgcca 180 gagtgtagaa acatccttca ttcttttgag cttctcaaac cttgggaccc tgttcgcagc 240 cttgttgtgg gccccgtcgg tctcggtctt gccattcttg gcaggttact gggcggggca 300 cgctgcatct ggcacttttt gcttaggctt ggcattgttg cagactgtat cttggctgga 360 gcttacgtgc tttctcaagg taggtgtaaa aagtgctggg gatcttgtat aagaactgct 420 cctaatgagg tcgcttttaa cgtgtttcct ttcacacgtg cgaccaggtc gtcacttatc 480 gacctgtgcg atcggttttg tgcgccaaaa ggaatggacc ccatttttct cgccactggg 540 tggcgcgggt gctgggccgg ccgaagcccc attgagcaac cctctgaaaa acccatcgcg 600 tttgcccaat tggatgaaaa gaagattacg gctaggactg tggtcgccca gccttatgac 660 cccaaccaag ccgtaaagtg cttgcgggta ttgcagtcgg gtggggcgat ggtggctaag 720 gcggtcccaa aagtggtcaa ggtttccgct gttccattcc gagccccctt ctttcccact 780 ggagtgaaag ttgaccctga ttgcagggtc gtggttgacc ctgacacttt cactgcagct 840 ctccggtctg gctactccac cacaaacctc gtccttggtg taggggactt tgcccagctg 900 aatggattaa aaatcaggca aatttccaag ccttcaggg 939 <210> 7 <211> 957 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 7 ggaggcccac atctcatggc tgccctgcat gttgcctgct cgatggctct gcacatgctt 60 gctgggattt atgtgactgc ggtgggttct tgcggcaccg gcaccaacga cccgtggtgc 120 gctaacccgt ttgccgtccc tggctacgga cctggctctc tctgcacgtc caggttgtgc 180 atttcccaac acggccttac cctgcccttg acagcacttg tggcgggatt cggtattcaa 240 gaaattgcct tggtcgtttt gatttttgtt tccatcggag gcatggctca taggttgagc 300 tgtaaggctg acatgctgtg tgttttgctt gcaattgcca gctatgtttg ggtacctctt 360 acctggttgc tttgtgtgtt tccttgctgg ttgcgctgtt tttctttgca ccccctcacc 420 atcctatggt tggtgttttt cttgatttct gtgaatatgc cttcaggaat cttggccatg 480 gtgttgttgg tttctctttg gcttcttggt cgttatacta atgttgctgg ccttgtcacc 540 ccctacgaca ttcatcatta caccagtggc ccccgcggtg ttgccgcctt ggctaccgca 600 ccagatggga cctacttggc cgctgtccgc cgcgctgcgt tgactggccg caccatgctg 660 tttaccccgt cccagcttgg gtctcttctt gagggtgctt tcagaactcg aaagccctca 720 ctgaacaccg tcaatgtgat cgggtcctcc atgggctctg gcggggtgtt taccatcgac 780 gggaaagtca agtgcgtaac tgccgcacat gtccttacgg gcaattcagc tcgggtttcc 840 ggggtcggct tcaatcaaat gcttgacttt gacgtaaagg gagatttcgc tatagctgat 900 tgcccgaatt ggcaaggggc tgcccccaag acccaattct gcacggatgg atggact 957 <210> 8 <211> 957 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 8 tgcacggatg gatggactgg ccgtgcctat tggctaacat cctctggcgt cgaacccggc 60 gtcattggaa aaggattcgc cttctgcttc accgcatgtg gcgattccgg gtccccagtg 120 atcaccgagg ccggtgagct tgtcggcgtt cacacgggat cgaataaaca aggggggggc 180 attgttacgc gcccctcagg ccagttttgt aatgtggcac ccatcaagct aagcgaatta 240 agtgaattct ttgctgggcc taaggtcccg ctcggtgatg tgaaggtcgg cagccacata 300 attaaagaca taagcgaggt gccttcagat ctttgtgcct tgcttgctgc caaacctgaa 360 ctggaaggag gcctctccac cgtccaactt ctttgtgtgt tttttctcct gtggagaatg 420 atgggacatg cctggacgcc cttggttgct gtgagtttct ttattttgaa tgaggttctc 480 ccagccgtcc tggtccggag tgttttctcc tttggaatgt ttgtgctatc ctggctcacg 540 ccatggtctg cgcaagttct gatgatcagg cttctgacag cagctcttaa caggaacaga 600 tggtcacttg cctttttcag cctcggtgca gtgaccggtt ttgtcgcaga tcttgcggcc 660 actcaggggc atccgttgca ggcagtgatg aatttgagca cctatgcatt cctgcctcgg 720 atgatggttg tgacctcacc agtcccagtg atcacgtgtg gtgtcgtgca cctacttgcc 780 atcattttgt acttgtttaa gtaccgtggc ccgcaccata tccttgttgg cgatggagtg 840 ttctctgcgg ctttcttctt gagatacttt gccgagggaa agttgaggga aggggtgtcg 900 caatcctgcg gaatgaatca tgagtctctg actggtgccc tcgctatgag actcaat 957 <210> 9 <211> 852 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 9 atgagactca atgacgagga cttggatttc cttatgaaat ggactgattt taagtgcttt 60 gtttctgcgt ccaacatgag gaatgcagcg ggtcaattta tcgaggctgc ctatgctaaa 120 gcacttagag tagaactggc ccagttggtg caggttgata aagttcgagg tactttggcc 180 aaacttgaag cttttgctga taccgtggca cctcaactct cgcccggtga cattgttgtc 240 gctctcggcc acacgcctgt tggcagtatc ttcgacctaa aggttggtag caccaagcat 300 accctccaag ccattgagac cagagtcctt gctgggtcca aaatgaccgt ggcgcgcgtc 360 gtcgacccga cccccacgcc cccacccgca cccgtgccca tccccctccc accgaaagtt 420 ctggagaatg gccccaacgc ttggggggat gaggaccgtt tgaataagaa gaagaggcgc 480 aggatggaag ccctcggcat ctatgttatg ggcgggaaaa agtaccagaa attttgggac 540 aagaattccg gtgatgtgtt ttatgaggag gtccataata acacagatga gtgggagtgt 600 ctcagagttg gcgaccctgc cgactttgac cctgagaagg gaactctgtg tggacatgtc 660 accattgaaa acaaggctta ccatgtttac acctccccat ctggtaagaa gttcttggtc 720 cccgtcaacc cagagaatgg aagagttcaa tgggaagctg caaagctttc cgtggagcag 780 gccctaggta tgatgaatgt cgacggcgaa ctgactgcca aagaactgga gaaactgaaa 840 agaataattg ac 852 <210> 10 <211> 917 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 10 gcttggttgt tactgaaaca gcggtaaaaa tagtcaaatt tcacaaccgg accttcaccc 60 tgggacctgt gaatttaaaa gtggccagtg aggttgagct aaaagacgcg gttgagcaca 120 accaacaccc ggttgcgaga ccgatcgatg gtggagttgt gctcctgcgt tccgcggttc 180 cttcgcttat agacgtcttg atctccggtg ctgatgcatc tcccaagtta cttgcccatc 240 acgggccggg aaacactggg atcgatggca cgctctggga ttttgagtcc gaagccacta 300 aagaggaagt cgcactcagt gcgcaaataa tacaggcttg tgacattagg cgcggcgacg 360 ctcctgaaat tggtctccct tacaagctgt accctgttag gggtaaccct gagcgggtga 420 aaggagttct gcagaataca aggtttggag acatacctta caaaaccccc agtgacactg 480 gaagcccagt gcacgcggct gcctgcctta cgcccaacgc cactccggtg actgatgggc 540 gctccgtctt ggccacgacc atgccccccg ggtttgagtt atatgtaccg accataccag 600 cgtctgtcct tgattacctt gactctaggc ctgactgccc taaacagctg acagagcacg 660 gctgcgaaga tgccgcactg aaagacctct ctaaatatga cttgtccacc caaggctttg 720 ttttacctgg agttcttcgc cttgtgcgga aatacctgtt tgcccatgta ggtaagtgcc 780 cacccgttca tcggccttct acttaccctg ctaagaattc tatggctgga ataaatggga 840 acaggttccc aaccaaggac attcagagcg tccctgaaat cgacgttctg tgcgcacagg 900 ctgtgcgaga aaactgg 917 <210> 11 <211> 972 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 11 gctgtgcgag aaaactggca aactgtcacc ccttgtactc ttaagaaaca gtattgcggg 60 aagaagaaga ctaggaccat actcggcacc aataacttca tcgcactagc ccaccgagca 120 gtgttgagtg gtgttaccca gggcttcatg aaaaaggcgt ttaactcgcc catcgccctc 180 ggaaagaaca agtttaagga gctacagact ccggtcctgg gcaggtgcct tgaagctgat 240 ctcgcatcct gcgatcgatc cacgcctgca attgtccgct ggtttgccgc caaccttctt 300 tatgaacttg cctgtgctga agagcatcta ccgtcgtacg tgctgaactg ctgccacgac 360 ttactggtca cgcagtccgg cgcagtgact aagagaggtg gcctgtcgtc tggcgacccg 420 atcacctctg tgtctaacac catttatagt ttggtgatct atgcacagca tatggtgctt 480 agttacttca aaagtggtca cccccatggc cttctgttct tacaagacca gctaaagttt 540 gaggacatgc tcaaggttca acccctgatc gtctattcgg acgacctcgt gctgtatgcc 600 gagtctccca ccatgccaaa ctatcactgg tgggttgaac atctgaattt gatgctgggg 660 tttcagacgg acccaaagaa gacagcaata acagactcgc catcatttct aggctgtaga 720 ataataaatg ggcgccagct agtccccaac cgtgacagga tcctcgcggc cctcgcctat 780 cacatgaagg cgagtaatgt ttctgaatac tatgcctcag cggctgcaat actcatggac 840 agctgtgctt gtttggagta tgatcctgaa tggtttgaag aacttgtagt tggaatagcg 900 cagtgcgccc gcaaggacgg ctacagcttt cccggcacgc cgttcttcat gtccatgtgg 960 gaaaaactca gg 972 <210> 12 <211> 966 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 12 atgtgggaaa aactcaggtc caattatgag gggaagaagt cgagagtgtg cgggtactgc 60 ggggccccgg ccccgtacgc tactgcctgt ggcctcgacg tctgcattta ccacacccac 120 ttccaccagc attgtccagt cacaatctgg tgtggccatc cagcgggttc tggttcttgt 180 agtgagtgca aatcccctgt agggaaaggc acaagccctt tagacgaggt gctggaacaa 240 gtcccgtata agcccccacg gaccgttatc atgcatgtgg agcagggtct cacccccctt 300 gatccaggta gataccaaac tcgccgcgga ttagtctctg tcaggcgtgg aattagggga 360 aatgaagttg gactaccaga cggtgattat gctagcaccg ccttgctccc tacctgcaaa 420 gagatcaaca tggtcgctgt cgcttccaat gtattgcgca gcaggttcat catcggccca 480 cccggtgctg ggaaaacata ctggctcctt caacaggtcc aggatggtga tgttatttac 540 acaccaactc accagaccat gcttgacatg attagggctt tggggacgtg ccggttcaac 600 gtcccggcag gcacaacgct gcaattcccc gtcccctccc gcaccggtcc gtgggttcgc 660 atcctagccg gcggttggtg tcctggcaag aattccttcc tagatgaagc agcgtattgc 720 aatcaccttg atgttttgag gcttcttagt aaaactaccc tcacctgtct aggagacttc 780 aagcaactcc acccagtggg ttttgattct cattgctatg tttttgacat catgcctcaa 840 actcaactga agaccatctg gaggtttgga cagaatatct gtgatgccat tcagccagat 900 tacagggaca aactcatgtc catggtcaac acaacccgtg tgacctacgt ggaaaaacct 960 gtcagg 966 <210> 13 <211> 783 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 13 gtggaaaaac ctgtcaggta tgggcaggtc ctcaccccct accacaggga ccgagaggac 60 gacgccatca ctattgactc cagtcaaggc gccacattcg atgtggttac attgcatttg 120 cccactaaag attcactcaa caggcaaaga gcccttgttg ctatcaccag ggcaagacac 180 gctatctttg tgtatgaccc acacaggcag ctgcagggct tgtttgatct tcctgcaaaa 240 ggcacgcccg tcaacctcgc agtgcactgc gacgggcagc tgatcgtgct ggatagaaat 300 aacaaagaat gcacggttgc tcaggctcta ggcaacgggg ataaatttag ggccacagac 360 aagcgtgttg tagattctct ccgcgccatt tgtgctgatc tagaagggtc gagctctccg 420 ctccccaagg tcgcacacaa cttgggattt tatttctcac ctgatttaac acagtttgct 480 aaactcccag tagaacttgc acctcactgg cccgtggtgt caacccagaa caatgaaaag 540 tggccggatc ggctggttgc cagccttcgc cctatccata aatacagccg cgcgtgcatc 600 ggtgccggct atatggtggg cccttcggtg tttctaggca ctcctggggt cgtgtcatac 660 tatctcacaa aatttgttaa gggcggggct caagtgcttc cggagacggt tttcagcacc 720 ggccgaattg aggtagactg ccgggaatat cttgatgatc gggagcgaga agttgctgcg 780 tcc 783 <210> 14 <211> 774 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 14 gagcgagaag ttgctgcgtc cctcccacac ggtttcattg gcgacgtcaa aggcactacc 60 gttggaggat gtcatcatgt cacctccaga tacctcccgc gcgtccttcc caaggaatca 120 gttgcggtag tcggggtttc aagccccgga aaagccgcga aagcattgtg cacactgaca 180 gatgtgtacc tcccagatct tgaagcctat ctccacccgg agacccagtc caagtgctgg 240 aaaatgatgt tggacttcaa agaagttcga ctaatggtct ggaaagacaa aacagcctat 300 ttccaacttg aaggtcgcta tttcacctgg tatcagcttg ccagctatgc ctcgtacatc 360 cgtgttcccg tcaactctac ggtgtacttg gacccctgca tgggccccgc cctttgcaac 420 aggagagtcg tcgggtccac ccactggggg gctgacctcg cggtcacccc ttatgattac 480 ggcgctaaaa ttatcctgtc tagcgcgtac catggtgaaa tgccccccgg atacaaaatt 540 ctggcgtgcg cggagttctc gttggatgac ccagttaagt acaaacatac ctgggggttt 600 gaatcggata cagcgtatct gtatgagttc accggaaacg gtgaggactg ggaggattac 660 aatgatgcgt ttcgtgcgcg ccaggaaggg aaaatttata aggccactgc caccagcttg 720 aagttttatt ttcccccggg ccctgtcatt gaaccaactt taggcctgaa ttga 774

Claims (24)

1. PRRSV에 대항하는 면역반응을 유도할 수 있는 백신에 있어서,

   PRRSV ORF1 DNA의 첫 번째 부분, 상기 부분은 PRRSV ORF1 DNA로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드를 보유하고;

   적절한 약리학적 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
2. 제 1항에 있어서, 상기 부분은 SEQ ID No. l-14 중에서 임의의 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 보유하는 서열 및 이들의 조합에서 선택되는 서열로부터 적어도 150개의 연속 뉴클레오티드를 보유하는 것을 특징으로 하는 백신.
3. 제 2항에 있어서, 상기 부분은 SEQ ID No. l-6, 9, 10 중에서 임의의 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 보유하는 서열 및 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
4. 제 1항에 있어서, ORF1 이외의 PRRSV ORF로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, PRRSV ORF1로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, 이들의 조합에서 선택되는 PRRSV DNA의 일부분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
5. 제 1항에 있어서, PRRSV 감염에 대항하는 면역반응을 유도하는데 효과적인 다른 조성물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
6. 제 1항에 있어서, PRRSV ORF1은 PRRSV의 독성 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 백신.
7. 제 1항에 있어서, 어쥬번트, 부형제, 이들의 조합에서 선택되는 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
8. PRRSV 감염에 취약한 동물에서 PRRSV에 대항하는 면역반응을 유도하는 방법에 있어서,

   PRRSV ORF1 DNA의 일부분으로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 상기 동물에 투여하고;

   상기 면역반응을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역반응 유도 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 조성물의 두 번째 투여를 제공하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 면역반응 유도 방법.
10. 제 8항에 있어서, 상기 부분은 SEQ ID No. l-14 중에서 임의의 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 보유하는 서열 및 이들의 조합에서 선택되는 서열로부터 적 어도 150개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역반응 유도 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 부분은 SEQ ID No. l-6, 9, 10 중에서 임의의 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 보유하는 서열 및 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역반응 유도 방법.
12. 제 9항에 있어서, 조성물은 ORF1 이외의 PRRSV ORF로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, PRRSV ORF1로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, 이들의 조합에서 선택되는 두 번째 DNA 부분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역반응 유도 방법.
13. 제 9항에 있어서, 조성물은 PRRSV 감염에 대항하는 면역반응을 유도하는데 효과적인 두 번째 조성물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역반응 유도 방법.
14. 제 9항에 있어서, 조성물은 어쥬번트, 부형제, 이들의 조합에서 선택되는 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역반응 유도 방법.
15. PRRSV ORF1 DNA의 적어도 일부분을 포함하는 벡터.
16. 제 15항에 있어서, 플라스미드인 것을 특징으로 하는 벡터.
17. 제 15항에 있어서, PRRSV ORF1 DNA의 상기 부분은 PRRSV ORF1 DNA로부터 유래되는 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
18. 제 17항에 있어서, PRRSV ORF1 DNA의 상기 부분은 SEQ ID No. l-14 중에서 임의의 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 보유하는 서열 및 이들의 조합에서 선택되는 서열로부터 적어도 150개의 연속 뉴클레오티드를 보유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
19. 제 1항에 있어서, ORF1 이외의 PRRSV ORF로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, PRRSV ORF1로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, 이들의 조합에서 선택되는 PRRSV DNA의 두 번째 부분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
20. 제 15항에 있어서, PRRSV DNA는 PRRSV의 독성 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 벡터.
21. PRRSV ORF1 DNA로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 보유하는 세포.
22. 제 21항에 있어서, 상기 플라스미드는 SEQ ID No. l-14 중에서 임의의 하나와 적어도 85% 서열 동일성을 보유하는 서열 및 이들의 조합에서 선택되는 서열로부터 적어도 150개의 연속 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
23. 제 21항에 있어서, 상기 플라스미드는 ORF1 이외의 PRRSV ORF로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, PRRSV ORF1로부터 적어도 21개의 연속 뉴클레오티드, 이들의 조합에서 선택되는 PRRSV DNA의 두 번째 부분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
24. 제 21항에 있어서, PRRSV DNA는 PRRSV의 독성 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 세포.