KR20070001930A

KR20070001930A - Cytotoxicity assay

Info

Publication number: KR20070001930A
Application number: KR1020067014781A
Authority: KR
Inventors: 파멜라 던; 리웨이 히; 라스즐로 래드반니; 다니엘 살라
Original assignee: 사노피 파스퇴르 인크
Priority date: 2004-01-23
Filing date: 2005-01-21
Publication date: 2007-01-04
Also published as: JP2007522447A; CA2559394A1; ZA200605715B; BRPI0506488A; EP1706744A2; CN101065669A; AU2005224597A1; WO2005090990A2; WO2005090990A3; IL176938A0; MXPA06008336A

Abstract

본 발명은 세포독성 관련 효소의 절단을 검출하기 위하여, 유동세포분석법을 사용하여 CTL 활성을 검출하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for detecting CTL activity using flow cytometry to detect cleavage of cytotoxic enzymes.

Description

Cytotoxicity assay

⁵¹Cr 방출 분석은 30년이 넘는 동안 면역 반응 중의 CTL 활성을 측정하는 기본적인 전형이었다. 하지만, 이 분석법은 많은 기술적 제한을 갖고 있고 최근 실험 결과들에서는 Cr 방출 분석의 생리적 관련성 및 생체내 표적세포에 대해, 특히 충실성 종양에서 측정되는 CTL 활성의 진정한 척도인지의 여부가 의문시되고 있다. 시험관내 CTL 분석에서 표적세포는 다음과 같은 2가지 독특한 기작을 통해 용해가 유도될 수 있다: 1) 퍼포린(perforin)이 단순히 표적세포 막에 삽입될 때 매개되는 막용해(membranolyis) 과정; 및 2) 표적세포 표면에서 퍼포린 및/또는 소포 융합 사건을 통해 표적세포로 유입되는 그랜자임(Granzyme) B 및 그랜자임 A의 작용에 의해 유도되는 DNA 단편화(아폽토시스). 이러한 두 과정의 결과값 중 첫 번째 결과가 ⁵¹Cr 방출 분석에 의해 측정된다. 후자의 기작은 생리적 관련성이 더 커서 표 적세포 사멸이 생체 내에서 요구된다. 최근 관찰에서는 ⁵¹Cr 방출 분석에 의한 작동세포(effctor cell) 세포독성의 측정이 정확하지 않거나 또는 일부 경우에는 심지어 관련이 없을 수 있음이 시사되고 있다. 이러한 관찰에 근거하여 연구자는 ⁵¹Cr 방출 분석에 의해 세포독성으로 측정된 작동세포가 사실상 생체내에서 DNA 단편화를 통해 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 CTL이 아닐 수 있다는 사실을 인식하고 있어야 한다. 이것은 시험관내에서 모니터된 작동세포 반응이 환자 중에서의 백신 효능과 상관이 없을 수 있다는 암 면역요법 문헌의 많은 결과들을 설명하기도 한다. 예를 들어, ⁵¹Cr 방출 분석을 사용하여 수득된 양성 작동세포 세포독성 데이터에 의거하여 선발된 펩타이드 백신은 DNA 단편화를 통해 생체 내에서 CTL 용해를 유도하는 데 활성이 있는 실제 에피토프를 정확하게 반영하지 않을 수 있다. 또한, ⁵¹Cr-이용 분석의 사용을 곤란하게 하는 다수의 여타 문제로서, 유해 방사능 사용의 필요성 및 섬광계수기의 사용과 관련된 문제점 등도 있다. ^{The 51} Cr release assay has been the basic model for measuring CTL activity in immune responses for over 30 years. However, this assay has many technical limitations and recent experimental results question the physiological relevance of the Cr release assay and whether it is a true measure of CTL activity measured in target cells in vivo, especially in solid tumors. In vitro CTL analysis, target cells can be induced by lysis through two unique mechanisms: 1) a membranolyis process mediated when perforin is simply inserted into the target cell membrane; And 2) DNA fragmentation (apoptosis) induced by the action of Granzyme B and Granzyme A, which enter the target cell via Perforin and / or vesicle fusion events at the target cell surface. The first of these two results is measured by ⁵¹ Cr emission analysis. The latter mechanism is more physiologically related and requires target cell death in vivo. Recent observations suggest that measurement of effctor cell cytotoxicity by ⁵¹ Cr release assay may be inaccurate or in some cases even irrelevant. Based on these observations, the investigator should be aware that effector cells measured for cytotoxicity by the ⁵¹ Cr release assay may not actually be CTLs capable of killing tumor cells through DNA fragmentation in vivo. This also explains many of the results of the cancer immunotherapy literature that the effector cell response monitored in vitro may not be correlated with vaccine efficacy in patients. For example, peptide vaccines selected based on positive effector cytotoxicity data obtained using ⁵¹ Cr release assays will not accurately reflect the actual epitope active in inducing CTL lysis in vivo through DNA fragmentation. Can be. There are also a number of other problems that make the use of ⁵¹ Cr-use assays difficult, including the need for use of hazardous radioactivity and problems associated with the use of scintillation counters.

JAM 분석법은 ⁵¹Cr 방출의 일부 문제점을 해결한 더 새로운 방법이다. 이 방법이 DNA 단편화를 효과적으로 측정하기는 하지만, 표적세포의 DNA를 ³H-티미딘 또는 ¹²⁵I-데옥시우리딘과 같은 제제로 표지할 필요가 있는 심각한 문제점이 있다. 이 방법도 변함없이 DNA 손상을 유발하고 CTL 분석 전에 표적세포의 생리 반응을 변화시킨다. 또한, ³H-티미딘 표지화 방법은 ⁵¹Cr만큼의 동일한 감도를 제공하지 못하며 ¹²⁵I는 실험자 및 실험 지역을 모두 차폐시키는 상당한 납을 필요로 하는 유해 제제이다. 종합해보면, CTL 공격 동안 표적세포의 DNA 단편화 및 아폽토시스 유도를 측정하는 비-방사능 방법이 더욱 이상적인 분석법일 것이며, 특히 임상 시험 모니터링에 사용할 때에는 더욱 그러할 것이다.The JAM method is a newer method that solves some of the problems of ⁵¹ Cr release. Although this method effectively measures DNA fragmentation, there is a serious problem that requires labeling the DNA of target cells with agents such as ³ H-thymidine or ¹²⁵ I-deoxyuridine. This method invariably causes DNA damage and alters the physiological response of target cells prior to CTL analysis. In addition, the ³ H-thymidine labeling method does not provide the same sensitivity as ⁵¹ Cr and ¹²⁵ I is a hazardous agent that requires significant lead to mask both the experimenter and the experimental area. Taken together, non-radioactive methods of measuring DNA fragmentation and apoptosis induction of target cells during CTL challenge would be more ideal assays, especially when used for clinical trial monitoring.

또한, 세포독성 T 세포 활성의 측정에 형광발생성 카스파제 기질을 이용한 카스파제 절단 검출법이 사용된 바 있다(Liu et al., Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrate. Nature Medicine, Jan. 2003, 9(1): 4-5). 또한, 항원-특이적 CD8⁺ T 세포를 계수하기 위하여 다른 감도가 큰 방법이 도입되었고, 그 예로서 세포내 사이토카인 염색, ELISPOT 분석 및 I형 MHC 테트라머를 이용한 T 세포 염색 등이 있다. 하지만, 이러한 분석들은 항종양 면역 반응을 분석하는데 특히 중요한 궁극적인 세포용해 기능을 측정하지 못한다. 즉, 적당한 수준의 감도, 특이성, 안전성 및 사용 용이성을 제공하는 분석법이 부족한 실정이다. 이에, 본 발명은 CTL 활성을 검출하는 민감한 신규 분석 시스템을 제공한다.In addition, caspase cleavage detection using fluorogenic caspase substrates has been used to measure cytotoxic T cell activity (Liu et al., Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrate. Nature Medicine, Jan. 2003, 9 (1): 4-5). In addition, other highly sensitive methods have been introduced to count antigen-specific CD8 ⁺ T cells, such as intracellular cytokine staining, ELISPOT analysis and T cell staining with type I MHC tetramers. However, these assays do not measure the ultimate cytolytic function, which is particularly important for analyzing anti-tumor immune responses. That is, there is a lack of assays that provide adequate levels of sensitivity, specificity, safety and ease of use. Thus, the present invention provides a novel novel assay system for detecting CTL activity.

발명의 개요Summary of the Invention

본 발명은 작동세포와 접촉 후 표적세포에서 DNA 단편화 및/또는 아폽토시스 관련 변화를 검출하는 세포독성 분석법을 제공한다. 일 양태에서, 본 분석법은 카스파제 절단 또는 히스톤의 인산화를 측정하는 1 이상의 시약을 사용함으로써 수행 된다. 바람직한 양태에서, 카스파제 절단은 모노클로날 항체의 사용을 통해 검출된다. 다른 바람직한 양태에서, 히스톤의 인산화는 모노클로날 항체의 사용을 통해 검출된다. 다른 양태에서 절단된 카스파제 및/또는 인산화된 히스톤은 유동세포분석법과 함께 적어도 하나의 모노클로날 항체를 사용함으로써 검출된다.The present invention provides cytotoxicity assays for detecting DNA fragmentation and / or apoptosis related changes in target cells after contact with effector cells. In one aspect, the assay is performed by using one or more reagents to measure caspase cleavage or histone phosphorylation. In a preferred embodiment, caspase cleavage is detected through the use of monoclonal antibodies. In another preferred embodiment, phosphorylation of histones is detected through the use of monoclonal antibodies. In other embodiments cleaved caspases and / or phosphorylated histones are detected by using at least one monoclonal antibody in conjunction with flow cytometry.

도 1. 표적세포 표지화 염료의 안정성 및 표적세포에서 일어나는 카스파제 3-절단을 통해 Figure 1. Stability of target cell labeled dyes and through caspase 3-cleavage occurring in target cells CTLCTL 활성을 모니터하도록 개발된 Developed to monitor activity 게이팅Gating (gating) 전략.gating strategy.

A. DDAO-SE 세포 추적 염료는 CTL 표적세포주를 밝고 안정되게 표지한다. 일반적으로 사용되는 다수의 현탁 배양 및 유착 세포주, P815, EL4, T2 림프종, NIH 3T3, 4T1 유방암 및 B16F10 흑색종의 염색 결과를 나타낸다. 세포는 DDAO-SE로 염색한 뒤, 제시된 시간 간격(0h, 1h, 3h 또는 15h) 동안 배양한 후 FACS로 분석했다. 각 세포주마다 평균 형광 강도 및 변동 계수(CV)를 나타냈다. 유사한 두 실험 중 하나의 결과를 제시했다. A. DDAO-SE cell tracking dyes brightly and stably label CTL target cell lines. The results of staining of a number of commonly used suspension culture and adherent cell lines, P815, EL4, T2 lymphoma, NIH 3T3, 4T1 breast cancer and B16F10 melanoma are shown. Cells were stained with DDAO-SE and incubated for the indicated time intervals (0h, 1h, 3h or 15h) and analyzed by FACS. The mean fluorescence intensity and coefficient of variation (CV) were shown for each cell line. The results of one of two similar experiments are presented.

B. DDAO-SE 표지된 표적에서의 카스파제 3-절단을 계수하는 데 사용된 게이팅 전략. C57BL/6 항-Balb/c MLR 세포와 DDAO-SE 표지된 P815 세포의 일 예를 제시했다. 첫 번째 플롯은 전체 집단(R1)의 게이팅을 이용한 FSC 대 SSC 결과를 도시한 것이다. 그 다음 SSC 및 FSC 대 FL4 형광성(DDAO-SE 양성)을 이용하여 게이트 R1 세포를 분석했다. DDAO-SE 양성 세포는 적은 FSC(사멸) 세포를 제외하고는 제시된 바와 같이(R2 및 R3) 게이팅되었다. 그 다음 R2*R3 세포를 FL2(PE 표지된 절단 된 카스파제 3) 대 FL4(DDAO-SE)를 통해 분석하여 아폽토시스성 표적(R4)의 백분율을 측정했다. B. Gating strategy used to count caspase 3-cleavage at DDAO-SE labeled targets. An example of C57BL / 6 anti-Balb / c MLR cells and DDAO-SE labeled P815 cells is shown. The first plot shows the FSC vs. SSC results using the gating of the entire population (R1). Gate R1 cells were then analyzed using SSC and FSC versus FL4 fluorescent (DDAO-SE positive). DDAO-SE positive cells were gated as shown (R2 and R3) except for few FSC (killed) cells. R2 * R3 cells were then analyzed via FL2 (PE labeled cleaved caspase 3) to FL4 (DDAO-SE) to determine the percentage of apoptotic targets (R4).

도 2. Fig 2. 카스파제Caspase 3 절단 분석을 이용한 쥐의 3 Rats Using Cleavage Assays MLRMLR 에서의 In CTLCTL 활성 측정 및 Activity measurement and CTLCTL 에 의한 On by 퍼포린Perforin 및 And 그랜자임Granzyme 분비에 미치는 표적 중의 Of targets on secretion 카스파제Caspase 3 절단의 의존성. 3 dependence of cleavage.

C57BL/6 항-Balb/c 또는 Balb/c 항-C57BL/6 MLR 작동세포를 여러 시점(0.5h, 1h, 2h 및 3h)에서 표지된 P815 표적(A)과 항온배양한 뒤 제시된 바와 같이 카스파제 3 절단에 대해 염색했다. 카스파제 3 절단은 항-Balb/c MLR 작동세포에 의해서만 관찰되었다. Caspa as shown after incubating C57BL / 6 anti-Balb / c or Balb / c anti-C57BL / 6 MLR effector cells with labeled P815 target (A) at various time points (0.5 h, 1 h, 2 h and 3 h). Stained for the third cut. Caspase 3 cleavage was observed only by anti-Balb / c MLR effector cells.

B. P815 또는 DDAO-SE로 표지된 EL4 표적을 제시된 바와 같은 여러 시점에서 C57BL/6 항-Balb/c 또는 Balb/c 항-C57BL/6 MLR 작동세포와 항온배양했다. 카스파제 3 절단된 표적세포의 백분율을 제시했다. 결과는 MLR 작동세포가 H2 부정합 표적만을 사멸시키는 본 분석의 특이성을 나타냈다. 결과는 유사 결과를 나타내는 3회 실험의 대표값이다. B. EL4 targets labeled P815 or DDAO-SE were incubated with C57BL / 6 anti-Balb / c or Balb / c anti-C57BL / 6 MLR effector cells at various time points as shown. The percentage of caspase 3 cleaved target cells is shown. The results showed the specificity of this assay in which MLR effector cells killed only H2 mismatch targets. The results are representative of three experiments showing similar results.

C. CTL에 의한 세포용해성 과립 분비의 억제제인 콘카나마이신 A는 C57BL/6 항-Balb/c MLR 작동세포와 함께 항온배양된 P815 표적에서 카스파제 3 절단을 방해한다. 5일간의 MLR 배양물을 분리하여 순수(naive) 동계(syngeneic) C57BL/6 비장 림프구와 제시된 바와 같이 1:1, 1:3, 1:9의 비율로 희석하거나 또는 희석 없이 사용했다. 희석된 작동세포를 표지된 P815 세포와 항온배양했다. 대조군으로는 MLR 세포없이 순수 C57BL/6 비장 세포를 사용하거나 표지된 P815 세포만을 사용했다. 본 분석물을 3시간 후 카스파제 3 절단에 대해 염색했다.C. Concanamycin A, an inhibitor of cytolytic granule secretion by CTL, interferes with caspase 3 cleavage at P815 targets incubated with C57BL / 6 anti-Balb / c MLR effector cells. Five days of MLR cultures were isolated and used with naive syngeneic C57BL / 6 splenic lymphocytes with or without dilution at a ratio of 1: 1, 1: 3, 1: 9 as shown. Diluted effector cells were incubated with labeled P815 cells. As a control, pure C57BL / 6 spleen cells without MLR cells or only labeled P815 cells were used. This analyte was stained for caspase 3 cleavage after 3 hours.

도 3. 마우스에서의 Figure 3. In mice 펩타이드계Peptides 백신 반응 후 분리된 Isolated after vaccine reaction CTLCTL 및 쥐의 And of rat MLRMLR 작동세포를 이용하여 Using effector cells CTLCTL 활성을 모니터하는 To monitor activity ⁵¹⁵¹ CrCr 방출 및 Emission and 카스파제Caspase 3 절단 분석의 비교. Comparison of three cleavage assays.

A. 쥐 MLR(b→d) 유래의 작동세포를 100,000 P815 또는 EL4 표적세포(대조군)와 4h 분석에서 제시된 E:T 비율로 사용하여 항온배양했다. ⁵¹Cr 방출 분석에는 16:1의 희석물에서부터 시작하여 0.2:1까지 희석했고, 카스파제 3 절단 분석은 1:1과 0.1:1의 E:T 비율 사이에서 검사했다. 유사한 두 실험 중 하나의 결과를 제시했다. A. The effector cells from murine MLR (b → d) were incubated with 100,000 P815 or EL4 target cells (control) at the E: T ratio shown in the 4h assay. ⁵¹ Cr release assays were diluted starting at 16: 1 to 0.2: 1, and caspase 3 cleavage assays were checked between E: T ratios of 1: 1 and 0.1: 1. The results of one of two similar experiments are presented.

B. 카스파제 3 절단 분석은 펩타이드-면역화된 마우스에서의 회상(recall) 반응을 모니터하는 ⁵¹Cr 방출 분석과 동일한 확실성 및 특이성을 나타낸다. 마우스는 흑색종 TRP2 펩타이드로 면역화하고 제시된 E:T 비율에서 검사했다.The B. caspase 3 cleavage assay shows the same certainty and specificity as the ⁵¹ Cr release assay, which monitors the recall response in peptide-immunized mice. Mice were immunized with melanoma TRP2 peptide and tested at the indicated E: T ratio.

도 4. 마우스에서의 바이러스 벡터계 백신접종 후 카스파제 3-절단 CTL 분석을 이용한 CD8 ⁺ T 세포 반응의 모니터링은 IFN-γ ELISPOT 분석에서와 비슷한 결과를 제공한다. HLA-A2.1/K^b 유전자전이된(transgenic) 마우스를 ALVAC-gp 100으로 면역화하고 비장 세포를 gp100 펩타이드의 저장물(pool)로 5일 동안 재자극했다. 생존 세포를 분리하고, 20:1 E:T 비율에서 카스파제 3 절단을 사용하여 CTL 활성에 대해 검사하거나(좌측 패널), 또는 웰당 100,000개 세포를 사용한 ELISPOT 분석(우측 패널)에서 IFN-γ 생산에 대해 검사했다. 표적으로는 gp100 펩타이드로 펄 싱(pulsing)된 P815-A2/K^b 형질감염체 또는 대조군 A2 결합성 CMV pp65 펩타이드를 사용했다. 독립된 두 실험의 결과를 제시했다. 각 점들은 각각 백신접종된 마우스에서 측정된 결과를 나타낸다. 4. Monitoring of CD8 ⁺ T cell responses using caspase 3-cleaved CTL assay after viral vector based vaccination in mice gives similar results as in IFN-γ ELISPOT assay. HLA-A2.1 / K ^b transgenic mice were immunized with ALVAC-gp 100 and spleen cells were restimulated with a pool of gp100 peptides for 5 days. Surviving cells were isolated and tested for CTL activity using caspase 3 cleavage at 20: 1 E: T ratio (left panel), or IFN-γ production in an ELISPOT assay (right panel) with 100,000 cells per well. Checked for. Targets were either P815-A2 / K ^b transfectants or control A2 binding CMV pp65 peptides pulsed with gp100 peptide. The results of two independent experiments are presented. Each point represents the results measured in each vaccinated mouse.

도 5. 카스파제 3 절단 분석을 이용한 항원-특이적 사람 CD8 ⁺ T 세포 반응의 모니터링. 일차 펩타이드-특이적 사람 T 세포주를 기술된 바와 같이 펩타이드-펄싱된 자가 DC 및 활성화된 B 세포를 사용하여 HLA-A^*0201⁺ 제공자의 PBMC로부터 수득했다. T 세포를 CTL 활성에 대해 검사하기 전에 펩타이드-특이적 자극 실험을 4회 실시했다. 5. Monitoring of antigen-specific human CD8 ⁺ T cell response using caspase 3 cleavage assay . Primary peptide-specific human T cell lines were obtained from PLAC of HLA-A ^* 0201 ⁺ donor using peptide-pulsed autologous DCs and activated B cells as described. Four peptide-specific stimulation experiments were performed before T cells were tested for CTL activity.

A. 이종 항원-특이적(HIV rev 펩타이드) T 세포주에 대한 카스파제 3 절단 분석의 적용. T 세포를 수거하여 HIV rev 또는 CMV pp65 펩타이드로 펄싱되거나 펩타이드 처리되지 않은 DDAO-SE 표지된 T2 림프종 표적과 항온배양했다. 수득되는 T 세포를 순수 자가 PBMC로 1:1 또는 1:5의 비율로 희석한 다음, 100,000개의 펄싱된 표적과 1:1 비율로 혼합했다. 이러한 세포들을 제시된 바와 같이 1h 또는 3h 동안 항온배양하고 절단된 카스파제 3에 대해 염색했다. 표적세포만("T 단독")은 대조군으로 사용했다. 유사한 세 실험 중 하나의 결과를 제시했다. A. Application of Caspase 3 cleavage assays for heterologous antigen-specific (HIV rev peptide) T cell lines. T cells were harvested and incubated with DDAO-SE labeled T2 lymphoma targets that were not pulsed or peptide treated with HIV rev or CMV pp65 peptides. The resulting T cells were diluted 1: 1 or 1: 5 in pure autologous PBMC and then mixed in a 1: 1 ratio with 100,000 pulsed targets. These cells were incubated for 1 h or 3 h as shown and stained for cleaved caspase 3. Target cells only (“T alone”) were used as controls. The results of one of three similar experiments are presented.

B. 자가 항원-특이적(CEA CAP1 펩타이드) 사람 T 세포주에서의 CTL 활성을 카스파제 3 절단 분석 또는 Annexin-V + 7-AAD 염색 분석을 사용하여 측정했다. 작동세포를 순수 자가 PBMC 세포로 제시된 비율로 희석한 다음, CAP1-특이적 펩타이드 또는 비특이적 CMV pp65 펩타이드로 펄싱된 펩타이드-펄싱된 T2 세포와 혼합했 다. 표적세포 단독("T 단독") 및 제공자의 순수 PBMC를 음성 대조군으로 사용했다. 3h 항온배양의 결과를 제시했다. 1h 또는 4h 항온배양 후에도 유사한 결과가 수득되었다(제시 안됨). 유사한 두 실험 중 하나의 결과를 제시했다.B. Autologous Antigen-Specific (CEA CAP1 Peptides) CTL activity in human T cell lines was measured using Caspase 3 cleavage assay or Annexin-V + 7-AAD staining assay. The effector cells were diluted in the ratios presented as pure autologous PBMC cells and then mixed with peptide-pulsed T2 cells pulsed with CAP1-specific peptide or nonspecific CMV pp65 peptide. Target cells alone (“T only”) and donor's pure PBMCs were used as negative controls. The results of 3h incubation are presented. Similar results were obtained after 1 h or 4 h incubation (not shown). The results of one of two similar experiments are presented.

도 6. 카스파제 3 절단은 쥐의 CTL 활성을 모니터하는 감도가 큰 분석법이다. b→d MLR 유래의 비장 세포를 수거하여 DDAO-SE 표지된 P815 표적세포와 항온배양했다. MLR 작동세포를 제시된 비율로 순수 동계 비장 세포로 희석한 다음, P815 표적과 1:1 비율로 혼합했다. 100,000개 희석된 작동세포와 100,000 표적세포를 본 분석에 사용했다. 상단 패널(A)은 여러 희석율의 MLR 작동세포에서 FACS 분석한 후 DDAO-SE 대 카스파제 3 절단에 대한 점 플롯을 도시한 것이다. 표적세포와 혼합된 순수 B6 비장 세포는 음성 대조군으로 제시했다. Figure 6. Caspase 3 cleavage is a great sensitivity assay for monitoring CTL activity in mice. Splenocytes derived from b → d MLR were harvested and incubated with DDAO-SE labeled P815 target cells. MLR effector cells were diluted with pure syngeneic spleen cells in the indicated ratios and then mixed in 1: 1 ratio with the P815 target. 100,000 diluted working cells and 100,000 target cells were used in this assay. Top panel (A) shows dot plots for DDAO-SE versus caspase 3 cleavage after FACS analysis in MLR effector cells at various dilution rates. Pure B6 spleen cells mixed with target cells were presented as negative controls.

B. 제시된 b→d MLR 작동세포 희석율에서 카스파제 3 절단을 나타내는 독립된 두 실험 결과. 작동세포와 P815 표적세포는 2h 또는 4h 동안 항온배양한 뒤 절단된 카스파제 3에 대한 염색을 실시했다.B. Two independent experiments showing caspase 3 cleavage at the indicated b → d MLR effector cell dilution. The effector cells and P815 target cells were incubated for 2 h or 4 h and then stained for cut caspase 3.

도 7. 카스파제 3 절단은 HLA 펩타이드 펜타머로 염색된 TCR과 유사한 수준의 감도를 나타내는, 사람 CD8 ⁺ T 세포 활성을 모니터하는 감도가 큰 분석법이다. HLA-A^*0201-제한된 HIV gag 펩타이드-특이적 사람 T 세포주를 전술한 바와 같이 수득하고 CTL 활성에 대해 검사했다. T 세포를 제시된 비율로 순수 자가 PBMC로 희석한 뒤, 1:1 비율의 HIV 또는 CMV(특이성 대조군) 펩타이드-펄싱된 T2 표적을 첨가했다. 표적 단독 및 작동세포 없는 순수 PBMC를 음성 대조군으로 사용했다. Caspase 3 cleavage is a highly sensitive assay that monitors human CD8 ⁺ T cell activity , showing a level of sensitivity similar to TCR stained with HLA peptide pentamers . HLA-A ^* 021-limited HIV gag peptide-specific human T cell lines were obtained as described above and tested for CTL activity. T cells were diluted with pure autologous PBMC at the indicated ratios and then a 1: 1 ratio of HIV or CMV (specific control) peptide-pulsed T2 target was added. Pure PBMCs without target alone and effector cells were used as negative controls.

A. 점 플롯은 고도로 희석된 HIV gag 펩타이드-특이적 T 세포가 HIV gag 펩타이드 또는 비특이적 CMV pp65 펩타이드로 펄싱된 T2 세포와 항온배양되었을 때의 대표적 결과를 나타낸다. 카스파제 절단 백분율의 유의적인 차이는 심지어 1:199 희석율에서도 일정하게 측정되었다. A. Dot plots show representative results when highly diluted HIV gag peptide-specific T cells were incubated with T2 cells pulsed with HIV gag peptide or nonspecific CMV pp65 peptide. Significant differences in caspase cleavage percentages were consistently measured even at 1: 199 dilution.

B. 막대 그래프는 제시된 바와 같이 순수 PBMC로 희석된 HIV gag 펩타이드-특이적 T 세포주에서의 CTL 활성을 측정하는 카스파제 3 절단 분석을 검사하는 독립된 세 실험의 평균값 및 표준편차를 나타낸다. 각 경우마다 150,000개 희석된 작동세포를 150,000개 DDAO-SE 표지된 펩타이드-펄싱된 표적세포와 항온배양했다. 비교용으로서 동일한 T 세포를 HLA-gag 펩타이드 펜타머(ProImmune, Oxford, UK)로 염색하는 실험을 병행했다(C). 특이성 대조군으로서 CMV pp65 펩타이드-특이적 T 세포주를 사용했다. 카스파제 3 절단 분석과 펩타이드 분석을 비교하기 위하여 150,000개 게이팅된 T 세포를 각 데이터 점마다 수집했다(동일한 양의 작동세포를 CTL 분석에 첨가했다).B. Bar graphs show the mean and standard deviation of three independent experiments examining caspase 3 cleavage assays measuring CTL activity in HIV gag peptide-specific T cell lines diluted with pure PBMC as shown. In each case 150,000 diluted effector cells were incubated with 150,000 DDAO-SE labeled peptide-pulsed target cells. For comparison, experiments were performed in which the same T cells were stained with HLA-gag peptide pentamer (ProImmune, Oxford, UK) (C). CMV pp65 peptide-specific T cell lines were used as specific controls. To compare the Caspase 3 cleavage assay and the peptide assay, 150,000 gated T cells were collected at each data point (the same amount of effector cells was added to the CTL assay).

본 발명은 세포독성 분석을 수행하는 시약 및 분석법에 관한 것이다. 본 분석법은 T 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 과립구, 단핵구, 대식세포 등, 이에 국한되지 않는 면역 작동세포에 의해 매개되는 세포독성을 검출하는 데 적당하다. 본 분석법은 일반적으로 표적세포에서의 DNA 단편화 및/또는 아폽토시스 관련 변화의 측정을 기초로 한다. 예를 들어, 특정 양태에서는 아폽토시스 과정에 관련된 효소의 절단이 검출된다. 다른 양태에서는 아폽토시스 과정 중에 DNA 관련 단백질의 특성 변화가 검출된다. 이러한 변화들은 세포 형광성을 검출하는 장치, 예컨대 형광표지세포분리기(FACS) 또는 유동세포분석기를 이용한 검출에 적합하다.The present invention relates to reagents and assays for performing cytotoxicity assays. The assay is suitable for detecting cytotoxicity mediated by immune effector cells, including but not limited to T cells, natural killer (NK) cells, granulocytes, monocytes, macrophages, and the like. This assay is generally based on the measurement of DNA fragmentation and / or apoptosis related changes in target cells. For example, in certain embodiments cleavage of enzymes involved in the apoptosis process is detected. In another embodiment, changes in the properties of the DNA related proteins are detected during the apoptosis process. These changes are suitable for detection using an apparatus for detecting cell fluorescence such as a fluorescently labeled cell separator (FACS) or a flow cytometer.

일 양태에 따르면, 본 발명은 아폽토시스 과정 중에 하나 이상의 카스파제의 절단을 측정하는 분석법에 관한 것이다. 본원에서 밝혀진 바와 같이, 분석을 통한 검출에 적합할 수 있는 아폽토시스에서 일정 역할을 하는 것으로 밝혀진 카스파제에는 카스파제 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 14 등이 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 일 양태에 따르면, 카스파제 3은 본 명세서에 기술된 분석법에 의해 측정된다. 아폽토시스 과정 동안 절단되는 것으로 알려진 또 다른 효소는 폴리-ADP 리보스 폴리머라제(PARP)이다. 카스파제, 구체적으로 카스파제 3 및 PARP의 절단은 아폽토시스 중의 초기 사건이며 CTL 표적들 중에서 자극된다. 카스파제 및 PARP 절단 외에도, 다수의 세포내 기질이 아폽토시스 유도 중에 인산화된다. 예를 들어, 히스톤 H2A.X는 다양한 세포 계통에서 인산화된다. 절단된 카스파제에 대한 특이 결합능이 있는 항체 및 인산화된 히스톤 H2.AX에 대해 특이적인 항체는 시중에서 입수할 수 있고 본 발명을 실시하는데 사용하기에 적합하다.In one aspect, the invention relates to an assay for measuring cleavage of one or more caspases during the apoptosis process. As found herein, caspases found to play a role in apoptosis that may be suitable for detection through analysis include caspase 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, and the like, but are not limited to such. In one embodiment, Caspase 3 is measured by the assay described herein. Another enzyme known to be cleaved during the apoptosis process is poly-ADP ribose polymerase (PARP). Cleavage of caspases, specifically caspase 3 and PARP, is an early event in apoptosis and is stimulated among CTL targets. In addition to caspase and PARP cleavage, many intracellular substrates are phosphorylated during apoptosis induction. For example, histone H2A.X is phosphorylated in various cell lines. Antibodies specific for cleaved caspase and antibodies specific for phosphorylated histone H2.AX are commercially available and suitable for use in practicing the present invention.

특정 양태에서는 작동세포와 접촉하기 전에 표적세포의 염색을 위해 염료가 사용된다. 적당한 염료에는 Vial T, CFSE 및 DDAO-SE가 있고, 모두 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 염료는 DDAO-SE(Molecular Probes)이다. 다른 적당한 염료도 당업계에 공지되어 있고 본 발명을 실시하는데 유용하게 사용될 수 있다.In certain embodiments, dyes are used to stain target cells prior to contact with effector cells. Suitable dyes include Vial T, CFSE and DDAO-SE, all of which are known in the art. Preferred dyes are Molecular Probes (DDAO-SE). Other suitable dyes are also known in the art and may be usefully used in practicing the present invention.

일 양태에 따르면, 본 발명의 분석법은 1) 작동세포(E)를 제조하는 단계; 2) 표적세포(T)를 제조하고 형광 염료와 같은 검출성 마커로 세포를 태그화(tagging)하는 단계; 3) 상기 작동세포와 표적세포를 충분한 E:T 비율로 혼합하는 단계; 4) 이 혼합물을 적어도 일부의 작동세포가 적어도 일부의 표적세포에 대해 세포독성이 되기에 적합한 시간과 조건 하에 항온배양하는 단계; 5) 혼합 세포를 고정시키고 침투시키는 단계; 6) 아폽토시스 과정 동안 또는 아폽토시스 과정의 결과로 변화를 겪는 단백질 또는 이의 단편과 결합할 수 있는 능력이 있는 검출 시약으로 상기 세포를 염색하는 단계; 및 7) 상기 검출 시약을 검출하는 단계로 수행된다. 특정 양태에서, 검출 시약은 이 시약에 함유된 형광 태그 또는 잔기에 의해 측정되거나, 또는 상기 검출 시약에 결합하는 2차 시약을 측정하여 검출할 수 있는데, 이 2차 시약은 이 시약에 함유된 형광 태그 또는 잔기에 의해 검출될 수 있다. 바람직한 양태에서, 검출 시약 및/또는 2차 시약은 형광 표지될 수 있는 항체이다. 이러한 검출 시약은 FACS를 비롯하여 이에 제한되지 않는 여러 공지된 방법 중 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 바람직한 일 양태에서, 검출 시약은 항-카스파제 3 항체(예컨대, PE 접합된 모노클로날 토끼 항-활성 카스파제 3 항체, BD Pharmingen Catalog No. 550914)이다. 다른 적합한 시약도 당업계에 공지되어 있다.According to one aspect, the assay of the present invention comprises the steps of 1) preparing effector cells (E); 2) preparing target cells (T) and tagging the cells with a detectable marker such as a fluorescent dye; 3) mixing the effector and target cells in a sufficient E: T ratio; 4) incubating the mixture at a time and under conditions suitable for the at least some effector cells to be cytotoxic to at least some target cells; 5) immobilizing and infiltrating the mixed cells; 6) staining said cells with a detection reagent capable of binding a protein or fragment thereof that undergoes a change during or as a result of the apoptosis process; And 7) detecting the detection reagent. In certain embodiments, the detection reagent can be detected by measuring a fluorescent tag or moiety contained in the reagent or by measuring a secondary reagent that binds to the detection reagent, wherein the secondary reagent can be detected by fluorescence contained in the reagent. It can be detected by a tag or a residue. In a preferred embodiment, the detection reagent and / or secondary reagent is an antibody that can be fluorescently labeled. Such detection reagents can be detected by any of several known methods, including but not limited to FACS. In one preferred aspect, the detection reagent is an anti-caspase 3 antibody (eg, PE conjugated monoclonal rabbit anti-active caspase 3 antibody, BD Pharmingen Catalog No. 550914). Other suitable reagents are also known in the art.

특정 양태에 따르면, 표적세포의 염색 및/또는 표적세포와 작동세포의 혼합 전에, 작동세포가 반응할 수 있는 펩타이드와 표적세포를 접촉 또는 "펄싱"하는 것이 유리하거나 바람직할 수 있다. 예를 들어, 표적세포는 HIV와 같은 감염 인자 또는 종양 항원의 아미노산 서열에 상응하는 펩타이드로 펄싱될 수 있다. 적당한 종양 항원에는 gp100(Cox et al., Science, 264:716-719(1994)), MART-1/Melan A (Kawakami et al., J. Exp. Med., 180:347-352 (1994)), gp75 (TRP-I) (Wang et al., J. Exp. Med., 186:1131-1140 (1996)), 티로시나제(Wolfel et al., Eur. J. Immunol, 24:759-764(1994)), NY-ESO-I (WO 98/14464; WO 99/18206), 흑색종 프로테오글리칸(Hellstrom et al., J. Immunol., 130:1467-1472 (1983)), MAGE 계열 항원(즉, MAGE-1,2,3,4,6 및 12; Van der Bruggen et al., Science, 254:1643-1647 (1991); 미국 특허 6,235,525), BAGE 계열 항원(Boel et al., Immunity, 2:167-175 (1995)), GAGE 계열 항원(즉, GAGE-1,2; Van den Eynde et al., J. Exp. Med., 182:689-698 (1995); 미국 특허 6,013,765), RAGE 계열 항원(즉, RAGE-1; Gaugler et at., Immunogenetics, 44:323-330(1996); 미국 특허 5,939,526), N-아세틸글루코스아미닐트란스퍼라제-V(Guilloux et al., J. Exp. Med., 183 : 1173-1183(1996)), p15(Robbins et al., J. Immunol. 154:5944-5950(1995)), β-카테닌(Robbins et al., J. Exp. Med., 183:1185-1192(1996)), MUM-1(Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7976-7980(1995)), 사이클린 의존적 키나제-4(CDK4)(Wolfel et al., Science, 269:1281-1284(1995)), p21-ras(Fossum et at, Int. J. Cancer, 56:40-45 (1994)), BCR-abl(Bocchia et al., Blood, 85:2680-2684(1995)), p53(Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11993-11997 (1995)), p185 HER2/neu (erb-Bl; Fisk et al., J. Exp. Med., 181:2109-2117 (1995)), 표피 성장인자 수용체(EGFR)(Harris et al., Breast Cancer Res. Treat, 29:1-2(1994)), 암배아 항원(CEA)(Kwong et al., J. Natl. Cancer Inst., 85:982-990 (1995) 미국 특허 5,756,103; 5,274,087; 5,571,710; 6,071,716; 5,698,530; 6,045,802; EP 263933; EP 346710; 및 EP 784483); 암종 관련 변이된 뮤신(즉, MUC-I 유전자 산물; Jerome et al., J. Immunol., 151:1654-1662 (1993)); EBV의 EBNA 유전자 산물(즉, EBNA-1; Rickinson et al., Cancer Surveys, 13:53-80 (1992)); 사람 유두종바이러스의 E7, E6 단백질(Ressing et al., J. Immunol, 154:5934-5943(1995)); 전립선-특이적 항원(PSA; Xue et al., The Prostate, 30:73-78(1997)); 전립선-특이적 막 항원(PSMA; Israeli, et al., Cancer Res., 54:1807-1811 (1994)); 이디오타입(iodiotypic) 에피토프 또는 항원, 예컨대 면역글로불린 이디오타입 또는 T 세포 수용체 이디오타입(Chen et al., J. Immunol, 153:4775-4787 (1994)); KSA(미국 특허 5,348,887), 키네신 2(Dietz, et al. Biochem Biophys Res Commun 2000 Sep 7;275(3):731-8), HIP-55, TGFβ-1 항-아폽토시스 인자(Toomey, et al. Br J Biomed Sci 2001;58(3):177-83), 종양 단백질 D52(Bryne J.A., et al., Genomics, 35:523-532 (1996)), HlFT, NY-BR-1(WO 01/47959), NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, NY-BR-87 및 NY-BR-96(Scanlan, M. Serologic and Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens, in Cancer Vaccines 2000, Cancer Research Institute, New York, NY) 의 야생형, 변형 형태 및 돌연변이 형태 등이 포함된다. In certain embodiments, it may be advantageous or desirable to contact or “pulse” a target cell with a peptide to which the effector cell can react prior to staining the target cell and / or mixing the target cell with the effector cell. For example, the target cell can be pulsed with a peptide corresponding to the amino acid sequence of an infectious agent or tumor antigen such as HIV. Suitable tumor antigens include gp100 (Cox et al., Science, 264: 716-719 (1994)), MART-1 / Melan A (Kawakami et al., J. Exp. Med., 180: 347-352 (1994) ), gp75 (TRP-I) (Wang et al., J. Exp. Med., 186: 1131-1140 (1996)), tyrosinase (Wolfel et al., Eur. J. Immunol, 24: 759-764 ( 1994)), NY-ESO-I (WO 98/14464; WO 99/18206), melanoma proteoglycans (Hellstrom et al., J. Immunol., 130: 1467-1472 (1983)), MAGE family antigens (ie , MAGE-1,2,3,4,6 and 12; Van der Bruggen et al., Science, 254: 1643-1647 (1991); US Pat. No. 6,235,525), BAGE family antigen (Boel et al., Immunity, 2 : 167-175 (1995)), GAGE family antigens (ie, GAGE-1,2; Van den Eynde et al., J. Exp. Med., 182: 689-698 (1995); US Pat. No. 6,013,765), RAGE Family antigens (ie RAGE-1; Gaugler et at., Immunogenetics, 44: 323-330 (1996); US Pat. No. 5,939,526), N-acetylglucoamiminyltransferase-V (Guilloux et al., J. Exp Med., 183: 1173-1183 (1996)), p15 (Robbins et al., J. Immunol. 154: 5944-5950 (1995)), β-catenin (Robbins et al. , J. Exp. Med., 183: 1185-1192 (1996)), MUM-1 (Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7976-7980 (1995)), cyclin dependent Kinase-4 (CDK4) (Wolfel et al., Science, 269: 1281-1284 (1995)), p21-ras (Fossum et at, Int. J. Cancer, 56: 40-45 (1994)), BCR-abl (Bocchia et al., Blood, 85: 2680-2684 (1995)), p53 (Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11993-11997 (1995)), p185 HER2 / neu (erb-Bl; Fisk et al., J. Exp. Med., 181: 2109-2117 (1995)), epidermal growth factor receptor (EGFR) (Harris et al., Breast Cancer Res. Treat, 29: 1-2 (1994)), cancer embryonic antigen (CEA) (Kwong et al., J. Natl. Cancer Inst., 85: 982-990 (1995) U.S. Patents 5,756,103; 5,274,087; 5,571,710; 6,071,716; 5,698,530; 6,045,802; EP 263933; EP 346710; and EP 784483); Carcinoma related mutated mucins (ie, MUC-I gene products; Jerome et al., J. Immunol., 151: 1654-1662 (1993)); EBNA gene product of EBV (ie, EBNA-1; Rickinson et al., Cancer Surveys, 13: 53-80 (1992)); E7, E6 proteins of human papillomavirus (Ressing et al., J. Immunol, 154: 5934-5943 (1995)); Prostate-specific antigen (PSA; Xue et al., The Prostate, 30: 73-78 (1997)); Prostate-specific membrane antigen (PSMA; Israeli, et al., Cancer Res., 54: 1807-1811 (1994)); Idiotypic epitopes or antigens, such as immunoglobulin idiotypes or T cell receptor idiotypes (Chen et al., J. Immunol, 153: 4775-4787 (1994)); KSA (US Pat. No. 5,348,887), kinesin 2 (Dietz, et al. Biochem Biophys Res Commun 2000 Sep 7; 275 (3): 731-8), HIP-55, TGFβ-1 anti-apoptotic factor (Toomey, et al. Br J Biomed Sci 2001; 58 (3): 177-83), tumor protein D52 (Bryne JA, et al., Genomics, 35: 523-532 (1996)), HlFT, NY-BR-1 (WO 01 / 47959), NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, NY-BR-87 and NY-BR-96 (Scanlan, M. Serologic and Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens, in Cancer Vaccines 2000, Cancer Research Institute, New York, NY).

특정 양태에 따르면, 표적세포와 작동세포가 배양될 수 있는 시간이 변경될 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 추가 분석에 앞서서 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간 또는 그 이상 동안 배양하는 것이 바람직할 수 있다. In certain embodiments, the time for which target cells and effector cells can be cultured can be varied. For example, the mixture may be incubated for 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours or more prior to further analysis.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 본 명세서에 기술된 분석법을 실시하는 키트가 제공된다. 키트는 작동세포를 제조하는데 유용한 물질, 적당한 수의 작동세포, 표적세포를 염색하는 형광 염료, 표적세포와 작동세포가 혼합 및 배양될 수 있는 96웰 평판과 같은 장치, 세포의 고정화 및 침투화에 필요한 물질, 검출 시약 및/또는 2차 시약을 포함한다. 이러한 물질의 여러 조합이 본 발명의 분석법을 수행하는데 있어서 당업자를 돕기 위하여 키트로서 구성될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a kit is provided for carrying out the assay described herein. Kits are useful for the preparation of effector cells, suitable number of effector cells, fluorescent dyes that stain target cells, devices such as 96-well plates on which target and effector cells can be mixed and cultured, immobilization and infiltration of cells. Necessary materials, detection reagents and / or secondary reagents. Various combinations of these materials can be configured as kits to assist those skilled in the art in carrying out the assays of the present invention.

본 발명 및 이의 많은 장점들에 대해서는 예시적으로 제시된 이하 실시예를 통해 더 상세히 이해될 수 있을 것이다.The invention and its many advantages will be understood in more detail by the following examples which are presented by way of example.

실시예 1Example 1

재료 및 방법Materials and methods

A. 시약 및 세포 배양 배지A. Reagents and Cell Culture Media

항-절단 카스파제 3(사람 및 마우스 단백질 모두에 대해 반응성이다)은 피코에리트린(PE)로 표지되어 있고 BD 바이오사이언스(BD Biosciences: Mississauga, ON)에서 구입했다. 항-포스포히스톤 H2A.X-FITC는 업스테이트 셀 시그널링 솔류션스(Upstate Cell Signaling Solutions: Lake Placid, NY)에서 구입했다. 세포 추적 염료 DDAO-SE는 몰리큘라 프로브스(Molecular Probes: Eugene, OR)에서 구입했다. 모든 세포 배양 배지는 인비트로겐(Invitrogen: Mississauga, ON)에서 구입했다. 사이토카인(IL-2, IL-12 및 IL-6)은 알앤디 시스템스(R&D Systems: Minneapolis, MN)에서 구입했다. 사람 및 마우스 IFN-γ ELISPOT 분석용 항-IFN-γ 항체 쌍은 MabTech(Amsterdam, NL) 및 BD 바이오사이언스(Mississauga, ON)에서 각각 구입했다. ⁵¹Cr(⁵¹크롬산 나트륨)은 아머샴(Amersham: Toronto, Ontario)에서 구입했다. 본 실험에는 다음과 같은 HLA-A2.1 결합성 펩타이드 및 쥐의 H-2K^b 결합성 펩타이드를 사용했다: ILKEPVHGV (HIV rev), SLYNTVATL (HIV gag), YLSGANLNL (CEA 종양 항원 CAPl 에피토프), IMDQVPVSV, YLEPGPVTV, KTWGQYWQV (gplOO 흑색종 에피토프), NLVPMVATV (CMV pp65 에피토프), DAPIYTNV(β-갈락토시다제 H-2K^b 에피토프), TPHPARIGL(β-갈락토시다제 H-2L^d), 및 TLDSQVMSL(TRP-2 흑색종 에피토프). 펩타이드들은 396 Multiple Biomolecular Synthesizer(Advanced Chemtech, Louisville, KY)로 합성하고 HPLC로 정제했다. ALVAC-gal 및 ALVAC-gplOO은 종래 기술(Ferrari et al., 1997)된 바와 같이 병아리 배아 섬유아세포(CEF)에서 증가시키고 용균된 세포로부터 슈크로스 쿠션 상에서의 원심분리로 정제했다. 바이러스 역가(플라크 형성 단위, pfu)는 종래 문헌(Santra et al., 2002)에 기술된 바와 같이 CEF로 측정되었다. Anti-cutting caspase 3 (reactive for both human and mouse proteins) is labeled with phycoerythrin (PE) and was purchased from BD Biosciences: Mississauga, ON. Anti-phosphohistone H2A.X-FITC was purchased from Upstate Cell Signaling Solutions (Lake Placid, NY). Cell tracking dye DDAO-SE was purchased from Molecular Probes (Eugene, OR). All cell culture media was purchased from Invitrogen (Mississauga, ON). Cytokines (IL-2, IL-12 and IL-6) were purchased from R & D Systems (Minneapolis, Minn.). Anti-IFN-γ antibody pairs for human and mouse IFN-γ ELISPOT assays were purchased from MabTech (Amsterdam, NL) and BD Biosciences (Mississauga, ON), respectively. ⁵¹ Cr ( ⁵¹ Sodium Chromate) was purchased from Amersham: Toronto, Ontario. The following HLA-A2.1 binding peptides and murine H-2K ^b binding peptides were used in this experiment: ILKEPVHGV (HIV rev), SLYNTVATL (HIV gag), YLSGANLNL (CEA tumor antigen CAPl epitope), IMDQVPVSV , YLEPGPVTV, KTWGQYWQV (gplOO melanoma epitope), NLVPMVATV (CMV pp65 epitope), DAPIYTNV (β-galactosidase H-2K ^b epitope), TPHPARIGL (β-galactosidase H-2L ^d ), and TLDSQVM TRP-2 melanoma epitope). Peptides were synthesized with 396 Multiple Biomolecular Synthesizer (Advanced Chemtech, Louisville, KY) and purified by HPLC. ALVAC-gal and ALVAC-gplOO were increased in chick embryo fibroblasts (CEF) and purified from lysed cells by centrifugation on sucrose cushions as previously described (Ferrari et al., 1997). Virus titers (plaque forming units, pfu) were measured by CEF as described in the prior art (Santra et al., 2002).

B. 마우스B. Mouse

Balb/c 및 C57BL/6 마우스는 챨스 리버(Charles River: Montreal, QC)에서 구입했다. HLA-A2.1/K^b 유전자전이된 마우스는 종래 기술된 바와 같이 제조했다(Borenstein et al., 2000). 마우스는 모두 캐나다 동물 보호협회(CACC) 지침을 고수하는 아방티스 파스퇴르(Aventis Pasteur: Sunnybrook Campus, Toronto, ON)의 동물 자원부에서 마이크로아이솔레이터(microisolator) 우리의 특정 병원균이 없는(SPF) 조건 하에서 사육했다. Balb / c and C57BL / 6 mice were purchased from Charles River, Montreal, QC. HLA-A2.1 / K ^b transgenic mice were prepared as described previously (Borenstein et al., 2000). All mice were bred under our specific pathogen-free (SPF) conditions at the Animal Resources Department of Aventis Pasteur: Sunnybrook Campus, Toronto, ON, which adheres to the Canadian Animal Protection Association (CACC) guidelines. .

C. 사람 C. Person PBMCPBMC 제조물 Manufacture

사람 PBMC는 Ficoll-Hypaque 구배 원심분리(Sigma, St.Louis, MO)를 이용하여 류코페리시스(leukopherisis) 제공자로부터 수득했다. 혈액 산물은 모두 제공자의 완전한 동의를 얻어 협회(IRB)의 지침에 따라 서니브룩 여성 보건 과학 센터(Sunnybrook and Women's Health Sciences Center, Toronto, ON)에서 수집했다. 제공자는 먼저 DNA 서열분석을 이용하여 HLA-A^*0201에 대해 선별되었고, 양성 개체만이 류코페리시스 수집에 사용되었다.Human PBMCs were obtained from leukopherisis providers using Ficoll-Hypaque gradient centrifugation (Sigma, St. Louis, MO). All blood products were collected at the Sunnybrook and Women's Health Sciences Center, Toronto, ON with the provider's full consent and in accordance with the guidelines of the Association (IRB). The donors were first selected for HLA-A ^* 0201 using DNA sequencing, and only positive individuals were used for leucoperisis collection.

D. 쥐의 D. Rat MLRMLR 및 작동세포 및 표적세포의 제조 And preparation of effector and target cells

C57BL/6 또는 Balb/c 마우스 유래의 비장을 마우스 세포 배양 배지(α-MEM, 10% FCS, 50μM 머캅토에탄올, 1mM Glutamax, 페니실린-스트렙토마이신)에 수확한 후, 스토마커기(Stomacher 80 Biomaster, UK)를 사용하여 세포 현탁액을 제조했다. 이 세포 현탁액을 소공 크기가 70㎛인 여과기(strainer)(BD Biosciences)를 통해 여과했다. 세포를 세척하고 배양 배지에 재현탁시켰다. 자극 세포는 2000 Rad(Gammacell^®1000 Eliter, MDS Nordion)에서 방사선 조사하고 배양 배지로 1회 세척한 뒤 배지에 10x10⁶ 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 반응 세포(20x10⁶ 세포) 및 방사선 조사된 자극 세포(20x10⁶ 세포)는 총 20ml의 양으로 직립형 T-25 플라스크에 첨가했다. 배양물을 5일 동안 항온배양하고 Lympholyte-M(Cedarlane Labs, Canada) 위에서 100xg로 20분 동안 원심분리하여 생존 세포를 수거했다. 세포를 배양 배지에서 1.5x10⁶/ml로 세척했다.Spleens derived from C57BL / 6 or Balb / c mice were harvested in mouse cell culture medium (α-MEM, 10% FCS, 50 μM mercaptoethanol, 1 mM Glutamax, penicillin-streptomycin), followed by a Stomacher 80 Biomaster , UK) to prepare cell suspensions. This cell suspension was filtered through a strainer (BD Biosciences) with a pore size of 70 μm. Cells were washed and resuspended in culture medium. Stimulated cells ^{2000 Rad (Gammacell ® 1000 Eliter,} MDS Nordion) was irradiated to reproduce in the culture medium after concentration of 10x10 ⁶ cells / ml in culture medium were washed once suspended from. Reaction cells (20 × 10 ⁶ cells) and irradiated stimulating cells (20 × 10 ⁶ cells) were added to an upright T-25 flask in an amount of 20 ml in total. Cultures were incubated for 5 days and centrifuged at 100 × g for 20 minutes on Lympholyte-M (Cedarlane Labs, Canada) to harvest viable cells. The cells were washed at 1.5 × 10 ⁶ / ml in culture medium.

E. 마우스 면역화 연구 및 E. Mouse Immunization Studies and 시험관내In vitro T 세포 재자극 T cell restimulation

펩타이드 면역화는 사람 주기(Period) 1 유전자 유래의 트랜스사이토시스(transcytosis) 펩타이드에 결합시킨 흑색종 H-2^b 결합성 TRP-2 종양 항원 펩타이드를 사용하여 수행했다. 이 서열은 APC에서 TRP-2 서열의 흡수를 유도하고 강력한 항-펩타이드 CTL 반응을 유도한다. C57BL/6 마우스에 TRP-2 펩타이드 50㎍를 피하 주사하여 면역화하고 3주 후에 추가접종(boosting)했다. 추가접종 3주 후에 비장을 수거하고, 이 비장 세포를 TRP-2 펩타이드로 5일 동안 재자극한 뒤, ⁵¹Cr 방출 분석 또는 카스파제 3 절단 분석을 사용하여 CTL 분석을 실시했다. 카나리폭스(canarypox) 바이러스 벡터(ALVAC-gp100)를 사용한 면역화는 HLA-A2.1/K^b 유전자전이된 마우스(Borenstein et al., 2000)에 피하 주사로 실시했다. 마우스를 2x10⁷ pfu의 ALVAC-gp100으로 면역화한 다음 2주 후 동일 용량을 추가 접종했다. 비장세 포는 추가 접종 후 5주 후와 7주 후에 수거한 뒤, 우성 HLA-A2.1 결합성 gp100 펩타이드(IMDQVPVSV, YLEPGPVTV 및 KTWGQYWQV) 저장물 0.2㎍/ml/펩타이드로 5일 동안 재자극했다(5x10⁶ 세포/웰, 24웰 평판 중에서). 세포를 수거하고 IFN-γ ELISPOT 또는 카스파제 3 절단 분석법을 사용하여 분석을 실시했다. ELISPOT 분석은 HLA-A2/K^b 발현 플라스미드로 안정되게 형질감염된 10,000개 gp100 펩타이드-펄싱된(2㎍/ml) P815와 100,000개 재활성화된 비장 세포를 혼합하여 실시했다.Peptide immunization was performed using melanoma H- ^2b binding TRP-2 tumor antigen peptides bound to transcytosis peptides derived from the Human Cycle 1 gene. This sequence induces uptake of the TRP-2 sequence in APC and induces a potent anti-peptide CTL response. C57BL / 6 mice were immunized subcutaneously with 50 μg of TRP-2 peptide and boosted three weeks later. Three weeks after booster spleens were harvested and the spleen cells were restimulated with TRP-2 peptide for 5 days, followed by CTL analysis using ⁵¹ Cr release assay or caspase 3 cleavage assay. Immunization with canarypox virus vector (ALVAC-gp100) was performed by subcutaneous injection in HLA-A2.1 / K ^b transgenic mice (Borenstein et al., 2000). Mice were immunized with 2 × 10 ⁷ pfu of ALVAC-gp100 and then boosted at the same dose two weeks later. Spleen cells were harvested 5 and 7 weeks post booster and then re-stimulated for 5 days with 0.2 μg / ml / peptide stock of dominant HLA-A2.1 binding gp100 peptide (IMDQVPVSV, YLEPGPVTV and KTWGQYWQV). (5 × 10 ⁶ cells / well in 24-well plates). Cells were harvested and analyzed using IFN-γ ELISPOT or Caspase 3 cleavage assay. ELISPOT analysis was performed by mixing 10,000 gp100 peptide-pulsed (2 μg / ml) P815 with 100,000 reactivated spleen cells stably transfected with an HLA-A2 / K ^b expression plasmid.

F. 사람 F. Person 펩타이드Peptide -특이적 T 세포 생산-Specific T cell production

T 세포 농축된 PBMC(PBMC의 플라스틱 부착성 음성 분획)를, 아이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), 1mM Glutamax, 1mM 피루베이트(Invitrogen, Mississauga, ON), 5% 사람 AB 혈청, 50μM 2-머캅토에탄올, 20㎍/ml 젠타마이신으로 이루어진 사람 T 세포 배양 배지(HTC-CM)에 함유된 펩타이드-펄싱된 자가 성숙 수지상 세포(DC)를 사용하여 자극했다. 성숙 DC는, 2% 사람 AB 혈청, 1,000U/ml GM-CSF, 1,000 U/ml IL-4, 4ng/ml TNF-α 및 100U IFN-α를 함유하는 HTC-CM을 사용하여 유착성 단핵구로부터 6일이 지나서 1단계 프로토콜에 따라 제조했다. DC를 수거하고 세척한 뒤 펩타이드 10㎍/ml로 펄싱했다. T 세포 생산을 위해 다음과 같은 HLA-A2.1 결합성 노나머 펩타이드를 사용했다: HIV rev 펩타이드(ILKEPVHGV), HIV gag 펩타이드(SLYNTNATL) 및 CEA 종양 항원 유래의 CAP1 에피토프(YLSGANLNL). 이러한 펩타이드들은 이미 HLA-A2.1에 결합하고 HLA-A2.1-제한된 CD8⁺ T 세포 반응을 유도하는 것으로 입증된 바 있다(Stuber et al., 1992; Herr et al., 1996; Zaremba et al., 1997). 펄싱된 DC를 세척하고, 24웰 평판에서 T 세포 농축된 자가 PBMC(T 세포)를 자극하기 위해, 0.6x10⁶ 개의 펄싱된 DC와 6x10⁶개의 T 세포의 비율로 사용했다. IL-2(10U/ml), IL-7(5ng/ml), IL-6(1,000U/ml) 및 IL-12(10ng/ml)를 배양 개시 때 첨가하고, 4일 후 세포에 IL-2(추가 10U/ml)를 첨가했다. 1차 활성화는 10 내지 12일 동안 실시하고, 그 다음 종래 기술(Schultze et al., 1997)된 바와 같이 생산된 펩타이드-펄싱된 CD40 리간드-활성화된 자가 B 림프구를 사용하여 2 내지 3회 재자극했다. 3차 또는 4차 자극 5일 후에 작동세포 분석(카스파제 3 절단, IFN-γ ELISPOT, Annexin-V/7-AAD를 이용한 CTL 분석 및 HLA-펜타머 염색)을 실시했다. 몇몇 경우에는 활성화된 T 세포를 분석에 앞서 제시된 바와 같이 순수 자가 PBMC로 희석했다.T cell enriched PBMC (plastic adherent negative fraction of PBMC) was obtained from Iscove's Modified Dulbecco's Medium, 1 mM Glutamax, 1 mM Pyruvate (Invitrogen, Mississauga, ON), 5% human AB serum, 50 μM Stimulation was performed using peptide-pulsed autologous mature dendritic cells (DCs) contained in human T cell culture medium (HTC-CM) consisting of 2-mercaptoethanol, 20 μg / ml gentamycin. Mature DCs were obtained from adherent monocytes using HTC-CM containing 2% human AB serum, 1,000 U / ml GM-CSF, 1,000 U / ml IL-4, 4 ng / ml TNF-α and 100 U IFN-α. Six days later it was prepared according to the one-step protocol. DCs were harvested, washed and pulsed with 10 μg / ml of peptide. The following HLA-A2.1 binding nonamer peptides were used for T cell production: HIV rev peptide (ILKEPVHGV), HIV gag peptide (SLYNTNATL) and CAP1 epitope (YLSGANLNL) from CEA tumor antigen. These peptides have already been demonstrated to bind HLA-A2.1 and induce HLA-A2.1-restricted CD8 ⁺ T cell responses (Stuber et al., 1992; Herr et al., 1996; Zaremba et al. , 1997). The washed and the pulsed DC, T cells in 24 well plates and concentrated woman to stimulate PBMC (T cells), was used at a rate of pulsing of the DC 0.6x10 ⁶ and 6x10 ⁶ of T cells. IL-2 (10 U / ml), IL-7 (5 ng / ml), IL-6 (1,000 U / ml) and IL-12 (10 ng / ml) were added at the start of the culture and after 4 days the cells were IL- 2 (additional 10 U / ml) was added. Primary activation is performed for 10-12 days and then re-stimulated 2-3 times using peptide-pulsed CD40 ligand-activated autologous B lymphocytes produced as described in the prior art (Schultze et al., 1997). did. Five days after the third or fourth stimulation, effector cell analysis (Caspase 3 cleavage, IFN-γ ELISPOT, CTL analysis using Annexin-V / 7-AAD and HLA-pentamer staining) were performed. In some cases, activated T cells were diluted with pure autologous PBMC as indicated prior to analysis.

G. G. 카스파제Caspase 3 절단 분석 및 염색 방법론 3 Cleavage Analysis and Staining Methodology

1. 표적세포 표지화 및 펩타이드 - 펄싱 . 수거된 표적세포(P815, EL4, T2 림프종 세포)를 D-PBS로 1회 세척했다. 세포를, D-PBS중에 0.6μM DDAO-SE(Molecular Probes, Eugene, OR)를 함유하는 표지화 완충액에서 5x10⁶/ml로 재현탁시키고 37℃에서 15분 동안 항온배양했다. 세포를 배양 배지로 세척한 뒤 배지에 2x10⁶개 세포/ml의 농도로 재현탁시킨 후, 1 내지 3㎍/ml 농도의 제시된 펩타이드로 1시간 동안 펄싱했다. 펄싱된 표적을 배양 배지에서 1회 세척하고 1x10⁶ 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 1. Target Cell Labeling and Peptide - Pulsing . Harvested target cells (P815, EL4, T2 lymphoma cells) were washed once with D-PBS. Cells were resuspended at 5 × 10 ⁶ / ml in labeling buffer containing 0.6 μM DDAO-SE (Molecular Probes, Eugene, OR) in D-PBS and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. The cells were washed with culture medium and then resuspended in medium at a concentration of 2 × 10 ⁶ cells / ml, followed by pulsing with the indicated peptides at a concentration of 1-3 μg / ml for 1 hour. The pulsed target was washed once in culture medium and resuspended at a concentration of 1 × 10 ⁶ cells / ml.

2. CTL 분석 준비 및 항체 염색. 펩타이드로 펄싱된 DDAO-SE 표지된 표적세포(0.1ml)를 원추형 폴리프로필렌 코스타(Costar) 클로스터 튜브(cluster tube)(Costar, Corning, NY)에서 작동세포(1x10⁶ 세포/ml) 0.1ml와 혼합했다. 세포 혼합물은 저속(200rpm)으로 1분 동안 원심분리했다. 혼합물을 가습 항온배양기에서 37℃, 5% CO₂ 하에 제시된 시간(0.5h 내지 5h) 동안 배양했다. 세포를 실온(RT)에서 D-PBS, 1% BSA로 세척하고, Fix/Perm 용액(BD Biosciences, Mississauga, ON)으로 RT에서 즉시 20분 동안 고정 및 침투시키거나, 또는 RT에서 20분 동안 1% 파라포름알데하이드로 고정시킨 뒤 4℃에서 24h 이하 동안 보관했다. 고정하여 보관한 세포를 원심분리한 뒤 Fix/Perm 완충액 중에 RT에서 20분 동안 재현탁시켰다. 그 다음, 세포를 염색 완충액(D-PBS, 1% BSA, 0.1% 사포닌)으로 2회 세척하고, 염색 완충액 0.1ml에 재현탁시켰다. 세포를 얼음 위에서 15㎕ 비오틴-표지된 항-절단 카스파제 3 모노클로날 항체(BD Biosciences, Mississauga, ON)로 60분 동안 염색했다. 세포를 염색 완충액으로 세척한 뒤, 스트렙타비딘-PE(Sigma, St.Louis, MO)로 30분 동안 빙상에서 대비염색했다. 세포를 염색 완충액으로 2회 세척하고, 유동세포분석기에서 분석을 위해 D-PBS, 1% BSA에 재현탁시켰다. 2. Preparation of CTL Assay and Antibody Staining. Peptide-pulsed DDAO-SE labeled target cells (0.1 ml) were mixed with 0.1 ml of effector cells (1 × 10 ⁶ cells / ml) in a conical polypropylene Costar cluster tube (Costar, Corning, NY). Mixed. The cell mixture was centrifuged for 1 minute at low speed (200 rpm). The mixture was incubated in a humidified incubator at 37 ° C., 5% CO ₂ for the time indicated (0.5 h to 5 h). Cells are washed with D-PBS, 1% BSA at room temperature (RT) and fixed and infiltrated immediately with Fix / Perm solution (BD Biosciences, Mississauga, ON) for 20 minutes at RT, or 1 minute at RT. Fixed with% paraformaldehyde and stored at 4 ° C. for up to 24 h. Fixed and stored cells were centrifuged and resuspended in Fix / Perm buffer for 20 minutes at RT. Cells were then washed twice with staining buffer (D-PBS, 1% BSA, 0.1% saponin) and resuspended in 0.1 ml of staining buffer. Cells were stained for 60 minutes with 15 μl Biotin-labeled anti-cleaving caspase 3 monoclonal antibody (BD Biosciences, Mississauga, ON) on ice. Cells were washed with staining buffer and counterstained on ice for 30 minutes with streptavidin-PE (Sigma, St. Louis, MO). Cells were washed twice with staining buffer and resuspended in D-PBS, 1% BSA for analysis in a flow cytometer.

3. 유동세포분석. 염색한 세포를 FACSCalibur 유동세포분석기(BD Biosciences, Mississauga, ON)에서 분석했다. 각 샘플마다 30 내지 50,000개를 수집했다. 살아있는 세포 및 표적세포를 전방 및 측방 산란 파라미터를 사용하여 게이팅한 다음, FL4 채널(channel)에서 DDAO-SE 표지된 표적세포 집단를 게이팅을 하였다(도 1B 참조). 그 다음 DDAO-SE 게이팅된 표적세포를 사용한 절단 카스파제 3 발현(FL2 채널)을 FL4 대 FL2 점 플롯에서 측정했다. 3. Flow cytometry. Stained cells were analyzed on a FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences, Mississauga, ON). 30 to 50,000 were collected for each sample. Living and target cells were gated using anterior and lateral scattering parameters, followed by gating DDAO-SE labeled target cell populations in the FL4 channel (see FIG. 1B). Cleavage caspase 3 expression (FL2 channel) using DDAO-SE gated target cells was then measured in the FL4 versus FL2 dot plot.

H. H. IFNIFN -γ -γ ELISPOTELISPOT 분석 analysis

ELISPOT 분석은 Millipore MultiScreen-HA 96웰 여과 평판(Millipore Cat No. MAHAS4510)을 사용하여 실시했다. 평판을 pH 9.5 탄산염 완충액 중의 항-IFN-γ mAb 5㎍/ml와 4℃에서 하룻밤 동안 배양하여 코팅한 뒤, D-PBS, 2% BSA로 차단했다. 사람 또는 쥐의 T 세포(100,000/웰)를 제시된 바와 같이 첨가하고, 관련 또는 무관련 펩타이드와 하룻밤 동안 항온배양했다. 평판을 세척하고, 비오틴 표지된 항-IFN-γ mAb와 RT에서 1h동안 항온배양했다. 평판을 세척한 뒤, 1:5,000 희석율의 Extravidin-Alkaline 포스파타제(Sigma)로 RT에서 1시간 동안 처리했다. 모든 반점들이 분명하게 보일 때까지 평판을 BCIP/NBT 기질(Sigma)로 발색시켰다. 발색된 평판을 건조하고 AID Version 3.1.1 ELISPOT 판독기(Cell Technologies, USA)에서 계수했다. 세포를 PMA로 처리하고 모든 실험의 양성 대조군으로서 이오노마이신(Ionomycin: Sigma)을 사용했다.ELISPOT analysis was performed using Millipore MultiScreen-HA 96-well filtration plates (Millipore Cat No. MAHAS4510). Plates were coated with 5 μg / ml of anti-IFN-γ mAb in pH 9.5 carbonate buffer and incubated overnight at 4 ° C. and then blocked with D-PBS, 2% BSA. Human or rat T cells (100,000 / well) were added as shown and incubated overnight with related or unrelated peptides. Plates were washed and incubated for 1 h at RT with biotin labeled anti-IFN-γ mAb. Plates were washed and treated with Extravidin-Alkaline phosphatase (Sigma) at 1: 5,000 dilution for 1 hour at RT. Plates were developed with BCIP / NBT substrate (Sigma) until all spots were clearly visible. The developed plates were dried and counted in an AID Version 3.1.1 ELISPOT reader (Cell Technologies, USA). Cells were treated with PMA and ionomycin (Sigma) was used as a positive control for all experiments.

I. I. ⁵¹⁵¹ CrCr 방출 분석 Emission analysis

표적세포(P815, P815-A2/K^b, EL4 및 T2 세포)를 10% FCS 함유 세포 배양 배지 중의 100μCi Na₂ ⁵¹CrO₄로 37℃에서 45분 동안 표지화했다. 세포를 배양 배지에서 세척하고, 이 프로토콜이 필요한 경우에는 특이적 또는 비특이적 대조용 펩타이드(1 내지 3㎍/ml)로 1h동안 펄싱했다. 펄싱된 세포를 배양 배지에서 1회 세척하고, 30,000세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 작동세포(쥐 MLR, 펩타이드 재자극된 비장 세포 또는 펩타이드-활성화된 사람 T 세포주)를 결과에 제시된 바와 같은 여러 E:T 비율로 첨가했다. 일부 실험에서 작동세포는 ⁵¹Cr 방출 분석을 위한 다양한 E:T 비율의 첨가 전에, 순수 림프구로 희석했다. 4시간 배양 후, 분석 상청액 25㎕를 96웰 루마플레이트(Lumaplate; Packard)에 주입했다. 평판을 건조하고, 방사능을 TopCount NXT v2.12 섬광계수기(Packard)를 사용하여 계수했다. 결과는 (실험 방출 - 자발 방출/ 총 방출 - 자발 방출)x100으로 계산된 비용해율%로서 나타냈다.Target cells (P815, P815-A2 / K ^b , EL4 and T2 cells) were labeled with 100 μCi Na ₂ ⁵¹ CrO ₄ in 10% FCS containing cell culture medium at 37 ° C. for 45 minutes. Cells were washed in culture medium and pulsed for 1 h with specific or nonspecific control peptides (1-3 μg / ml) when this protocol was needed. Pulsed cells were washed once in culture medium and resuspended at a concentration of 30,000 cells / ml. Effector cells (rat MLR, peptide restimulated spleen cells or peptide-activated human T cell lines) were added at various E: T ratios as shown in the results. In some experiments the working cells were diluted with pure lymphocytes before addition of various E: T ratios for ⁵¹ Cr release assay. After 4 hours of incubation, 25 μl of assay supernatant was injected into a 96 well Lumaplate (Packard). Plates were dried and radioactivity counted using a TopCount NXT v2.12 scintillation counter (Packard). The results are presented as% uncalculated percentage calculated as (experimental release-spontaneous release / total release-spontaneous release) x 100.

J. J. HLAHLA -- 펜타머Pentamers 염색 dyeing

HIV gag 펩타이드-특이적 및 CEA CAP1 펩타이드-특이적인 HLA-A^*0201 사람 T 세포주를 PE-접합된 재조합 HLA-펩타이드 펜타머(ProImmune, Oxford, UK)를 사용하여 염색했다. HIV gag 유래의 SLYNTVATL 서열을 함유하는 HLA-A^*0201 펜타 머(ProImmune 코드 010)는 HIV-특이적 세포주의 염색에 사용하고, CEA 유래의 YLSGANLNL 펩타이드를 함유하는 HAL-A^*0201 펜타머(ProImmune 코드 075)는 CAP1 펩타이드-특이적 세포주의 염색에 사용했다. 두 경우 모두 비특이적 펜타머 염색 대조군으로서, 유사한 백분율의 CD8⁺ T 세포로 이루어진 HLA-A^*0201-제한된 T 세포주를 사용했다. 이러한 T 세포를 세척하고 D-PBS, 0.1% NaN₃, 0.1% BSA로 이루어진 펜타머 염색 완충액(PSB)에서 2x10⁶세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 이러한 세포를 10㎕의 Pro5™으로 RT에서 20분 동안 염색하고, 세척한 뒤, PSB 중에서 항-사람 CD8-FITC(BD Biosciences) 5㎕로 RT에서 20분 동안 염색했다. 세포를 PSB로 세척하고 D-PBS, 1% 파라포름알데하이드로 고정한 뒤, FACScalibur 유동세포분석기로 분석했다. 먼저 전방 산란과 측방 산란 판별기를 사용하여 살아있는 세포를 게이팅한 뒤, x축에 CD8⁺ 형광도를 나타내고 y축에 펜타머⁺ 형광도를 나타내는 2색 플롯 분석을 통해 펜타머 양성 세포를 검출하고 정량했다. 결과는 각 배양물마다 펜타머⁺ 세포 백분율(%)로서 나타냈다.HIV gag peptide-specific and CEA CAP1 peptide-specific HLA-A ^* 0201 human T cell lines were stained using PE-conjugated recombinant HLA-peptide pentamers (ProImmune, Oxford, UK). HLA-A ^* 0201 pentamers containing SLYNTVATL sequences from HIV gag (ProImmune code 010) are used for staining of HIV-specific cell lines and HAL-A ^* 0201 pentamers containing YLSGANLNL peptides from CEA (ProImmune). Code 075) was used for staining CAP1 peptide-specific cell lines. In both cases, as a nonspecific pentamer staining control, a HLA-A ^* 0201-limited T cell line consisting of similar percentages of CD8 ⁺ T cells was used. These T cells were washed and resuspended at a concentration of 2 × 10 ⁶ cells / ml in pentamer staining buffer (PSB) consisting of D-PBS, 0.1% NaN ₃ , 0.1% BSA. These cells were stained with 10 μl of Pro5 ™ for 20 minutes at RT, washed and then stained with 5 μl of anti-human CD8-FITC (BD Biosciences) in PSB for 20 minutes at RT. Cells were washed with PSB, fixed with D-PBS, 1% paraformaldehyde and analyzed by FACScalibur flow cytometer. First, the living cells are gated using forward scattering and lateral scattering discriminator, and then pentamer positive cells are detected and quantified by two-color plot analysis showing CD8 ⁺ fluorescence on the x-axis and pentamer ⁺ fluorescence on the y-axis. did. Results are expressed as percentage of pentamers ⁺ cells for each culture.

실시예Example 2 2

A. 분석 절차 및 표적세포 추적 염료의 선택A. Assay Procedures and Selection of Target Cell Tracking Dyes

본 발명자들이 해결한 첫 번째 과제 중 하나는 FACS 분석 동안 카스파제 3 시그널을 방해하지 않는 효과적인 표적세포 추적 염료를 발견한 문제이다. 감도 최 대화를 위해 본 발명자들은 비오틴-표지된 1차 항-절단 카스파제 3 이후에 FL2 채널에서 밝은 형광을 발하는 스트렙타비딘-PE 대비 염색을 사용하고자 했다. 결과적으로, 본 발명자들은 근적광(FL4) 채널에서 형광을 발하고 FL2 채널에 의한 어떠한 보충도 필요로 하지 않는 비독성 세포 추적 염료를 연구했다. 그 결과, DDAO-SE(Molecular Probes)가 이러한 조건을 충족하는 염료임을 발견했다. 도 1A에 도시한 바와 같이, DDAO-SE는 어떠한 비특이적 카스파제 3 절단의 유도 없이, 최고 15시간 동안 다양한 쥐 및 사람 세포주, 예컨대 P815, EL-4, B16F10 흑색종, 4T1 유방암, 사람 T2 가슴샘종 및 COS 세포를 재현성 있고 안정되게 염색하는 것으로 발견되었다.One of the first challenges we have solved is the problem of finding an effective target cell tracking dye that does not interfere with caspase 3 signal during FACS analysis. For sensitivity maximization, we sought to use staining against streptavidin-PE which fluoresces brightly in the FL2 channel after biotin-labeled primary anti-cutting caspase 3. As a result, we studied non-toxic cell tracking dyes that fluoresce in the near-red light (FL4) channel and do not require any supplementation with the FL2 channel. As a result, DDAO-SE (Molecular Probes) was found to be a dye that satisfies these conditions. As shown in FIG. 1A, DDAO-SE can be used in various rat and human cell lines such as P815, EL-4, B16F10 melanoma, 4T1 breast cancer, human T2 thymomas for up to 15 hours, without any induction of nonspecific caspase 3 cleavage. And staining of COS cells reproducibly and stably.

DDAO-SE 염색된 표적세포를 사용하여, 먼저 쥐 동종이형 T 세포 반응 중의 CTL 활성을 측정하기 위한 카스파제 3 절단 분석을 시험했다. C57BL/6 항-Balb/c 및 Balb/c 항-C57BL/6 비장 세포의 혼합 림프구 반응을 ⁵¹Cr 방출과 비교하여 배양 5일 후 시험했다. 작동세포를 표적세포(P815 또는 EL-4 세포)와 여러 비율로 혼합하고 여러 시간 간격으로 항온배양한 뒤 고정시키고 항-절단 카스파제 3으로 염색했다. 도 1B는 카스파제 3 절단된 표적세포의 백분율을 열거하는데 사용된 게이팅 전략을 나타낸다. 이 방법을 모든 실험에 사용했다. 전방 산란(FSC) 및 측방 산란(SSC) 플롯은 제시된 바와 같이 생존 DDAO-SE⁺(FL4 채널) 표적세포의 집단을 분리하는 데 사용했다(R2 및 R3). R2 및 R3 게이트를 합하여 DDAO-SE⁺ 카스파제 3 절단된 (FL2 채널) 표적의 백분율을 측정하는 데 사용했다. 이 게이팅 전략은 생존 표 적만이 조사될 수 있게 하였다.Using DDAO-SE stained target cells, a caspase 3 cleavage assay was first tested to measure CTL activity in a murine allogeneic T cell response. Mixed lymphocyte responses of C57BL / 6 anti-Balb / c and Balb / c anti-C57BL / 6 spleen cells were tested after 5 days of culture compared to ⁵¹ Cr release. The effector cells were mixed with target cells (P815 or EL-4 cells) at various ratios, incubated at various time intervals, fixed and stained with anti-cutting caspase 3. 1B shows the gating strategy used to enumerate the percentage of caspase 3 cleaved target cells. This method was used for all experiments. Forward scatter (FSC) and lateral scatter (SSC) plots were used to separate populations of live DDAO-SE ⁺ (FL4 channel) target cells as shown (R2 and R3). The R2 and R3 gates were combined and used to determine the percentage of DDAO-SE ⁺ caspase 3 cleaved (FL2 channel) targets. This gating strategy allowed only survival targets to be investigated.

C57BL/6 항-Balb/c MLR 작동세포와 P815 표적세포(1:1 E:T 비율)를 이용한 실험에서는 유도 카스파제 3 절단이 H-2^d P815 표적에 대해서만 특이적이고 H-2^b EL4 표적에서는 분명한 절단이 나타나지 않는 것으로 밝혀졌다(도 2A). 또한, 도 2A 및 도 2B에 제시된 경시적 결과는 카스파제 3 절단 시그널이 이 경우에 1시간 항온배양 후 최대임을 보여주고 있다. 유사한 결과가 Balb/c 항-C57BL/7 MLR 작동세포가 시험된 경우에도 관찰되었다(도 2B). 종합해 보면, 카스파제 3 절단 분석은 MLR 중의 알로(allo)-특이적 CTL 활성을 측정하는 데 있어서 4 시간 ⁵¹Cr 방출 분석과 동일한 특이성을 나타냈다(데이터는 제시하지 않았다). In experiments with C57BL / 6 anti-Balb / c MLR effector cells and P815 target cells (1: 1 E: T ratio), induced caspase 3 cleavage was specific for H-2 ^d P815 targets only and H-2 ^b EL4 targets. It was found that no apparent cleavage was seen in FIG. 2 (FIG. 2A). In addition, the time course results presented in FIGS. 2A and 2B show that the caspase 3 cleavage signal is maximal after 1 hour incubation in this case. Similar results were observed when Balb / c anti-C57BL / 7 MLR effector cells were tested (FIG. 2B). Taken together, the caspase 3 cleavage assay showed the same specificity as the 4 hour ⁵¹ Cr release assay in measuring allo-specific CTL activity in MLR (data not shown).

표적세포에서의 카스파제 3 절단이 CTL에 의해 분비된 세포독성 과립에 의존적인지를 확인하기 위하여, C57BL/6 항-Balb/c MLR 작동세포를 표적세포와 혼합하기 전에, CTL 분석의 CTL 탈과립 억제제로서 사용된 콘카나마이신 A와 함께 배양했다. 콘카나마이신 A는 P815 표적세포에서 카스파제 3 절단의 출현을 억제했다(도 2C). 유사한 결과는 CEA 종양 항원 유래의 CAP1 펩타이드에 대해 반응성인 사람 CTL 세포주를 이용하여 실시된 분석에서도 수득되었다(데이터는 제시하지 않았다). 또한, 카스파제 억제제, Z-DEVD-FMK 또는 일반적 카스파제 억제제, Z-VAD-FMK를 이용한 카스파제 3 활성의 억제는 C57BL/6 항-Balb/c MLR의 P815 표적세포에서 절단된 카스파제 3의 출현을 차단하지 못했다(데이터는 제시하지 않았다). 종합해보면, 이러한 결과들은 표적세포에서의 카스파제 3 절단이 CTL에 의해 분비된 그랜자임에 의존적이고 내인적으로 활성화된 카스파제 3 또는 사멸 과정 동안 표적세포에서 카스파제 3을 절단하는 여타 카스파제에 의해서는 자극되지 않는다는 것을 시사한다.CTL degranulation inhibitor of CTL assay before mixing C57BL / 6 anti-Balb / c MLR effector cells with target cells to confirm whether caspase 3 cleavage in target cells is dependent on cytotoxic granules secreted by CTL It was incubated with conkanamycin A used as. Conkanamycin A inhibited the appearance of caspase 3 cleavage in P815 target cells (FIG. 2C). Similar results were obtained in assays conducted with human CTL cell lines reactive against CAP1 peptides derived from CEA tumor antigens (data not shown). In addition, inhibition of caspase 3 activity with caspase inhibitors, Z-DEVD-FMK or general caspase inhibitors, Z-VAD-FMK, resulted in caspase 3 cleaved in P815 target cells of C57BL / 6 anti-Balb / c MLR. Did not block the appearance of (data not shown). Taken together, these results indicate that caspase 3 cleavage in target cells is dependent on granzymes secreted by CTL and endogenously activated caspase 3 or other caspases cleaving caspase 3 in target cells during the killing process. Suggests that it is not stimulated by

카스파제 3 절단 분석을 2가지 다른 분석 시스템, 즉 쥐 C57Bl/6 항-Balb/c MLR 시스템 및 HLA-A2.1/K^b 유전자전이된 마우스에서의 펩타이드 백신접종 반응에서의 ⁵¹Cr 방출 분석과 비교했다(도 3). MLR 모델에서는 카스파제 3 절단 분석이 ⁵¹Cr 방출 분석과 동일한 특이성 및 신뢰성을 보여주었다. 하지만, 0.5:1 이하의 E:T 비율에서 CTL 활성이 검출될 수 있다는 점에서 감도는 훨씬 컸다(도 3A). 또한, 사람 TRP2 흑색종 항원 펩타이드로 백신접종된 마우스 유래의 비장 세포를 가지고 펩타이드-펄싱된 P815-A2/K^b 표적세포에 대한 CTL 활성 시험을 실시했다(도 3B). 이 카스파제 3 절단 분석은, 펩타이드 재자극된 비장 세포가 40:1 및 10:1 E:T의 비율에서 시험되었을 때 ⁵¹Cr 방출에서와 유사한 결과를 나타냈다. 부언하면, 전술한 바와 같이 상기 분석은 특이적 CTL 활성의 더 높은 반응률이 10:1 E:T 비율에서 검출되는 유의적으로 더 높은 감도를 보여주었다(도 3B).Caspase 3 cleavage analysis was performed using two different assay systems: ⁵¹ Cr release assay in peptide vaccination response in rat C57Bl / 6 anti-Balb / c MLR system and HLA-A2.1 / K ^b transgenic mice. Comparison was made (FIG. 3). In the MLR model, caspase 3 cleavage assay showed the same specificity and reliability as ⁵¹ Cr release assay. However, the sensitivity was much greater in that CTL activity could be detected at an E: T ratio of 0.5: 1 or less (FIG. 3A). In addition, CTL activity tests were performed on peptide-pulsed P815-A2 / K ^b target cells with splenocytes derived from mice vaccinated with human TRP2 melanoma antigen peptide (FIG. 3B). This caspase 3 cleavage assay showed similar results with ⁵¹ Cr release when peptide restimulated spleen cells were tested at ratios of 40: 1 and 10: 1 E: T. In addition, as described above, the assay showed a significantly higher sensitivity where a higher response rate of specific CTL activity was detected at a 10: 1 E: T ratio (FIG. 3B).

B. 바이러스 벡터 백신에 대한 B. Against Virus Vector Vaccines CTLCTL 반응을 모니터하기 위한 To monitor the response 카스파제Caspase 3 절단 분석의 이용 Use of 3 cutting analysis

HLA-A2.1/K^b 유전자전이된 마우스를 2x10⁷ pfu ALVAC-gp100으로 면역화한 후 gp100 펩타이드-특이적 CD8⁺ 회상 반응을 측정하는 IFN-γ ELISPOT 분석과 카스파제 3 절단 CTL 분석을 비교했다. 먼저 마우스를 초회 항원 주사한 후 추가 접종하고, 당해 비장 세포를 HLA-A2.1 결합성 gp100 펩타이드의 저장물 0.2㎍/ml로 5일 동안 재자극한 다음, 카스파제 3 절단 또는 IFN-γELISPOT을 사용하여 작동세포 분석을 실시했다. 카스파제 3 절단 분석에는 DDAO-SE 표지된 gp 100 또는 대조용의 HLA-A2.1/K^b 플라스미드로 안정하게 형질전환된 펩타이드-펄싱된 P815 세포를 사용했다. P815-A2/K_b 세포가 DDAO-SE 표지되지 않은 것을 제외하고는 유사한 방법을 ELISPOT 분석에도 사용했다(방법 섹션 참조). 각 분석마다 5마리의 마우스를 반복 사용하여 카스파제 3 절단 분석을 판독값으로 사용할 때 각 동물 간의 결과의 정확도를 조사했다. 도 4는 gp100 펩타이드-특이적 CD8⁺ T 세포 반응에 대한 카스파제 3 절단 판독값 대 ELISPOT을 비교한 각 두 실험의 결과를 도시한 것이다. 두 분석은 모두 공(空) ALVAC 대조용 벡터로 면역화된 마우스에서 비특이적 반응성을 보이는 비슷한 결과를 나타냈다. 각 동물들 사이의 산란은 낮아서 CTL 표적에서 카스파제 3 절단을 이용한 CD8⁺ T 세포 반응의 모니터링이 백신접종 후 항원-특이적 CD8⁺ T 세포 반응을 높은 정확도 하에 정확하게 측정할 수 있음을 시사한다.HLA-A2.1 / K ^b transgenic mice were immunized with 2 × 10 ⁷ pfu ALVAC-gp100 and then compared with IFN-γ ELISPOT assay, which measures gp100 peptide-specific CD8 ⁺ recall response, and caspase 3 cleaved CTL assay . The mice were first challenged and further inoculated, and the spleen cells were restimulated with 0.2 μg / ml of the stock of HLA-A2.1 binding gp100 peptide for 5 days, followed by caspase 3 cleavage or IFN-γELISPOT. Effector cell analysis was performed. Caspase 3 cleavage assays used peptide-pulsed P815 cells stably transformed with DDAO-SE labeled gp 100 or a control HLA-A2.1 / K ^b plasmid. A similar method was used for ELISPOT assays, except that P815-A2 / K _b cells were not DDAO-SE labeled (see Methods section). Five mice were repeated for each assay to examine the accuracy of the results between each animal when the Caspase 3 cleavage assay was used as a reading. 4 gp100 peptide-specific CD8 ⁺ The results of each of the two experiments comparing the caspase 3 cleavage readout versus ELISPOT for T cell response are shown. Both assays showed similar results with nonspecific reactivity in mice immunized with the empty ALVAC control vector. Scattering between each animal is low, suggesting that monitoring CD8 ⁺ T cell responses using caspase 3 cleavage on CTL targets can accurately and accurately measure antigen-specific CD8 ⁺ T cell responses after vaccination.

이러한 결과를 통해 알 수 있듯이, 쥐 시스템에서 CTL 표적세포의 카스파제 3 절단 측정은 ⁵¹Cr 방출 분석의 대안으로 사용가능한 분석법이며, 특이성 정도는 동일하나 ⁵¹Cr 방출 분석에 비해 감도는 훨씬 높다. 또한, 카스파제 3 절단을 통한 CTL 활성의 측정은 IFN-γ ELISPOT의 지지성 기능 분석법으로서 또는 표적 항원이나 펩타이드를 발현하는 표적세포가 입수용이한 경우 ELISPOT의 대체 분석법으로서 사용될 수도 있다.As can be seen from these results, the measurement of caspase 3 cleavage of CTL target cells in the mouse system is an alternative to ⁵¹ Cr release assay, with the same specificity but much higher sensitivity than ⁵¹ Cr release assay. In addition, measurement of CTL activity through caspase 3 cleavage may be used as a supportive functional assay of IFN-γ ELISPOT or as an alternative assay for ELISPOT when target cells expressing the target antigen or peptide are available.

C. 항원-특이적 사람 T 세포 반응을 모니터하는 C. Monitoring Antigen-Specific Human T Cell Responses 카스파제Caspase 3 절단 3 cutting CTLCTL 분석analysis

1차 연구 실험에서, 사람 T 세포주는 HIV gag 펩타이드인 9-mer HIV rev 펩타이드에 대하여, 또는 종양 관련 항원 CEA 유래의 CAP1 펩타이드에 대하여 HLA-A^*0201⁺ 제공자로부터 생성되었다. 모든 T 세포주는 방법 섹션에 개략된 바와 같이 펩타이드 자극과 IL-2 및 IL-7으로의 증식을 반복 순환하여 정상 제공자, HIV 미감염성 제공자 및 비암성 제공자로부터 생성되었다. 3차 또는 4차 자극 순환 후, TCRαβ⁺, CD8⁺, CD16^-, CD56^- 증식성 T 세포가 85%를 초과하는 T 세포주가 통상적으로 수득되었다. 이러한 T 세포를 카스파제 3 절단의 모니터링을 이용한 작동세포 활성 검사에 사용했다. IFN-γ ELISPOT 분석은 3차 및 4차 자극 후 펩타이드-특이적 T 세포의 존재를 확인했다. 그 범위는 HIV 펩타이드-특이적 세포주 및 CEA 펩타이드-특이적 세포주 모두에서 1:100 내지 1:250 범위였다(데이터는 제시하지 않았다).In the first study experiment, human T cell lines were generated from HLA-A ^* 0201 ⁺ donors for the 9-mer HIV rev peptide, an HIV gag peptide, or for the CAP1 peptide from the tumor associated antigen CEA. All T cell lines were generated from normal donors, HIV uninfected donors and noncancerous donors by repeated circulation of peptide stimulation and proliferation with IL-2 and IL-7 as outlined in the Methods section. After the third or fourth stimulation cycle, T cell lines with more than 85% of TCRαβ ⁺ , CD8 ⁺ , CD16 ⁻ , CD56 ⁻ proliferative T cells were usually obtained. These T cells were used for assaying effector cell activity using monitoring of caspase 3 cleavage. IFN-γ ELISPOT analysis confirmed the presence of peptide-specific T cells after third and fourth stimulation. The range was from 1: 100 to 1: 250 in both HIV peptide-specific and CEA peptide-specific cell lines (data not shown).

도 5A는 HIV rev 유래의 펩타이드에 특이적인 HLA-A2.1-제한된 T 세포주를 이용하여 활성화된 사람 T 세포-특이적 활성을 모니터하는 카스파제 3 절단 분석의 전형적인 결과를 도시한 것이다. 활성화된 T 세포는 펄싱된 T2 표적과 5:1 또는 1:1 E:T 비율로 혼합했다(도 5A). 이 분석은 pp65 CMV 항원 유래의 비특이적 HLA-A^*0201 결합 펩타이드에 의해 T2 표적 중의 최소 수준의 카스파제 3 절단만이 펄싱되는 특이성을 나타내는 것으로 확인되었다. 도 5B에서는 카스파제 3 절단 분석 결과를, CEA의 CAP1 HLA-A2.1 에피토프에 특이적인 T 세포주를 이용하는 키트(BD Bisciences)에 의한 Annexin-V 및 7-AAD 염색을 통해 표적 중의 아폽토시스를 측정하는 다른 FACS계 CTL 분석 결과와 비교했다. T 세포주(4차 자극후)를 제공자의 순수 자가 PBMC로 제시된 비율대로 희석하고 동일한 수(100,000)의 펩타이드로 펄싱된 T2 표적세포와 혼합했다. 두 분석에서는 감도 수준이 유사한 비슷한 결과가 나타났다(도 5B). 하지만, Annexin-V + 7-AAD 분석의 비특이적 배경값이 훨씬 더 높다는 것이 다수의 실험에서 확인되었다. 또한, 샘플마다 Annexin V 형광도 수준에 상당한 변동이 있음을 확인했다(데이터는 제시하지 않았다). 포스파티딜 세린에 결합하는 Annexin V는 Ca²⁺ 민감성이며 Ca²⁺ 농도의 약간의 변화가 Annexin-V 결합 균형을 변동시킬 수 있다. 염색 형광도에서의 이러한 변동은 카스파제 3 절단을 염색하는 경우에는 관찰되지 않았다.5A depicts the typical results of a caspase 3 cleavage assay that monitors activated human T cell-specific activity using HLA-A2.1-limited T cell lines specific for HIV rev derived peptides. Activated T cells were mixed with pulsed T2 targets in a 5: 1 or 1: 1 E: T ratio (FIG. 5A). This analysis confirmed that only a minimal level of caspase 3 cleavage in the T2 target exhibited the specificity of pulsing by a nonspecific HLA-A ^* 0201 binding peptide from the pp65 CMV antigen. In FIG. 5B, caspase 3 cleavage assay results are used to measure apoptosis in target via Annexin-V and 7-AAD staining by kit (BD Bisciences) using T cell lines specific for CAP1 HLA-A2.1 epitopes of CEA. The results were compared with other FACS CTL analysis results. T cell lines (after fourth stimulation) were diluted in the ratios indicated by the donor's pure autologous PBMCs and mixed with T2 target cells pulsed with the same number (100,000) of peptides. Both analyzes showed similar results with similar sensitivity levels (FIG. 5B). However, many experiments have confirmed that the nonspecific background of the Annexin-V + 7-AAD assay is much higher. It was also confirmed that there was a significant variation in Annexin V fluorescence levels from sample to sample (data not shown). Annexin V binding to phosphatidylserine is Ca ²⁺ sensitive and slight changes in Ca ²⁺ concentrations can alter the Annexin-V binding balance. This variation in staining fluorescence was not observed when staining caspase 3 cleavage.

카스파제 3 절단 분석은 배경값이 낮은 것 외에도 CTL 활성을 추적하는데 있어서 1:7 희석율의 작동세포에서 특이적 CTL 활성이 검출되는 것으로 볼 때 감도 수준이 상당한 것으로 나타났다(도 5B; 카스파제 3 절단). 또한, IFN-γ ELISPOT 분석으로 도 5B에 사용된 T 세포주에서 CAP1-특이적 T 세포의 빈도를 측정했고(데이터는 제시되지 않았다), 빈도가 1:237인 것을 발견했다. 이러한 결과에 비추어 볼 때, 도 5B에 제시된 1:3 및 1:7 희석율에서의 CAP1-특이적 T 세포의 빈도가 각각 1:711(0.14%) 및 1:1659(0.06%)인 것으로 추정되었다. 이것은 본 분석법이 민감하며 희귀한 항원-특이적 CD8⁺ T 세포를 검출할 수 있고, 특히 CTL 빈도가 꽤 낮은 경우에도 TAA에 대하여 상기 T 세포를 검출할 수 있음을 암시한다.Caspase 3 cleavage assays showed significant sensitivity levels in the presence of low background values in the detection of specific CTL activity in 1: 7 dilution of effector cells in tracking CTL activity (FIG. 5B; Caspase 3 cleavage). ). In addition, the IFN-γ ELISPOT assay measured the frequency of CAP1-specific T cells in the T cell line used in FIG. 5B (data not shown) and found that the frequency was 1: 237. In light of these results, it was estimated that the frequency of CAP1-specific T cells at 1: 3 and 1: 7 dilution ratios shown in FIG. 5B was 1: 711 (0.14%) and 1: 1659 (0.06%), respectively. . This suggests that the assay can detect sensitive and rare antigen-specific CD8 ⁺ T cells, especially for TAA even when the CTL frequency is quite low.

D. D. 카스파제Caspase 3 절단에 기초한 3 based on cutting CTLCTL 분석의 감도 Sensitivity of analysis

추가로 이 분석법의 감도 한계를 검사하기 위하여 순수 동계 비장 세포 또는 순수 자가 PBMC로 각각 1:199까지 희석한 마우스 MLR 작동세포와 활성화된 펩타이드-특이적 사람 T 세포주를 사용하여 일련의 실험을 실시했다.In addition, to examine the sensitivity limits of this assay, a series of experiments were performed using mouse MLR effector cells and activated peptide-specific human T cell lines diluted 1: 199 each with pure syngeneic spleen cells or pure autologous PBMCs. .

제1 실험은 MLR 수거 후 순수 동계 C57BL/6 비장세포를 이용하여 1:0(희석 없이) 내지 1:199로 희석한 C57BL/7 항-Balb/c MLR 작동세포를 가지고 실시했다(도 6). 희석한 작동세포를 DDAO-SE 표지된 P815 세포와 1:1 비율로 배양했다. 표적세포 단독 및 순수 비장세포는 CTL 활성의 음성 대조군으로 사용하고, DDAO-SE 표지된 EL-4 표적은 특이성 대조군으로 사용했다. 카스파제 3 절단의 감도는, MLR 작동세포가 순수 비장세포에 의해 1:199의 비율로 희석된 경우에도 카스파제 3 절단이 상당히 존재하는 것으로 알 수 있듯이 높은 수준인 것으로 나타났다(도 6). 비특이적 EL4 표적의 모든 희석물에서는 카스파제 3 절단 수준이 거의 무시할 수 있는 정도였다(도 6). 전형적인 쥐의 MLR에서 알로(allo)-반응성 CD8⁺ 비장세포의 백분율은 1:10 정도로 높게 관찰되었다. 즉, 이러한 빈도의 항-Balb/c 작동세포가 순수 비장 세포로 1:199의 비율로 희석된 MLR에서 존재한다고 가정하면, 이 분석법은 작동세포의 빈도가 1:2,000(0.05%)인 경우에도 CTL 활성을 검출할 수 있을 것이다. 본 실험은 적어도 3회 반복했으며 모든 결과가 유사했다.The first experiment was performed with C57BL / 7 anti-Balb / c MLR effector cells diluted 1: 0 (without dilution) to 1: 199 using pure syngeneic C57BL / 6 splenocytes after MLR collection (FIG. 6). . Diluted effector cells were incubated at a 1: 1 ratio with DDAO-SE labeled P815 cells. Target cells alone and pure splenocytes were used as negative controls for CTL activity and DDAO-SE labeled EL-4 targets were used as specific controls. The sensitivity of caspase 3 cleavage was shown to be high as it can be seen that caspase 3 cleavage was significant even when the MLR effector cells were diluted 1: 199 by pure splenocytes (FIG. 6). In all dilutions of nonspecific EL4 targets, caspase 3 cleavage levels were almost negligible (FIG. 6). In typical rat MLR the percentage of allo-reactive CD8 ⁺ splenocytes was observed as high as 1:10. In other words, assuming that these frequencies of anti-Balb / c effector cells are present in MLR diluted 1: 199 to pure splenocytes, the assay can be used even when the frequency of effector cells is 1: 2,000 (0.05%). It will be possible to detect CTL activity. The experiment was repeated at least three times and all results were similar.

유사한 희석 실험은 순수 PBMC 저장물로 3회 내지 4회 자극한 후의 HIV 펩타이드-특이적 사람 HLA-A^*0201-제한된 T 세포주를 이용하여 실시했다(도 7). 도 9A에 도시된 실험에 따르면, IFN-γ ELISPOT 분석에서는 3회 자극 후 배양물 중의 HIV 펩타이드-특이적 T 세포의 빈도가 1:156(0.64%)인 결과가 추정되었다. 이러한 T 세포 배양물을 순수 자가 PBMC로 1:0 내지 1:199 비율로 희석했다. 앞에서와 같이, DDAO-SE 표지된 T2 림프종 세포 표적 단독 및 HIV 펩타이드-펄싱된 T2 표적과 함께 항온배양된 순수 PBMC^- 활성화된 T 세포를 음성 대조군으로 사용한 반면, HLA-A^*0201 결합성 pp65 CMV 펩타이드로 펄싱된 T2 세포를 특이성 대조군으로 사용했다. 도 7B 및 9B에 도시한 바와 같이, 카스파제 3 절단의 측정은 현저하게 민감하여 1:99 및 1:199 정도로 낮은 작동세포 희석율에서도 상당한 활성이 측정되었다. HIV 펩타이드-펄싱된 T2 세포에서는 1:99 및 1:199 희석율에서 각각 5.7% 및 6%의 카스파제 3 절단율이 관찰된 반면, 비특이적 pp65 CMV 펩타이드-펄싱된 표적에서는 겨우 2.1% 및 2.2%의 카스파제 3 절단율이 관찰되었다. 이러한 CMV 펩타이드에 의한 카스파제 3 절단 세포의 낮은 백분율은 작동세포의 희석율이 감소됨에 따라 증가하지 않았다. 작동세포가 없는 표적세포 및 순수 PBMC⁺ 표적세포에서의 카스파제 3 절 단 백분율은 2% 미만이었다(도 7B). 본 분석법의 추가적인 감도 분석으로서, 항원-특이적 T 세포의 TCR을 직접 염색하는 HLA 펩타이드 펜타머(ProImmunoe, Oxford, UK)를 이용하여 HIV gag-특이적 T 세포주를 염색했다(도 7C). 도 7C는 도 7B에 제시된 카스파제 3 절단 분석에서 사용된 것과 동일한 T 세포를 펜타머 염색한 결과를 도시한 것이다. 이 분석 결과, 카스파제 3 절단 분석이 HLA 펜타머 염색과 비슷한 수준의 감도를 나타낸다는 것을 알 수 있었다. IFN-γ ELISPOT 빈도에 기초한 카스파제 3 절단 분석에서의 HIV gag 펩타이드-특이적 T 세포의 빈도(도 7B)는 1:99 및 1:199 희석율의 작동세포에서 각각 1:15,444(0.007%) 및 1:31,044(0.003%)였다. 이것은 항원-특이적 T 세포 빈도가 상당히 낮은 경우에 CTL 활성을 정량하는 데 유용한 분석법으로 사용할 수 있는 높은 감도의 분석법임을 나타낸다. 또한, 펜타머 또는 테트라머에 기초한 방법과 달리, 단지 T 세포 빈도가 아닌 T 세포 기능을 측정하는 방법이다. Similar dilution experiments were performed using HIV peptide-specific human HLA-A ^* 0201-limited T cell lines after stimulation three to four times with pure PBMC stock (Figure 7). According to the experiment shown in FIG. 9A, the IFN-γ ELISPOT assay estimated that the frequency of HIV peptide-specific T cells in the culture was 1: 156 (0.64%) after three stimulations. These T cell cultures were diluted 1: 0 to 1: 199 in pure autologous PBMC. As before, pure PBMC ^- activated T cells incubated with DDAO-SE labeled T2 lymphoma cell targets alone and HIV peptide-pulsed T2 targets were used as negative controls, while HLA-A ^* 0201 binding pp65 CMV T2 cells pulsed with peptide were used as specificity controls. As shown in Figures 7B and 9B, the measurement of caspase 3 cleavage was remarkably sensitive and significant activity was measured even at effector dilution rates as low as 1:99 and 1: 199. Caspase 3 cleavage rates of 5.7% and 6% were observed at 1:99 and 1: 199 dilutions, respectively, in HIV peptide-pulsed T2 cells, whereas only 2.1% and 2.2% of non-specific pp65 CMV peptide-pulsed targets were observed. Caspase 3 cleavage was observed. The low percentage of caspase 3 cleaved cells by these CMV peptides did not increase as the dilution rate of effector cells decreased. The percentage of caspase 3 cleavage in target cells without effector cells and neat PBMC ⁺ target cells was less than 2% (FIG. 7B). As an additional sensitivity assay of this assay, HIV gag-specific T cell lines were stained using HLA peptide pentamers (ProImmunoe, Oxford, UK), which directly stain TCR of antigen-specific T cells (FIG. 7C). FIG. 7C shows the results of pentamer staining of the same T cells as used in the caspase 3 cleavage assay presented in FIG. 7B. As a result, it was found that caspase 3 cleavage analysis showed a level of sensitivity similar to that of HLA pentamer staining. The frequency of HIV gag peptide-specific T cells in the caspase 3 cleavage assay based on IFN-γ ELISPOT frequency (FIG. 7B) was 1: 15,444 (0.007%) in effector cells at 1:99 and 1: 199 dilution rates, respectively. 1: 31,044 (0.003%). This indicates a high sensitivity assay that can be used as an assay useful for quantifying CTL activity when antigen-specific T cell frequency is significantly low. Also, unlike the method based on pentamers or tetramers, it is a method of measuring T cell function, not just T cell frequency.

참고문헌references

Claims

a) exposing a population of immune effector cells to a target cell population;

b) incubating the cells for a sufficient time under conditions suitable for the immune effector cells to affect the target cells so that the apoptosis pathway of the target cells is activated;

c) immobilizing and infiltrating said mixed cell population;

d) exposing the mixed cell population to a detection reagent capable of binding to a protein or fragment thereof that undergoes a change during or as a result of the apoptosis process; And

e) detecting the detection reagents

Including together, the method for detecting the cytotoxic activity of the immune effector cell population to the target cell population.

The method of claim 1, wherein the immune effector cells are T cells.

The method of claim 1, wherein the target cell is a virus infected cell or a tumor cell.

The method of claim 1, wherein the protein of step d) is caspase.

The method of claim 4, wherein the caspase is caspase-3.

The method of claim 1, wherein the detection reagent is an antibody.

The method of claim 1, wherein the detection reagent is a fluorescent tagged antibody.

The method of claim 1, wherein the detection of step e) is carried out using flow cytometry.