KR20060133596A - 생물학적 및 화학적 시료의 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
용액/현탁액 상 검정법의 이점 및 고체상/측면 흐름(lateral flow) 검정법의 간단함을 결합시킨, 분석물의 감도 높은 검출 기법을 설명한다. 본 검정법은 고체 지지체로서 자성 미소 구체를 사용하며, 용액/현탁액 중에서 실시될 수 있다. 그후, 자기적 분리를 실시하여 결합된 분석물을 용액으로부터 분리할 수 있다. 세척 단계 후, 형광 신호는 자성 입자 표면으로부터 직접 판독될 수 있다. 또한, 형광 중합체의 초소광을 이용한 휴대용 생검출 시스템 및 이를 이용한 생물학적 시료의 검출 방법도 설명한다.
생검출 시스템, 생물학적 시료, 형광자, 소광자, 검출 방법
Description
본 출원은 2004년 1월 30일 출원된 미국 가출원 제60/540,297호로부터 우선권을 주장한다. 상기 가출원 전문은 본 명세서에서 참조로 인용한다.
본 출원은 2001년 5월 8일 출원된 미국 특허 출원 제09/850,074호 및 2003년 7월 18일 출원된 미국 특허 출원 제10/621,311호에 관한 것이다. 상기 출원 각각의 전문은 본원에서 참조로 인용한다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 생물학적 시료의 검출을 위한 시스템 및 방법, 특히, 형광을 이용한 휴대용 생검출기, 상기 검출기의 생물학적 시료의 검출에 대한 용도 및 자성 고체상을 이용한 분석 기술 및 시약에 관한 것이다.
환경에는 자연적 원인으로 인해 다양한 병원체가 존재할 수 있다. 또한, 전세계적으로 생물학적 테러에 대한 위협이 최근 증가함에 따라 의도적으로 환경에 도입된 유해한 생물학적 시료를 조기에 동정하는 것이 더욱더 시급한 우선 과제가 되었다. 전문화된 실험실에서는 특정 생물학적 시료에 대한 다수의 검정법을 사용할 수 있지만, 상대적으로 비전문 인력이 수행할 수 있는 강력하고 신뢰할만한 시 스템 및 검정법이 요구되고 있다. 특히, 에어로졸, 분말형 또는 액상을 포함하는 다양한 형태로서, 환경에 존재할 수 있는 병원체에 대하여 감도 높고 특이적이며 신속한 검정법을 수행하기 위해, 본 분야에서 사용될 수 있는 휴대용 (즉, 소형(hand-held)) 검출 시스템이 계속적으로 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 제1 실시태양에 따르면,
검출 저장고를 한정하는 벽;
자기장에 의해 끌릴 수 있고, 표면에 생물학적 시료와 결합할 수 있는 수용체를 포함하는 미립자 고체 지지체 및 생물학적 시료와 결합할 수 있는 형광자를 포함하는, 검출 저장고 내의 유체; 및
샘플을 저장고로 도입하기 위한 포트를 포함하는 카트리지를 제공한다.
본 발명의 제2 실시태양에 따르면,
상기 기술된 바와 같은 카트리지를 수용할 수 있도록 적합화된 하우징(housing);
카트리지의 검출 저장고 내부 표면상에 빛을 조사할 수 있도록 적합화된 여기 광원; 및
카트리지의 검출 저장고 내부 표면으로부터의 형광 방출을 검출할 수 있도록 적합화된 검출기를 포함하는 검출 장치를 제공한다.
본 발명의 제3 실시태양에 따르면,
자기장에 의해 끌릴 수 있고, 표면에 생물학적 시료와 결합할 수 있는 수용 체를 포함하는 미립자 고체 지지체를 포함하는 제1 성분; 및
생물학적 시료가 수용체에 결합하였을 때 생물학적 시료와 결합할 수 있는 형광자를 포함하는 제2 성분을 포함하는, 샘플 내의 생물학적 시료의 존재 및(또는) 그의 양을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 제4 실시태양에 따르면,
저장고를 한정하는 벽을 포함하는 용기의 저장고 내에서 샘플을, 자기장에 의해 끌릴 수 있고, 그 표면에 생물학적 시료와 결합할 수 있는 잔기를 포함하는 미립자 고체 지지체 및 생물학적 시료와 결합할 수 있는 잔기를 포함하는 형광자와 함께 인큐베이션하는 단계;
샘플 내의 고체 지지체 입자가 자기장에 의해 끌리도록 하여 용기의 벽에 인접한 위치에서 표면이 형성되도록 용기의 벽을 통해 샘플에 자기장을 적용시키는 단계;
고체 지지체 입자에 의해 형성된 표면상에 광원을 조사하는 단계; 및
고체 지지체 입자에 의해 형성된 표면으로부터 방출되는 형광을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서, 검출된 형광은 샘플 내의 생물학적 시료의 존재 및(또는) 그의 양을 나타내는 것인, 샘플 내의 생물학적 시료를 검출하는 방법을 제공한다.
도 1은 내부에 생검출 카트리지가 삽입되어 있음을 보이는 생검출 장치의 대표도이다.
도 2는 형광 중합체 및 생체수용체가 고체 지지체 (즉, 미소 구체)상에 함께 위치하는 검정법을 나타내는 것으로서, 수용체에 비표지화된 분석물이 결합할 경우에는 중합체 형광에 변화가 없지만, 분석물 소광자 컨쥬게이트의 결합이 어떻게 중합체 형광을 증폭적으로 초소광시키는지를 도시한다.
도 3은 형광 중합체 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 엔테로톡신 B에 대한 수용체가 고체 지지체 상에 함께 위치하는 것으로서, 분석물 (즉, 단백질 독소 SEB)의 존재하에서 소광자로 표지화된 항체를 첨가하는 경우, 형광을 증폭적으로 초소광시키는 검정법을 도시한다.
도 4a 내지 4d는 자성 고체상을 이용하고, 자기적 분리에 의한 동적 표면 형성 및 생성된 표면의 영상화를 이용한 검출 시스템을 도시한다.
도 5는 각각이 표적 생물학적 시료에 결합할 수 있는 수용체를 포함하는 형광자 및 자성 입자를 이용한, 표적 생물학적 시료에 대한 검정법의 도해도이다.
도 6은 하나는 표적 항체에 대한 항원을 포함하고, 다른 하나는 표적 항체에 대한 수용체를 포함하는 형광자 및 자성 입자를 이용한, 항체에 대한 검정법의 도해도이다.
도 7은 표적에 대한 인식 요소와 함께 소광자/감작 발광체를 포함하는 제3 감지 성분을 이용한, 표적 생물학적 시료에 대한 FRET 또는 초소광 검정법의 도해도이다.
도 8은 감작 발광체로서 작용할 수 있거나 작용할 수 없는 소광 물질에 내장되어 있거나 그와 커플링된 자기화될 수 있는 물질을 이용한, 표적 생물학적 시료에 대한 FRET 또는 초소광 검정법의 도해도이다.
도 9는 포스파타제 및 키나제에 의한 인산기의 첨가 또는 제거를 모니터하는 검정법 (반응식 A); 프로테아제에 의한 펩티드의 절단 또는 DNA 리가제에 의한 DNA 가닥의 라이게이션을 모니터하는 검정법 (반응식 B); 및 고유하게 폴딩된 단백질에 대한 항체에 의해 단백질이 리폴딩되는 과정을 모니터하는 검정법을 포함하는 다양한 검정법의 도해도이다.
도 10은 각각이 표적에 대한 친화성을 갖고, 바이오틴 잔기를 포함하는 제 1 및 제2 핵산 시약, 및 각각이 바이오틴 결합 단백질을 포함하는 형광자 및 자성 입자를 사용하여 DNA 트리플렉스를 형성하는 것을 포함하는, 표적 핵산에 대한 검정법의 도해도이다.
도 11a는 검출기에서 사용될 수 있는 반응 카트리지의 도해도이다.
도 11b는 검출기 내에 삽입된 도 11a의 반응 카트리지를 보여주는 검출기의 도해도이다.
도 12는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)에 대한 샘플중 포자 갯수의 함수로서 측정된 형광을 나타내는 막대 차트이다.
도 13은 SEB에 대한 생물학적 시료 농도의 함수로서 측정된 형광을 나타내는 막대 차트이다.
도 14는 리신에 대한 생물학적 시료 농도의 함수로서 측정된 형광을 나타내는 막대 차트이다.
도 15는 간섭 물질(interferent) 및 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 포자를 포함하는 샘플과 비교하여, 다양한 간섭 물질을 포함하는 샘플 에 대해 측정된 형광을 나타내는 막대 차트이다.
도 16은 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 이외의 바실러스 포자를 고농도로 포함하는 샘플에 대해 측정된 형광을 나타내는 막대 차트로서, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 검정법에서 어느 샘플도 양성 신호를 나타내지 않았음을 설명한다.
도 17은 간섭 물질 및 리신을 포함하는 샘플과 비교하여, 다양한 간섭 물질을 포함하는 샘플에 대해 측정된 형광을 나타내는 막대 차트이다.
도 18a 내지 18d는 둘 다 표적 생물학적 시료에 결합할 수 있는 자성 입자 및 형광 표지와 포자를 혼합하고 (도 18a); 혼합 및 인큐베이션하는 동안 자성 입자 및 형광 표지가 포자에 결합하고 (도 18b); 용액을 자기화시켜 결합 및 비결합 자성 물질이 자기화된 표면으로 끌리게 하고 (도 18c); 용액 중 남아있는 비결합 형광 표지를 씻어내는 것인(도 18d), 검정법의 도해도이다.
본 발명은 대기, 물 또는 다양한 표면으로부터의 채취한 샘플 내의 생물학적 시료 (예를 들어, 세균, 독소, 바이러스)를 검출하기 위하여 사용할 수 있는 휴대용 (예를 들어, 소형) 자동 장치를 제공한다. 한 실시태양에 따르면, 검출은 5분 이내로 수행될 수 있다. 검출기는 생물학적 시료의 존재를 신호로 알리는 알람을 포함할 수 있다. 장치를 사용할 가능성이 있는 사람으로서는 응급 구조 요원 및 병원 분류 직원을 포함한다. 생검출기 장치는 작동을 위해서는 최소의 전문적 기술을 필요로 하고, 여러가지 시료를 검출하고 동정할 수 있으며, 이때, 위양성(false positive) 및 위음성(false negative)일 경우는 낮다.
몇몇 검정법을 생검출기 장치에서 사용할 수 있다. 일례의 검정법으로서 고체상 (예를 들어, 미소 구체 기반) 검정법을 포함한다. 고체상 검정법은 예를 들면, 단백질 및 저분자 독소를 검출하기 위해서 사용될 수 있다. 상기 검정법은 검출하는 분석물 (예를 들어, 독소)의 화학적 또는 물리적 변형을 필요로 하지 않으므로, 분석물이 생물학적 샘플 중에 자연적으로 존재하는 그대로 분석물을 검출할 수 있다. 고체상 검정법이 상기와 같이 기술되었지만, 가용성 시약을 사용하는 검정법 또한 사용할 수 있다.
본 분석 단계는 단용(single-use), 즉 1회용 카트리지를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 장치는 최소로만 교육을 받은 조작자에 의해서도, 조작자에 의한 오류 발생 가능성은 거의 없이 사용될 수 있다. 휴대용 생체검출 장치의 일례를 도 1에 나타낸다.
1회용 피펫을 사용하여 샘플을 카트리지 내로 도입할 수 있다. 샘플의 용량은 예를 들면, 50 mL일 수 있다. 카트리지 내의 플런저(plunger)를 사용하여 액체를 유동시킴으로써 분석을 완료할 수 있다.
생검출기, 하나 이상의 카트리지, 및 하나 이상의 양성 및(또는) 음성 대조군을 포함하는 생검출 시스템 또한 제공한다. 시스템 대조군은 생검출기의 적절한 작동성을 보장하기 위해 사용될 수 있다.
다양한 부류의 생물학적 및 화학적 시료에 대한 검정법을 제공한다. 일례의 생물학적 시료로서는, 세균 (예를 들어, 바실러스 안트라시스), 독소 (예를 들어, 스타필로코쿠스 엔테로톡신 B), 및 바이러스 (예를 들어, 인플루엔자)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 세균 시료는 포자 형성형일 수 있다. 예를 들면, 바실러스 안트라시스 및 스타필로코쿠스 엔테로톡신 B를 위한 검출 카트리지를 제공한다. 검출될 수 있는 다른 일례의 시료는 포자 형성형 세균, 영양 세균(vegetative bacteria), 바이러스, 단백질 독소, 프로테아제, 질식가스, 신경가스(nerve agents), 수포가스(blister agents), 및 남용약물을 포함하는 화학적 및 생물학적 시료이다. 검출될 수 있는 화학적 및 생물학적 시료의 구체적인 일례로서 보툴리눔 독소 A, B, 및 E; Q-열; 흑사병 (예르시니아 페스티스(Yersinia Pestis)); 우두/천연두; 사린가스; 포스겐; VX 가스; 및 코카인을 포함한다. 추가로, 효소, 효소 활성, 핵산 (예를 들어, DNA), 항체 및 저분자 물질, 예로서, 카페인 및 코카인의 검출을 위한 검정법을 생성할 수 있다. 구체적인 적용으로 바실러스 안트라시스, 스타필로코쿠스 엔테로톡신 B (SEB), 리신 독소 및 포자 코트 당단백질에 대한 검정법을 포함한다.
QTL
생물학적 시료 검출
첫번째 접근법은 표적 분석물에 대한 수용체 (예를 들어, SEB에 대하여 특이성인 항체 또는 펩티드 수용체와 같은 SEB 수용체)를 포함하는 고체 지지체 (예를 들어, 미소 구체)를 사용하는 것을 포함한다. 상기 접근법의 경우, 고체 지지체는 형광자를 포함하지 않는다. 일단 분석물이 수용체를 포함하는 고체 지지체에 노출되면, 분석물에 결합하는 잔기를 포함하는 형광자 (예를 들어, 고도로 형광성인 표지, 예컨대 중합체 또는 고도로 흡착성이고 형광성인 다른 앙상블을 포함하는 SEB-항체)가 고체 지지체 상에 포획된 분석물에 결합할 수 있다. 결합된 형광자로부터의 형광 강도를 측정하는 것은 분석물의 정량적 지표를 제공한다. 상기 접근법을 사용하여 바실러스 안트라시스 및 SEB를 포함하나 이에 한정되지 않는 생물학적 시료에 대하여 감도 높고 특이적인 정량적 검정법을 제공한다.
또한 본 발명은 증폭된 초소광 또는 형광 공명 에너지 전이 (즉, FRET)를 사용하는 검정법을 제공한다. 또한, 컨쥬게이션에 의해 서로 연결되거나 (즉, 컨쥬게이션된 중합체) 컨쥬게이션되지 않은 중합체 백본상에 아주 근접하게 매달려 있는(pendant) (즉, 염료 펜던트 중합체) 일련의 발색단을 포함하는 중합체는 분리된 단량체 발색단 또는 염료의 형광보다 개선된 형광 방출을 나타낸다. 중합체가 노출되어 극소량의 특정 에너지 또는 전자 전이 소광자와 결합하면, 상기 중합체들로부터의 형광이 증폭된 반응 (즉, 초소광)을 나타낸다는 것이 증명되었다. [참고문헌 1 내지 3 및 6]. 따라서, 분자당 수백개 내지 수천개의 유닛 또는 발색단으로 구성된 중합체의 경우, 한 분자의 소광자 중 단지 수개의 분자들이 전체 중합체로부터의 형광을 "끄거나" 소광시킬 수 있다. 형광의 증폭된 소광 또는 초소광은 단 하나의 전구가 제거되거나 소진된 경우, 연속된 일련의 크리스마스 트리 등불이 꺼지는 것과 매우 유사하다. 증폭된 초소광을 사용하는 검정법은 다수의 생물학적 표적을 위해 개발되었다 [참고문헌 1 및 7 내지 9]. 상기 생체검출 검정법은 중합체들 및 중합체 앙상블의 형광과 이들의 에너지 전이 또는 전자 전이 소광자에 의한 형광 소광에 대한 특유의 고감도성에 기초한다.
형광 중합체 및 생체수용체가 미소 구체 또는 다른 고체 지지체 상에 함께 위치하는 검정법을 도 2에 나타낸다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 분석물이 수용체에 결합하는 것은 중합체 형광에 어떤 변화도 일으키지 않는 반면, 분석물 소광자 컨쥬게이트 (예를 들어, 소광자, 테더(tether), 및 수용체에 대한 리간드를 포함하는 바이오컨쥬게이트)의 결합은 중합체 형광을 증폭적으로 초소광시킨다.
두번째 접근법에 따르면, 형광 중합체 및 생물학적 시료 (예를 들어, SEB 또는 BT)에 대한 수용체는 고체 지지체 (예를 들어, 미소 구체)상에 함께 위치한다. 중합체 및 수용체는 공지 기술을 사용하여 지지체에 컨쥬게이션될 수 있다 [1-5, 7-10]. 이러한 방식의 검정법은 도 3에 나타낸다.
수용체는 항체 (예를 들어, 바이오틴 결합 단백질 결합에 의해 지지체에 부착된 바이오티닐화된 항체) 또는 분자 수용체 (예를 들면, 바이오티닐화된 펩티드)일 수 있다. SEB의 경우, 시판되는 항체를 사용할 수 있거나, SEB에 결합하는 바이오티닐화된 펩티드를 합성할 수 있다. 폴리클로날 항체가 SEB가 부착된 고체 지지체에 결합한다는 것이 증명되었다. 상기 "샌드위치 검정법"의 첫번째 단계에서 SEB 분석물은 미소 구체상에 포획된다. 다음 단계에서, 형광 중합체에 대한 에너지 전이 수용체로 작용화된 제2 항체는 비드에 노출됨으로써, 부착된 SEB와 함께 "샌드위치"를 형성하고, 이로써 중합체 형광을 소광시킴과 동시에 수용체 형광을 감작시킨다(상이한 보다 긴 파장에서).
중합체 형광 및 에너지 수용체 형광 중 어느 하나 또는 양쪽 모두를 모니터할 수 있고, 상기의 비율은 SEB 수준에 대한 정량적 측정치를 제공할 것이다.
동적 표면 형성 및 영상화
몇몇 적용에 있어, 표적 물질은 상대적으로 크다 (예를 들어, 작은 단백질 독소와 대조적인 나노 또는 마이크로 입자). 이러한 적용에 있어서, 상기 기술된 바와 같은 초소광을 사용하는 것은 에너지 전이 기작에 내재된 거리상의 제한 때문에 효과적이지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명은 용액/현탁액 상 검정법이 갖는 이점 및 고체상/측면 흐름(lateral flow) 검정법의 간단함을 결합시킨 검출 기술을 제공한다. 이러한 기술은 샌드위치 및 경쟁법을 포함하나 이에 한정되지 않는 몇몇 상이한 검정법에 적절하다.
상기 접근법을 사용할 경우, 자성 고체 지지체 (예를 들어, 자성 미소 구체)를 사용하여 용액/현탁액 상에서 분석을 실시할 수 있다. 그후, 자기적 분리를 실시하여 결합된 분석물을 용액으로부터 분리할 수 있다. 이러한 방식으로, 자성 입자를 포함하는 표면이 형성된다. 세척 단계 후, 입자를 재현탁시키고 용액 중 형광을 검출하는 대신, 자성 입자 표면으로부터 직접 형광 신호를 판독할 수 있다.
도 4는 동적 표면 형성 및 영상화를 포함하는 검출 시스템 및 검정법을 설명한다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 카트리지 프레임 (A)은 표지화 용액 (B)중 분산되어 있는 자성 극미립자를 포함하는 검출 저장고를 한정한다. 자성 극미립자는 형광 표지 (C)에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있다. 표지화 용액은 과량으로 존재한다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 제1 자기장 (D)를 적용시킬 경우, 검출 저장고로부터 자성 입자로 코팅된 표면(E)이 형성된다. 표면이 형성된 후, 제1 자기장보다 강한 제2 자기장 (F)를 적용하여, 자성 입자의 코팅의 제거를 방지하는 세척 단계를 준비한다. 단일 자기장 강도를 사용하여서도 검정법을 수행할 수 있다. 본 단계를 도 4c에 나타낸다. 세척시, 검출 저장고 중 표지화 용액은 세척액 (G)으로 대체된다. 일단 표지화 용액이 제거되면, 자성 입자의 표면 또는 코팅은 영상화될 수 있다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 영상화하는 동안, 여기 광원 (H)을 자성 입자의 코팅에 초점을 맞추고, 동시에 코팅 표면으로부터 방출된 형광 (I)을 신호로서 수집한다.
형광 표지는 예를 들면, 분석물의 존재하에서 자성 극미립자에 결합할 수 있다. 예를 들어, 형광 표지는 분석물에 결합하는 부위에 컨쥬게이션될 수 있다. 결국, 샘플중 분석물은 자성 극미립자의 표면상의 수용체에 결합할 수 있다. 따라서, 분석물이 샘플 중에 존재할 때, 자성 극미립자는 형광으로 표지화된다. 이로써, 샘플중 분석물의 존재가 형광을 증가시킨다.
별법으로, 표지화 용액은 형광 표지된 분석물 또는 분석물 대용체를 포함할 수 있다. 샘플을 저장고에 가할 때, 샘플 중 분석물은 표시된 분석물과 자성 입자상의 분석물 결합 부위에 대하여 경쟁한다. 따라서, 샘플 중 분석물의 존재가 형광을 감소시킨다.
상기 기술된 동적 표면 형성 및 영상화 기술의 하나의 이점은 용액/현탁액 상을 사용함으로써 최적의 역학적 상태를 보장함과 동시에, 자성 입자 코팅의 형성은 분석물을 농축시켜 분석 감도를 현저히 향상시킨다는 것이다. 본 기술의 또다른 이점은 표면이 동적으로 생성되고, 통상적으로 나일론 및 니트로셀룰로오스 막을 사용하는 측면 흐름(lateral flow) 검정법에서 자주 직면하게 되는 것과 같은 비특이적 결합 문제는 나타나지 않는다는 점이다.
본 발명은 단백질 독소 및 미생물을 포함하는 병원체의 검출을 위한 고감도성 시스템 및 검정법을 기술한다. 특히, 현장에서 위험한 생물학적 시료를 신속하게 검출할 수 있도록 하는 소형 생체감지기를 제공한다. 검출용으로서 사용되는 화학물질의 단순성 및 강건성에 기인하여, 생물학적으로 위협적인 새로운 시료가 출현할 때마다 상기 기술들이 용이하게 적용될 수 있다.
검정법의 예
동적 표면 형성 및 영상화 적용에 대한 일례는 형광자 및 자기화될 수 있는 물질이 각각 수용체를 포함하고 있는 샌드위치 면역검정법이다. 일례의 수용체는 항체 (예를 들어, 모노클로날, 폴리클로날, 단일쇄 또는 항체 단편), 올리고머 압타머 (예를 들어, DNA, RNA, 합성 올리고뉴클레오티드), 당, 지질, 펩티드, 작용기 결합 단백질 (예를 들어, 바이오틴 결합 단백질, 포스페이트 결합 단백질), DNA, RNA, 합성 올리고뉴클레오티드, 금속 결합 복합체, 또는 다른 분자 또는 복합체에 대해 특이적인 친화성을 갖는 임의의 천연 또는 합성 분자 또는 복합체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 수용체는 특정의 표적 물질 (예를 들어, 화학적 또는 생물학적 시료)에 대하여 특이적인 친화성을 가질 수 있다. 형광자-표적-자기화될 수 있는 물질의 복합체 생성시, 용액은 자기화되고 세척됨으로써 표적이 샘플중에 존재할 경우에만 형광자를 포함하는 펠릿을 수득할 수 있다. 이러한 방식의 검정법을 도 5에 도시한다.
직접 검출법의 다른 일례는 형광자 또는 자기화될 수 있는 물질이 목적 항체에 대한 항원을 포함하는, 항체 역가 검정법이다. 본 실시태양에서, 항원이 결합하지 않는 감지(sensing) 물질 (즉, 형광자 또는 자기화될 수 있는 물질)은 목적 항체를 생성시킨 동물 종에 의해 생성된 항체에 대해 특이적인 항체에 연결될 수 있다. 목적 항체가 존재하는 샘플을 상기 감지 물질을 포함하는 용액과 함께 인큐베이션했을 때, 목적 항체는 자성 물질 및 형광자와 함께 복합체를 형성할 수 있다. 결과적으로, 목적 항체가 샘플 중에 존재할 때, 형광 신호는 동적 표면 형성 및 영상화 검정법으로 검출될 수 있다. 이러한 방식의 검정법을 도 6에 도시한다.
도 5에 도시한 기술은 2가지 방법 중 하나를 사용하여 FRET 또는 초소광에 기초한 적용으로 변형될 수 있다. 첫번째 경우는 도 7에 나타낸 바와 같이, 감작 발광체일 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 소광자를 포함하는 제3 감지 성분을 표적에 대한 인식 요소와 함께 첨가하는 것을 포함한다. 두번째 방법에서, 도 8에 나타낸 바와 같이, 자성 물질은 감작 발광체로서 작용할 수 있거나 작용할 수 없는 소광자 (예를 들어, 내장되거나 커플링된 소광자)를 포함한다. 상기 감작 방출 방법에서는 신호 분석에 세척 단계가 필수적인 것은 아니다. 그러나, 소광자만 사용될 경우, 세척 단계를 사용하여 비결합 형광자에 기인하는 배경을 감소시킬 수는 있다.
대안적인 적용으로서 화학적 또는 생물학적 변화, 예컨대 구조적 변형을 모니터하는 것을 포함한다. 검정법에 대한 다양한 일례를 하기 기술한다.
화학적 또는 생물학적 잔기의 첨가 또는 제거
이러한 방식의 적용예는 포스파타제 및 키나제에 의한 인산기의 첨가 또는 제거를 모니터하는 것이다. 출발 물질의 일례로서 인산화 부위를 갖는 바이오티닐화된 펩티드, 공유 결합된 바이오틴 결합 단백질 (예를 들어, 아비딘)을 갖는 형광자 및 공유 결합된 포스페이트 결합 단백질을 갖는 자기화될 수 있는 물질을 포함한다. 이러한 방식의 검정법을 도 9의 반응식 A에 도시한다.
공유/
비공유
착화/결합 또는 해리/
결합절단
이러한 방식의 검정법에 대한 적용예는 프로테아제에 의한 펩티드의 절단 또는 DNA 리가제에 의한 DNA 가닥의 라이게이션을 모니터하는 것이다. 출발 물질의 일례로서 바이오틴 결합 단백질(예를 들어, 아비딘)을 포함하는 형광자와 바이오틴 결합 단백질(예를 들어, 아비딘)을 포함하는 자성 물질 사이에서 프로테아제를 인식하는, 2개의 바이오틴을 포함하는 펩티드를 포함한다. 바이오틴 결합 단백질은 형광자 및(또는) 자성 물질에 공유 결합할 수 있다.
착화/해리 과정을 통해 형광자/자성 물질 복합체가 형성되는 것으로서, 복합체화/해리를 포함하는 이러한 방식의 검정법을 도 9의 반응식 B에 도시한다.
화학적 또는 생물학적 변형 또는
폴딩
이러한 방식의 적용은 고유하게 폴딩된 단백질에 대한 항체에 의해 단백질이 리폴딩되는 과정을 모니터하는 것을 포함한다. 그러나, 이러한 방식의 적용은 리폴딩 과정으로만 제한되지 않고, 이는 임의의 검출가능한 화학적 또는 생물학적 잔기를 포함한다. 출발 물질의 일례로서 공유 결합된 바이오틴을 갖는 폴딩되지 않은 단백질, 형광자에 공유 결합할 수 있는 바이오틴 결합 단백질 (예를 들어, 아비딘)을 포함하는 형광자, 및 고유하게 폴딩된 단백질에 대한 항체를 포함하는 자성 물질을 포함한다.
폴딩 (도에서는 ●이 ▲로 전환된 것으로서 표시됨)을 통해 자성 물질에 연결된 항체에 의해 단백질을 인식함으로써 형광자/자성 물질 복합체를 형성하는, 이러한 방식의 검정법을 도 9의 반응식 C에 도시한다.
다중 수용체 부위를 포함하는 복합체
의
생성
검정법의 일례로서 다중 수용체 부위를 포함하는 복합체가 생성되는 검정법을 포함한다. 이러한 방식의 검정법에 대한 예는 DNA 트리플렉스 형성을 포함한다. 출발 물질의 일례로서 각각이 표적 핵산에 대해 친화성을 갖고, 바이오틴 부위 또한 포함하는 제1 및 제2 핵산, 및 각각이 바이오틴 결합 단백질 (예를 들어, 아비딘)을 포함하는 형광자 및 자성 물질을 포함한다. 바이오틴 결합 단백질은 형광자 및(또는) 자성 물질에 공유 결합할 수 있다. 이러한 방식의 검정법을 도 10에 도시한다.
상기 기술된 검정법 및 포맷은 일반적으로 여기원(excitation source) 및 검출기 둘 모두를 사용하여 초점이 맞춰질 수 있는 자성 입자의 표면 (즉, 펠릿)이 생성되는 어느 시스템에나 적용시킬 수 있다. 예를 들면, 하기 기술하는 바와 같이 플레이트 판독기상에서 분석을 실시할 수 있다. 먼저, 플레이트 벽 아래에 자석을 놓고 벽 바닥 상의 특정 위치에서 자기 펠릿이 형성될 수 있도록 하는 래크(rack)를 사용함으로써 플레이트 중 샘플을 자기화시킨다. 이어서, 샘플을 세척한다. 이어서, 플레이트 판독기의 광원 및 플레이트 판독기의 검출기를 광학적으로 초점을 맞추어 형성된 펠릿을 여기시키고 형광 방출에 대하여 모니터한다.
상기 방법은 자석을 적합화시켜 펠릿을 형성시킬 수 있고 광원 및 검출기로 초점을 맞추어 여기시키고 상기 펠릿으로부터 방출을 수집할 수 있는 임의의 칩에 기초한 적용에 사용할 수 있다.
바실러스 안트라시스, 리신 (피마자 독소), 및 스타필로코쿠스 엔테로톡신 B에 대한 검출 및 측량 검정법은 동적 표면 형성 및 영상화 방법을 사용하여 개발되었다. 본 검정법을 실시하는 기기를 도 11a 및 11b에 나타낸다. 도 11a에 나타낸 바와 같이, 검정법은 감지 물질 (예를 들어, 생물학적 시료에 대한 수용체를 갖는 형광자와 생물학적 시료에 대한 수용체를 갖는 자성 물질)이 미리 적재된 카트리지를 사용할 수 있었다. 장기간 보관하기 위하여 상기 감지 물질을 건조된 형태로 제조할 수 있었다. 세척액을 포함하는 세척용 주사기 (도 11a에 큰 주사기로 나타냄)를 카트리지에 삽입할 수 있었다. 시험을 위한 목적 물질을 포함하는 샘플은 스웝 키트 또는 용액을 통해 샘플링 용매 중에서 제조하고 샘플링 주사기 (도 11a에 작은 주사기로 나타냄)내로 수집할 수 있었다. 이어서, 샘플링 주사기를 카트리지에 삽입하였다. 이어서, 샘플링 주사기 배럴을 눌러 감지 시약을 샘플에 첨가하였다. 이어서, 카트리지를 1분 동안 진탕할 수 있었다 (독소 분석에서는 이 단계가 포자 분석에서보다 덜 중요하다). 이어서, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 카트리지를 2분간의 인큐베이션 기간 동안 검출 유닛 내로 삽입시켰다. 상기 시간 동안 자성 물질은 자기화되고 목적 생물학적 시료의 존재하에서 형광자를 나타내는 표면을 형성하였다. 여기 및 방출되는 형광을 수집한 후, 사용자가 결과 (예를 들어, 표적의 존재 또는 표적의 부재)를 확인할 수 있었다. 여기 및 방출된 형광의 수집은 5분간 수행할 수 있었다. 분석에 필요한 전체 시간은 대략 3.5분이었다.
동적 표면 형성 및 영상화를 사용하여 수집한 데이터를 도 12 내지 16에 나타낸다.
검출 한도는 하기와 같이, 도 12 내지 14에 나타낸 바와 같은 데이터로부터 결정하였다.
표적
검출 한도
바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 대략 5,000개의 포자
리신 5 ng 미만
SEB 0.1 ng 미만
도 15 및 17에 나타낸 바와 같이, 베이킹 소다, 옥수수 전분, 밀가루 및 아리조나 시험용 분진의 간섭 물질을 시험하였고, 이에 따라 검정법 제한된 효능을 갖는 것으로 측정되었으며, 양성 신호의 결과를 나타내지는 않았다 (즉, 위양성). 그러나, 몇몇 간섭 물질의 존재하에서는 신호가 변할 수 있다. 그러나, 사용된 농도(즉, 간섭 물질의 농도는 100 ㎍/mL로서, 이는 사용된 독소 분석물 농도의 100,000배이다)하에서는 시험한 물질중 어떤 것도 분석을 완전히 저해시키지는 못했다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 바실러스 안트라시스에 가장 가까운 포자 또한 바실러스 안트라시스 검정법으로 시험하였고, 이들 포자 중 어떤 것도 분석당 1,000,000개의 포자 수준에서는 양성 신호를 나타내지는 않았다.
따라서, 동적 표면 형성 및 영상화에 의한 검정법은 감도가 높고 특이적이다. 추가로, 감지 시약의 혼합물은 다중 생물학적 시료에 대해 다중 분석을 할 수 있다. 이는 다양한 방식으로 수행될 수 있지만, 가장 간단한 것으로 2개의 감지기를 함께 혼합하거나, 형광자 및 자기화될 수 있는 물질의 다중 수용체를 배치함으로써 다중감지기를 생성하는 것이다. 2가지 방법 중 전자의 것은 존재시 결과가 표적 A 또는 B인 단색 검정법일 수 있는 반면, 후자의 방법(다중감지기)은 A가 존재할 경우, 형광이 하나의 색으로 존재하고, B가 존재할 경우, 형광이 다른 색으로 존재하는 다색 검정법일 수 있다. 본 실시태양에서, 형광자들은 그 색이 서로 상이하다.
검정법의 일례를 도 18a 내지 18d에 도시한다. 도 18a에 나타낸 바와 같이, 양자 모두가 표적의 생물학적 시료 (포자로서 나타냄)에 결합할 수 있는 자기 미소 구체 및 형광 표지를 포함하는 QTL 감지 용액을 포자와 혼합하였다. 도 18b에 나타낸 바와 같이, 혼합 및 인큐베이션하는 동안 감지 물질 (즉, 자기 미소 구체 및 형광 표지)이 포자에 결합할 수 있었다. 이어서, 도 18c에 나타낸 바와 같이, 용액을 자기화시켰다. 자기장을 적용시킴으로써 결합 및 비결합 자성 물질은 표면으로 끌렸다. 이어서, 도 18d에 나타낸 바와 같이, 용액 중 남아있는 비결합 형광 표지를 씻어내었다. 여기된 표면에 의해 방출된 형광의 존재는 샘플 중의 표적 생물학적 시료의 존재 및(또는) 양을 나타내었다.
본 명세서에서 설명하기 위한 목적으로 제공한 실시예를 통해 본 발명의 원리를 교시하는 동안, 본 분야의 당업자는 본 명세서를 읽음으로써 본 발명의 진정한 범주를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항을 다양하게 변형시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
인용된 참고 문헌
Claims (33)
- 검출 저장고를 한정하는 벽;자기장에 의해 끌릴 수 있고, 표면에 생물학적 시료와 결합할 수 있는 수용체를 포함하는 미립자 고체 지지체 및 생물학적 시료와 결합할 수 있는 형광자를 포함하는, 검출 저장고 내의 유체; 및샘플을 저장고로 도입하기 위한 포트를 포함하는 카트리지.
- 제1항에 있어서, 검출 저장고에서 액체를 유동시킬 수 있도록 적합화된 플런저(plunger)를 추가로 포함하는 카트리지.
- 제1항에 있어서, 상기 형광자가 서로서로 결합된 다수의 형광 종을 포함하여, 소광자로 하여금 형광자와 결합하였을 때 형광자에 의해 방출되는 형광을 증폭적으로 초소광시킬 수 있도록 하는 것인 카트리지.
- 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 엔테로톡신 B, 보툴리눔 독소, 또는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)인 카트리지.
- 제1항에 있어서, 상기 미립자 고체 지지체가 미소 구체인 카트리지.
- 제1항에 있어서, 상기 미립자 고체 지지체가, 미립자 고체 지지체 및 형광자가 생물학적 시료에 결합하였을 때 형광자에 의해 방출되는 형광을 소광시킬 수 있는 소광자를 포함하는 것인 카트리지.
- 제6항에 있어서, 상기 소광자가 형광을 방출하는 것인 카트리지.
- 제1항에 있어서, 상기 검출 저장고 내의 유체가, 생물학적 시료가 미립자 고체 지지체 및 형광자에 결합하였을 때 생물학적 시료와 결합할 수 있는 소광자를 추가로 포함하며, 상기 소광자가 형광자와 결합하였을 때 형광자에 의해 방출되는 형광을 소광시킬 수 있는 것인 카트리지.
- 상기 기술된 바와 같은 카트리지를 수용할 수 있도록 적합화된 하우징(housing);카트리지의 검출 저장고 내부 표면상에 빛을 조사할 수 있도록 적합화된 여기 광원; 및카트리지의 검출 저장고 내부 표면으로부터의 형광 방출을 검출할 수 있도록 적합화된 검출기를 포함하는 검출 장치.
- 제9항에 있어서, 생물학적 시료가 검출 저장고 내에 존재할 때 신호화할 수 있도록 적합화된 표시자를 추가로 포함하는 검출 장치.
- 제9항에 있어서, 상기 표시자가, 생물학적 시료가 검출 저장고 내에 존재할 때 소리를 내는 알람인 검출 장치.
- 제9항에 있어서, 용기의 벽을 통해 검출 저장고 내의 유체에 자기장을 적용시킬 수 있도록 적합화된 자기장 발생기를 추가로 포함하는 검출 장치.
- 제12항에 있어서, 상기 자기장 발생기가 2개 이상의 상이한 강도의 자기장을 발생시킬 수 있는 것인 검출 장치.
- 제9항에 있어서, 저장고로부터 유체를 제거하기 위한 포트를 추가로 포함하는 검출 장치.
- 자기장에 의해 끌릴 수 있고, 표면에 생물학적 시료와 결합할 수 있는 수용체를 포함하는 미립자 고체 지지체를 포함하는 제1 성분; 및생물학적 시료가 수용체에 결합하였을 때 생물학적 시료와 결합할 수 있는 형광자를 포함하는 제2 성분을 포함하는, 샘플 내의 생물학적 시료의 존재 및(또는) 그의 양을 검출하기 위한 키트.
- 제15항에 있어서, 상기 미립자 고체 지지체가 미소 구체인 키트.
- 제15항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 엔테로톡신 B, 보툴리눔 독소, 또는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)인 키트.
- 제15항에 있어서, 생물학적 시료가 수용체 및 형광자에 결합하였을 때, 생물학적 시료와 결합할 수 있는 소광자를 포함하는 제3 성분을 추가로 포함하되, 상기 소광자가 형광자와 결합하였을 때 형광자에 의해 방출되는 형광을 소광시킬 수 있는 것인 키트.
- 제18항에 있어서, 상기 형광자가 서로서로 결합된 다수의 형광 종을 포함하여, 소광자로 하여금 형광자와 결합하였을 때 형광자에 의해 방출되는 형광을 증폭적으로 초소광시킬 수 있도록 하는 것인 키트.
- 제18항에 있어서, 상기 소광자가 형광을 방출하는 것인 키트.
- 제15항에 있어서, 상기 미립자 고체 지지체가, 미립자 고체 지지체 및 형광자가 생물학적 시료에 결합하였을 때 형광자에 의해 방출되는 형광을 소광시킬 수 있는 소광자를 포함하는 것인 키트.
- 제21항에 있어서, 상기 소광자가 형광을 방출하는 것인 키트.
- 저장고를 한정하는 벽을 포함하는 용기의 저장고 내에서 샘플을, 자기장에 의해 끌릴 수 있고 표면에 생물학적 시료와 결합할 수 있는 잔기를 포함하는 미립자 고체 지지체, 및 생물학적 시료와 결합할 수 있는 잔기를 포함하는 형광자와 함께 인큐베이션하는 단계;샘플 내의 고체 지지체 입자가 자기장에 의해 끌리도록 하여 용기의 벽에 인접한 위치에서 표면이 형성되도록 용기의 벽을 통해 샘플에 자기장을 적용시키는 단계;고체 지지체 입자에 의해 형성된 표면상에 광원을 조사하는 단계; 및고체 지지체 입자에 의해 형성된 표면으로부터 방출되는 형광을 검출하는 다계 (여기서, 검출된 형광은 샘플 내의 생물학적 시료의 존재 및(또는) 그의 양을 나타냄)를 포함하는, 샘플 내의 생물학적 시료를 검출하는 방법.
- 제23항에 있어서, 자기장을 적용시킨 후 광원을 조사하기 전에, 고체 지지체 입자에 의해 형성된 표면을 세척하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제24항에 있어서, 자기장을 적용시킨 후 세척하기 전에, 적용한 자기장의 강도를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서, 샘플을, 생물학적 시료가 미립자 고체 지지체 및 형광자에 결합하였을 때 생물학적 시료와 결합할 수 있고, 형광자와 결합하였을 때 형광자에 의해 방출되는 형광을 소광시킬 수 있는 소광자와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 형광자가 서로서로 결합된 다수의 형광 종을 포함하여 소광자로 하여금 형광자와 결합하였을 때 형광자에 의해 방출되는 형광을 증폭적으로 초소광시킬 수 있도록 하는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 소광자가 형광을 방출할 수 있는 것이고, 상기 검출 단계가 소광자에 의해 방출되는 형광을 검출하는 것, 및 또한 임의로는 형광자에 의해 방출되는 형광을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 검출 단계가 형광자에 의해 방출되는 형광을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 미립자 고체 지지체가, 미립자 고체 지지체 및 형광자가 생물학적 시료에 결합하였을 때 형광자에 의해 방출되는 형광을 소광시킬 수 있는 소광자를 포함하는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 소광자가 형광을 방출하는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 미립자 고체 지지체의 표면에 제2 생물학적 시료와 결합할 수 있는 제2 잔기를 포함하고, 상기 형광자가 제2 생물학적 시료가 미립자 고체 지지체에 결합하였을 때 제2 생물학적 시료와 결합할 수 있는 제2 잔기를 포함하는 것인 방법.
- 제23항에 있어서, 샘플을, 저장고 내에서 자기장에 의해 끌릴 수 있고, 표면에 제2 생물학적 시료와 결합할 수 있는 잔기를 포함하는 제2 미립자 고체 지지체, 및 제2 생물학적 시료가 미립자 고체 지지체에 결합하였을 때 제2 생물학적 시료에 결합할 수 있는 잔기를 포함하는 제2 형광자와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하며,여기서, 제2 형광자에 의해 방출되는 형광은 상기 형광자에 의해 방출되는 것과 구별될 수 있고,상기 형광자에 의해 방출되는 형광은 샘플 내의 생물학적 시료의 존재 및(또는) 그의 양을 나타내며, 제2 형광자에 의해 방출되는 형광은 샘플 내의 제2 생물학적 시료의 존재 및(또는) 그의 양을 나타내는 것인 방법.
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Patent event date: 20060829 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
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| PG1501 | Laying open of application | ||
| PC1203 | Withdrawal of no request for examination | ||
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |