[go: up one dir, main page]

KR20060103957A - 치료제 전달용의 리포솜 조성물 - Google Patents

치료제 전달용의 리포솜 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20060103957A
KR20060103957A KR1020067016098A KR20067016098A KR20060103957A KR 20060103957 A KR20060103957 A KR 20060103957A KR 1020067016098 A KR1020067016098 A KR 1020067016098A KR 20067016098 A KR20067016098 A KR 20067016098A KR 20060103957 A KR20060103957 A KR 20060103957A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
liposomes
lipid
composition
liposome
lipids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
KR1020067016098A
Other languages
English (en)
Inventor
사무엘 잘리프스키
웨이밍 장
쉬쿤 후앙
Original Assignee
알자 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 알자 코포레이션 filed Critical 알자 코포레이션
Publication of KR20060103957A publication Critical patent/KR20060103957A/ko
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A61K47/544—Phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1273—Polymersomes; Liposomes with polymerisable or polymerised bilayer-forming substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

중성의 양이온성 지질 및 상기 중성의 양이온성 지질로부터 제조된 리포솜이 개시되어 있다. 지질로 이루어진 리포솜은 핵산 등의 다중 음이온성 화합물(polyanionic compound)의 전달에 적합하다. 상기 전달은 생체내 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 생리적 pH에서의 전하가 중성이고 생리적 pH보다 작은 pH 값에서 양으로 하전되는 중성의 양이온성 지질은, 지질의 용해도를 부여하고 리포솜 지질 이중층 속으로의 그의 패킹을 허용하는 극성 헤드기를 함유한다.

Description

치료제 전달용의 리포솜 조성물{LIPOSOME COMPOSITION FOR DELIVERY OF THERAPEUTIC AGENTS}
본 발명은 치료제인 다중 음이온성 화합물(polyanionic compound), 특히 핵산의 전달용의 리포솜 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 등의 다중 음이온성 화합물을 포함하는 치료제의 생체내 혹은 생체외 전달에 이용하기 위한, 약 양이온성 지질 및 임의로 친수성 폴리머 사슬 및/또는 표적화 리간드(targeting ligand)를 포함하는 리포솜 조성물에 관한 것이다.
특정 세포 속으로의 유전자 물질의 전달을 용이하게 하기 위하여 각종 방법이 개발되어 있다. 이들 방법은 생체내 혹은 생체외 유전자 전달의 양쪽에 대해서 유용하다. 전자에 있어서, 유전자는 대상 속으로 직접 도입(정맥내, 복막내, 에어로졸 등)된다. 생체외(또는 시험관내) 유전자 전달에 있어서, 유전자는 개인의 특정 조직으로부터 세포를 제거한 후 세포 속으로 도입된다. 이어서, 핵내 주입(transfection) 세포는 대상 속으로 도로 도입된다.
생체내 및 생체외 유전자 요법을 달성하기 위한 전달 시스템은 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터, 미세 주사, 전기천공, 원 형질체 융합(protoplast fusion), 인산칼슘 및 리포솜을 포함한다(Felgner, J. 등에 의한 「Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84: 7413-7417 (1987)」; Mulligan, R. S.에 의한 「Science 260: 926-932 (1993)」; Morishita, R. 등에 의한 「J. Clin. Invest . 91: 2580-2585 (1993)」).
양이온성 지질, 즉, 리포솜 지질 이중층 성분으로서 올리고뉴클레오타이드 및 DNA 분절 등의 음하전된 생체 분자의 전달을 위해 양하전된 암모늄 또는 설포늄 이온함유 헤드기를 지닌 지질의 유도체를 이용하는 것이 널리 보고되어 있다. 지질의 양하전 헤드기는 음하전 세포 표면과 상호작용하여 세포에 대한 생체 분자의 접촉 및 전달을 용이하게 한다. 양이온성 지질의 양하전은 핵산 복합화에 더욱 중요하다.
그러나, 이러한 양이온성 리포솜/핵산 복합체의 전신 투여는 폐의 간편한 포획을 가져온다. 이 폐의 편재화는 종래의 양이온성 복합체의 강한 양의 표면전하에 의해 초래된다. 정맥내 투여후 폐, 심장, 간, 신장 및 비장에 있어서 정보제공유전자를 지닌 종래의 양이온성 복합체의 생체내 유전자 발현이 입증되어 있다. 그러나, 형태학적 조사는, 폐의 혈관에 일렬로 있는 내피세포에서 발현의 대부분이 일어나는 것을 나타낸다. 이 관찰의 잠재적인 설명은 폐가 정맥내 주입 후 양이온성 리포솜/핵산 복합체가 만나는 첫번째 기관이라는 것이다. 또한, 폐 속의 내피 세포의 커다란 표면적이 있어, 양이온성 리포솜/핵산 복합체용의 용이하게 접근가능한 표적을 제공한다.
초기의 결과가 고무적이기는 하지만, 간단한 양이온성 리포솜의 정맥내 주입 은 질환(폐 종양 이외의 기타 고형 종양 등)의 전신 부위에 혹은 임상적으로 관련된 유전자 발현(p53 또는 HSV-tk 등)용의 소망의 부위에의 유전자전달에 유용한 것으로 입증되지 않았다. 양이온성 리포솜은 너무 신속하게 명백하게 되고 안전성 관련 호스트를 제공한다. 예를 들면, Senior 등(Biochim . Biophys . Acta 1070, 173-179 (1991))은 스테아릴아민 함유 리포솜이 혈장 및 단리된 적혈구와 하전 및 농도 의존 방식으로 상호작용하는 것을 보고하고 있다. 전체 상호작용은 응괴 같은 덩어리의 형성 및 용혈현상을 포함해서 혈장 성분과 적혈구간에 관찰되며, 생체내 신속한 제거를 제안하고, 폐의 모세혈관에서의 리포솜을 포획한다.
또한, Filion 등(Filion, M. C. 및 Phillips, N. C.에 의한 「Int . J. Pharmaceutics 162: 159-170 (1998)」)은 양이온성 리포솜이 대식세포 등의 포식세포에 대해서 독성의 위험을 불러일으키는 것을 보고한 바 있다. 비독성 조건하의 시험관내 또는 생체내 양이온성 리포솜에 의한 대식세포의 배양은 활성화 대식세포에 의한 단백질 키나제 C 의존 매개체 질산, 종양 괴사 인자-α 및 프로스타글란딘 E2.의 합성의 하향 조절을 가져왔다. 3시간을 초과한 시간 동안 양이온성 리포솜에 대한 대식세포의 노출은 높은 레벨의 독성(ED50 < 50 nmol/㎖)을 초래하였다.
양이온성 리포솜의 용도에 대한 변형예는 팔미토일호모시스테인 등의 리포솜에 pH 민감성 지질을 포함하도록 되어 있었다(Connor, J. 등에 의한 「Proc . Natl. Acad . Sci . USA 81: 1715 (1984)」; Chu, C.-J. 및 Szoka, F., J.에 의한 「L iposo me Res. 4 (1): 361 (1994)」). 이러한 중성의 pH에서의 pH 민감성 지질은 음으로 하전되어 있고, 리포솜 지질 이중층 속에 안정적으로 편입되어 있다. 그러나, 약산성 pH (pH < 6.8)에서, 지질은 하전이 중성으로 되고, 리포솜 이중층을 불안정하게 하는 데 충분한 구조로 변경된다. 지질은, 엔도솜 속에 들어가 있는 리포솜에 편입될 경우, pH가 5.0 내지 6.0인 것으로 보고되어 있어, 불안정하여, 리포솜 내용물의 방출을 일으킨다.
다른 접근법은 핵산 등의 관련된 제제의 전달용의 리포솜 속에 중성의 양이온성 지질을 편입시키는 것이었다. 미국 특허출원 제 2003/0031764호 공보에 개시된 바와 같이, 이러한 리포솜은 생리적 pH에서 감소된 표면 전하를 지니므로, 폐나 기타 기관에 포획되기 어려운 경향이 있다. 그러나, 상기 미국 특허출원에 개시된 지질은 극성의 헤드기가 결여되어 있어 일부의 용매 중에서 용해도의 감소를 초래할 수 있다.
또한, 종양 세포 직접 표적화는 혈관형성성 내피 세포 표적화보다 훨씬 더 매력적이다. 리포솜/DNA 복합체는 세포가 혈액 구획에 직접 노출되므로 비교적 용이하게 종양 혈관구조의 혈관 형성성 내피 세포에 도달한다. 종양 세포의 표적화를 위해서는, 리포솜/DNA 복합체는 누설되는 종양 혈관을 통해 관외유출되어 종양 세포에 도달가능하게 될 필요가 있다. 따라서, 복합체 안정성, 크기, 표면 전하, 혈액순환 시간 및 복합체의 핵내 주입 효율은 종양 세포 핵내 주입 및 발현용의 모든 인자이다.
발명의 개요
따라서, 본 발명의 목적은 핵산 등의 다중 음이온성 화합물을 세포에 전신 전달하기 위한 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 중성의 양이온성 지질을 포함하는 리포솜을 제공하는 데 있고, 상기 리포솜은 핵산을 세포나 조직에 후속 전달하기 위한 핵산과 관련되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 친수성 폴리머에 의해 유도된 지질을 포함하는 리포솜을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 리포솜이 환자의 혈액에 있어 연장된 순환시간을 지니며, 또한, 표적 조직 또는 세포에서의 유전자 전달 혹은 유전자 조정용의 리포솜 조성물을 제공하는 데 있다.
따라서, 본 발명은 일측면에 있어서, (i) 하기 화학식 (I)의 구조를 지닌 중성의 양이온성 지질 및 (ii) 다중 음이온성 화합물을 포함하는 다중 음이온성 화합물 투여용의 조성물을 포함한다:
Figure 112006057132389-PCT00001
식 중,
R1 및 R2는 각각 6 내지 24개의 탄소원자를 지닌 직쇄 혹은 분기쇄의 알킬, 알케닐 또는 알키닐 사슬이고;
n = 1-20;
m= 1-20;
p = 1-3;
L 및 Q는 독립적으로 Cl-C6 알킬, -X-(C=O)-Y-CH2-, -X-(C=O)-, -X-CH2-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X 및 Y는 독립적으로 산소, NH 및 직접 결합으로부터 선택되며;
W는 아미노, 구아니디노 또는 아미디노 부분이고;
Z는 7.4보다 작고 약 4.0보다 큰 pKa를 지닌 약염기성 부분임.
하나의 구체예에 있어서, L 및 Q는 Cl-C6 알킬이다. 다른 구체예에 있어서, p는 1이고 W는 -NR8 2-이고, R8은 각각 독립적으로 H 또는 C1 -6 알킬로부터 선택된다. 다른 구체예에 있어서, p는 2이고 W는 -NR8-이다.
소정의 구체예에 있어서, n = 1-10 또는 1-5이다. 다른 구체예에 있어서, m = 1-10 또는 1-5이다.
특정 구체예에 있어서, Z의 pKa는 6.5보다 작고 약 5.0보다 크다. 임의의 다른 구체예에 있어서, Z의 pKa는 6.0보다 작고 약 5.0보다 크다. 소정의 구체예에 있어서, Z는 환식 또는 비환식 아민이고, 특히 Z는 이미다졸이다.
하나의 구체예에 있어서, 다중 음이온성 화합물은 폴리뉴클레오타이드, 음으로 하전된 단백질 또는 다당류이다. 특정 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 소간섭 RNA(small interfering RNA), 대용(surrogate) 링커를 지닌 폴리뉴클레오타이드, 5가 인산 링커 및 대용 링커를 지닌 하이브리드 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 혼합물이다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 변성 뉴클레오타이드, 비천연적으로 생성되는 뉴클레오타이드, 단백질-핵산 복합체 또는 폴리뉴클레오타이드-약물-컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 리포솜의 적어도 일부에 포획된다.
부가의 구체예에 있어서, 상기 조성물은 리포솜에 포획된 치료제를 더 포함한다.
리포솜은 친수성 폴리머 사슬의 표면 코팅을 형성하도록 리포폴리머(lipopolymer)(예를 들어, 친수성 폴리머에 의해 유도된 지질)를 더 포함할 수 있다. 특히, 리포폴리머는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리하이드록시프로필 메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸 아크릴레이트, 폴리메타크릴아마이드, 폴리-디메틸아크릴아마이드, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로플옥사졸린, 폴리아스파르트아마이드 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드 등의 친수성 폴리머, 그의 공중합체 및 그의 혼합물을 포함한다. 친수성 폴리머는 지질에 공유결합되어 있고, 일부의 구체예에 있어서, 공유결합은 리포솜으로부터 폴리머의 탈착을 허용하도록 분리가능하다. 이 분리는 산, 염기, 티올, 효소 작용(예를 들어, 프로테아제, 에스테라제 또는 글리코시다제), 산화, 환원 또는 빛에 의해 수행될 수 있다. 분리가능한 결합은 에스테르, 히드라존, 아마이드 및 에테르를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
추가의 구체예에 있어서, 리포솜은 해당 리포솜을 표적 부위에 표적화하기 위한 리간드를 더 포함한다. 표적화 리간드는 리포솜 형성용 지질의 극성 헤드기에 직접, 또는 당업계에 공지된 결합(혹은 연결)을 통해서 부착될 수 있다. 표적화 리간드는 또한 리포폴리머 상의 친수성 폴리머의 말단에 공유결합으로 부착될 수 있다. 특히, 표적화 리간드는 목적으로 하는 표적 세포, 예를 들어, 내피 세포, 종양 세포, 또는 유전자 요법이 요망되는 경우 이러한 세포에 의한 내재화를 위한 세포에 대해 결합 친화성을 지닌다. 표적 세포는 본 명세서에 열거된 것으로 제한되지 않고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자(이하 "당업자"라 약칭함)라면 목적으로 하는 치료에 대해 원하는 바대로 표적 세포를 선택할 수 있다. 소정의 구체예에 있어서, 표적화 리간드는 펩타이드, 당류, 비타민(예를 들어, 엽산, 비오틴, 시아노코발아민), 항체, 렉틴, 또는 그의 유사체이다. 다른 구체예에 있어서, 표적화 리간드는 성장인자수용체의 세포외 영역에 특이적으로 결합된다. 이러한 수용체는 HER2/neu 종양 유전자의 c-erbB-2 단백질 산물(product), 표피성장인자 수용체, 염기성 섬유모세포성장인자 수용체 및 혈관내피성장인자 수용체로부터 선택된다. 다른 구체예에 있어서, 표적화 리간드는 E-셀렉틴 수용체, L-셀렉틴 수용체, P-셀렉틴 수용체, 엽산 수용체, CD4 수용체, CD19 수용체, αβ 인테그린 수용체 및 케모카인 수용체로부터 선택된 수용체에 결합된다. 표적화 리간드는 예를 들어, 엽산, 인산 피리독살, 비타민 B12, 시알릴 루이스x(sialyl Lewisx), 트랜스페린, 표피 성장인자, 염기성 섬유모세포 성장인자, 혈관내피 성장인자, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, RGD 펩타이드 또는 NGR 펩타이드일 수도 있다.
소정의 구체예에 있어서, 리포솜은 화학식 (I)의 지질을 5 내지 80 몰% 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 소포형성용 지질은 상기 열거된 바와 같은 친수성 폴리머를 포함하는 리포폴리머를 1 내지 30 몰% 함유한다. 리포폴리머의 추가는 리포폴리머가 결여된 리포솜과 비교할 때 리포솜의 순환시간을 연장하는 데 유효하다. 또 다른 구체예에 있어서, 리포솜은 또한 양이온성 지질을 포함한다.
다른 측면에 있어서, 다중 음이온성 화합물의 투여용의 리포솜의 제조방법이 제공되며, 이때 리포솜은 연장된 순환 시간을 특징으로 한다. 상기 방법은 상기 화학식 (I)의 구조를 지닌 중성의 양이온성 지질을 포함하는 소포형성용 지질로부터 리포솜을 형성하는 단계; 및 다중 음이온성 화합물을 첨가하는 단계를 포함한다. 또, 리포솜은 약 0.05 내지 0.5 마이크론 범위의 선택된 크기로 크기조정된다. 중성의 양이온성 지질은 중성의 양이온성 지질을 결여하고 있는 리포솜에 비교해서 리포솜의 순환시간을 연장하는 데 유효하다.
또 다른 측면에 있어서, 세포를 본 명세서에 기재된 리포솜 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 세포의 핵내 주입방법이 제공된다. 다른 측면에 있어서, 다중 음이온성 화합물을 세포에 전달하는 방법은 세포가 본 명세서에 기재된 리포솜 조성물과 접촉됨으로써 제공된다.
도 1은 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 이미다졸(DSPEI) 및 디스테아로일포스파티딜에탄올아민디이미다졸(DSPEDI)의 제조용의 합성식을 표시한 도면;
도 2는 DSPEI로부터, 히스타민 디스테아로일 글리세롤(HDSG)을 함유하는 중성의 양이온성 지질(NCL)로부터, 그리고 디메틸디옥타데실암모늄으로부터 제조된 리포솜용의 pH의 함수로서의 제타전위측정치를 표시한 도면;
도 3은 DNA-리포솜 복합체를 지닌 베이비 햄스터 신장 세포의 핵내 주입을 표시한 그래프.
발명의 상세한 설명
I. 정의
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 다른 언급이 없다면 본 발명은 특정 지질 또는 합성법으로 한정되지 않고 다양하게 변경가능함을 이해할 필요가 있다. 또 한, 본 명세서에서 이용되는 용어는 단지 특정 실시예를 설명하기 위한 목적이며 한정하기 위하여 의도된 것이 아님도 이해할 필요가 있다. 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에 있어서 이용되는 바와 같이, 단수 형태는 명백하게 다른 언급이 없는 한 복수의 형태도 포함하는 것임에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 단일의 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 2종 이상의 상이한 폴리뉴클레오타이드의 조합 혹은 혼합물 등도 포함한다.
수치의 범위가 제공될 경우, 명백하게 규정되어 있지 않은 한, 그 범위의 상한치와 하한치 사이의 하한치의 단위의 각 1/10까지의 각각의 사이에 있는 값 그리고 기타 달리 표현되거나 그 표현된 범위에 있어서 사이에 끼인 값은 본 발명 속에 포함되는 것으로 이해할 필요가 있다. 이들 보다 작은 범위의 상한치와 하한치는 독립적으로 보다 작은 범위 내에 포함될 수도 있고, 또한 표시된 범위 내에서 구체적으로 제외된 한계에 종속되는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다. 표시된 범위가 한계치의 한쪽 또는 양쪽을 포함할 경우, 포함된 한계치의 어느 한쪽 또는 양쪽을 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
본 발명을 설명하고 청구하는 데 있어, 이하에 설명된 정의에 따라 이하의 용어가 사용될 것이다.
정의 "양이온성"이란 순수 양 하전을 지닌 성질을 의미하며, 존재하는 하전의 총합이 양(+)인 한 음 하전의 존재를 포함할 수 있다.
용어 "음이온성"이란 순수 음 하전을 지닌 성질을 의미하며, 존재하는 하전의 총합이 음(-)인 한 양 하전의 존재를 포함할 수 있다.
용어 "다중 음이온성"이란 1개보다 많은 음 하전을 지닌 성질을 갖는 화합물을 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"란 길이가 적어도 6개의 뉴클레오타이드에 상당하는 핵산 서열을 의미하며, 폴리뉴클레오타이드가 다중 음이온성 특성을 보유하는 한, DNA, RNA, RNA/DNA 하이브리드, 촉매 RNA, 비천연적으로 생성되는 뉴클레오타이드 또는 변성 뉴클레오타이드를 함유하는 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 소간섭 RNA, 트리플렉스 결합 핵산 서열, 대용 논-포스포디에스테르 결합을 함유하는 폴리 혹은 올리고뉴클레오타이드 유사물, 펩타이드 핵산-핵산 하이브리드 등의 5가 인산 링커 및 대용 링커를 함유하는 하이브리드 폴리뉴클레오타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드(또는 올리고뉴클레오타이드)-약물 컨쥬게이트 등을 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "중성의" 지질은 중성의 pH에서 하등의 순 하전을 갖지 않는 것이며, 중성의 pH에서 동일한 수의 양 하전과 음 하전을 갖는 쯔비터 이온성 지질을 포함한다,
"하전된" 지질은 순수 양 하전 또는 순수 음 하전을 지닌 것이다.
"리포폴리머"는 친수성 폴리머에 의해 유도된 지질이다.
"중성의 양이온성 지질"은 일반적으로 pH 약 7 내지 약 7.5의 범위에서 순수 하전을 지니지 않고, 약염기성 부분의 pKa 이하의 pH에서 주로 양이온성으로 되는 약염기성 부분을 함유하는 지질이다. 따라서, 중성의 양이온성 지질은 생리적 pH 에서 중성이지만, 염기성 기의 pKa 보다 작은 pH에서 양이온성이다.
용어 "리포솜"은 통상의 의미에서 지질 소포를 칭하는 데 이용되며, 또한, 통상의 지질 소포와는 다른 형태를 지닐 수 있는 지질-폴리뉴클레오타이드 입자를 포함한다.
용어 "소포형성용 지질"이란 소수성 및 극성 헤드기 부분을 지니고, 수중 이중층 수포속으로 자발적으로 형성될 수 있는 양친매성 지질을 의미한다. 소포형성용 지질은 인지질로 예시되며, 이중층 소포의 형태의 경우, 소수성 부분은 이중층 막의 내부인 소수성 영역과 접촉하고, 극성 헤드기 부분은 이중층 막의 외부인 극성 표면쪽으로 배향되어 있다. 이러한 형태의 소포형성용 지질은 전형적으로 1개 혹은 2개의 소수성 아실 탄화수소 사슬 또는 스테로이드기를 포함하고, 또한 극성 헤드기에서 아민, 산, 에스테르, 알데하이드 혹은 알코올 등의 화학적 반응기를 함유할 수도 있다. 이러한 부류에는 포스파티딜 콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티드산(PA), 포스파티딜 이노시톨(PI) 및 스핑고미엘린(SM) 등의 인지질이 포함되며, 여기서, 2개의 탄화수소 사슬은 전형적으로 길이가 약 14 내지 22개의 탄소 원자에 상당하며, 다양한 불포화도를 지닌다.
"알킬"이란 탄소와 수소를 함유하는 완전 포화된 1가의 라디칼을 의미하고, 분기 혹은 직쇄일 수 있다. 알킬기의 예로서는 메틸, 에틸, n-부틸, t-부틸, n-헵틸 및 이소프로필을 들 수 있다. "저급 알킬"이란 1개 내지 6개의 탄소원자를 지닌 알킬기를 의미하며, 그 예로서는 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, t-부틸, 이소 아밀, n-펜틸 및 이소펜틸을 들 수 있다.
"알케닐"이란 탄소와 수소를 함유하는 1가의 기를 의미하고, 분기 혹은 직쇄일 수 있고, 또한 1개 이상의 이중결합을 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 "친수성 폴리머"란 수중 가용성인 부분을 지닌 폴리머를 의미하며, 실온에서 폴리머에 어느 정도의 수 용해도를 부여한다. 친수성 폴리머의 예로서는, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필옥사졸린, 폴리하이드록시프로필-메타크릴아마이드, 폴리메타크릴아마이드, 폴리디메틸-아크릴아마이드, 폴리하이드록시프로필메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸아크릴레이트, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아스파르트아마이드, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상기 폴리머의 공중합체 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. 이들 다수의 폴리머의 성질 및 반응은 미국특허 제 5,395,619호 및 제 5,631,018호 공보에 기재되어 있다.
"기능성 폴리머"란 1개 이상의 반응성 작용기를 함유하는 중합체로, 전형적으로 필수는 아니지만 다른 화합물과 반응해서 공유결합을 형성하기 위해 말단 부분에 변성되어 있는 폴리머를 의미한다. 이러한 반응성 작용기를 지니도록 폴리머를 기능화시키는 반응식은 당업자에 의해 용이하게 결정되고/결정되거나, 예를 들면 미국 특허 제 5,613,018호 공보 또는 잘립스키(Zalipsky) 등에 의한 「Eur . Polymer. J., 19 (12): 1177-1183 (1983)」 및 「Bioconj . Chem ., 4 (4): 296-299 (1993)」에 개시되어 있다.
약호: PEG: 폴리에틸렌 글리콜; mPEG: 메톡시-말단폴리에틸렌 글리콜; Chol: 콜레스테롤; PC: 포스파티딜 콜린; PHPC: 부분 수소첨가된 포스파티딜 콜린; PHEPC: 부분 수소첨가된 계란 포스파티딜 콜린; PHSPC: 부분 수소첨가된 콩 포스파티딜 콜린 ; DSPE: 디스테아로일 포스파티딜 에탄올아민; DSPEI: 디스테아로일포스포에탄올아민 이미다졸; APD: l-아미노-2,3-프로판디올; DTPA: 디에틸렌테트라민 펜타아세트산; Bn: 벤질; NCL: 중성의 양이온성 리포솜; FGF: 섬유모세포성장인자; HDSG; 히스타민 디스테아로일 글리세롤; DOTAP: 1,2-디올레일옥시-3-(트리메틸아미노)프로판; DTB: 디티오벤질; FC-PEG: 고속 분해성 PEG; SC-PEG: 저속 분해성 PEG; DDAB: 디메틸디옥타데실암모늄; EtDTB: 에틸디티오벤질; DOPE: 디올레오일 포스파티딜에탄올아민; BHK: 베이비 햄스터 신장.
II . 리포솜
일측면에 있어서, 본 발명은 리포솜 및 다중 음이온성 화합물, 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 리포솜 조성물을 포함한다. 리포솜은 중성의 양이온성 지질, 및 임의로 해리가능한 결합을 통해 임의로 유도된 리포폴리머를 포함한다. 리포솜은 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 이들 리포솜 성분에 대해서는 이하에 설명할 것이다.
A. 중성의 양이온성 지질
본 발명의 리포솜에 포함된 중성의 양이온성 지질은 일반적으로 화학식 (I)의 구조로 표시되는 지질이다:
Figure 112006057132389-PCT00002
식 중,
R1 및 R2는 각각 6 내지 24개의 탄소원자를 지닌 직쇄 혹은 분기쇄의 알킬, 알케닐 또는 알키닐 사슬이고;
n = 1-20;
m= 1-20;
p = 1-3;
L 및 Q는 독립적으로 Cl-C6 알킬, -X-(C=O)-Y-CH2-, -X-(C=O)-, -X-CH2-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X 및 Y는 독립적으로 산소, NH 및 직접 결합으로부터 선택되며;
W는 아미노, 구아니디노 또는 아미디노 부분이고;
Z는 7.4보다 작고 약 4.0보다 큰 pKa를 지닌 약염기성 부분이다.
다른 구체예에 있어서, Z는 4.5 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 5 내지 6.5, 가장 바람직하게는 5 내지 6의 pKa를 지닌 부분이다.
약 염기성 부분 Z에 의해 생리적 pH 7.4가 주로 예를 들어 중성의 하전에서 50% 보다 많지만, 그의 pKa보다 낮은 선택된 pH 값에서 주로 양 하전으로 되는 경향이 있는 지질로 된다. 예로서 또한 바람직한 구체예에 있어서, Z는 이미다졸 부분이며, pKa가 약 6.0이다. 생리적 pH 7.4에서, 이 부분은 주로 중성이지만, 6.0 보다 낮은 pH 값에서, 상기 부분은 주로 양으로 된다. 본 발명을 뒷받침하기 위해, 이미다졸 부분을 지닌 지질이 제조되어, 후술하는 리포솜의 제조에 이용되었다.
이미다졸에 부가해서, 벤즈이미다졸 및 나프트이미다졸뿐만 아니라 치환된 이미다졸 등의 기타 환식 아민은, 상기 치환이 pKa를 바람직한 범위 밖의 값으로 변경하지 않는 한 상기 주어진 구조 중의 Z부분으로서 이용될 수 있다. 적합한 치환체는 전형적으로 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 아릴, 할로겐, 할로알킬, 아미노 및 아미노알킬을 포함한다. pKa가 5.0 내지 6.0의 범위를 지니도록 보고된 이러한 화합물의 예로는 각종 메틸 치환된 이미다졸 및 벤즈이미다졸, 히스타민, 나프트[1,2-d]이미다졸, 1H-나프트[2,3-d]이미다졸, 2-페닐이미다졸, 2-벤질 벤즈이미다졸, 2,4-디페닐-lH-이미다졸, 4,5-디페닐-lH-이미다졸, 3-메틸-4(5)-클로로-lH-이미다졸, 5(6)-플루오로-1H-벤즈이미다졸 및 5-클로로-2-메틸-1H-벤즈이미다졸 을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
피리딘류, 퀴놀린류, 이소퀴놀린류, 피리미딘류, 펜난트롤린류 및 피라졸류를 포함하는 헤테로원자 등의 기타 질소 함유 환식 아민도 Z기로서 이용될 수 있다. 재차, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 아릴, 할로, 알킬, 아미노, 아미노알킬 및 하이드록시로부터 선택된 치환기를 지닌 많은 이러한 화합물이 바람직한 범위의 pKa를 지니는 것으로 보고되어 있다. 이들은 피리딘류 중에서 2-벤질피리딘, 각종 메틸- 및 디메틸피리딘 뿐만 아니라, 기타 저급 알킬 및 하이드록시알킬 피리딘류, 3-아미노피리딘, 4-(4-아미노페닐)피리딘, 2-(2-메톡시에틸)피리딘, 2-(4-아미노페닐)피리딘, 2-아미노-4-클로로피리딘, 4-(3-퓨라닐)피리딘, 4-비닐피리딘, 및 4,4'-디아미노-2,2'-비피리딘을 포함하며, 이들은 모두 pKa가 5.0 내지 6.0인 것으로 보고되어 있다. 바람직한 범위의 pKa를 지니는 것으로 보고된 퀴놀리노이드 화합물은 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 및 8-아미노 이소퀴놀린, 각종 저급 알킬- 및 하이드록시-치환 퀴놀린류 및 이소퀴놀린류, 4-, 5-, 7- 및 8-이소퀴놀리놀, 5-, 6-, 7- 및 8-퀴놀리놀, 8-히드라지노퀴놀린, 2-아미노-4-메틸퀴나졸린, 1,2,3,4-테트라하이드로-8-퀴놀리놀, 1,3-이소퀴놀린디아민, 2,4-퀴놀린디올, 5-아미노-8-하이드록시퀴놀린, 및 퀴누클리딘을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또, 바람직한 범위의 pKa를 지니는 것으로는, 4-(N,N-디메틸아미노)피리미딘, 4-(N-메틸아미노)피리미딘, 4,5-피리미딘 디아민, 2-아미노-4-메톡시 피리미딘, 2,4-디아미노-5-클로로피리미딘, 4-아미노-6-메틸피리미딘, 4-아미노 피리미딘, 및 4,6-피리미딘디 아민뿐만 아니라, 4,6-피리미딘디올 등의 수개의 아민-치환된 피리미딘이 있다. 1,10-, 1,8-, 1,9-, 2,8-, 2,9- 및 3,7-페난트롤린 등의 각종 페난트롤린은 그들의 저급 알킬-, 하이드록실- 및 아릴-치환 유도체의 대부분과 마찬가지로, 바람직한 범위의 pKa를 지닌다. 사용가능한 피라졸은 4,5-디하이드로-lH-피라졸, 4,5-디하이드로-4-메틸-3H-피라졸, 1-하이드록시-lH-피라졸 및 4-아미노피라졸을 들 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
아닐린 및 나프틸아민 등의 많은 질소치환 방향족도 Z기의 적합한 구체예이다. 메틸 또는 기타 저급 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 하이드록실, 부가의 아민기, 아미노알킬, 할로겐 및 할로알킬로부터 선택된 기로 더욱 치환된 아닐린 및 나프틸아민은 일반적으로 바람직한 범위의 pKa를 지니는 것으로 보고되어 있다. 이용가능한 기타 아민-치환 방향족으로서는 2-아미노페나진, 2,3-피라진디아민, 4- 및 5-아미노아세나프텐, 3- 및 4-아미노 피리다진, 2-아미노-4-메틸퀴나졸린, 5-아미노인단, 5-아미노인다졸, 3,3',4,4'-비페닐 테트라민, 및 1,2- 및 2,3-디아미노안트라퀴논을 포함한다.
또한, Z의 구체예로서는 트리메틸하이드라진, 테트라메틸하이드라진, 1-메틸-1-페닐하이드라진, 1-나프탈레닐하이드라진, 및 2-, 3- 및 4-메틸페닐 하이드라진을 포함하는 각종 치환된 하이드라진 등의 소정의 비환식 아민화합물이 포함되고, 이들은 모두 4.5 내지 7.0의 pKa를 지니는 것으로 보고되어 있다. 이 범위에 pKa를 지니는 지환식 화합물은 1-피롤리딘에탄아민, 1-피페리딘에탄아민, 헥사메틸렌 테트라민 및 1,5-디아자비사이클로[3.3.3]운데칸을 포함한다.
또, 상기 주어진 구조에 있어서의 Z 부분으로서 적합한 것은 공계류중인 미국특허출원 제 2003/0031764호 공보에 개시된 바와 같은 임의의 아미노슈거이다.
상기 열거한 것들은 본 발명의 지질 컨쥬게이트에 있어서 pH-반응성 기로서 이용가능한 4.5 내지 7.0의 pKa를 지닌 화합물의 예를 부여하고, 이들 열거한 것들로 제한시키고자 의도된 것은 아니다. 선택된 구체예에 있어서, Z기는 이미다졸, 아닐린, 아미노슈거 또는 이들의 유도체이다. 바람직하게는 Z기의 유효한 pKa는 지질기에 대한 그의 부착에 의해 상당히 영향받지 않는다. 결합된 컨쥬게이트의 예는 이하에 기재되어있다.
본 발명의 지질은 Z 부분 및 4차 암모늄 부분을 연결하는 중성 결합 L을 포함한다. 지질도 4차 암모늄 부분 W와 인지질 헤드기의 포스페이트 부분간의 중성의 결합 Q를 포함한다. 결합 L 및 Q는 가변적이며, 바람직한 구체예에 있어서, 각각은 메틸렌, 카바메이트, 에스테르, 아마이드, 카보네이트, 우레아, 아민 및 에테르로부터 선택된다. 본 발명을 뒷받침하기 위해 제조된 바람직한 지질에 있어서, L 및 Q가 -CH2-인 경우의 메틸렌 결합이 제조되었다.
지질의 꼬리부분에 있어서, R1 및 R2는 동일 또는 상이할 수 있고, 6 내지 24개의 탄소원자를 지닌 분기 혹은 미분기된 알킬, 알케닐 또는 알키닐 사슬일 수 있다. 더욱 바람직하게는, R1 및 R2기는 길이가 탄소원자 12 내지 22개에 상당하 는 것으로, R1 = R2 = C17H35(이 기가 스테아릴기로 됨) 또는 R1 = R2 = C17H33(이 기가 올레일기로 됨), 또는 R1 = R2 = C15H33(팔미토일 사슬을 포함함)로 된다.
본 발명의 지질은 표준의 합성법을 이용해서 제조될 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, 본 발명의 뒷받침을 위해 수행된 연구에 있어서, Z가 이미다졸이고, n= 1, p=l, m= 1, L이 메틸렌이고, Q가 메틸렌이며, W가 아미노이고, R1 = R2 =Cl7H35인 상기 표시된 구조를 지닌 지질이 제조되었다. 예시적인 지질의 제조용의 반응식은 도 1에 표시되어 있고, 합성의 상세는 실시예 1에서 제공된다. 간단하게는, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 이미다졸은 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 및 4(5)-이미다졸 카복스알데하이드로부터 제조되어 피리딘/보란의 존재하에 반응되어 메틸렌 결합을 통해서 포스파티딜에탄올아민의 아미노 부분에 결합된 이미다졸 부분을 지닌 지질이 얻어진다. 과잉의 알데하이드가 사용된 경우, 2개의 이미다졸이 포스파티딜에탄올아민에 결합되어, 디이미다졸이 얻어진다. 4(5)-이미다졸 카복스알데하이드 대신에 벤즈이미다졸 카복스알데하이드를 이용하는 마찬가지 경로가 벤즈이미다졸 결합된 포스파티딜에탄올아민을 생성하는 데 이용될 수 있다.
다른 결합을 지닌 지질의 제조는 당업자에게 있어 통상의 방법을 이용해서 용이하게 수행된다. 다른 결합으로서는 에테르(L = -O-CH2-) 및 에스테르 결합(L = -O-(C=O)-), 그외 아마이드, 우레아 및 아민 결합(예를 들어, L=-NH-(C=O)-NH-, -NH-(C=O)-CH2-, -NH-(C=O)-NH-CH2- 또는 -NH-CH2-)을 들 수 있다. 합성 절차의 추가의 상세는 통상의 방법을 이용해서, 예를 들어, 공계류중인 미국특허출원 제 2003/0031764호 공보로부터 얻어질 수 있다.
본 발명을 뒷받침하기 위해 수행된 연구에 있어서, DSPEI로 이루어진 리포솜은 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 비교를 위해, 공계류 중인 미국특허출원 제 2003/0031764호 공보에 기재된 중성의 양이온성 지질인 히스타민-디스테아로일 글리세롤(HDSG)로 이루어진 리포솜도 제조하였다. 히스타민의 이미다졸의 pKa는 6이다. HDSG는 생리적 pH(pH 7.4)에서 중성인 경향이 있고, 6보다 낮은 pH에서 주로 양 하전된다. HDSG로 이루어진 리포솜은 통상의 양이온성 리포솜과 마찬가지로 대략 pH 4 내지 5에서 DNA를 포획한다. HDSG 리포솜/복합체의 표면 전하는 혈액 순환시 생리적 pH에서 감소된다. HDSG의 표면 전하는 pH 5 내지 6(엔도솜 및 용해소체(lysosome)에서 동일한 pH)에서 주로 양이므로, 용해소체 막과 복합체와의 상호작용 및 핵산 내용물의 세포질로의 방출을 용이하게 한다.
실시예 5에 기재된 바와 같이, 제타 전위 계측치는 DSPEI를 함유하는 리포솜 및 HDSG를 함유하는 리포솜에 대해서 얻어졌다. 이 결과는 도 2에 표시되어 있다. DSPEI-함유 리포솜에 대한 제타전위(삼각형)는 생리적 pH 근방에서 0인 반면, DSPEI-함유 리포솜은 pH 7 근방에서 중성인 것을 나타내고 있다. DSPEI-함유 리포솜에 대해서 pH 증가에 따른 제타 전위의 감소는 다른 리포솜 제제에 대해서 관찰되는 것보다 크다. HDSG-함유 리포솜에 대한 제타 전위(사각형)는 얕은 제타 전위 대 pH 기울기에 의해 증명되는 바와 같이, pH의 변화에 덜 반응성이다. 이것은 생리적 pH에서 높은 pKa와 큰 전하를 나타내기 쉽다. 이들 결과는 DSPEI-함유 리포솜이 중성의 양이온성 지질 히스타민 디스테아로일글리세롤(HDSG)을 함유하는 리포솜보다도 낮은 pKa를 지니는 동시에 생리적 pH에서 더욱 중성인 것을 나타낸다. HDSG에 대한 것에 비해서 DSPEI에 대한 제타 전위 대 pH의 가파른 기울기도 DSPEI가 HDSG보다 낮은 pKa를 지니므로, DSPEI-함유 리포솜이 HDSG-함유 리포솜보다 생리적 pH에서 훨씬 더 중성인 것을 나타낸다. DSPEI-함유 리포솜의 보다 큰 중성도는 생체내 조건하에서 혈장 단백질 및 세포와의 비특이적인 상호작용의 최소화를 위해 중요하므로, 혈액 순환을 연장시켜, 질병 조직에 대해서 유전자 조절제의 전달뿐만 아니라 약물 및 유전자의 전신 전달에 필요하다.
도 2를 계속 참조하면, 제타 전위 계측치도 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB)를 이용해서 제조된 리포솜(다이아몬드)에 대해서 구하였다. DDAB-함유 리포솜의 비교적 평탄한 기울기는 pH의 가변에 따른 제타 전위의 변화가 적고, DDAB에 대한 pKa가 HDSG 또는 DSPEI에 대한 것보다 높은 것을 나타낸다. 따라서, DDAB-함유 리포솜은 생리적 pH에서 그들의 양이온성 하전을 유지하고, 생체내 조건하에서 혈장 단백질과의 비특이적 상호작용에 참여하기 더욱 쉬워진다. 결과적으로 DDAB-함유 리포솜은 순환으로부터 신속하게 물러나 질환 조직에 대한 약물 또는 유전자 전달에 덜 적합하게 된다.
화학식 (I)의 중성의 양이온성 지질에 의해 부여되는 부가의 이점은 극성 헤드기의 존재에 연유해서 이들 지질의 더욱 큰 용해도와 관계가 있다. 보다 큰 용 해도는 생리적 pH에 가까운 pH 값에서 리포솜 DNA 제제를 허용한다. 또한, 극성 헤드기를 지닌 지질은 통상의 인지질로 이루어진 지질 이중층으로 더욱 양호하게 패킹되는 경향이 있다. 더욱 양호한 패킹은 리포솜 안정성을 부여한다.
이론에 구속되는 것을 원하지 않지만, 화학식 (I)의 중성의 양이온성 지질은 생체내 투여에 대해 증대된 안정성을 지닌 리포솜을 제공하고, 또한 다중 음이온성 화합물을 포획해서 전달하고, 나아가서는 비특이적 상호작용(예를 들어, 혈장 단백질과의)을 피하는 데 유효한 생리적 pH에서 비하전(uncharged) 리포솜을 제공하며, 이에 따라, 혈장에서의 연장된 순환을 제공하는 것으로 가정된다. 이와 같이 해서, 본 명세서에 기재된 중성의 양이온성 지질은 종래의 양이온성 지질 및 그들의 관련된 독성의 위험에 대해서 개량되어 있다.
B. 소포형성용 지질
소포형성용 지질은 2개의 탄화수소 사슬, 전형적으로 아실 사슬과 극성 헤드기를 지닌 것이 바람직하다. 이 부류에는 포스파티딜콜린(PC), 포스파티드산(PA), 포스파티딜이노시톨(PI) 및 스핑고미엘린(SM) 등의 인지질이 포함되고, 2개의 탄화수소사슬은 전형적으로 길이가 탄소원자 약 14 내지 22개에 상당하며, 다양한 불포화도를 지닌다. 소정예에 있어서, 분기된 탄화수소 사슬을 지닌 소포형성용 지질을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
아실 사슬이 각종 포화도를 지닌 상기 지질 및 인지질은 시판품으로부터 얻을 수 있고, 또는 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 포함될 수 있 는 기타 지질은 당지질 및 콜레스테롤 등의 스테롤이다. 계란 또는 콩 포스파티딜콜린 등의 시판품은 부분 수소첨가된 상태 또는 천연 상태에서 이용될 수 있다. 이하의 예에 있어서는, 부분 수소첨가된 콩 포스파티딜콜린을 이용하였다(PHSPC).
상이한 유형의 소포형성용 지질은 또한 혼합가능하므로, 예를 들어, 리포솜은 각종 몰 분율로 존재하는 광범위한 지질을 이용해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 PE, PC 및 콜레스테롤의 혼합물로부터 통상 제조된다.
C. 리포폴리머: 친수성 폴리머에 의해 유도된 지질
리포솜 조성물에 임의로 포함될 수 있는 제 2성분은 리포폴리머 또는 친수성 폴리머에 의해 유도된 지질이다. 리포폴리머로서 이용될 수 있는 소포형성용 지질은 소포형성용 지질 성분에 대해서 기재된 것들 중의 어느 것이라도 된다. 인지질 등의 디아실 사슬을 지닌 소포형성용 지질이 바람직하다. 인지질의 일례는 포스파티딜에탄올아민(PE)이며, 이것은 활성화 폴리머에 결합하기 편리한 반응성 아미노기를 제공한다. PE의 일례는 디스테아릴 PE(DSPE)이다. 폴리에틸렌글리콜에 의한 유도화는 바람직한 리포폴리머를 가져오며, 바람직하게는 우레탄 결합을 통해서 유도된 메톡시-PEG-DSPE를 가져온다.
리포솜 속으로의 리포폴리머의 편입은 캡슐화된 약물의 감소된 연결 등의 상당한 이점을 제공할 수 있다. 또한, 다른 이점은 리포솜 표면의 표적 세포와 그리고 RES와의 상호작용을 조절하는 데 있어 더욱 유연성이 크다는 점이다(Miller 등에 의한 「Biochemistry , 37: 12875-12883 (1998)」). PEG-치환된 합성 세라마 이드는 입체적으로 안정화된 리포솜의 비하전된 성분으로서 이용되지만(Webb 등에 의한 「Biochim . Biophys . Acta, 1372: 272-282(1998)」); 이들 분자는 제조하기에 복잡하고 값비싸며, 이들은 일반적으로 디아실 글리세로포스포리피드뿐만 아니라 인지질 이중층 속으로 패킹되지도 않는다.
잘립스키에 의한 미국특허 제 6,586,001호 공보에 기재된 바와 같은 리포폴리머도 이용될 수 있고, 제조 및 비용상의 용이함의 면에서 PEG-치환된 합성 세라마이드에 대해 임의의 이점을 제공한다. 상기 미국특허 제 6,586,001호 공보에 기재된 리포폴리머는 입체적으로 안정화된 리포솜에서 빈번하게 이용되는 PEG-DSPE 등의 PEG-인지질의 하전된 포스페이트 결합 대신에 중성의 결합을 포함한다. 이 중성의 결합은 전형적으로 카바메이트, 에스테르, 아마이드, 카보네이트, 우레아, 아민 및 에테르로부터 선택된다. 이황화물, 히드라존, 펩타이드, 카보네이트 및 에스테르 등의 가수분해성 또는 기타 분해성 결합은 생체내에서 주어진 순환시간 후에 PEG 사슬을 제거하는 것이 요망되는 경우의 용도에서 바람직하다. 이 특징은 리포솜이 그의 표적에 도달 후 약물을 방출하거나 세포속으로의 흡인을 용이하게 할 때(Martin 등에 의한 미국특허 제 5,891, 468호 공보; 잘립스키 등에 의한 PCT 공개공보 제 WO 98/18813호(1998) 참조) 혹은 표적화 리간드를 임시로 은폐할 때 유용할 수 있다.
친수성 폴리머의 예로서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필옥사졸린, 폴리하이드록시프로필-메타크릴아마이드, 폴리메타크릴아마이드, 폴리디메틸-아크 릴아마이드, 폴리하이드록시프로필메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸아크릴레이트, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아스파르트아마이드, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상기 예시된 폴리머의 공중합체, 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. 이들 많은 폴리머에 의한 특성 및 반응은 미국특허 제 5,395,619호 공보 및 제 5,631,018호 공보에 기재되어 있다. 적합한 기타 폴리머로서는 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 하이드록시에틸셀룰로오스 등의 유도된 셀룰로오스뿐만 아니라, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 그의 공중합체를 들 수 있다. 또한, 특히 PEG 분절을 포함하는 이들 폴리머의 블록 코폴리머 혹은 랜덤 코폴리머가 적합하다. PEG 등의 친수성 폴리머에 의해 유도된 지질을 제조하는 방법은 예를 들어 공동 소유인 미국특허 제 5,013, 556호 공보에 충분히 공지되어 있다.
유도된 지질에 있어서의 바람직한 폴리머는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이고, 바람직하게는 분자량이 1,000 내지 15,000 달톤, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 5,000 달톤을 지닌 PEG 사슬이다.
특정 구체예에 있어서, 친수성 폴리머는 잘립스키에 의한 미국 특허출원 공개 제2003/0031764호 공보 및 미국 특허 제 6,342,244호 공보에 기재된 디티오벤질 부분과 같은 해리가능한 결합을 통해 부착되어 있다.
이하에 설명되어 있는 바와 같이, 중성의 양이온성 지질로 이루어진 리포솜은 본 발명을 뒷받침하는 연구에 있어서 제조되었다. 리포폴리머는 임의의 실시예에 포함된다.
D. 표적화 리간드
리포솜은 특이적 세포 모집단에 대한 소망의 표적-결합 성질을 얻기 위해, 항체 혹은 항체 분절, 세포-표면 수용체와 상호작용하기 위한 소작용 분자, 항원 및 기타 유사한 화합물 등의 표면 기를 함유하도록 제조될 수 있다. 이러한 리간드는 리포솜 지질에 표적화 분자에 의해 유도된 지질 또는 미리 형성된 리포솜(예를 들어, 반응성 아미노 부분을 지닌 포스파티딜에탄올아민)에 표적화 부자에 의해 유도될 수 있는 극성 헤드기를 지닌 지질을 포함시킴으로써 리포솜에 포함될 수 있다. 대안적으로는, 표적화 부분은 리간드-폴리머-지질 컨쥬게이트를 지닌 미리 형성된 리포솜을 배양함으로써 미리 형성된 리포솜 속으로 삽입될 수 있다.
지질은 소포형성용 지질에 그의 말단이 부착되는 친수성 폴리머 사슬의 자유 말단부에 리간드를 공유결합으로 부착시키고, 표적화 리간드를 리포솜에 편입시킴으로써 표적화 리간드에 의해 유도될 수 있다(Zalipsky, S.에 의한 「Bioconjugate Chem., 8 (2): 111-118 (1997)」). 또는, 표적화 리간드는 직접 또는 연결기를 통해 지질(예를 들어, 포스파티딜에탄올아민)에 유도되고, 이에 의해, 친수성 폴리머 사슬이 제거될 때까지 은폐상태를 유지할 수 있게 된다. 물론, 당업자라면, 가끔 리포폴리머의 존재 없이도 리포솜에 표적화 리간드를 편입시키는 것이 바람직할 경우가 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
선택된 친수성 폴리머를 선택된 지질에 부착시키고, 해당 폴리머의 자유로운 미부착 말단을 선택된 리간드와의 반응을 위해 활성화시키는 많은 다양한 기술이 있고, 특히, 친수성 폴리머인 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 널리 연구되어 있다(Zalipsky, S.에 의한 「Bioconjugate Chem ., 8 (2) (1997)」: 111-118; Allen, T. M. 등에 의한 「Biochemicia et Biophysica Acta 1237: 99-108 (1995)」; Zalipsky, S.에 의한 「Bioconjugate Chem., 4 (4): 296-299 (1993)」; Zalipsky, S. 등에 의한 「FEBS Lett. 353: 71-74 (1994)」; Zalipslcy, S. 등에 의한 「Bioconjugate Chemistry, 705-708 (1995)」; Zalipsky, S.에 의한 「STEALTH LIPOSOMES (D. Lasic and F. Martin, Eds.) Chapter 9, CRC Press, Boca Raton, FL (1995)」).
표적화 리간드는 당업자에게 공지되어 있고, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 리간드는 내피 또는 종양 세포에 대해서 결합 친화성을 지니는 것이며, 또한, 하나의 구체예에 있어서, 세포에 의해 내재화될 수 있는 것이다. 이러한 리간드는 성장 인자 수용체의 세포외 영역에 결합될 경우가 있다. 표적화 리간드는 펩타이드류, 당류, 비타민류, 항체 혹은 항체 분절, 렉틴, 수용체 리간드, 또는 이들의 유사체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에 있어서, 표적화 리간드는 성장 인자 수용체의 세포외 영역에 특이적으로 결합된다. 이러한 수용체는 HER2/neu 종양 유전자의 c-erbB-2 단백질 산물, 표피성장인자 수용체, 염기성 섬유모세포성장인자 수용체, 및 혈관내피성장인자 수용체로부터 선택된다. 다른 구체예에 있어서, 표적화 리간드는 E-셀렉틴 수용체, L-셀렉틴 수용체, P-셀렉틴 수용체, 엽산 수용체, CD4 수용체, CD19 수용체, αβ 인테그린 수용체 및 케모카인 수용체로부터 선택된 수용체에 결합된다. 표적화 리간드는 엽산, 비오틴, 인산 피리독살, 비타민 B 12(시아노코발아민), 시알릴 루이스X 트랜스페린, 표피성장인자, 염기성 섬유 모세포 성장인자, 혈관내피성장인자, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, RGD 펩타이드 또는 NGR 펩타이드일 수도 있다. 임의의 다른 구체예에 있어서, 리간드는 E-셀렉틴, Her-2 또는 FGF이다.
III . 다중 음이온성 화합물
본 명세서에 기재된 조성물에 포함될 수 있는 다중 음이온성 화합물은 폴리뉴클레오타이드, 대용 링커를 지닌 폴리뉴클레오타이드 유사체, 음 하전된 단백질 또는 다당류를 포함한다.
A. 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 유사체
폴리뉴클레오타이드는 플라스미드, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 소간섭 RNA, 또는 대용 링커뿐만 아니라 5가의 인산 링커를 포함하는 하이브리드 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변성 뉴클레오타이드, 비천연적으로 생성되는 뉴클레오타이드, 단백질-핵산 복합체 또는 폴리뉴클레오타이드-약물 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 리포솜의 적어도 일부에 포획된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오사이드" 및 "뉴클레오타이드"란 통상의 퓨린 및 피리미딘 염기, 즉 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아 닌(G) 및 우라실(U) 뿐만 아니라 변성 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 함유하는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 의미한다. 이러한 변성은 퓨린 또는 피리미딘 부분의 메틸화 혹은 아실화, 피리미딘 고리에 대한 또는 퓨린 고리계 중의 하나 혹은 두개의 고리에 대한 상이한 복소환 고리 구조의 치환, 및 예를 들어 아세틸, 디플루오로아세틸, 트리플루오로아세틸, 이소부티릴, 벤조일 등의 보호기를 이용한 1개 이상의 작용기의 보호 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 변성 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 또한 당 부분상의 변성을 포함하고, 예를 들어, 이 경우, 1개 이상의 수산기가 할라이드 및/또는 하이드로카빌 치환기(전형적으로는 후자의 경우 지방족 기)로 치환되거나, 에테르, 아민 등으로서 작용화된다. 통상의 유사체는 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데닌, N,N-디메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오시토신, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-에틸시토신, 4-아세틸시토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2,2-디메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 5-플루오로-우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도라실, 5-에틸우라실, 5-프로필우라실, 5-메톡시우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-(메틸-아미노메틸)우라실, 5-(카복시메틸아미노메틸)우라실, 2-티오우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-(2-브로모비닐)우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 슈도우라실, 1-메틸슈도우라실, 큐에오신, 이노신, 1-메틸이노신, 하이포크산틴, 크산틴, 2-아미노퓨린, 6-하이드록시아미노퓨린, 6-티오퓨린 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이소-구아닌 및 이소-시토신은 하이브리드화가 요망되지 않을 경우 서열간의 잠재적인 교차 반응성을 낮추기 위해 올리고뉴클레오타이드에 편입될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 또한, 폴리머가 DNA 및 RNA에서 발견되는 바와 같은 염기 짝짓기 및 염기 쌓기를 허용하는 형태로 뉴클레오베이스를 함유하는 조건하에, 폴리데옥시뉴클레오타이드(2-데옥시-D-리보스를 함유), 폴리리보뉴클레오타이드(D-리보스를 함유), 퓨린 혹은 피리미딘 염기의 N-글리코사이드 등의 대용 링커를 지닌 폴리뉴클레오타이드 유사체의 기타 형태, 및 비뉴클레오타이드성(nonnucleotidic) 골격 또는 기타 대용 링커를 함유하는 기타 폴리머(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 펩타이드 핵산 및 미국 오레곤주의 코발리스시에 소재한 Anti-Gene Development Group에서 상품명 NeugeneTM polymers로서 시판되고 있는 합성 서열-특이 핵산 폴리머 등)를 망라한다. 따라서, 본 명세서에서 "올리고뉴클레오타이드"는 이중쇄- 및 단일쇄- RNA 및 DNA/RNA 하이브리드뿐만 아니라 이중쇄- 및 단일쇄-DNA로 포함하며, Byrn, S. R. 등에 의한 「"Drug-oligonucleotide conjugates", Adv . Drug Delivery Reviews 6: 287-308 (1991)」에 기재된 바와 같은, 예를 들면 1개 이상의 천연적으로 생성되는 뉴클레오타이드가 유사물로 치환된 올리고뉴클레오타이드; 예를 들어 비하전 결합(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데 이트, 카바메이트 등), 음 하전 결합(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트 등) 및 양 하전 결합(예를 들어, 아미노알킬포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포트리에스테르)를 지닌 것, 펜탄트 부분을 함유하는 것, 예를 들어 단백질(뉴클레아제, 독소, 항체, 펩타이드를 포함), 인터킬레이터(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이트제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등), 알킬화제, 안료 혹은 형광성 라벨 등의 부분 등의 대용 결합을 함유하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 올리고뉴클레오타이드-약물 컨쥬게이트를 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"와 "올리고뉴클레오타이드" 간에는 길이의 구별을 의도하는 일은 없고, 이들 용어는 상호 호환적으로 사용된다. 본 명세서에 이용된 바와 같이, 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드에 대한 기호는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 권장 위원회(IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature recommendation)(Biochemistry 9: 4022, 1970)에 따른다.
올리고뉴클레오타이드는 공지의 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위한 방법에 대한 배경 문헌은 예를 들면, de Napoli 등에 의한 「Gazz . Chim . Ital. 114: 65 (1984)」, Rosenthal 등에 의한 「Tetrahedron Lett. 24 : 1691 (1983)」, Belagaje 및 Brush에 의한 「Nuc . Acids Res. 10: 6295 (1977)」와 같이 β-시아노에틸 포스페이트 보호기를 이용하는 것에 의거한 5'- 내지 -3' 합성과 관련된 것을 포함하며, 용액상 5'- 내지 -3' 합성을 개시한 문헌으로서는, Hayatsu 및 Khorana에 의한 「J. Am . Chem . Soc . 89: 3880 (1957)」, Gait 및 Sheppard에 의한 「Nuc . Acids Res . 4: 1135 (1977)」, Cramer 및 Koster에 의한 「Angew . Chem . Int . Ed . Engl. 7: 473 (1968)」, 그리고 Blackburn 등에 의한 「J. Chem . Soc . Part C, 2438 (1967)」을 포함한다. 또한, Matteucci 및 Caruthers에 의한 「J. Am . Chem . Soc. 103: 3185-91 (1981)」에는 올리고뉴클레오타이드의 제조시 포스포클로리다이트의 용도를 기재하고 있다. 또, Beaucage 및 Caruthers에 의한 「Tetrahedron Lett . 22: 1859-62 (1981)」 및 미국특허 제 4,415,732호 공보에는 올리고뉴클레오타이드의 제조용의 포스포르아미다이트의 용도를 개시하고 있다. Smith에 의한 「ABL 15-24 (1983년 12월)에는 자동 고상 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 합성이 개시되어 있다. 또, 본 명세서에 인용된 문헌 및 Warner 등에 의한 「DNA 3: 401-11 (1984)」도 참조하면 된다. T. Horn 및 M. S. Urdea에 의한 「DNA 5: 421-25 (1986)」에는 비스(시아노에톡시)-N,N-디이소프로필아미노포스핀을 이용한 고형 지지된 DNA 분절의 인산화를 개시하고 있다. 또한, T. Horn 및 M. S. Urdea에 의한 「Tetrahedron Lett. 27: 4705-08 (1986)」도 참조하면 된다.
상기 설명한 지질로 이루어진 리포솜은 핵산과 관련되어 있다. "관련"이란, 핵산 등의 치료제가 리포솜 중앙 구획에 포획되어 있고/있거나, 지질 이중층 공간이 외부의 리포솜 표면과 관련되거나, 혹은 리포솜과 내적으로 및 외적으로 관련되어 포획되어 있는 것을 의미한다. 치료제는 핵산 또는 약물 화합물일 수 있는 것을 알 수 있을 것이다. 또한 약물 화합물은 리포솜 및 리포솜과 외적으로 관련된 핵산 또는 이의 역으로 포획될 수 있는 것 또한 알 수 있다. 용어 포획 및 관련은 본 명세서에서 상호 호환적으로 이용된다.
핵산은 이들의 분절 및 유사체를 포함한 각종 DNA 및 RNA계 핵산으로부터 선택될 수 있다. 각종 상태의 치료용의 각종 유전자는 설명되어 있고, 주목하는 특정 유전자의 부호화 서열은 GenBank 또는 EMBL 등의 DNA 서열 데이터은행으로부터 회수할 수 있다. 예를 들어, 낭성 섬유증, 아데노신 데아미나제 결핍증 및 AIDS 등의 바이러스성, 악성 및 염증성 질환 및 상태의 치료용의 폴리뉴클레오타이드는 설명되어 있다. APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, RB, p53, WT1, BRCAl, BRCA2 및 VHL 등의 종양 억제자 유전자의 투여에 의한 암의 치료가 상정된다.
표시된 상태의 치료용의 특정 핵산의 예는, HLA-B7, 종양류, 결장직장암종, 흑색종; IL-2, 암류, 특히 유방암, 폐암 및 종양; IL-4, 암; TNF, 암; IGF-1 안티센스, 뇌종양; IFN, 신경모세포종; GM-CSF, 콩팥 세포 암종; MDR-1, 암, 특히 진행된 암, 유방암 및 난소암; 그리고 HSV 티미딘 키나제, 뇌종양, 머리 및 목 종양, 중피종, 난소암을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 그의 표적, 통상 메신저 RNA(mRNA) 또는 mRNA 전구물질에 대해 상보적인 서열로 이루어진 안티센스 DNA 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. mRNA는 기능성, 또는 감각, 배향에 있어서의 유전적 정보를 포함하고, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 결합은 목적으로 하는 mRNA를 불활성화시켜, 그의 단백질로의 전위를 방지한다. 이러한 안티센스 분자는 단백질이 특이적 RNA로부터 전위되는 것을 나타내는 생화학적 실험에 의거해서 구해지며, 일단 RNA의 서열이 공지되어 있다면, 상보적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 통해 결합하게 될 안티센스 분자가 설계될 수 있다. 이러한 안티센스 분자는 전형적으로 10 내지 30 염기쌍, 더욱 바람직하게는 10 내지 25 염기쌍, 가장 바람직하게는 15 내지 20 염기쌍을 함유한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 가수분해에 대한 내성을 개선하기 위해 변성될 수 있고, 이러한 유사물은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포디에스테르 및 p-에톡시 올리고뉴클레오타이드를 포함한다(WO 97/07784).
포획제는 또한 리보자임, DNA 효소(DNAzyme), 촉매 RNA, 또는 RNA 간섭을 유발하는 소간섭 RNA(siRNA)일 수 있다. RNA 간섭은 이중쇄 RNA를 통해 매개된 RNA 간섭(RNAi)으로서 칭해지는 프로세스를 통해 유래되는 잠재적이고 특이적인 유전자 잠복을 의미한다. RNAi는 RNA-유래 잠복성 복합체(RISC: RNA-induced silencing complex), 즉, 잠복성 트리거(trigger)와 상동인 메신저 RNA 유사체를 파괴하는 서열 특이적인 다성분 뉴클레아제에 의해 매개된다. RISC는 이중쇄 RNA 트리거로부터 유래된 짧은 RNA(대략 22개의 뉴클레오타이드)를 함유하는 것이 공지되어 있다. RNAi는 선충(C. elegans), 초파리, 균류, 식물, 및 심지어 포유류 세포주를 포함하는 많은 시스템에 있어서의 기능상실 연구에 대한 선택방법으로 되었다. 대부분의 포유류 세포주에 있어서의 유전자를 특이적으로 잠복시키기 위해서는, 소간섭 RNA(siRNA)가 이용되는 데, 그 이유는 커다란 dsRNA ( > 30 bp)는 인터페론 반응을 개시시켜 비특이적 유전자 잠복을 일으키기 때문이다.
또한, RNA 간섭에 대한 배경은 관련된 문헌의 검토로부터 얻어질 수 있다. 즉, WO 01/68836 공보; Bernstein 등에 의한 「RNA (2001) 7: 1509-1521」; Bernstein 등에 의한 「Nature (2001) 409: 363-366」; Billy 등에 의한 「Proc . Nat'l Acad . Sci USA (2001) 98 : 14428-33」; Caplan 등에 의한 「Proc . Nat'l Acad. Sci USA (2001) 98: 9742-7」; Carthew 등에 의한 「Curr . Opin . Cell Biol (2001) 13: 244-8」; Elbashir 등에 의한 「Nature (2001) 411: 494-498」; Hammond 등에 의한 「Science (2001) 293: 1146-50」; Hammond 등에 의한 「Nat . Ref. Genet . (2001) 2: 110-119」; Hammond 등에 의한 「Nature (2000) 404: 293-296」; McCaffrrey 등에 의한 「Nature (2002): 418-38-39 」; 및 McCaffrey 등에 의한 「Mol . Ther . (2002) 5: 676-684」; Paddison 등에 의한 「Genes Dev . (2002) 16: 948-958」; Paddison 등에 의한 「Proc . Nat'l Acad . Sci USA (2002) 99: 1443-48」; Sui 등에 의한 「Proc . Nat'l Acad . Sci USA (2002) 99: 5515-20」.
RNA 간섭 분야에 관심을 두고 있는 미국특허는 미국특허 제 5,985,847호 및 제 5,922,687호 공보를 포함한다. 그외 관심을 두고 있는 것은 국제특허 공개공보인 WO/11092이다. 관심의 대상이 되는 추가의 문헌으로서는 Acsadi 등에 의한 「New Biol . (January 1991) 3:71-81」; Chang 등에 의한 「J. Virol. (2001) 75: 3469-3473」; Hickman 등에 의한 「Hum . Gen . Ther. (1994) 5: 1477-1483」; Liu 등에 의한 「Gene Ther . (1999) 6: 1258-1266」; Wolff 등에 의한 「Science (1990) 247: 1465-1468」; Zhang 등에 의한 「Hum . Gene Ther . (1999) 10: 1735-1737」: 및 Zhang 등에 의한 「Gene Ther . (1999) 7: 1344-1349」등을 포함한다.
다중 음이온성 화합물은 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드이고, 플라스미드 (예를 들어 유전자의 부호화), DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 올리고뉴클레오타이 드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 소간섭 RNA(siRNA), 변성 뉴클레오타이드, 비천연적으로 생성되는 뉴클레오타이드 또는 단백질-핵산 복합체를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
하나의 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드에 삽입될 수 있고, 바람직하게는 5 내지 40 Kbp(kilo basepair) 영역의 크기를 지닌 순환형 혹은 폐쇄형 2중쇄 단분자인 것이 바람직하다. 이러한 플라스미드는 잘 알려진 방법에 따라 구축되고, 치료제, 즉 적절한 촉진자 및 증강자의 제어하에 유전자 요법에서 발현될 유전자, 및 호스트 셀 내의 복제 및/또는 호스트-셀 유전체 속으로의 통합에 필요한 기타 요소를 포함한다. 유전자 요법에 유용한 플라스미드의 제조 방법은 널리 알려져 있고 참조된다.
전술한 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 기타 핵산은 지질 막의 수화 동안 수동 포획에 의해 리포솜에 포획될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 포획하기 위한 기타 절차는 단분자 형태로 핵산을 축합시키는 것을 포함하고, 여기서 핵산은 핵산을 소립자로 축합시키는 데 유효한 조건하에 황산 프로타민, 스페르민, 스페르미딘, 히스티딘, 리신, 양이온성 펩타이드, 이들의 혼합물, 또는 기타 적합한 다중 양이온성 축합제를 함유하는 수성 매질중에 현탁된다. 축합된 핵산 분자의 용액은 건조된 지질 막을 재수화하여 포획된 형태의 축합 핵산을 지닌 리포솜을 형성한다.
B. 음으로 하전된 단백질
음으로 하전된 단백질은, 단백질이 중성의 양이온성 지질을 포함하는 리포솜과 상호작용할 수 있는 한 가장 범용의 의미에서의 음이온성 단백질을 포함한다. 음으로 하전된 단백질은 용해도의 실제의 제한 내에서 임의의 길이일 수 있다. 바람직한 구체예는 약물-단백질 컨쥬게이트이고, 여기서 음으로 하전된 단백질은 중성의 양이온성 지질을 포함하는 리포솜과 상호작용하기 위한 수단을 제공한다. 음으로 하전된 단백질은, 주로 글루타메이트 혹은 아스파테이트 잔기인 1개 이상의 서열 모티프를 함유하는 폴리글루타메이트 혹은 폴리아스파테이트 족에 있어서의 펩타이드; 콜라겐 및 알부민을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 폴리글루탐산 및 폴리아스파르트산 약물 담체 또는 컨쥬게이트는 Li, C.에 의한 「Adv . Drug Delivery Reviews 54, 695-713 (2002)」 및 Peterson, R. V.에 의한 「"Biodegradable Drug Delivery Systems Based on Polypeptides" in Bioactive Polymeric Systems: An Overview, Gerberin, C. G. & Carraher, C. R. , Eds., Plenum Press, NY (1985)」에 기재되어 있다. 예를 들어, 독소루비신, 다우노루비신, 아라-C, 우라실 및 우리딘 유도체, 사이클로포스파미드, 멜팔란, 미토마이신 C, 파클리탁셀, 및 캄프토테신의 폴리글루탐산 컨쥬게이트는 본 명세서에 기재된 중성의 양이온성 지질을 포함하는 리포솜을 이용해서 제조되어 전달될 수 있다.
C. 다당류
음으로 하전된 다당류도 중성의 양이온성 지질을 포함하는 리포솜을 지닌 본 발명에서 사용가능한 다중 음이온성 화합물내에 포함된다. 황산화 다당류는 음으 로 하전된 다당류의 부류의 일례이며, 황산 헤파린, 히알루론산, 황산 덱스타란, 황산 콘드로이틴, 황산 데르마탄, D-글루코사민과 L-이두론산 혹은 D-글루쿠론산의 반복 단위로 이루어진 각종 황산화 다당류 사슬의 혼합물, 또는 상기 어느 것의 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
또, 음으로 하전된 키토산 유도체, 알긴산 나트륨, 화학변성 덱스트란 등도 포함된다.
III . 조성물의 제조
A. 리포솜 성분
상기 지질, 즉, 중성의 양이온성 지질 및 리포폴리머를 함유하는 리포솜은 Szoka, F., Jr. 등의 「Ann . Rev . Biophys . Bioeng. 9: 467 (1980)」에 상세히 기재된 바와 같은 각종 수법에 의해 제조될 수 있고, 본 발명을 뒷받침하기 위해 제조된 리포솜의 구체예를 이하에 설명한다. 전형적으로, 리포솜은 다층 소포(MLV: multilamellar vesicles)이며, 단순한 지질-막 수화 수법에 의해 형성될 수 있다. 이 절차에 있어서, 이하에 상세히 설명하는 유형의 리포솜-형성용 지질의 혼합물은 적절한 유기 용매에 용해되고, 이어서 관(vessel)에 포획되어 박막을 형성한다. 다음에, 지질 막은 수성 매질로 덮여 수화되어 전형적으로 약 0.1 내지 10 마이크론의 크기를 지닌 MLV를 형성한다. 이어서, MLV는 리포솜의 크기 분포를 더욱 감소시키기를 원할 경우 초음파 처리될 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용하기 위한 리포솜은 (i) 화학식 (I)에 의한 중성의 양이온성 지질을 포함하고, 또한, 추가의 소포형성용 지질 또는, 디아실글리세롤류, 라이소-인지질류, 지방산류, 당지질류, 세레브로사이드류 및 콜레스테롤 등의 스테롤류 등의 리포솜 지질 이중층 속에 안정하게 편입되는 지질을 포함할 수 있다. 추가의 양이온성 혹은 중성의 양이온성 지질은 필요에 따라 포함될 수 있다. 리포폴리머도 포함될 수 있다. 소정의 바람직한 구체예에 있어서, 친수성 폴리머는 분리가능한 결합을 통해 부착된다.
전형적으로, 리포솜은 화학식 (I)의 중성의 양이온성 지질을 약 5 내지 80 몰%, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 60 몰%, 더욱더 바람직하게는 약 20 내지 45 몰%로 함유해서 이루어진다. 리포폴리머는 전형적으로 약 1 내지 30 몰%, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 15 몰%, 더욱더 바람직하게는 4 내지 12 몰% 포함된다. 후술하는 본 발명을 뒷받침하기 위해 수행되는 연구에 있어서, 중성의 양이온성 지질을 30 내지 60 몰% 그리고 리포폴리머를 5 몰%까지 함유해서 이루어진 리포솜을 이용하였다.
본 발명에 있어서 제조된 리포솜은 선택된 크기 범위, 전형적으로는 약 0.01 내지 0.5 마이크론, 더욱 바람직하게는 0.03 내지 0.40 마이크론에서 실질적으로 균일한 크기를 지니도록 크기조절될 수 있다. REV 및 MLV에 대한 하나의 유효한 크기조절방법은 0.03 내지 0.2 마이크론의 범위, 전형적으로는 0.05, 0.08, 0.1 또는 0.2 마이크론의 선택된 균일한 기공 크기를 지닌 일련의 폴리카보네이트 막을 통해 리포솜의 수성 현탁액을 밀어내는 것(extruding)을 포함한다. 상기 막의 기공 크기는 대략 그 막을 통한 밀어내기에 의해 생성된 리포솜의 최대 크기에 상당 하며, 특히 상기 제법에서는 동일한 막을 통해 2회 이상 밀어내기한다. 균일화 방법은 리포솜을 100 ㎚ 이하의 크기까지 축소하는 데 유용하다 (Martin, F. J.에 의한 「SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS-MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY,(P. Tyle, Ed.) Marcel Dekker, New York, pp. 267-316 (1990)」).
B. 예시 조성물의 제조 및 특성화
본 발명을 뒷받침하기 위해 수행된 연구에 있어서, CMV 프로모터를 지닌 pNSL 루시페라제 혈장 DNA는 중성의 양이온성 지질로 이루어진 리포솜에 포획되어 있다. 몇몇 연구에 있어서, 분해성 리포폴리머는 Zalipsky, S. 등의 논문 「"New approach to gene delivery mediated by reversible PEGylation of cationic lipid-DNA complexes" in Proceed . Intl . Symp . Control . Rel . Bioact . Mater. 28: 1177 (#7066) (2001)」에 기재된 바와 같이 리포솜에 포함되어 있다. 복합체의 표적화는 표적화 리간드로서 엽산 또는 FGF를 포함함으로써 달성되었다. 전형적으로, 표적화 리간드는 당업계에 공지된 예를 들어, 미국 특허 제 6,180,134호 공보 및 Klibanov, A. L.에 의한 「"Long-circulating sterically protected liposomes" in Liposomes: A Practical Approach, 2nd Edition, Torchilin, V. P., et al., Eds., Oxford University Press, pp. 231-265 (2003)」에 개시된 통상의 화학 기술에 따라 리포폴리머의 PEG 사슬의 말단에 공유결합으로 부착되어 있다.
실시예 8은 DSPEI 리포솜을 이용한 BHK 세포의 시험관내 핵내 주입 및 발현 을 설명한다. 루시페라제를 발현하는 BHK 세포는 동정되어 있고, 유전자 발현, 따라서 핵내 주입 효능은 DSPEI 및 HDSG 함유 리포솜에 대해 비교되어 있다. 도 3에 표시된 바와 같이, HSDG를 함유하는 리포솜에 비해서 DSPEI를 함유하는 리포솜을 이용한 경우 더욱 큰 유전자 발현이 얻어졌다. DSPEI를 함유하는 리포솜을 이용한 유전자 발현의 증강은 대략 3배 이상이다.
실시예 9는 루이스 폐 암종(Lewis lung carcinoma) 세포 종양을 지닌 생쥐에 대해서 생체내 투여하기 위한 제제 번호 9-1, 9-2, 9-3, 9-4 및 9-5의 제조를 설명한다. 제제 번호 2 및 3은 미국특허출원 제 2003/0031764호 공보에 기재된 HDSG 및 mPEG-DTB-지질을 포함하였고, 여기서 R은 H(본 명세서에 있어서 "FC PEG" 또는 "고속분해성"(fast-cleavable) PEG)였다. 상기 제제는 또한 FGF 표적화 리간드를 포함하였다. 제제 번호 1, 4 및 5는 비교 대조예로서 기능한다. 리포솜-DNA 복합체는 시험 생쥐에게 정맥내 투여하였다. 20시간 후, 종양 및 기타 조직을 회수하여 루시페라제 발현에 대해 분석을 실시하였다. 그 결과는 하기 표 1에 표시되어 있다.
FGF-표적화 리포솜 제제의 정맥내 투여 후 루이스-폐 암종을 보유한 생쥐에서의 루시페라제 발현
제제번호 (상세는 실시예 9 참조) 표적화 리간드 루시페라제 발현(루시페라제 pg/ 단백질 ㎎)
종양 폐 간
제제번호 9-1 (HDSG/CHOL) FGF 15.3 1.4 1.2
제제번호 9-2 (HDSG/CHOL/F-C PEG) FGF 7.8 1.9 4.5
제제번호 9-3 (HDSG/PHSPC/P-C PEG) FGF 1.2 2.0 3.2
제제번호 9-4 (HDSG/PHSPC/PEG) FGF 3.7 2.0 4.6
제제번호 9-5 (DDAB/CHOL) 엽산 4.3 403.9 25.4
양이온성 리포솜인 DDAB(제제 번호 9-5)로 이루어진 리포솜에 대한 폐에서의 루시페라제 발현은 다른 제제보다도 거의 100배 높다. 본 제제에 있어서의 표적화 리간드는 다른 제제와는 다르지만, 제제 번호 9-5에 대한 높은 폐 발현은 주로 폐의 커다란 표면적 및 폐에서의 양 하전된 플라스미드-리포솜 복합체와 음 하전된 내피 세포 표면 간의 정전하전 상호작용에 기인된다. 양이온성 지질 DDAB보다 오히려 중성의 양이온성 지질 HDSG가 사용된 리포솜 조성물(제제 번호 9-1)은 이 문제를 극복한다. 제제 번호 9-1, 9-2, 9-3 및 9-4는 모두 HDSG 중성-양이온성 지질을 포함한다. 지질은 생리적 pH (7.4)에서 중성이므로, 리포솜은 폐 표면에 점착되지 않아 리포솜이 전신으로 분포할 수 있게 된다. 이 개량된 분포는 제제 번호 9-1 및 9-2에 대한 종양 조직에서의 높은 루시페라제 발현에 반영된다.
실시예 10은 추가의 연구를 기재한 것으로, FGF-표적화 리포솜/DNA 복합체는 루이스 폐 종양이 접종된 생쥐에게 투여하고, 그 생쥐에게 종양 혈관구조 표적화용의 FGF-혈관형성 내피 세포 모델인 마트리겔(Matrigel)을 주입하였다. 이 연구에 있어서, 종양 세포 및 마트리겔을 동일한 생쥐의 대향하는 측복부에 삽입하였다. 리포솜은 중성의-양이온성 지질 HDSG 및 콜레스테롤 또는 PHSPC로 구성되어 제조되었다. PEG-DTB-지질은 본 발명에 따른 제제에도 포함시켰다. 양이온성 지질도 복합체에 포함시켜, 양이온성 지질의 복합체 안정성 및 핵내 주입 효율의 작용을 결정하였다. 2개의 양이온성 지질은 DOTAP 및 본 명세서에서 "GC33"으로 칭하고 있는 N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오미틸]-N,N-디옥타데실-L-글루타민 테트라하이드로트리플루오로아세테이트를 이용하였다.
상기 제제를 종양-보유 혹은 마트리겔-보유 생쥐에 정맥내 투여한 바, 투여 이래로 24시간 후 마트리겔 혹은 종양에서, 폐에서 그리고 간에서 루시페라제 발현이 측정되었다. 그 결과는 하기 표 2에 표시되어 있다.
제제번호 표적화 리간드 루시페라제 발현(루시페라제 pg/ 단백질 ㎎)
마트리겔 폐 간
제제번호 10-1 (DOTAP/Chol) 없음 28.6 2286.1 18.1
제제번호 10-2 (HDSG/PHSPC) FGF 16.0 126.7 3.1
제제번호 10-3 (HDSG/PHSPC/FC-PEG) FGF 8.9 4.1 1.2
제제번호 10-4 (HDSG/DOTAP/PHSPC) 없음 9.9 4.4 1.7
제제번호 10-5 (HDSG/DOTAP/PHSPC) FGF 10.3 3.8 1.6
제제번호 10-6 (HDSG/DOTAP/PHSPC/FC-PEG) FGF 14.2 2.0 1.3
제제번호 10-7 (HDSG/GC33/PHSPC) 없음 10.5 223.1 2.7
제제번호 10-8 (HDSG/GC33/PHSPC) FGF 11.2 121.3 3.1
제제번호 10-9 (HDSG/GC33/PHSPC/FC-PEG) FGF 11.3 96.0 2.2
마찬가지로, 실시예 11 및 12는 화학식 (I)에 의한 중성의 양이온성 지질을 이용해서 제조된 리포솜 제제의 그들의 생체내 효능의 평가를 뒷받침하기 위해 리포솜을 함유하는 DSPEI의 생체내 투여를 설명하고 있다. HDSG를 함유하는 리포솜 조성물에 비해서, DSPEI를 함유하는 리포솜은 표적 종양 조직에 의한 더욱 특이적이고 표적화된 상호작용을 제공할 것으로 기대된다.
IV . 실시예
본 발명을 바람직한 특정 구체예와 관련하여 설명하였으나, 상기 설명뿐만 아니라 이하의 실시예는 설명을 목적으로 하는 것인 바, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아님을 이해할 필요가 있다. 본 발명의 기타 측면, 이점 및 변형예는 당업자에 의해 명백해질 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 공고, 특허출원, 각종 간행물과 논문 및 기타 참고 문헌은 전체로서 본 명세서에 참조로 병합된다.
이하의 실시예는 당업자에게 본 발명의 화합물을 제조하고 이용하는 방법의 완전히 개시 및 설명을 제공하기 위해 제안된 것이며, 본 발명자가 그들의 발명으로서 간주하는 범위를 제한하기 위해 의도된 것은 아니다. 노력의 성과는 수치(예를 들어, 양, 온도 등)에 대해서 정확성을 확보하고자 하였으나, 일부의 오차 및 편차는 고려될 필요가 있다. 다른 언급이 없는 한, "부"는 "중량부"를, "온도"는 "섭씨 온도(℃)"를, "압력"은 "대기압 혹은 그 근방"이다.
이하 및 본 명세서를 통해 설명하는 방법에 있어서, 이용된 약칭은 그들의 일반적으로 허용되는 의미를 지니며, 구체적으로는 다음과 같다:
℃ 섭씨온도
mM 밀리몰
μM 마이크로몰
pM 피코몰(10-12 몰)
㎎ 밀리그램
㎍ 마이크로그램
㎖ 밀리리터
μℓ 마이크로리터
㎛ 마이크로미터
Tm 융점
FBS 소태아혈청
DMEM 둘베코의 변성 이글 배지(Dulbeco's Modified Eagle's Medium)
DOTAP 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판
DSPE 디스테아로일포스파티딜에탄올아민
GC33 N2-[N2,N5-비스(3-아미노프로필)-L-오미틸]-N,N-디옥타데실-L-글루타민 테트라하이드로트리플루오로아세테이트;
재료: 이하의 재료를 표시된 공급처로부터 얻었다: 부분 수소첨가된 콩 포스파티딜콜린(미국의 뉴저지주의 그린 빌리지시에 소재한 Vernon Walden Inc.사 제품); 콜레스테롤(네덜란드의 Solvay Pharmaceuticals사 제품); 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 및 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB)(미국 앨라배마주의 버밍햄시에 소재한 Avanti Polar Lipids,Inc.사 제품).
방법: 콜터 N4-MD( (미국 플로리다주의 마이애미시에 소재한 Coulter사 제품)를 이용해서 동적 광산란을 수행하였다.
실시예 1
중성- 양이온성 지질예의 제조
A. 이미다졸릴 유래 디스테아로일포스파티딜에탄올아민의 제조
Figure 112006057132389-PCT00003
4(5)-이미다졸 카복스알데하이드(Aldrich사 제품, 0.06 g, 0.6 mmol) 및 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE)(0.39 g, 0.52 mmol)을 CHC13 : CH30H (1 : 1 v/v, 16㎖)의 혼합물 중에 50℃에서 15분간 용해시켰다. 상기 혼합물에, 보란-피리딘 복합체(0.05 ㎖, 0.6 mmol)를 적하하고, 이 반응혼합물을 50℃에서 3시간, 이어서 실온에서 18시간 교반하였다. 상기 반응혼합물의 TLC(CHC13 : CH30H : H20 = 80 : 18 : 2)는, 반응이 완료되었음을 나타내었다. 용매를 증발시키고, 얻어진 조제의(crude) 혼합물을 실리카겔을 이용해서 크로마토그래피처리하였다. CHC13 : CH30H(80 : 18)를 용리액으로 사용해서 상부 불순물을 제거하고, 이어서 CHC13 : CH30H : H20(80 : 18 : 2) 용매계로 백색 고형 생성물을 용리시키고, tert-부탄올로부터 냉동건조시켰다. 생성물의 수율은 0.37 g(86%)이었다.
1 H NMR ( CDCl 3 ) : δ 8 0.878 (t, 6H, CH3), 1.25-1.75 (m, 48H, 지질 CH2), 1.59 (m, 4H, 지질 CH2), 2.30 (m, 4H, CO-CH2), 2.74 (m, 2H, NH2-CH2), 3.67 (m, 2H, CH2-NH2), 4.02 (m, 2H, -CH2-OPO3), 4.22 (m, 2H, OP03-CH2), 4.42 (d, 2H, CH2-O-CO), 5.27 (m, 1H, CH2-CH-CH2), 6.87 (s, 1H, N-CH-C), 7.54 (m, 1H, N-CH-NH) ppm.
13 C NMR ( CDC1 3 ) : δ 14.11, 22.67, 24.88, 29.12, 29.16, 29.35, 29.53, 29.66, 29.71, 31.90, 34.13, 34.29, 49.48, 55.71, 62.58, 63.46, 64.22, 70.14, 70.20, 119.97, 128.81, 130.88, 131.01, 134.17, 173.09, 173.48 ppm.
실시예 2
디이미다졸 포스파티딜에탄올아민의 제조
이미다졸 카복스알데하이드(1mmole) 및 보란-피리딘(1.1mmole)의 양을 두배로 해서 실시예 1에 기재된 바와 같은 동일한 절차를 이용해서 표제의 유도체를 얻었다. 디-이미다졸 생성물을 실리카겔 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하고 MALDI-TOF 질량분광분석에 의해 특성 평가하였다. 상기 생성물의 분자량은 907g/mol로, 포스파티딜에탄올아민의 4차 아민에 2개의 이미다졸 부분이 부착된 것을 나타내었다. 이 반응은 또한 도 1에 개략적으로 표시되어 있다. 마찬가지의 1H NMR 스펙트럼이 실시예 1에 기재된 바와 같이 나타났고, 적분결과 2개의 이미다졸 부분의 존재가 확인되었다.
실시예 3
DSPEI 및 PHSPC 함유 리포솜의 제조
DSPEI 및 PHSPC는 40 : 60의 몰비로 혼합하고, 클로로포름에 용해시켰다. 클로로포름을 회전증발에 의해 증발시켜 지질 박막을 형성하였다. 얻어진 지질 박막은 pH ∼4.5의 물에 의해 ∼40℃에서 30분간 수화되었다. 얻어진 다층 리포솜은 ∼10분간 초음파 처리하였고, 최종 리포솜 크기는 80 ㎚ 부근이었다.
실시예 4
DSPEI , DOTAP 및 콜레스테롤 함유 리포솜의 제조
DSPEI, DOTAP 및 CHOL을 35: 30: 35(몰비)의 몰비로 혼합하고, 클로로포름에 용해시켰다. 클로로포름을 회전증발에 의해 증발시켜 지질 박막을 형성하였다. 이어서, 얻어진 지질 박막은 pH 3 내지 3.5의 물에 의해 ∼40℃에서 30분간 수화되었다. 얻어진 다층 리포솜은 ∼20분간 초음파 처리하였고, 최종 리포솜 크기는 100 ㎚ 부근이었다.
DSPEI 리포솜의 제조
제제 pH 수화 초음파처리 크기(㎚)
DSPEI/PHSPC(40:60) 4.5 용이함 10분 80
DSPEI/DOTAP/CHOL(35:30:35) 3 용이함 30분 100
실시예 5
중성의 양이온성 지질을 함유하는 리포솜에 대한 제타 전위 결정
Malver Instruments, Inc.(미국 매사추세츠주의 사우스보로우시에 소재함)로부터의 ZETASIZER 2000을 이용해서 제타 전위를 측정하였다. 이 측정기기의 작동조건은 다음과 같았다: 측정 횟수: 3; 측정 간의 지연: 5초; 온도: 25 ℃ ; 점도: 0.89 cP; 유전상수: 79; 세포 유형: 모세관 흐름(capillary flow); 제타 한계: -150 ㎷ 내지 150 ㎷. 제타전위측정치는 HDSG로 이루어진 리포솜 및 DDAB로 이루어진 리포솜을 대조예로 해서, 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 DSPEI 및 PHSPC를 함유하는 리포솜으로부터 얻었다. 그 결과는 도 2에 표시되어 있다.
실시예 6
핵산 함유 리포솜의 제조
DSPEI를 함유하는 리포솜은 상기 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 제조하였다. 중성의 양이온성 지질 HDSG를 함유하는 리포솜은 소망의 몰비의 유기용매 중 소망의 지질 조성물의 용액을 조제함으로써 제조하고 나서, pH 4 내지 5에서 5% 글루코오스에 의해 수화시켰다. 지질 성분 및 이들 성분의 몰비는 이하의 실시예에 규정되어 있다
루시페라제 부호화용의 pNSL 플라스미드는 2개의 시판의 플라스미드인 pGFP-N1 플라스미드(미국 캘리포니아주의 팔로 알토에 소재한 Clontech사 제품) 및 pGL3-C(미국 위스콘신주의 매디슨시에 소재한 Promega Corporation사 제품)로부터 미국 특허 제 5,851,818호 공보에 기재된 바와 같이 구축하였다. DNA-리포솜 복합체는 플라스미드 보유 루시페라제 유전자를 DSPEI 또는 HDSG, DOTAP 및 콜레스테롤로 이루어진 리포솜으로 총 지질 14 nmole에 대해서 DNA 1 ㎍의 비율로 전이시킴으로써 제조하였다. 루시페라제 정보제공 플라스미드 DNA 용액을 10분간 연속 교반하에 서서히 산성 리포솜 용액에 첨가하였다.
실시예 7
표적화 리간드를 함유하는 DNA -리포솜의 제조
FGF 또는 엽산 리간드는 당업계에 공지된 절차(Gabizon, A 등에 의한 「Bioconjugate Chem ., 10:289 (1999)」)에 의해 말레이미드-PEG-DSPE(mPEG-DSPE)에 컨쥬게이트되었다.
리포솜은 실시예 3 및 4에 기재된 바와 같이 제조되었다. DNA-리포솜 복합체는 리간드-PEG-지질의 미리 형성된 리포솜에의 삽입을 달성하기 위해 2 내지 3시간 동안 mPEG-DSPE, FGF-PEG-DSPE 또는 엽산-PEG-DSPE의 미셀 용액으로 접종되었다.
실시예 8
DSPEI 및 HDSG 리포솜을 이용한 시험관내 핵내 주입 및 발현
베이비 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포를 6웰 플레이트 상에 ∼1 × 104 세포/웰로 파종하고, 2일간 배양하였다. 이어서, BHK 세포는 DSPEI-함유 리포솜 또는 HDSG-함유 리포솜을 이용해서 플라스미드 DNA 1 ㎍/웰로 실시예 6에 기재된 바와 같이 제조된 DNA-리포솜 복합체의 존재하에 세포를 5시간 배양하고 나서 DNA-리포솜 복합체를 정규 매질로 치환함으로써, 상기 DNA-리포솜 복합체에 의해 핵내 주입하였다. 20시간 후 세포를 수확하고, 정보제공 유전자인 루시페라제의 발현을 분석하여, 루시페라제 pg/단백질 mg으로서 제공하였다. 그 결과는 표 3에 표시되어 있다.
실시예 9
HDSG -리포솜 및 FGF - 또는 엽산 표적화 리간드를 이용한 종양 조직에서의 생체내 핵내 주입 및 발현
A. 종양 모델
KB 종양 세포(1백만개의 세포)를 누드 생쥐의 측복부에 피하 접종하였다. 이들 생쥐에게 감소된 엽산 식이를 제공하여, KB 종양 세포상의 엽산 수용체의 발현을 상향 조절하였다. 이 모델은 종양 혈관 구조의 혈관형성 내피 세포를 표적화하기 위한 엽산-컨쥬게이트된 리포솜-DNA 복합체용으로 이용되었다.
루이스 폐 암종 세포(1백만개의 세포)를 B6C3-F1 생쥐의 측복부에 경피 접촉하였다. FGF 수용체는 혈관형성 내피 세포 또는 종양 세포의 표면 상에 발현되었다. 이 모델은 종양 혈관 구조의 혈관형성 내피 세포를 표적화하기 위한 FGF-컨쥬게이트된 리포솜-DNA 복합체용으로 이용되었다.
B. 리포솜 제제
실시예 6에 기재된 바와 같이 이하의 지질 성분을 지닌 5개의 리포솜 제제를 제조하였다:
제제 번호 9-1
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 60 몰%
콜레스테롤 총 지질의 40 몰%
루시페라제 플라스미드 100 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 9-2
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 60 몰%
콜레스테롤 총 지질의 40 몰%
mPEG-DTB-DSPE("FC PEG) 총 지질의 5 몰%
루시페라제 플라스미드 100 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 9-3
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 40 몰%
PHSPC 총 지질의 60 몰%
mPEG-DTB-DSPE("FC PEG) 총 지질의 5 몰%
루시페라제 플라스미드 100 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 9-4
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 40 몰%
PHSPC 총 지질의 60 몰%
mPEG-DSPE 총 지질의 5 몰%
루시페라제 플라스미드 100 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 9-5
성분 양
DDAB 총 지질의 55 몰%
PHSPC 총 지질의 45 몰%
루시페라제 플라스미드 100 ㎍
엽산 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
C. 생체내 투여
루이스 폐 암종 세포가 주입된 15마리의 시험 생쥐를 제제 번호 9-1 내지 9-5 중의 하나를 수취하도록 4개의 시험군으로 나누었다. 리포솜-DNA 복합체는 200 ㎍ DNA 플라스미드의 용량으로 정맥내 투여하였다. 종양 및 기타 조직을 처치 후 24시간째에 회수하고, 조직 추출물로부터 루시페라제 분석에 의해 루시페라제 발현을 결정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 표시되어 있다.
실시예 10
FGF - 표적화된 HDSG -리포솜- DNA 복합체의 생체내 투여
A. 마트리겔 종양 모델
생쥐에 있어서의 마트리겔(Matrigel®) 모델을 FGF-혈관형성 내피 세포의 종양 혈과구조 표적화에 이용하였다. 마트리겔(Matrigel®)에 있어서의 혈관형성 내피 세포는 종양내의 혈관 구조 혈관형성 내피 세포와 유사하고, 마트리겔(Matrigel®)에 있어서의 이들 내피 세포(종양 세포 없이 내피 세포 단독)는 생체내 FGF-표적화 리포솜/핵산 복합체 핵내 주입 및 발현의 연구를 위한 종양에서의 유사 내피 세포에 이용되었다. 마트리겔(Matrigel®)은 생쥐에 피하 주입된 경우 고형 겔을 형성하여, 신속하고 강한 혈관형성반응을 유도한다.
B. 리포솜 제제
실시예 6에 기재된 바와 같이 이하의 지질 성분을 지닌 9개의 리포솜 제제를 제조하였다:
제제 번호 10-1
성분 양
DOTAP 총 지질의 55 몰%
콜레스테롤 총 지질의 45 몰%
루시페라제 플라스미드 100 ㎍
제제 번호 10-2
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 40 몰%
PHSPC 총 지질의 60 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 10-3
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 40 몰%
PHSPC 총 지질의 60 몰%
FC-PEG 총 지질의 1 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 10-4
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 35 몰%
DOTAP 총 지질의 30 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
제제 번호 10-5
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 35 몰%
DOTAP 총 지질의 30 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 10-6
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 35 몰%
DOTAP 총 지질의 30 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
FC-PEG 총 지질의 1 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 10-7
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 42.5 몰%
GC33 총 지질의 22.5 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 250 ㎍
제제 번호 10-8
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 42.5 몰%
GC33 총 지질의 22.5 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 10-9
성분 양
HDSG 중성의 양이온성 지질 총 지질의 42.5 몰%
GC33 총 지질의 22.5 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
FC-PEG 총 지질의 1 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
C. 생체내 투여
27 마리의 생쥐에게 마트리겔(Matrigel®)을 주입하였다. 마트리겔(Matrigel®)의 삽입 6일 후, 상기 B 부분에 기재된 9개의 제제 중 하나에 의한 처치를 위해 생쥐를 처치군(n = 3)으로 임의로 추출하였다. 리포솜-DNA 복합체를 200 ㎍ DNA 플라스미드의 용량으로 정맥내 투여하였다. FGF-표적화 리포솜-DNA 복합체의 투여 이래로 24시간 후에, 마트리겔, 폐 및 간에서의 루시페라제 발현이 측정되었다. 이 결과는 표 2에 표시되어 있다.
실시예 11
FGF - 표적화된 DSPEI -리포솜- DNA 복합체의 생체내 투여
A. 시험동물
생쥐에게 실시예 9A에 기재된 바와 같은 루이스 폐 암종 세포를 접종하였다.
B. 리포솜 제제
실시예 6 및 7에 기재된 바와 같이 이하의 지질 성분을 지닌 9개의 리포솜 제제를 제조하였다:
제제 번호 11-1
성분 양
DOTAP 총 지질의 55 몰%
콜레스테롤 총 지질의 45 몰%
루시페라제 플라스미드 100 ㎍
제제 번호 11-2
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 40 몰%
PHSPC 총 지질의 60 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 11-3
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 40 몰%
PHSPC 총 지질의 60 몰%
FC-PEG 총 지질의 1 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 11-4
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 35 몰%
DOTAP 총 지질의 30 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
제제 번호 11-5
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 35 몰%
DOTAP 총 지질의 30 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 11-6
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 35 몰%
DOTAP 총 지질의 30 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
FC-PEG 총 지질의 1 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 11-7
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 42.5 몰%
GC33 총 지질의 22.5 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 250 ㎍
제제 번호 11-8
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 42.5 몰%
GC33 총 지질의 22.5 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 11-9
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 42.5 몰%
GC33 총 지질의 22.5 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
FC-PEG 총 지질의 1 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
C. 생체내 투여
종양 세포에의 접종 9일 후, 제제 번호 11-1 내지 제제 번호 11-9 중의 하나의 제제에 의한 처치를 위해 27마리의 종양 보유 생쥐를 3군의 처치군(n = 3)으로 임의로 추출하였다. 리포솜-DNA 복합체를 200 ㎍ DNA 플라스미드의 용량으로 정맥내 투여하였다. FGF-표적화 리포솜-DNA 복합체의 투여 이래로 24시간 후에, 종양, 폐 및 간에서의 루시페라제 발현이 측정되었다.
실시예 12
FGF - 표적화 리포솜- DNA 복합체의 생체내 투여
A. 시험동물
생쥐에게 실시예 9A에 기재된 바와 같은 루이스 폐 암종 세포를 접종하였다. 반대쪽의 측복부에는 실시예 10A에 기재된 바와 같이 마트리겔(Matrigel®)을 주입하였다.
B.리포솜 제제
실시예 6 및 7에서 설명한 바와 같이 이하의 지질 성분을 지닌 7개의 리포솜 제제를 제조하였다:
제제 번호 12-1
성분 양
DOTAP 총 지질의 55 몰%
콜레스테롤 총 지질의 45 몰%
루시페라제 플라스미드 100 ㎍
제제 번호 12-2
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 35 몰%
DOTAP 총 지질의 30 몰%
CHOL 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
제제 번호 12-3
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 35 몰%
DOTAP 총 지질의 30 몰%
CHOL 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 12-4
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 35 몰%
DOTAP 총 지질의 30 몰%
CHOL 총 지질의 35 몰%
FC-PEG 총 지질의 1 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 12-5
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 53.75 몰%
GC33 총 지질의 11.25 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
제제 번호 12-6
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 53.75 몰%
GC33 총 지질의 11.25 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
제제 번호 12-7
성분 양
DSPEI 중성의 양이온성 지질 총 지질의 53.75 몰%
GC33 총 지질의 11.25 몰%
PHSPC 총 지질의 35 몰%
FC-PEG 총 지질의 1 몰%
루시페라제 플라스미드 200 ㎍
FGF 표적화 리간드 15 FGF/리포솜
C. 생체내 투여
종양 세포에의 접종 9일 후, 제제 번호 12-1 내지 제제 번호 12-7의 어느 하나의 제제에 의한 처치를 위해 21마리의 종양 보유 생쥐를 3군의 처치군(n = 3)으로 임의로 추출하였다. 리포솜-DNA 복합체를 200 ㎍ DNA 플라스미드의 용량으로 정맥내 투여하였다. FGF-표적화 리포솜-DNA 복합체의 투여 이래로 20시간 후에, 마트리겔, 종양, 폐 및 간에서의 루시페라제 발현이 측정되었다.
이상 본 발명에 대해서는 특정 구체예에 관해 설명하였으나, 당업자에게 있어서는 본 발명으로부터 벗어나지 않고도 각종 변화와 변형이 가능함은 명백하다.

Claims (28)

  1. 화학식 (I)의 화합물:
    Figure 112006057132389-PCT00004
    식 중,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 또는 6 내지 24개의 탄소원자를 지닌 직쇄 혹은 분기쇄의 알킬, 알케닐 또는 알키닐 사슬이고;
    n = 1-20;
    m= 1-20;
    p = 1-3;
    L 및 Q는 독립적으로 Cl-C6 알킬, -X-(C=O)-Y-CH2-, -X-(C=O)-, -X-CH2-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    X 및 Y는 독립적으로 산소, NH 및 직접 결합으로부터 선택되며;
    W는 아미노, 구아니디노 또는 아미디노 부분이고;
    Z는 pKa가 7.4보다 작고 약 4.0보다 큰 약염기성 부분이다.
  2. 제 1항에 있어서, p는 1이고, W는 -NR8 2-이며, R은 각각 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬로부터 선택되는 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, p는 2이고, W는 -NR8-이며, R8은 H 또는 C1 -6 알킬로부터 선택되는 화합물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, n = 1-10인 화합물.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, m = 1-5인 화합물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, Z의 pKa는 6.5보다 작고 약 5.0보다 큰 화합물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 환식 또는 비환식 아민인 화합물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 이미다졸인 화합물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2는 각각 C17H35인 화합물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 중성의 양이온성 지질을 포함하는 리포솜 및 다중 음이온성 화합물을 포함하는 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 다중 음이온성 화합물은 폴리뉴클레오타이드, 다당류 또는 음으로 하전된 단백질인 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 소간섭 RNA(small interfering RNA), 단백질-핵산 복합체, 폴리뉴클레오타이드-약물 컨쥬게이트 또는 이들의 혼합물인 조성물.
  13. 제 11항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 변성 뉴클레오타이드, 비천연적으로 생성되는 뉴클레오타이드, 대용 링커(surrogate linker)를 지닌 폴리뉴클레오타이드 유사체, 5가의 인산 링커 및 대용 링커를 포함하는 하이브리드 폴리뉴클레오 타이드 또는 이들의 혼합물인 조성물.
  14. 제 10항에 있어서, 리포폴리머를 더 포함하는 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 리포폴리머는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리하이드록시프로필 메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸 아크릴레이트, 폴리메타크릴아마이드, 폴리디메틸아크릴아마이드, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로플옥사졸린, 폴리아스파르트아마이드, 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 친수성 폴리머로 이루어진 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 친수성 폴리머는 분해성 결합을 통해 리포폴리머의 지질 부분에 부착되어 있는 조성물.
  17. 제 14항에 있어서, 리포폴리머는 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 조성물.
  18. 제 10항에 있어서, 상기 리포솜은 화학식 (I)의 지질을 5 내지 80 몰% 포함하는 조성물.
  19. 제 14항에 있어서, 상기 리포솜은 리포폴리머를 약 1 내지 30몰% 포함하는 조성물.
  20. 제 10항에 있어서, 리포솜에 포획된 치료제를 더 포함하는 조성물.
  21. 제 10항에 있어서, 상기 다중 음이온성 화합물은 상기 리포솜의 적어도 일부에 포획되어 있는 조성물.
  22. 제 10항에 있어서, 리포솜을 표적 부위에 표적화하기 위한 표적화 리간드를 더 포함하는 조성물.
  23. 제 22항에 있어서, 표적화 리간드는 내피 세포 또는 종양 세포에 대한 결합 친화성을 지닌 조성물.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 표적화 리간드는 HER2/neu 종양 유전자의 c-erbB-2 단백질 산물, 표피성장인자(EGF), 염기성 섬유모세포 성장(염기성 FGF), 혈관내피성장인자, E-셀렉틴, L-셀렉틴, P-셀렉틴, 엽산, CD4, CD19, αβ 인테그린 또는 케모카인인 조성물.
  25. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 화학식 (I)의 구조를 지닌 중성의 양이 온성 지질을 포함하는 소포형성용 지질로부터 리포솜을 형성하고;
    다중 음이온성 화합물을 첨가하고;
    리포솜을 0.05 내지 0.5 마이크론 크기 범위에서 선택된 크기로 크기조정하는 것을 포함하여,
    연장된 혈액 순환 시간이 특징인 다중 음이온성 화합물 투여용의 리포솜을 제조하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 리포솜은 포획 형태의 치료제를 더 포함하는 방법.
  27. 세포를 제 10항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 의한 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 세포의 핵내 주입 방법.
  28. (i) 화학식 (I)의 구조를 지닌 중성의 양이온성 지질;
    (ii) 플라스미드, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 소간섭 RNA, 대용 링커를 지닌 폴리뉴클레오타이드 유사체의 적어도 하나; 또는 5가 인산 링커 및 대용 링커를 포함하는 하이브리드 폴리뉴클레오타이드; 및
    (iii) 리포폴리머 또는 표적화 리간드
    를 구비한 리포솜을 포함하는, 다중 음이온성 화합물 투여용 조성물:
    Figure 112006057132389-PCT00005
    식 중,
    Rl 및 R2는 각각 6 내지 24개의 탄소 원자를 지닌 직쇄 또는 분기쇄의 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고;
    n = 1;
    m=1;
    p=1;
    L 및 Q는 독립적으로 Cl-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    W는 -NR8 2-이고;
    R8은 각각 독립적으로 H 또는 Cl-C6 알킬로부터 선택되고;
    Z는 이미다졸이다.
KR1020067016098A 2004-01-15 2005-01-13 치료제 전달용의 리포솜 조성물 Withdrawn KR20060103957A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51386404P 2004-01-15 2004-01-15
US60/513,864 2004-01-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20060103957A true KR20060103957A (ko) 2006-10-04

Family

ID=34806873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067016098A Withdrawn KR20060103957A (ko) 2004-01-15 2005-01-13 치료제 전달용의 리포솜 조성물

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20050191344A1 (ko)
EP (1) EP1706149A2 (ko)
JP (1) JP2007520481A (ko)
KR (1) KR20060103957A (ko)
CA (1) CA2553426A1 (ko)
TW (1) TW200533388A (ko)
WO (1) WO2005070466A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170099878A (ko) * 2014-10-31 2017-09-01 일루미나 케임브리지 리미티드 신규한 폴리머 및 dna 코폴리머 코팅

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7968115B2 (en) 2004-03-05 2011-06-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal curcumin for treatment of cancer
US8784881B2 (en) 2004-03-05 2014-07-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal curcumin for treatment of diseases
JP2008536874A (ja) * 2005-04-15 2008-09-11 ボード オブ リージェンツ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム 中性脂質組成物によるｓｉＲＮＡの送達
CA2631875A1 (en) * 2005-12-06 2007-10-04 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Formulation of insoluble small molecule therapeutics in lipid-based carriers
EP2034019B1 (en) * 2006-06-30 2014-08-20 Hokkaido System Science Co., Ltd. Composition for nucleic-acid introduction
WO2008094959A1 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Pharmaceutical composition comprising a campothecin derivative
GB0712905D0 (en) * 2007-07-04 2007-08-15 Reckitt Benckiser Uk Ltd Hard surface treatment compositions with improved mold or fungi remediation properties
US20090092664A1 (en) * 2007-10-08 2009-04-09 University Of Kentucky Research Foundation Polymer-metal chelator conjugates and uses thereof
US8067432B2 (en) * 2008-03-31 2011-11-29 University Of Kentucky Research Foundation Liposomal, ring-opened camptothecins with prolonged, site-specific delivery of active drug to solid tumors
ES2630805T3 (es) * 2008-07-14 2017-08-24 Polypid Ltd. Composición de vehículo de fármaco de liberación sostenida
IN2012DN00570A (ko) 2009-07-14 2015-06-12 Polypid Ltd
US9937128B2 (en) * 2009-08-03 2018-04-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Liposomes comprising a calcium phosphate-containing precipitate
JP5860409B2 (ja) * 2010-01-19 2016-02-16 ポリピッド リミテッド 徐放性核酸マトリックス組成物
US9393320B2 (en) 2011-12-07 2016-07-19 Universidade Do Minho Liposomes and its production method
EP3142684A4 (en) * 2014-05-12 2018-05-23 Purdue Research Foundation Selectin and icam/vcam peptide ligand conjugates
WO2017106827A1 (en) * 2015-12-17 2017-06-22 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions for modulated release of proteins and methods of use thereof
US20200384002A1 (en) * 2017-12-06 2020-12-10 Yale University Prodrugs Activated by Reduction in the Cytosol

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4415732A (en) * 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US6180134B1 (en) * 1993-03-23 2001-01-30 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced ciruclation effector composition and method
US5985847A (en) * 1993-08-26 1999-11-16 The Regents Of The University Of California Devices for administration of naked polynucleotides which encode biologically active peptides
US5922687A (en) * 1995-05-04 1999-07-13 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Intracellular delivery of nucleic acids using pressure
EP0784984B1 (en) * 1996-01-17 2003-07-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Transfection competent molecules
TW520297B (en) * 1996-10-11 2003-02-11 Sequus Pharm Inc Fusogenic liposome composition and method
US6056973A (en) * 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
US6121457A (en) * 1997-11-14 2000-09-19 Megabios Corporation Compositions and methods using novel substituted imidazolium lipids
EP1046394A3 (en) * 1999-04-19 2001-10-10 ImaRx Pharmaceutical Corp. Novel compositions useful for delivering compounds into a cell
IL146055A0 (en) * 1999-04-23 2002-07-25 Alza Corp Conjugate having a cleavable linkage for use in a liposome
US7112337B2 (en) * 1999-04-23 2006-09-26 Alza Corporation Liposome composition for delivery of nucleic acid
DE60026030T2 (de) * 1999-07-14 2006-08-10 Alza Corp., Mountain View Neutrales lipopolymer und liposomale zusammensetzungen daraus
US7056653B2 (en) * 2000-02-10 2006-06-06 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Detection of binding of charged species using PH- or potential-sensitive probes
DE10109898A1 (de) * 2001-02-21 2002-09-05 Novosom Gmbh Lipide mit veränderlicher Ladung
DE10207177A1 (de) * 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Fakultativ kationische Lipide

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170099878A (ko) * 2014-10-31 2017-09-01 일루미나 케임브리지 리미티드 신규한 폴리머 및 dna 코폴리머 코팅

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005070466A2 (en) 2005-08-04
TW200533388A (en) 2005-10-16
EP1706149A2 (en) 2006-10-04
US20050191344A1 (en) 2005-09-01
JP2007520481A (ja) 2007-07-26
CA2553426A1 (en) 2005-08-04
WO2005070466A3 (en) 2007-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7112337B2 (en) Liposome composition for delivery of nucleic acid
KR20060103957A (ko) 치료제 전달용의 리포솜 조성물
CN112472822B (zh) 一类细胞内质网靶向纳米载药系统的构建与应用
US7390780B2 (en) Gene delivery mediated by liposome-DNA complex with cleavable peg surface modification
US20110117026A1 (en) Methods and compositions for the delivery of bioactive compounds
KR100723852B1 (ko) 핵산 및 약물 전달용 중성-양이온성 지질
AU2008295666B2 (en) Improved liposomes and uses thereof
US20040197390A1 (en) Neutral-cationic lipid for systemic delivery of factor VIII gene
AU8006400B2 (ko)

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20060810

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
PC1203 Withdrawal of no request for examination
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid