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KR20060102592A - 자가항체 검출방법을 이용한 암진단용 면역복합체 및키트와 이를 이용하는 방법 - Google Patents

자가항체 검출방법을 이용한 암진단용 면역복합체 및키트와 이를 이용하는 방법 Download PDF

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KR20060102592A
KR20060102592A KR1020050024363A KR20050024363A KR20060102592A KR 20060102592 A KR20060102592 A KR 20060102592A KR 1020050024363 A KR1020050024363 A KR 1020050024363A KR 20050024363 A KR20050024363 A KR 20050024363A KR 20060102592 A KR20060102592 A KR 20060102592A
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ecpka
autoantibody
antigen
ecpka autoantibody
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KR1020050024363A
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에스 조-정 윤
Original Assignee
바이오제멕스 주식회사
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Abstract

본 발명은 생물학적 시료에서의 항-ECPKA 검출을 위한 검출방법에 관한 것이며, 또한 항-ECPKA 검출을 이용한 암진단용 면역복합체 및 키트와 이를 이용한 포유동물의 암진단방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 항-ECPKA IgG 항체-EIA 방법은, ECPKA 효소 검정보다 민감도, 특이성이 탁월하며, 자가항체 검정이 종래의 항원 검정보다 암 진단에 훨씬 더 유용하다는 것을 보여 준다.
항-ECPKA 자가항체, 암진단방법

Description

자가항체 검출방법을 이용한 암진단용 면역복합체 및 키트와 이를 이용하는 방법{IMMUNOLOGICAL COMPLEXES AND KITS FOR CANCER DIAGNOSTICS USING AUTOANTIBODY DETECTION, AND THE USES THEREOF}
도 1은 정상인과 암환자를 대상으로 본 발명의 바람직한 면역검정법의 포맷을 사용하여 얻은 ECPKA 자가항체의 검정치이다.
도 2는 본 발명의 면역검정법의 포맷의 감도 및 특이성의 대조로서 ECPKA 효소 검정법을 사용하여 얻은, 정상인과 암환자의 ECPKA 활성치이다.
도 3은 정상인과 암환자의 혈청으로부터 분리한 항-ECPKA 항체의 검정치와 ECPKA 효소검정치간의 상관관계를 나타낸다.
도 4는 암항원으로서 HCT-15 종양 추출물을 사용한 경우의 정상인과 암환자의 혈청 중 항암 항원 항체의 역가를 나타낸다.
도 5는 여러가지 암환자의 혈청중 항암 항원 항체의 역가를 나타낸다.
본 발명은 생물학적 시료에서의 항-ECPKA 검출을 위한 면역복합체 및 검출방법에 관한 것이며, 또한 항-ECPKA 검출을 이용한 암진단용 면역복합체 및 키트와 이를 이용한 포유동물의 암진단방법에 관한 것이다.
종양 표지물질은 악성종양 세포에 의해 합성되고 혈관으로 분비된다. 이러한 표지물질은 침윤 또는 종양으로 인한 대사 변화의 결과이며, 숙주조직에 의해서 만들어진다. 혈액과 조직액 내의 종양 표지물질 농도는 종양의 진행과 퇴화를 진단, 스크리닝, 추적하는 데에 매우 유용하다. 이상적인 종양 표지물질은, 단순한 혈액 테스트로 암검출이 가능하고, 그 농도가 종양 진행 단계와 비례하는 것일 것이다. 그러나, 감도와 특이성의 결핍 때문에, 이제까지는 하나의 표지물질만으로는 건강한 사람과 암 발병 환자를 가려내지 못하는 실정이었다. 암 검출을 위한 종양 표지물질의 사용에 대하여는 하기의 문헌에 잘 설명되어 있다.
1. Sluss, P.M. et al. [2004] "ESTABLISHMENT OF A CENTRAL LABORATORY SERUM TUMOR MARKER SERVICE ON A CONSOLIDATED IMMUNODIAGNOSTIC PLATFORM :DEVELOPMENT OF PRACTICE STANDARDS, SERVICE IMPROVEMENTS, AND OPERATIONAL EFFICIENCY," Clin. Leadersh. Manag. Rev. 18[1]:25-31;
2. Gion, M. [2000] "SERUM TUMOUR MARKERS: FROM QUALITY CONTROL TO TOTAL QUALITY MANAGEMENT," Breast 9[6]:306-11;
3. Wiesner, A. [2004] "DETECTION OF TUMOR MARKERS WITH PROTEINCHIP® TECHNOLOGY," Curr. Pharm. Biotechnol. Feb;5[1]:45-67;
4. Crawford, N.P. et al. [2003] "TUMOR MARKERS AND COLORECTAL CANCER: UTILITY IN MANAGEMENT," J. Surg. Oncol. 84[4]:239-48;
5. Agnantis, N.J. et al. [2003] "TUMOR MARKERS. AN UPDATE APPROACH FOR THEIR PROGNOSTIC SIGNIFICANCE. PART Ⅰ. IN VIVO," 17[16]:609-18;
6. Riley, R.D. et al. [2004] "A SYSTEMATIC REVIEW OF MOLECULAR AND BIOLOGICAL TUMOR MARKERS IN NEUROBLASTOMA," Clin. Cancer Res. 10[l Pt 1]:4-12;
7. Given, M. et al. [2000] "THE PREDICTIVE OF TUMOUR MARKERS CA 15-3, TPS AND CEA IN BREAST CANCER RECURRENCE," Breast. 9[5]:277-80.
현재 이용할 수 있는 암 표지물질은 암 항원이다. 예를 들면, 전립선 암은 전립선에 특이적인 PSA(Prostate-specific antigen)를 검정하여 진단할 수 있다(Gretzer, M.B. et al. [2003] "PSA MARKERS IN PROSTATE CANCER DETECTION," Urol. Clin. North Am. 30[4]:677-86). 또한, CEA(Carcino-Embryonic Antigen) 표지물질은 결장암을 알아내는 데에 진단적 유용성이 있음이 확인되었다(Crawford, N.P. et al. [2003] "TUMOR MARKERS AND COLORECTAL CANCER: UTILITY IN MANAGEMENT," J. Surg. Oncol. 84[4]:239-48). 암 항원으로서 CA15-3은 유방암과 직접적으로 관련이 있다(Cheung, K.L. et al. [2003] "OBJECTIVE MEASUREMENT OF REMISSION AND PROGRESSION IN METASTATIC BREAST CANCER BY THE USE OF SERUM TUMOUR MARKERS," Minerva. Chir. Jun;58[3]:297-303). 암 항원 CA19-9은 위장암을 진단하기 위해 이용되어 왔고(Grotowski, M. [2002] "ANTIGENS [CEA AND CA 19-9] IN DIAGNOSIS AND PROGNOSIS COLORECTAL CANCER," Pol Merkuriusz Lek. 12[67]:77-80; Trompetas, V. et al. [2002] "GIANT BENIGN TRUE CYST OF THE SPLEEN WITH HIGH SERUM LEVEL OF CA 19-9," Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 14[1]:85-8), 암 항원 CA125는 난소 암 진단에 사용되어 왔다(Anderiesz, C. et al. [2003] "SCREENING FOR OVARIAN CANCER," Med. J. Aust. 178[12]:655-6).
고형암의 대부분은 염색체의 불안정으로 인하여 세포분열이 일어나는 동안 염색체 분리의 이상이 야기된다. 몇몇 효소 인산화효소(kinase)는 염색체 분리를 적절히 유지시키거나 세포 주기의 진행을 조절하는데 관여한다. cAMP-의존성 인산화 효소(cAMP-dependant protein kinase: PKA)는 세포 신호전달계, 대사, 그리고 증식 등, 많은 곳에서 기능적인 역할을 한다(Matyakhina, L. et al. [2002] "PROTEIN KINASE A AND CHROMOSOMAL STABILITY," Ann. NY. Acad. Sci. 968:148-57; Tortora, G. et al. [2002] "PROTEIN KINASE A AS TARGET FOR NOVEL INTEGRATED STRATEGIES OF CANCER THERAPY," Ann. NY. Acad. Sci. 968:139-47).
포유동물 세포에는 2가지 부류의 PKA가 존재하며(Krebs, E. G. et al. [1979] "PHOSPHORYLATION-DEPHOSPHORYLATION OF ENZYME," Annu. Rev. Biochem. 48:923-39), 그것은 type Ⅰ(PKA-Ⅰ)과 typeⅡ(PKA-Ⅱ)로 구분된다. 그것들은 서로 다른 조절 서브유닛(R subunits)인 RⅠ과 RⅡ에 의해서 구별되고, 공통 촉매 서브유닛(C subunit)을 가지고 있다(Beebe, S.J. et. al. [1986] "CYCLIC NUCLEOTIDE-DEPENDENT PROTEIN KINASES," In: The Enzymes: Control by Phosphorylation, E. G. Krebs et al. [Eds] Academic Press: Orlando and London. pp. 43-111).
종래에, 단백 인산화 효소의 효소활성은, ATP의 방사성의 인산기(γ-32P)를 적당한 단백질 또는 펩티드 기질의 잔기로 이동시키는 방법을 사용하여 검정하였다(Witt, J.J. et al. [1975] Anal. Biochem. 66:253-8; Casnellie, J.E. [1991] Methods Enzymol. 200:115-20; 미국특허 제6,498,005호). PKA 효소 검정방법은 여러 문헌에 기술되어 있다(Cohen, C.B. et al. [1999] "A MICROCHIP-BASED ENZYME ASSAY FOR PROTEIN KINASE A," Anal. Chem. [1999] 273:89-97; Cho, Y.S. et al. [2000] "EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCER BIOMARKER: ITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSAL BY A MYRISTATE-LACKING CALPHA AND RⅡBETA SUBUNIT OVEREXPRESSION," Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97[2]:835-40).
생화학적인 연구와 유전자 클로닝을 통하여 조절 서브유닛의 4개의 이소폼인, RⅠα, RⅠβ, RⅡα, 및 RⅡβ가 확인되었다(Amieux, P.S. et al. [2002] "THE ESSENTIAL ROLE OF RI ALPHA IN THE MAINTENANCE OF REGULATED PKA ACTIVITY," Ann. NY. Acad. Sci. 968:75-95; McKnight, G.S. et al. [1988] "ANALYSIS OF cAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE SYSTEM USING MOLECULAR GENETIC APPROACHES," Recent Prog. Honn. Res. 44:307-35; Levy, F.O. et al. [1988] "MOLECULAR CLONING, COMPLEMENTARY DEOXYRIBONUCLEIC ACID STRUCTURE AND PREDICTED FULL-LENGTH AMINO ACID SEQUENCE OF THE HORMONE-INDUCIBLE REGULATORY SUBUNIT OF 3',5'-CYCLIC ADENOSINE MONOPHOSPHATE-DEPENDENT PROTEIN KINASE FROM HUMAN TESTIS," Mol. Endocrinol. 2:1364-73).
세포가 성장, 분화 및 형질전환하는 동안, PKA-Ⅰ과 PKA-Ⅱ 비율이 급격히바 뀔 수 있다는 점은 매우 중요하다(Lohmann, S. M. et al. [1984] "REGULATION OF THE CELLULAR AND SUBCELLULAR CONCENTRATIONS AND DISTRIBUTION OF CYCLIC NUCLEOTIDE-DEPENDENT PROTEIN KINASES," In: Advances in Cyclic Nucleotide and Protein Phosphorylation Research, P. Greengard et al. [Eds] Raven Press: New York. pp. 63-117; Cho-Chung, Y.S. [1990] "ROLE OF CYCLIC AMP RECEPTOR PROTEINS IN GROWTH, DIFFERENTIATION, AND SUPPRESSION OF MALIGNANCY: NEW APPROCHES TO THERAPY," Cancer Res. 50:7093-100; Cho-Chung, Y.S. [2003] "cAMP SIGNALING IN CANCER GENESIS AND TREATMENT," Cancer Treat Res. 115:123-43).
cAMP 신호전달계는, 림프계의 악성종양의 치료 표적으로 제안되어 왔다 (Lerner, A. et al. [2000] "THE cAMP SIGNALING PATHWAY AS A THERAPEUTIC TARGET IN LYMPHOID MALIGNANCIES," Leuk Lymphoma. 37[1-2];39-51; Cho-Chung, Y.S. et al. [1995] "cAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE: ROLE IN NORMAL AND MALIGNANT GROWTH," Crit. Rev. Oncol. Hematol. 21[1-3]:33-61; Cho-Chung, Y.S. et al. [1993] "THE REGULATORY SUBUNIT OF cAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE AS A TARGET FOR CHEMOTHERAPY OF CANCER AND OTHER CELLULAR DYSFUNCTIONAL-RELATED DISEASES," Pharmacol. Ther. 60[2]:265-88). 인체 암세포주 및 원발성 종양에서는, 화학물질, 바이러스의 발암물질, 그리고 Ki-ras 발암유전자, 또는 전환성장인자(transforming growth factor)-α로 형질전환된 후에 과립체-마크로파지 콜로니-자극인자 또는 포볼에스테르(phorbol ester)로 세포성장이 촉진된 세포내에서의 정상 대응부와 비교하여(Cho-Chung, Y.S. [1990] "ROLE OF CYCLIC AMP RECEPTOR PROTEINS IN GROWTH, DIFFERENTIATION, AND SUPPRESSION OF MALIGNANCY: NEW APPROACHES TO THERAPY," Cancer Res. 50:7093-100; Miller, W.R. et al. [1993] "TYPES OF CYCLIC AMP BINDING PROTEIN IN HUMAN BREAST CANCERS," Eur. J. Cancer. 29A:989-91), RⅠα/PKA-Ⅰ의 발현이 증가됨을 확인하였다(Cho-Chung, Y.S.[1990] "ROLE OF CYCLIC AMP RECEPTOR PROTEIN GROWTH, DIFFERENTIATION, AND SUPPRESSION OF MALIGNANCY: NEW APPROACHES TO THERAPY," Cancer Res. 50:7093-100; Cho Chung, Y.S. et al [2002] "DISSECTING THE CIRCUITRY OF PROTEIN KINASE A AND cAMP SIGNALING IN CANCER GENESIS : ANTISENSE, MICROARRAY, GENE OVEREXPRESSION, AND TRANSCRIPTION FACTOR DECOY," Ann. NY. Acad. Sci. 968:22-36). 반대로, RⅠα/PKA-Ⅰ의 발현의 감소는, 누드마우스에서 자란 광범위한 인체 암세포주와 인체 종양에서의 PKA의 RIα subunit를 표적으로 한 부위선택적인 cAMP 아날로그, 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 야기되는 성장억제와 비례한다(Cho-Chung, Y.S. et al. [1989] "SITE-SELECTIVE CYCLIC AMP ANALOGS AS NEW BIOLOGICAL TOOLS IN GROWTH CONTROL, DIFFERENTIATION AND PROTO-ONCOGENE REGULATION," Cancer Inv. 7:161-77; Cho-Chung, Y.S. et al. [1999] "ANTISENSE DNA-TARGETING PROTEIN KINASE A-RⅠα SUBUNIT: A NOVEL APPROACH TO CANCER TREATMENT," Front Biosci. 4:D898-D907).
다양한 암세포 종들은 배지로 PKA를 분비한다는 것이 이전에 밝혀진 바 있다(Cho, Y.S. et al. [2000] "EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCER BIOMARKER : ITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSAL BY A MYRISTATE-LACKING CALPHA AND RⅡBETA SUBUNIT OVEREXPRESSION," Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97[2]:835-40). 이 세포-외 PKA(ECPKA)는 유리 촉매성 서브유닛(C subunit) 형태("PKA Cα")인 활성상태로 존재하며, 그 활성은 PKA 억제 단백질인 PKI에 의해서 특이적으로 억제된다.
세포내에서 PKA-Ⅰ를 증가시키는 발현 벡터에서, PKA의 Cα 또는 RⅠα의 과발현은 ECPKA 발현을 현저하게 증가시킨다. 반대로, PKA-Ⅰ를 제거하고 PKA-Ⅱ를 증가시켜 형질변경 표현형을 되돌리게 하는 RⅡβ 서브유닛의 과발현은 ECPKA를 감소시킨다. 미리스틸화(myristylation)를 막는 Cα 돌연변이는 세포내 PKA를 증가시키게하지만 ECPKA 증가는 억제된다. 이것은 Cα의 NH2-말단의 미리스틸기가 ECPKA 발현에 필요하다는 것을 암시한다. 암환자 혈청에서, ECPKA 발현은 정상인의 혈청과는 대조적으로 현저하게 증가하였다(Cho, Y.S. et al. [2000] "EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCER BIOMARKER: ITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSAL BY A MYRISTATE-LACKING CALPHA AND RⅡBETA SUBUNIT OVEREXPRESSION," Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97[2]:835-40).
단일클론 항체의 개발에 의하여 악성종양 환자의 혈청과 조직 내 수많은 종양-결합 항원의 발견이 가능하게 되었다. 발암유전자 및 종양 억제유전자의 단백질 산물은, 세포 밖에서 탐지할 수 있고, 생체 내에서 발암에 대한 잠재적인 표지물질로서 작용할 수 있다. 성장인자 중 몇몇은 발암유전자에 의해 코드화 되었는데, 예를 들면, p21-ras 단백질은 환자 혈액에서 발견된 ras 발암유전자에 의해 코드화 되었다. p53 종양억제 단백질에 대한 항체는 유방암, 폐암 환자 및 B-림프종을 지닌 유아들의 혈청에서 발견되었다(Winter, S.F. et al. [1992] "DEVELOPMENT OF ANTIBODIES AGAINST p53 IN LUNG CANCER PATIENTS APPEARS TO BE DEPENDENT ON THE TYPE OF p53 MUTATION." Cancer Res. 52:4168-74; Lubin, R., et al. [1993] "ANALYSIS OF p53 ANTIBODIES IN PATIENTS WITH VARIOUS CANCERS DEFINE B-CELL EPITOPES OF HUMAN p53: DISTRIBUTION ON PRIMARY STRUCTURE AND EXPOSURE ON PROTEIN SURFACE." Cancer Res. 53:5872-6; Crawford, L.V., et al. [1982] "DETECTION OF ANTIBODIES AGAINST THE CELLULAR PROTEIN p53 IN SERA FROM PATIENTS WITH BREAST CANCER." Int. J. Cancer. 30:403-8). c-myc와 c-myb와 같은 발암유전자에 대한 항체는 결장, 유방암 환자 혈청에서 발견되었다(Sorokine, I., K. et al. [1991] "PRESENCE OF CIRCULATING ANTI-C-MYB ONCOGENE PRODUCT ANTIBODIES IN HUMAN SERA." Int. J. Cancer. 47:665-9; Ben-Mahrez, K., et al. [1988] "DETECTION OF CIRCULATING ANTIBODIES AGAINST C-MYC PROTEIN IN CANCER PATIENT SERA." Br. J. Cancer. 57:529-34; Ben-Mahrez, K., et al.[1990] "CIRCULATING ANTIBODIES AGAINST C-MYC ONCOGENE PRODUCT IN SERA OF COLORECTAL CANCER PATIENTS." Int. J. Cancer. 46:35-8).
위에서 언급한 새로운 표지물질 뿐만 아니라, 다른 어떤 단백질, 호르몬 그리고 효소들은 과거 약 30년간 표지물질로서 사용되어 왔다. 그 중에서 주목할 만한 것으로는, CEA(carcinoembryonic antigen), AFP(α-fetoprotein), HCG(human chorionic gonadotropin) 및 PAP(prostatic acid phosphatase)가 있다.
상기한 표지물질을 포함하여 대부분의 표지물질들은 특이성이 부족하다. 그 농도가 양성 종양의 경우나 임신중에 증가하기도 한다. 이러한 모든 표지물질들은 항원 검출 방법을 기본으로 하여 이루어져 있으나, 특이성이나 민감도가 떨어진다. 따라서 새로운 생표지 분자를 발견하여, 이를 임상에 사용할 수 있게 하는 것이 필요하게 되었다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키기 위한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 세포외 단백질 합성효소(extracelluar protein kinase A: ECPKA)에 대한 IgG 항체 검정을 위한, 매우 민감한 효소 면역검정법(enzyme immunoassay; EIA)에 관한 것이다. 다양한 유형의 암환자 295명과 정상인 100명의 혈청을 가지고 실험한 결과, 항-ECPKA IgG 항체의 농도가 정상인(14%)보다 암환자(92%)에서 월등히 높다는 것을 발견하게 되었다. EIA를 이용한 항-ECPKA IgG 항체 검정법과 PKA 효소검정을 이용한 ECPKA 항원 검정법간에는 유의적인 상관관계가 없었고, 항-ECPKA IgG 항체-EIA 방법은 ECPKA 효소 검정법보다 민감도, 특이성이 탁월하게 우수하였다. 본 발명의 결과로부터 종래의 항원 검정보다 자가항체 검정이 암 진단에 훨씬 유용하다는 것을 알 수 있다.
상세하게는, 본 발명은 포유동물의 생물학적 시료에서 항-ECPKA 자가항체의 유무 또는 농도를 검정하는, 하기의 단계들을 포함하는 면역검정법을 제공한다:
(a) 항-ECPKA 자가항체에 특이한 항원과 생물학적 시료를 접촉시키는 단계: 상기의 단계는 상기의 생물학적 시료에 항-ECPKA 자가항체가 존재하는 경우에 상기의 항원과 결합하여 항원-항-ECPKA 자가항체 복합체 형태를 만들기에 충분한 조건하에서 수행된다;
(b) 상기에서 형성된 항원-항-ECPKA 자가항체 복합체에 항-ECPKA 자가항체 결합 분자를 접촉시키는 단계: 상기의 단계는 상기의 항-ECPKA 자기항체 결합 분자가, 상기의 형성된 항원-항-ECPKA 자가항체 복합체의 항-ECPKA 자가항체와 결합하여, 확장된 복합체를 형성하도록 하기에 충분한 조건하에서 수행된다; 그리고,
(c) 상기에서 형성된 확장된 복합체의 유무와 농도를 검정하므로써 생물학적 시료에서 항-ECPKA 자가항체의 유무와 농도를 결정하는 단계.
본 발명의 면역검정법의 하나의 구체예에 있어서, 상기 항-ECPKA 자가항체에 대한 특이적 항원은 세포외 PKA 단백질이다.
본 발명의 면역검정법의 다른 구체예에 있어서, 상기 항-ECPKA 자가항체는 상기의 포유동물의 것과는 다른 포유류 종의 항체이고, 상기의 포유동물에서 생산되는 항체에 특이적이다.
본 발명의 면역검정법의 다른 구체예에 있어서, 상기 포유동물은 인간이고, 상기의 항-ECPKA 자가항체는 인간 IgG 항체이다.
본 발명의 면역검정법의 다른 구체예에 있어서, 상기 항-ECPKA 자가항체 결합 분자는 검출할 수 있도록 표지된다(특히, 화학적 표지 또는 효소적 효지).
본 발명의 면역검정법의 다른 구체예에 있어서, 상기 단계 (a)의 항-ECPKA 자가항체에 대하여 특이적인 상기의 항원은 생물학적 시료와의 접촉 전에 고형 지 지체에 고정된 것이다.
본 발명의 면역검정법의 다른 구체예에 있어서, 상기 단계 (a)의 항-ECPKA 자가항체에 대하여 특이적인 상기의 항원은 상기의 생물학적 시료와 접촉 후에 고형 지지체에 고정된 것이다.
본 발명의 면역검정법의 다른 구체예에 있어서, 상기 사용되는 면역검정법은 면역크로마토그래픽 면역검정법으로서,
상기의 단계 (a)에서, 생물학적 시료는 첫 번째 다공성 운반체에 접촉하도록 놓이고, 첫 번째 다공성 운반체는 항-ECPKA 자가항체에 특이적인 비고정, 표지 항원을 함유하며;
상기의 단계 (b)에서, 형성된 항원-항-ECPKA 자가항체 복합체는 두 번째의 다공성 운반체에 접촉하도록 놓이고, 두 번째의 다공성 운반체는 첫 번째 다공성 운반체와 연결되고, 고정된 항-ECPKA 자가항체 결합 분자를 함유하며; 그리고,
상기의 단계 (c)에서, 생물학적 시료 중의 항-ECPKA 자가항체의 유무 또는 농도는, 두 번째의 다공성 운반체에 있는 항-ECPKA 자가항체에 특이적인 표지된 항원의 존재를 검출함으로써 검정한다.
또한, 본 발명은 항-ECPKA 자가항체에 결합한 항-ECPKA 자가항체에 특이적인 항원을 함유하는 면역복합체에 관한 것으로서, 상기 항-ECPKA 자가항체는 항-ECPKA 자가항체 결합 분자에 부가적으로 결합된 것이다.
본 발명의 면역복합체의 하나의 구체예에 있어서, 상기 항-ECPKA 자가항체에 특이적인 항원은 세포외 PKA 단백질이다.
본 발명의 면역복합체의 다른 구체예에 있어서, 상기 항-ECPKA 자가항체 결합 분자는 검출할 수 있도록 표지된다(특히, 화학적 표지 또는 효소적 효지).
본 발명의 면역복합체의 다른 구체예에 있어서, 상기 항-ECPKA 자가항체 결합 분자는 면역학적 분자이다.
본 발명의 면역복합체의 다른 구체예에 있어서, 상기 항-ECPKA 자가항체는 인간의 자가항체이고, 항-ECPKA 자가항체 결합 분자는 항-인간 IgG 항체이다.
또한, 본 발명은 포유동물의 생물학적 시료에서 항-ECPKA 자가항체의 유무와 농도를 검정하기 위한 하기의 구성으로 이루어진 키트에 관한 것이다:
여기서 키트는 다중 필터 시스템으로 이루어진 빈 케이스와, 첫 번째와 두 번째 다공성 운반체로 구성되어 있고, 두 번째 다공성 운반체는 첫 번째 다공성 운반체와 연결되어 있고, 첫 번째 다공성 운반체는 다중 필터 시스템과 연결되어 있고, 그 일부분은 케이스로부터 접근될 수 있으며;
첫 번째 다공성 운반체는 비-고정의, 표지되어 있는 PKA Cα 또는 Cα 단편을 함유하고 있고; 그리고
두 번째 다공성 운반체는 고정되어 있고, 표지되어 있지 않은 인간 IgG와 결합된 항체를 함유하고 있다.
본 발명의 키트의 하나의 구체예에 있어서, 상기 표지된 PKA Cα는 ECPKA이다(특히 화학적 표지 또는 효소적 효지).
본 발명의 키트의 다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 인간 항-ECPKA 자가항체들을 검출하고, 인간 IgG와 결합하는 상기의 항체는 인간 외의 포유동물의 항체 이다.
또한, 본 발명은 상기의 면역복합체 또는 키트를 사용하여 인간을 제외한 포유동물의 암을 진단하기 위한 진단방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
세포외 PKA(ECPKA)는 암세포로부터 분비된다(Cho, Y.S. et al [2000] "EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCER BIOMARKER : ITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSAL BY A MYRISTATE-LACKING CALPHA AND RⅡBETA SUBUNIT OVEREXPRESSION," Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97[2]:835-40). 본 발명은 ECPKA 분비가 혈청 자가항체의 형성을 일으키므로, 자가항체의 농도 또는 존재유무를 검정하므로써, 암 진단 및 예측 표지로 이용될 가능성이 있다는 생각에서 비롯되었다. 본 발명은 암의 의심이 가거나 또는 확인된 암 환자의 생물학적 시료에서 항-ECPKA 자가항체(특히 항-ECPKA-IgG 항체)의 농도, 또는 존재유무를 검정하는 높은 민감도를 갖는 면역검정법이다. 이 자가항체를 기본으로 하는 면역검정법은 다양한 암세포를 검출하는 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 항원-항체 결합에 관련한다. 여기서 사용한 것처럼, 항원의 2~3차원적 부위인“에피토프(epitope)"가 특이적으로 항체와 결합한다. 따라서 항원과 항체가 서로 면역특이적으로 결합이 가능하다면 "특이적이다" 또는“인식한다", 또는“결합한다"고 할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르는 검정법은 어떠한 포맷도 가능하다. 그러한 포맷은 이질적 또는 동질적, 순서적 또는 동시적, 경쟁적 또는 비경쟁적일 수 있다. 미국특허 제5,563,036호, 제5,627,080호, 제5,633,141호, 제5,679,525호, 제5,691,147호, 제5,698,411호, 제5,747,352호, 제5,811,526호, 제5,851,778호 및 제5,976,822호는 몇몇 다른 검정법의 포맷과 적용을 설명한다. 그러한 검정법은 항-ECPKA 자가항체의 농도 또는 양을 검정하기위해 정량적(quantitative) 구성으로 할 수 있고, 또는 항-ECPKA 자가항체의 유무를 검정하기 위한 정성적(qualitative) 구성으로 할 수 있다.
이질적 면역검정법 기술은 반응 생성물의 결합이 이루어지는 고형상 물질의 사용과 관련되며, 비-고정화된 항원과 항체(즉, 액체상 면역검정법)의 결합과는 다르다. 그 반응산물은 반응혼합물로부터 고형분을 제거함(예컨대, 세척에 의함)으로써, 과잉 시료, 검정 시약, 다른 물질로부터 분리한다. 본 발명과 연관되어 사용되었던 고형상 면역검정법의 한 형태는 샌드위치(sandwich) 면역검정법이다. 이 샌드위치 면역검정법에서는, 시료에 더 많은 검정 물질이 존재할수록 고형상에 표지물질의 양이 더 증가할 것이다. 이런 검정법은, 검정 물질 농도가 낮은 경우에 일반적으로 널리 이용된다. 왜냐하면, 고형상의 표지 농도는 아주 쉽게 검출되기 때문이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 항-ECPKA 자가항체와 특이적으로 반응이 일어나는 항원은 고형지지체와 결합(즉, 고정됨)이 이루어지고, 항-ECPKA IgG 항체의 유무를 테스트하기 위하여 생물 시료와 혼합시켜 배양된다. 항원은 비결합 상태인 생물 시료와 함께 배양된 후 고형지지체와 결합이 이루어져 고정된다. 그후 지지체를 세척하므로써, 고정된 항원과 결합이 이루어지지 않은 비-ECPKA IgG 항체가 제거된다. 이러한 처리가 끝나면 항원과 항-ECPKA IgG 항체간에 면역복합체가 형성된다.
검출 가능하게 표지된 이차 항체(예컨대, 항-인간 IgG 항체)를 첨가하고, 이차 항체와 면역복합체의 항-ECPKA IgG 항체간에 결합이 가능하도록 충분한 조건으로 배양해준다. 그후, 결합이 이루어지지 않은 이차 항체를 제거시키기 위하여 세척한다. 항-ECPKA IgG 항체가 시료에 존재한다면, 두 항체는 면역복합체를 형성할 것이다(즉, 이차 항체/항-ECPKA IgG 항체/항원의 샌드위치 형). 이러한 검정에서 이차 항체의 검출은 테스트하는 시료에 항-ECPKA IgG 항체가 존재하는 것을 암시하는 것이다. 샌드위치 검정 포맷은 Schuurs et al. 미국 특허 제3,791,932호 및 제4,016,043호, 및 Pankratz, et al., 미국특허 제5,876,935호에 기재되어 있다. 이차 항체로는 비인체 영장류(예, 항-인간 IgG 쥐 항체, 항-인간 IgG 염소 항체, 등)로부터 분리된 자연 면역글로블린과 재조합, 합성적으로 생산된 면역글로블린 단편이 있다. 그리고 필요에 따라, 다른 결합 분자(항-ECPKA 자가항체와 결합할 수 있는)를 이차 항체와 같이 사용하거나, 대신하여 사용할 수도 있다. 예를 들면, 항-ECPKA 자가항체는 비오틴화(biotinylation) 될 수 있고, 이차항체도 또한 표지된 아비딘(avidin) 또는 스트렙트아비딘(streptavidin)으로 대체될 수 있다.
비결합부를 분리하는 단계를 없애고, 화학적 결합법에 필요한 장비와 검출시간을 줄이기 위하여, 동질성 검정 포맷법이 대안으로 이용될 수 있다. 이 검정법은 결합 쌍의 한 쪽(항원)이 이미 고정화되어 있다; 그러나 결합 쌍의 다른 쪽(항- ECPKA 자가항체)이 존재하면 비결합부의 분리없이 검출된다. 예로서, 동질성 광학법인 형광 퀀칭의 검출을 통해 작동하는 Syva, Inc(Sunnyvale, CA)의 EMIT법; 광 산란의 변화를 검출하므로써 작동하는 베링베르케(Behringwerke, Marburg, Germany)의 레이저 네펠로메트리 라텍스 입자 응집법; 미쓰비시 화학사(Tokyo, Japan)의 LPIA 라텍스 입자 응집법; 애보트사(Abbott Park, IL)의 TDX 플루오레센스 탈분극법; 및 시스사(Cis Bio International, Paris, France)의 형광 에너지 전이법이 있다.
상기의 검정법들 중 어느 것이나 본 발명의 목적에 따라 적용될 수 있다.
본 발명의 결합 검정법은 경쟁적 검정법에 따라 구성될 수 있다. 경쟁적 검정법에서는 테스트 시료에 존재하는 항-ECPKA IgG 항체가 많을수록 고형상(solid phase)에 존재하는 표지물질의 양은 적다.
샌드위치 검정법과 유사한 방법으로서 경쟁적 검정법은, 표지된 항-ECPKA IgG 항체의 정확한 양을 제공하고, 지지체와 결합되도록 하기 위하여 표지된 항체와 경쟁적인 항-ECPKA IgG 항체가 실험한 액상에 함유되어 있는지를 판단하기 위하여 시행할 수 있다. 이 경쟁적 검정법에서, 상당량의 획득된 표지된 항체는 테스트 시료에 존재하는 상당량의 검정물질과 서로 반비례한다. 스미스(미국 특허 제 4,401,764호)는, 검정물질 또는 표지된 검정물질과 결합할 수 있는 혼합된 결합 복합체를 사용하는 새로운 경쟁적 검정법을 제시하였다. 그러나 검정물질과 표지된 검정물질이 동시에 복합체와 결합할 수는 없다. 클라겟(미국 특허 제4,746,631호)은 반응챔버를 사용하는 면역검정법을 개시하였다. 이 방법은 테스트 시료 검정물 질에서 검정물질/리간드/표지 결합체는 반응 표면으로부터 치환이 되고, 치환된 검정물질/리간드/표지 결합체는 두번째의 반응 부위에 고정된다. 그 결합체는 결합체의 리간드 성분으로서 비오틴, 소의 혈청 알부민 및 합성 펩타이드를 포함하고, 표지 성분으로는 효소, 화학 발광 물질, 효소 억제제 그리고 방사능 핵산을 포함한다.
리(미국특허 제4,661,444호)는, 항-이디오타입 항체와 검출가능하게 표지되어 있는 이차 항체와의 결합체를 사용한 경쟁적 면역검정법을 개시하였다. 이 방법에서는 검출가능한 반응은 시료에서의 검정물질 존재와 역비례한다. 앨런(유럽특허출원 제177,191호)은 플루오레세인(fluorescein)과 같은 이차 시약과 리간드 유도체와의 결합체와 관련된 결합 검정법을 개시하였다. 이 검정법에 따르면, 결합체는 리간드에 특이적인 표지된 결합 파트너에 결합함에 있어서, 검정물질(리간드)과 경쟁하고, 그 결과로서 표지된 결합체는 그후 반응 혼합물로부터 분리된다. 이 결합 검정 포맷법은 경쟁적 결합 기술과 역(reverse) 샌드위치 검정법 배열이 결합된 방법이다. 즉, 고형상에 결합체를 결합시키고, 혼합물로부터 결합체를 분리하기 전에 결합체를 표지된 결합 분자에 결합시키는 방법이다. 그러나 이 검정 결과는 종래의 경쟁적 검정법에서처럼, 고형상에 결합된 표지의 양은 테스트 시료에서의 검정물질의 양과 반비례하는 방식으로 검정된다. Chieregatt et al.(GB 특허 제2,084,317호)은 특이적으로 검정물질에 비간접인 방법으로 표지된 결합 파트너를 사용한 유사한 검정 포맷법을 설명하였다. Mochida et. al.(미국특허 제4,185,084호)은, 또한 고정된 항체에 결합하기 위하여 항원 검정물질과 경쟁적으로 결합하고, 그 다음 표지되는 이중-항원 결합체의 사용을 설명하였다. 이 방법도 역시 고형상의 표지를 검출하는 것으로서, 표지의 양과 테스트 시료에서의 검정물질의 양과는 반비례한다. Sadeh et. al. (미국 특허 제4,243,749호)은 합텐(hapten) 결합체가 고형상에 고정된 항체에 결합하기 위하여, 검정물질과 경쟁하는 유사한 효소 면역검정법을 기술하였다. 이와 같이 다양한 검정법들이 본 발명과 연관되어 사용될 수 있다.
어떠한 검정 포맷에서도, 검정 시약 중에 적어도 하나는 우선적으로 표지될 것이고, 또는 빛의 방출 또는 퀀칭에 의해 검출가능할 것이다. 그러한 성분은 고안된 면역검정법 방식에 따라 이차 항체, 항-ECPKA IgG 항체, 또는 항-ECPKA IgG 항체가 결합하는 항원일 것이다. 방사성 동위 원소-결합 검정 방식은(예컨대, 방사면역검정법 등) 방사선 동위 원소가 표지로서 사용되는 것이다. 그 신호는 형광물질 또는 형광물질 부분의 빛이 방출되므로써 검출 가능하다(Lucas et al. [미국특허 제5,698,411호] and Landrum et. al. [미국특허 제5,976,822호]). 효소-결합 검정 방식은(예컨대, 엘리사 등) 표지로서 효소를 사용한다. 그 신호는 발색 또는 형광물질 부분에서 색 또는 빛이 방출되므로써 검출 가능하다. 파라마그네틱 표지, 착색입자로서 사용되는 물질, 유액, 셀레늄 및 금과 같은 콜로이드 금속, 그리고 염료와 같은 다른 표지들이 이용될 수 있다(미국특허 제4,313,734호, 제4,373,932호, 및 제5,501,985호 참조). 검출 표지로서 효소(특히, 알칼리포스파타제, β-갈락토시다제, 호스 래디쉬 퍼옥시다제, 또는 우레아제)의 사용이 바람직하다.
효소표지의 존재여부는 효소표지에 의하여 촉매작용이 일어나는 발색기질의 사용을 통해 검출된다. 더욱 바람직하게 사용되는 것으로는, 화학적 표지이다(예컨 대, 콜로이드성 금, 라텍스비드 라벨 등). 표지 검출은 다중 검출기, 다중필터, 그레이팅, 또는 특이적으로 다른 형광을 사용하여 이루어질 수 있다(예컨대, 미국특허 제5,759,781호). 효소 표지로서 퍼옥사이드의 사용이 특히 바람직한데, 이는 발색기질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)과 특이적으로 반응한다. 효소 표지로 퍼옥사이드를 항체에 표지하는 경우에, 페리오데이트 테크닉(Nakane, P.K. et al. [1974] "PEROXIDASE-LABELED ANTIBODY. A NEW METHOD OF CONJUGATION," J Histochem. Cystochem. 22:1084-90) 또는 파트너를 이형기능물질(heterofunctional reagent)과 결합시키는 방법(Ishikawa. E. et al. [1983] "ENZYME-LABELING OF ANTIBODIES AND THEIR FRAGMENTS FOR ENZYME IMMUNOASSAY AND IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINING," J. Immunoassay. 4[3]:209-327)의 사용이 가능하다.
널리 다양하게 사용되는 모든 고형 지지체는 본 발명의 면역검정법에 사용될 수 있다. 고형 지지체로 사용하기에 적당한 물질은 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드와 같은 합성물질, 또는 다른 합성 폴리머로 이루어져 있고, 셀룰로오스와 같은 천연 폴리머 뿐만 아니라, 셀룰로오스아세테이트, 니트로셀룰로오스, 및 유리와 같은 천연 폴리머에서 유래한 것으로도 이루어질 수 있다. 지지체는, 공(ball), 가지(branch), 튜브(tube) 및 마이크로검정 또는 마이크로적정판의 형태를 취할 수 있다. 그밖에 종이 스트립, 소판(small plate) 및 맴브레인과 같은 시트형 구조도 적당하다. 그 운반체의 표면은 수용성 용액에 대해 침투성 혹은 비침투성일 수 있다.
상기의 설명은 액체(예컨대, 혈청, 혈액, 뇨, 타액, 췌장액, 뇌척수액, 정액 등)인 생물 시료 중에 항-ECPKA-자가항체가 존재하는지를 검정하는 것과 관계가 있지만, 어떠한 액체 생물 시료(예컨대, 조직 또는 생검 추출액, 대변 추출액, 가래 등)라도, 본 발명의 면역검정법에서 마찬가지로 이용될 수 있다. 생물 시료로 가장 적당한 것으로는 혈청일 것이다.
본 발명의 검정법에서 사용하기 위한 물질은 키트화 된 것이 가장 이상적이다. 어떤 키트는 일정 부분에 시료를 넣을 수 있게 칸이 이루어진 구성일 수 있다. 또한 다른 키트로는 바이알, 튜브형이 있다. 각 용기는 분리된 요소로 구성되어 이루어져 있다. 예를 들면, 용기 중 하나에는 적당한 항원이 지지체에 결합하여 존재하고, 두 번째 용기의 구성물은 액상이며 검출가능하게 표지된 이차 항체가 내부에 존재한다. 게다가, 그 키트는 미리 결정된 ECPKA 또는 항-ECPKA(PKA Cα 또는 Cα 단편) 자가항체를 포함하고 있는 한개 또는 그 이상의 용기를 함유할 수 있다. 후자의 용기는 ECPKA에 대한 자가항체의 양이 밝혀지지 않은 시료로부터 얻어진 결과를 삽입시킬 수 있는 표준곡선 작성을 위해 사용될 수 있다.
이 키트 사용에 있어, 모든 사용자는 ECPKA에 대한 자가항체의 양이 밝혀지지 않은 시료를 적당히 희석하여 용기에 첨가하여야 한다. 첫 번째 용기에는 지지체에 결합되어 있는 항원이 존재하고, 두 번째 용기에서는 검출가능하게 표지된 항체가 존재한다. 배양 시간이 적당히 흐른 후, 면역복합체가 형성되거나 또는 상층액으로부터 분리되며, 면역복합체 또는 상층액에 대하여 방사성 활성을 검출하거나, 효소의 기질을 첨가하고 발색을 일으키거나 또는 화학적 표지(예컨대, 콜로이드성 금, 라텍스 비드 등)를 결합시켜 검출할 수 있다.
본 발명은 특히 항-ECPKA 자가항체들을 검출하기 위한 면역크로마토그래픽 검정법의 사용과 관련되어 있다. 바람직한 면역크로마토그래픽 검정법에서, 접하고는 있지만 공간적으로는 다른 두가지의 다공성 운반체가 사용된다. 첫 번째의 운반체는 PKA Cα 또는 Cα 단편(fragment)이 표지되어 있는 비-고정형으로 이루어져 있고, 두 번째 운반체는 고정형이며 IgG에 결합하는 비표지된 항체를 함유하고 있다(예컨대, 인간 항-ECPKA 자가항체의 검정에서, 비표지 항체로는 항-인간 IgG 항체가 될 수 있다).
바람직하게는, 상기 장치는, 예를 들어 플라스틱 재료 등의 텅 빈 케이스로 구성되어 있을 것이다. 첫 번째 운반체는 장치(예컨대, 노출되어 있거나 장치를 완전히 덮지 않은 장치)를 이용할 수 있는 다중 필터 시스템을 경유하여 케이스의 내부와 간접적으로 연결되어 있다. 혈청, 혈장 또는 완전한 혈액과 같은 시험 시료는 필터 시스템에 직접적으로 적용될 수 있고, 첫 번째 다공성 운반체 내에서 그것으로부터 투과할 수 있다. 이러한 장치에, 항-ECPKA 자가항체를 함유하는 액체를 투과시키면, 첫 번째 운반체의 비고정화되고 표지된 PKA Cα 또는 Cα 단편이 이동하는 항체와 결합하게 될 것이고, 그후 두 번째 운반체를 투과할 것이다. 왜냐하면 두 번째 운반체는 인간 IgG와 결합하는 고정된 항체를 함유하고 있기 때문에 두 번째 운반체에 들어오는 어떤 표지된 PKA Cα 또는 Cα 단편이 그 안에서 포착될 수 있기 때문이다.
따라서, 이러한 항-ECPKA 자가항체들을 나타내는, 고정되고 표지되지 않은 항체를 함유하는 운반체에서의 표지된 PKA Cα 또는 Cα 단편의 검출은, 항-ECPKA 자가항체가 시험시료 중에 존재함을 의미한다. 상기 검정법에서 두 번째 다공성 운반체 안에 결합되는 표지된 PKA Cα 또는 Cα 단편들의 양을 검정함으로써 정량화할 수 있다.
정상인과 암환자를 대상으로 본 발명의 면역검정법의 포맷을 이용하여 얻은 ECPKA 자가항체를 도 1에 나타내었다. 암환자의 빈도와 평균 역가는 각각 92%, 2.2로서, 정상인의 빈도=14%, 평균 역가 0.6보다 훨씬 높았다. 1.0(점선 위)보다 높은 값은 양성이다.
본 발명의 면역검정법 포맷법의 민감도, 특이성을 비교하기 위하여 ECPKA 효소 검정을 사용하여 얻은 ECPKA 활성값을 도 2에 나타내었다. 정상인과 암환자로부터 얻어진 이 값은, 암환자에서 빈도=83%, 평균치=130mU/ml로서 정상인의 빈도=21%, 평균치=60mU/ml와 대비할 때, 민감도와 특이성이 떨어지는 것을 보여준다. 75mU/ml보다 높은 값이 양성이다.
암 환자와 건강한 사람의 혈청을 분리하여 항-ECPKA 항체값과 ECPKA 효소검정값과의 상관관계를 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 암 환자는 0.003, 정상인은 0.001의 계수로 나타나 통계학적으로 의미가 없었다.
암 항원으로서 HCT-15 종양 추출물을 암 환자, 정상인에게 사용한 경우 혈청내의 항암 항원 항체의 역가를 도 4에 나타내었다. 수치 1.5(점선) 이상은 양성이다.
여러가지 종류의 암(폐, 신장, 췌장, 난소, 대장, 간, 위, 방광, 자궁경부, 흑색종, 육종, 근종)을 지니고 있는 암 환자의 혈청에서 항원항체의 역가를 나타낸 것이다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의하여 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명의 실시예는 본 발명의 사상을 구체적으로 제시하는 일부에 불과한 것일 뿐, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가지는 자가 본 발명의 본질을 해하지 않는 범위에서 여러가지 수정, 변형 등을 가할 수 있으나, 이는 본 발명의 범위에 속하는 것임을 밝힌다.
실시예
〈실험예 1〉
인체 내의 암 진단에 대한 항-ECPKA 자가항체 면역검정법과 PKA 효소검정의 비교 평가
재료 및 방법
대상: 여러가지 유형별 암세포를 가진 295명의 환자와 100명의 건강한 사람들로부터 혈청 시료를 얻었다.
ELISA: 암 환자들과 건강한 사람들의 혈청내의 항-ECPKA IgG 자가항체를 고형상 ELISA 검정을 통해서 검정한다. 검정용 둥근바닥 폴리비닐클로라이드 미세적정 플레이트(Thermolab System, Helsinki, Finland)상에 정제된 재조합 인체 PKA Cα 항원(PKA Cα를 정제한 것, 재료 및 방법 참조)을 희석한(PBS에 1ml당 50μg의 농도)것 100μl로 코팅한다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양한 후, 세정완충액(20mM Hepes, 0.9% NaCl, 30mM 수크로스-0.1% 소의 혈청알부민[BSA], pH 7.0)으로 3번 세척하고, 각 용기(well)에 물에 용해된(4g/400ml) 블록케이스(Blockace, Serotec, http://www.serotec.com) 100μl로 실온에서 1시간 동안 차단 하고나서, 플레이트를 구연산나트륨 세정액(50mM 구연산나트륨, 0.15M NaCl, 0.1% 폴리옥시에틸렌솔비탄모노라우레이트 Tween® 20, pH 5.0-5.2)으로 세번 세척한다. 혈청 시료는 시료 희석 완충액(PBS pH 7.4, 0.25% BSA [무지방산 분획 V], 0.05% Tween 20)으로 계속 희석하고, 희석된 시료 100μl를 각 용기에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양한다. 구연산나트륨 세정액으로 3번 세척한 후, 인산완충 식염수(PBS) 0.01M, 0.9% NaCl, 1% BSA 중의 항-인간 IgG-HRP 항체-효소 결합체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 100μl를 용기에 첨가하고, 그후 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양한다. 플레이트를 구연산나트륨 세정액으로 5번 세척한 후, TMB 기질 100μl를 첨가한다. 반응을 0.45M H2SO4 시약 100μl로 중단시킨 후, 450nm에서의 흡광도를 ELISA 해독기(BioRad [Hercules, CA] microplate reader)로 기록한다. ELISA 특이성은 상기의 항원을 최종농도 1g/L로해서 실온에서 1시간 동안 배양한 혈청 시료에 동시에 억제 시험을 실행함으로써 확인한다.
PKA Cα 정제: OT1529-Cα 플라스미드(Cho, Y.S. et al. [2000] "EXTRACELLULAR PROTEIN KINASE A AS A CANCER BIOMARKER: ITS EXPRESSION BY TUMOR CELLS AND REVERSAL BY A MYRISTATE- LACKING CALPHA AND RⅡBETA SUBUNIT OVEREXPRESSION," Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97[2]:835-40)에 pQE31 DNA를 주입하여 pQE-Cα를 생산한다. pQE-Cα 플라스미드를 E-coli에서 발현시키고, 본래의 PKA Cα 단백질의 정제를 실시하였다(Paragon, Baltimore MD).
PKA 검정: PKA의 효소활성은 Rohlff, C. et al. (1993) ("8-Cl-cAMP INDUCES TRUNCATION AND DOWN-REGULATION OF THE RⅠ ALPHA SUBUNIT AND UP-REGULATION OF THE RⅡ BETA SUBUNIT OF CAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE LEADING TO TYPE Ⅱ HOLOENZYME-DEPENDENT GROWTH INHIBITION AND DIFFERENTIATION OF HL-60 LEUKEMIA CELLS," J. Biol. Chem. 268:5774-82)의 방법으로 검정하였다. 혈청 ECPKA 활성의 측정을 위하여, 검정(총부피, 50μl)은 혈청 10μl와 반응 혼합물(5μM cAMP와 5μM PKI가 함유되어 있거나 함유되어 있지 않으며, 50mM Tris HCl[pH 7.5], 1mM DTT, 10mM MgCl2, 5μM 켑타이드(Kemptide)[PKA를 위한 합성기질; GIBCO/BRL], 1.2μM[γ-32P]ATP [25 Ci/mmol; ICN] 함유)에 혼합하여 37℃에서 20분 동안 실행하였다. 배양 후, 반응 혼합물을 포스포셀룰로오스 디스크(GIBCO/BRL) 안에 점적하고, 0.5% 인산으로 3번 세척한다. 필터를 공기 중에서 말리고, 액체 섬광 수치기로 수치를 잰다. PKA 활성의 1 단위는 (γ-32P)ATP로부터 표준 검정 시스템에서 37℃에서 1분 내에 재생된 단백질로 32P가 1 pmol 이동한 효소의 양으로 규정된다. LDH 활성은 시판용 키트(Sigma)를 사용해서 검정하였다.
결과
환자와 정상 대조 개체의 혈청을 상기에서 기술한 ELISA를 이용하여, 정상 대조군 혈청의 평균 흡광도에 대한 비율에 따라 임의적으로 항-ECPKA 자가항체 역가를 나타내어 조사한다. 정상 대조군의 항-ECPKA 자가항체 역가로부터, 1.0보다 큰 비율은 양성으로 간주한다.
검사 중 그리고 검사간의 변이계수가 각각 <8.8%와 <9.0%로서 감정법에 재연성이 있음이 확인되었다. 암 환자의 혈청에서 항-ECPKA 자가항체에 대한 값을 도 1에 나타내고 있다. 환자의 빈도수와 평균 역가 양쪽 모두 정상 대조군(빈도수 14%, 평균 역가 0.60)보다 유의적으로 높았다(빈도수 92%, 평균 적정농도 2.2).
대조적으로, ECPKA 효소검정(항원 농도 검정에서)의 빈도수와 평균 역가(환자, 빈도수 = 83%, 평균값 = 130mU/ml; 정상 대조군, 빈도수 = 21%, 평균값 = 60mU/ml)는, 암환자(n=66)와 정상 대조군(n=66) 사이에 반응성과 특이성의 결핍을 시사하는 유의적인 겹침이 나타났다(도 2).
ELISA에 의해서 얻어진 개개인의 항-ECPKA 자가항체 적정농도와 PKA 효소검정에 의해서 검정된 ECPKA 비교를 도 3에 나타낸다. 이것으로부터 ELISA에 의해서 얻어진 항-ECPKA IgG 항체의 역가와 효소검정(ECPKA 항원 검정)에 의해서 검정된 ECPKA 간에 상관관계가 없다는 것을 알 수 있다.
〈실험예 2〉
항-ECPKA 자가항체 면역검정법과 인간의 암에 대한 그의 이용에 관한 결론
본 발명은 ECPKA에 대한 자가항체의 혈청 존재가 암과 높은 상관관계가 있다는 것을 보여준다. 항-ECPKA 자가항체에 대해, 개발된 ELISA는 고감도와 특이성을 지니고, 암 환자에서 현저하게 높은 항-ECPKA 자가항체 역가(평균 역가 2.2, 빈도수 92%)를 나타내지만, 정상 개체 대조군에서는 낮거나 음성인 역가와 빈도수 (14%)를 나타낸다. ELISA에 의해 검출된 빈도수를 효소 검정법에 의해 검출된 빈도 수와 비교해보면, ECPKA에 대한 자가항체를 검출하는 ELISA는 항원 활성을 검정한 효소 검정법과 비교할때 높은 감도와 특이성을 나타낸다.
본 발명의 자가항체 검출 방법이 다른 암 항원(세포 외에 분비된)에 적용할 수 있는지를 조사하기 위해서 다음의 실험을 실행하였다
: HCT-15 종양(누드 마우스에서 키운 다약제-저항성의 인체 결장암)을 암항원의 원료로 사용한다. 종양은 완충액 #10(20mM Tris-HCl pH 7.4, 100mM NaCl, 0.5% 소디움데옥시콜레이트, 5mM MgCl2, 프로테아제 억제 칵테일셋 1 [Calbiochem])에, 종양 조각 1(중량)에 완충액 3(부피)의 비율로 균질화한다. 균질화된 것을 10,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 모은다. 추출물을 4℃에서 1시간 동안 회전시키면서 프로테인-A 세파로오즈(3:1)와 같이 배양하고 나서, 6,000rpm에서 2분 동안 원심분리한다. 상층액을 모으고, 4℃에서 하룻밤 동안 PBS에 접촉시켜 투석한다. 투석한 후, 추출물은 ELISA의 미세적정 플레이트에 코팅하기 위해 준비한다. 도 4는 암 환자 (n=36)와 건강한 사람 (n=25)으로부터 얻은 혈청의 항암 항원 항체의 역가를 보여주고 있다. 1.5 이상의 평균 값은 양성이다. 도 5는 여러가지 형태의 암(폐, 신장, 흑생종, 췌장, 난소, 결장, 간, 위, 방광, 경부암종, 육종, 평활근종)을 가진 암 환자로부터 혈청의 항원 항체의 역가를 얻은 것을 보여준다. 환자의 혈청(n=36)과 정상 혈청(n=25)은 도 4에서와 같다.
상기의 실험 결과로부터 사람과 동물의 암 항원 검출에, 본 발명의 면역복합체 또는 키트를 사용한 자가항체 면역검정법이 민감도, 특이성이 뛰어나며, 신뢰성 있는 방법임을 확인하였다. 또한 ECPKA에 대한 항원 및 다른 암 항원보다, 본 발명을 이용하여 자가항체를 검출하기 위한 ELISA가 인간과 동물에서 암 진단을 위한 탁월하고도 새로운 접근법을 제시하고 있음을 알 수 있다.

Claims (21)

  1. 포유동물의 생물학적 시료에서 항-ECPKA 자가항체의 유무 또는 농도를 검정하는, 하기의 단계들을 포함하는 면역검정법:
    (a) 항-ECPKA 자가항체에 특이한 항원과 생물학적 시료를 접촉시키는 단계: 상기의 단계에서는, 상기의 생물학적 시료에 항-ECPKA 자가항체가 존재하는 경우에 상기의 항원과 결합하여 항원-항-ECPKA 자가항체 복합체가 형성된다;
    (b) 상기에서 형성된 항원-항-ECPKA 자가항체 복합체에 항-ECPKA 자가항체 결합 분자를 접촉시키는 단계: 상기의 단계에서는, 상기의 항-ECPKA 자기항체 결합 분자가, 상기의 형성된 항원-항-ECPKA 자가항체 복합체의 항-ECPKA 자가항체와 결합하여, 확장된 복합체를 형성한다; 그리고,
    (c) 상기에서 형성된 확장된 복합체의 유무와 농도를 검정하므로써 생물학적 시료에서 항-ECPKA 자가항체의 유무와 농도를 결정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기의 항-ECPKA 자가항체에 대한 특이적 항원은 세포외 PKA 단백질인 것을 특징으로 하는 면역검정법.
  3. 제1항에 있어서, 상기의 항-ECPKA 자가항체는 상기의 포유동물과는 다른 포유류 종의 항체이고, 상기의 포유동물에서 생산되는 항체에 특이적인 것을 특징으로 하는 면역검정법.
  4. 제3항에 있어서, 상기의 포유동물은 인간이고, 상기의 항-ECPKA 자가항체는 인간 IgG 항체인 것을 특징으로 하는 면역검정법.
  5. 제1항에 있어서, 상기의 항-ECPKA 자가항체 결합 분자는 검출할 수 있도록 표지된 것인 것을 특징으로 하는 면역검정법.
  6. 제5항에 있어서, 상기의 검출할 수 있는 표지는 화학적 표지인 것을 특징으로 하는 면역검정법.
  7. 제1항에 있어서, 상기의 단계 (a)에서 항-ECPKA 자가항체에 대하여 특이적인 상기의 항원은 상기의 생물학적 시료와의 접촉 전에 고형 지지체에 고정된 것인 것을 특징으로 하는 면역검정법.
  8. 제1항에 있어서, 상기의 단계 (a)에서 항-ECPKA 자가항체에 대하여 특이적인 상기의 항원은 상기의 생물학적 시료와 접촉 후에 고형 지지체에 고정된 것인 것을 특징으로 하는 면역검정법.
  9. 제1항에 있어서, 상기의 면역검정법은 면역크로마토그래픽 면역검정법으로서,
    상기의 단계 (a)에서, 상기의 생물학적 시료는 첫 번째 다공성 운반체에 접촉하도록 놓이고, 상기의 첫 번째 다공성 운반체는 항-ECPKA 자가항체에 특이적인 비고정의, 표지된 항원을 함유하며;
    상기의 단계 (b)에서, 상기의 형성된 항원-항-ECPKA 자가항체 복합체는 두 번째의 다공성 운반체에 접촉하도록 놓이고, 상기의 두 번째의 다공성 운반체는 상기의 첫 번째 다공성 운반체와 연결되고, 고정된 항-ECPKA 자가항체 결합 분자를 함유하며; 그리고,
    상기의 단계 (c)에서, 상기의 생물학적 시료 중의 항-ECPKA 자가항체의 유무 또는 농도는, 상기의 두 번째의 다공성 운반체에 있는 항-ECPKA 자가항체에 특이적인 상기의 표지된 항원의 존재를 검출함으로써 검정하는 것을 특징으로 하는 면역검정법.
  10. 항-ECPKA 자가항체에 결합한 항-ECPKA 자가항체에 특이적인 항원을 함유하는 면역복합체로서, 상기의 항-ECPKA 자가항체는 항-ECPKA 자가항체 결합 분자에 부가적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 면역복합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기의 항-ECPKA 자가항체에 특이적인 항원은 세포외 PKA 단백질인 것을 특징으로 하는 면역복합체.
  12. 제10항에 있어서, 상기의 항-ECPKA 자가항체 결합 분자는 검출할 수 있도록 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 면역복합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기의 검출할 수 있는 표지는 화학적 표지인 것을 특징으로 하는 면역복합체.
  14. 제10항에 있어서, 상기의 항-ECPKA 자가항체 결합 분자는 면역학적 분자인 것을 특징으로 하는 면역복합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기의 항-ECPKA 자가항체는 인간의 자가항체이고, 상기의 항-ECPKA 자가항체 결합 분자는 항-인간 IgG 항체인 것을 특징으로 하는 면역복합체.
  16. 포유동물의 생물학적 시료에서 항-ECPKA 자가항체의 유무와 농도를 검정하기 위한 하기의 구성으로 이루어진 키트:
    상기의 키트는 다중 필터 시스템으로 이루어진 빈 케이스와, 첫 번째와 두 번째 다공성 운반체로 구성되어 있고, 상기의 두 번째 다공성 운반체는 첫 번째 다공성 운반체와 연결되어 있고, 상기의 첫 번째 다공성 운반체는 다중 필터 시스템과 연결되어 있고, 그 일부분은 케이스로부터 접근될 수 있으며;
    상기의 첫 번째 다공성 운반체는 비-고정의, 표지되어 있는 PKA Cα 또는 Cα 단편을 함유하고 있고; 그리고
    상기의 두 번째 다공성 운반체는 고정되어 있고, 표지되어 있지 않은 인간 IgG와 결합된 항체를 함유하고 있다.
  17. 제16항에 있어서, 상기의 표지된 PKA Cα는 ECPKA인 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제16항에 있어서, 상기의 표지된 PKA Cα의 상기의 표지는 화학적 표지인 것을 특징으로 하는 키트.
  19. 제16항에 있어서, 상기의 키트는 인간 항-ECPKA 자가항체들을 검출하고, 인간 IgG와 결합하는 상기의 항체는 인간 외의 포유동물의 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 면역복합체를 사용하여 인간을 제외한 포유동물의 암을 진단하는 진단방법.
  21. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 키트를 사용하여 인간을 제외한 포유동물의 암을 진단하는 진단방법.
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