KR20060096272A

KR20060096272A - 글리코펩타이드 조성물

Info

Publication number: KR20060096272A
Application number: KR1020060008847A
Authority: KR
Inventors: 아이-치엔 웨이; 데이비드 제이. 양; 동-팡 유
Original assignee: 타이완 호펙스 켐스 엠에프지. 컴퍼니, 리미티드
Priority date: 2005-03-04
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2006-09-11
Anticipated expiration: 2026-01-27
Also published as: US20110087003A1; US9820986B2; US20060198786A1; EP1698351A2; EP1698351B1; CN100412086C; AU2006200363B2; JP4428538B2; AU2006200363A1; CA2533545C; TWI309572B; KR100825584B1; CA2533545A1; TW200642696A; EP1698351A3; JP2006241142A; CN1827635A

Abstract

본 발명은 아미드 결합을 통해 공유 결합된 글리코사이드와 펩타이드를 갖는 글리코펩타이드를 포함한다. 상기 글리코펩타이드는, 상기에 결합된 진단제 또는 치료제를 또한 포함할 수 있다. 금속, 예를 들어 방사성 핵종을 또한 상기 글리코펩타이드에 킬레이트화할 수 있다. 본 발명의 특정한 실시태양은 폴리(아미노산), 예를 들어 폴리(글루탐산) 또는 폴리(아스파트산)에 공유 결합된 키토산으로 제조된 글리코펩타이드에 관한 것이다. 상기 글리코펩타이드에 공액 결합된 진단제는 영상화를 촉진시킬 수 있다. 상기 글리코펩타이드에 공액 결합될 수 있는 구체적인 치료제로는 항암 약물, 류마티스성 관절염 약물, 항응고제, 신생혈관형성 억제 약물, 세포사멸 약물, 골다공증 약물, 스테로이드 및 소염 약물이 있다. 방사성 핵종과 같은 일부 작용제는 진단 및 치료 효과를 모두 가질 수 있다. 상기 글리코펩타이드를 카보디이미드 및 산 그룹 활성제의 존재 하에서 글리코사이드와 펩타이드를 결합시켜, 상기 글리코사이드와 펩타이드 사이에 아미드 결합을 형성시킴으로써 제조할 수 있다.

글리코펩타이드, 글리코사이드, 폴리(글루탐산), 폴리(아스파트산)

Description

글리코펩타이드 조성물{GLYCOPEPTIDE COMPOSITIONS}

첨부된 도면과 함께 하기의 설명을 참조로 본 발명의 실시태양 및 그의 이점들을 보다 완벽하고 철저하게 이해할 수 있다. 특허 또는 출원 파일은 컬러로 제작한 하나 이상의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본을, 요청 시 해당 관청에 제공할 것이며 필요 수수료를 지불할 것이다.

도 1은 4 가지 유형의 글리코펩타이드의 조성을 예시한다.[G-(G)n-G, 키토산; A, 폴리(글루탐산)]

도 2는 글리코펩타이드 제조(도 2A) 및 글리코펩타이드 공액 결합체(도 2B)의 제조를 위한 합성 반응을 예시한다.[A-(A)n-A, 폴리(글루탐산); EDC, N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드; 설포-NHS, N-하이드록시설포숙신이미드]

도 3은 글리코펩타이드에 공액 결합된 금속과 또 다른 작용제를 모두 갖는 2 개의 상이한 글리코펩타이드 공액 결합체를 예시한다.

도 4는 종양 및 뼈 국소화 능력에 대해 시험된 글리코펩타이드 및 키토산 작용제의 구조를 예시한다.

도 5는 생체 외에서 유방 종양 세포에 의한 ^99mTc-GP, ^99mTc-PGA 및 ^99mTc- CH(100%)의 세포 흡수를 나타낸다.[99mTc-GP, 글리코펩타이드; 99mTc-PGA, 폴리(글루탐산); 99mTc-CH(100%), 키토산]

도 6은 생체 내에서 유방암 세포(13762 세포 주)에서 세포 흡수에 대한 분석 결과를 나타낸다. 유방 종양 세포 주 및 염증 함유 래트(280 내지 300 mCi/래트, 정맥 내 주입, 획득한 총수 500,000)에서 ^99mTc-CH-10(50%), ^99mTc-CH-10(100%), ^99mTc-PGA(750) 및 ^99mTc-G-P(1:2)의 평면 섬광조영술을, 주입 후 120 분째에 수행하여 종양 가시화(tumor visualization)를 비교하였다. 종양 대 근육 및 종양 대 염증 비를 나타낸다. T=종양, M=근육 및 I=염증.

도 7은 생체 내에서 뼈에서의 세포 흡수에 대한 분석 결과를 나타낸다. ^99mTc-파미드로네이트(P), ^99mTc-글리코펩타이드(GP), 및 ^99mTc-글리코펩타이드-파미드로네이트(GPP)의 평면 섬광조영술을, 주입 후 120 분째에 수행하였다(300 μCi/래트, 정맥 내 주입, 획득한 총수 500,000).

도 8은 생체 내에서 뼈에서의 세포 흡수에 대한 분석 결과를 나타낸다. ^99mTc-파미드로네이트(P), ^99mTc-글리코펩타이드(GP), 및 ^99mTc-글리코펩타이드-파미드로네이트(GPP)의 라인 프로파일 실연(line profile demonstration)을, 주입 후 120 분째에 수행하였다(300 μCi/래트, 정맥 내 주입, 획득한 총수 500,000).

발명의 기술분야

본 발명은 글리코사이드와 펩타이드를 함유하는 글리코펩타이드 조성물, 그리고 생체재료(biomaterial)로서의 그의 용도에 관한 것이다. 구체적인 실시태양은 키토산계 글리코펩타이드(chitosan-based glycopeptide)에 관한 것이다. 보다 구체적인 실시태양은 키토산 및 폴리(아미노산)을 포함하는 글리코펩타이드에 관한 것이다.

배경기술

생체재료는 생물계, 예를 들어 인간 및 다른 포유동물에서 다양한 의학적 용도에 끊임없이 요구되고 있다. 이러한 의학적 용도는 현재 가능한 거의 전 범위의 의학적 치료에 걸쳐 있다. 일례로, 일부 생체재료는 의료 장치 또는 이식물에 구조 및 생화학적 목적 모두를 위해서 사용된다. 다른 것들은 약물 전달 비히클(drug delivery vehicle)로서 또는 심지어 약물 자체로서 사용된다.

의도된 용도는 종종 선택되는 물질의 유형에 영향을 미치지만, 대부분의 용도에서 생분해성(biodegradable) 또는 생제거성 물질(bioclearable material)이 바람직하다. 유사하게, 어느 정도의 독성이나 유해성에 내성이 있거나 또는 심지어 어떤 생체재료의 경우는 바람직할 수도 있지만, 대부분의 용도에서 상기 물질은 독성이지 않은 것이 바람직하다.

생체재료에 대해, 용도의 광범위한 다양성 및 목적하는 특성들이 제공되었지만, 새로운 생체재료가 끊임없이 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명은 하나 이상의 펩타이드에 공유 결합된 하나 이상의 글리코사이드로부터 형성된 글리코펩타이드에 관한 것이다. 글리코사이드 및 펩타이드, 뿐만 아니라 상기에 공액 결합된 작용제들(agents conjugated)을 종종 본 명세서 및 청구의 범위 전체에 걸쳐 단수로 지칭하지만, 본 발명의 중합체성 성질이 제공되는 경우 이는 당해 분야의 숙련가들에 의해 글리코펩타이드가 하나 이상의 글리코사이드(glycoside) 및 하나 이상의 펩타이드(peptide)를 함유할 수 있는 것으로 쉽게 이해될 것이다. 더욱이, 다수의 결합 부위들로 인해, 소정 유형의 많은 작용제들이 단일의 글리코펩타이드에 결합될 수 있다. 글리코펩타이드 단량체의 상대적인 수뿐만 아니라 중합체 상의 임의의 작용제의 치환도를 조절하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 통상적인 실험을 통해 본 발명에 적용될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은 아미드 결합을 통해 하나 이상의 펩타이드에 공유 결합된 하나 이상의 글리코사이드 잔기 및, 추가로 상기 글리코사이드 및 펩타이드 잔기 중 어느 하나에 공액 결합된 진단제 또는 치료제(diagnostic or therapeutic agent)를 갖는 글리코펩타이드를 포함한다. 더욱이, 상기 글리코펩타이드는 진단제 또는 치료제를 갖지 않는 잔기에 공액 결합된 금속 작용제(metal agent)를 가질 수도 있다.

상기 진단제 또는 치료제를 펩타이드 결합을 경유하여 카복실산을 통해 상기 글리코사이드에 공액 결합(conjugate)시킬 수 있으며, 이 경우 어떠한 금속도 상기 펩타이드에 킬레이트화(chelated)될 수 있다. 한편으로, 상기 진단제 또는 치료제를 펩타이드 결합을 경유하여 아민 그룹을 통해 상기 펩타이드에 공액 결합시킬 수 있으며, 이 경우 어떠한 금속도 상기 글리코사이드에 킬레이트화될 수 있다. 상기 글리코펩타이드는 약 5,000 달톤 내지 약 30,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다.

상기 글리코사이드는 2 개 이상의 공유 결합된 단량체 단위(monomeric units)를 포함할 수 있다. 더욱이, 상기 글리코사이드는 아민화된 당(aminated sugar)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 글리코사이드는 키토산(chitosan), 콜라겐(collagen), 콘드로이틴(chondroitin), 히아우라니에이트(hyauraniate), 및 헤파린(heparin), 그리고 이들의 임의의 조합일 수 있다. 상기 글리코사이드를 내피세포(endothelial cell), 예를 들어 인테그린(integrin)같은 혈관 조직의 세포 외 단백질(extracellular proteins)을 포함하는 혈관 조직을, 표적화(target)하는 능력을 기준으로 선택할 수 있다. 상기 글리코사이드는 약 3,000 달톤 내지 약 10,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다.

상기 펩타이드는 폴리(아미노산) 또는 펩타이드 또는 소정의 표적화 서열(targeting sequence)을 포함할 수 있다. 주로 산성 아미노산을 갖는 폴리(아미노산)이 일부 실시태양에서 바람직할 수 있다. 상기 폴리(아미노산)은 폴리(글루 탐산)(poly(glutamic acid)) 및 폴리(아스파트산)(poly(aspartic acid)), 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 상기 펩타이드는 상기 글리코펩타이드의 약 5 중량% 내지 약 50 중량%를 구성할 수 있다. 더욱이, 상기 펩타이드는 약 750 달톤 내지 약 3,000의 분자량을 가질 수 있다. 상기 펩타이드는 암 세포를 표적화할 수 있다.

상기 진단제 또는 치료제는 상기 글리코펩타이드의 약 10 중량% 내지 약 60 중량%를 구성할 수 있다. 상기 글리코펩타이드에 공액 결합될 수 있는 임의의 진단제 또는 치료제를 사용할 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 진단제는 항암 약물(anticancer drug), 류마티스성 관절염 약물(rheumatoid arthritis drug), 항응고제(anticoagulant), 신생혈관형성 억제제(anti-angiogenesis drug), 세포사멸 약물(apoptosis drug), 골다공증 약물(osteoporosis drug), 스테로이드(steroid), 소염 약물(anti-inflammatory drug) 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 상기 진단제 또는 치료제는 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 파미드로네이트(pamidronate)를 포함할 수 있다.

일부 실시태양에서, 상기 글리코펩타이드는 추가적인 금속 진단제 또는 치료제를 또한 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 금속을 킬레이트제, 예를 들어 DPTA를 통해 공액 결합시킬 수 있다. 상기 금속은 방사성 핵종(radionuclide), 예를 들어 Tc-99m, Cu-60, Cu-61, Cu-62, Cu-67, In-111, T1-201, Ga-67, Ga-68, As-72, Re-186, Re-188, Ho-166, Y-90, Sm-153, Sr-89, Gd-157, Bi-212, 및 Bi-213, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 방사성 핵종 금속은 진단제 및 치료제 모두로서 이중 용도로 작용할 수 있다.

진단제는 영상화(imaging)를 포함한, 다양한 방식에서 진단을 용이하게 할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 글리코펩타이드를 환자의 병행 진단 및 치료, 및 용량 측정에 사용할 수 있다. 상기는 방사성 핵종을 사용함으로써 수행될 수 있으며, 상기 방사성 핵종은 영상화를 용이하게 하기도 하고 항암제로서 작용하기도 한다. 한편으로, 상기 글리코펩타이드는 환자의 표적 영역으로 전달되는 치료법상의 양을 측정할 수 있게 하는 치료제 및 금속을 포함할 수 있다. 더욱 또 달리, 2 개의 상이한 글리코펩타이드를 병용할 수 있다. 먼저, 진단용 글리코펩타이드를 환자에게 투여하고 표적 영역에 도달하는 양을 측정할 수 있다. 이어서, 치료용 글리코펩타이드에 대한 정확한 용량을, 상기 진단용 글리코펩타이드와 유사한 양으로 상기 표적 영역에 도달할 것이라는 가정을 근거로 결정할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양들은 아미드 결합을 통해 폴리(아미노산)에 공유 결합된 키토산을 포함한 글리코펩타이드에 관한 것이다. 상기 키토산은 개질되지 않은 키토산, 또는 개질된 형태, 예를 들어 알킬 설폰화된 키토산(alkyl sulfonated chitosan)일 수 있다. 유사하게, 상기 폴리(아미노산)은 임의의 유형일 수 있으나, 다수의 실시태양들에서 상기는 산성 폴리(아미노산), 예를 들어 폴리(글루탐산) 또는 폴리(아스파트산)일 수 있다.

본 발명의 키토산계 글리코펩타이드를, 상술한 본 발명의 글리코펩타이드와 동일한 방식으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 키토산계 글리코펩타이드는 상기에 공액 결합된, 금속을 포함한 진단제 또는 치료제를 또한 가질 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양들은 글리코펩타이드의 제조 방법, 예를 들어 상술한 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 글리코사이드와 펩타이드를 카보디이미드 및 산 그룹 활성제의 존재 하에서 결합시켜, 상기 글리코사이드와 펩타이드 사이에 아미드 결합을 형성시킬 수 있다. 상기 글리코사이드를 추가로 반응시켜 상기 글리코사이드 또는 펩타이드와, 진단제 또는 치료제 간에 아미드 결합(amide bond) 또는 에스테르 결합(ester bond)을 형성시킬 수 있다. 또한, 킬레이트제를 상기 글리코사이드 또는 펩타이드에 공액 결합시켜 금속을 킬레이트화할 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 글리코사이드와 펩타이드를 함유하는 글리코펩타이드(GP) 조성물, 및 생체재료로서 그의 용도에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 이들 생체재료는 멸균 분말(sterilized powder)로서 제공될 수 있다. 치료제 또는 진단제를 상기 글리코펩타이드에 공액 결합시킬 수도 있다.

특정한 실시태양에서, 상기 글리코사이드와 펩타이드를 아미드 결합에 의해 결합시킬 수 있다. 상기 글리코사이드는 아민화된 당일 수 있다. 상기 글리코펩타이드는 5 내지 50 중량%의 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드가 너무 많으면 글리코펩타이드들 간에 허용될 수 없는 가교결합 수준이 생성될 수 있다. 상기 글리코사이드는 약 3,000 내지 10,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 상기 펩타이드는 약 750 내지 3,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다. 상기 글리코펩타이드는 약 5,000 내지 30,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다.

보다 특정한 실시태양에서, 상기 글리코펩타이드를 키토산 및 폴리(아미노산), 특히 폴리(글루탐산)으로부터 제조할 수 있다. 상기 글리코펩타이드는 특정한 표적화제를 포함하도록 개질시킬 필요 없이 종양 표적화 능력을 갖는다.

키토산(CH)은 다수의 용도에 특히 중요한 폴리아미노사카라이드이다. 많은 폴리아미노사카라이드들처럼, 키토산은 천연 물질로부터 쉽게 수확될 수 있다. 키토산의 주요 공급원은 현재, 버려진 바다가재 및 가재(crayfish) 또는 새우(shrimp)의 껍질이지만, 상기를 또한 게 및 다른 갑각류의 껍질뿐만 아니라 곤충의 외피(insect shells) 및 진균(fungi)으로부터 얻을 수도 있다. 키토산은 통상적으로 무독성이며 인체 조직을 포함하여 다양한 살아있는 조직에 적합하다. 그러나, 다른 많은 폴리아미노사카라이드들(polyaminosaccharides)처럼, 키토산은 물에서 단지 제한된 용해도를 나타낸다. 용해도를 개선시키기 위해서, 알킬 설폰화된 키토산(alkyl sulfonated chitosan)을 사용할 수 있다. 알킬 설폰화된 키토산은 예를 들어 2004년 6월 18일자로 출원된 미국 특허 출원 제 10/871,890 호에 개시되어 있다.

다른 적합한 글리코사이드는 콜라겐, 콘드로이틴, 히아우라니에이트 및 헤파린을 포함한다.

폴리(글루탐산)(PGA)을 또한 상업적으로 쉽게 입수할 수 있으며(Sigma Cheimcal Company, St. Louis, MO) 다양한 방식으로 합성할 수 있다. PGA는 생리적인 조건 하에서 양의 전하를 가지며, 생분해성이고 이러한 성질은 생물학적 용도에 보다 적합토록 만들 수 있다.

다른 펩타이드들을 본 발명의 또 다른 실시태양들에 사용할 수 있다. 이러한 펩타이드들은, 특정한 서열 또는 특정한 아미노산 조성을 갖는 펩타이드뿐만 아니라 다른 폴리(아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 펩타이드는 표적화 기능을 할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 폴리(아스파트산)을 사용할 수 있다. 이는 종양 세포가 내부에서 아스파트산을 제조할 수 없고 상기를 외부 공급원으로부터 많이 수득하기 때문에, 상기 종양 세포에 의한 흡수를 향상시키는 듯 하다. 산 그룹(acid group)을 갖는 아미노산을 포함하는 폴리(아미노산)의 경우에, 상기 산 그룹을, 다양한 작용제에 대한 상기 글리코펩타이드의 이후의 공액 결합에 사용하거나 또는 용해도를 개선시키기 위한 염 형성에 사용할 수 있다.

본 발명의 글리코펩타이드는 글리코사이드와 펩타이드를 다양한 배열로 가질 수 있다. 키토산 및 폴리(글루탐산)을 사용하는 4 가지 배열을 도 1a~1d에 나타낸다. 본 발명의 다양한 실시태양들에서, 이러한 상이한 유형의 글리코펩타이드를 혼합물로서 사용하거나 또는 하나 이상의 구조 배열을 분리시켜 사용할 수 있다. 특정한 구조 배열의 그러한 분리가 바람직한 지의 여부는 많은 인자들, 예를 들어 의도된 최종 용도 및 첨가되는 임의의 공액 결합체(conjugates)에 따라 변할 수 있다. 대부분의 합성 방법에서, 도 1a에 나타낸 구조가 우세한 듯 하다.

본 발명의 글리코펩타이드의 한 가지 합성 방법을 도 2a 및 2b에 나타낸다. 또 다른 합성 수단들도 가능하다. 예를 들어, 상기 합성 반응을 한 가지 유형의 글리코펩타이드 구조에 유리하도록 설계할 수 있다. 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같은 특정한 실시태양에서, 상기 글리코사이드 및 펩타이드를, 커플링제(coupling agent)로서 카보디이미드(carbodiimide)를 사용하여 공액 결합시킨다. 도 2a 및 2b에서 설포-NHS는 글리코펩타이드 형성을 촉진시키는 산 그룹 활성제(acid group activators)로서 작용한다. 다른 산 그룹 활성제들도 또한 본 발명의 글리코펩타이드의 형성에 사용될 수 있다.

본 발명의 글리코펩타이드가 단독으로 유용한 생물학적 성질들을 나타낼 수 있지만, 매우 다양한 작용제들을 또한 상기 글리코펩타이드에 공액 결합시킬 수 있다. 적합한 작용제들로는 표적화제(targeting agent), 영상화제(imaging agent) 및 치료제(therapeutic agent)가 있다. 다수의 작용제 또는 다수 유형의 작용제를 동시에 동일한 글리코펩타이드 분자에 공액 결합시킬 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 작용제는 상기 글리코펩타이드 공액 결합체의 10 중량% 내지 60 중량%를 차지할 수 있다.

상기 글리코펩타이드는 본래부터 종양 조직을 표적화하지만, 종양 표적화를 더욱 증가시키거나 이를 보다 특이적으로 만드는 작용제들을 공액 결합시킬 수도 있다. 다른 조직을 표적화하는 작용제, 예를 들어 뼈를 표적화하는 파미드로네이트를 또한 공액 결합시킬 수 있다. 메토트렉세이트를 엽산(folate) 수용체의 표적화에 사용할 수 있다. 다수의 영상화제들은 먼저 킬레이트제, 예를 들어 DPTA를 공액 결합시킴으로써 제공될 수 있는 금속을 포함한다. 상기를 ^99mTc, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁷Cu, ¹¹¹In, ²⁰¹Tl, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ¹⁵³Sm, ⁸⁹Sr, ¹⁵⁷Gd, ²¹²Bi 및 ²¹³Bi와 같은 원자가 금속 이온들의 킬레이트화에 사용할 수 있다. 이들 금속 킬레이트들을 병변의 영상화에 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 글리코펩타이드 자체의 카복실 그룹 및 아미노 그룹이 금속 이온을 킬레이트화하기에 충분할 수 있다.

치료제들, 예를 들어 종양을 표적화하는 경우 화학요법제 및 기타 항암 약물들이 상기 표적화된 조직에 가장 특이적일 듯 하다. 류마티스성 관절염, 응고 억제, 신생혈관형성 억제, 세포사멸, 스테로이드, 소염 및 골다공증 치료제들을 또한 공액 결합시킬 수 있다.

치료제들을 임의의 허용 가능한 방식으로 공액 결합시킬 수 있으나, 아미드 결합 또는 에스테르 결합과 같은 생물 불안정한 결합(biolabile bond)이 다수의 실시태양들에 사용될 수 있다. 도 2b는 골다공증 치료제인 파미드로네이트에 대한 하나의 공액 결합 방법을 예시한다. 동일하거나 유사한 방법들을 사용하여 다른 작용제들을 공액 결합시킬 수 있다. 작용제들을, 상기 작용제 상의 카복실산 또는 아민 그룹을 사용하여 상기 글리코펩타이드에 공액 결합시킬 수 있다. 특히 수-불용성 작용제(water-insoluble agents)를 공액 결합시키는 경우, DMF 또는 DMSO를 상기 반응에 가할 수 있다.

특정한 실시태양에서, 영상화 및 치료용 공액 결합체 모두를 환자에게 제공할 수 있다. 그 후 상기 영상화 복합체를 사용하여, 상기 영상화 복합체가 얼마나 많이 표적 영역에 국소화되는 지를 근거로, 표지되지 않은 치료 복합체의 최적 또는 권장 용량을 결정할 수 있다.

일부 영상화 복합체는 방사선 치료 효과 또한 가지는 작은 금속 이온들을 사 용할 수 있다. 이들 복합체를 영상화하여 환자에 대한 내부 방사선 치료 용량을 직접 결정할 수 있다.

유사하게, 방사성화학물질 또는 다른 영상화제를 치료제로서 동일한 복합체에 혼합시키는 경우, 상기 환자에 대한 상기 치료제의 용량을 직접 결정할 수 있다. 그러한 복합체의 예가 도 3에 예시되어 있다.

상기 글리코펩타이드에 대한 작용제의 공액 결합은 특히 생물계, 예를 들어 포유동물에서 상기 작용제의 지속적인 방출을 제공할 수 있다. 공액 결합은 또한 불충분하게 수용성인 작용제의 유효한 수-용해도(water-solubility) 및 치료 지수(therapeutic index)를 증가시킬 수 있다.

종양-관련 용도

본 발명의 실시태양은 특히 세포독성물질(cytotoxic agents)의 전달을 통해 종양 치료에 사용할 수 있다. 단지 세포증식 억제제(cytostatic agents)와 상반되게, 세포독성물질의 전달은 종종 선행의 치료에서 문제를 일으킨다. 본 발명의 글리코펩타이드를 사용하여 세포증식 억제제를 전달할 수 있지만, 세포독성물질을 전달하는 이들 다수 능력 또한 치료 비히클(therapy vehicle)로서 이들의 가치를 증가시킨다.

구체적인 실시태양에서, 상기 사용되는 글리코펩타이드는 키토산 및, 폴리(글루탐산)이나 폴리(아스파트산)을 함유한다. 상기 실시태양은, 가장 그럴 듯 하게는 종양 조직에서 크게 증가된 속도로 발생하는 신생혈관형성(angiogenesis)을 통해 종양 조직을 표적화한다. 혈관 세포, 및 특히 상기 세포 상에 위치한 인테그린 분자를 폴리사카라이드(예를 들어 콜라겐, 콘드로이틴, 히아우라니에이트, 키토산)에 의해 표적화한다. 상기 혈관 표적화는, 종양 조직을 직접 표적화하지 않기 때문에 종양 세포의 약물 내성을 예방하는데 일조한다. 게다가, 종양 조직은 아미노산에 대한 증가된 필요성을 나타내며, 대부분의 세포는 몇몇 아미노산, 예를 들어 글루탐산 및 아스파트산에 대한 표면 수용체를 가져, 상기 폴리(아미노산) 부분이 표적화 기능 또한 하게 한다. 구체적으로, 상기 폴리(아미노산)이 종양 세포에 의해 가장 잘 흡수되는 듯 하다.

본 발명의 글리코펩타이드의 종양 표적화 능력(tumor targeting capacity)은 ^99mTc-표지된 키토산/폴리(글루탐산) 글리코펩타이드를 사용한 감마 영상화(gamma imaging)에 의해 입증되었다. ^99mTc-표지된 키토산/폴리(글루탐산) 글리코펩타이드를, 치료에 필요한 용량을 정량화하는데 사용할 수 있다. 궁극적으로, ^99mTc-표지된 키토산/폴리(글루탐산) 글리코펩타이드는 치료에 반응할 수 있는 환자를 예견하고 그들의 선택에 사용될 수 있다. ¹⁸⁸Re를 또한 다수의 종양을 치료하기 위한 방사선 치료제로서 사용할 수 있다. ¹⁸⁸Re는 상기가 혈관 중에 있든 종양으로 내면화하든 간에 상기 글리코사이드와 남아있는 것이 가장 유효하다. ¹⁸⁸Re는 베타 및 감마(15%) 방출제이며 17 시간의 반감기를 갖는다. 조직 침투(tissue penetration)는 5 내지 7 ㎜이며, 이를 큰 종양을 영상화하고 치료하는데 동시에 사용할 수 있다.

표적화 능력은 불충분한 수용해도를 갖는 화학요법제(chemotherapeutics)의 전달을 도우며, 따라서 상기와 같은 작용제의 치료 지수(독성/효능)((toxicity/efficacy))를 증가시킬 수 있다. 게다가, 상기 치료제들은 글리코펩타이드로부터 점차적으로 방출되기 때문에, 이것 또한 치료 지수에 기여하고 급성 전신 독성(acute systemic toxicity)을 줄이는데 일조한다.

뼈-관련 용도

구체적인 실시태양에서, 파미드로네이트를 본 발명의 글리코펩타이드에 공액 결합시킬 수 있다. 상기 공액 결합 방법을 도 2a 및 2b에 도시한다. 파미드로네이트는 파골세포제(osteoclast agent)이다. 파미드로네이트가 공액 결합된 키토산/폴리(글루탐산)을 사용하는 경우 미미한 독성이 관찰되었다. 파미드로네이트는 신속한 신장 클리어런스(renal clearance)를 나타내었다. 영상화 연구는 상기 조성물이 뼈를 표적화함을 보여주었다. 상기 조성물을 사용하여 뼈 퇴행성 질병, 예를 들어 골다공증을 치료할 수 있다.

하기의 실시예들은 본 발명의 소정의 실시태양들을 추가로 개시하기 위해 제공된다.

실시예

실시예 1: 글리코펩타이드의 합성

키토산의 가수분해 도중에, 다양한 분자량 및 아미노 그룹 전환 퍼센트(percentage amino group conversions)가 준비되었다. 분자량 및 아미노 그룹 전환 퍼센트를 본 발명에서는 "CH[분자량][아미노 전환]%"로서 나타낸다. 예를 들어 CH10은 10,000의 분자량을 갖고 아세트아미드 그룹이 100% 가수분해되어 아미노 그룹을 형성하는 키토산을 가리킨다.

전형적인 합성에서, 물(5 ㎖) 중 키토산(CH10, 100%)(200 ㎎, MW. 10,000 내지 20,000)의 교반된 용액에 설포-NHS(232.8 ㎎, 1.07 밀리몰(mmol)) 및 3-에틸카보디이미드 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드-HCl(EDC)(204.5 ㎎, 1.07 밀리몰)(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)을 가하였다. 이어서 폴리(글루탐산)(400 ㎎, MW. 750-3,000)을 가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 10,000의 컷오프(cut-off)를 갖는 스펙트라/POR 분자 다공성 멤브레인(Spectra/POR molecular porous membrane)(Spectrum Medical Industries Inc., Houston, TX)을 사용하여 48 시간 동안 투석하였다. 투석 후에, 상기 생성물을 여과하고 냉동건조기(lyophilizer)(Labconco, Kansas City, MO)를 사용하여 동결 건조시켰다. 상기 염 형태의 글리코펩타이드의 중량은 568.8 ㎎이었다. 그 결과 생성된 글리코펩타이드의 4 가지 유형의 조성을 도 1a~1d에 나타낸다. 상기 글리코펩타이드 혼합물을 나머지 실시예들에 사용하였지만, 예를 들어 상기 4 가지 유형의 글리코펩타이드 각각의 단리 및 독립적인 사용도 가능하다.

실시예 2: ^99m Tc에 의한 글리코펩타이드의 방사성 표지화

글리코펩타이드(5 ㎎)를 물 0.2 ㎖에 용해시키고 염화 주석(물 0.1 ㎖ 중 0.1 ㎎)을 실온에서 가하였다. 소디움 퍼테크네테이트(Sodium pertechnetate)(5 mCi)를 가하였다. 방사화학 순도(Radiochemical purity)를 메탄올:암모늄 아세테이트(1:4)로 용출되는 TLC(ITLC SG, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)에 의해 결정하였다. 방사성-TLC(Bioscan, Washington, DC) 분석으로부터, 방사화학 순도는 95%를 초과하였다.

실시예 3: 글리코펩타이드-파미드로네이트 공액 결합체의 합성

파미드로네이트(100 ㎎, 0.24 밀리몰)를 중탄산 나트륨(1N) 1 ㎖, 설포-NHS(91.8 ㎎, 0.43 밀리몰) 및 3-에틸카보디이미드 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드-HCl(EDC)(81.2 ㎎, 0.43 밀리몰)에 용해시켰다. 탈이온수 5 ㎖ 중의 글리코펩타이드(200 ㎎) 용액을 가하였다. 상기 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하여 방치하였다. 투석(MW: 10,000) 및 동결건조 후에, 상기 파미드로네이트-글리코펩타이드의 수율은 250 ㎎이었다. 합성 반응식을 도 2a 및 2b에 나타낸다.

실시예 4: 생체 외 세포 배양 분석

글리코펩타이드가 종양 표적화 잠재력(tumor targeting potential)을 갖는지의 여부를 평가하기 위해서, 유방 종양 세포 주(13762)를 선택하였다. 상기 세포를 12 웰 조직 배양 플레이트에, 웰 당 50,000 세포의 밀도로 도말하였다. 상기 세포를 4 μCi(0.148 MBq)의 ^99mTc-표지된 글리코펩타이드(GP), 폴리(글루탐산)(PGA), 키토산(CH10, 50%), 또는 키토산(CH10)(100 ㎍/웰)과 함께 배양하였다. 시험된 작용제들의 구조를 도 4에 나타낸다. 세포를 37 ℃에서 0.5 내지 2 시간 동안 방사성 추적자(radiotracers)와 함께 배양하였다. 배양 후에, 세포를 빙냉 포스페이트 완충 염수(ice-cold phosphate-buffered saline, PBS)로 2 회 세척하고, 트립신 용액 0.5 ㎖로 트립신 처리하였다. 이어서 세포들을 수거하고 방사활성을 감마 계수기(gamma counter)로 측정하였다. 데이터를 3 회 측정치에 대한 평균±SD 퍼센트 흡수비로 나타낸다. 글리코펩타이드와 PGA간에 유사한 세포 흡수가 존재하였다(도 5). 그러나, 실제 생물 시스템에서는 글리코펩타이드가 바람직한데, 그 이유는 세포만을 표적화하는 PGA와 달리 상기 글리코펩타이드는 혈관 조직 및 세포 수용체 모두를 표적화하기 때문이다.

실시예 5: 종양 섬광조영술(Tumor Scintographic)의 영상화 연구

글리코펩타이드가 특이적을로 종양 조직을 표적화할 수 있는지의 여부를 입증하기 위해서, 투르펜틴-유도된 염증(좌측 다리)이 있거나 없는, 암컷 피셔(Fischer) 344 종양-함유(우측 다리) 래트의 그룹에 300 μCi의 ^99mTc-표지된 글리 코펩타이드, 키토산(50% 및 100%), 또는 폴리(글루탐산)(PGA)을 투여하였다. 저-에너지(low-energy), 평행-구멍 조준기(parallel-hole collimator)가 장착된 감마 카메라를 사용하여, 섬광조영술 영상을 0.5, 2 및 4 시간째에 수득하였다. 상기 종양을 모든 시간에 잘 볼 수 있었다. 펩타이드 및 키토산 그룹과 비교하여 글리코펩타이드 그룹 중의 근육 대 근육 및, 종양 대 염증 비는 0.5 내지 3 시간째에 더욱 높았다. 선택된 영상들을 도 6에 나타낸다.

세포 흡수 분석은 글리코펩타이드 및 글루타메이트 펩타이드가 키토산(0.2%)보다 더 높은 흡수(0.4 내지 0.5%)를 가짐을 가리켰다. 유방 종양 함유 래트에서 ^99mTc-글리코펩타이드의 생물 분포는 증가된, 종양 대 조직 총수 밀도 비를 시간의 함수로서 나타내었다. 평면 영상은 상기 종양을 명확하게 볼 수 있음을 확인하였다. 2 시간째에, 글리코펩타이드, 글루타메이트 펩타이드 및 키토산에 대한 종양/근육 비는 3.9, 3.0 및 4.89이었다. 종양/근육 비는 키토산 단독의 경우에 더욱 높지만, 글리코펩타이드는 세포와 혈관을 모두 표적화하기 때문에 상기 글리코펩타이드를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 글리코펩타이드는 보다 양호한 조직 보유력(tissue retention)을 나타낸다.

실시예 6: 패클리탁실(Paclitaxil) 처리에 대한 종양 반응

신생혈관형성 억제 처리 반응을 평가하기 위해서, 래트를 패클리탁셀(40 ㎎/㎏, 정맥 내)로 처리한 다음, 4 일째에 ^99mTc-글리코펩타이드로 영상화하였다. 종 양 흡수 및 인 시튜 하이브리드화(in situ hybridization, ISH) 및 TUNEL 분석을 패클리탁셀 처리 전 및 후에 수행하였다.

패클리탁셀로 처리된 래트에서, 4 일째에 ^99mTc-글리코펩타이드 기준선과 비교하여 두드러진 종양 진행은 관찰되지 않았다. 종양 괴사(tumor necrosis)가 처리 후에 명백히 나타났다. ISH 및 TUNEL 분석에 의해 입증된 바와 같이, 종양 흡수와 세포 표적 발현 사이에 상관 관계가 존재하였다.

실시예 7: 뼈 섬광조영술에 의한 영상화 연구

글리코펩타이드를 뼈의 표적화에 사용할 수 있는지를 입증하기 위해서, 정상적인 암컷 피셔 344 래트(125-175 g)에게 300 μCi의 ^99mTc-표지된 파미드로네이트, 글리코펩타이드 및 글리코펩타이드-파미드로네이트 공액 결합체를 투여하였다. 글리코펩타이드-파미드로네이트는 뼈를 표적화할 수 있었다(도 7 및 8).

실시예 8: 뼈 손실 예방

글리코펩타이드-파미드로네이트 공액 결합체, 글리코펩타이드, 또는 파미드로네이트를 다양한 용량으로 난소가 이미 제거된 암컷 래트에게 투여할 것이다. 난소절제는 래트의 골다공증형 뼈 손실과 강한 상관성이 있다. 이러한 뼈 손실은 수 개월의 기간에 걸쳐 관찰될 수 있다. 글리코펩타이드-파미드로네이트 공액 결합체는 뼈-표적화 경향(bone-targeting tendencies)을 나타내기 때문에, 상기의 투 여가 암컷 래트에서 난소절제-관련된 뼈 손실을 감소 또는 예방할 것으로 기대된다. 더욱이, 파미드로네이트는 불충분하게 뼈를 표적화하기 때문에, 파미드로네이트 단독인 경우와 상반되게 글리코펩타이드 공액 결합체를 사용하는 경우 개선된 결과가 예상된다.

본 발명 및 그의 이점들을 상세히 개시하였지만, 하기 청구의 범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이, 본 발명의 다양한 변화, 치환 및 변경들을 수행할 수 있음은 물론이다.

본 발명은 글리코사이드와 펩타이드를 함유하는 글리코펩타이드(GP) 조성물, 및 생체재료로서 그의 용도에 관한 것으로, 상기 조성물을 사용하여 종양 치료 및 뼈 퇴행성 질병을 치료할 수 있다.

Claims

펩타이드, 및

아미드 결합을 통해 상기 펩타이드에 공유 결합된 글리코사이드

를 포함하는 2 개 이상의 잔기; 그리고

상기 글리코사이드 및 펩타이드 잔기 중 어느 하나에 공액 결합된 진단제 또는 치료제

를 포함하는 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

진단제 또는 치료제가 공액 결합되어 있지 않은 잔기에 공액 결합된 금속을 추가로 포함하는 글리코펩타이드.
제 2 항에 있어서,

펩타이드 결합을 경유하여 카복실산을 통해 글리코사이드에 공액 결합된 진단제 또는 치료제; 및

상기 펩타이드에 킬레이트화된 금속

을 추가로 포함하는 글리코펩타이드.
제 2 항에 있어서,

펩타이드 결합을 경유하여 아미노 그룹을 통해 펩타이드에 공액 결합된 진단제 또는 치료제; 및

글리코사이드에 킬레이트화된 금속

을 추가로 포함하는 것인 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 글리코사이드가 2 개 이상의 공유 결합된 단량체 단위를 포함하고, 상기 펩타이드가 폴리(아미노산)을 포함하는 것인 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 글리코사이드가 아민화된 당을 포함하는 것인 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 글리코사이드가 키토산을 포함하고, 상기 펩타이드가 폴리(글루탐산) 또는 폴리(아스파트산)을 포함하는 것인 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 펩타이드가 글리코펩타이드의 약 5 중량% 내지 약 50 중량%를 차지하는 것인 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 글리코사이드가 약 3,000 달톤 내지 약 10,000 달톤의 분자량을 갖고, 상기 펩타이드가 약 750 달톤 내지 약 3,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 글리코펩타이드가 약 5,000 달톤 내지 약 30,000 달톤의 분자량을 갖는 것인 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 글리코사이드가 콜라겐, 콘드로이틴, 히아우라니에이트, 및 헤파린, 그리고 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; 상기 펩타이드가 폴리(글루탐산) 및 폴리(아스파트산), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 진단제 또는 치료제가 항암 약물, 류마티스성 관절염 약물, 항응고제, 신생혈관형성 억제 약물, 세포사멸 약물, 골다공증 약물, 스테로이드, 소염 약물, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 진단제 또는 치료제가 메토트렉세이트 또는 파미드로네이트를 포함하는 것인 글리코펩타이드.
제 2 항에 있어서,

상기 금속이 방사성 핵종을 포함하는 것인 글리코펩타이드.
제 14 항에 있어서,

상기 금속이 Tc-99m, Cu-60, Cu-61, Cu-62, Cu-67, In-111, T1-201, Ga-67, Ga-68, As-72, Re-186, Re-188, Ho-166, Y-90, Sm-153, Sr-89, Gd-157, Bi-212, 및 Bi-213, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 진단제 또는 치료제가 글리코펩타이드의 약 10 중량% 내지 약 60 중량%를 차지하는 것인 글리코펩타이드.
제 1 항에 있어서,

상기 글리코사이드가 혈관 내피 세포를 표적화하고, 상기 펩타이드가 암 세포를 표적화하는 것인 글리코펩타이드.
키토산; 및

폴리(아미노산)을 포함하고,

상기 키토산 및 폴리(아미노산)이 아미드 결합을 통해 공유 결합되는 것인 글리코펩타이드.
제 18 항에 있어서,

상기 키토산이 알킬 설폰화된 키토산을 포함하는 것인 글리코펩타이드.
제 18 항에 있어서,

상기 폴리(아미노산)이 폴리(글루탐산) 또는 폴리(아스파트산)을 포함하는 것인 글리코펩타이드.
제 18 항에 있어서,

상기 키토산 또는 폴리(아미노산)에 공액 결합된 진단제 또는 치료제를 추가로 포함하는 것인 글리코펩타이드.
제 18 항에 있어서,

상기 키토산 또는 폴리(아미노산)에 공액 결합된 금속을 추가로 포함하는 것인 글리코펩타이드.
카보디이미드 및 산 그룹 활성제의 존재 하에서 글리코사이드와 펩타이드를 결합시켜, 상기 글리코사이드와 펩타이드 사이에 아미드 결합을 형성시킴을 포함하는, 글리코펩타이드의 제조 방법.
제 23 항에 있어서,

상기 글리코사이드 또는 펩타이드와, 진단제 또는 치료제 사이에 아미드 결합 또는 에스테르 결합을 형성시킴을 추가로 포함하는 것인 방법.
제 23 항에 있어서,

상기 글리코사이드 또는 펩타이드에 킬레이트제 및 금속을 공액 결합시킴을 추가로 포함하는 것인 방법.