KR20060094211A

KR20060094211A - 미토콘드리아 분리용 용액 및 이를 이용한 미토콘드리아의순수 분리방법

Info

Publication number: KR20060094211A
Application number: KR1020050015193A
Authority: KR
Inventors: 한진; 김나리; 염재범; 허대영; 주현
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2005-02-24
Filing date: 2005-02-24
Publication date: 2006-08-29
Anticipated expiration: 2025-02-24
Also published as: KR100663888B1

Abstract

본 발명은 동물조직으로부터 미토콘드리아를 얻을 수 있도록 헤페스(HEPES), 수크로오스, D-만니톨, 비에스에이(BSA), 이디티에이(EDTA), 류펩틴, 펩스타인-A, 피엠에스에프(PMSF) 및 디티티(DTT)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 분리용 용액 및 미토콘드리아의 분리에 있어서, 상기 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법을 제공한다.

본 발명의 용액 및 방법을 이용하는 경우 세포내 기타 물질들을 분리 제거하여 목표로 하는 미토콘드리아만을 분리 추출할 수 있을 뿐만 아니라, 생산효율 또한 공지기술보다 매우 우수하다.

미토콘드리아, 원심분리

Description

미토콘드리아 분리용 용액 및 이를 이용한 미토콘드리아의 순수 분리방법{The solution for separation of mitochondria and separation method of mitochondria using the solution}

도1은 본 발명의 미토콘드리아 순수분리과정을 보여주는 흐름도.

도2 및 도3은 본 발명의 방법으로 분리한 미토콘드리아의 순수 분리 상태를 나타내는 사진.

본 발명은 동물의 조직으로부터 미토콘드리아를 분리하는데 사용되는 용액 및 이를 이용한 미토콘드리아의 분리방법에 관한 것이다.

현재 동물 조직으로부터의 미토콘드리아 분리는,

『(1) 조직을 적출하여 남아있는 혈액을 깨끗이 제거한다.

(2) 조직을 가위로 잘게 조각내어 수크로오스 용액을 첨가하여 마쇄한다. 이때 2 ~ 4℃를 유지하면서 400rpm의 속도로 조심스럽게 왕복하면서 마쇄하며, 조 직 균질액을 준비한다.

(3) 상기 균질액을 모두 취하여 750×g에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 모아 15,000×g에서 다시 원심분리한다.

(4) 침전물에 수크로오스 용액을 첨가하여 녹인 후, 수크로오스 농도 구배 원심분리법으로 미토콘드리아 분획을 분리한다.

(5) 얻어진 미토콘드리아 분획을 수크로오스 용액에 희석 시킨 후 15,000×g에서 원심 분리』하는 과정을 통해 수행하고 있다.

그러나, 상기의 전형적인 미토콘드리아 분리방법은 리틀 플라스마 멤브레인(little plasma membrane) 또는 미크로소말(microsomal)에 의해 쉽게 오염되는 심각한 문제점이 있다.

미토콘드리아 순수분리의 용이성은 미토콘드리아-관련 질환연구와 치료타겟 발굴에 매우 중요하다. 그러나, 예전에 수행되었던 미토콘드리아 순수분리 기술로는 미토콘드리아와 세포내 타 물질들, 특히 단백질, 유전자 물질들의 오염으로 인하여 미토콘드리아 자체만이 지닌 유전자 및 이들 단백질 물질과의 구분이 어려웠다.

이에 본 발명의 목적은 상기 공지의 기술이 가지고 있는 문제점, 즉 세포내 타물질의 오염을 막을 수 있고, 최대한 많은 양의 미토콘드리아를 분리할 수 있는 새로운 분리방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 헤페스(HEPES), 수크로오스, D-만니톨, 비에스에이(BSA), 이디티에이(EDTA), 류펩틴, 펩스타인 A, 피엠에스에프(PMSF)및 디티티(DTT)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 분리용 용액 및 미토콘드리아의 분리에 있어서, 상기 용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서는 헤페스(HEPES=N-2-HydroxyEthylPiperazine-N'-2- Ethane Sulfonicacid), 수크로오스, D-만니톨, 비에스에이(BSA=Bovine Serum Albumin), 이디티에이(EDTA =EthyleneDiamineTetraAceticacid), 류펩틴(leupeptin), 펩스타인A(pepstain A), 피엠에스에프(PMSF=PhenylMethylSulfonylFluoride) 및 디티티(DTT=DiThioThreitol)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 분리용 용액을 제공한다.

상기 조성물 용액의 조성비는 바람직하게는 2mM 헤페스, 0.7M 수크로오스, 0.21M D-만니톨, 73μM 비에스에이, 0.1mM 이디티에이, 1μg/mL 류펩틴, 1μg/mL 펩스타인 A, 0.1mM 피엠에스에프 및 0.1mM 디티티로 조성되고, pH는 7.4인 것이 좋 다(이하, 이와 같이 조성된 용액을 편의상 "H-용액"이라 칭함).

상기 미토콘드리아 분리용 용액은 미토콘드리아의 분리에 있어서 버퍼로 사용되는데, 오염원들을 효과적으로 용액 중으로 배출하는 역할을 하지만, 미토콘드리아막에는 영향을 주지 않아 미토콘드리아를 효율적으로 분리할 수 있다.

또한, 본 발명은 미토콘드리아의 분리에 있어서, 상기에 기재된 용액을 버퍼로 사용하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법을 제공한다. 미토콘드리아의 분리는 공지의 방법을 사용해서 수행할 수도 있으나, 바람직하게는 조직의 무게를 측정하여 기록하고, 즉시 H-용액을 첨가하여 피를 제거하는 단계(1); 피가 제거된 조직을 블랜더(blender)로 옮기고, H-용액을 첨가한 다음 갈아주어서 현탁액을 얻는 단계(2); 현탁액을 원심 분리하는 단계(3); 원심분리 후 미토콘드리아를 포함한 상층액을 분리하는 단계(4); 모아진 상층액을 원심분리한 뒤 상층액을 제거하는 단계(5); 상층액이 제거된 펠렛을 H-용액에 재현탁시킨 후, 원심 분리하는 단계(6); 원심분리후 상층 펠렛은 H-용액으로 녹여 제거하고, 하층에 강하게 응축된 미토콘드리아 함유 펠렛을 분리하는 단계(7)로 수행하는 것이 좋다. 이상과 같이 분리된 미토콘드리아 함유 펠렛은 보존용으로 -20℃에서 1년 간 보존가능하다.

이때, 회수되는 미토콘드리아의 수율을 높이고자, 더욱 바람직하게는 상기 단계(2)에서 첨가되는 H-용액은, 단계(1)에서 측정한 조직의 무게 대비 2배 부피( 예, 조직이 1kg 무게일 경우 H-용액 2 Liter)인 것이 좋고, 상기 단계(2)의 현탁액을 얻기 위해 갈아주는 과정은 4분 간격으로 5번 수행하는 것이 좋다.

또한, 더욱 바람직하게는 상기 단계(3)의 원심분리는, 1100×g의 속도로 3 분간 수행하는 것이 좋으며, 상기 단계(5)의 원심분리는, 20000×g, 20분간 수행하는 것이 좋다.

또한, 더욱 바람직하게는 상기 단계(6)의 원심분리는, 20000×g의 속도로 수행하는 것이 좋다.

한편, 바람직하게는 미토플라스트(mitoplast)를 제거하여 더욱 순수한 형태로 미토콘드라이를 얻기 위해 디지토닌(digitonin)류의 계면활성제를 사용하는 단계(8)를 추가로 포함하는 것이 좋다.

이때, 더욱 더 순수한 분리를 위하여, 바람직하게는 상기 디지토닌류의 계면활성제를 사용하는 단계(8)는, 단계(7)로부터 얻은 펠렛을 H-용액에 재현탁하여 미토콘드리아 용액을 제조하는 단계(가); 디지토닌을 H-용액 중 비에스에이(BSA)를 제외시킨 용액에 녹이고 냉각시켜 디지토닌 용액을 제조하는 단계(나); 냉각된 디지토닌 용액을 상기 단계(가)에서 제조한 미토콘드리아 용액에 첨가 한 후 교반하는 단계(다); 교반 후, H-용액을 첨가하여 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계( 라); 및 상층액이 제거된 펠렛을 H-용액으로 재현탁하여 다시 원심 분리하여 미토플라스트를 함유하는 펠렛을 제거하고, 미토콘드리아를 함유하는 상층액을 회수하는 단계(마)로 구성되는 것이 좋다.

이때, 더욱 바람직하게는 상기 단계 (나)에서 사용된 디지토닌은, 그 사용량이 미토콘드리아 단백질 1 g당 0.11 g인 것이 좋고, 상기 단계(나)에서의 냉각은, 4℃로 수행하는 것이 좋다.

또한, 더욱 바람직하게는 상기 단계(다)에서의 교반은, 15분간 수행하는 것이 좋으며, 상기 단계(라)에서의 첨가되는 H-용액의 양은 단계(7)로부터 얻은 펠렛 무게 대비 3배 상응하는 부피(예, 펠렛 1 g 무게일 경우 H-용액은 3 ml)인 것이 좋다.

또한, 더욱 바람직하게는 상기 단계(라)에서의 원심분리는,10000×g의 속도로 10분 간 수행하는 것이 좋다.

한편, 본 발명은 상기의 단계(4)에서 상층액으로 분리되지 못하고 펠렛에 갇힌 미토콘드리아(trapped mitochondria)를 분리하기 위하여 단계(4)에서 얻어진 상층액이 분리되고 남은 펠렛을 H-용액으로 재현탁한 후, 재균질화하여 원심 분리함으로써, 미토콘드리아를 함유하고 있는 상층액을 분리하는 단계(a); 상기에서 분리 된 상층액을 원심분리하는 단계(b); 원심분리 후 회수된 펠렛을 H-용액에 재현탁하고 원심분리하는 단계(c); 원심분리 후 회수된 펠렛을 H-용액에 재현탁한 후, 원심 분리한 다음 상층액을 버리는 단계(d); 및 상층액을 버리고 남은 펠렛을 H-용액에 재현탁시킨 후, 원심분리하는 단계(e)로부터 회수한 상층액을 상기 단계(5)에 기재된 "모아진 상층액"에 첨가하여 이후의 단계를 수행하는 것이 좋다.

이상의 방법을 추가함으로서 갇힌(trapped) 미토콘드리아까지 회수할 수 있으므로 더욱 많은 양의 미토콘드리아를 샘플로부터 회수할 수 있는 장점이 있다.

한편, 회수되는 미토콘드리아의 수율을 높이고자, 더욱 바람직하게는 상기 단계(b)의 원심분리는, 6780×g의 속도로 15분간 수행하는 것이 좋고, 상기 단계(c)의 원심분리는, 20000×g의 속도로 10분간 수행하는 것이 좋다.

또한, 더욱 바람직하게는 상기 단계(d)의 원심분리는, 20000×g의 속도로 수행하는 것이 좋으며, 상기 단계(e)의 원심분리는, 3000×g의 속도로 3분간 수행하는 것이 좋다.

또한, 더욱 바람직하게는 상기 단계(e)의 원심분리 후, 상층액을 분리하고 남은 펠렛을 H-용액으로 재현탁하여 원심분리한 후 상층액을 회수하여, 단계(e)의 원심분리로 회수된 상기의 상층액과 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것이 좋다.

펠렛을 반복해서 재현탁시키고 원심분리함으로써, 갇힌 미토콘드리아를 더욱 많이 회수할 수 있다. 갇힌 미토콘드리아가 많은 경우, 재현탁 및 원심분리는 필요에 따라 1회 이상 실시할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 조직으로부터 많은 양의 순수한 미토콘드리아를 분리하는 방법으로, 본 발명의 미토콘드리아 분리 방법은 리틀 플라스마 멤브레인(little plasma membrane) 또는 미크로소말(microsomal)에 의한 오염을 최소화 하고, 특히 리보좀과 같은 소기관의 오염을 최소화하기 위해 미토플라스트(mitoplast)를 분리하는 과정을 선택적으로 포함한다.

따라서 종래 미토콘드리아 분리 방법에 비해 많은 양의 순수한 미토콘드리아를 효과적으로 분리해낼 수 있다. 또한, 본 발명은 조직으로부터 대량의 미토콘드리아를 30분 이내에 순수하게 분리할 수 있게 한다.

한편, 본 발명의 미토콘드리아 순수분리기술은 인간, 기니픽, 토끼, 쥐, 마우스, 어류, 갑각류, 양서류, 미생물종 등 미토콘드리아를 세포내부에 지니고 있는 다양한 생물종의 세포 샘플에 적용 가능하다.

본 발명인 미토콘드리아 순수분리기술은 미토콘드리아 이중막과 표면단백질 들에 전혀 손상을 주지않고 그 자체기능을 완벽하게 수행할 수 있는 장점을 제공한다.

도1은 본 발명의 미토콘드리아 순수분리 과정을 나타내는 흐름도를 나타낸다.

이상, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예1: 본 발명에 의한 미토콘드리아의 분리

1. 쥐의 간조직의 무게를 측정하여 기록하고, 즉시 본 발명에서 제조한 용액이하, 'H-용액'이라 함; 2mM 헤페스(HEPES), pH 7.4, 0.7M 수크로오스, 0.21M D-마니톨, 73μM 비에스에이(BSA), 0.1mM 이디티에이(EDTA), 1μg/mL 류펩틴(leupeptin), 1μg/mL 펩신A(pepstain A), 0.1mM 피엠에스에프(PMSF), 0.1mM 디티티(DTT)을 이용하여 피를 제거하였다.

2. 조직을 블렌더(blender)로 옮기고, 상기 무게의 2배에 상응하는 부피의 H-용액을 첨가한 다음 4분 간격으로 5번 갈아줌으로써 현탁액을 제조하였다.

3. 현탁액을 1100×g, 3 분간 원심분리하였다.

4. 이 후, 미토콘드리아를 포함한 상층액을 조심스럽게 옮겼다. 이때 남은 펠렛은 손상되지 않은 간, 핵, 갇힌 미토콘드리아(trapped mitochondria)를 포함하 고 있다.

5. 모아진 상층액을 20000×g, 20분 간 원심분리한 뒤 상층액을 제거하였다. 가벼운 층, 즉 펠렛의 윗부분에 존재하는 물질은 깨진 미토콘드리아로 H-용액에 의해 쉽게 녹아 나온다.

6. 아래층의 무거운 펫렛을 H-용액에 재현탁시킨 후, 20000×g에서 원심 분리하였다. 이전처럼 가벼운 상층 펠렛은 H-용액을 이용하여 녹여서 제거하고 미토콘드리아를 함유하고 있는 강하게 응축된 펠렛(tightly packed pellet)은 -20℃에 보관했는데, 1년간 보관 가능하다.

실시예2: 본 발명에 의한 미토콘드리아의 분리

1. 쥐의 간조직의 무게를 측정하여 기록하고, 즉시 본 발명에서 제조한 용액이하, 'H-용액'이라 함; 2mM 헤페스(HEPES), pH 7.4, 0.7M 수크로오스, 0.21M D-마니톨, 73μM 비에스에이(BSA), 0.1mM 이디티에이(EDTA), 1μg/mL 류펩틴(leupeptin), 1μg/mL 펩신A(pepstain A), 0.1mM 피엠에스에프(PMSF), 0.1mM 디티티(DTT))을 이용하여 피를 제거하였다.

3. 현탁액을 1100×g, 3 분간 원심분리하였다.

5. 갇힌 미토콘드리아를를 추출하기 위하여 펠렛을 H-용액으로 재현탁하여 재균질화한 후 원심분리하였다. 미토콘드리아를 함유하고 있는 이 상층액을 후-핵상층액(post-nuclear supernant; PNS)이라 부른다.

6. 상기의 PNS를 6780×g, 15분 간 원심 분리하여 펠렛을 회수하였다.

7. 회수된 펠렛을 H-용액에 재현탁하고 20000×g, 10분간 원심분리하였다. 상층액은 셀룰라 마이크로좀(cellular microsome) 등을 포함하고 있으므로 버렸다. 갇힌 마이크로좀(trapped microsome)을 제거하기 위해 펠렛을 H-용액에 재현탁한 후, 20000×g에서 원심분리한 다음 상층액을 버렸다.

8. 대-마이크로좀 유리 미토콘드리아 펠렛(large-microsome free mitochondrial pellet)을 H-용액에 재현탁시킨 후, 3000×g, 3분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 이때 펠렛은 잔류핵(residual nuclei), 플라스마 멤브레인(plasma membrane), 리보솜(lysosome) 등 이었다.

9. 상층액은 새로운 튜브(tube)로 옮겼고, 펠렛은 H-용액에 재현탁하여 원심분리한 뒤 전기의 튜브에 첨가하여 상층액을 취합했다.

10. 상기 "9" 및 "4"로부터 취합한 상층액을 20000×g, 20분간 원심분리한 뒤 상층액을 제거하였다. 가벼운 층, 즉 펠렛의 윗부분에 존재하는 물질은 깨진 미토콘드리아로 H-용액에 의해 쉽게 녹아 나온다.

11. 아래층의 무거운 펫렛을 H-용액에 재현탁시킨 후, 20000×g에서 원심 분리하였다. 이전처럼 가벼운 상층 펠렛은 H-용액을 이용하여 녹여서 제거하였고 미 토콘드리아를 함유하고 있는 강하게 응축된 펠렛(tightly packed pellet)은 -20℃에 보관하였다

실시예3: 본 발명에 의한 미토콘드리아의 분리

3. 현탁액을 1100×g, 3 분간 원심분리하였다.

4. 이 후, 미토콘드리아를 포함한 상층액을 조심스럽게 옮겼다. 이때 남은 펠렛은 손상되지 않은 간, 핵, 갇힌 미토콘드리아(trapped mitochondria)를 포함하고 있다.

5. 갇힌 미토콘드리아를 추출하기 위하여 펠렛을 H-용액으로 재현탁하여 재균질화한 후 원심분리하였다. 미토콘드리아를 함유하고 있는 이 상층액을 후-핵상층액(post-nuclear supernant; PNS)라 부른다.

7. 회수된 펠렛을 H-용액에 재현탁하고 20000×g, 10분 간 원심 분리하였다. 상층액은 셀룰라 마이크로좀(cellular microsome) 등을 포함하고 있으므로 버렸다. 갇힌 마이크로좀(trapped microsome)을 제거하기 위해 펠렛을 H-용액에 재현탁한 후, 20000×g에서 원심 분리한 다음 상층액을 버렸다.

9. 상층액은 새로운 튜브(tube)로 옮겼고, 펠렛은 H-용액에 재현탁하여 원심분리한 뒤 전기의 튜브에 첨가하여 취합했다.

11. 아래층의 무거운 펫렛을 H-용액에 재현탁시킨 후, 20000×g에서 원심 분리하였다. 이전처럼 가벼운 상층 펠렛은 H-용액을 이용하여 녹여서 제거하고 미토콘드리아를 함유하고 있는 강하게 응축된 펠렛(tightly packed pellet)을 회수하였다.

한편, 상기 여러 단계의 분리방법을 사용하여, 우선 리틀 플라스마 멤브레인(little plasma membrane) 또는 마이크로소말(microsomal)에 의한 오염을 줄일 수 있었다. 그러나 오염을 최소화하기 위하여 불완전 미토콘드리아로서 오염원인 미토플라스트(mitoplast)를 분리하는 과정을 하기와 같이 추가로 수행하였다.

12. 상기의 "11단계"로부터 얻은 미토콘드리아 펠렛을 H-용액에 재현탁하였다. 이때, 디지토닌(미토콘드리아 펠렛 무게 1g 대비 약 0.11 g의 디지토닌 양)을 약 10 mL의 H-용액(BSA를 제외시킨 H-용액)에 녹였다. 디지토닌을 첨가한 용액은 녹을 때까지 교반하면서 약간 끓여준 다음, 다 녹으면 4℃에서 1시간 방치하여 냉각시켰다.

13. 차게 준비되어진 디지토닌 용액을 "12단계"에서 현탁한 미토콘드리아 용액에 첨가 한 후 15분간 교반하였다.

14. 이후, 측정한 "12"의 미토콘드리아 펠렛 무게 대비 3배 부피(예, 펠렛 1 g 무게일 경우 H-용액 3 ml)에 해당하는 만큼 H-용액을 첨가하여 10000×g, 10분간 원심분리하였다. 상층액은 바깥 미토콘드리아 막(outer mitochondrial membrane)을 포함하는 분획이므로 제거하든지, 다른 실험에 필요하다면 보관할 수 있다.

15. 상기 "14단계"에서 회수된 펠렛은 H-용액에 재현탁하여 다시 원심 분리한다. 이렇게 얻어진 펠렛이 오염원인 미토플라스트를 함유하는 분획이고 상층액이 순수한 미토콘드리아를 함유하는 분획이다.

실험예1: 분리한 미토콘드리아의 순도 조사

도 2는 단백질 전기영동을 통하여 우리가 알고 있는 미토콘드리아 지표 단백질(ATPase)과 미토콘드리아에는 존재하지 않지만 다른 기관에 존재하는 지표 단백질(Cav)의 항체를 이용하여 단백질의 존재 유무를 관찰하는 실험결과를 나타낸다.

먼저, 1번 레인에 미토콘드리아를 제외한 상층액을 그리고 2번 레인은 순수 분리되어진 미토콘드리아 단백질을 전기영동하였다.

Cav 의 경우 미토콘드리아에는 없지만 세포막에 존재하는 단백질로 미토콘드리아 단백질(레인2)에서는 관찰되지 않았고, 미토콘드리아 지표 단백질인 "ATPase"는 미토콘드리아 단백질에서만 관찰되어졌다.

도 3의 실험은 미토콘드리아에 선택적으로 발색반응을 하는 형광지표물질(MitoTracker)을 이용하여 미토콘드리아를 발색 반응시켜 공초점 현미경(confocal microscopy)를 이용하여 관찰하였다. 관찰 결과 순수하게 분리되어진 미토콘드리아가 붉은 색으로 염색되어진 것을 관찰할 수 있었다.

따라서 이상의 결과로 부터 우리가 분리한 미토콘드리아가 다른 소기관의 오염 없이 순순하게 잘 분리되어 졌다는 것을 알 수 있었다.

이상, 상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 동물조직으로부터 미토콘드리아를 얻을 수 있는 용액 및 원심분리를 통한 미토콘드리아의 순수 분리 방법을 제공하는 바, 그로부터 세포내 타물질들을 분리하여 순수한 미토콘드리아를 분리할 수 있고, 그 양 또한 공지기술의 방법보다 많은 뛰어난 효과가 있다.

Claims

헤페스(HEPES), 수크로오스, D-만니톨, 비에스에이(BSA), 이디티에이(EDTA), 류펩틴, 펩스타인 A, 피엠에스에프(PMSF) 및 디티티(DTT)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 분리용 용액.
제1항에 있어서, 상기 용액의 조성은,

2mM 헤페스, 0.7M 수크로오스, 0.21M D-만니톨, 73μM 비에스에이, 0.1mM 이디티에이, 1μg/mL 류펩틴, 1μg/mL 펩스타인 A, 0.1mM 피엠에스에프 및 0.1mM 디티티로 조성되고, pH는 7.4인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 분리용 용액.
미토콘드리아의 분리에 있어서, 제1항에 기재된 용액을 버퍼로 사용하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제3항에 있어서, 상기 분리는,

조직의 무게를 측정하여 기록하고, 즉시 제1항의 미토콘드리아 분리용 용액을 첨가하여 피를 제거하는 단계(1);

피가 제거된 조직을 블랜더로 옮기고, 제1항의 미토콘드리아 분리용 용액을 첨가한 다음 갈아주어서 현탁액을 얻는 단계(2);

현탁액을 원심 분리하는 단계(3);

원심분리 후 미토콘드리아를 포함한 상층액을 분리하는 단계(4);

모아진 상층액을 원심분리한 뒤 상층액을 제거하는 단계(5);

상층액이 제거된 펠렛을 제1항의 용액에 재현탁시킨 후, 원심 분리하는 단계(6); 및

원심분리후 상층 펠렛은 제1항의 용액으로 녹여 제거하고, 하층에 강하게 응축된 미토콘드리아 함유 펠렛을 분리하는 단계(7)을 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제4항에 있어서, 상기 단계(2)에서 첨가되는 제1항의 용액의 양은, 단계(1)에서 측정한 조직 무게의 2배 부피비인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법;
제4항에 있어서, 상기 단계(2)의 현탁액을 얻기 위해 갈아주는 과정은 4분 간격으로 5번 수행함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제4항에 있어서, 상기 단계(3)의 원심분리는 1100×g의 속도로 3 분간 수행하고, 상기 단계(5)의 원심분리는 20000×g 속도로 20 분간 수행함을 특징으로 하고, 상기 단계(6)의 원심분리는 20000×g의 속도로 수행함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제4항에 있어서, 미토플라스트를 제거하기 위해 디지토닌류의 계면활성제를 사용하는 단계(8)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제8항에 있어서, 상기 디지토닌 류의 계면활성제를 사용하는 단계(8)는,

단계(7)로부터 얻은 펠렛을 제1항의 용액에 재현탁하여 미토콘드리아 용액을 제조하는 단계(가);

디지토닌을 제1항의 용액 중 비에스에이(BSA)를 제외시킨 용액에 녹이고 냉각시켜 디지토닌 용액을 제조하는 단계(나);

냉각된 디지토닌 용액을 상기 단계(가)에서 제조한 미토콘드리아 용액에 첨가 한 후 교반하는 단계(다);

교반 후, 제1항의 용액을 첨가하여 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계(라); 및

상층액이 제거된 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁하여 다시 원심 분리하여 미토플라스트를 함유하는 펠렛을 제거하고, 미토콘드리아를 함유하는 상층액을 회수하는 단계(마)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제9항에 있어서, 상기 단계 (나)에서 사용하는 디지토닌은, 그 사용량이 미토콘드리아 단백질 1 g당 0.11 g임을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제9항에 있어서, 상기 단계(나)에서의 냉각은 4℃로 수행함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법
제9항에 있어서, 상기 단계(라)에서의 첨가되는 제1항의 용액의 양은, 단계(7)로부터 얻은 펠렛 무게 대비 3부피비인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제9항에 있어서, 상기 단계(라)에서의 원심분리는 10000×g의 속도로 10분 간 수행함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제4항에 있어서,

단계(4)에서 상층액이 분리되고 남은 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁한 후, 재균질화하여 원심 분리함으로써, 미토콘드리아를 함유하고 있는 상층액을 분리하는 단계(a);

상기에서 분리된 상층액을 원심 분리하는 단계(b);

원심분리 후 회수된 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁하고 원심분리하는 단계(c);

원심분리 후 회수된 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁한 후, 원심분리한 다음 상층액을 버리는 단계(d); 및

상층액을 버리고 남은 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁한 후, 원심분리하는 단계(e)로부터 회수한 상층액을 상기 단계(5)에 기재된 모아진 상층액에 첨가하여 이후의 단계를 수행함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제14항에 있어서, 상기 단계(b)의 원심분리는 6780×g의 속도로 15분간 수행하고, 상기 단계(c)의 원심분리는 20000×g의 속도로 10분간 수행하고, 상기 단계(d)의 원심분리는 20000×g의 속도로 수행하고, 상기 단계(e)의 원심분리는 3000×g의 속도로 3분간 수행하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제14항에 있어서, 상기 단계(e)의 원심분리 후, 상층액을 분리하고 남은 펠렛을 제1항의 용액으로 재현탁하여 원심분리한 후 상층액을 회수하여, 단계(e)의 원심분리로 회수된 상기의 상층액과 혼합하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 미토콘드리아의 분리방법.
제1항의 용액을 이용하여 제4항의 방법으로 분리한 미토콘드리아 분리 생성물.