KR20060079496A

KR20060079496A - 간섬유화 및 간경화 억제 활성을 나타내는ｎ-(2,2-이중치환-2ｈ-크로멘-6-일)-ｎ,ｎ'-이중치환구아니딘 유도체

Info

Publication number: KR20060079496A
Application number: KR1020040117707A
Authority: KR
Inventors: 공영대; 서진수; 전문국; 곽의종; 조용백; 이남규; 이은주; 이정범; 이준원; 이석호; 동미숙; 김정란
Original assignee: 에스케이케미칼주식회사; 한국화학연구원
Priority date: 2004-12-31
Filing date: 2004-12-31
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2024-12-31
Also published as: KR101127158B1

Abstract

본 발명은 TGFβ 수용체 길항활성이 우수하여 간질환 예방 및 치료제로서는 물론 여러 섬유 증식성 질환 예를 들면 간섬유화, 간경화, 폐섬유증, 피부경화증, 신사구체 섬유증 등의 예방 및 치료제로서 유효한 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체의 의약적 용도에 관한 것이다.

간경화, 콜라겐합성, 구아니딘계 벤조피란, 고체상합성, 조합화학

Description

간섬유화 및 간경화 억제 활성을 나타내는 Ｎ-(2,2-이중치환-2Ｈ-크로멘-6-일)-Ｎ,Ｎ'-이중치환 구아니딘 유도체 {Derivatives of N-(2,2-disubstituted- 2H-cromene-6-yl)-N,N'-disubstituted guanidine derivatives for treating hepatic fibrosis and cirrhosis}

도 1은 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체의 TGFβ 수용체 길항활성을 보여주는 그래프이다.

도 2는 LI90 세포에서 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체의 세포독성 및 콜라겐 합성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

도 3은 LI90 세포에서 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체의 콜라겐 유전자 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

간은 체외에서 들어온 물질 및 체내의 물질 대사에서 중추적인 역할을 담당하는 생체조직이다. 만성적인 음주나 폭음, 바이러스성 간염, 약물의 오남용 등 원인에 지속적인 간조직의 손상을 입게 되면 만성 간질환인 간섬유화 및 간경화로 진전되는데, 간섬유화는 초기단계에서는 통증이나 자각증상이 나타나지 않고 말기에 발견되기 때문에 사망률이 높아 사회적인 문제를 일으키고 있다. 특히 간질환은 여러 가지 증상으로 분류된다. 초기의 지방간(fatty liver), 간염(hepatitis)를 거쳐, 간섬유화(fibrosis) 및 간경화(cirrhosis)를 일으킨다. 대개, 간섬유화 과정까지는 가역적(reversible)으로 일어나고, 간경화증이 일어나면, 비가역적(irreversible)으로 일어난다고 알려져 있으며, 간섬유화 이전의 단계나 초기 경화증 상태에 치료약물의 투여로 간질환을 치유할 수 있다.

간경화는 간 조직이 섬유화되어 일어난다. 간 섬유화는 결합조직의 합성 및 분해 과정의 균형이 상실된 상태로서, 간 조직 내에 결합조직이 과도하게 축적되어 발생되며 괴사나 염증이 동반된다. 특히 간에서 간기능이 정상적인 상태에서 비타민 A를 저장하는 역할을 하는 간성상세포(hepatic stellate cells : HSCs)는 급 만성 간 손상에 의해 근섬유아세포(myofibroblast) 형태로 전이되어 급속히 증식하여 콜라겐(collagen), 프로테오글리칸(proteoglycan), 히알유로난(hyaluronan) 등과 같은 세포외 기질의 생성을 증가 및 이동을 통한 과도한 결합조직을 생성함으로써 간의 섬유화 과정을 진행시키는 것으로 알려져 있다 [Friedman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82: 8681 (1985) Gressner et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151: 222 (1988) Gressner et al., J. Hepatol., 22: 28 (1995)]. 이 과정에서 TGFβ는 간조직 내의 여러 세포들, 특히 쿠퍼 세포나 TGFβ에 의해 활성화된 간성상세포로부터 생성 및 분비, 활성화되어 간성상세포의 증식과 분화를 유도하며 이로 인해 콜라겐과 같은 세포외 기질 (extracellular matrix)의 과생산과 축적을 유발하는 중요한 역할을 하게 된다. 간섬유화나 간경화와 같은 만성 간질환에서 TGFβ는 섬유화가 진행되고 있는 간 조직에서만 발현되어 세포외 기질을 증가시켜 간섬유화 진행을 촉진시키는 역할을 한다고 알려져 있다 [Bauer and Schuppan, FEBS Lett. 502:1-3 (2001); Bedossa and Paradis, J Hepatol., 22(Suppl. 2):37-4 (1995)].

현재까지는 간섬유화의 억제 또는 간경화 치료제의 개발은 간성상세포의 콜라겐으로 대표되는 결합조직의 과도한 생성 작용을 억제하거나 이들 세포의 증식을 억제할 수 있는 약물의 개발 등에 초점이 맞추어지고 있으나, 아직까지는 효과적인 치료제의 개발이 부재한 실정이며, 최근 들어 섬유화에 관여하는 사이토카인(cytokine) 중 간성상세포의 섬유화를 가장 강력하게 유발하는 물질인 TGFβ 작용 억제 또는 TGFβ 수용체의 활성화 억제 연구가 새로운 간경화 치료제 개발의 타겟으로 연구되고 있다.

이에 본 발명에서 TGFβ 수용체 길항활성을 갖는 물질을 합성하여 간섬유화 과정에서 핵심적인 역할을 수행하는 간성상세포를 이용하여 간섬유화를 억제 또는 예방할 수 있는 화합물을 검색한 결과, N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이 중치환 구아니딘 유도체가 탁월하게 간섬유화의 예방 및 치료효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 벤조피란 골격을 가진 천연물 및 합성물이 광범위하게 활성산소를 억제하는 약리적 효능을 나타내는 사실에 착안하여 다양한 벤조피란 유도체를 합성하여, 간성상세포의 섬유화를 가장 강력하게 유발하는 물질인 TGFβ 수용체에 대한 길항활성 연구, 간섬유화의 주원인 세포인 간성상세포를 이용한 콜라겐 합성 및 세포 증식 억제 연구 등을 거듭한 결과, 구아니딘계 벤조피란 유도체가 TGFβ 수용체 길항활성 및 콜라겐 합성 억제를 통한 간섬유화 억제활성을 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 간섬유화 및 간경화 치료제 개발에 유용한 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 TGFβ의 활성화와 과생성 및 과도하게 축적된 콜라겐과 같은 세포외 기질에 의해 발생하는 관련 질환의 예방 및 치료제로서 사용하는 용도를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 다음 화학식 (1)로 표시되는 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일) -N,N'-이중치환 구아니딘 유도체를 그 특징으로 한다.

상기 화학식 (1)에서,

R¹및 R²는 각각 C₁∼C₅의 알킬기, 또는 각각 치환 또는 비치환된 페닐기, 치환 또는 비치환된 벤질기, 디옥소벤질기, 또는 이소발린(메틸에스테르)기를 나타내거나, 또는 R¹또는 R²가 각각 결합된 질소와 함께 고리를 형성하고 있는 5 내지 7원의 헤테로 지방족 또는 방향족 싸이클기를 나타내고;

R³은 수소, 또는 C₁∼C₅의 알킬기를 나타내고;

R⁴는 수소, C₁∼C₅ 알킬기, 치환 또는 비치환된 페닐기, 또는 치환 또는 비치환된 벤질기를 나타내고; 그리고

상기한 치환된 페닐 또는 치환된 벤질은 할로겐, 니트로기, C₁∼C₅의 알킬기 및 C₁∼C₅의 알콕시기 중에서 선택된 1 내지 4개의 치환체로 치환된 페닐 또는 벤질기를 나타낸다.

또한, 본 발명이 목적하는 상기 화학식 (1)로 표시되는 N-(2,2'-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체 중에서 벤조피란의 2번 위치에 서 로 다른 치환체가 있는 경우 광학활성을 가지게 되는 바, 이에 본 발명은 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물의 이성체 화합물도 포함한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물에 있어, 바람직하기로는

상기 R¹및 R²는 각각 페닐기; 할로겐, 니트로기, C₁∼C₅의 알킬기 및 C₁∼C₅의 알콕시기 중에서 선택된 1 내지 4개의 치환체로 치환된 페닐기; 벤질기; 할로겐 치환체로 치환된 벤질기; 디옥소벤질기; R¹또는 R²가 각각 결합된 질소와 함께 고리를 형성하고 있는 페닐피페라지닐기, 또는 할로겐, C₁∼C₅의 알킬기 및 C₁∼C₅의 알콕시기 중에서 선택된 1 내지 4개의 치환체로 치환된 페닐피페라지닐기, 또는 모포리노기를 나타내고;

상기 R³은 수소; 또는 C₁∼C₅의 알킬기를 나타내고;

상기 R⁴는 수소; C₁∼C₅ 알킬기; 페닐기; 또는 벤질기를 나타내는 것이다.

한편, 본 발명은 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물을 용액상 고효율 합성기술에 의해 제조하는 방법을 포함하는 바, 그 제조방법을 간략히 도시하면 다음 반응식 1과 같다.

상기 반응식 1에서, R¹, R²,R³, 및 R⁴는 각각 상기에서 정의한 바와 같고, ⓟ는 폴리스티렌, 폴리스티렌-디비닐벤젠, 폴리메타아크릴산-디메틸아크릴아미드 및 폴리하이드록시 메타아크릴산 중에서 선택된 고분자 중합체 형태의 고체 지지체를 나타낸다.

본 발명에 따른 제조방법에서 원료물질로 사용하는 상기 화학식 (2)로 표시되는 2,2-이중치환-2H-6-아미노-크로멘 유도체는 공지 화합물로서, 공지된 제조방법에 의해 쉽게 제조하여 사용할 수 있다.

상기 반응식 1에 따른 본 발명의 제조방법은 다음과 같은 2단계 제조과정이 포함되어 이루어진다. 상기 화학식 (2)로 표시되는 2,2-이중치환-2H-6-아미노-크로멘과 상기 화학식 (3)으로 표시되는 다양한 R¹으로 치환된 이소싸이오시아네이트 유도체를 반응시켜 상기 화학식 (4)로 표시되는 R¹이 도입된 싸이오우레아 유도체를 합성하는 제 1단계 반응; 그리고 상기 화학식 (4)로 표시되는 싸이오우레아 유도체와 상기 화학식 (5)로 표시되는 R²로 치환된 다양한 아민 유도체를 반응시켜 상기 화학식 (1)로 표시되는 목적화합물인 N-(2,2'-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체를 합성하는 제 2단계 반응으로 구성된다.

또한, 본 발명은 상기 반응 종료 후에 미반응된 상기 화학식 (5)로 표시되는 아민 유도체는 상기 화학식 (6)으로 표시되는 이소시아네이트기를 보유한 스케빈저 레진을 사용하여 여과 제거하는 방법에도 그 특징이 있는 바, 반응 후 처리과정에서 이소시아네이트기를 보유한 스케빈저 레진을 사용함으로써 동시에 많은 반응물을 정제할 수 있기 때문에 구아니딘 유도체를 단기간에 합성할 수 있다.

본 발명에 따른 반응공정, 용매계의 조성 및 반응조건의 선택범위를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 본 발명에 따른 제조방법을 수행하는데 있어 반응용매로서는 최종단계에 고체상 스케빈져 레진을 사용할 것을 고려하여 고체상 레진의 팽윤효과(Swelling effect)가 뛰어난 유기용매를 사용한다. 반응용매로서는 구체적으로 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 클로로포름(CHCl₃), 테트라하이드로퓨란(THF)을 용매로 사용한다. 제 1단계 반응에서는, R¹ 치환체를 도입하기 위하여 상기 화학식 (3)으로 표시되는 R¹으로 치환된 이소싸이오시아네이트 유도체를 1.2 내지 2.0 당량 사용하는 것이 좋으며, 바람직하기로는 1.2 당량 사용하는 것이 경제성이 뛰어나다. 제 2단계 반응에서는 상기 화학식 (4)로 표시되는 싸이오우레아 유도체에 상기 화학식 (5)로 표시되는 R²로 치환된 아민 유도체를 반으시키며, 반응이 종료되면 미반응의 아민을 고체상 이소시아네이트기를 보유한 스케빈져 레진을 투입하여 여과함으로써 용이하게 미반응물을 제거할 수 있기 때문에 화학식 (1)로 표시되는 목적하는 구아니딘계 벤조피란을 동시에 여러 개의 반응 및 반응 후 처리가 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 (1)로 표시되는 목적화합물의 생성여부를 확인하기 위하여 반응 후 최종단계에서 다중 컬럼크로마토그래피 장비(Quad³⁺; 미국 Biotage사 제품) 및 자동 샘플주입장치가 있는 고속 액체크로마토그래피로 분리 정제한 다음 NMR 및 Mass 스펙트럼으로 구조를 분석 확인하였다.

또한, 본 발명에 따른 제조방법에서 원료물질로 사용하는 상기 화학식 (2)로 표시되는 2,2-이중치환-2H-6-아미노-크로멘 유도체, 반응 중간체로서 생성되는 상기 화학식 (4)로 표시되는 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)싸이오우레아 유도체, 그리고 본 발명이 목적하는 상기 화학식 (1)로 표시되는 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체 중 벤조피란의 2번 위치에 서로 다른 치환체가 있는 경우 광학활성을 가지게 되는 바, 이에 필요에 따라 공지된 분리 정제방법을 수행하여 각각의 순수한 광학이성체 화합물을 분리할 수도 있다.

한편, 본 발명의 화합물들은 TGFβ 활성 및 콜라겐 합성 활성, 및 간경화 활성에 의해 발생하는 각종 간질환의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 화학식 (1)로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 유효성분으로 함유된 간질환 예방 및 치료제를 포함한다. 또 한, 본 발명에 따른 화합물은 TGFβ 수용체 길항활성을 가지고 있으므로 여러 섬유 증식성 질환 예를 들면, 간섬유화, 간경화, 폐섬유증, 피부경화증, 신사구체 섬유증 등의 예방 및 치료제로서도 사용될 수 있다.

본 발명에서의 약제학적으로 허용 가능한 염은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로, 예를 들면, 염산, 브롬화수소, 황산, 황산수소나트륨, 인산, 탄산 등의 무기산과의 염 또는 개미산, 초산, 옥살산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 글루콘산, 게스티스산, 푸마르산, 락토비온산, 살리실릭산, 또는 아세틸살리실릭산(아스피린)과 같은 유기산과 함께 약제학적으로 허용 가능한 이들의 산의 염을 형성하거나, 또는 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속이온과 반응하여 이들의 금속염을 형성하거나, 또는 암모늄 이온과 반응하여 또 다른 형태의 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수도 있다.

또한, 본 발명의 약제 조성물은 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 이들의 염에 통상의 무독성 약제학적으로 허용 가능한 담체, 보강제 및 부형제 등을 첨가하여 약제학적 분야에서 통상적인 제제 예를 들면 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제 또는 비경구 투여용 제제로 제제화할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화합물의 인체에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인환자를 기준으로 할 때 일반적으로 0.01 내지 1000 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 다음의 대표적인 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하고 실시예의 화합물을 표 1에 나타내었는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: N-(2,2'-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N'-싸이오우레아 (화학식 4)의 합성

실시예 1-1) 1-(2,2-디메틸-2H-크로멘-6-일)-3-페닐-싸이오우레아(화학식 4a)의 합성

화학식 (2a)로 표시되는 벤조피렌 화합물(1.00 g, 5.7 mmol)을 디클로로메탄(DCM, 15 mL)에 녹인 후 상온에서 10분간 교반시킨 후, 화학식 (3a)로 표시되는 페닐이소싸이오시안산 염(C₆H₄NCS; 0.92 g, 6.8 mmol, 1.2 eq)을 가하고, 같은 온도에서 15시간동안 교반시켰다. 반응종료 후, 반응물을 감압 농축시키고 잔류물을 헥산/에틸아세테이트(4/1, v/v)의 혼합 용매 하에서 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 화학식 (4a)로 표시되는 표제화합물(1.15 g, 수율 65 %)을 얻었다.

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.23(d, 1H, J=7.9 Hz), 7.77(s, 1H), 7.39(s, 1H), 7.38-7.27(m, 2H), 7.14-7.08(m, 3H), 7.00(d, 2H), 6.82(d, 1H, J=8.5 Hz), 6.30(d, 1H, J=9.9 Hz), 5.69(d, 1H, J=9.9 Hz), 1.45(s, 6H); M/S 310.42

실시예 1-2) 1-(2,2-디메틸-2H-크로멘-6-일)-3-(4-니트로-페닐)-싸이오우레아 (화학식 4b)의 합성

화학식 (2a)로 표시되는 벤조피렌 화합물(1.00 g, 5.7 mmol)을 디클로로메탄(DCM, 15 mL)에 녹인 후 상온에서 10분간 교반시킨 후, 화학식 (3b)로 표시되는 4-니트로페닐이소싸이오시안산 염(4-O₂NC₆H₄NCS; 1.22 g, 6.8 mmol, 1.2 eq)을 가하고 같은 온도에서 15시간동안 교반시켰다. 반응종료 후, 반응물을 감압 농축시키고 잔류물을 헥산/에틸아세테이트(4/1, v/v)의 혼합 용매 하에서 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 화학식 (4b)로 표시되는 목적하는 중간체 화합물을 노란색 고체(1.50 g, 수율 74 %)로 얻었다.

¹H NMR(200 MHz, CDCl₃) δ8.20(d, 2H, J=9.2 Hz), 7.75(d, 2H, J=9.2 Hz), 7.07(m, 1H), 6.94-6.6.83(m, 2H), 6.30(d, 1H, J=9.8 Hz), 5.72(d, 1H, J=9.8 Hz), 1.47(s, 6H); M/S 355.44

실시예 1-3) 1-(2,7-디메틸-2-프로필-2H-크로멘-6-일)-3-(4-니트로-페닐)-싸이오우레아 (화학식 4c)의 합성

상기 실시예 1-1의 방법으로 수행하여 화학식 (4c)로 표시되는 목적하는 중간체 화합물을 얻었다.

M/S 397.49

실시예 1-4) 1-(2-메틸-2-펜에틸-2H-크로멘-6-일)-3-(4-니트로-페닐)-싸이오우레아 (화학식 4d)의 합성

상기 실시예 1-1의 방법으로 수행하여 화학식 (4d)로 표시되는 목적하는 중간체 화합물을 얻었다.

M/S 445.54

실시예 1-5) 1-(2,7-디메틸-2-펜에틸-2H-크로멘-6-일)-3-(4-니트로-페닐)-싸이오우 레아 (화학식 4e)의 합성

상기 실시예 1-1의 방법으로 수행하여 화학식 (4e)로 표시되는 목적하는 중간체 화합물을 얻었다.

M/S 459.59

실시예 2: 구아니딘계 벤조피란 유도체 (화학식 1) 합성

실시예 2-1) N-(2,2-디메틸-2H-크로멘-6-일)-N'-(4-니트로-페닐)-N"-페닐-구아니딘 (화합물번호 6)의 합성

화학식 (4a)로 표시되는 싸이오우레아 화합물(50 mg, 0.16 mmol, 1 eq)을 클로로포름(CHCl₃, 5 mL)에 가한 후 상온에서 10분간 교반시켰다. 1,3-디이소프로필카보디이미드(DIC; 0.029 mL, 0.19 mmol, 1.2 eq)와 디이소프로필에틸아민(DIPEA; 0.033 mL, 0.19 mmol, 1.2 eq)을 가하고 50 ℃에서 10분간 교반시킨 후 반응물에 화학식 (5a)로 표시되는 4-니트로아닐린(44 mg, 0.32 mmol)을 가하고 15시 간동안 교반시켰다. 반응종료 후, 상온으로 온도를 내리고 반응물에 화학식 (6)으로 표시되는 폴리스타이렌 이소시아네이트(2.90 mmol/g, 0.35 g, 1 mmol)를 가한 후 30분간 교반시켰다. 반응혼합물을 여과하고 여과물을 클로로포름(CHCl₃)으로 반복세척하고 여과액을 합하여 감압 농축한 다음 헥산/에틸아세테이트(3/1, v/v)의 혼합 용매 하에서 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 표제화합물(화합물번호 6; 35 mg, 수율 53 %)을 얻었다.

실시예 2-2) N-(2,2-디메틸-2H-크로멘-6-일)-N'-(4-니트로-페닐)-N"-4-톨릴-구아니딘 (화합물번호 8)의 합성

화학식 (4b)로 표시되는 싸이오우레아 화합물(69 mg, 0.16 mmol, 1 eq)을 클로로포름(CHCl₃, 5 mL)에 가한 후 상온에서 10분간 교반시켰다. 1,3-디이소프로필카보디이미드(DIC; 0.029 mL, 0.19 mmol, 1.2 eq)와 디이소프로필에틸아민 (DIPEA; 0.033 mL, 0.19 mmol, 1.2 eq)을 가하고 50 ℃에서 10분간 교반시킨 후 반응물에 화학식 (5b)로 표시되는 4-메틸아닐린(0.035 mL, 0.32 mmol)을 가하고 15시간동안 교반시켰다. 반응종료 후, 상온으로 온도를 내리고 반응물에 화학식 (6)으로 표시되는 폴리스타이렌 이소시아네이트(2.90 mmol/g, 0.35 g, 1 mmol)를 가한 후 30분간 교반시켰다. 반응혼합물을 여과하고 여과물을 클로로포름 (CHCl₃)으로 반복세척하고 여과액을 합하여 감압 농축한 다음 헥산/에틸아세테이트(3/1, v/v)의 혼합 용매 하에서 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 표제화합물(화합물번호 8; 34 mg, 수율 49 %)을 얻었다.

실시예 2-3) N-(2,2-디메틸-2H-크로멘-6-일)-N'-(4-플루오로-페닐)-N"-(4-니트로-페닐)-구아니딘 (화합물번호 29)의 합성

화학식 (4c)로 표시되는 싸이오우레아 화합물(64 mg, 0.16 mmol, 1 eq)을 클로로포름(CHCl₃, 5 mL)에 가한 후 상온에서 10분간 교반시켰다. 1,3-디이소프로필카보디이미드(DIC; 0.029 mL, 0.19 mmol, 1.2 eq)와 디이소프로필에틸아민(DIPEA; 0.033 mL, 0.19 mmol, 1.2 eq)을 가하고 50 ℃에서 10분간 교반시킨 후 반응물에 화학식 (5c)로 표시되는 4-플루오로아닐린(0.030 mL, 0.32 mmol)을 가하고 15시간동안 교반시켰다. 반응종료 후, 상온으로 온도를 내리고 반응물에 화학식 (6)으로 표시되는 폴리스타이렌 이소시아네이트(2.90 mmol/g, 0.35 g, 1 mmol)를 가한 후 30분간 교반시켰다. 반응혼합물을 여과하고 여과물을 클로로포름 (CHCl₃)으로 반복세척하고 여과액을 합하여 감압 농축한 다음 헥산/에틸아세테이트 (3/1, v/v)의 혼합 용매 하에서 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하여 표제화합물(화합물번호 29; 44 mg, 수율 58 %)을 얻었다.

실시예 2-4) N-(2,2-디메틸-2H-크로멘-6-일)-N'-(4-메톡시-페닐)-N"-(4-니트로-페닐)-구아니딘 (화합물번호 36)의 합성

화학식 (4d)로 표시되는 싸이오우레아 화합물(71 mg, 0.16 mmol, 1 eq)을 클로로포름(CHCl₃, 5 mL)에 가한 후 상온에서 10분간 교반시켰다. 1,3-디이소프로필카보디이미드(DIC; 0.029 mL, 0.19 mmol, 1.2 eq)와 디이소프로필에틸아민(DIPEA; 0.033 mL, 0.19 mmol, 1.2 eq)을 가하고 50 ℃에서 10분간 교반시킨 후 반응물에 화학식 (5d)로 표시되는 4-메톡시아닐린(39 mg, 0.32 mmol)을 가하고 15시간동안 교반시켰다. 반응종료 후, 상온으로 온도를 내리고 반응물에 화학식 (6)으로 표시되는 폴리스타이렌 이소시아네이트(2.90 mmol/g, 0.35 g, 1 mmol)를 가한 후 30분간 교반시켰다. 반응혼합물을 여과하고 여과물을 클로로포름(CHCl₃)로 반복세척하고 여과액을 합하여 감압 농축한 다음 헥산/에틸아세테이트(3/1, v/v)의 혼합 용매 하에서 실리카겔상의 컬럼 크로마토그래피로 분리 정제하 여 표제화합물(화합물번호 36; 37 mg, 수율 43 %)을 얻었다.

상기 실시예 1 및 2의 제조방법으로 본 발명이 목적하는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 합성한 결과는 다음 표 1에 나타내었다.


화합물 번호	R¹	R²	R³	R⁴	구조확인 데이터
1	Ph-	Ph	H	H	M/S 369.48
2	Ph-	4-Me-Ph-	H	H	M/S 383.49
3	Ph-	4-F-Ph-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ7.36-7.31(m, 5H), 7.01(m, 2H), 6.86(t, 2H,J=8.7 Hz), 6.65(d, 1H), 6.64-6.61(m, 2H), 6.32(d, 1H), 5.72(d, 1H), 1.43(s, 6H); M/S 387.46
4	Ph-	4-Cl-Ph-	H	H	M/S 403.92
5	Ph-	4-MeO-Ph-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ7.29-7.11(m, 7H), 6.95(d, 2H,J=8.1 Hz), 6.86-6.81(m, 2H), 6.67(d, 2H,J=7.2 Hz), 6.25(d, 1H), 5.62(d, 1H,J=9.9 Hz), 3.75(s, 3H), 1.38(s, 6H); M/S 399.47
6	Ph-	4-NO₂-Ph-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.08(d, 2H,J=8.9 Hz), 7.34-7.16(m, 7H), 6.90(dd, 1H,J=8.6 Hz,J=2.5 Hz), 6.82(d, 1H,J=2.5 Hz), 6.71(d, 1H,J=8.6 Hz), 6.23(d, 1H,J=9.8 Hz), 5.65(d, 1H,J=9.8 Hz), 1.41(s, 6H); M/S 414.46
7	Ph-	Bn-	H	H	M/S 383.47
8	4-NO₂-Ph-	4-Me-Ph-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.02(d, 2H,J=8.9 Hz), 7.21(d, 2H,J=8.9 Hz), 7.08(s, 4H), 6.91(dd, 1H,J=8.4 Hz,J=2.4 Hz), 6.84(d, 1H,J=2.4 Hz), 6.66(d, 1H,J=8.4 Hz), 6.21(d, 1H,J=9.9 Hz), 5.63(d, 1H,J=9.9 Hz), 2.27(s, 3H), 1.38(s, 6H); M/S 428.50
9	4-NO₂-Ph-	3,5-Me-Ph-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.05(d, 2H,J=8.97 Hz), 7.20(d, 2H,J=8.97 Hz), 6.89(dd, 1H,J=8.46 Hz,J=2.49 Hz), 6.82(d, 1H,J=2.49 Hz), 6.77(s, 3H), 6.69(d, 1H,J =8.46 Hz), 6.22(d, 1H,J=9.83 Hz), 5.64(d, 1H,J=9.83 Hz), 2.24(s, 6H), 1.39(s, 6H); M/S 442.55

10	4-NO₂-Ph-	4-F-Ph-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.10(d, 2H,J=9.0 Hz), 7.26(d, 2H,J=9.0 Hz), 7.17(m, 2H), 6.99(m, 2H), 6.91(dd, 1H,J=8.4 Hz,J=2.4 Hz), 6.81(d, 1H,J=2.4 Hz), 6.73(d, 1H,J=8.4 Hz), 6.24(d, 1H,J=9.9 Hz), 5.66(d, 1H,J=9.9 Hz), 1.42(s, 6H); M/S 432.47
11	4-NO₂-Ph-	4-Cl-Ph-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.12(d, 2H,J=7.6 Hz), 7.29-7.14(m, 4H), 7.10(d, 2H,J=8.7 Hz), 6.90(d, 1H,J=2.6 Hz), 6.79-6.71(m, 2H), 6.23(d, 1H,J=9.8 Hz), 5.66(d, 1H,J=9.8 Hz), 1.40(s, 6H); M/S 448.93
12	4-NO₂-Ph-	4-MeO-Ph-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.11(d, 2H,J=8.9 Hz), 7.24(d, 2H,J=8.9 Hz), 7.14(d, 2H,J=8.8 Hz), 6.93(dd, 1H,J=8.5 Hz,J=2.3 Hz), 6.86(m, 3H), 6.73(d, 1H,J=8.5 Hz), 6.25(d, 1H,J=9.8 Hz), 5.64(d, 1H,J=9.8 Hz), 3.78(s, 3H), 1.42(s, 6H); M/S 444.50
13	4-NO₂-Ph-	2-MeO-Ph-	H	H	M/S 444.51
14	4-NO₂-Ph-	iso-valine (methyl ester)-	H	H	M/S 452.54
15	4-NO₂-Ph-	Bn-	H	H	M/S 428.48
16	4-NO₂-Ph-	4-F-Bn-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.14(d, 2H,J=8.99 Hz), 7.27(m, 2H), 7.12(d, 2H,J=8.99 Hz), 7.03(m, 2H), 6.85(dd, 1H,J=8.49 Hz,J=2.60 Hz), 6.74(d, 1H,J=2.60 Hz), 6.70(d, 1H,J=8.49 Hz), 6.20(d, 1H,J=9.85 Hz), 5.65(d, 1H,J=9.85 Hz), 4.45(s, 2H), 1.41(s, 6H); M/S 446.49
17	4-NO₂-Ph-	4-Cl-Bn-	H	H	M/S 462.95
18	4-NO₂-Ph-	4-NO₂-Ph-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.14(d, 2H,J=9.32 Hz), 8.12(d, 2H,J=8.49 Hz), 6.96(d, 2H,J=8.49 Hz), 6.82(d, 2H,J=9.32 Hz), 6.70(m, 2H), 6.62(s, 1H), 6.22(d, 1H,J=9.81 Hz), 5.66(d, 1H,J=9.81 Hz), 3.55(t, 4H,J=4.11 Hz), 3.45(br-s, 4H), 1.41(s, 6H); M/S 528.55
19	4-NO₂-Ph-	Ph- piperazine-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.10(d, 2H,J=8.7 Hz), 7.30(d, 2H,J=8.7 Hz), 6.92(m, 5H), 6.75(br-s, 1H), 6.68(d, 1H,J=8.1 Hz), 6.63(br-s, 1H), 6.22(d, 1H,J=9.9 Hz), 5.64(d, 1H,J=9.9 Hz), 3.54(t, 4H,J=5.0 Hz), 3.18(br-s, 4H), 1.41(s, 6H); M/S 483.57

20	4-NO₂-Ph-	2-MeO-Ph-piperazine-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.10(d, 2H,J=8.7 Hz), 7.06-6.92(m, 4H), 6.88(d, 2H,J=8.7 Hz), 6.74(br-s, 1H), 6.68(d, 1H,J=8.1 Hz), 6.62(br-s, 1H), 6.22(d, 1H,J=9.9 Hz), 5.64(d, 1H,J=9.9 Hz), 3.86(s, 3H), 3.57(t, 4H,J=4.8 Hz), 3.06(br-s, 4H), 1.41(s, 6H); M/S 513.63
21	4-NO₂-Ph-	3-MeO-Ph-piperazine-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.08(d, 2H,J=8.40 Hz), 7.18(m, 1H), 6.93(d, 2H,J=8.4 Hz), 6.75(br-s, 1H), 6.67(d, 1H,J=8.40 Hz), 6.63(br-s, 1H), 6.53(d, 1H,J=9.03 Hz), 6.45(m, 2H), 6.21(d, 1H,J=9.78 Hz), 5.64(d, 1H,J=9.78 Hz), 3.79(s, 3H), 3.52(t, 4H,J=4.91 Hz), 3.17(br-s, 4H), 1.41(s, 6H); M/S 513.64
22	4-NO₂-Ph-	4-F-Ph- piperazine-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.11(d, 2H,J=9.0 Hz), 7.03-6.95(m, 3H), 6.91-6.85(m, 2H), 6.74(br-s, 1H), 6.69(d, 1H,J=8.1 Hz), 6.62(br-s, 1H), 6.22(d, 1H,J=9.9 Hz), 5.65(d, 1H,J=9.9 Hz), 3.53(t, 4H,J=5.0 Hz), 3.09(br-s, 4H), 1.41(s, 6H); M/S 501.58
23	4-NO₂-Ph-	4-Cl-Ph- piperazine-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.10(d, 2H,J=8.7 Hz), 7.22(d, 2H,J=7.5 Hz), 6.94(d, 2H,J=8.7 Hz), 6.83(d, 2H,J=7.5 Hz), 6.75(br-s, 1H), 6.68(d, 1H,J=8.4 Hz), 6.62(br-s, 1H), 6.21(d, 1H,J=9.9 Hz), 5.64(d, 1H,J=9.9 Hz), 3.52(t, 4H,J=5.3 Hz), 3.13(br-s, 4H), 1.41(s, 6H); M/S 518.03
24	4-NO₂-Ph-	4-Me-Ph- piperazine-	H	H	M/S 497.61
25	4-NO₂-Ph-	3,4-dioxo- Bn-	H	H	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.14(d, 2H,J=8.9 Hz), 7.16(d, 2H,J=8.9 Hz), 6.87(dd, 1H,J=8.5 Hz,J=2.5 Hz), 6.81-6.76(m, 4H), 6.70(d, 1H,J=8.5 Hz), 6.21(d, 1H,J=9.8 Hz), 5.96(s, 2H), 5.64(d, 1H,J=9.8 Hz), 4.42(s, 2H), 1.40(s, 6H); M/S 472.51
26	4-NO₂-Ph-	Ph-	CH₃	-CH₂CH₃	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.13(d, 2H), 7.33-7.23(m, 7H), 7.10(t, 1H), 6.82(s, 1H), 6.65(s, 1H), 6.27(d, 1H), 5.56(d, 1H), 5.64(d, 1H,J=9.8 Hz), 2.20(s, 3H), 1.62(m, 2H), 1.46(m, 2H), 1.37(s, 3H), 0.92(t, 3H); M/S 456.54

27	4-NO₂-Ph-	4-Me-Ph-	CH₃	-CH₂CH₃	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.06(d, 2H), 7.22(d, 2H), 7.05(m, 4H), 6.82(s, 1H), 6.59(s, 1H), 6.25(d, 1H), 5.54(d, 1H), 2.28(s, 3H), 2.04(s, 3H), 1.64(m, 2H), 1.58(m, 2H), 1.37(s, 3H), 0.90(t, 3H); M/S 470.58
28	4-NO₂-Ph-	4-MeO-Ph-	CH₃	-CH₂CH₃	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.10(d, 2H), 7.28(d, 2H), 7.15(d, 2H), 6.86(m, 3H), 6.62(s, 1H), 6.26(d, 1H), 5.55(d, 1H), 3.78(s, 3H), 2.20(s, 3H), 1.66(m, 2H), 1.60(m, 2H), 1.40(s, 3H), 0.91(t, 3H); M/S 486.56
29	4-NO₂-Ph-	4-F-Ph-	CH₃	-CH₂CH₃	¹H NMR(500 MHz, CDCl₃) δ8.10(d, 2H), 7.26(d, 2H), 7.16(m, 2H), 6.80(s, 1H), 6.98(t, 2H), 6.80(s, 1H), 6.61(s, 1H), 6.25(d, 1H), 5.55(d, 1H), 2.20(s, 3H), 1.65(m, 2H), 1.41(m, 2H), 1.35(s, 3H), 0.91(t, 3H,J=7.30 Hz); M/S 474.52
30	4-NO₂-Ph-	4-Cl-Ph-	CH₃	-CH₂CH₃	¹H NMR(500 MHz, CDCl₃) δ8.15(d, 2H,J=9.05 Hz), 7.28(d, 2H,J=9.05 Hz), 7.10(d, 2H,J=8.70 Hz), 6.80(s, 1H), 6.66(s, 1H), 6.61(d, 2H,J=8.70 Hz), 6.27(d, 1H,J=9.95 Hz), 5.57(d, 1H,J=9.95 Hz), 2.20(s, 3H), 1.68(m, 2H), 1.60(m, 2H), 1.38(s, 3H), 0.92(t, 3H,J=7.30 Hz); M/S 490.99
31	4-NO₂-Ph-	4-NO₂-Ph-	CH₃	-CH₂CH₃	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.18(d, 4H,J=9.2 Hz), 7.53(d, 2H,J=9.2 Hz), 7.40(br-s, 2H), 6.83(s, 1H), 6.67(s, 1H), 6.27(d, 1H,J=9.9 Hz), 5.59(d, 1H,J=9.9 Hz), 2.22(s, 3H), 1.62-1.43(m, 4H), 1.38(s, 3H), 0.93(m, 3H); M/S 501.55
32	4-NO₂-Ph-	morpholine-	CH₃	-CH₂CH₃	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.09(d, 2H,J=8.2 Hz), 6.94(d, 2H,J=8.2 Hz), 6.70(s, 1H), 6.54(s, 1H), 6.25(d, 1H,J=10.1 Hz), 5.55(d, 1H,J=10.1 Hz), 3.64(m, 4H), 3.32(m, 4H), 2.04(s, 3H), 1.68-1.57(m, 2H), 1.47-1.43(m, 2H), 1.34(s, 3H), 0.91(t, 3H,J=7.2 Hz); M/S 450.55
33	4-NO₂-Ph-	(CH₂CH₃)₂-	CH₃	-CH₂CH₃	¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ8.08(d, 2H,J=9.0 Hz), 7.05(d, 2H,J=9.0 Hz), 6.68(s, 1H), 6.55(s, 1H), 6.23(d, 1H,J=9.9 Hz), 5.54(d, 1H,J=9.9 Hz), 3.29(q, 4H,J=7.2 Hz), 2.16(s, 3H), 1.64-1.57(m, 4H), 1.33(s, 3H), 1.17(t, 3H,J=7.2 Hz), 0.90(t, 6H,J=7.2 Hz); M/S 436.54
34	4-NO₂-Ph-	Ph-	H	-CH₂Ph	M/S 504.59
35	4-NO₂-Ph-	4-Me-Ph-	H	-CH₂Ph	M/S 518.63
36	4-NO₂-Ph-	4-MeO-Ph-	H	-CH₂Ph	M/S 534.62
37	4-NO₂-Ph-	4-F-Ph-	H	-CH₂Ph	M/S 522.59

38	4-NO₂-Ph-	4-Cl-Ph-	H	-CH₂Ph	M/S 539.02
39	4-NO₂-Ph-	4-NO₂-Ph-	H	-CH₂Ph	M/S 549.56
40	4-NO₂-Ph-	Ph-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 518.63
41	4-NO₂-Ph-	4-Me-Ph-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 532.65
42	4-NO₂-Ph-	4-MeO-Ph-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 548.65
43	4-NO₂-Ph-	4-F-Ph-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 536.64
44	4-NO₂-Ph-	4-Cl-Ph-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 553.07
45	4-NO₂-Ph-	4-NO₂-Ph-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 563.63
46	4-NO₂-Ph-	Ph-piperazine-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 587.74
47	4-NO₂-Ph-	2-MeO-Ph- piperazine-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 617.76
48	4-NO₂-Ph-	3-MeO-Ph- piperazine-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 617.76
49	4-NO₂-Ph-	4-F-Ph- piperazine-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 605.72
50	4-NO₂-Ph-	4-Cl-Ph- piperazine-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 622.17
51	4-NO₂-Ph-	4-Me-Ph- piperazine-	CH₃	-CH₂Ph	M/S 601.76
52	4-NO₂-Ph-	Ph-	CH₃	Ph	M/S 490.5

다음은 본 발명에 따른 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제제 1 : 정제(직접 가압)

활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 14.1 ㎎, 크로스포비돈 USNF 0.8 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 만들었다.

제제 2 : 정제(습식 조립)

활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 16.0 ㎎과 녹말 4.0 ㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 80 0.3 ㎎을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 만들었다.

제제 3 : 분말과 캡슐제

활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후에, 락토스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎와 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

제제 4 : 주사제

활성성분으로서 100 mg을 함유시키고, 그 밖에도 만니톨 180 mg, Na₂HPO₄·12H₂O 26 mg 및 증류수 2974 mg를 함유시켜 주사제를 제조하였다.

실험예 : 생물검정실험

실험예 1) TGFβ 수용체 길항활성 시험

간섬유화/간경화의 가장 핵심적인 과정인 간세포의 손상시 염증세포와 쿠퍼세포(Kupffer cell)에 의해 생산되고 분비되는 TGFβ 사이토카인은 간성상세포의 증식과 분화를 유도하여 콜라겐과 같은 세포외기질(extracellular matrix)의 과생산과 축적을 유발한다. 따라서 TGFβ의 작용을 억제하여 간성상세포의 증식과 분화를 억제하고 염증세포의 화학주성 기전을 억제하는 물질을 간섬유화/간경화 치료제로 개발할 수 있을 것이다.

본 실험예에서는 TGFβ 수용체와 이의 내인성 리간드인 TGFβ의 결합을 경쟁적으로 길항함으로써 TGFβ에 의한 세포내 신호전달체계를 차단하는 물질을 탐색하고자 하였다. 탄산나트륨 용액에 용해된 TGFβ 수용체를 플레이트의 각 웰(well)에 가하고 4 ℃에서 밤새 동안 부착시켰다. 정제된 비오틴-TGFβ를 트리스-HCl 완충액에 녹인 후 검색하고자 하는 화합물과 함께 각 웰에 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켜 TGFβ 수용체와 비오틴-TGFβ의 결합반응을 유도하였다. 각 웰을 PBS-0.05% 트윈 20 용액(PBST buffer)으로 세척한 후 HRP로 표지된 스트렙타비딘(Streptavidin)을 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST 완충액을 이용하여 각 웰을 세척한 후 HRP의 기질인 TMB 용액을 첨가하고 상온에서 20분간 반응시켜 발색시킨 후 동량의 1 M 인산 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응을 정지시킨 후 약 5분 후에 측정파장 450 nm, 보정파장 540 nm에서 를 측정하였다. 그 결과 중에 뛰어난 활성을 보인 화합물 일부분에 대한 결과 예시를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보여지는 바와 같이 TGFβ 수용체에 대한 길항활성을 보이고 있는 이들 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유 도체들은 간성상세포에서도 섬유화를 억제할 수 있을 것으로 예상되어 아래 실험을 실시하였다.

실험예 2) 콜라겐 합성 억제활성 시험

간섬유화는 간성상세포가 증식 및 활성화되어 콜라겐 합성 증가 및 분해 감소에 의해 콜라겐 축적이 일어나는 과정이다. 따라서 간섬유화가 진행됨에 따라 활성화된 간성상세포로부터 콜라겐 합성이 증가되어 세포 밖으로 콜라겐 분비가 증가되므로 간성상세포의 세포독성과 콜라겐 합성 저래 효과를 관찰함으로써 간섬유화 억제 효과를 확인할 수 있다.

사람의 활성화된 간성상세포주인 LI90 세포는 일본의 JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources) 세포주 은행으로부터 구입했다. LI90 세포주는 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagles Medium(DMEM)을 배양액으로 하여 96 웰 플레이트에 24시간동안 배양하였다. 우태아혈청이 없는 배지로 갈아준 다음 약물들을 다양한 농도로 처리하였다. 약물을 처리한 지 48시간이 지난 다음, Promega 사의 CellTiter 96 non radioactive cell proliferation assay kit을 이용하여 MTS assay를 실시하여 세포독성을 측정하였다. 또한 영국 ABcam사의 anti-rabbit 사람 콜라겐 항체를 사용하여 배양액 내의 콜라겐을 ELISA 방법으로 측정하여 그 결과를 도 2에 표시하였다. 도 2에 보여지는 바와 같이 TGFβ 수용체 길항활성을 보인 화합물들은 간성상세포의 증식 및 콜라겐 생성 역시 억제함을 알 수 있었다. 이상의 결과로 볼 때, N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체들은 이상 증식 및 활성화되어 간섬유화를 유발하는 간성상세포의 증식을 억제하고, 세포로부터 콜라겐의 합성 및 분비를 억제함으로써 간섬유화 억제효능을 가짐을 알 수 있다.

실험예 3) 콜라겐 유전자 발현 저해

간섬유화에 관여하는 주된 콜라겐은 Type 1 콜라겐으로 이는 α1과 α2 체인으로 구성되어 있다. 콜라겐 발현에는 콜라겐 유전자 프로모터 부위에 여러 전사인자들이 관여하며, 일반적으로 콜라겐의 전사가 증가하면 콜라겐 발현양이 증가된다. 그러므로 콜라겐 프로모터의 활성도의 감소를 관찰함으로써 간섬유화의 저해 정도를 측정할 수 있다. 본 실험예에서는 콜라겐 프로모터 활성도의 저해효과를 다음의 방법에 의해 측정하였다.

실험예 2에서 사용된 세포주와 동일한 LI90 세포주 내에 Type 1 콜라겐 α2 체인(COL1A2)의 프로모터 3.3 kb를 루시페라아제(luciferase)를 수용체 유전자로 갖고 있는 pGL3 기본벡터에 삽입한 pCOL1A2-Luc 플라스미드와 트랜스펙션(transfection)을 보정하기 위하여 레닐라 루시페라아제(Renilla luciferase) 유전자를 함유하고 있는 Herpes simplex virus thymidine kinase(HSV-TK) 벡터를 lipofectamine plus(Life Science 사, 미국) 용액으로 동시에 트랜스펙션시키고 24시간 경과 후에 우태아혈청을 함유하고 있지 않은 DMEM으로 바꾸어 주었다. 이때 화학물질들을 함께 첨가하고 24시간 동안 배양한 후 세포를 분해시켜 Promega 사의 dual-luciferase assay kit을 사용하여 루시페라아제 활성도를 측정하였다. 얻어진 fire fly 루시페라아제 활성도와 Renilla 루시페라아제 활성도의 비율을 구하여 활성도 저해 정도를 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 실험예 2의 결과와 마찬가지로 이들 화합물들은 Col1A2 프로모터 활성도를 70% 이상 감소시켜 콜라겐 유전자의 전사를 억제함으로써, 콜라겐 발현양이 억제함을 알 수 있었다.

이상에서 밝힌 바와 같이 본 발명의 화합물인 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체는 TGFβ 수용체 길항활성, 콜라겐의 합성 억제활성, 및 간경화 억제활성을 나타내어 간경화 질환의 예방 및 치료제 개발에 극히 유용하다.

Claims

다음 화학식 (1)로 표시되는 것임을 특징으로 하는 N-(2,2-이중치환-2H-크로멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 간질환 예방 및 치료제 :

[화학식 1]

상기 화학식 (1)에서,

R¹및 R²는 각각 C₁∼C₅의 알킬기, 또는 각각 치환 또는 비치환된 페닐기, 치환 또는 비치환된 벤질기, 디옥소벤질기, 또는 이소발린(메틸에스테르)기를 나타내거나, 또는 R¹또는 R²가 각각 결합된 질소와 함께 고리를 형성하고 있는 5 내지 7원의 헤테로 지방족 또는 방향족 싸이클기를 나타내고;

R³은 수소, 또는 C₁∼C₅의 알킬기를 나타내고;

R⁴는 수소, C₁∼C₅ 알킬기, 치환 또는 비치환된 페닐기, 또는 치환 또는 비치환된 벤질기를 나타내고; 그리고

상기한 치환된 페닐 또는 치환된 벤질은 할로겐, 니트로기, C₁∼C₅의 알킬기 및 C₁∼C₅의 알콕시기 중에서 선택된 1 내지 4개의 치환체로 치환된 페닐 또는 벤질기를 나타낸다.
제 1 항에 있어서,

상기 R¹및 R²는 각각 페닐기; 할로겐, 니트로기, C₁∼C₅의 알킬기 및 C₁∼C₅의 알콕시기 중에서 선택된 1 내지 4개의 치환체로 치환된 페닐기; 벤질기; 할로겐 치환체로 치환된 벤질기; 디옥소벤질기; R¹또는 R²가 각각 결합된 질소와 함께 고리를 형성하고 있는 페닐피페라지닐기, 또는 할로겐, C₁∼C₅의 알킬기 및 C₁∼C₅의 알콕시기 중에서 선택된 1 내지 4개의 치환체로 치환된 페닐피페라지닐기, 또는 모포리노기를 나타내고;

상기 R³은 수소; 또는 C₁∼C₅의 알킬기를 나타내고;

상기 R⁴는 수소; C₁∼C₅ 알킬기; 페닐기; 또는 벤질기를 나타내는 것임을 특징으로 하는 예방 및 치료제.
다음 화학식 (1)로 표시되는 것임을 특징으로 하는 N-(2,2-이중치환-2H-크로 멘-6-일)-N,N'-이중치환 구아니딘 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 함유되어 있는 것임을 특징으로 하는 TGFβ 수용체 길항활성에 의한 섬유 증식성 질환의 예방 및 치료제 :

[화학식 1]

상기 화학식 (1)에서, R¹, R², R³, 및 R⁴는 각각 청구항 1에서 정의한 바와 같다.
제 3 항에 있어서, 상기 섬유 증식성 질환은 간섬유화, 간경화, 폐섬유증, 피부경화증, 신사구체 섬유증이 포함되는 것을 특징으로 하는 예방 및 치료제.